專利名稱：高純度、高細(xì)胞毒活性的γδT細(xì)胞的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于體外細(xì)胞培養(yǎng)領(lǐng)域，具體是一種高純度、高細(xì)胞毒活性的Y δτ細(xì)胞的制備方法。
背景技術(shù)：
γ δ T細(xì)胞是介于獲得性免疫和天然免疫之間的特殊免疫類型細(xì)胞，具有抗原特異性識別功能而無MHC限制性。目前用于抗腫瘤研究的Y δΤ細(xì)胞主要是指VY9VS2T細(xì)胞，約占外周血Y δ T細(xì)胞的50-95%。人外周血的V γ 9V δ 2Τ細(xì)胞通過細(xì)胞表面TCR識別非肽類磷酸化抗原，在抗原識別過程中無需MHC分子的限制和提呈。目前常用于活化V γ 9V δ 2Τ細(xì)胞的非肽類磷酸化抗原有異戊二烯焦磷酸(IPP)、含氮雙磷酸鹽(N-BPs)及烷基胺。其中IPP是甲羥戊酸通路的中間產(chǎn)物，能直接引起V γ 9V δ 2Τ細(xì)胞的活化。N-BI^s及烷基胺是通過抑制甲羥戊酸通路的限速酶一法尼基二磷酸合酶，使胞內(nèi)IPP蓄積，從而間接活化Vy 9V δ 2Τ細(xì)胞。由于 IPP在腫瘤細(xì)胞內(nèi)廣泛存在，使V γ 9V δ 2Τ細(xì)胞對IPP刺激適應(yīng)，并呈弱反應(yīng)或無反應(yīng)。故使用更為有效的磷酸抗原是目前需要解決的技術(shù)難題之一。最新研究表明，2-甲基-赤藻糖醇-4-磷酸途徑的產(chǎn)物羥甲異戊烯二磷酸酯 (HMBPP)是目前功能最強的V γ 9V δ 2Τ細(xì)胞激活劑，其刺激V γ 9V δ 2Τ細(xì)胞增殖能力是IPP 的10000倍，法國hnate Wiarma公司所合成的磷酸化抗原HDMAPP (商品名Picostim)的結(jié)構(gòu)式與HMBPP基本相同，經(jīng)體外實驗證實同樣具有強大的刺激V γ 9V δ 2T細(xì)胞的功能。磷酸化抗原與IL-2聯(lián)用可在體外選擇性擴增V γ 9V δ 2Τ細(xì)胞，并在臨床試驗中得到了證實。利用這一方法體外擴增肝癌、結(jié)直腸癌、血液腫瘤患者的自體VY9VS δ2Τ細(xì)胞技術(shù)已經(jīng)建立。這些V γ 9V δ 2Τ細(xì)胞大多數(shù)為⑶27XD45RA+表型，表達(dá)穿孔素、顆粒酶A和 B和分泌IFN- γ，并且呈現(xiàn)多細(xì)胞克隆的多樣性。目前已開展V γ 9V δ 2Τ細(xì)胞治療晚期腫瘤的I期臨床研究，Bennouna等人對10 例晚期腎癌研究發(fā)現(xiàn)60% (6/10)的患者疾病穩(wěn)定，穩(wěn)定時間達(dá)25. 7周。Dieli等人利用 VY9V52T細(xì)胞激動劑和IL-2治療18例激素抵抗性前列腺癌，結(jié)果有3例部分緩解，5例穩(wěn)定。盡管V γ 9V δ 2Τ細(xì)胞治療在可行性、治療耐受以及初步的療效方面取得了令人鼓舞的結(jié)果，但是該療法尚未取得最佳療效，其主要原因在于V γ 9V δ 2Τ細(xì)胞的體內(nèi)殺傷腫瘤活性還有待提高。因此，尋求增強V γ 9V δ 2Τ細(xì)胞的抗腫瘤細(xì)胞毒活性的新手段十分必要。IL-21是一個良好的細(xì)胞因子，IL-21R廣泛表達(dá)于包括活化的、δ T細(xì)胞在內(nèi)的淋巴細(xì)胞表面。IL-21與IL-2、IL-15等細(xì)胞因子聯(lián)用可協(xié)同刺激原始和記憶性⑶8+T細(xì)胞及NKT細(xì)胞增殖，IL-21同樣可以刺激Y δ T細(xì)胞的短期增殖，并且通過上調(diào)穿孔素和顆粒酶來增強NK和⑶8+Τ細(xì)胞的抗腫瘤功能，因此我們選擇IL-21來刺激V γ 9V δ 2Τ細(xì)胞。本項發(fā)明證實IL-21在一定程度上能促進(jìn)磷酸化抗原活化的V γ 9V δ 2Τ細(xì)胞的分裂，短暫誘導(dǎo)V Y 9V δ 2Τ細(xì)胞增殖。IL-21與IL-2共同刺激的V γ 9V δ 2Τ細(xì)胞抗腫瘤功能顯著增強， 表現(xiàn)為⑶56及一些溶酶體顆粒表達(dá)增加。