纖維狀脫鈣骨基質(zhì)的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種纖維狀脫鈣骨基質(zhì)的制備方法，其包括下述步驟：（a）將分離到體外的骨在酸性溶液中進(jìn)行1-5小時(shí)的第1次脫鈣；（b）將從步驟（a）得到的骨切成0.1-3mm厚的片狀骨；（c）將從步驟（b）得到的片狀骨在酸性溶液中進(jìn)行2-6小時(shí)的第2次脫鈣；及（d）將從步驟（c）得到的經(jīng)過脫鈣的骨進(jìn)行粉碎。
【專利說明】纖維狀脫鈣骨基質(zhì)的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及纖維狀脫鈣骨基質(zhì)的改善的制備方法，具體地，涉及包括部分脫鈣、切害I]、完全脫鈣及粉碎步驟的纖維狀脫鈣骨基質(zhì)的改善的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]將骨浸潰在酸中去除骨中的礦物質(zhì)成分的部分稱為脫鈣骨基質(zhì)(demineralizedbone matrix, DBM)。脫鈣骨基質(zhì)大部分由高度交聯(lián)的骨膠原構(gòu)成,殘存的非骨膠原性蛋白質(zhì)包括轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子_β (TGF - β)、血小板源性生長(zhǎng)因子(PDGF)、骨橋蛋白、骨粘連蛋白、骨形態(tài)生成蛋白(bone morphogenetic protein,BMP)等。脫鈣骨基質(zhì)以用于修復(fù)骨缺損等為目的的骨移植用組合物的形態(tài)使用。
[0003]脫鈣骨基質(zhì)對(duì)分離到體外的骨進(jìn)行脫鈣步驟之后，將此粉碎為適當(dāng)?shù)拇笮。苽涑深w粒形態(tài)。本發(fā)明發(fā)明人公開過具有0.05-250μπι顆粒大小的脫鈣骨基質(zhì)；具有250-2000 μ m的顆粒大小的脫鈣骨基質(zhì)；及以特定比例混合水合物的骨再生用組合物，所述組合物具有優(yōu)異的注入性及形態(tài)維持性(處理性)(韓國(guó)授權(quán)專利第10-1041784號(hào))。
[0004]另外，皮質(zhì)骨(cortical bone)平行于骨的長(zhǎng)軸并由骨膠原纖維束(fiber bundles)構(gòu)成，已知由此得到的纖維狀脫鈣骨基質(zhì)在骨修復(fù)及其它整形外科的移植方面具有有用的性質(zhì)。纖維狀脫鈣骨基質(zhì)通過將分離到體外的皮質(zhì)骨利用特殊粉碎機(jī)(例如，美國(guó)專利第5，607，269號(hào))粉碎至得 到纖維狀顆粒，然后進(jìn)行脫鈣而制備。但是這種制備方法由于受到粉碎儀器的機(jī)械方面的限制，只能使用天然的皮質(zhì)軸(intact cortical shafts)作為骨原料，且得到的纖維狀脫鈣骨收率低。為了改善上述問題，美國(guó)專利第7，323，193號(hào)及第7，939，108號(hào)中公開了將分離到體外的骨切斷成適當(dāng)大小，并在酸性溶液中進(jìn)行6小時(shí)的脫鈣后，再在酸性溶液中進(jìn)行2天的脫鈣，然后將其進(jìn)行粉碎，從而制備纖維狀脫鈣骨基質(zhì)的方法。但是上述美國(guó)專利第7，323，193號(hào)及第7，939，108號(hào)中公開的制備方法，需要進(jìn)行長(zhǎng)達(dá)2日，即48小時(shí)的長(zhǎng)時(shí)間的脫鈣步驟。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]發(fā)明目的
