專利名稱：一種有效培養(yǎng)腫瘤浸潤淋巴細胞的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于自體免疫細胞治療技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種能夠有效培養(yǎng)腫瘤浸潤淋巴細胞的方法。
背景技術(shù)：
腫瘤是嚴重危害人民生活和健康的重大疾病之一。目前，惡性腫瘤是全球第二大導(dǎo)致死亡的疾病，也是中國城鄉(xiāng)居民第一位死亡原因，中國每年新發(fā)病腫瘤患者總數(shù)約200 萬人，新增腫瘤患者年均增長率在10%左右。手術(shù)、化療、放療仍是腫瘤的主要治療方法，但是，即使根治性手術(shù)也只能解決局部問題，不能避免全身轉(zhuǎn)移。化療、放療存在的最大問題是其殺傷作用沒有針對性，長期的化療、放療會損傷機體的免疫系統(tǒng)及各器官組織的功能， 甚至誘發(fā)新的癌變。更為重要的是由于腫瘤細胞缺乏特異性的抗原、腫瘤細胞的抗原調(diào)變及MHC分子表達異常等因素導(dǎo)致腫瘤免疫逃逸，成為腫瘤治療的一大難題。由于傳統(tǒng)的手術(shù)、放化療的發(fā)展已進入平臺期，人們把越來越多的目光投到腫瘤的生物治療上。腫瘤生物治療(Biotheropy)是應(yīng)用現(xiàn)代生物技術(shù)及其產(chǎn)品進行腫瘤防治的新療法，它通過調(diào)動宿主的天然防衛(wèi)機制或給予天然(或基因工程)產(chǎn)生的針對性靶向性很強的物質(zhì)來取得抗腫瘤的效應(yīng)。隨著對腫瘤發(fā)生發(fā)展分子機制的深入研究和生物技術(shù)的發(fā)展，生物治療已經(jīng)成為腫瘤綜合治療中的第四種模式。生物治療對放、化療不敏感及無法耐受放、化療的老年患者來說是一大福音，可以明顯提高患者的生活質(zhì)量。延長患者的生存期，受到越來越多的重視。在37-39屆美國臨床腫瘤協(xié)會會議(ASCO)和第7屆中國抗癌協(xié)會臨床腫瘤學協(xié)作專業(yè)委員會(CSCO)年會上成為最令人囑目、最鼓舞人心的焦點。自體免疫細胞治療是生物治療中過續(xù)性細胞治療的一類，是將自體的免疫活性細胞經(jīng)過體外擴增后輸入患者體內(nèi)，直接殺傷腫瘤細胞，調(diào)節(jié)和增強機體的免疫功能。細胞治療具有增殖速度快、殺瘤活性高的特點，可直接殺傷患者體內(nèi)殘余腫瘤細胞，解除機體免疫抑制，增強患者的免疫功能，降低復(fù)發(fā)率和轉(zhuǎn)移率，延長腫瘤患者的生存期并提高其生活質(zhì)量。包括自然殺傷細胞(NK)、腫瘤浸潤細胞(TIL)、細胞因子誘導(dǎo)的殺傷細胞(CIK)、細胞毒性T淋巴細胞(CTL)、樹突狀細胞聯(lián)合細胞因子誘導(dǎo)的殺傷細胞(DC-CIK)等。腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)是從腫瘤組織中或腫瘤患者胸腹水分離出來的淋巴細胞，這種細胞在體外經(jīng)白細胞介素II刺激后可大量增殖。這種刺激后增殖的TIL細胞又稱之為“腫瘤來源的激活細胞”。TIL治療除適用于實體瘤患者外，同樣適應(yīng)于各類晚期胸、腹水的癌癥患者。因為在這些病灶的表面會脫落大量的腫瘤細胞和淋巴細胞種植到胸、腹腔， 因此癌性患者胸、腹水中通常存在大量的淋巴細胞浸潤，作為一種特殊類型的TIL (即胸腹水中獲得的TIL)而較實體瘤TIL更易獲得。另外，在過繼免疫治療中，這些效應(yīng)細胞重新又回到原來生存的環(huán)境，在抗腫瘤活性方面，TIL顯示出主動的、抗原特異的抗腫瘤能力，而且其特異性及細胞殺傷活性已得到臨床證實，可有效的控制癌性胸腹水，為過繼免疫治療提供一條更為簡便的途徑，對晚期癌癥患者提供了一種新的治療手段。目前傳統(tǒng)的TIL細胞培養(yǎng)的方法由于受腫瘤大小、腫瘤浸潤程度以及胸腹水量的限制，存在細胞增殖速度慢，增殖倍率低的問題；不同患者間培養(yǎng)出的細胞數(shù)存在很大的差異，很多患者的細胞經(jīng)過培養(yǎng)在短期內(nèi)無法達到臨床治療要求的細胞數(shù)；國內(nèi)外常用的培養(yǎng)方法需要40 50天，臨床應(yīng)用受到很大限制；由于所培養(yǎng)的TIL細胞缺乏特異性，臨床療效仍然受到限制。如何克服上述問題，找到更符合臨床需要的TIL細胞，就成為現(xiàn)有技術(shù)中亟待解決的技術(shù)問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種可以有效刺激和擴增胸腹水或腫瘤組織中浸潤淋巴細胞的方法，從而培養(yǎng)出有臨床療效的TIL細胞。本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)。除非另有說明，本發(fā)明所采用的百分數(shù)均為重量百分數(shù)。一種有效培養(yǎng)腫瘤浸潤淋巴細胞的方法，包括以下步驟