由于V γ 9V δ 2Τ細(xì)胞在人外周血中含量極微，單用磷酸抗原HDMAPP刺激擴增兩周獲得的細(xì)胞純度仍低于70%，無法為臨床提供一種高純度的細(xì)胞制劑，因此我們發(fā)明一種先用免疫磁珠分選技術(shù)富集V γ 9V δ 2T細(xì)胞，然后用HDMAPP聯(lián)合IL-2和IL-21擴增高純度VY9VS2T細(xì)胞的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種高純度、高細(xì)胞毒活性的Y δ T細(xì)胞的制備方法，能提高Y δ T細(xì)胞純度，及CD56+、穿孔素、顆粒酶表達(dá)率?？朔F(xiàn)有制備Y δ T細(xì)胞的方法存在純度低、細(xì)胞毒活性低的技術(shù)問題。本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是一種制備Vy 9V δ 2Τ細(xì)胞的方法，包括如下步驟采集并分離患者外周血單個核細(xì)胞，先經(jīng)Mini MACS分選得到γ δ T細(xì)胞，再經(jīng)HDMAPP激活， 同時加入IL-2和IL-21，置于37°C，5% CO2的培養(yǎng)箱中孵育，4天后補充含有IL-2的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)7-14天，即可得到高純度、高細(xì)胞毒活性的V γ 9V δ 2T細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明，所述的培養(yǎng)基為GT-551人淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基或RPMI1640，并添加10% 自身血漿。所述的單個核細(xì)胞是采用Ficoll密度梯度離心法分離收集，并用生理鹽水清洗，低速離心后獲得。所述的Y S T細(xì)胞是指Vy 9V δ 2Τ細(xì)胞，采用Mini MACS間接免疫磁珠正向分選方法獲得。所述的HDMAPP的終濃度為3 μ M，細(xì)胞因子IL-2的終濃度為100IU/ ml，IL-21的終濃度為lOng/ml。依據(jù)單個核細(xì)胞的濃度不同，細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)時間約7_14天。本發(fā)明所用的原料和試劑除特別說明外，均市售可得。本發(fā)明的有益效果是利用免疫磁珠分選技術(shù)以獲得高純度的Y δ TCR陽性細(xì)胞，然后聯(lián)用IL-2和IL-21共同刺激培養(yǎng)的γ δ T細(xì)胞，使其抗腫瘤功能增強。解決了現(xiàn)有技術(shù)體外擴增的Y ST細(xì)胞純度低及細(xì)胞毒活性低的問題。
具體實施例方式下面用實施例來具體說明本發(fā)明，但本發(fā)明并不受其限制。下面實施例中凡未注明具體條件的實驗方法，均為遵照常規(guī)方法和廠家提供的操作說明執(zhí)行。實施例1 γ δ T細(xì)胞的制備1)外周血單個核細(xì)胞(PBMC)的制備用血細(xì)胞分離機采集患者抗凝血，1500rpm/min離心10分鐘，吸取上層血漿，56°C 滅活30分鐘后離心備用，用生理鹽水對倍稀釋血細(xì)胞沉淀，比重為1. 077的人淋巴細(xì)胞分離液與稀釋血按1 1. 5的比例加入離心管中，2000rpm/min離心15分鐘，小心抽取白細(xì)胞層，用生理鹽水清洗兩次，低速離心后得到外周血單個核細(xì)胞(PBMC)。2) Mini MACS間接免疫磁珠正向分選Y δ T細(xì)胞用含10%(V/V)自身血漿的RPMI1640重懸外周血單個核細(xì)胞，并調(diào)整細(xì)胞濃度至108/ml，加入10 μ 1抗TCR γ / δ Hapten抗體，混勻后4°C孵育1小時，用MACS緩沖液離心洗滌兩次；用MACS緩沖液重懸細(xì)胞至108/ml，加20 μ 1抗Hapten磁珠后4°C孵育40分鐘，離心洗滌后用500 μ 1 MACS緩沖液重懸細(xì)胞待分選。將MS柱置于Mini MACS上，用 500 μ IMACS緩沖液沖洗MS柱，將上述制備的500 μ 1細(xì)胞懸液加至MS柱中讓其自然流過， 用500 μ IMACS緩沖液沖洗柱子三遍，流過MS柱的為Y / δ -Τ細(xì)胞。取下MS柱加Iml緩沖液將附壁細(xì)胞快速從柱上沖洗下來，收集的即為Y S T細(xì)胞。
