專利名稱：一種水杉皮提取物及其制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及中藥領(lǐng)域，具體涉及ー種水杉皮提取物及其制備方法和用途。
背景技術(shù)：
水杉(Metasequoiaglyptostroboides Hu et Cheng)為杉科水杉屬植物，為單種屬植物，是我國特有的孑遺物種，被稱為“活化石”。水杉的化石發(fā)現(xiàn)其在中生代白堊紀(jì)和新生代廣泛分布于北半球，但在第四世紀(jì)冰期以后，水杉屬的其它種類全部滅絕。在20世紀(jì)40年代中期中國的植物學(xué)家在湖北、四川及湖南三省交界的局部地區(qū)發(fā)現(xiàn)水杉。水杉的栽培、繁殖技術(shù)成熟使得水杉成為國內(nèi)主要的園林綠化樹種，并在國外約50個(gè)國家和地區(qū)引種栽培。據(jù)《中國中藥資源志要》記載，水杉具有“祛風(fēng)燥濕，括血止痛”之功效，葉、果實(shí)有清熱解毒、消炎止痛的功效。水杉葉的化學(xué)成分比較復(fù)雜，含有黃酮類、萜類(倍半萜、半日花型ニ萜、松香烷型ニ萜和三萜等)、木脂素類和留醇等成分。水杉葉黃酮有高良姜素(5，6, 7-Trihydroxyflavone)、橙皮苷(Hesperidin)、斧菜素(Apigenin)、蘆丁 -7 葡萄糖苷(Luteolin-7-glucoside)、五輕黃酮(Tricetin-7-glucoside)、山萘酹-3-鼠李糖苷(Kampferol-3-rhamnoside)、楊梅樹皮素-3-鼠李糖苷(Myricetin-3-rhamnoside)、扁柏雙黃酮(Hinokif lavon)、異柳杉雙黃酮(Isocryptomerin)、阿曼托黃酮(Amentof Iavon)、阿曼托黃酮 _7〃，4〃- ニ 甲基醚(Amentoflavon_7〃，4〃_dimethylather)、金松雙黃酮(Sciadopitysin)>2, 3- ニ輕基扁柏雙黃酮(2，3-Dihydrohinokiflavon)>2, 3- ニ輕基金松雙黃酮(2，3-Dihydro sciadopitysin)等。水杉葉和種子中還有揮發(fā)油成分，以職烯、倍半萜烯及其含氧衍生物為主要成分的油狀液體，還存在ニ苯基甲烷等物質(zhì)。關(guān)于水杉藥理作用研究主要是針對水杉葉中的總黃酮和揮發(fā)油的作用。水杉總黃酮具有較好的抗大鼠血小板聚集和改善血液流變性的作用、抗實(shí)驗(yàn)性心肌肥厚和心律失常的作用及對缺血再灌注損傷心肌具有保護(hù)作用，對胰島素樣生長因子I (IGFl)誘導(dǎo)的乳鼠心肌成纖維細(xì)胞增殖和膠原的合成具有抑制作用，對大鼠腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用。水杉葉揮發(fā)油具有抗菌和抗氧化活性；如水杉葉甲醇提取物濃度為2mg/mL下對蘋果腐爛病菌、葡萄白腐病菌和葡萄黑痘病菌的抑制率超過50%，對蘋果腐爛病菌、棉花枯萎病菌、葡萄白腐病菌、葡萄黑痘病菌、瓜果腐霉菌、立枯絲核菌的EC50分別為I. 33mg/mL、4. 809mg/mL、2. 198mg/mL> I. 765mg/mL、2. 483mg/mL、5. 456mg/mL (水杉葉甲醇提取物的農(nóng)用抑菌活性研究，姜明凱等，《現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技》，2007年10期)。而有關(guān)水杉樹皮的研究未見報(bào)道
