專利名稱：黃連提取物與納米銀抑菌組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于中藥領(lǐng)域，尤其涉及一種中藥抑菌組合物。
背景技術(shù)：
黃連屬多年生草本，根莖黃色，常分枝，密生多數(shù)須根，為毛茛科的黃連，三角葉黃連或者云蓮的干燥根莖。其主要分布于四川、貴州、湖南、湖北、陜西南部，具有清熱燥濕，瀉火解毒的功效。鹽酸小檗堿(黃連素)是其主要的有效成分?，F(xiàn)代藥理實(shí)驗(yàn)研究表明黃連具有抗病原微生物作用，同時(shí)對金黃色葡萄球菌、大腸埃氏菌、溶血性鏈球菌、肺炎球菌、銅綠假單胞菌、腦膜炎雙球菌、痢疾桿菌、炭疽桿菌、流感病毒、乙肝病毒等都具有抑制作用。除此之外，黃連還有降血糖、抗腫瘤、抗腹瀉、利膽、抗心律失常、抗炎以及免疫調(diào)節(jié)等作用。黃連因其具有較高的藥用和保健價(jià)值，廣泛引起了人們關(guān)注。
中藥制劑濃縮液制成口服液或抑菌組合物、涂覆劑等一次用劑量大，且長期使用影響人體健康。

發(fā)明內(nèi)容
針對黃連抑菌組合物一次用量大和長期使用影響人體健康問題，本發(fā)明人經(jīng)過大量實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)納米銀能有效增強(qiáng)黃連提取液抑菌性能，減少黃連抑菌劑的用量，且采用兩種低劑量的抑菌組合物，更加的安全。本發(fā)明的目的在于提供一種黃連納米銀抑菌組合物，減少黃連抑菌劑一次的用劑量和降低藥品對人體的毒性。本發(fā)明提供如下技術(shù)方案
一種抑菌組合物，含有黃連提取液、水溶性納米銀；
黃連提取液制備包括如下步驟取干藥材黃連，加水量為黃連重量的9倍，經(jīng)95 °C水浴提取4 h，再經(jīng)過減壓濃縮得到提取液；所得提取液經(jīng)O. 22 μ m濾膜過濾。所得提取液經(jīng)高效液相色譜法對黃連素進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)定量。抑制大腸桿菌0157:H7時(shí)，黃連提取液、水溶性納米銀的體積比為26. 6 30: I。抑制藤黃微球菌時(shí)，黃連提取液、水溶性納米銀的體積比為廣1.2:1。在算體積時(shí)提取液中黃連素的含量為28 mg/mL，水溶性納米銀濃度為10 mg/mL。水溶性納米銀顆粒粒徑為3 10 nm,納米銀外表包覆兩性聚合物。水溶性納米銀粒徑為3 10 nm,外表為羧基，依照下列方法制備取22. 8 g十四烷酸溶于140 mL按2:5比例混合的甲醇和水中，向溶液中加入4 g的氫氧化鈉析出沉淀，過濾，將沉淀加入到100 mL濃度為10 mol/L水溶性的硝酸銀溶液中得到十四烷酸銀；稱取6. 7 g濃度為20 mmoL/L十四燒酸銀于100 mL燒杯中，向燒杯中加入58 mL濃度為40mmoL/L的三乙胺，80°C下電磁攪拌2 h，白色的十四烷酸銀粉末逐漸變成棕色，不溶的前體消失，加入20 mL丙酮沉淀析出，抽濾，用丙酮洗滌沉淀數(shù)次后，真空干燥，即得到納米銀粒子粉末。依照本方法制備的水溶性納米銀顆粒與黃連提取液具有良好的協(xié)同抗菌作用。本發(fā)明還涉及上述抑菌組合物在抑制大腸桿菌0157:H7中的應(yīng)用。
本發(fā)明還涉及上述抑菌組合物在抑制藤黃微球菌中的應(yīng)用。本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明水溶性納米銀的應(yīng)用能有效增強(qiáng)黃連抑菌性能，降低黃連抑菌劑的用量，更令人意想不到的是兩種藥物的合用對抑制大腸桿菌0157:H7和藤黃微球菌起到協(xié)同作用，同時(shí)本抑菌組合物采用兩種低劑量的抑菌物質(zhì)，相對于使用高劑量的黃連或者水溶性納米銀，更加的安全，可以作為安全可靠地外用涂覆劑等。