1、抽出的胸腹水或腫瘤組織處理后形成的單細胞懸液，經(jīng)淋巴細胞分離液分離后取白膜層細胞；
2、白膜層細胞經(jīng)反復(fù)洗滌2次后即為單個核細胞，調(diào)節(jié)細胞數(shù)至1 2X106/ml接種到重組人纖維蛋白RetroNectin和聚類分化群3 (cluster of differentiation，CD3)抗體包被的培養(yǎng)瓶中，同時加胸、腹水上清；
3、24小時后，加入白介素II(IL-2) 1000 1500U/ml,以后每隔2 3天加含IL-2 1000 1500u/ml、胸水上清的無血清培養(yǎng)基擴瓶、傳代培養(yǎng)；
4、在培養(yǎng)的第12 13天加入凋亡調(diào)節(jié)蛋白生存素(Survivin)和粘蛋白-I(Mucl), 進一步激活TIL細胞的殺傷活性，第14天收獲細胞。其中，步驟(1)中，在無菌條件下抽取患者胸水、腹水，離心，取上清，沉淀加無血清培養(yǎng)基混勻，用淋巴細胞分離液分離后取白膜層細胞。步驟(1)中，將手術(shù)切除的腫瘤組織在無菌環(huán)境下，用含慶大霉素100 160IU/ml 的無菌生理鹽水沖洗2 3次；在培養(yǎng)皿中加10 20ml培養(yǎng)液，放入一塊200目金屬網(wǎng)， 將腫瘤組織剪成小塊；將腫瘤組織塊碾碎，細胞流入到培養(yǎng)皿中；收集培養(yǎng)皿中細胞懸液， 用淋巴細胞分離液分離后取白膜層細胞。相對于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明具有如下優(yōu)點
1、培養(yǎng)時間14天，較傳統(tǒng)培養(yǎng)時間40 50天大大縮短，使患者的住院時間大大縮短， 減輕患者的住院負擔。2、解決了細胞增殖速度慢，增殖倍率低的問題，使培養(yǎng)后的細胞數(shù)能夠達到臨床要求。3、培養(yǎng)出的TIL細胞特異性更強，增強了臨床療效。


圖1為相同基數(shù)細胞兩種方法培養(yǎng)后細胞數(shù)的比較；
圖2為不同效靶比時新方法TIL細胞對K562細胞的殺傷率； 圖3為傳統(tǒng)TIL和本發(fā)明方法TIL對K562細胞總殺傷單位的比較。具體實施方案下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明作進一步的詳細說明，但附圖和實施例并非是對本發(fā)明的限定。實施例1
患者，男，70歲，右肺癌并大量胸水，將800ml胸水移到離心管中，離心1500rpm X8min，取胸水上清，沉淀加無血清培養(yǎng)基混勻，用淋巴細胞分離液分細胞后離心800gX20min。吸出白膜層，離心2000rpmX IOmin后，加無血清培養(yǎng)基，離心 1600rpmX8min，棄上清，得到單個核細胞。調(diào)節(jié)細胞數(shù)至1. 5X 106/ml，用含胸水上清 0. 05ml/ml的無血清培養(yǎng)基接種到用RetroNectin250 μ 1、CD3抗體100 μ 1包被的175cm2 培養(yǎng)瓶中，置于飽和濕度90%、溫度37°C、CO2 5. 0%培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)M小時后，加入 IL-2 1000U/ml，繼續(xù)于飽和濕度90%、溫度37°C、CO2 5. 0%培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。第三天，將TIL 細胞用含IL-2 1000 U/ml、胸水上清0.05ml/ml的無血清培養(yǎng)基傳代、擴瓶。第六天，繼續(xù)用含IL-2 1000 U/ml、胸水上清0. 05ml/lml的無血清培養(yǎng)基加傳代、擴瓶。第九天，繼續(xù)傳代、擴瓶。第13天添加Survivin和Mucl Iml0第十四天，收集細胞。同時，采用傳統(tǒng)的TIL方法進行對比試驗，對細胞擴增數(shù)和體外細胞毒作用進行比較，詳見圖1。