3)高效Y δ T細(xì)胞的誘導(dǎo)擴增將上述獲得的Y δ T細(xì)胞置于含有HDMAPP(3 μ Μ)的RPMI1640培養(yǎng)液中，放入 225cm2的培養(yǎng)瓶中，同時加入細(xì)胞因子IL-2(終濃度為100IU/ml)和IL_21(終濃度為 10ng/ml)，置于37°C，5% CO2的培養(yǎng)箱中孵育，每M小時觀察細(xì)胞形態(tài)及生長情況，并計數(shù)細(xì)胞。每2-3天補充含有IL-2的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)7-14天，即可得到高純度、高細(xì)胞毒活性的Y δ T細(xì)胞。實施例21.培養(yǎng)的、δ T細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察細(xì)胞培養(yǎng)Mh即可見γ δ T細(xì)胞貼壁生長，每個集落約3-6個細(xì)胞，48h后集落開始變大，培養(yǎng)IOd可見大的集落和極少量單個貼壁生長細(xì)胞，單個細(xì)胞呈條梭狀。培養(yǎng)IOd 的細(xì)胞涂片行瑞姬氏染色，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)細(xì)胞體積大，呈橢圓或不規(guī)則形，細(xì)胞核大多為橢圓或圓形，核染質(zhì)疏松，核膜不規(guī)則，有凸起，每個細(xì)胞可見1個小核仁，呈深藍(lán)色；胞質(zhì)豐富， 染成灰蘭色，形態(tài)不規(guī)則，有偽足，近核處有淡染現(xiàn)象，也有呈不規(guī)則形。透射電鏡見細(xì)胞呈圓形，表面有較多的細(xì)長突起的微絨毛，胞質(zhì)中見多組高爾基氏器，較豐富的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，線粒體細(xì)小，電子密度高，還可見高電子密度顆粒和脂滴，細(xì)胞核橢圓有凹陷，常染色質(zhì)多細(xì)小，分布均勻，異染色質(zhì)少，核仁明顯。取培養(yǎng)10天的細(xì)胞 100 μ 1，加入100 μ 1 0. 4%臺盼藍(lán)染色液，活細(xì)胞不被染色，死細(xì)胞被染成藍(lán)色，顯微鏡下計數(shù)。本發(fā)明制備的細(xì)胞活力大于90%。2.培養(yǎng)的Y δ T細(xì)胞純度及免疫表型檢測分別取培養(yǎng)0、4、7、10天濃度約106/ml的細(xì)胞100 μ 1，分別加入檢測用鼠抗人 CD3-FITC、V δ 2-FITC、CD56-PE抗體10 μ 1，室溫避光孵育30分鐘，用PBS洗滌兩次，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測，本發(fā)明制備的細(xì)胞制劑，⑶3+Τ細(xì)胞高度富集達(dá)到99. 5% 士0. 3%，⑶3+V δ 2+Τ 細(xì)胞從1. 3% 士0. 6%急速擴增到93. 8% 士4%，⑶3+V δ 2+Τ細(xì)胞在培養(yǎng)第7天達(dá)到峰值， 直到第10天保持穩(wěn)定。3.培養(yǎng)的Y δ T細(xì)胞細(xì)胞毒活性的測定取對數(shù)生長期的腎腺癌786-0細(xì)胞株作為靶細(xì)胞，靶細(xì)胞懸液濃度為lX105/ml、 5XioVml,2. 5X 104/ml，每孔取100 μ 1鋪于96孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24小時，取本發(fā)明制備的細(xì)胞濃度調(diào)節(jié)為lX106/ml，加入96孔板中，使效靶比分別為10 1,20 1和40 1，各濃度設(shè)3個復(fù)孔并分別設(shè)空白對照，培養(yǎng)48小時后每孔加入濃度為5mg/ml的MTT20 μ 1，繼續(xù)培養(yǎng)4小時后棄上清，每孔加入DMSO 100 μ 1，于570nm處讀取吸光度值，計算殺傷率。結(jié)果顯示本發(fā)明制備的Vy 9V δ 2T細(xì)胞對786-0細(xì)胞株的殺傷活性高于單用IL-2 時的5倍，證實IL-2和IL-21聯(lián)用對增強V γ 9V δ 2Τ細(xì)胞的抗腫瘤效應(yīng)有協(xié)同作用。
