專利名稱：姜黃素在制備甲狀腺癌治療劑中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種治療甲狀腺癌的藥物，具體的說(shuō)是將姜黃素及其衍生物用于在制備甲狀腺癌治療劑中的應(yīng)用，屬于姜黃素的醫(yī)藥用途技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
甲狀腺癌是內(nèi)分泌系統(tǒng)最常見(jiàn)的腫瘤，是由數(shù)種不同生物學(xué)行為以及不同病理類型的癌腫組成，主要包括乳頭狀癌(papillary thyroid carainoma，PTC)、濾泡 ^ IS (follicular thyroid carainoma, FTC)> 未分化癌(undifferentiated thyroid carainoma，uDTC)、髓樣癌(medulla thyroid carcinoma，MTC))四種類型。甲狀腺癌的發(fā)病率為2 - 10/10萬(wàn)，約占全身惡性腫瘤的1%。據(jù)國(guó)際癌癥學(xué)會(huì)資料統(tǒng)計(jì)，各國(guó)甲狀腺癌的發(fā)病率逐年增加。2009年，美國(guó)甲狀腺癌的新發(fā)病例數(shù)達(dá)37200， 死亡病例數(shù)為1630，主要是PTC發(fā)病率的增加。研究調(diào)查結(jié)果顯示，我國(guó)甲狀腺癌的發(fā)病率也在明顯增加。而且，在國(guó)內(nèi)一些腫瘤醫(yī)院中，甲狀腺癌占頭頸部腫瘤的首位。姜黃素(curcumin)是從姜科姜黃屬植物姜黃中提取得到的一種植物多酚。除姜黃外，咖喱、芥茉中也富含姜黃素，因其毒副作用小，已廣泛用作食品天然色素。同時(shí)姜黃素的藥理作用廣泛，是抗突變劑，也是抗癌劑，美國(guó)國(guó)家腫瘤研究所已將其列為第三代癌化學(xué)預(yù)防藥。近年來(lái)，對(duì)姜黃素在各種生物學(xué)體系的作用機(jī)制的研究越來(lái)越多，姜黃素顯著抑制腫瘤細(xì)胞增殖也得以證實(shí)。姜黃素抗腫瘤作用的分子機(jī)制相當(dāng)復(fù)雜，其作用靶點(diǎn)從基因 (DNA)水平到mRNA水平及酶(蛋白質(zhì))水平，姜黃素可能在某一水平或在這幾個(gè)水平上同時(shí)產(chǎn)生作用?？偨Y(jié)起來(lái)其抗癌機(jī)制有以下幾方面(1)細(xì)胞毒作用；(2)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡； (3)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化；(4)抑制腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移。目前已有文獻(xiàn)報(bào)道姜黃素對(duì)多種腫瘤細(xì)胞具有殺傷作用，但姜黃素對(duì)甲狀腺癌細(xì)胞的作用國(guó)內(nèi)外均尚無(wú)報(bào)道。我們通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)姜黃素可特異性殺傷甲狀腺癌細(xì)胞而對(duì)正常甲狀腺細(xì)胞影響較小并能促進(jìn)甲狀腺癌細(xì)胞凋亡，引起聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARP) 的切割并顯著抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，同時(shí)能夠抑制甲狀腺癌細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶-9的分泌和對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)的粘附，對(duì)甲狀腺癌細(xì)胞的增殖、遷移、粘附各環(huán)節(jié)都顯示出良好的干預(yù)作用，可以用于制備治療甲狀腺癌藥物的應(yīng)用。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供姜黃素在制備治療甲狀腺癌藥物的用途。