[0006]本發(fā)明發(fā)明人為了開發(fā)出具有有用的性質(zhì)的纖維狀脫鈣骨基質(zhì)的制備方法，尤其是能夠改善長(zhǎng)時(shí)間的脫鈣步驟的制備方法，進(jìn)行了多種研究。結(jié)果將部分脫鈣而得到的骨進(jìn)行切割制備成薄片狀形態(tài)后，將此進(jìn)行脫鈣時(shí)，驚奇地發(fā)現(xiàn)能夠?qū)⒚撯}步驟顯著縮短至約6小時(shí)左右，且脫鈣骨基質(zhì)具有纖維狀形態(tài)的同時(shí)能夠以高收率獲得。
[0007]從而，本發(fā)明的目的在于通過依次進(jìn)行部分脫鈣、切割、完全脫鈣及粉碎步驟的纖維狀脫鈣骨基質(zhì)的制備方法。
[0008]技術(shù)方案
[0009]本發(fā)明涉及一種纖維狀脫鈣骨基質(zhì)的制備方法，其包括下述步驟:(a)將分離到體外的骨在酸性溶液中進(jìn)行1-5小時(shí)的第1次脫鈣；(b)將從步驟(a)得到的骨切割(slicing)成0.l_3mm厚的片狀骨；(c)將從步驟(b)得到的片狀骨在酸性溶液中進(jìn)行2-6小時(shí)的第2次脫鈣；及((1)將從步驟(c)得到的經(jīng)過脫鈣的骨進(jìn)行粉碎。
[0010]根據(jù)本發(fā)明的纖維狀脫鈣骨基質(zhì)的制備方法，所述步驟(a)和步驟(C)的所述酸性溶液可以相互獨(dú)立地為0.1-3N的HCl水溶液，優(yōu)選所述步驟(a)和步驟(c)的所述酸性溶液可以為0.6N的HCl水溶液。此外，可以以獲得具有1000-5000 μ m范圍長(zhǎng)度的纖維狀脫鈣骨基質(zhì)來實(shí)施所述粉碎。
[0011]發(fā)明效果
[0012]根據(jù)本發(fā)明，依次進(jìn)行部分脫鈣、切割、完全脫鈣及粉碎步驟時(shí)，發(fā)現(xiàn)能夠?qū)⒚撯}步驟顯著縮短至約6小時(shí)左右。尤其通過引入切割步驟，不僅縮短了脫鈣步驟的時(shí)間，而且還能夠使最終得到的脫鈣骨基質(zhì)以具有纖維形態(tài)的脫鈣骨基質(zhì)高收率地獲得。因此，本發(fā)明的制備方法能夠適用于工業(yè)規(guī)模的大量生產(chǎn)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0013]圖1是表示將部分脫鈣的骨進(jìn)行切割后得到的骨(A)及將脫鈣的骨進(jìn)行粉碎后得到的骨(B)。
[0014]圖2是表示纖維狀脫鈣骨基質(zhì)(A)和顆粒狀脫鈣骨基質(zhì)(B)的形態(tài)的光學(xué)顯微鏡測(cè)定照片。
【具體實(shí)施方式】
[0015]本發(fā)明提供一種纖維狀脫鈣骨基質(zhì)的制備方法，其包括下述步驟:(a)將分離到體外的骨在酸性溶液中進(jìn)行1-5小時(shí)的第1次脫鈣；(b)將從步驟(a)得到的骨切割成
0.1-3mm厚的片狀骨；(c)將從步驟(b)得到的片狀骨在酸性溶液中進(jìn)行2_6小時(shí)的第2次脫鈣；及((1)將從步驟(c)得到的經(jīng)過脫鈣的骨進(jìn)行粉碎。
[0016]本發(fā)明的制備方法依次進(jìn)行部分脫鈣、切割、完全脫鈣及粉碎步驟，尤其是通過部分脫鈣及切割步驟，不僅能夠?qū)⒔酉聛淼拿撯}步驟顯著縮短至約6小時(shí)左右，還能夠高收率制備具有纖維形態(tài)的脫鈣骨基質(zhì)。
