降鈣素基因相關(guān)肽與鮭魚(yú)降鈣素融合多肽的制備與應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種降鈣素基因相關(guān)肽與鮭魚(yú)降鈣素融合多肽的氨基酸序列如SEQ?ID?NO：1所示；且降鈣素基因相關(guān)肽與鮭魚(yú)降鈣素融合多肽C端酰胺化。其中將msCT第8位的纈氨酸變?yōu)楦拾彼?、?6位的亮氨酸用丙氨酸置換、再刪除22位的酪氨酸，msCT的生物活性由4500IU/mg提高到8600IU/mg。本發(fā)明進(jìn)一步公開(kāi)了融合多肽在治療骨質(zhì)疏松、心肌缺血造成的心肌梗塞藥物方面的應(yīng)用藥物方面的應(yīng)用。本發(fā)明降鈣素基因相關(guān)肽與鮭魚(yú)降鈣素融合多肽C端酰胺化可提高降鈣素的活性約30倍，生物學(xué)活性為100～200IU/mg。
【專利說(shuō)明】降鈣素基因相關(guān)肽與鮭魚(yú)降鈣素融合多肽的制備與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物化學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種融合多肽。更具體地說(shuō)是一種降鈣素基因相關(guān)肽與鮭魚(yú)降鈣素的融合多肽及其制備方法與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]降鈣素(calcitonin，CT)可直接抑制破骨細(xì)胞(osteoclasts，0C)增殖，阻止骨溶解，促進(jìn)骨形成，并能迅速減輕因骨質(zhì)疏松而引起的腰錐病疼痛或發(fā)病，是治療骨質(zhì)疏松癥的首選藥物之一。 它還可以有效調(diào)節(jié)骨鈣與血鈣之間的平衡，并有鎮(zhèn)痛作用；對(duì)治療高血鈣癥、變形性骨炎、甲狀腺機(jī)能亢進(jìn)以及各種原因引起的骨骼疼痛(如類風(fēng)濕、腫瘤)等有非常明顯的效果，在骨痛病的治療中，降鈣素的鎮(zhèn)痛效果可達(dá)嗎啡的30~50倍。由于降鈣素能抑制胃酸分泌，它可用于治療急性胃潰瘍；由于降鈣素能抑制胰腺激素分泌及抑制酶的釋放，它可用于治療急性胰腺炎；降鈣素對(duì)甲狀旁腺機(jī)能亢進(jìn)也有治療作用。降鈣素在慢性多關(guān)節(jié)炎及心血管疾病的治療方面也有一定的潛力。
[0003]鮭魚(yú)降鈣素(salmon calcitonin, sCT)是天然降鈣素中活性最高的一種，其活性約是人降鈣素的40倍，與人降鈣素具有同源性。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證明鮭魚(yú)降鈣素作用在人降鈣素受體上，所產(chǎn)生的第二信使cAMP的量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于人降鈣素，因此其使用量占臨床用降鈣素的近 50%。
[0004]降鈣素基因相關(guān)妝(calcitonin gene-related peptide, CGRP)是調(diào)節(jié)心血管活動(dòng)的重要神經(jīng)遞質(zhì)之一，是迄今所知的人體最強(qiáng)的舒血管物質(zhì)。降鈣素基因相關(guān)肽擴(kuò)冠狀動(dòng)脈作用比硝酸甘油、硝普鈉強(qiáng)240倍，它是由辣椒素敏感的感覺(jué)神經(jīng)末梢釋放的一種生物活性多肽，廣泛分布于神經(jīng)及心血管系統(tǒng)。在心血管系統(tǒng)中，降鈣素基因相關(guān)肽生物活性具有多樣性，如強(qiáng)大的舒血管作用、抑制平滑肌細(xì)胞增殖和內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，也能促進(jìn)細(xì)胞分化增殖，參與血管新生。CGRP的舒張冠狀血管的作用遠(yuǎn)強(qiáng)于P物質(zhì)(substance P，SP)、心鈉素和去甲腎上腺素(norepinephrine,NE);比乙酰膽堿(acetylcholine,Ach)、5_輕色胺(5-hydroxytryptamine, 5-HT)等強(qiáng)10000倍左右，比異丙腎上腺素強(qiáng)10~100倍。CGRP血管舒張反應(yīng)呈現(xiàn)不同程度的劑效一依賴性，即適當(dāng)加大CGRP的注入劑量時(shí)反應(yīng)增強(qiáng)，濃度低則效應(yīng)緩慢，但持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)。