專利名稱：二甲雙胍在制備治療淋巴瘤疾病藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及二甲雙胍的新用途，具體地說，是二甲雙胍在制備治療淋巴瘤疾病藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
淋巴瘤是一種起源于淋巴結(jié)或結(jié)外淋巴組織的惡性腫瘤。隨著環(huán)境污染的加重、 生活節(jié)奏的加快及人口老齡化，淋巴瘤的發(fā)病率越來越高，并且呈現(xiàn)年輕化趨勢(shì)。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，惡性淋巴瘤發(fā)病率年增長率為7. 5%，是目前發(fā)病率增長最快的惡性腫瘤之一。全球每年約有35萬新發(fā)病例，死亡人數(shù)超過20萬。我國惡性淋巴瘤發(fā)病率為0.02%。， 每年新增病例2. 5萬人，死亡2萬人，呈上升趨勢(shì)。惡性淋巴瘤的發(fā)病年齡以兒童和青壯年最為多見，是兒童最常見的惡性腫瘤之一。死于淋巴瘤的患者平均年齡為49. 9歲，明顯低于所有惡性腫瘤平均死亡年齡58. 2歲。惡性淋巴瘤分為霍奇金淋巴瘤(Hodgkin Lymphoma，HL)和非霍奇金淋巴瘤 (Non-Hodgkin Lymphoma, NHL)兩類，其中，以NHL為主，大約占到80_90%。NHL常常采用聯(lián)合化療、放療、免疫靶向治療及骨髓移植等綜合治療方案。CHOP方案一直是NHL治療的標(biāo)準(zhǔn)方案，雖然對(duì)60% 70%患者有效，但是仍有30%-40%的淋巴瘤患者對(duì)治療無效或治療后迅速復(fù)發(fā)，疾病進(jìn)展快，預(yù)后差。因此尋找新的治療方法就顯得猶為重要，尤其是特異性靶向淋巴瘤細(xì)胞生存相關(guān)的信號(hào)傳導(dǎo)途徑藥物的研究已成為目前淋巴瘤研究的熱點(diǎn)。AMPK是一個(gè)主要的細(xì)胞能量感應(yīng)器，近來研究發(fā)現(xiàn)AMPK是mTOR上游信號(hào)分子，成為新陳代謝和腫瘤相互關(guān)系中的一個(gè)關(guān)鍵的因子。AMH(是一異源三聚體，包括α催化亞單位和β、Y調(diào)節(jié)亞單位。在人類各有2到3個(gè)不同的基因編碼各亞單位(α 1，α 2，β 1， β 2, γ 1, γ2, Y 3)，因此有12種可能的組合。AMPK是一個(gè)能量感應(yīng)器，處于非激活狀態(tài)。 當(dāng)細(xì)胞內(nèi)能量耗竭，ΑΜΡ/ΑΤΡ比例升高時(shí)，ΑΜΡΚ172位蘇氨酸殘基被上游激酶磷酸化而激活。比如葡萄糖缺乏、缺氧、氧化應(yīng)激、高滲、組織缺血、肌肉收縮等情況下ATP消耗，AMP上升，激活A(yù)MPK。ΑΜΗ(—旦被激活，即通過增加葡萄糖攝取、糖酵解、脂肪酸氧化等分解代謝過程，減少脂肪酸、膽固醇、蛋白質(zhì)合成等ATP消耗過程而恢復(fù)細(xì)胞內(nèi)能量水平。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)存在足夠的能量資源，細(xì)胞才進(jìn)行有絲分裂，因此ΑΜΗ(可以作為一個(gè)理想的能量監(jiān)視器。二甲雙胍是一個(gè)雙胍類抗糖尿病藥物，用于臨床已有50年歷史。流行病學(xué)資料顯示使用二甲雙胍的糖尿病的患者癌癥的發(fā)生率低，如乳腺癌、結(jié)腸癌、前列腺癌、胰腺癌等，這一現(xiàn)象促進(jìn)了大家對(duì)AMPK/mTOR途徑的認(rèn)識(shí)。研究發(fā)現(xiàn)服用二甲雙胍的糖尿病患者與服用磺脲類降糖藥的糖尿病患者相比，癌癥的發(fā)生率降低23%。在另一個(gè)研究中，10309 個(gè)糖尿病患者分2組，一組用二甲雙胍，另一組用磺脲類藥物，后一組腫瘤相關(guān)死亡率明顯高于二甲雙胍組。研究資料顯示，二甲雙胍對(duì)這些瘤細(xì)胞有顯著的抑制作用。最新的臨床資料表明，患有糖尿病的乳腺癌患者接受化療及二甲雙胍聯(lián)合用藥有一個(gè)更高的病理學(xué)完全緩解率。二甲雙胍通過提高肝和肌肉對(duì)胰島素敏感性而控制血糖。二甲雙胍通過胰島素受體增強(qiáng)其信號(hào)，減少糖尿病患者胰島素耐受，成為胰島素增敏器。二甲雙胍也通過抑制肝糖異生而降低胰島素水平。另外，肥胖、胰島素耐受、高胰島素血癥及其相關(guān)的雄激素增多癥參與乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌、前列腺癌等惡性腫瘤的起動(dòng)，這與二甲雙胍使用者癌癥低發(fā)生率相符合。在分子水平，二甲雙胍通過激活A(yù)MPK，AMPK調(diào)節(jié)下游控制細(xì)胞增殖的信號(hào)通路。 在上皮細(xì)胞二甲雙胍活化AMPK，抑制mTOR活性，進(jìn)而抑制mRNA翻譯，蛋白合成及細(xì)胞增殖。 但是關(guān)于二甲雙胍在制備治療淋巴瘤疾病藥物中的應(yīng)用目前還未見報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種二甲雙胍在制備治療淋巴瘤疾病藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的再一的目的是，提供一種具有協(xié)同作用的治療淋巴瘤的組合藥物。