[0017]本發(fā)明的制備方法包括部分脫鈣步驟，即將分離到體外的骨在酸性溶液中進(jìn)行1-5小時(shí)的第1次脫鈣的步驟(即步驟(a))。所述分離到體外的骨可以是包括人類的哺乳動(dòng)物的骨。所述分離到體外的骨優(yōu)選按照通常的方法將附著于骨的軟組織、脂肪、骨髓等去除之后使用。所述去除通常可以使用60-90重量％的乙醇溶液進(jìn)行，根據(jù)需要可以額外使用表面活性劑。所述酸性溶液通?？梢允褂肏Cl水溶液，可以使用0.1-3N的HCl水溶液，優(yōu)選使用約0.6N的HCl水溶液。所述第1次脫鈣時(shí)間可以是1-5小時(shí)，優(yōu)選約3小時(shí)。
[0018]本發(fā)明的制備方法包括將部分脫鈣的骨切割成片狀形態(tài)的切片步驟，即，將從部分脫鈣步驟中得到的骨切割成0.l_3mm厚的片狀骨的步驟(即步驟(b))。所述切割只要是能夠?qū)⒐乔谐杀∑臋C(jī)器均可使用，例如可以使用骨切割機(jī)(Bone Slicer) (YOU IL MC/C0.KR)等的骨切片器(bone slicer)。通過所述切割步驟得到的片狀骨的厚度為0.l_3mm，優(yōu)選0.2-1.0mm,更優(yōu)選0.3-0.6mm,最優(yōu)選約為0.5mm。厚度超過3.0mm時(shí),骨形態(tài)為粉碎的顆粒形態(tài)而不是片狀；厚度小于0.1mm時(shí)，雖然能夠得到片狀，但即使脫鈣也無法得到纖維狀而只能夠得到顆粒狀。[0019]本發(fā)明包括將部分脫鈣的片狀骨完全脫鈣的步驟，即將上述得到的片狀骨在酸性溶液中進(jìn)行2-6小時(shí)的第2次脫鈣的步驟(即步驟(C))。所述酸性溶液通?？梢允褂肏Cl水溶液，可以使用0.1-3N的HCl水溶液，優(yōu)選使用約0.6N的HCl水溶液。本發(fā)明公開了以下內(nèi)容，第2次脫鈣，即完全脫鈣可以以相比以往的脫鈣時(shí)間顯著縮短的2-6小時(shí)，優(yōu)選約3小時(shí)以內(nèi)的時(shí)間進(jìn)行。
[0020]本發(fā)明包括將完全脫鈣的骨進(jìn)行粉碎的步驟(即步驟(d))。所述粉碎步驟可以使用通常的粉碎機(jī)實(shí)施。其中，優(yōu)選地以獲得具有1000-5000μπι，更優(yōu)選地以獲得2000-4000 μ m范圍長(zhǎng)度的纖維狀脫鈣骨基質(zhì)來實(shí)施所述粉碎，所述粉碎可以根據(jù)粉碎機(jī)的種類來設(shè)定適合的粉碎條件，從而獲得上述纖維狀脫鈣骨基質(zhì)。
[0021]下面，通過實(shí)施例詳細(xì)說明本發(fā)明。但是，以下實(shí)施例僅是例示本發(fā)明，本發(fā)明并不僅限于此。 [0022]實(shí)施例1
[0023]將來自人供體的骨(重量:約172g)利用手術(shù)器械去除附著在骨上的軟組織，使用含有表面活性劑的組織洗滌劑去除軟組織、脂肪及骨髓等雜質(zhì)，然后切斷成兩半。將切斷的骨在相對(duì)于每克骨重量為20ml的0.6N的HCl水溶液中浸潰3小時(shí)，從而進(jìn)行部分脫鈣。將部分脫鈣的骨進(jìn)行回收，在相對(duì)于每克骨重量為20ml的蒸餾水中浸潰，從而去除骨中的脫鈣溶液。將得到的骨利用骨切片器(bone slicer, YOU IL MC/C0.KR)切片成0.5mm厚度的片狀。得到的片狀骨如圖1A所示。將得到的片狀骨在相對(duì)于每克骨重量為0.6N的HCl水溶液30ml中浸潰3小時(shí)，進(jìn)行完全脫鈣。將脫鈣骨基質(zhì)進(jìn)行沉淀而分離后，放入粉碎機(jī)(ΙΚΑ，M20通用粉碎機(jī)(Univeral mill), GR)中粉碎約10分鐘，然后使用磷酸緩沖液(PBS)進(jìn)行中和，用蒸餾水洗滌，然后進(jìn)行冷凍干燥得到約31g的脫鈣骨基質(zhì)。利用光學(xué)顯微鏡觀察得到的脫鈣骨基質(zhì)的照片如圖2A所示。從圖2A中可以確認(rèn)得到的脫鈣骨基質(zhì)為纖維狀脫鈣骨基質(zhì)。