圖I黃連提取液與水溶性納米銀之比為30:1的協(xié)同抑菌。圖Ia 2 μ L納米銀對大腸桿菌0157:H7的抑制結(jié)果，圖Ib 60 μ L黃連提取液 對大腸桿菌0157:Η7的抑制結(jié)果，圖Ic 30 μ L黃連提取液與I μ L納米銀對大腸桿菌0157 :Η7的抑制結(jié)果。圖2黃連提取液與水溶性納米銀之比為26. 6:1的協(xié)同抑菌
圖2a表示的是I. 5 μ L納米銀對大腸桿菌0157:Η7的抑菌結(jié)果，圖2c表示的是40 μ L黃連提取液對大腸桿菌0157:H7的抑菌結(jié)果，圖2c表示的是O. 75 μ L納米銀、20 μ L黃連提取液混合物對大腸桿菌0157 :Η7的協(xié)同抑菌結(jié)果。圖3黃連提取液與水溶性納米銀之比為I的協(xié)同抑菌
圖3a表示的是16 μ L納米銀對藤黃微球菌的抑菌結(jié)果，圖3b表示的是16 yL黃連提取液對藤黃微球菌的抑菌結(jié)果，圖3c表示的是8 μ L納米銀、8 μ L黃連提取液對藤黃微球菌的協(xié)同抑菌結(jié)果。圖4黃連提取液與水溶性納米銀之比為5:8的協(xié)同抑菌
圖4a表示的是16 μ L納米銀對藤黃微球菌的抑菌結(jié)果，圖4b表示的是10 μ L黃連提取液對藤黃微球菌的抑菌結(jié)果，圖4c表示的是8 μ L納米銀與5 μ L黃連提取液對藤黃微球菌的協(xié)同抑菌結(jié)果。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I
I、黃連提取液的制備過程稱取干藥材黃連50 g，加水量為450 mL，在95 °C下提取4h，再經(jīng)過真空旋轉(zhuǎn)濃縮儀濃縮得到提取液，經(jīng)O. 22 μ m濾膜過濾后，最后再用高效液相色譜法測得提取液中黃連素的含量為28 mg/mL。2、水溶性銀納米顆粒制備
取22. 8 g十四烷酸溶于140 mL按2:5比例混合的甲醇和水中，向溶液中加入4 g的氫氧化鈉析出沉淀，過濾，將沉淀加入到100 mL濃度為10 mol/L水溶性的硝酸銀溶液中得到十四烷酸銀；稱取6. 7 g濃度為20 mmoL/L十四烷酸銀于100 mL燒杯中，向燒杯中加入58 mL濃度為40 mmoL/L的三乙胺，80°C下電磁攪拌2 h，白色的十四烷酸銀粉末逐漸變成棕色，不溶的前體消失，加入20 mL丙酮沉淀析出，抽濾，用丙酮洗滌沉淀數(shù)次后，真空干燥，即得到納米銀粒子粉末。3、黃連提取液與水溶性納米銀協(xié)同抑菌作用。a細(xì)菌的培養(yǎng)
挑取LB瓊脂培養(yǎng)基上的大腸桿菌0157:H7的單菌落于10 mL LB肉湯培養(yǎng)基中，置于37 °C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16 h，再按I %的接種量接種于5 mL的LB肉湯培養(yǎng)基中，37 °C培養(yǎng)4h后。取I mL上述菌液用O. 1%的蛋白胨水連續(xù)稀釋三個(gè)梯度，最終的菌液大約為IO6 CFU/
Π Τ, ηb水溶性納米銀與黃連提取液在抑菌性能上的協(xié)同作用
分別取I mL上述已稀釋好的菌液于I. 5 mL滅菌的離心管中，向I號離心管中分別加Λ 60 μ L黃連提取液(黃連素的含量為28 mg/mL,下同)，向2號離心管中加入2 μ L濃度為10 mg/mL的水溶性納米銀，向3號離心管中加入30 μ L黃連提取液和I μ L濃度為10mg/mL水溶性納米銀，不加入任何上述抑菌劑。為保證每管液體最終體積相等，差量用O. 1%的蛋白胨水補(bǔ)齊。置于37 °C培養(yǎng)2 h。每組實(shí)驗(yàn)平行三次。c平板計(jì)數(shù)