本發(fā)明的另一的目的是，提供一種具有協(xié)同作用的治療淋巴瘤的組合藥物的應(yīng)用。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是二甲雙胍在制備治療淋巴瘤疾病藥物中的應(yīng)用。淋巴瘤細(xì)胞為2-8X IO5個(gè)細(xì)胞/毫升時(shí)，二甲雙胍的使用量為10_20mM。二甲雙胍在制備治療Burkitt’ s淋巴瘤藥物中的應(yīng)用。二甲雙胍在制備治療彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤藥物中的應(yīng)用。二甲雙胍在制備治療T細(xì)胞急性淋巴母細(xì)胞白血病藥物中的應(yīng)用。二甲雙胍在制備治療耐6巰基嘌呤的T細(xì)胞急性淋巴母細(xì)胞白血病藥物中的應(yīng)用。二甲雙胍在制備治療皮膚T細(xì)胞淋巴瘤藥物中的應(yīng)用。二甲雙胍在制備治療Kappas間變大細(xì)胞淋巴瘤藥物中的應(yīng)用。為實(shí)現(xiàn)上述第二個(gè)目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是一種具有協(xié)同作用的治療淋巴瘤的組合藥物，所述的組合藥物由二甲雙胍和阿霉素組成。所述的二甲雙胍和阿霉素的比例為1. 25-20 mM: 6. 25_50ng/ml。一種具有協(xié)同作用的治療淋巴瘤的組合藥物，所述的組合藥物由二甲雙胍和地塞米松組成。所述的二甲雙胍和地塞米松的比例為1.25-20 mM: 1-1000 nM。一種具有協(xié)同作用的治療淋巴瘤的組合藥物，所述的組合藥物由二甲雙胍和mTOR 抑制劑iTemsirolimus組成。所述的二甲雙胍和Temsirolimus 的比例為 1. 25-20 mM: 0. 1-10 nM。為實(shí)現(xiàn)上述第三個(gè)目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是所述的組合藥物在制備治療淋巴瘤疾病藥物中的應(yīng)用。所述的組合藥物在制備治療Burkitt淋巴瘤、或彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤、或T細(xì)胞急性淋巴母細(xì)胞白血病、或皮膚T細(xì)胞淋巴瘤藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)在于
1、通過使用本發(fā)明的藥物，可以抑制惡性淋巴瘤細(xì)胞生長增殖，使淋巴瘤細(xì)胞株周期阻滯，上調(diào)P21，調(diào)節(jié)AMPK/mTOR信號(hào)傳導(dǎo)通路；
2、本發(fā)明開拓了傳統(tǒng)降糖藥物二甲雙胍的新用途，二甲雙胍費(fèi)用低，安全，耐受性好， 易被患者接受，抑制淋巴瘤細(xì)胞生長增殖，并且提高淋巴瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物阿霉素和mTOR 抑制劑Temsirolimus的敏感性，為淋巴瘤的治療提供了新的策略。


圖IA =MTT實(shí)驗(yàn)中二甲雙胍處理各種淋巴瘤細(xì)胞株(SU-DHL-4、Namalwa, DB、 SU-DHL-5、Daudi、Jurkat、6-TCEM、Kappas、H9、Hut78 ) IC50 結(jié)果。圖IB 不同濃度二甲雙胍處理Daudi、SU-DHL_4、Hut78和Jurkat細(xì)胞株72小時(shí)。 顯示二甲雙胍對(duì)4個(gè)細(xì)胞株都存在增殖抑制作用，且存在劑量依賴性。圖 IC :10mM 二甲雙胍處理 Daudi、SU-DHL_4、Hut78 和 Jurkat 細(xì)胞株 24、48、72 小時(shí)。顯示二甲雙胍對(duì)4個(gè)細(xì)胞株的增殖抑制作用存在時(shí)間依賴性。圖2A 流式細(xì)胞分析顯示，IOmM 二甲雙胍處理細(xì)胞36小時(shí)后，4個(gè)細(xì)胞株都引起 G0/G1 期阻滯。ClGO/Gl 期，S 期， ■ G2/M 期。圖2B :10mM二甲雙胍處理細(xì)胞24、36及48小時(shí)后。免疫印跡結(jié)果顯示，二甲雙胍上調(diào)P21，但不影響P27、P53和CyclinDl。圖3A :10mM 二甲雙胍處理細(xì)胞24、36及48小時(shí)。免疫印跡結(jié)果顯示，二甲雙胍上調(diào) p-AMPK,導(dǎo)致下游 p-mTOR、p_P70S6K、ρ_4Ε_ΒΡ1 水平降低。圖3B IOmM 二甲雙胍處理Jurkat細(xì)胞24、36及48小時(shí)。AKT和P-AKT無明顯變化。圖3C 二甲雙胍對(duì)AKT過表達(dá)的Jurkat細(xì)胞抗增殖效應(yīng)和Jurkat細(xì)胞類似。圖3D 二甲雙胍和AKT特異性抑制劑MERCK124005共同作用于Jurkat細(xì)胞，二甲雙胍的抗增殖效應(yīng)未受影響。