Shen 等(Shen YT, Pittman TJ, Buie PS.[J].PharmacolExp Ther, 2001, 298 (3):551-558.)認(rèn)為盡管外源性的a-CGRP可以引起不同部位血管床的舒張，但在正常狀態(tài)下的內(nèi)源性a-CGRP對(duì)血管調(diào)節(jié)并不起重要作用。經(jīng)反復(fù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證降鈣素基因相關(guān)肽能夠抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖、保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞和抑制血管新生，防治高血壓，防止充血性心力衰竭，防治心絞痛，防治心肌梗死和治療休克。而且具有在脊髓水平調(diào)制痛覺(jué)的功能，可調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞骨吸收和促進(jìn)成骨細(xì)胞分裂。目前市場(chǎng)上只有降鈣素產(chǎn)品，而降鈣素基因相關(guān)肽只停留在實(shí)驗(yàn)室研究階段。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是為了得到一種既含有降鈣素又含有降鈣素基因相關(guān)肽的產(chǎn)品，而提供了一種降鈣素基因相關(guān)肽與鮭魚(yú)降鈣素融合多肽。本發(fā)明公開(kāi)了如下的技術(shù)內(nèi)容:降鈣素基因相關(guān)肽與鮭魚(yú)降鈣素融合基因表達(dá)的多肽，其特征在于降鈣素基因相關(guān)肽與鮭魚(yú)降鈣素融合多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；AlaCysAspThrAlaThrCysValThrHiSArgLeuAlaGlyLeuLeuSerArgSerGlyGlyValValLysAsnAsnPheValProThrAsnValGlySerLysAlaPheGlyThrCysSerAsnLeuSerThrCysGlyLeuGlyLysLeuSerGlnGluAlaHisLysLeuGlnThrProArgThrAsnThrGlySerGlyThrPro ;且降鈣素基因相關(guān)肽與鮭魚(yú)降鈣素融合多肽C端酰胺化。
[0006]本發(fā)明所述的降鈣素基因相關(guān)肽與鮭魚(yú)降鈣素融合多肽，其中將msCT第8位的纈氨酸變?yōu)楦拾彼帷⒌?6位的亮氨酸用丙氨酸置換、再刪除22位的酪氨酸，msCT的生物活性由 4500IU/mg 提高到 8600IU/mg。
[0007]本發(fā)明所述的降鈣素基因相關(guān)肽與鮭魚(yú)降鈣素融合多肽，其中融合多肽生物學(xué)活性為4500IU/mg，C端非酰胺化的降鈣素基因相關(guān)肽與鮭魚(yú)降鈣素融合多肽生物學(xué)活性為100 ~200IU/mg。
本發(fā)明進(jìn)一步公開(kāi)了一種藥物組合物，主要含有降鈣素基因相關(guān)肽與鮭魚(yú)降鈣素融合多肽及一種或多種藥用輔料。所述的組合物為固體制劑或液體制劑。所述的其中固體制劑為膠囊、軟膠囊、片劑、含片、顆粒劑或滴丸；液體制劑為口服液或注射液。
[0008]本發(fā)明所用到的輔料指的是藥學(xué)上可接受的載體、賦形劑及其它添加劑形成的化合物，可采用乳糖或淀粉做載體，明膠，羧甲基纖維素鈉，甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮等是合適的結(jié)合劑或成顆劑。作為崩解劑可選用淀粉或微晶纖維素，常以滑石粉，膠體硅膠，硬脂酸甘油酯，硬脂酸鈣或鎂等作為合適的抗粘合劑和潤(rùn)滑劑。例如，可通過(guò)壓制濕顆粒來(lái)制備片劑?；钚猿煞峙c載體以及選擇性的與一份崩解添加劑組成混合物，該混合物與粘合劑的含水溶液，醇性或含水醇性溶液在合適的設(shè)備中進(jìn)行顆?；?，干燥顆粒隨后加入其它的崩解劑，潤(rùn)滑劑和抗粘劑將此混合物壓片。
[0009]本發(fā)明進(jìn)一步公開(kāi)了降鈣素基因相關(guān)肽與鮭魚(yú)降鈣素融合多肽在制備治療骨質(zhì)疏松藥物方面的應(yīng)用。
[0010]本發(fā)明同時(shí)也公開(kāi)了降鈣素基因相關(guān)肽與鮭魚(yú)降鈣素融合多肽在制備治療心肌缺血造成的心肌梗塞藥物方面的應(yīng)用。
