專利名稱：一種鼻咽癌靶向磁共振對(duì)比劑及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)生物材料領(lǐng)域，尤其是一種LMPl+-鼻咽癌靶向磁共振對(duì)比劑及其制備方法。
背景技術(shù)：
腫瘤是當(dāng)今影響人類健康的主要疾病之一，世界衛(wèi)生組織的一項(xiàng)報(bào)道表明，隨著全球人類生存環(huán)境的變化，全球惡性腫瘤的發(fā)生率將由現(xiàn)在的1000萬(wàn)人/年上升到1500 萬(wàn)人/年，成為威脅人類健康的頭號(hào)殺手。在我國(guó)(特別是華南地區(qū))，近年來(lái)，鼻咽癌的發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，全世界80%的鼻咽癌病例發(fā)生在中國(guó)。鼻咽癌病理類型主要為非角化型未分化癌，易出現(xiàn)頸部淋巴結(jié)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移；在首程診療患者中，III-IV期患者占了 70% -80%。放射治療在過(guò)去很長(zhǎng)一段時(shí)間都是鼻咽癌的標(biāo)準(zhǔn)治療手段，鼻咽癌治療的5年生存率I-II期在60%左右，III-IV期則生存率很低， 僅20%-40%，治療失敗的主要原因是局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。此外，中晚期鼻咽癌放化療后嚴(yán)重副反應(yīng)有時(shí)難以避免，因此，早期發(fā)現(xiàn)鼻咽癌并進(jìn)行準(zhǔn)確診斷對(duì)其預(yù)后至關(guān)重要。EB病毒(Epstein-Barr Virus, EBV)是鼻咽癌的主要病因， EBV-LMPl (Epstein-Barr Virus Latent membrane protein 1) B^^J^IgS , ^ EBV永生化基因中唯一能夠轉(zhuǎn)化體外培養(yǎng)的人和嚙齒類動(dòng)物細(xì)胞并使細(xì)胞獲得“永生”的基因。其中EB病毒編碼的潛伏膜蛋白LMPl(Latent membrane protein 1)在鼻咽癌病人中陽(yáng)性率超過(guò)65%，是重要的致瘤蛋白，是目前廣泛認(rèn)可的鼻咽癌細(xì)胞表面的標(biāo)志性抗原。有望成為臨床診斷及治療的靶標(biāo)，且潛伏膜蛋白陽(yáng)性鼻咽癌的增殖能力、侵襲和轉(zhuǎn)移能力均明顯強(qiáng)于潛伏膜蛋白陰性鼻咽癌，兩者對(duì)腫瘤治療方案的反應(yīng)也有較大差異。因此對(duì)鼻咽癌進(jìn)行進(jìn)一步的分型有明顯的臨床意義和科學(xué)價(jià)值。我們研制的i^304-APTES-PEG-LMPl， Clone CS. 1_4磁共振對(duì)比劑不僅僅可用于鼻咽癌的影像診斷，而且可以利用MRI對(duì)鼻咽癌進(jìn)行進(jìn)一步分型。磁共振(Magnetic Resonance Imaging，MRI)因其具有精確的軟組織分辨率，無(wú) X射線引起的輻射損傷，在腫瘤的診斷和療效的監(jiān)測(cè)中正在扮演著越來(lái)越重要的角色，磁共振對(duì)比齊Ll (Contrast agent for Magnetic resonance imaging,MRICA)能顯著提高正常與異常組織之間的對(duì)比度，特別是提高腫瘤組織與周圍正常組織的之間的信噪比，提高早期腫瘤的診斷的準(zhǔn)確率。常規(guī)磁共振成像往往對(duì)這種腫瘤的早期準(zhǔn)確診斷存在較大困難。目前全世界醫(yī)院運(yùn)用最多的陰性/陽(yáng)性磁共振對(duì)比劑主要是非特異性對(duì)比劑，按照磁化性能分為陽(yáng)性對(duì)比劑及陰性對(duì)比劑兩大類。陽(yáng)性對(duì)比劑主要為含釓與含錳螯合物， 其馳豫性能低，由于游離釓與錳對(duì)生物體具有較強(qiáng)的毒性，如釓(Gd)等的毒性反應(yīng)(可以引起腎纖維化等)，且其是一種血池性對(duì)比劑，其使用范圍較窄。其作用主要是縮短自旋晶格弛豫時(shí)間(Tl馳豫時(shí)間)，使靶組織的Tl信號(hào)加強(qiáng)，在磁共振上呈高信號(hào)，因此，又叫Tl 相對(duì)比齊LU 例如[Gd(DTPA)]. sup. 2- (diethylenetriaminepentaacetate-gadolinium(II I)), [Gd(DOTA)]. sup. -(1,4,7,10-tetraazacyclododecane-N,N' ,N" ,N' ‘’ —tetraacetate-gadolinium(III))，[Gd(BOPTA)]. sup. 2-(benzylo xypropioic-diethylenetriamine pentaacetate-gadolinium(III))禾口 MnDPDP(N, N' -dipyridoxylethy Iene diamine-N, N' -diacetate-5,5' -bis (phosphate)-manganese (II))。