圖4A 二甲雙胍提高B淋巴瘤細(xì)胞Daudi、SU-DHL_4對(duì)化療藥物阿霉素、地塞米松和mTOR抑制劑Temsirolimus的敏感性。圖4B 二甲雙胍提高T淋巴瘤細(xì)胞Hut78和Jurkat對(duì)化療藥物阿霉素、地塞米松和mTOR抑制劑Temsirolimus的敏感性。圖 5A =AMPK siRNA 轉(zhuǎn)染 Jurkat 細(xì)胞，AMPK siRNA Jurkat 細(xì)胞 AMPK 表達(dá)下調(diào)。圖 5B =AMPK siRNA Jurkat 細(xì)胞與 Con siRNA Jurkat 細(xì)胞相比，P21 的誘導(dǎo)上升和mTOR的抑制效應(yīng)也被削弱。圖5C:Con siRNA Jurkat 細(xì)胞存在G0/G1 期周期阻滯效應(yīng)，而 AMPK siRNA Jurkat 細(xì)胞G0/G1期周期阻滯效應(yīng)被取消。圖5D =AMPK siRNA Jurkat細(xì)胞二甲雙胍的抑制作用被減弱，同時(shí)，也削弱了二甲雙胍對(duì)阿霉素和Temsirolimus增敏作用。圖6A:10 mM二甲雙胍應(yīng)用48小時(shí)后原代白血病/淋巴瘤細(xì)胞生長抑制為33. 5%。圖6B 不同劑量二甲雙胍應(yīng)用48小時(shí)對(duì)造血干細(xì)胞的影響。圖6C 腹腔注射二甲雙胍抑制小鼠Daudi移植瘤生長，分小劑量組(2 mg/kg)和大劑量組(4 mg/kg)。
圖6D 腹腔注射二甲雙胍抑制小鼠Jurkat移植瘤生長，分小劑量組(2 mg/kg)和大劑量組(4 mg/kg)。圖6E 二甲雙胍治療組Daudi細(xì)胞P21表達(dá)明顯上調(diào)。圖6F 二甲雙胍治療組Jurkat細(xì)胞P21表達(dá)明顯上調(diào)。圖6G 二甲雙胍聯(lián)合阿霉素治療Daudi組，明顯抑制小鼠移植瘤生長。圖6H 二甲雙胍聯(lián)合阿霉素治療Jurkat組，明顯抑制小鼠移植瘤生長。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明提供的具體實(shí)施方式
作詳細(xì)說明。 實(shí)施例一、實(shí)驗(yàn)方法
(一)試劑
二甲雙胍購自Sigma公司，用PBS溶解。MTT，碘化丙啶(PI)，蛋白酶抑制劑，抗GAPDH 抗體購自Sigma公司。P21、P27、cyclin Dl抗體，辣根過氧化物酶偶聯(lián)的羊抗鼠二抗， 羊抗兔二抗和鼠抗羊二抗均購自Santa Cruz公司。P53、AMPK、P-AMPK、mTOR、p-mTOR、 P70S6K、p-P70S6K、4EBP-l、p-4EBP_l、AKT、p-AKT，購自 Cell Signaling 公司。AKT 抑制劑 MERCK124005 購自 Merck 公司。( 二 )細(xì)胞培養(yǎng)
本研究應(yīng)用了以下幾種人淋巴瘤細(xì)胞株Burkitt’ s淋巴瘤細(xì)胞株Namalwa、Daudi，該病即Burkitt淋巴瘤(BL)；彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞株SU-DHL-4、SU-DHL-5、DB, T細(xì)胞急性淋巴母細(xì)胞白血病細(xì)胞株Jurkat，耐6巰基嘌呤的T細(xì)胞急性淋巴母細(xì)胞白血病細(xì)胞株 6T-CEM，皮膚T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞株Hut78和H9，Kappas間變大細(xì)胞淋巴瘤。所有細(xì)胞株均購自美國ATCC，均用含10%熱滅活胎牛血清(Hyclone or Gibco)的RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)， 置于37°C、95%空氣、5%C02濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。隔日換液，調(diào)整細(xì)胞濃度為3-5X105/ml。 用臺(tái)盼藍(lán)計(jì)數(shù)計(jì)算細(xì)胞存活率。瑞氏染色法觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變。(三)MTT 實(shí)驗(yàn)
檢測(cè)不同濃度的二甲雙胍對(duì)各淋巴瘤細(xì)胞株的增殖抑制作用，計(jì)算半數(shù)生長抑制濃度 (IC50)o各淋巴瘤細(xì)胞株，以每孔20000個(gè)細(xì)胞接種于96孔板中，分別用終濃度為1、10、20 和40mM的二甲雙胍處理細(xì)胞。72小時(shí)后，向每孔中加入0. Img MTT, 37°C孵育4小時(shí)，在分光光度計(jì)490nm處檢測(cè)標(biāo)本吸光度值。每個(gè)藥物濃度設(shè)3復(fù)孔，并重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)。(四)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期