權(quán)利要求
1.一種高純度、高細(xì)胞毒活性的Y S T細(xì)胞的制備方法，其特征在于制備步驟如下1)采集患者外周血，分離并收集外周血單個核細(xì)胞；2)用抗TCRγ / δ微珠試劑盒Mini MACS分選Y δ T細(xì)胞；3)用含10%自身血漿的培養(yǎng)基重懸上述獲得的陽性細(xì)胞，經(jīng)磷酸抗原HDMAPP活化后， 加入細(xì)胞因子IL-2和IL-21培養(yǎng)3天；4)依據(jù)細(xì)胞生長狀況每2-3天補加含IL-2的新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)7-14天，獲得高擴增倍數(shù)的Y S T細(xì)胞。
2.如權(quán)利要求1所述的高純度、高細(xì)胞毒活性的YS T細(xì)胞的制備方法，其特征在于 單個核細(xì)胞是采用Ficoll密度梯度離心法分離收集，低速離心后獲得。
3.如權(quán)利要求1所述的高純度、高細(xì)胞毒活性的YS T細(xì)胞的制備方法，其特征在于 Y δ T細(xì)胞是采用Mini MACS間接免疫磁珠正向分選方法獲得。
4.如權(quán)利要求1所述的高純度、高細(xì)胞毒活性的、ST細(xì)胞的制備方法，其特征在于 所述的培養(yǎng)基是指GT-T551人淋巴細(xì)胞培養(yǎng)液或RPMI1640，HDMAPP的終濃度為3 μ Μ, IL-2 的終濃度為100IU/ml，IL-21的終濃度為lOng/ml。
5.如權(quán)利要求1所述的高純度、高細(xì)胞毒活性的YS T細(xì)胞的制備方法，其特征在于細(xì)胞置于細(xì)胞培養(yǎng)袋或培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，培養(yǎng)環(huán)境為37°C，5% C02，所述的細(xì)胞濃度達(dá)到 3-5 XlOVml時分瓶培養(yǎng)。
6.上述方法得到的Yδ T細(xì)胞，能應(yīng)用于治療多種腫瘤以及病毒性疾病的藥物中。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種高純度、高細(xì)胞毒活性的γδT細(xì)胞的制備方法。屬于體外細(xì)胞培養(yǎng)領(lǐng)域。方法包括采集并分離患者外周血單個核細(xì)胞，先經(jīng)Mini MACS分選得到γδT陽性細(xì)胞，再經(jīng)磷酸抗原HDMAPP(3μM)激活，同時加入基因重組人細(xì)胞因子IL-2(100IU/ml)和IL-21(10ng/ml)，置于37℃，5％CO2的培養(yǎng)箱中孵育，4天后補充含有IL-2的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)7-14天，即可得到高純度、高細(xì)胞毒活性的γδT細(xì)胞。本發(fā)明利用免疫磁珠分選技術(shù)以獲得高純度的γδTCR陽性細(xì)胞，然后聯(lián)用IL-2和IL-21共同刺激培養(yǎng)的γδT細(xì)胞，使其抗腫瘤功能增強；解決了現(xiàn)有技術(shù)體外擴增的γδT細(xì)胞純度低及細(xì)胞毒活性低的問題。
文檔編號A61P31/12GK102154205SQ201110036488
公開日2011年8月17日 申請日期2011年1月31日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月31日
發(fā)明者劉俊杰, 徐為, 李慧中, 李連濤, 程乾, 章龍珍, 裴冬生, 鄭駿年, 陳菲菲 申請人:鄭駿年