陰性對(duì)比劑又叫 T2 相對(duì)比劑， 主要是使局部磁場(chǎng)不均勻，進(jìn)而減少自旋弛豫時(shí)間(T2馳豫時(shí)間)，使得靶向組織T2相信號(hào)減低，馳豫性能高。臨床上的陰性對(duì)比劑主要以菲立磁為代表，但是菲立磁也是一種非特異性磁共振對(duì)比劑。與釓對(duì)比劑相比，其特點(diǎn)如下1)能夠進(jìn)入血管周圍間隙，是一種血管間隙對(duì)比劑，因此，其使用范圍更廣泛；幻每單位金屬鐵能夠產(chǎn)生更多的信號(hào)強(qiáng)度的改變， 馳豫性能高，尤其在T2WI序列；幻在體內(nèi)具有生物可降解性，可經(jīng)細(xì)胞內(nèi)正常代謝途徑而進(jìn)入體內(nèi)鐵循環(huán)，參與體內(nèi)鐵的生命活動(dòng)；4)菲立磁經(jīng)過(guò)普魯士藍(lán)染色等方法染色，可以被光鏡或電鏡直接觀察到，因此，更有可能成為腫瘤磁共振靶向?qū)Ρ葎┑男盘?hào)組件。缺點(diǎn)是在體內(nèi)易被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)和免疫吞噬細(xì)胞吞噬，因而半衰期短、對(duì)腫瘤的主動(dòng)靶向聚集功能較弱。而要改變其生物相容性，延長(zhǎng)其血液中的循環(huán)時(shí)間，增強(qiáng)其靶向性能，主要通過(guò)對(duì) Fe3O4納米微粒進(jìn)行表面改性。可以成為表面修飾材料有多種，如多糖，白蛋白、APTES等。 為了減少其空間位阻，在I^e3O4與靶向分子之間插入一個(gè)柔軟的連接臂作為一種鏈繩結(jié)構(gòu)， 其系著抗原的游離端活動(dòng)度大，在靶區(qū)能為抗原與抗體結(jié)合提供相對(duì)較長(zhǎng)的接觸時(shí)間與更多的接觸機(jī)會(huì)，造影劑和靶器官之間的結(jié)合便更加緊密。合成一種價(jià)格低廉的、生物相容性好的、特異性強(qiáng)的鼻咽癌靶向磁共振對(duì)比劑，解決以往對(duì)比劑的不足，具有潛在的產(chǎn)業(yè)化前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種LMPl+-鼻咽癌特異性陰性對(duì)比劑及其制備方法，使得對(duì)比劑與現(xiàn)有技術(shù)相比具有低毒性，形態(tài)可控，高穩(wěn)定性，好的生物相容性，高敏感性，好的特異靶向性，該對(duì)比劑可以用于人體或非人體LMPl+-鼻咽癌增強(qiáng)對(duì)比劑。本發(fā)明的目的可以通過(guò)以下方式實(shí)現(xiàn)一種鼻咽癌靶向磁共振對(duì)比劑，是用3-氨丙基三乙氧基硅烷(apteq包覆或連接到超順磁性四氧化三鐵上，使狗304表面氨基化，得到!^3O4-aptes表面改性微粒，再將聚乙二醇(peg)作為!^3O4-aptes表面改性微粒與eb病毒潛伏膜蛋白1單克隆抗體(簡(jiǎn)寫為 LMPLClone CS. 1-4 ；購(gòu)于DAKO公司，購(gòu)買時(shí)間2008. 05. 05)之間的連接臂，將二者連接起來(lái)，得到的分散穩(wěn)定的!^3O4-Aptes-Peg-LMPI, Clone CS. 1-4膠體溶液。所述的超順fi53o4是采用化學(xué)共沉淀的方法合成的粒徑為10-15nm顆粒。
所述的 fii3O4-APTES-PEG-LMPl，Clone CS. 1-4 膠體微粒粒徑為 20_30nm。所述的鼻咽癌靶向磁共振對(duì)比劑是將超順狗304與3-氨丙基三乙氧基硅烷混合反應(yīng)，通過(guò)離心，超濾，和透析純化納米粒子；得到!^3O4-APTES表面改性微粒，然后與PEG連接；再將LMP1，Clone CS. 1-4和帶有PEG連接臂的!^3O4-APTES表面改性微?；旌?，冰浴中攪拌過(guò)夜；借助于外磁場(chǎng)的作用對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行磁性分離，再經(jīng)過(guò)洗滌，分散得到的磁共振對(duì)比劑。Fe3O4與APTES反應(yīng)摩爾比為0. 1 1-20 1 ；兩者反應(yīng)30分鐘_1小時(shí)。!^e3O4-APTES表面改性微粒與PEG的反應(yīng)摩爾比為0. 1 1-20 1，兩者反應(yīng)30 分鐘-1小時(shí)。
帶有PEG連接臂的!^e3O4-APTES表面改性微粒和LMPl，Clone CS. 1-4以Fii3O4/單抗的摩爾比1 1-100 1混合反應(yīng)。Fe3O4與APTES的摩爾比優(yōu)選為1 1-10 1，F(xiàn)e3O4與PEG摩爾比優(yōu)選為 1 1-10 1，帶有PEG連接臂的!^e3O4-APTES表面改性微粒和 LMPl,Clone CS. 1—4 以Fii3O4/ 單抗的摩爾比優(yōu)選為10 1-100 1。一種鼻咽癌靶向磁共振對(duì)比劑的制備方法，將超順磁性!^e3O4與3-氨丙基三乙氧基硅烷混合反應(yīng)，通過(guò)離心，超濾，和透析純化納米粒子；得到!^3O4-APTES表面改性微粒， 然后與PEG連接；再將LMP1，Clone CS. 1-4和帶有PEG連接臂的!^3O4-APTES表面改性微粒混合，冰浴中攪拌過(guò)夜；借助于外磁場(chǎng)的作用對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行磁性分離，再經(jīng)過(guò)洗滌，分散得到磁共振對(duì)比劑。