發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明提供了ー種具有很強(qiáng)的自由基清除作用和抗氧化能力的水杉皮提取物。本發(fā)明還提供了ー種水杉皮提取物的制備方法，該方法操作簡單、成本低，適于エ業(yè)化生產(chǎn)。本發(fā)明研究發(fā)現(xiàn)水杉樹皮與文獻(xiàn)報(bào)道的水杉葉化學(xué)成分有很大的差異，其主要含有兒茶素、表兒茶素、掊兒茶素、表掊兒茶素等原花色素単體及其聚合物，以及綠原酸等多酚酸類成分。原花色素，尤其是原花色素的低聚體(OPC)，是ー種強(qiáng)效的抗氧化劑和自由基清除劑，抗氧化能力是維生素E的50倍，是維生素C的20倍。經(jīng)過多年的臨床試驗(yàn)，世界各國研制出不少以原花色素為主要活性成分的醫(yī)藥產(chǎn)品，如法國海岸松提取物碧蘿芷(Pycnogenol )、葡萄籽提取物等,它們是強(qiáng)カ的抗氧化劑,具有延緩衰老、抗皺、抗過敏、抗輻射、防治心腦血管疾病等作用。ー種水杉皮提取物的制備方 法，包括步驟(I)將水杉樹皮粉末在提取劑中于25°C至回流溫度提取2小吋 24小時(shí)，濾除殘?jiān)玫教崛∫?；所述的提取劑為水、甲醇、こ醇、丙酮、こ酸こ酯中的ー種或兩種以上的混合溶液；(2)將步驟(I)中的提取液冷卻后過濾，濾液濃縮，得到一次濃縮液；(3)將步驟(2)中的一次濃縮液經(jīng)こ酸こ酯萃取，こ酸こ酯萃取液經(jīng)石油醚或氯仿脫脂和干燥，得到水杉皮提取物；或者，將步驟(2)中的一次濃縮液經(jīng)大孔吸附樹脂柱層析，收集洗脫液經(jīng)濃縮和干燥，得到水杉皮提取物。步驟(I)中，水杉樹皮粉末與提取劑的用量關(guān)系對于提取效果并沒有顯著的影響，因而不需進(jìn)行嚴(yán)格限定。為了達(dá)到更好的提取效果，優(yōu)選步驟(I)中，所述的提取劑選用水、甲醇、こ醇、丙酮、こ酸こ酯中的一種或水與甲醇、こ醇、丙酮、こ酸こ酯中的ー種的混合溶液，進(jìn)ー步優(yōu)選質(zhì)量百分濃度為50% 95%的こ醇水溶液。步驟(I)中，所述的水杉樹皮粉末的目數(shù)為20目 100目。步驟(3)中，將步驟(2)中的一次濃縮液經(jīng)こ酸こ酯萃取3次，合并こ酸こ酯萃取液后干燥并濃縮，得到二次濃縮液，二次濃縮液經(jīng)石油醚或氯仿脫脂和干燥，得到水杉皮提取物。步驟(3)中，所述的大孔吸附樹脂柱層析的洗脫液為甲醇、こ醇、丙酮、體積百分濃度為10% 95%的こ醇水溶液、體積百分濃度為10% 95%的丙酮水溶液或體積百分濃度為10% 95%的甲醇水溶液。所述的水杉皮提取物中原花色素和總多酚含量高，具有很強(qiáng)的自由基清除作用和抗氧化能力，可用于制備抗氧化劑或自由基清除劑，該水杉皮提取物還對酪氨酸酶和α-葡萄糖苷酶均具有抑制作用，對心血管具有保護(hù)作用，可用于制備具有抗衰老、美容護(hù)膚和/或預(yù)防和治療心血管疾病作用的藥物或者制備具有抗衰老、美容護(hù)膚和/或預(yù)防和治療心血管疾病作用的保健食品，還可以用于制備具有預(yù)防和治療糖尿病作用的藥物或者制備具有預(yù)防和治療糖尿病作用的保健食品。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)本發(fā)明水杉皮提取物含有較豐富的原花色素以及多酚酸類成分，具有很強(qiáng)的自由基清除作用和抗氧化能力，還對酪氨酸酶和α-葡萄糖苷酶均具有抑制作用，對心血管具有保護(hù)作用。
本發(fā)明水杉皮提取物的制備方法操作簡單、成本低，無需特殊的設(shè)備，適于エ業(yè)化生產(chǎn)。