將實(shí)驗(yàn)組待測液用PBS連續(xù)稀釋兩個(gè)梯度，10°、10'10_2各取出200 μ L分別均勻涂布在LB固體平板上；空白組連續(xù)稀釋四個(gè)梯度，從10_2、10_3、10_4三個(gè)梯度分別均涂布
在
LB固體平板上。平板吹干后，37°C倒置培養(yǎng)12 h，長出菌落后計(jì)數(shù)，以30-300個(gè)菌落形成單位(CFU)為有效的計(jì)數(shù)范圍。每毫升原菌液活菌數(shù)=平板計(jì)數(shù)*稀釋倍數(shù)*5實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下
權(quán)利要求
1.一種黃連提取物與納米銀抑菌組合物，其特征在于含有黃連提取液、水溶性納米銀；所述黃連提取液制備包括如下步驟加水量為黃連重量的9倍，提取時(shí)間為4 h，再經(jīng)過減壓濃縮得到提取液；所述水溶性納米銀依照下列方法制備取22. 8 g十四烷酸溶于140mL按2:5比例混合的甲醇和水中，向溶液中加入4 g的氫氧化鈉析出沉淀，過濾，將沉淀加入到100 mL濃度為10 mol/L水溶性的硝酸銀溶液中得到十四烷酸銀；稱取6. 7 g濃度為20 mmoL/L十四燒酸銀于100 mL燒杯中，向燒杯中加入58 mL濃度為40 mmoL/L的三乙胺，80°C下電磁攪拌2 h，白色的十四烷酸銀粉末逐漸變成棕色，不溶的前體消失，加入20 mL丙酮沉淀析出，抽濾，用丙酮洗滌沉淀數(shù)次后，真空干燥，即得到納米銀粒子粉末。
2.如權(quán)利要求I所述的抑菌組合物，其特征在于抑制大腸桿菌0157:H7時(shí)，黃連提取液、水溶性納米銀的體積比為26. 6 30: I。
3.如權(quán)利要求I所述的抑菌組合物，其特征在于抑制藤黃微球菌時(shí)，黃連提取液、水溶性納米銀的體積比為廣1.2:1。
4.如權(quán)利要求I所述的抑菌組合物，其特征在于所得提取液經(jīng)O.22 μ m濾膜過濾。
5.如權(quán)利要求I所述的抑菌組合物，其特征在于所得提取液經(jīng)高效液相色譜法對黃連素進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)定量。
6.如權(quán)利要求f5任一所述抑菌組合物在抑制大腸桿菌0157 :H7中的應(yīng)用。
7.如權(quán)利要求f5任一所述抑菌組合物在抑制藤黃微球菌中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了黃連提取物與納米銀抑菌組合物，屬于中藥領(lǐng)域。抑菌組合物中黃連提取液與水溶性納米銀兩種藥物的合用對抑制大腸桿菌O157:H7、藤黃微球菌起到協(xié)同的作用。本發(fā)明的一種黃連提取物與納米銀抑菌組合物與現(xiàn)有的技術(shù)相比，解決了常規(guī)抑菌方法中黃連抑菌劑用量較大的問題，同時(shí)采用兩種低劑量的抑菌物質(zhì)減少了微生物耐藥的發(fā)生機(jī)率、降低了其對人體的毒性，更加的安全。
文檔編號A61P31/02GK102895341SQ20121036651
公開日2013年1月30日 申請日期2012年9月28日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月28日
發(fā)明者許恒毅, 楊林, 魏華, 曲鋒, 徐鋒, 萬翠香, 熊勇華, 賴衛(wèi)華 申請人:南昌大學(xué)