所述的超順Fe53O4是采用化學(xué)共沉淀的方法合成的粒徑為10-15nm顆粒。!^e3O4與APTES反應(yīng)摩爾比為0. 1 1-20 1 ；兩者反應(yīng)30分鐘_1小時(shí)； Fe3O4-APTES表面改性微粒與PEG的反應(yīng)摩爾比為0. 1 1-20 1 ；兩者反應(yīng)30分鐘-1小時(shí)；帶有PEG連接臂的!^e3O4-APTES表面改性微粒和LMP1，Clone CS. 1-4以!^e3O4/單抗的摩爾比1 1-100 1混合反應(yīng)。一種LMPl+-鼻咽癌特異性陰性磁共振對(duì)比劑是運(yùn)用Discovery Studio和 Autodock等計(jì)算機(jī)模擬藥物分子設(shè)計(jì)軟件構(gòu)建的分子設(shè)計(jì)平臺(tái)進(jìn)行設(shè)計(jì)，并通過(guò)以上方法制備而成。本發(fā)明的優(yōu)勢(shì)本發(fā)明制備的LMPl+-鼻咽癌特異性陰性磁共振對(duì)比劑，所產(chǎn)生的!^e3O4-LMPl是生物相容性好的磁共振對(duì)比劑，具有超順磁性。體外細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，該對(duì)比劑對(duì)血細(xì)胞形態(tài)無(wú)明顯影響，對(duì)腎細(xì)胞生長(zhǎng)無(wú)明顯影響，體內(nèi)大鼠急性動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，該對(duì)比劑安全性好， 無(wú)1例動(dòng)物死亡，可以從腎臟排除，不存在體內(nèi)長(zhǎng)期聚集問題。解決了常規(guī)含釓對(duì)比劑腎臟等毒性問題，解決了常規(guī)狗304生物相容性差，易聚集于受體肝脾等網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的問題。本發(fā)明制備的LMPl+-鼻咽癌特異性陰性磁共振對(duì)比劑，體外細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)證實(shí)， 磁性細(xì)胞分選儀顯示其敏感性為85.9%，同時(shí)，它具有高度特異靶向LMP-Γ鼻咽癌細(xì)胞 (CNE1-LMP1細(xì)胞株)的能力，特異性為75. 51 %，體內(nèi)裸鼠荷瘤模型MR成像實(shí)驗(yàn)證實(shí)，其對(duì) LMP-I+鼻咽癌腫瘤顯像的敏感性及特異性為85. 7%及71. 4%，且具有高馳豫性能，該對(duì)比劑在主要聚集于LMP-Γ鼻咽癌瘤灶區(qū)。解決了常規(guī)磁共振對(duì)比劑低馳豫性能，對(duì)鼻咽癌低敏感性及低特異性，MRI診斷正確率低的問題。本發(fā)明制備的!^3O4-Aptes-Peg-LMPI,Clone CS. 1-4 磁共振對(duì)比劑，經(jīng) APTES、PE6 與LMPl，Clone CS. 1-4表面改性及修飾后，具有良好的分散性能，解決了顆粒團(tuán)聚易至動(dòng)物死亡的問題，提升其臨床應(yīng)用價(jià)值。


圖1為本發(fā)明的主要工藝流程圖及檢測(cè)實(shí)驗(yàn)步驟示意圖；圖 2Fi5304-APTES-PEG-LMPl，Clone CS. 1-4 與 LMP-Γ 鼻咽癌進(jìn)行特異性結(jié)合光學(xué)顯微圖(X1000)；2-1為L(zhǎng)MPl靶向?qū)Ρ葎┡cCNE1-LMP1細(xì)胞共孵后油鏡下成像；4/8頁(yè)2-2為L(zhǎng)MPl靶向?qū)Ρ葎┡cCNEl細(xì)胞共孵后油鏡下成像；圖 3Fi5304-APTES-PEG-LMPl，Clone CS. 1-4 與 LMP-Γ 鼻咽癌靴共孵后 MRI 成像圖； 肉眼觀察即可發(fā)現(xiàn)T2WI信號(hào)強(qiáng)度降低程度隨著細(xì)胞數(shù)量級(jí)的遞增；圖 4Fe304-APTES-PEG-LMPl，Clone CS. 1-4 對(duì)荷鼻咽癌 LMPl+ 和鼻咽癌 LMPr 雙瘤動(dòng)物MRI成像圖；4-1，4-2分別為裸鼠T1、T2序列圖像，證明模型造瘤成功，箭頭所指為CNE+LMP1腫瘤，4-3為經(jīng)裸鼠尾靜脈注射LMPl-Fe3O4后在Τ2序列，可見右側(cè)LMPl+信號(hào)明顯降低，而左側(cè)LMPr鼻咽癌腫塊信號(hào)無(wú)明顯變化。圖5荷鼻咽癌LMPl+和鼻咽癌LMP1—雙瘤動(dòng)物模型LMPl抗原表達(dá)的免疫組化分析圖(Χ200)；5-1為L(zhǎng)MPl+鼻咽癌細(xì)胞細(xì)胞膜上見棕黃色染色，LMPl表達(dá)陽(yáng)性；5-2為L(zhǎng)MPl-鼻咽癌細(xì)胞表達(dá)LMPl陰性；圖 6Fe304-APTES-PEG-LMPl，Clone CS. 1-4 增強(qiáng)掃描后，對(duì)荷鼻咽癌 LMPl+ 和鼻咽癌LMP1_雙瘤動(dòng)物普魯士蘭染色圖；6-l，CNEl_LMPl移植瘤腫塊組織內(nèi)見大量、顯示清晰的藍(lán)染鐵顆粒，說(shuō)明腫瘤組織中LMPl靶向?qū)Ρ葎┚奂己茫?