圖I為水杉皮提取物清除DPPH自由基活性的清除率-濃度曲線；圖2為水杉皮提取物清除羥自由基活性的清除率-濃度曲線；圖3為水杉皮提取物清除超氧陰離子自由基活性的清除率-濃度曲線；圖4為水杉皮提取物對酪氨酸酶的抑制率-濃度曲線；圖5為水杉皮提取物對α -葡萄糖苷酶的抑制率-濃度曲線。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I水杉皮提取物的制備 Ikg水杉樹皮粗粉(40目)以25kg水50°C提取5小吋，濾除殘?jiān)玫?0L提取液，冷卻到20°C，過濾。濾液于40°C減壓濃縮至濾液總體積的1/5，得到一次濃縮液，以こ酸こ酯萃取3次，毎次こ酸こ酯用量為一次濃縮液體積的1/2，合并こ酸こ酯萃取液用無水硫酸鈉干燥，然后減壓濃縮到こ酸こ酯萃取液總體積的1/5，得到二次濃縮液，在機(jī)械攪拌下傾入二次濃縮液三倍體積的石油醚(沸程60°C _90°C)中。靜置沉淀，過濾，沉淀再以こ酸こ酯溶解，石油醚(沸程60°C -900C )沉淀純化，石油醚(沸程60°C -900C )洗滌，于40°C以下減壓干燥，得到水杉皮提取物，該水杉皮提取物樣品名記作SSW。SSW的原花色素重量百分含量為35. 6%，總多酚重量百分含量為48. 3%。實(shí)施例2水杉皮提取物的制備Ikg水杉樹皮粗粉(60目)以20kg質(zhì)量百分濃度為70%的こ醇水溶液回流提取3小吋，濾除殘?jiān)?，得?0L提取液，冷卻到30°C，過濾。濾液于40°C減壓濃縮至無醇味，得到一次濃縮液，加水至4L使混懸，混懸液以こ酸こ酯萃取3次，毎次こ酸こ酯用量為混懸液體積的1/2，合并こ酸こ酯萃取液用無水硫酸鈉干燥，然后減壓濃縮到こ酸こ酯萃取液總體積的1/5，得到二次濃縮液，在機(jī)械攪拌下傾入二次濃縮液三倍體積的石油醚(沸程60°C -90°C)中。靜置沉淀，過濾，沉淀再以こ酸こ酯溶解，石油醚(沸程60°C -90°C)沉淀純化，石油醚(沸程60°C _90°C )洗滌，于40°C以下減壓干燥，得到水杉皮提取物，該水杉皮提取物樣品名記作SSEl。SSEl的原花色素重量百分含量為44. 9%，總多酚重量百分含量為59. 2%。實(shí)施例3水杉皮提取物的制備Ikg水杉樹皮粗粉(20目)以20kg質(zhì)量百分濃度為95%的こ醇水溶液回流提取2小吋，濾除殘?jiān)?，得?0L提取液，冷卻到25°C，過濾。濾液于40°C減壓濃縮至無醇味，得到一次濃縮液，加水至4L使混懸，混懸液以こ酸こ酯萃取3次，毎次こ酸こ酯用量為混懸液體積的1/2，合并こ酸こ酯萃取液用無水硫酸鈉干燥，然后減壓濃縮到こ酸こ酯萃取液總體積的1/5，得到二次濃縮液，在機(jī)械攪拌下傾入二次濃縮液三倍體積的石油醚(沸程60°C -90°C)中。靜置沉淀，過濾，沉淀再以こ酸こ酯溶解，石油醚(沸程60°C _90°C)沉淀純化，石油醚、(沸程60°C _90°C )洗滌，于40°C以下減壓干燥，得到水杉皮提取物，該水杉皮提取物樣品名記作SSE2。SSE2的原花色素重量百分含量為46. 1%，總多酚重量百分含量為41. 7%。實(shí)施例4水杉皮提取物的制備Ikg水杉樹皮粗粉(80目)以20kg質(zhì)量百分濃度為70%的こ醇水溶液于25°C提取6小吋，濾除殘?jiān)玫?0L提取液，冷卻到28°C，過濾，濾液于40°C以下減壓濃縮至無醇味，得到一次濃縮液。一次濃縮液上DlOl型大孔吸附樹脂柱層析，先以3倍柱體積的水洗去雜質(zhì)，再用體積百分濃度為60%的こ醇水溶液進(jìn)行洗脫，直至薄層層析鑒別無明顯斑點(diǎn)。收集洗脫液，于40°C減壓濃縮至無醇味，冷凍干燥，得到水杉皮提取物，該水杉皮提取物樣品名記作SSE3。SSE3的原花色素重量百分含量為62. 8%，總多酚重量百分含量為65. 7%。實(shí)施例5