收集1-2 X IO6細(xì)胞，PBS洗滌，_20°C下75%乙醇固定過夜。檢測(cè)前加50mg/L的RNA酶 37°C孵育30分鐘，50mg/L的PI染色，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。(五)免疫印跡分析
收集各處理組細(xì)胞 6X106，用 100μ1 RIPA 裂解液(50mM Tris-HCl pH 8. 0,150mM NaCl，0. 1% SDS, 1% Nonidet P-40,0. 5% Na-deoxycholate)，加入終濃度各為 ImM 的 PMSF、 NaF、Na3VO4和lPg/ml cocktail蛋白酶抑制劑置于冰上，裂解30分鐘，12000rpm離心20 分鐘后，收集上清即為總蛋白；再加入1/5體積的6XLoading Buffer (0. 35mM Tris-HClpH6. 8,10% SDS, 5% β -mercaptoethanol, 36% glycerol, 0. 012% Bromophenol Blue)煮沸 10分鐘，分裝-80°C凍存。取蛋白在含SDS的89Γ15%聚丙烯酰胺凝膠中電泳，然后轉(zhuǎn)移至 PVDF膜上；PVDF膜用 TBS(20mM Tris-Hcl PH7. 4,150mM NaCl)配制的 5%脫脂牛奶室溫封閉1小時(shí)，之后與一抗在4°C孵育過夜。經(jīng)TBS-T(20mM Tris-Hcl PH7. 4,150mM NaCl, 0. 1% Tween20)漂洗3次，每次10分鐘后，在搖床上與辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗室溫孵育 1 小時(shí)。再用 TBS-T 漂洗 3 次 X 10 分鐘。用 Chemiluminescent Western Detection System (Cell Signaling Technology，USA)進(jìn)行化學(xué)發(fā)光顯影，X光片記錄影像。GAPDH作為內(nèi)參調(diào)整不同樣品的上樣量。條帶的信號(hào)強(qiáng)度用Quantity One version 4. 4.0 software軟件分析。(六)免疫組化染色
用superfrost玻璃片撈片，60°C烘烤30分鐘后，在Vatana半自動(dòng)免疫組化儀上進(jìn)行抗原修復(fù)及染色。(七)AMPKsiRNA轉(zhuǎn)染淋巴瘤細(xì)胞
(1)取Jurkat細(xì)胞2 X 106，離心后棄上清，盡可能吸棄上清。(2)配轉(zhuǎn)染液solution ν 82μ1 + supplement 1 18μ1 + 質(zhì)粒。(3)用轉(zhuǎn)染液重懸細(xì)胞，轉(zhuǎn)入電轉(zhuǎn)杯，加蓋。(4)電轉(zhuǎn)，選擇程序X-001。(5)取出電轉(zhuǎn)杯后，加500μ1預(yù)熱培養(yǎng)基后，小心轉(zhuǎn)入12孔板，終體積^iil。(6) 24小時(shí)后加嘌呤霉素，篩選濃度ml, 10-14天后濃度減半維持。(A)建立Daudi，Jurkat細(xì)胞淋巴瘤小鼠模型
雌性裸鼠(5-6周)購自上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，在無菌條件下飼養(yǎng)。注射Daudi細(xì)胞的裸鼠接種M小時(shí)前進(jìn)行300c Gy照射。每只小鼠右側(cè)肩部皮下注射l*107Daudi細(xì)胞， 4*107Jurkat細(xì)胞，3周左右在注射部位可及可測(cè)量的腫瘤，開始注射藥物治療。小鼠隨機(jī)分組，一組為對(duì)照組，對(duì)照組注射相同量的PBS，二甲雙胍腹腔注射治療組分二組，小劑量組 (2 mg/kg)和大劑量組(4 mg/kg)，每日一次；連續(xù)治療21天。二甲雙胍聯(lián)合阿霉素組分四組對(duì)照組，阿霉素組，二甲雙胍口服治療組，二甲雙胍聯(lián)合阿霉素組。對(duì)照組注射相同量的 PBS ；阿霉素組ang/kg，每周二次，連續(xù)二周；二甲雙胍口服治療組，口服:3mg/kg，二甲雙胍聯(lián)合阿霉素組，二甲雙胍口服:3mg/kg和阿霉素ang/kg，每周二次，連續(xù)二周。每組6只小鼠，每2天記錄小鼠腫瘤的長徑(a)和短徑(b)。第35天處死小鼠，取出腫瘤分3部分，一部分做電鏡，一部分瞬時(shí)冰凍-80°C保存，另一部分中性甲醛固定，石蠟包埋。(九)統(tǒng)計(jì)分析
實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差表示，用t檢驗(yàn)比較差異。P值小于0. 05 認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。所有統(tǒng)計(jì)采用SPSS16.0軟件。二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
(一)二甲雙胍抑制淋巴瘤細(xì)胞株生長