-2，CNEl移植瘤腫塊組織內(nèi)只可見少許藍(lán)染鐵顆粒(箭頭所示)。與前圖相比差異明顯，從而表明LMPl靶向!^e3O4對(duì)于裸小鼠荷人鼻咽癌CNE1-LMP1 移植瘤腫塊具有一定的靶向效應(yīng)。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合實(shí)施例旨在進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，而非限制本發(fā)明。實(shí)施例1取0. 5mmoL氯化亞鐵和1. 2mmoL氯化鐵水溶液混合，加入事先配制好的15mL十二烷基苯磺酸鈉(DBS)溶液05mM)，待溶液成為乳白色后，加入75mL甲苯，高速攪拌30min 讓溶液混合均勻，滴加濃度為2. 5M的NaOH溶液調(diào)pH值至8_9，繼續(xù)攪拌lh。將混合溶液轉(zhuǎn)入分液漏斗靜置分層，可見顆粒分散于上層甲苯溶液中，分掉水層，將上層黑液轉(zhuǎn)入三口瓶中，此時(shí)先通氬氣除氧，然后緩慢升溫，蒸出溶液中的水和部分甲苯后回流半小時(shí)，再與 3-氨丙基三乙氧基硅烷按照摩爾比0.1 1，溶解于水中進(jìn)行混合。將該混合物置于純氬氣環(huán)境中，回流半小時(shí)，使磁鐵礦結(jié)晶，通過(guò)離心，超濾，和透析純化納米粒子。產(chǎn)生顆粒均勻的納米微粒，然后與PEG連接臂按照摩爾比0.1 1反應(yīng)半小時(shí)，進(jìn)行共價(jià)偶聯(lián)，再以!^e3O4/ 單抗的摩爾比1 1取PEG連接的APTES修飾的Fe3O4納米磁流體和LMP1, Clone CS. 1-4 混合，置于冰浴中，攪拌過(guò)夜。借助于外磁場(chǎng)的作用對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行磁性分離，用超純水和無(wú)水乙醇交替洗滌4-5遍，經(jīng)透析除去雜質(zhì)后分散于超純水中，就得到鼻咽癌抗體修飾的!^e3O4 納米磁流體，粒徑20-30nm ；加分散劑(油酸酰，用量0. 2% 0. 5% )超聲分散30分鐘后， 得到所述的磁共振對(duì)比劑的濃度為0. 25mmol/ml。實(shí)施例2 取0. 5mmoL氯化亞鐵和1. 2mmoL氯化鐵水溶液混合，加入事先配制好的15mL十二烷基苯磺酸鈉(DBQ溶液05mM)，待溶液成為乳白色后，加入75mL甲苯，高速攪拌30min 讓溶液混合均勻，滴加濃度為2. 5M的NaOH溶液調(diào)pH值至8_9，繼續(xù)攪拌lh。將混合溶液
6轉(zhuǎn)入分液漏斗靜置分層，可見顆粒分散于上層甲苯溶液中，分掉水層，將上層黑液轉(zhuǎn)入三口瓶中，此時(shí)先通氬氣除氧，然后緩慢升溫，蒸出溶液中的水和部分甲苯后回流半小時(shí)，再與 3-氨丙基三乙氧基硅烷按照摩爾比0.1 1，溶解于水中進(jìn)行混合。將該混合物置于純氬氣環(huán)境中，回流半小時(shí)，使磁鐵礦結(jié)晶，通過(guò)離心，超濾，和透析純化納米粒子。產(chǎn)生顆粒均勻的納米微粒，然后與PEG連接臂按照摩爾比0.1 1反應(yīng)半小時(shí)，進(jìn)行共價(jià)偶聯(lián)，再以!^e3O4/ 單抗的摩爾比10 1取PEG連接的APTES修飾的Fe3O4納米磁流體和LMPl，Clone CS. 1-4 混合，置于冰浴中，攪拌過(guò)夜。借助于外磁場(chǎng)的作用對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行磁性分離，用超純水和無(wú)水乙醇交替洗滌4-5遍，經(jīng)透析除去雜質(zhì)后分散于超純水中，就得到鼻咽癌抗體修飾的!^e3O4 納米磁流體，粒徑20-30nm;加分散劑(油酸酰.用量0. 2% 0. 5% )超聲分散30分鐘后， 得到所述的磁共振對(duì)比劑的濃度為0. 25mmol/ml。實(shí)施例3取0. 5mmoL氯化亞鐵和1. 2mmoL氯化鐵水溶液混合，加入事先配制好的15mL十二烷基苯磺酸鈉(DBQ溶液05mM)，待溶液成為乳白色后，加入75mL甲苯，高速攪拌30min 讓溶液混合均勻，滴加濃度為2. 5M的NaOH溶液調(diào)pH值至8_9，繼續(xù)攪拌lh。將混合溶液轉(zhuǎn)入分液漏斗靜置分層，可見顆粒分散于上層甲苯溶液中，分掉水層，將上層黑液轉(zhuǎn)入三口瓶中，此時(shí)先通氬氣除氧，然后緩慢升溫，蒸出溶液中的水和部分甲苯后回流半小時(shí)，再與 3-氨丙基三乙氧基硅烷按照摩爾比0.1 1，溶解于水中進(jìn)行混合。將該混合物置于純氬氣環(huán)境中，回流半小時(shí)，使磁鐵礦結(jié)晶，通過(guò)離心，超濾，和透析純化納米粒子。產(chǎn)生顆粒均勻的納米微粒，然后與PEG連接臂按照摩爾比0.1 1反應(yīng)半小時(shí)，進(jìn)行共價(jià)偶聯(lián)，再以!^e3O4/ 單抗的摩爾比1 1取PEG連接的APTES修飾的Fe3O4納米磁流體和LMP1, Clone CS. 1-4 混合，置于冰浴中，攪拌過(guò)夜。