水杉皮提取物的制備Ikg水杉樹皮粗粉(100目)以20kg質(zhì)量百分濃度為70%的こ醇水溶液于25°C提取8小吋，濾除殘?jiān)?，得?0L提取液，冷卻到22°C，過濾，濾液于40°C以下減壓濃縮至無醇味，得到一次濃縮液。一次濃縮液上AB-8型大孔吸附樹脂柱層析，先以3倍柱體積的水洗去雜質(zhì)，再用體積百分濃度為60%的こ醇水溶液進(jìn)行洗脫，直至薄層層析鑒別無明顯斑點(diǎn)。收集洗脫液，于40°C減壓濃縮至無醇味，冷凍干燥，得到水杉皮提取物，該水杉皮提取物樣品名記作SSE4。SSE4的原花色素重量百分含量為63. 7%，總多酚重量百分含量為67. 2%。實(shí)施例6水杉皮提取物的自由基清除作用與機(jī)體老化相關(guān)的疾病及基因的突變，都與自由基的損傷有夫，因此保持機(jī)體足夠的抗氧化物質(zhì)，及時(shí)清除自由基，是抗衰老的重要手段。I. I, I- ニ苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基清除活性測定于96孔培養(yǎng)板中，加入O. 5mM(mmol/L)的DPPH無水こ醇溶液100 μ L和供試樣品溶液(溶劑為質(zhì)量百分濃度為2%的ニ甲基亞砜(DMSO)的水溶液)IOOyL,振搖后避光40°C反應(yīng)30min，反應(yīng)后以酶標(biāo)儀于492nm測定吸光度A，作為供試樣品組；同時(shí)設(shè)空白溶劑組(IOOyL無水こ醇和100 μ L質(zhì)量百分濃度為2%的DMSO的水溶液的混合液，其余同供試樣品組)、對照組(100 μ L DPPH無水こ醇溶液和100 μ L質(zhì)量百分濃度為2%的DMSO的水溶液的混合液，其余同供試樣品組)。DPPH自由基清除活性以清除率表示，清除率％= (Ac-As)/(Ac-Ab) X 100%, A。、As、Ab分別表示對照組、供試樣品組和空白溶劑組的吸光度，結(jié)果見圖I。2.羥自由基(0H ·)清除活性測定根據(jù)南京建成羥自由基試劑盒說明操作，于5ml離心管中，加入底物工作液和供試樣品溶液(溶劑為質(zhì)量百分濃度為2%的DMSO的水溶液)各O. 2mL,混合后37°C預(yù)熱，加經(jīng)37°C預(yù)熱的羥自由基試劑盒的試劑三O. 4mL后，于37°C反應(yīng)lmin，立即加羥自由基試劑盒的顯色劑(Griess試劑)2mL終止反應(yīng)，混勻后室溫放置20min，于550nm測吸光度值A(chǔ)，作為供試樣品組；同時(shí)設(shè)空白溶劑組(底物工作液以水代替，供試品溶液以質(zhì)量百分濃度為2%的DMSO的水溶液代替，其余同供試樣品組)、對照組(不加供試樣品溶液，其余同供試樣品組)。羥基自由基清除活性以清除率表示，清除率％= (Ac-As) / (Ac-Ab) X 100%, Ac,As,Ab分別表示對照組、供試樣品組和空白溶劑組的吸光度，結(jié)果見圖2。
3.超氧陰離子自由基(O2 · _)清除活性測定根據(jù)南京建成抑制與產(chǎn)生超氧陰離子自由基試劑盒說明操作，于5mL離心管中，加入抑制與產(chǎn)生超氧陰離子自由基試劑盒的試劑ー lmL，供試樣品溶液(溶劑為質(zhì)量百分濃度為2%的DMSO的水溶液)50 μ L，抑制與產(chǎn)生超氧陰離子自由基試劑盒的試劑ニ、抑制與產(chǎn)生超氧陰離子自由基試劑盒的試劑三、抑制與產(chǎn)生超氧陰離子自由基試劑盒的試劑四各O. ImL,混勻后，于37°C反應(yīng)40min，加抑制與產(chǎn)生超氧陰離子自由基試劑盒的顯色劑(Griess試劑)2mL,混勻,避光放置IOmin后,550nm測定吸光度A,作為供試樣品組；同時(shí)設(shè)空白溶劑組(不加供試樣品溶液，顯色劑以質(zhì)量百分濃度為25%的冰醋酸水溶液代替，其余同供試樣品組)、對照組(不加供試樣品溶液，其余同供試樣品組)。超氧陰離子自由基清除活性以清除率表示，清除率％= (Ac-As) / (Ac-Ab) X 100%, Ac,As,Ab分別表示對照組、供試樣品組和空白溶劑組的吸光度，結(jié)果見圖3。