用MTT法檢測(cè)二甲雙胍對(duì)人淋巴瘤細(xì)胞株生長的影響。二甲雙胍對(duì)所有細(xì)胞株的半數(shù)生長抑制濃度(IC5tl)在8. 5 21. 2mM之間(圖1A)。不同濃度的二甲雙胍對(duì)所有被檢測(cè)的細(xì)胞株均有生長抑制作用。Daudi細(xì)胞顯示對(duì)二甲雙胍的抑制作用最敏感，其余B細(xì)胞如 Namalwa、SU-DHL-5，DB 和 T 細(xì)胞如 Jurkat、6T_CEM、Kappas、Hut78 和 H9 的 IC5tl 介于 15 20mM之間。SU-DHL-4和Jurkat對(duì)二甲雙胍相對(duì)不敏感。圖IB為Daudi, SU-DHL-4和Hut78、 Jurkat的劑量效應(yīng)曲線。圖IC為4個(gè)細(xì)胞株的時(shí)間效應(yīng)曲線，表明二甲雙胍對(duì)淋巴瘤細(xì)胞株生長抑制作用存在劑量和時(shí)間依賴性。淋巴瘤細(xì)胞2-8X IO5個(gè)細(xì)胞/毫升時(shí)，二甲雙胍的使用量為10-20mM。(二)二甲雙胍對(duì)人類淋巴瘤細(xì)胞株有周期阻滯
我們用IOmM 二甲雙胍分別處理Daudi、SU-DHL-4、Hut78和Jurkat 4個(gè)細(xì)胞株，36小時(shí)后檢測(cè)細(xì)胞周期(圖2A)。結(jié)果顯示，對(duì)照組Daudi和SU-DHL-4的G0/G1期的比例分別為 32. 6%士 1. 0%、33. 5%士4. 6%, 二甲雙胍(IOmM)治療組分別為 54. 6%士2. 3%,47. 8%士 1%。 兩組相比均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P < 0. 001 ；P < 0.01)。T細(xì)胞淋巴瘤/白血病細(xì)胞株 Hut78 和 Jurkat 也有相似的結(jié)果。(45. 9%士5. 9%,62. 3%士9. 5%, P < 0. 05 ；44. 5%士 1. 9%, 51. 2%士 1. 1%，P < 0. 01)。(三)二甲雙胍上調(diào)P21，但不影響P27、P53和CyclinDl
細(xì)胞周期由周期蛋白如CyclinDl，周期蛋白依賴性蛋白激酶抑制劑P21，P27及抑癌蛋白P53 (圖2B)。P21蛋白在腫瘤細(xì)胞中幾乎不表達(dá)或弱表達(dá)，經(jīng)二甲雙胍處理后，其表達(dá)水平隨處理時(shí)間的延長而顯著升高。這說明二甲雙胍通過P21上調(diào)阻滯腫瘤細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞周期，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和生存。已有研究表明，P27在許多人類腫瘤中是低表達(dá)甚至檢測(cè)不到其活性。在淋巴瘤細(xì)胞株，我們檢測(cè)到P27的表達(dá)。但用二甲雙胍處理細(xì)胞后，未檢測(cè)到P27的顯著上調(diào)，說明二甲雙胍并不通過P27這條信號(hào)通路來發(fā)揮作用。抑癌蛋白 P53負(fù)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期，我們發(fā)現(xiàn)P53在Daudi和SU-DHL-4兩個(gè)B淋巴瘤細(xì)胞株中高表達(dá)， 而在Hut78和Jurkat兩個(gè)T淋巴瘤細(xì)胞株中弱表達(dá)，當(dāng)用二甲雙胍處理細(xì)胞后，P53未有明顯變化。D型的周期蛋白在Gl期特別重要，有三種D型周期蛋白(Dl、D2、D3)，CyclinDl 在調(diào)節(jié)所有類型細(xì)胞的Gl期中起核心作用。在細(xì)胞Gl期，有絲分裂信號(hào)如生長因子，激活 CyclinDl基因的轉(zhuǎn)錄，增加了 CyclinDl-⑶K4/6復(fù)合物的濃度，促進(jìn)細(xì)胞通過調(diào)控點(diǎn)，進(jìn)入下一個(gè)調(diào)控節(jié)點(diǎn)。但是二甲雙胍對(duì)CyclinDl未有明顯的影響。因此二甲雙胍能使4個(gè)細(xì)胞株的P21明顯上調(diào)，而CyclinDl，P27，P53不變。二甲雙胍所致的腫瘤細(xì)胞生長抑制是由于P21上調(diào)阻滯細(xì)胞周期引起的。(四)二甲雙胍上調(diào)AMPK活性
在乳腺癌，結(jié)腸癌，前列腺癌，胰腺癌，二甲雙胍通過激活A(yù)MPK發(fā)揮抗腫瘤活性。因此我們推測(cè)二甲雙胍的抗淋巴瘤增殖活性涉及的是相同的信號(hào)通路。免疫印跡分析顯示，二甲雙胍能刺激AMPK磷酸化，并明顯地下調(diào)下游的效應(yīng)分子mTOR，P70S6K, 4E-BP1的磷酸化 (圖3A)。以上結(jié)果表明，二甲雙胍通過活化AMI3K來干擾淋巴瘤細(xì)胞生長。mTOR的抑制可能會(huì)促發(fā)負(fù)反饋調(diào)節(jié)，導(dǎo)致AKT信號(hào)的活化。而AKT是細(xì)胞內(nèi)重要的促存活分子。若負(fù)反饋激活A(yù)KT會(huì)削弱二甲雙胍的抗腫瘤效應(yīng)。然而我們發(fā)現(xiàn)二甲雙胍未引起總AKT和P-AKT的增加(圖;3B)。