借助于外磁場(chǎng)的作用對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行磁性分離，用超純水和無(wú)水乙醇交替洗滌4-5遍，經(jīng)透析除去雜質(zhì)后分散于超純水中，就得到鼻咽癌抗體修飾的!^e3O4 納米磁流體，粒徑20-30nm ；加分散劑(己烯基雙硬脂酰胺.用量為0. 5% 2% )超聲分散30分鐘后，得到所述的磁共振對(duì)比劑的濃度為0. 25mmol/ml。。實(shí)施例4取0. 5mmoL氯化亞鐵和1. 2mmoL氯化鐵水溶液混合，加入事先配制好的15mL十二烷基苯磺酸鈉(DBQ溶液05mM)，待溶液成為乳白色后，加入75mL甲苯，高速攪拌30min 讓溶液混合均勻，滴加濃度為2. 5M的NaOH溶液調(diào)pH值至8_9，繼續(xù)攪拌lh。將混合溶液轉(zhuǎn)入分液漏斗靜置分層，可見顆粒分散于上層甲苯溶液中，分掉水層，將上層黑液轉(zhuǎn)入三口瓶中，此時(shí)先通氬氣除氧，然后緩慢升溫，蒸出溶液中的水和部分甲苯后回流半小時(shí)，再與 3-氨丙基三乙氧基硅烷按照摩爾比1 1，溶解于水中進(jìn)行混合。將該混合物置于純氬氣環(huán)境中，回流半小時(shí)，使磁鐵礦結(jié)晶，通過(guò)離心，超濾，和透析純化納米粒子。產(chǎn)生顆粒均勻的納米微粒，然后與PEG連接臂按照摩爾比1 1反應(yīng)半小時(shí)，進(jìn)行共價(jià)偶聯(lián)，再以!^e3O4/單抗的摩爾比1 1取PEG連接的APTES修飾的Fe3O4納米磁流體和LMPl，Clone CS. 1-4混合，置于冰浴中，攪拌過(guò)夜。借助于外磁場(chǎng)的作用對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行磁性分離，用超純水和無(wú)水乙醇交替洗滌4-5遍，經(jīng)透析除去雜質(zhì)后分散于超純水中，就得到鼻咽癌抗體修飾的!^e3O4納米磁流體，粒徑20-30nm ；加分散劑(己烯基雙硬脂酰胺.用量為0. 5% 2% )超聲分散 30分鐘后，得到所述的磁共振對(duì)比劑的濃度為0. 25mmol/ml。。實(shí)施例5
取0. 5mmoL氯化亞鐵和1. 2mmoL氯化鐵水溶液混合，加入事先配制好的15mL十二烷基苯磺酸鈉(DBS)溶液05mM)，待溶液成為乳白色后，加入75mL甲苯，高速攪拌30min 讓溶液混合均勻，滴加濃度為2. 5M的NaOH溶液調(diào)pH值至8_9，繼續(xù)攪拌lh。將混合溶液轉(zhuǎn)入分液漏斗靜置分層，可見顆粒分散于上層甲苯溶液中，分掉水層，將上層黑液轉(zhuǎn)入三口瓶中，此時(shí)先通氬氣除氧，然后緩慢升溫，蒸出溶液中的水和部分甲苯后回流半小時(shí)，再與 3-氨丙基三乙氧基硅烷按照摩爾比1 1，溶解于水中進(jìn)行混合。將該混合物置于純氬氣環(huán)境中，回流半小時(shí)，使磁鐵礦結(jié)晶，通過(guò)離心，超濾，和透析純化納米粒子。產(chǎn)生顆粒均勻的納米微粒，然后與PEG連接臂按照摩爾比1 1反應(yīng)半小時(shí)，進(jìn)行共價(jià)偶聯(lián)，再以!^e3O4/ 單抗的摩爾比10 1取PEG連接的APTES修飾的Fe3O4納米磁流體和LMPl，Clone CS. 1-4 混合，置于冰浴中，攪拌過(guò)夜。借助于外磁場(chǎng)的作用對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行磁性分離，用超純水和無(wú)水乙醇交替洗滌4-5遍，經(jīng)透析除去雜質(zhì)后分散于超純水中，就得到鼻咽癌抗體修飾的!^e3O4 納米磁流體，粒徑20-30nm ；加分散劑(聚乙烯醇PVA.用量為2% )超聲分散30分鐘后，得到所述的磁共振對(duì)比劑的濃度為0. 25mmol/mL·實(shí)施例6取0. 5mmoL氯化亞鐵和1. 2mmoL氯化鐵水溶液混合，加入事先配制好的15mL十二烷基苯磺酸鈉(DBS)溶液05mM)，待溶液成為乳白色后，加入75mL甲苯，高速攪拌30min 讓溶液混合均勻，滴加濃度為2. 5M的NaOH溶液調(diào)pH值至8_9，繼續(xù)攪拌lh。將混合溶液轉(zhuǎn)入分液漏斗靜置分層，可見顆粒分散于上層甲苯溶液中，分掉水層，將上層黑液轉(zhuǎn)入三口瓶中，此時(shí)先通氬氣除氧，然后緩慢升溫，蒸出溶液中的水和部分甲苯后回流半小時(shí)，再與 3-氨丙基三乙氧基硅烷按照摩爾比1 1，溶解于水中進(jìn)行混合。將該混合物置于純氬氣環(huán)境中，回流半小時(shí)，使磁鐵礦結(jié)晶，通過(guò)離心，超濾，和透析純化納米粒子。產(chǎn)生顆粒均勻的納米微粒，然后與PEG連接臂按照摩爾比1 1反應(yīng)半小時(shí)，進(jìn)行共價(jià)偶聯(lián)，再以!^e3O4/單抗的摩爾比100 1取PEG連接的APTES修飾的Fe3O4納米磁流體和LMP1, Clone CS. 1-4 混合，置于冰浴中，攪拌過(guò)夜。借助于外磁場(chǎng)的作用對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行磁性分離，用超純水和無(wú)水乙醇交替洗滌4-5遍，經(jīng)透析除去雜質(zhì)后分散于超純水中，就得到鼻咽癌抗體修飾的!^e3O4 納米磁流體，粒徑20-30nm ；加分散劑(聚乙烯醇PVA.