姜黃素化學(xué)命名1，7_bis_(4-hydroxy-3_methoxyphenyl)_1，6-heptadiene_3，5-dione,英文名為 curcumin，分子式為C21H2tlO6,分子量368. 37，對(duì)人體毒性小。本發(fā)明的技術(shù)方案姜黃素及其衍生物的應(yīng)用，用于制備治療甲狀腺癌的藥物。抑制甲狀腺癌細(xì)胞增殖，使甲狀腺癌細(xì)胞接觸姜黃素，姜黃素能夠抑制甲狀腺癌細(xì)胞增殖。誘導(dǎo)甲狀腺癌細(xì)胞凋亡，使甲狀腺癌細(xì)胞接觸姜黃素，姜黃素能誘導(dǎo)甲狀腺癌細(xì)胞凋亡。誘導(dǎo)甲狀腺癌細(xì)胞凋亡，姜黃素誘導(dǎo)甲狀腺癌細(xì)胞凋亡的機(jī)制主要是通過(guò)促進(jìn)甲狀腺癌細(xì)胞PARP的切割并抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)。抑制甲狀腺癌細(xì)胞侵襲及轉(zhuǎn)移，使甲狀腺癌細(xì)胞接觸姜黃素，姜黃素能抑制甲狀腺癌細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶一 9的分泌和對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)的粘附。所述姜黃素選用姜黃素、去甲氧基姜黃素、或雙去甲氧基姜黃素；姜黃素衍生物選用取代姜黃素中的甲氧基或雙甲氧基的基團(tuán)后的衍生物。姜黃素及其衍生物用化學(xué)合成方法制備得到。姜黃素及其衍生物從植物提取得到。姜黃素及其衍生物用于制備治療甲狀腺癌藥物劑型為液體制劑、顆粒劑、片劑、 沖劑、膠丸、膠囊、緩釋劑、滴丸劑、口崩制劑或注射劑。腫瘤細(xì)胞最顯著的特點(diǎn)之一就是其生長(zhǎng)不受機(jī)體控制，進(jìn)入無(wú)限增殖狀態(tài)。這可能與細(xì)胞正常的生長(zhǎng)調(diào)控機(jī)制發(fā)生障礙有關(guān)。我們研究發(fā)現(xiàn)姜黃素對(duì)于惡性程度不同的甲狀腺癌細(xì)胞均有不同程度的抑制增殖作用，其中以濾泡癌FTC-133最為敏感。30 μΜ姜黃素作用，F(xiàn)TC-133細(xì)胞死亡率達(dá)40. 9 士 5. 7%，而乳頭狀癌Kl為23. 3 士 8. 3%，未分化癌8505C 為7. 9士 1. 7%。目前臨床使用的抗癌藥物多無(wú)選擇性，有不同程度的毒副作用，藥物在消滅腫瘤細(xì)胞的同時(shí)也破壞正常細(xì)胞。然而，我們研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)于原代培養(yǎng)的甲狀腺正?；虬┘?xì)胞，高劑量的姜黃素(50 μ Μ)對(duì)甲狀腺癌細(xì)胞殺傷強(qiáng)度要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于對(duì)正常甲狀腺細(xì)胞的損害(50. 5士4. 68% vs20. 87士 1. 65%)，顯示出一定的腫瘤殺傷特異性。在腫瘤發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中，細(xì)胞不僅發(fā)生了異常增殖，更重要的是其發(fā)生凋亡的能力和傾向降低了。姜黃素與Kl或FTC-133細(xì)胞作用對(duì)小時(shí)后，Armexin V/PI雙染，流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，姜黃素可梯度依賴性地誘導(dǎo)Kl和FTC-133細(xì)胞凋亡。當(dāng)姜黃素濃度達(dá) 40 μ M時(shí)，所有細(xì)胞幾乎都發(fā)生了凋亡，其中Kl細(xì)胞的凋亡率為99. 41%，F(xiàn)TC-133細(xì)胞的凋亡率為99. 56%οBcl-2家族在細(xì)胞凋亡調(diào)控中有重要的作用，是目前細(xì)胞凋亡研究的熱點(diǎn)之一。 Bcl-2家族分為抑制凋亡和促進(jìn)凋亡蛋白兩大類。Bcl-2和Bax分別是Bcl_2家族中最主要的抑制凋亡和促進(jìn)凋亡蛋白。