同時(shí)二甲雙胍對(duì)AKT過表達(dá)的Jurkat細(xì)胞抗增殖效應(yīng)和Jurkat細(xì)胞類似(圖3C)。而且二甲雙胍和AKT特異性抑制劑MERCK124005共同作用于Jurkat細(xì)胞，二甲雙胍的抗增殖效應(yīng)未受影響(圖3D)。以上資料表明二甲雙胍未引起 AKT信號(hào)的活化。(五)二甲雙胍提高淋巴瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物和mTOR抑制劑Temsirolimus的敏感性二甲雙胍聯(lián)合化療藥物如阿霉素、地塞米松及mTOR抑制劑"Temsirol imus處理Daudi、SU-DHL-4、Hut78和Jurkat 4個(gè)細(xì)胞株，72小時(shí)后通過MTT檢測(cè)細(xì)胞生長抑制率。結(jié)果顯示二甲雙胍顯著增加這些藥物對(duì)淋巴瘤的細(xì)胞毒作用，即使在一個(gè)相對(duì)小的濃度1. 25mM 時(shí)也能發(fā)揮作用。因此二甲雙胍能提高化療藥物的敏感性(圖4A、B)。二甲雙胍與阿霉素作為具有協(xié)同作用的治療淋巴瘤的組合藥物時(shí)，二甲雙胍和阿霉素的比例為1. 25-20 mM: 6. 25-50ng/ml ；二甲雙胍與地塞米松作為具有協(xié)同作用的治療淋巴瘤的組合藥物時(shí)，二甲雙胍和地塞米松的比例為1.25-20 mM: 1-1000 nM ； 二甲雙胍與Temsirolimus作為具有協(xié)同作用的治療淋巴瘤的組合藥物時(shí)，二甲雙胍和 Temsirolimus 的比例為1. 25-20 mM: 0. 1-10 nM。為了檢測(cè)二甲雙胍的抗增殖效應(yīng)是否為AMPK依賴的，我們使用了 AMPK小干擾RNA 轉(zhuǎn)染Jurkat細(xì)胞。圖5A顯示AMPK siRNA Jurkat細(xì)胞與Con siRNA Jurkat細(xì)胞相比， AMPK的表達(dá)下調(diào)。圖5B顯示P21的誘導(dǎo)上升和mTOR的抑制效應(yīng)也被削弱了。同時(shí)二甲雙胍處理AMPK siRNA Jurkat細(xì)胞，G0/G1期周期阻滯效應(yīng)也被取消(圖5C)。Jurkat細(xì)胞 AMPK- α亞單位下調(diào)后，部分抵消了二甲雙胍對(duì)Jurkat細(xì)胞的抑制作用。同時(shí)也削弱了二甲雙胍對(duì)阿霉素和Temsirolimus增敏作用(圖5D)。因此二甲雙胍對(duì)淋巴瘤的的抗增殖效應(yīng)為AMPK依賴性。(六)二甲雙胍對(duì)患者原代細(xì)胞的作用
為了進(jìn)一步確定二甲雙胍對(duì)原代細(xì)胞的作用，我們收集了 3例T-細(xì)胞白血病/淋巴瘤患者的骨髓標(biāo)本。MTT結(jié)果顯示，IOmM 二甲雙胍應(yīng)用48小時(shí)后腫瘤細(xì)胞生長抑制為33. 5% (圖6A)。另外，我們也觀察了二甲雙胍對(duì)正常人造血干細(xì)胞的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)二甲雙胍應(yīng)用 48小時(shí)后，對(duì)從外周血分離的⑶34+造血干細(xì)胞沒有明顯生長抑制作用(圖6B)。(七)二甲雙胍抑制移植小鼠中腫瘤生長
我們通過小鼠移植瘤模型研究了二甲雙胍在體內(nèi)的抗白血病/淋巴瘤活性。在所用的四種細(xì)胞株中，接種Daudi和Jurkat細(xì)胞后，裸鼠接種部位出現(xiàn)瘤塊，并且，所有裸鼠在皮下接種細(xì)胞觀天后，接種部位都出現(xiàn)了瘤塊。二甲雙胍腹腔注射治療組，小劑量組(2 mg/ kg)和大劑量組(4 mg/kg)裸鼠的瘤體積明顯小于對(duì)照組裸鼠的瘤體積(圖6C、D)。為了進(jìn)一步證實(shí)體外P21在細(xì)胞周期阻滯中的作用，我們通過免疫組化方法檢測(cè)了瘤組織切片中P21表達(dá)情況，結(jié)果顯示治療組腫瘤細(xì)胞P21表達(dá)明顯高于對(duì)照組(圖6E、 F)。體外試驗(yàn)中，二甲雙胍增加阿霉素的化療敏感性，在小鼠移植瘤模型中，我們進(jìn)一步驗(yàn)證了該結(jié)果。二甲雙胍聯(lián)合阿霉素治療組裸鼠的瘤體積明顯小于對(duì)照組及單一藥物治療組裸鼠的瘤體積，進(jìn)一步在體內(nèi)證實(shí)了二甲雙胍的增敏作用(圖6G、H)。三、討論