用量為2% )超聲分散30分鐘后，得到所述的磁共振對(duì)比劑的濃度為0. 25mmol/mL·實(shí)施例7 取0. 5mmoL氯化亞鐵和1. 2mmoL氯化鐵水溶液混合，加入事先配制好的15mL十二烷基苯磺酸鈉(DBS)溶液05mM)，待溶液成為乳白色后，加入75mL甲苯，高速攪拌30min 讓溶液混合均勻，滴加濃度為2. 5M的NaOH溶液調(diào)pH值至8_9，繼續(xù)攪拌lh。將混合溶液轉(zhuǎn)入分液漏斗靜置分層，可見顆粒分散于上層甲苯溶液中，分掉水層，將上層黑液轉(zhuǎn)入三口瓶中，此時(shí)先通氬氣除氧，然后緩慢升溫，蒸出溶液中的水和部分甲苯后回流半小時(shí)，再與 3-氨丙基三乙氧基硅烷按照摩爾比10 1，溶解于水中進(jìn)行混合。將該混合物置于純氬氣環(huán)境中，回流半小時(shí)，使磁鐵礦結(jié)晶，通過(guò)離心，超濾，和透析純化納米粒子。產(chǎn)生顆粒均勻的納米微粒，然后與PEG連接臂按照摩爾比10 1反應(yīng)半小時(shí)，進(jìn)行共價(jià)偶聯(lián)，再以!^e3O4/ 單抗的摩爾比1 1取PEG連接的APTES修飾的Fe3O4納米磁流體和LMP1, Clone CS. 1-4 混合，置于冰浴中，攪拌過(guò)夜。借助于外磁場(chǎng)的作用對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行磁性分離，用超純水和無(wú)水乙醇交替洗滌4-5遍，經(jīng)透析除去雜質(zhì)后分散于超純水中，就得到鼻咽癌抗體修飾的!^e3O4納米磁流體，粒徑20-30nm ；加分散劑(油酸.用量0. 2% )超聲分散30分鐘后，得到所述的磁共振對(duì)比劑的濃度為0. 25mmol/mL·實(shí)施例8取0. 5mmoL氯化亞鐵和1. 2mmoL氯化鐵水溶液混合，加入事先配制好的15mL十二烷基苯磺酸鈉(DBS)溶液05mM)，待溶液成為乳白色后，加入75mL甲苯，高速攪拌30min 讓溶液混合均勻，滴加濃度為2. 5M的NaOH溶液調(diào)pH值至8_9，繼續(xù)攪拌lh。將混合溶液轉(zhuǎn)入分液漏斗靜置分層，可見顆粒分散于上層甲苯溶液中，分掉水層，將上層黑液轉(zhuǎn)入三口瓶中，此時(shí)先通氬氣除氧，然后緩慢升溫，蒸出溶液中的水和部分甲苯后回流半小時(shí)，再與 3-氨丙基三乙氧基硅烷按照摩爾比10 1，溶解于水中進(jìn)行混合。將該混合物置于純氬氣環(huán)境中，回流半小時(shí)，使磁鐵礦結(jié)晶，通過(guò)離心，超濾，和透析純化納米粒子。產(chǎn)生顆粒均勻的納米微粒，然后與PEG連接臂按照摩爾比10 1反應(yīng)半小時(shí)，進(jìn)行共價(jià)偶聯(lián)，再以!^e3O4/ 單抗的摩爾比10 1取PEG連接的APTES修飾的Fe3O4納米磁流體和LMPl，Clone CS. 1-4 混合，置于冰浴中，攪拌過(guò)夜。借助于外磁場(chǎng)的作用對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行磁性分離，用超純水和無(wú)水乙醇交替洗滌4-5遍，經(jīng)透析除去雜質(zhì)后分散于超純水中，就得到鼻咽癌抗體修飾的!^e3O4 納米磁流體，粒徑20-30nm;加分散劑(油酸酰.用量0. 2% 0. 5% )超聲分散30分鐘后， 得到所述的磁共振對(duì)比劑的濃度為0. 25mmol/mL·實(shí)施例9取0. 5mmoL氯化亞鐵和1. 2mmoL氯化鐵水溶液混合，加入事先配制好的15mL十二烷基苯磺酸鈉(DBS)溶液05mM)，待溶液成為乳白色后，加入75mL甲苯，高速攪拌30min 讓溶液混合均勻，滴加濃度為2. 5M的NaOH溶液調(diào)pH值至8_9，繼續(xù)攪拌lh。將混合溶液轉(zhuǎn)入分液漏斗靜置分層，可見顆粒分散于上層甲苯溶液中，分掉水層，將上層黑液轉(zhuǎn)入三口瓶中，此時(shí)先通氬氣除氧，然后緩慢升溫，蒸出溶液中的水和部分甲苯后回流半小時(shí)，再與 3-氨丙基三乙氧基硅烷按照摩爾比10 1，溶解于水中進(jìn)行混合。將該混合物置于純氬氣環(huán)境中，回流半小時(shí)，使磁鐵礦結(jié)晶，通過(guò)離心，超濾，和透析純化納米粒子。產(chǎn)生顆粒均勻的納米微粒，然后與PEG連接臂按照摩爾比10 1反應(yīng)半小時(shí)，進(jìn)行共價(jià)偶聯(lián)，再以!^e3O4/ 單抗的摩爾比100 1取PEG連接的APTES修飾的!^e3O4納米磁流體和LMPl,Clone CS. 1-4 混合，置于冰浴中，攪拌過(guò)夜。借助于外磁場(chǎng)的作用對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行磁性分離，用超純水和無(wú)水乙醇交替洗滌4-5遍，經(jīng)透析除去雜質(zhì)后分散于超純水中，就得到鼻咽癌抗體修飾的!^e3O4 納米磁流體，粒徑20-30nm;加分散劑(油酸酰.用量0. 2% 0. 5% )超聲分散30分鐘后， 得到所述的磁共振對(duì)比劑的濃度為0. 25mmol/ml。實(shí)施例10取0. 5mmoL氯化亞鐵和1. 