當(dāng)細(xì)胞凋亡，DNA發(fā)生損傷時(shí)，聚腺苷二磷酸核糖聚合酶 (PARP)可作為細(xì)胞內(nèi)的分子感受器，識(shí)另I」、結(jié)合到DNA斷裂處，并被激活。我們通過(guò)western blot方法檢測(cè)，姜黃素梯度依賴性地促進(jìn)Kl和FTC-133細(xì)胞PARP的切割并抑制Bcl_2的表達(dá)，其中20 μ M以上姜黃素對(duì)Bcl-2的抑制效果極為顯著。腫瘤轉(zhuǎn)移是一個(gè)多步驟、多因素、多基因相互作用的連續(xù)復(fù)雜的過(guò)程。一個(gè)有轉(zhuǎn)移潛能的腫瘤細(xì)胞從離開(kāi)腫瘤原發(fā)部位到新的部位扎根增殖，需要經(jīng)過(guò)許多步驟1.原發(fā)部位的細(xì)胞轉(zhuǎn)化和腫瘤生長(zhǎng)；2.原發(fā)部位血管生長(zhǎng)因子的合成與分泌以及血管形成； 3.癌細(xì)胞浸潤(rùn)薄壁淋巴管、小靜脈或毛細(xì)管的基質(zhì)；4.癌細(xì)胞進(jìn)入血循環(huán)或淋巴循環(huán)繼續(xù)存活并隨之轉(zhuǎn)運(yùn)；5.癌細(xì)胞通過(guò)粘附新部位的內(nèi)皮細(xì)胞或暴露的內(nèi)皮下基底膜而被捕獲；6.癌細(xì)胞通過(guò)降解細(xì)胞外基質(zhì)而滲出血管或淋巴管；7.癌細(xì)胞在新的部位增殖，形成腫瘤。目前已知，轉(zhuǎn)移的腫瘤細(xì)胞通常會(huì)發(fā)生一系列的生理生化過(guò)程，包括細(xì)胞骨架的重排、粘附能力的改變及運(yùn)動(dòng)能力的提高，并可合成分泌蛋白水解酶來(lái)降解基底膜等。這些變化在腫瘤細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)移的過(guò)程中起到了十分重要的作用。通過(guò)明膠酶譜分析，我們發(fā)現(xiàn)姜黃素與Kl細(xì)胞作用M小時(shí)后，可梯度依賴性地抑制基質(zhì)金屬蛋白酶-9的活性，其中 25，50，100 μ M姜黃素能夠極顯著地抑制基質(zhì)金屬蛋白酶-9的活性。同時(shí)對(duì)細(xì)胞做粘附分析，發(fā)現(xiàn)姜黃素可顯著降低甲狀腺癌細(xì)胞對(duì)胞外基質(zhì)I型膠原蛋白的粘附。與溶劑對(duì)照組相比，以姜黃素12. 5，25，50 μ M處理FTC-133細(xì)胞，可將細(xì)胞粘附率分別由69. 2士7. 7%， 60. 8 士 1. 9%, 65. 5 士8. 4% 降低至 28. 5 士0. 9%，6 士4. 5%, 6. 8 士 5. 6%，抑制效果極其顯著。本發(fā)明的有益效果(1)提出了姜黃素的新用途；(2)姜黃素可特異性殺傷甲狀腺癌細(xì)胞而對(duì)正常甲狀腺細(xì)胞影響較小并能促進(jìn)甲狀腺癌細(xì)胞凋亡，引起PARP的切割并顯著抑制抗凋亡Bcl-2的表達(dá)，同時(shí)能夠抑制甲狀腺癌細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶-9的分泌并降低細(xì)胞對(duì)胞外基質(zhì)的粘附，對(duì)甲狀腺癌細(xì)胞的增殖、遷移、粘附各環(huán)節(jié)都顯示出良好的干預(yù)作用；(3)姜黃素對(duì)人體正常細(xì)胞安全、低毒，可用于治療甲狀腺癌的藥物。
圖1姜黃素對(duì)三種甲狀腺癌細(xì)胞(Kl，F(xiàn)TC-133，8505C)的生長(zhǎng)抑制率比較。 姜黃素與細(xì)胞作用M小時(shí)后，Hoechest/PI雙染，計(jì)數(shù)細(xì)胞死亡率。溶劑對(duì)照(0.1% DMSO). *P<0. 05，**P<0. 01 vs 溶劑對(duì)照(學(xué)生 t 檢驗(yàn)).
圖2姜黃素對(duì)原代培養(yǎng)甲狀腺正常及癌細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率比較。溶劑對(duì)照(0.1% DMSO). . *P<0. 05，#P<0.01 vs溶劑對(duì)照(學(xué)生t檢驗(yàn)).##P<0. 01，原代甲狀腺正常細(xì)胞與原代甲狀腺癌細(xì)胞比較.