本發(fā)明顯示，二甲雙胍在體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)中對(duì)淋巴瘤細(xì)胞有抑制作用。首次把二甲雙胍用于淋巴細(xì)胞惡性腫瘤的治療。二甲雙胍通過上調(diào)P21，細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期而抑制淋巴瘤細(xì)胞生長。文獻(xiàn)也有類似報(bào)道，Zhuang等研究顯示，二甲雙胍上調(diào)乳腺癌細(xì)胞P21 致細(xì)胞周期阻滯。除了淋巴瘤細(xì)胞株，二甲雙胍還抑制原代T-白血病/淋巴瘤細(xì)胞的增殖， 對(duì)從外周血分離的⑶34+造血干細(xì)胞沒有明顯毒性，保證了二甲雙胍臨床使用的安全性。 而且二甲雙胍顯著抑制小鼠移植瘤的生長，沒有明顯的全身毒性。這預(yù)示著二甲雙胍有可能成為治療腫瘤的一個(gè)老藥新用的例子。本發(fā)明探討了二甲雙胍對(duì)細(xì)胞周期的影響。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)二甲雙胍可導(dǎo)致G0/G1期阻滯，這個(gè)結(jié)果與其它文獻(xiàn)報(bào)道一致。本發(fā)明進(jìn)一步探討了對(duì)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的影響。細(xì)胞周期由周期蛋白如CyclinDl，周期蛋白依賴性蛋白激酶(⑶K)及⑶K抑制劑(CKI)P21， P27等。周期蛋白和相應(yīng)的蛋白激酶形成復(fù)合物，蛋白激酶獲得活性，推動(dòng)細(xì)胞周期不斷運(yùn)行。而CKI能抑制大多數(shù)CDK的激酶活性。既往研究顯示在乳腺癌細(xì)胞中二甲雙胍下調(diào) CyclinDl，導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯，并且周期阻滯效應(yīng)依賴P21和P27的存在。在胰腺癌細(xì)胞中， 二甲雙胍下調(diào)CyclinDl，上調(diào)P27致細(xì)胞周期阻滯。本發(fā)明的研究發(fā)現(xiàn)對(duì)于淋巴瘤細(xì)胞二甲雙胍上調(diào)P21，從而阻滯細(xì)胞周期，抑制腫瘤細(xì)胞增值和生存，但CyclinDl、P27、P53未見明顯變化。在細(xì)胞有絲分裂期，AMPK是一個(gè)重要的參與者。AMPK是mTOR上游信號(hào)分子，具有腫瘤抑制活性，成為新陳代謝和腫瘤相互關(guān)系中的一個(gè)關(guān)鍵的因子二甲雙胍活化能量感受器AMPK，抑制腫瘤細(xì)胞生長。本發(fā)明研究顯示二甲雙胍激活A(yù)MPK而抑制下游的mTOR信號(hào)。既往研究顯示在乳腺癌細(xì)胞中AMH(上調(diào)P21和P53導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯。本發(fā)明的研究發(fā)現(xiàn)對(duì)于淋巴瘤細(xì)胞二甲雙胍上調(diào)P21，但P53未見明顯變化。本發(fā)明用AMPK-α si RNA 下調(diào)AMPK來進(jìn)一步研究AMPK的作用。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，不僅二甲雙胍的G0/G1期周期阻滯效應(yīng)被削弱，而且對(duì)淋巴瘤細(xì)胞的抑制作用和對(duì)阿霉素和Temsirolimus增敏作用也被削弱。 說明二甲雙胍對(duì)淋巴瘤的的抗增殖效應(yīng)為AMH(依賴性。實(shí)際上，AMPKa催化亞單位的活化形式和細(xì)胞中間體和中心體的有絲分裂調(diào)節(jié)因子相互作用協(xié)調(diào)細(xì)胞有絲分裂時(shí)基因分開的基本生理過程，而這也與AMPK的腫瘤抑制活性有著直接的關(guān)系。mTOR信號(hào)控制mRNA翻譯和蛋白合成，在淋巴瘤細(xì)胞中持續(xù)活化。二甲雙胍不僅能調(diào)節(jié)細(xì)胞周期，它還調(diào)節(jié)mTOR信號(hào)通路。本發(fā)明的結(jié)果也顯示，二甲雙胍以AMPK依賴的方式抑制mTOR信號(hào)，從而抑制淋巴瘤細(xì)胞生長。mTORCl特異性抑制劑雷帕霉素及其衍生物CCI779已經(jīng)作為抗腫瘤藥物應(yīng)用于臨床試驗(yàn)。但是臨床試驗(yàn)表明這兩種化合物的抗腫瘤效應(yīng)有限。比如在急性髓系白血病AML或與化療藥物聯(lián)合使用時(shí)抗腫瘤效應(yīng)有限。其原因有AKT反饋性地激活和P-4EBP1持續(xù)高表達(dá)。而二甲雙胍未導(dǎo)致AKT反饋性地激活，且能顯著下調(diào)P-4EBP1。而且二甲雙胍與mTOR抑制劑CCI779有協(xié)同效應(yīng)，更加提示二甲雙胍在淋巴瘤治療中的有效性。二甲雙胍能增加化療藥物的抗腫瘤效應(yīng)。二甲雙胍抑制耐藥的卵巢癌細(xì)胞的增殖，P21上調(diào)，細(xì)胞周期阻滯，P-mT0R降低?；仡櫺苑治鲲@示把二甲雙胍作為乳腺癌一個(gè)新的輔助治療可以提高病人病理學(xué)完全緩解率。本發(fā)明研究顯示小劑量二甲雙胍和化療藥物有協(xié)同效應(yīng)。體內(nèi)，二甲雙胍顯著加強(qiáng)阿霉素的療效。這些結(jié)果表明有必要在以后的臨床試驗(yàn)中進(jìn)一步評(píng)估二甲雙胍的抗腫瘤效應(yīng)?？傊?，淋巴瘤存在mTOR信號(hào)通路的失調(diào)，故靶向AMPK的治療提供了一個(gè)機(jī)會(huì)。二甲雙胍便宜，安全，耐受性好，為淋巴瘤的治療提供新的策略。