2mmoL氯化鐵水溶液混合，加入事先配制好的15mL十二烷基苯磺酸鈉(DBS)溶液05mM)，待溶液成為乳白色后，加入75mL甲苯，高速攪拌30min 讓溶液混合均勻，滴加濃度為2. 5M的NaOH溶液調(diào)pH值至8_9，繼續(xù)攪拌lh。將混合溶液轉(zhuǎn)入分液漏斗靜置分層，可見顆粒分散于上層甲苯溶液中，分掉水層，將上層黑液轉(zhuǎn)入三口瓶中，此時(shí)先通氬氣除氧，然后緩慢升溫，蒸出溶液中的水和部分甲苯后回流半小時(shí)，再與 3-氨丙基三乙氧基硅烷按照摩爾比20 1，溶解于水中進(jìn)行混合。將該混合物置于純氬氣環(huán)境中，回流半小時(shí)，使磁鐵礦結(jié)晶，通過(guò)離心，超濾，和透析純化納米粒子。產(chǎn)生顆粒均勻的納米微粒，然后與PEG連接臂按照摩爾比20 1反應(yīng)半小時(shí)，進(jìn)行共價(jià)偶聯(lián)，再以!^e3O4/單抗的摩爾比1 1取PEG連接的APTES修飾的Fe3O4納米磁流體和LMP1, Clone CS. 1-4 混合，置于冰浴中，攪拌過(guò)夜。借助于外磁場(chǎng)的作用對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行磁性分離，用超純水和無(wú)水乙醇交替洗滌4-5遍，經(jīng)透析除去雜質(zhì)后分散于超純水中，就得到鼻咽癌抗體修飾的!^e3O4 納米磁流體，粒徑20-30nm;加分散劑(油酸酰.用量0. 2% 0. 5% )超聲分散30分鐘后， 得到所述的磁共振對(duì)比劑的濃度為0. 25mmol/mL·實(shí)施例11取0. 5mmoL氯化亞鐵和1. 2mmoL氯化鐵水溶液混合，加入事先配制好的15mL十二烷基苯磺酸鈉(DBS)溶液05mM)，待溶液成為乳白色后，加入75mL甲苯，高速攪拌30min 讓溶液混合均勻，滴加濃度為2. 5M的NaOH溶液調(diào)pH值至8_9，繼續(xù)攪拌lh。將混合溶液轉(zhuǎn)入分液漏斗靜置分層，可見顆粒分散于上層甲苯溶液中，分掉水層，將上層黑液轉(zhuǎn)入三口瓶中，此時(shí)先通氬氣除氧，然后緩慢升溫，蒸出溶液中的水和部分甲苯后回流半小時(shí)，再與 3-氨丙基三乙氧基硅烷按照摩爾比20 1，溶解于水中進(jìn)行混合。將該混合物置于純氬氣環(huán)境中，回流半小時(shí)，使磁鐵礦結(jié)晶，通過(guò)離心，超濾，和透析純化納米粒子。產(chǎn)生顆粒均勻的納米微粒，然后與PEG連接臂按照摩爾比20 1反應(yīng)半小時(shí)，進(jìn)行共價(jià)偶聯(lián)，再以!^e3O4/ 單抗的摩爾比10 1取PEG連接的APTES修飾的Fe3O4納米磁流體和LMPl，Clone CS. 1-4 混合，置于冰浴中，攪拌過(guò)夜。借助于外磁場(chǎng)的作用對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行磁性分離，用超純水和無(wú)水乙醇交替洗滌4-5遍，經(jīng)透析除去雜質(zhì)后分散于超純水中，就得到鼻咽癌抗體修飾的!^e3O4 納米磁流體，粒徑20-30nm ；加分散劑(油酸.用量0. 2% )超聲分散30分鐘后，得到所述的磁共振對(duì)比劑的濃度為0. 25mmol/mL·實(shí)施例12 取0. 5mmoL氯化亞鐵和1. 2mmoL氯化鐵水溶液混合，加入事先配制好的15mL十二烷基苯磺酸鈉(DBS)溶液05mM)，待溶液成為乳白色后，加入75mL甲苯，高速攪拌30min 讓溶液混合均勻，滴加濃度為2. 5M的NaOH溶液調(diào)pH值至8_9，繼續(xù)攪拌lh。將混合溶液轉(zhuǎn)入分液漏斗靜置分層，可見顆粒分散于上層甲苯溶液中，分掉水層，將上層黑液轉(zhuǎn)入三口瓶中，此時(shí)先通氬氣除氧，然后緩慢升溫，蒸出溶液中的水和部分甲苯后回流半小時(shí)，再與 3-氨丙基三乙氧基硅烷按照摩爾比20 1，溶解于水中進(jìn)行混合。將該混合物置于純氬氣環(huán)境中，回流半小時(shí)，使磁鐵礦結(jié)晶，通過(guò)離心，超濾，和透析純化納米粒子。產(chǎn)生顆粒均勻的納米微粒，然后與PEG連接臂按照摩爾比20 1反應(yīng)半小時(shí)，進(jìn)行共價(jià)偶聯(lián)，再以!^e3O4/ 單抗的摩爾比100 1取PEG連接的APTES修飾的!^e3O4納米磁流體和LMPl,Clone CS. 1-4 混合，置于冰浴中，攪拌過(guò)夜。借助于外磁場(chǎng)的作用對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行磁性分離，用超純水和無(wú)水乙醇交替洗滌4-5遍，經(jīng)透析除去雜質(zhì)后分散于超純水中，就得到鼻咽癌抗體修飾的!^e3O4 納米磁流體，粒徑20-30nm ；加分散劑(油酸.用量0. 2% )超聲分散30分鐘后，得到所述的磁共振對(duì)比劑的濃度為0. 25mmol/mL·
權(quán)利要求