由圖I 3可見，水杉皮提取物SSW、SSE1、SSE2和SSE3均具有清除DPPH自由基、羥自由基(0H ·)和超氧陰離子自由基(O2 · _)的能力。清除DPPH自由基活性，SSE1、SSE2和SSE3強(qiáng)于法國海岸松標(biāo)準(zhǔn)提取物(PCG,Maritime Pine Extract,符合美國藥典標(biāo)準(zhǔn));清除OH ·活性，SSE1、SSE3強(qiáng)于PCG ;清除O2 · ^活性、高濃度時(shí)SSE2、SSE3、SSff強(qiáng)于PCG。實(shí)施例7水杉皮提取物對酪氨酸酶的抑制作用酪氨酸酶是生物體合成黑色素的關(guān)鍵酶，酪氨酸酶抑制劑就是通過抑制酪氨酸酶活性從而抑制黑色素的生成，因而可用于預(yù)防和治療色素沉著和黑色素瘤等，也可作為化妝品添加劑用于美白、保護(hù)皮膚等。在96孔板中，200 μ I反應(yīng)體系中加酪氨酸酶(終濃度400U/ml)和供試品或陽性對照藥各50μ (ΜρΗ=7.4ΡΒ5 (磷酸鹽緩沖液)溶解)，37°C反應(yīng)lOmin，加底物L(fēng)-酪氨酸100 μ L (終濃度ImM)后，37°C反應(yīng)30min，酶標(biāo)儀490nm處測定吸光度，計(jì)算供試品或曲酸(kojic)對酪氨酸酶的抑制率，抑制率％= (Ac-As)/(Ac-Ab) X 100%, A。、As、Ab分別表示對照組、供試品組和空白溶劑組的吸光度，結(jié)果見圖4。由圖4結(jié)果可知，水杉皮提取物SSEl，SSE3能夠濃度依賴性地抑制酪氨酸酶的活性，抑制活性強(qiáng)于法國海岸松標(biāo)準(zhǔn)提取物(PCG, Maritime Pine Extract,符合美國藥典標(biāo)準(zhǔn))，低濃度O. 8-20 μ g/ml時(shí)與酪氨酸酶抑制劑曲酸的抑制活性相當(dāng)，高濃度100 μ g/ml時(shí)抑制活性弱于酪氨酸酶抑制劑曲酸。實(shí)施例8水杉皮提取物的心血管保護(hù)作用I.對大鼠凝血功能的影響雄性SD大鼠90只，體重180_220g，隨機(jī)分為9組，即正常對照組、模型對照組、SSEl 18、6、2mg/kg劑量組、SSE3 18、6、2mg/kg劑量組，每組10只，各藥物組大鼠ig給藥，正常對照組和模型對照組大鼠ig給予等體積水，每天I次，共10天。于第9天給藥后，除正常對照組外，其余各組大鼠皮下注射給予腎上腺素O. Smg · kg-1共2次，間隔時(shí)間為4h。第I次皮下給予腎上腺素后2h，將大鼠至于0°C冰水中游泳5min，2h后再第二次給予腎上腺素，造成大鼠急性血瘀癥。于末次給藥后lh，腹主動(dòng)脈取血，3. 8%檸檬酸鈉抗凝血(枸櫞酸鈉全血為I :9，V/V)，按試劑盒的要求進(jìn)行凝血酶原時(shí)間(PT)、凝血酶時(shí)間(TT)、活化部分凝血活酶時(shí)間(APTT)、血漿纖維蛋白原(FIB)的測定。表1SSE1、SSE3對腎上腺素致血瘀大鼠凝血功能的影響(文士SD)
權(quán)利要求
1.一種水杉皮提取物的制備方法，包括步驟 (1)將水杉樹皮粉末在提取劑中于25°c至回流溫度提取2小時(shí) 24小時(shí)，濾除殘?jiān)?，得到提取液? 所述的提取劑為水、甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯中的一種或兩種以上的混合溶液； (2)將步驟(I)中的提取液冷卻后過濾，濾液濃縮，得到一次濃縮液； (3)將步驟(2)中的一次濃縮液經(jīng)乙酸乙酯萃取，石油醚或氯仿脫脂和干燥，得到水杉皮提取物； 或者，將步驟(2)中的一次濃縮液經(jīng)大孔吸附樹脂柱層析，收集洗脫液經(jīng)濃縮和干燥，得到水杉皮提取物。