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明方法的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和補(bǔ)充，這些改進(jìn)和補(bǔ)充也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.二甲雙胍在制備治療淋巴瘤疾病藥物中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，淋巴瘤細(xì)胞為2-8X IO5個(gè)細(xì)胞/毫升時(shí)， 二甲雙胍的使用量為10-20mM。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，二甲雙胍在制備治療Burkitt’s淋巴瘤藥物中的應(yīng)用。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，二甲雙胍在制備治療彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤藥物中的應(yīng)用。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，二甲雙胍在制備治療T細(xì)胞急性淋巴母細(xì)胞白血病藥物中的應(yīng)用。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，二甲雙胍在制備治療耐6巰基嘌呤的T細(xì)胞急性淋巴母細(xì)胞白血病藥物中的應(yīng)用。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，二甲雙胍在制備治療皮膚T細(xì)胞淋巴瘤藥物中的應(yīng)用。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，二甲雙胍在制備治療Kappas間變大細(xì)胞淋巴瘤藥物中的應(yīng)用。
9.一種具有協(xié)同作用的治療淋巴瘤的組合藥物，其特征在于，所述的組合藥物由二甲雙胍和阿霉素組成。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的組合藥物，其特征在于，所述的二甲雙胍和阿霉素的比例為 1.25-20 mM: 6.25-50ng/mlo
11.一種具有協(xié)同作用的治療淋巴瘤的組合藥物，其特征在于，所述的組合藥物由二甲雙胍和地塞米松組成。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的組合藥物，其特征在于，所述的二甲雙胍和地塞米松的比例為 1. 25-20 mM: 1-1000 nM。
13.一種具有協(xié)同作用的治療淋巴瘤的組合藥物，其特征在于，所述的組合藥物由二甲雙胍和mTOR抑制劑Temsirolimus組成。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的組合藥物，其特征在于，所述的二甲雙胍和Temsirolimus 的比例為 1. 25-20 mM: 0. 1-10 nM。
15.根據(jù)權(quán)利要求9-14任一所述的組合藥物在制備治療淋巴瘤疾病藥物中的應(yīng)用。
16.根據(jù)權(quán)利要求12所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的組合藥物在制備治療Burkitt’s 淋巴瘤、或彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤、或T細(xì)胞急性淋巴母細(xì)胞白血病、或皮膚T細(xì)胞淋巴瘤藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及二甲雙胍在制備治療淋巴瘤疾病藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供一種具有協(xié)同作用的治療淋巴瘤的組合藥物及其應(yīng)用。本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)在于通過使用本發(fā)明的藥物，可以抑制惡性淋巴瘤細(xì)胞生長增殖，使淋巴瘤細(xì)胞株周期阻滯，上調(diào)P21，調(diào)節(jié)AMPK/mTOR信號(hào)傳導(dǎo)通路；本發(fā)明開拓了傳統(tǒng)降糖藥物二甲雙胍的新用途，二甲雙胍費(fèi)用低，安全，耐受性好，易被患者接受，抑制淋巴瘤細(xì)胞生長增殖，并且提高淋巴瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物阿霉素和mTOR抑制劑Temsirolimus的敏感性，為淋巴瘤的治療提供了新的策略。
文檔編號(hào)A61K31/704GK102327256SQ201110282718
公開日2012年1月25日 申請(qǐng)日期2011年9月22日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月22日
發(fā)明者施文瑜, 王黎, 肖丹, 趙維蒞 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院