1.一種鼻咽癌靶向磁共振對(duì)比劑，其特征在于，是用3-氨丙基三乙氧基硅烷包覆或連接到超順磁性四氧化三鐵上，使狗304表面氨基化，得到!^3O4-APTES表面改性微粒，再將聚乙二醇作為!^3O4-APTES表面改性微粒與EB病毒潛伏膜蛋白1單克隆抗體之間的連接臂， 將二者連接起來(lái)，得到的分散穩(wěn)定的i^OfAPTES-PEG-LMPl，Clone CS. 1-4膠體溶液。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鼻咽癌靶向磁共振對(duì)比劑，其特征在于，所述的超順!^e3O4是采用化學(xué)共沉淀的方法合成的粒徑為10-15nm顆粒。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鼻咽癌靶向磁共振對(duì)比劑，其特征在于， Fe3O4-APTES-PEG-LMPl, Clone CS. 1-4 膠體微粒粒徑為 20_30nm。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的鼻咽癌靶向磁共振對(duì)比劑，其特征在于，所述的鼻咽癌靶向磁共振對(duì)比劑是將超順磁性!^e3O4與3-氨丙基三乙氧基硅烷混合反應(yīng)，通過(guò)離心， 超濾，和透析純化納米粒子；得到!^e3O4-APTES表面改性微粒，然后與PEG連接；再將LMP1， Clone CS. 1_4和帶有PEG連接臂的!^3O4-APTES表面改性微?；旌希≈袛嚢柽^(guò)夜；借助于外磁場(chǎng)的作用對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行磁性分離，再經(jīng)過(guò)洗滌，分散得到的磁共振對(duì)比劑。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的鼻咽癌靶向磁共振對(duì)比劑，其特征在于，F(xiàn)e3O4與APTES反應(yīng)摩爾比為0.1 1-20 1 ；兩者反應(yīng)30分鐘-1小時(shí)。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的鼻咽癌靶向磁共振對(duì)比劑，其特征在于，F(xiàn)e3O4-APTES表面改性微粒與PEG的反應(yīng)摩爾比為0. 1 1-20 1 ；兩者反應(yīng)30分鐘-1小時(shí)。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的鼻咽癌靶向磁共振對(duì)比劑，其特征在于，帶有PEG連接臂的 Fe3O4-APTES 表面改性微粒和 LMPl，Clone CS. 1_4 以!^e3O4/單抗的摩爾比 1 1-100 1 混合反應(yīng)。
8.—種鼻咽癌靶向磁共振對(duì)比劑的制備方法，其特征在于，將超順磁性狗304與3_氨丙基三乙氧基硅烷混合反應(yīng)，通過(guò)離心，超濾，和透析純化納米粒子；得到!^3O4-APTES表面改性微粒，然后與PEG連接；再將LMP1，Clone CS. 1-4和帶有PEG連接臂的!^e3O4-APTES表面改性微?；旌?，冰浴中攪拌過(guò)夜；借助于外磁場(chǎng)的作用對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行磁性分離，再經(jīng)過(guò)洗滌， 分散得到磁共振對(duì)比劑。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的制備方法，其特征在于，所述的超順!^e3O4是采用化學(xué)共沉淀的方法合成的粒徑為10-15nm顆粒。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的制備方法，其特征在于，！^e3O4與APTES反應(yīng)摩爾比為 0. 1 1-20 1 ；兩者反應(yīng)30分鐘-1小時(shí)Je3O4-APTES表面改性微粒與PEG的反應(yīng)摩爾比為0. 1 1-20 1 ；兩者反應(yīng)30分鐘-1小時(shí)；帶有PEG連接臂的Fe3O4-APTES表面改性微粒和LMP1，Clone CS. 1_4以Fii3O4/單抗的摩爾比1 1-100 1混合反應(yīng)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種鼻咽癌靶向磁共振對(duì)比劑及其制備方法，該對(duì)比劑是采用化學(xué)共沉淀的方法合成粒徑約10-15nm的超順磁性Fe3O4，用APTES包覆或連接到10-15nm的Fe3O4上，使Fe3O4表面氨基化，得到Fe3O4-APTES表面改性微粒，聚乙二醇作為Fe3O4-APTES與EB病毒潛伏膜蛋白1單克隆抗體(LMP1，Clone CS.1-4)之間的連接臂，將二者連接起來(lái)，得到分散穩(wěn)定的Fe3O4-APTES-PEG-LMP1，Clone CS.1-4膠體溶液，本發(fā)明的對(duì)比劑與現(xiàn)有常規(guī)對(duì)比劑相比，具有低毒，高穩(wěn)定性，好的生物相容性，高敏感性，對(duì)LMP1+鼻咽癌具有好的特異靶向性，可以用于鼻咽癌篩查和特異性磁共振診斷。
文檔編號(hào)A61K49/16GK102552944SQ20121001607
公開日2012年7月11日 申請(qǐng)日期2012年1月18日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月18日
發(fā)明者劉晟, 周科朝, 容鵬飛, 張聲旺, 曾文彬, 王維, 鄒蟠 申請(qǐng)人:中南大學(xué)