圖3姜黃素誘導(dǎo)甲狀腺癌細(xì)胞凋亡。姜黃素與細(xì)胞作用M小時(shí)后，Armexin V/PI雙染，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。(A) Kl0 (B)FTC-133。圖4姜黃素促進(jìn)甲狀腺癌細(xì)胞PARP的切割并抑制Bcl-2的表達(dá)。圖5姜黃素抑制甲狀腺癌細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶-9的分泌。圖6姜黃素降低甲狀腺癌細(xì)胞對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)的粘附。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例和附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明。實(shí)施例1 姜黃素抑制原代培養(yǎng)或甲狀腺癌細(xì)胞株的增殖。1.實(shí)驗(yàn)材料
下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法和所用的試劑，如無(wú)特別說(shuō)明，均為常規(guī)方法和常規(guī)試劑。1. 1細(xì)胞系本實(shí)驗(yàn)中所用乳頭狀癌細(xì)胞株K1、濾泡狀癌細(xì)胞株FTC-133、未分化癌細(xì)胞株8505C均購(gòu)自歐洲細(xì)胞庫(kù)。FTC-133細(xì)胞使用DMEM與Hams F-12培養(yǎng)基1 1(ν/ ν)培養(yǎng)；Kl細(xì)胞使用DMEM培養(yǎng)基、Hams F-12培養(yǎng)基與MCDB105培養(yǎng)基2 1 1 (ν/ν)培養(yǎng)， 8505C細(xì)胞使用MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。以上三株細(xì)胞在相應(yīng)培養(yǎng)基中均添加10%胎牛血清(杭州四季青)培養(yǎng)。1. 2原代細(xì)胞培養(yǎng)流程取適量臨床手術(shù)并經(jīng)病理鑒定的甲狀腺癌組織、癌旁或?qū)?cè)正常甲狀腺組織，用含1000 U/mL硫酸慶大霉素的1640培養(yǎng)基洗滌3次，去除包膜和結(jié)締組織，剪成1立方毫米大小碎塊。用0. (600 U/mL)膠原酶37°C消化，每15分鐘振搖一次，4小時(shí)后吸取上清，800 rpm離心10分鐘后，棄上清，細(xì)胞重懸于紅細(xì)胞裂解液中3 分鐘，再以1000 rpm離心10分鐘，棄上清。細(xì)胞重懸，用含15%胎牛血清和1U/L牛促甲狀腺激素(TSH)和100 U/mL青-鏈霉素的F-12培養(yǎng)基常規(guī)二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)。1.3姜黃素的配制姜黃素(sigma公司，貨號(hào)C7727，純度彡80%)以二甲基亞砜 (DMSO)充分溶解，配成lOmg/mL貯存液，-20°C保存。臨用時(shí)以各細(xì)胞使用的培養(yǎng)基稀釋到所需藥物濃度。2.實(shí)驗(yàn)方法
2. 1 細(xì)胞處理當(dāng)原代培養(yǎng)的甲狀腺癌細(xì)胞或甲癌細(xì)胞株匯合度達(dá)80%左右時(shí)， 進(jìn)行胰酶消化，按10000個(gè)細(xì)胞/孔接種于96孔板中，待細(xì)胞貼壁后給藥，以不同濃度的姜黃素(10，20，30，40，50 μ M)作用M小時(shí)，溶劑對(duì)照組按姜黃素最大劑量(50 μ Μ)中所含溶劑的量加入0. 18% (ν/ν)的DMS0。藥物作用結(jié)束后，加入碘化吡啶(PI) (10 μ g/ mL)和赫斯特33；342 熒光染料(Hoechest 33；342) (10 μ g/mL)染色10分鐘后，熒光顯微鏡下(Olympus，1X5)拍攝5個(gè)視野，計(jì)數(shù)。細(xì)胞死亡率(%)= (PI陽(yáng)性染色細(xì)胞/總細(xì)胞數(shù))X 100%。2.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果
姜黃素與甲狀腺癌細(xì)胞株或原代培養(yǎng)甲狀腺正?；虬┘?xì)胞共孵M小時(shí)后，Hoechest 33342/PI雙染，計(jì)算PI陽(yáng)性細(xì)胞比例。如圖1所示，姜黃素對(duì)于惡性程度不同的甲狀腺癌細(xì)胞均有不同程度的殺傷作用，其中以濾泡癌FTC-133最為敏感。30 μ M姜黃素作用，F(xiàn)TC-133細(xì)胞死亡率達(dá)40. 9 士 5. 7%，而乳頭狀癌Kl為23. 3 士8. 3%，未分化癌8505C為 7.9士 1.7%。圖2顯示，對(duì)于原代培養(yǎng)的甲狀腺正常或癌細(xì)胞，高劑量的姜黃素(50 μΜ)對(duì)甲癌細(xì)胞殺傷強(qiáng)度要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于對(duì)正常甲狀腺細(xì)胞的損害(50. 5士4. 68% vs20. 87士 1. 65%)， 顯示出一定的腫瘤殺傷特異性。實(shí)施例2 姜黃素對(duì)原代培養(yǎng)或甲狀腺癌細(xì)胞株的生長(zhǎng)抑制作用。1.實(shí)驗(yàn)材料