[0011]經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證本發(fā)明降鈣素基因相關(guān)肽與鮭魚(yú)降鈣素融合多肽保留了降鈣素基因相關(guān)肽和鮭魚(yú)降鈣素各自的酶活性；而且偶聯(lián)反應(yīng)產(chǎn)生還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)的速度是同時(shí)加入兩種單一(降鈣素基因相關(guān)肽和鮭魚(yú)降鈣素)多肽的反應(yīng)體系反應(yīng)速度的兩倍以上，同 時(shí)過(guò)渡態(tài)時(shí)間(transienttime)大大縮短,縮短至原過(guò)渡態(tài)時(shí)間的1/4左右。
[0012]本發(fā)明為了提高msCT生物活性依據(jù)msCT生物活性對(duì)構(gòu)象依存性的現(xiàn)象從而對(duì)其氨基酸殘基進(jìn)行了改造，將msCT第8位的纈氨酸變?yōu)楦拾彼?、?6位的亮氨酸用丙氨酸置換、再刪除22位的酪氨酸(mSCT[Gly8，Ala16，del-Tyr22])，msCT的生物活性由4500IU/mg提高到 8600IU/mg。
[0013]本發(fā)明降鈣素基因相關(guān)肽與鮭魚(yú)降鈣素融合多肽C端酰胺化可提高降鈣素的活性約30倍C端酰胺化的本發(fā)明降鈣素基因相關(guān)肽與鮭魚(yú)降鈣素融合多肽生物學(xué)活性為4500IU/mg，C端非酰胺化的降鈣素基因相關(guān)肽與鮭魚(yú)降鈣素融合多肽生物學(xué)活性為100~200IU/mg)。
【具體實(shí)施方式】
[0014]下面結(jié)合實(shí)施例說(shuō)明本發(fā)明，這里所述實(shí)施例的方案，不限制本發(fā)明，本領(lǐng)域的專業(yè)人員按照本發(fā)明的精神可以對(duì)其進(jìn)行改進(jìn)和變化，所述的這些改進(jìn)和變化都應(yīng)視為在本發(fā)明的范圍內(nèi)，本發(fā)明的范圍和實(shí)質(zhì)由權(quán)利要求來(lái)限定。
[0015]實(shí)施例1
本實(shí)施方式降鈣素基因相關(guān)肽與鮭魚(yú)降鈣素融合多肽的氨基酸序列如下:AlaCysAspThrAlaThrCysValThrHisArgLeuAlaGlyLeuLeuSerArgSerGlyGlyValValLysAsnAsnPheVaIProThrAsnValGlySerLySAlaPheGlyThrCysSerAsnLeuSerThrCysGlyLeuGlyLysLeuSerGlnGIuAlaHi sLysLeuGlnThrProArgThrAsnThrGlySerGlyThrPro ;且降鈣素基因相關(guān)妝與鮭魚(yú)降鈣素融合多肽C端酰胺化。
[0016]本實(shí)施方式降鈣素基因相關(guān)肽與鮭魚(yú)降鈣素融合基因由上海生工公司合成，融合多肽系本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建菌株進(jìn)行轉(zhuǎn)入番茄后經(jīng)親和層析純化獲得。
[0017]本實(shí)施方式降鈣素基因相關(guān)肽與鮭魚(yú)降鈣素融合基因中有一段被稱為“親和手柄”(affinity handle)的編碼序列相連接，這段“親和手柄”可以與親和層析柱上的配基特異性地結(jié)合，這樣所表達(dá)的融合蛋白可以用親和層析的方法快速而簡(jiǎn)便地純化出來(lái)，所得到的融合多肽蛋白經(jīng)化學(xué)方法或酶法切割開(kāi)來(lái)之后，混合產(chǎn)物再上同一親和柱，充作“親和手柄”的一段多肽或蛋白以及尚未被切開(kāi)的融合蛋白被吸附于柱上，而重組目的產(chǎn)物則處于流動(dòng)相中。因此可得到較高純度的降鈣素基因相關(guān)肽與鮭魚(yú)降鈣素融合多肽。
[0018]本實(shí)施方式在降鈣素基因相關(guān)肽與鮭魚(yú)降鈣素融合多肽的C端加上一個(gè)Gly為肽酰甘氨酸?；瘑窝趺铬０坊峁┌被w。
[0019]本實(shí)施方式在CGRP和msCT`氨基酸序列之間設(shè)計(jì)一個(gè)Kpn I酶切位點(diǎn)(如氨基酸序列下劃線所示)，可用于驗(yàn)證陽(yáng)性克隆及其它基因操作。對(duì)本實(shí)施方式降鈣素基因相關(guān)肽與鮭魚(yú)降鈣素融合多肽進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn):
實(shí)驗(yàn)1:
將骨質(zhì)疏松模型大鼠隨機(jī)分成兩組(治療組和模型組)，以正常大鼠為空白對(duì)照組；治療組按體重0.g/kg劑量注射本實(shí)施方式降鈣素基因相關(guān)肽與鮭魚(yú)降鈣素融合多肽，模型組注射同等劑量的生理鹽水。實(shí)驗(yàn)進(jìn)行84天，對(duì)大鼠血清酸性磷酸酶(TRAP)、堿性磷酸酶(ALP)和骨鈣素(BGP)進(jìn)行檢測(cè)，并對(duì)大鼠進(jìn)行了骨密度測(cè)定。檢測(cè)結(jié)果如表1和表2所示。
[0020]表1大鼠血清TRAP、ALP、BGP測(cè)定結(jié)果(X土 S)
I 別鼠數(shù)TRAP(U/L)ALP(U/L)BGP(ug/L)
圣白對(duì)照組 _ 10 一 18.67±3.31 ' 152.84±21.081.20±0.25
_ 模型組 —10 一 29.96±3.05 ' 156.22±23.341.32±0.23
_ 治療組1019.25±4.23** 233.70±42.05* 1.97±0.18**
表2大鼠股骨、脛骨、腰椎密度值(X土S)
組別鼠數(shù)股骨(g/cm3)腔骨(g/cm3)腰椎(g/cm3)
空白對(duì)照組 10__0.61±0.04__0.58±0.03__0.62±0.04_
模型組 -10_ 0.41±0.12' 0.42±0.080.44±0.06
治療組100.59±0.07*0.59±0.05*0.58±0.04*根據(jù)表1和表2的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)說(shuō)明本實(shí)施方式降鈣素基因相關(guān)肽與鮭魚(yú)降鈣素融合多肽對(duì)骨質(zhì)疏松具有優(yōu)異的治療效果，證明本實(shí)施方式降鈣素基因相關(guān)肽與鮭魚(yú)降鈣素融合多肽具有鮭魚(yú)降鈣素活性。
[0021]實(shí)驗(yàn)2:
SD大鼠20只造成心肌缺血模型，然后隨機(jī)分成兩組(治療組和模型組)，治療組按體重2.5mg/kg劑量注射本實(shí)施方式降鈣素基因相關(guān)肽與鮭魚(yú)降鈣素融合多肽，模型組注射同等劑量的生理鹽水。實(shí)驗(yàn)進(jìn)行4次，對(duì)大鼠心肌進(jìn)行危險(xiǎn)區(qū)域(AAR)、壞死區(qū)(IS)及壞死區(qū)與危險(xiǎn)區(qū)域的比值檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如表3所示。
[0022]表3
【權(quán)利要求】
1.降鈣素基因相關(guān)肽與鮭魚(yú)降鈣素融合基因表達(dá)的多肽，其特征在于降鈣素基因相關(guān)肽與鮭魚(yú)降鈣素融合多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；且降鈣素基因相關(guān)肽與鮭魚(yú)降鈣素融合多肽C端酰胺化。
2.權(quán)利要求1所述的降鈣素基因相關(guān)肽與鮭魚(yú)降鈣素融合多肽，其中將msCT第8位的纈氨酸變?yōu)楦拾彼帷⒌?6位的亮氨酸用丙氨酸置換、再刪除22位的酪氨酸，msCT的生物活性由 4500IU/mg 提高到 8600IU/mg。
3.權(quán)利要求1所述的降鈣素基因相關(guān)肽與鮭魚(yú)降鈣素融合多肽，其中融合多肽生物學(xué)活性為4500IU/mg，C端非酰胺化的降鈣素基因相關(guān)肽與鮭魚(yú)降鈣素融合多肽生物學(xué)活性為 100 ~200IU/mg。
4.一種藥物組合物，其特征在于含有權(quán)利要求1所述的降鈣素基因相關(guān)肽與鮭魚(yú)降鈣素融合多肽及一種或多種藥用輔料。
5.權(quán)利要求4所述的組合物，其中所述的組合物為固體制劑或液體制劑。
6.權(quán)利要求5所述的組合物，其中所述的固體制劑為膠囊、軟膠囊、片劑、含片、顆粒劑或滴丸；液體制劑為口服液或注射液。
7.權(quán)利要求1所述的降鈣素基因相關(guān)肽與鮭魚(yú)降鈣素融合多肽在制備治療骨質(zhì)疏松藥物方面的應(yīng)用。
8.權(quán)利要求1所述的降鈣素基因相關(guān)肽與鮭魚(yú)降鈣素融合多肽在制備治療心肌缺血造成的心肌梗塞藥物方面的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A61K38/17GK103665167SQ201210328864
【公開(kāi)日】2014年3月26日 申請(qǐng)日期:2012年9月7日 優(yōu)先權(quán)日:2012年9月7日
【發(fā)明者】李虹 申請(qǐng)人:天津拓飛生物科技有限公司