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的水杉皮提取物的制備方法，其特征在于，步驟(I)中，所述的提取劑為水、甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯中的一種或水與甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯中的一種的混合溶液。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的水杉皮提取物的制備方法，其特征在于，步驟(I)中，所述的水杉樹皮粉末的目數(shù)為20目 100目。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的水杉皮提取物的制備方法，其特征在于，步驟(3)中，將步驟(2)中的一次濃縮液經(jīng)乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯萃取液后干燥并濃縮，得到二次濃縮液，二次濃縮液經(jīng)石油醚或氯仿脫脂和干燥，得到水杉皮提取物。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的水杉皮提取物的制備方法，其特征在于，步驟(3)中，所述的大孔吸附樹脂柱層析的洗脫液為甲醇、乙醇、丙酮、體積百分濃度為10% 95%的乙醇水溶液、體積百分濃度為10% 95%的丙酮水溶液或體積百分濃度為10% 95%的甲醇水溶液。
6.根據(jù)權(quán)利要求I 5任一項(xiàng)所述的水杉皮提取物的制備方法制備的水杉皮提取物。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的水杉皮提取物在制備抗氧化劑或自由基清除劑中的應(yīng)用。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的水杉皮提取物在制備具有抗衰老、美容護(hù)膚和/或預(yù)防和治療心血管疾病作用的藥物或者保健食品中的應(yīng)用。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的水杉皮提取物在制備具有預(yù)防和治療糖尿病作用的藥物或者保健食品中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種水杉皮提取物及其制備方法和用途，其制備包括(1)將水杉樹皮粉末在提取劑中于25℃至回流溫度提取2小時(shí)～24小時(shí)，濾除殘?jiān)?，得到提取液?2)將提取液冷卻后過濾，濾液濃縮得到一次濃縮液；(3)將一次濃縮液經(jīng)乙酸乙酯萃取，石油醚或氯仿脫脂和干燥，得到水杉皮提取物；或者，將一次濃縮液經(jīng)大孔吸附樹脂柱層析，收集洗脫液經(jīng)濃縮和干燥，得到水杉皮提取物；該方法操作簡單、成本低，無需特殊的設(shè)備，適于工業(yè)化生產(chǎn)。該水杉皮提取物含有較豐富的原花色素以及多酚類成分，具有很強(qiáng)的自由基清除作用和抗氧化能力、酪氨酸酶抑制作用、α-葡萄糖苷酶抑制作用和心血管保護(hù)作用。
文檔編號(hào)A61P39/06GK102727536SQ20121018413
公開日2012年10月17日 申請日期2012年6月4日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月24日
發(fā)明者葉益萍, 徐世芳, 李曉譽(yù), 陳峰陽 申請人:浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院