AnnexinV-FITC (異硫氰酸熒光素標(biāo)記的磷脂結(jié)合蛋白5)細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒，BD Pharmingen 公司，貨號(hào) 556547。2.實(shí)驗(yàn)方法
凋亡檢測(cè)按照BD公司ArmexinV-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒使用說(shuō)明進(jìn)行。細(xì)胞重懸于1 X結(jié)合緩沖液中，調(diào)整到1 X lOVmL,每100 μ L細(xì)胞懸液中加入5 μ L的Annexin V-FITC和5 μ L的PI溶液，室溫避光保存15分鐘。進(jìn)行流式細(xì)胞儀分析前每管中加入400 μ L 1 X結(jié)合緩沖液。流式細(xì)胞儀，F(xiàn)Ll和FL2通道分別檢測(cè)AnnexinV和PI陽(yáng)性細(xì)胞，統(tǒng)計(jì)分析細(xì)胞凋亡率。3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果
姜黃素與Kl或FTC-133細(xì)胞作用M小時(shí)后，Annexin V/PI雙染，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。 如圖3所示，姜黃素可梯度依賴性地誘導(dǎo)Kl和FTC-133細(xì)胞凋亡。當(dāng)姜黃素濃度達(dá)40 μ M 時(shí)，所有細(xì)胞幾乎都發(fā)生了凋亡，其中Kl細(xì)胞的凋亡率為99. 41%，F(xiàn)TC-133細(xì)胞的凋亡率為 99. 56%ο實(shí)施例3 姜黃素促進(jìn)甲狀腺癌細(xì)胞PARP的切割并抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)。1.實(shí)驗(yàn)材料
PARP —抗，碧云天生物技術(shù)公司，1 1000稀釋；Bcl-2 —抗，碧云天生物技術(shù)公司，1 1000稀釋；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗兔二抗，碧云天生物技術(shù)公司，1 1000稀釋。ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒，碧云天生物技術(shù)公司。2.實(shí)驗(yàn)方法
細(xì)胞內(nèi)凋亡蛋白表達(dá)的檢測(cè)采用Astern blot法。Kl和FTC-133細(xì)胞以4X IO5個(gè)/ mL的密度接種到6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔1 mL，37°C、5% CO2培養(yǎng)過(guò)夜后，加入不同濃度的姜黃素(10-50 μ Μ)或溶劑對(duì)照分組處理，培養(yǎng)結(jié)束后收集細(xì)胞，6000 rpm離心5分鐘，PBS 洗滌兩次，加入25 μ L細(xì)胞裂解緩沖液[150 mM NaCl，l%(w/v)已基苯基聚乙二醇，0.0 (w/v)疊氮化納，10 μ g/mL苯甲基磺酰氟，50 mM Tris-HCl (pH8. 0)]裂解細(xì)胞，裂解產(chǎn)物在41下10，000 rpm離心5離心，收集上清，考馬斯亮蘭法測(cè)定蛋白濃度。取30 yg蛋白，加入4 PL上樣緩沖液(500 mM三羥甲基氨基甲烷，600 mM 二硫蘇糖醇，20. 3% (w/v) 十二烷基硫酸鈉，30% (ν/ν)甘油，0.012% (w/v)溴酚蘭，pH 6. 8)，煮沸5分鐘，15% (w/v) SDS-PAGE凝膠電泳，濕法轉(zhuǎn)膜，硝酸纖維素膜室溫下置于含5% (w/v)脫脂牛奶的TBST緩沖液(137 mM NaCl, 20 mM三羥甲基氨基甲烷-HCl，0. 1%(ν/ν)吐溫_20，pH 7.6)中封閉1 小時(shí)，孵育PARP、Bcl-2 —抗，4°C過(guò)夜，用TBST緩沖液清洗三次，每次5分鐘，孵育辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔或抗鼠二抗，室溫下1小時(shí)，生物素標(biāo)記法化學(xué)發(fā)光，X光膠片感光顯影。3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果