[0024]比較例I
[0025]將來自人供體的骨(重量:約165g)利用手術(shù)器械去除附著在骨上的軟組織，使用含有表面活性劑的組織洗滌劑去除軟組織、脂肪及骨髓等雜質(zhì)，然后切斷成兩半。將切斷的骨在相對(duì)于每克骨重量為0.6N的HCl水溶液20ml中浸潰3小時(shí)，從而進(jìn)行部分脫鈣。將部分脫鈣的骨進(jìn)行回收，在相對(duì)于每克骨重量的蒸餾水20ml中浸潰，從而去除骨中的脫鈣溶液。將得到的骨在相對(duì)于每克骨重量為0.6N的HCl水溶液30ml中浸潰3小時(shí)，再次進(jìn)行脫鈣步驟，但是脫鈣幾乎沒有進(jìn)行，無法得到脫鈣骨基質(zhì)。
[0026]比較例2
[0027]將來自人供體的骨(重量:約192g)利用手術(shù)器械去除附著在骨上的軟組織，使用含有表面活性劑的組織洗滌劑去除軟組織、脂肪及骨髓等雜質(zhì)，然后切斷成兩半。將切斷的骨在相對(duì)于每克骨重量為0.6N的HCl水溶液20ml中浸潰3小時(shí)，從而進(jìn)行部分脫鈣。將部分脫鈣的骨進(jìn)行分離，在相對(duì)于每克骨重量的蒸餾水20ml中浸潰，從而去除骨中的脫鈣溶液。將得到的骨放入粉碎機(jī)(ΙΚΑ, M20通用粉碎機(jī)，GR)中粉碎約60分鐘得到粉碎的骨，其形態(tài)如圖1B所示。將上述粉碎的骨在相對(duì)于每克骨重量為0.6N的HCl水溶液30ml中浸潰3小時(shí)，進(jìn)行完全脫鈣。脫鈣骨基質(zhì)進(jìn)行沉淀分離后，使用磷酸緩沖液(PBS)進(jìn)行中和，用蒸餾水洗滌，然后進(jìn)行冷凍干燥得到約36.4g的脫鈣骨基質(zhì)。利用光學(xué)顯微鏡觀察得到的 脫鈣骨基質(zhì)的照片如圖2B所示。從圖2B中可以確認(rèn)得到的脫鈣骨基質(zhì)為顆粒狀脫鈣骨基質(zhì)。
【權(quán)利要求】
1.一種纖維狀脫鈣骨基質(zhì)的制備方法，其特征在于，該方法包括下述步驟:(a)將分離到體外的骨在酸性溶液中進(jìn)行1-5小時(shí)的第1次脫鈣；(b)將從步驟(a)得到的骨切割成.0.1-3mm厚的片狀骨；(c)將從步驟(b)得到的片狀骨在酸性溶液中進(jìn)行2_6小時(shí)的第2次脫鈣；及((1)將從步驟(c)得到的經(jīng)過脫鈣的骨進(jìn)行粉碎的步驟。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的纖維狀脫鈣骨基質(zhì)的制備方法，其中，所述步驟(a)和步驟(c)的所述酸性溶液相互獨(dú)立地為0.1-3N的HCl水溶液
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的纖維狀脫鈣骨基質(zhì)的制備方法，其中，所述步驟(a)和步驟(c)的所述酸性溶液為0.6N的HCl水溶液。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的纖維狀脫鈣骨基質(zhì)的制備方法，其中，以獲得具有1000-5000 μ m范圍長(zhǎng)度的纖維狀脫鈣骨基質(zhì)來實(shí)施所述粉碎。
【文檔編號(hào)】A61L27/38GK103998070SQ201180073750
【公開日】2014年8月20日 申請(qǐng)日期:2011年10月11日 優(yōu)先權(quán)日:2011年9月29日
【發(fā)明者】宋錫范, 鄭求源, 蘇怔援, 徐漢率, 柳眩承, 金貴南, 金炳奭 申請(qǐng)人:Cg生物技術(shù)有限公司