姜黃素與Kl或FTC-133細(xì)胞作用M小時(shí)后，western blot檢測(cè)PARP的切割及抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)水平。如圖4所示，姜黃素梯度依賴性地促進(jìn)Kl和FTC-133細(xì)胞PARP的切割并抑制Bcl-2的表達(dá)。其中20 μ M以上姜黃素對(duì)Bcl-2的抑制效果尤為顯著。β -肌動(dòng)蛋白(β -actin)作為內(nèi)參對(duì)照。實(shí)施例4 姜黃素抑制甲狀腺癌細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶的分泌。1.實(shí)驗(yàn)材料
明膠，上海生工生物工程有限公司，貨號(hào)G9764。2.實(shí)驗(yàn)方法
使用明膠酶譜分析可檢測(cè)基質(zhì)金屬蛋白酶-2 (MMP-2，72KD)和9 (MMP-9，92KD)的活性。甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞株K1，以7. 5X IO4/孔懸于M孔培養(yǎng)板中，加入不同濃度的姜黃素(12. 5、25、50、100 μ M)或溶劑對(duì)照分組處理，在37°C、5%C02的培養(yǎng)箱中孵育M小時(shí)，離心，取上清。將 20 μ L 上清與 IOyL Tris 緩沖液(62.5 mM Tris-HCl，10% 甘油，0. 00125% 溴酚藍(lán)，12% SDS)混合，以含2 mg/mL明膠的10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳 (SDS-PAGE)分離。電泳后凝膠用洗滌緩沖液(50 mM Tris-HCl, 2. 5% Triton X-100,5 mM CaCl2,1 μ M ZnCl2,0. 05% NaN3)洗滌，每次30分鐘，以除去SDS，再以去離子水洗滌30分鐘， 重復(fù)以上洗滌步驟一次，然后將凝膠置于孵育緩沖液中(50 mM Tris-HCl, 5 mM CaCl2, ΙμΜ ZnCl2,0. 05% NaN3) 37°C孵育M小時(shí)，用蒸餾水洗兩次后再用0. 25%考馬斯亮藍(lán)R-250染色30 min，并用含10%醋酸和10%異丙醇的溶液脫色2小時(shí)。藍(lán)色背景上的亮帶(明膠降解區(qū))即顯示蛋白裂解活性。3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果
姜黃素與Kl細(xì)胞作用M小時(shí)后，使用明膠酶譜法分析基質(zhì)金屬蛋白酶-2和9的活性。 如圖5所示，姜黃素可梯度依賴性地抑制基質(zhì)金屬蛋白酶-9的活性，其中25，50，100 μ M姜黃素能夠極顯著地抑制基質(zhì)金屬蛋白酶-9的活性，而對(duì)基質(zhì)金屬蛋白酶-2的活性基本沒(méi)有影響，各溶劑對(duì)照組基質(zhì)金屬蛋白酶酶活無(wú)顯著變化。實(shí)施例5 姜黃素降低甲狀腺癌細(xì)胞對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)的粘附能力。1.實(shí)驗(yàn)材料
鼠尾I型膠原，sigma,貨號(hào)C7661 ；BSA，上海申能博彩生物公司，貨號(hào)A0710。2.實(shí)驗(yàn)方法
在96孔板內(nèi)加入50 μ L用0.02 M醋酸稀釋的鼠尾I型膠原(50 μ g/mL)，4°C過(guò)夜。PBS 洗三次后，用0. BSA室溫封閉2小時(shí)，再以PBS洗滌三次。胰酶消化細(xì)胞，記數(shù)，稀釋成 2. 5X IOVmL的細(xì)胞懸液，每孔加入100 μ L細(xì)胞懸液，同時(shí)加入不同濃度的姜黃素(12. 5、 25,50 μ Μ)或溶劑對(duì)照處理，每組做三個(gè)平行的孔，37°C培養(yǎng)2小時(shí)。孵育完畢后，用溫?zé)岬臒o(wú)血清培養(yǎng)基洗三次，洗去未粘附的細(xì)胞，以Hoechest 33342 (10 μ g/mL)染色10分鐘后，熒光顯微鏡拍照并計(jì)數(shù)。以只用BSA包被孔的細(xì)胞數(shù)作為空白對(duì)照，以加入細(xì)胞不經(jīng)沖洗直接染色的孔的細(xì)胞數(shù)做為接種總細(xì)胞數(shù)，粘附細(xì)胞百分?jǐn)?shù)通過(guò)以下公式計(jì)算得到，粘附細(xì)胞百分?jǐn)?shù)(％)=[(膠原包被組細(xì)胞數(shù)一 BSA包被組細(xì)胞數(shù))/不洗組細(xì)胞數(shù)]X 100%。3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果
細(xì)胞粘附是細(xì)胞遷移運(yùn)動(dòng)的首要條件。通過(guò)粘附分析，考察姜黃素對(duì)甲狀腺癌細(xì)胞與胞外基質(zhì)I型膠原蛋白粘附能力的影響。如圖6所示，姜黃素可顯著降低甲狀腺癌細(xì)胞與胞外基質(zhì)I型膠原蛋白的粘附。與溶劑對(duì)照組相比，以姜黃素12. 5，25，5(^11處理？幾-133 細(xì)胞，可將細(xì)胞粘附率分別由69. 2士7. 7%, 60. 8士 1. 9%, 65. 5士8. 4%降低至28. 5士0. 9%， 6士4. 5%, 6. 8士5. 6%，而各溶劑對(duì)照組對(duì)細(xì)胞的粘附能力影響不大。
權(quán)利要求
1.姜黃素及其衍生物的應(yīng)用，用于制備治療甲狀腺癌的藥物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述姜黃素及其衍生物的應(yīng)用，其特征在于抑制甲狀腺癌細(xì)胞增殖，使甲狀腺癌細(xì)胞接觸姜黃素，姜黃素能夠抑制甲狀腺癌細(xì)胞增殖。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述姜黃素及其衍生物的應(yīng)用，其特征在于誘導(dǎo)甲狀腺癌細(xì)胞凋亡，使甲狀腺癌細(xì)胞接觸姜黃素，姜黃素能誘導(dǎo)甲狀腺癌細(xì)胞凋亡。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述姜黃素及其衍生物的應(yīng)用，其特征在于誘導(dǎo)甲狀腺癌細(xì)胞凋亡，姜黃素誘導(dǎo)甲狀腺癌細(xì)胞凋亡的機(jī)制是通過(guò)促進(jìn)甲狀腺癌細(xì)胞PARP的切割并抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述姜黃素及其衍生物的應(yīng)用，其特征在于抑制甲狀腺癌細(xì)胞侵襲及轉(zhuǎn)移，使甲狀腺癌細(xì)胞接觸姜黃素，姜黃素能抑制甲狀腺癌細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶一 9 的分泌和對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)的粘附。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的姜黃素及其衍生物的應(yīng)用，其特征在于所述姜黃素選用姜黃素、去甲氧基姜黃素、或雙去甲氧基姜黃素；姜黃素衍生物選用取代姜黃素中的甲氧基或雙甲氧基的基團(tuán)后的衍生物。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的姜黃素及其衍生物的應(yīng)用，其特征在于姜黃素及其衍生物用化學(xué)合成方法制備得到。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的姜黃素及其衍生物的應(yīng)用，其特征在于姜黃素及其衍生物從植物提取得到。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的姜黃素及其衍生物的應(yīng)用，其特征在于姜黃素及其衍生物用于制備治療甲狀腺癌藥物劑型為液體制劑、顆粒劑、片劑、沖劑、膠丸、膠囊、緩釋劑、滴丸劑、口崩制劑或注射劑。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了姜黃素在制備甲狀腺癌治療劑中的應(yīng)用，屬于姜黃素的醫(yī)藥用途技術(shù)領(lǐng)域。姜黃素可特異性殺傷甲狀腺癌細(xì)胞而對(duì)正常甲狀腺細(xì)胞影響較小。姜黃素能促進(jìn)甲狀腺癌細(xì)胞凋亡，引起聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARP)的切割并顯著抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，同時(shí)，姜黃素還能夠抑制甲狀腺癌細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶-9的分泌以及細(xì)胞對(duì)胞外基質(zhì)的粘附。以上結(jié)果顯示，姜黃素對(duì)甲狀腺癌細(xì)胞的增殖、遷移、粘附各環(huán)節(jié)都顯示出良好的干預(yù)作用，可以用于制備治療甲狀腺癌藥物。
文檔編號(hào)A61P35/00GK102319234SQ20111020168
公開(kāi)日2012年1月18日 申請(qǐng)日期2011年7月19日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月19日
發(fā)明者俞惠新, 包建東, 宋菲, 張弛羽, 張莉, 譚成 申請(qǐng)人:江蘇省原子醫(yī)學(xué)研究所