由圖1可以看出，在基礎(chǔ)細胞數(shù)相同的基礎(chǔ)上，通過不同的培養(yǎng)方法獲得的細胞數(shù)是有區(qū)別的，本方法獲得的細胞數(shù)為傳統(tǒng)方法培養(yǎng)細胞數(shù)的11. 26倍，是培養(yǎng)前的 182倍，完全達到衛(wèi)生部第三類技術(shù)中細胞治療所要求的101°數(shù)量級的細胞。由圖2、圖3可以看出本方法培養(yǎng)的TIL細胞有較強的殺傷活性，是傳統(tǒng)方法的十余倍，較傳統(tǒng)方法培養(yǎng)的TIL細胞對腫瘤細胞的殺傷率更高。充分說明本方法是一種有效的培養(yǎng)TIL細胞的方法。實施例2
患者，男，65歲，左肺癌，取肺部的手術(shù)組織置于無菌缸中，用含慶大霉素100 160IU/ ml的無菌生理鹽水沖洗腫瘤標本2 3次。在IOcm直徑的培養(yǎng)皿中加10_20ml培養(yǎng)基， 放入一塊200目金屬網(wǎng)，將腫瘤組織剪成小塊放在金屬網(wǎng)上。用20ML注射器芯將腫瘤組織塊碾碎，棄金屬網(wǎng)，收集培養(yǎng)皿中的無血清培養(yǎng)基(細胞流入培養(yǎng)基中形成單細胞懸液)，將細胞懸液加入到20ml無血清培養(yǎng)基中，300RPMX;3min。取上清，1500 RPMX 6min,沉淀即為單細胞層。加無血清培養(yǎng)基混勻，用淋巴細胞分離液分細胞后離心800gX20min。吸出白膜層，離心2000rpmX IOmin后，加無血清培養(yǎng)基，離心1600rpmX 8min，棄上清，得到單個核細胞。調(diào)節(jié)細胞數(shù)至IX 106/ml，用無血清培養(yǎng)基接種到用RetrONectin250 μ 1、OT3抗體100 μ 1包被的175cm2培養(yǎng)瓶中，置于飽和濕度90%、溫度37°C、0)2 5. 0%培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 培養(yǎng)M小時后，細胞加入IL-2 1000U/ml，繼續(xù)于飽和濕度90%、溫度37°C、C02 5. 0%培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。第三天，將TIL細胞用含IL-2 1000 U/ml的無血清培養(yǎng)基傳代、擴瓶，第六天， 繼續(xù)用含IL-2 1000 U/ml的無血清培養(yǎng)基傳代、擴瓶，第九天，繼續(xù)傳代、擴瓶。第12天添加Survivin和Mucl lml。第十四天，收集細胞，細胞數(shù)為0. 65X 101CI。實施例3
患者，女，68歲，胃腺癌多發(fā)骨轉(zhuǎn)移，大量腹水。無菌條件下抽取胸水650ml。將650ml 胸水移到50M1離心管中，離心1800rpm X6min，取胸水上清，沉淀加無血清培養(yǎng)基混勻，用淋巴細胞分離液分細胞后離心800gX22min。吸出白膜層，離心2000rpmX IOmin后，加無血清培養(yǎng)基，離心1500rpmX 8min，棄上清，得到單個核細胞。調(diào)節(jié)細胞數(shù)至2. 0 X 106/ml，用含胸水上清0. 01ml/ml的無血清培養(yǎng)基接種到用RetroNectin250 μ 1、CD3抗體100 μ 1包被的175cm2培養(yǎng)瓶中，置于飽和濕度90%、溫度37°C、(X)2 5. 0%培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)M小時后，細胞加入IL-2 1500U/ml，繼續(xù)于飽和濕度90%、溫度37°C、0)2 5.0%培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。第三天，將TIL細胞用含IL-2 1500 U/ml、胸水上清0. Olml/ml的無血清培養(yǎng)基傳代、擴瓶。 第六天，繼續(xù)用含IL-2 1500 U/ml、胸水上清0. Olml/ml的無血清培養(yǎng)基傳代、擴瓶。第九天，繼續(xù)傳代、擴瓶。第13天添加Survivin和Mucl Iml0第十四天，收集細胞，細胞數(shù)為 1. 08X IO100
權(quán)利要求
1.一種有效培養(yǎng)腫瘤浸潤淋巴細胞的方法，包括以下步驟(1)抽出的胸腹水或腫瘤組織處理后形成的單細胞懸液，經(jīng)淋巴細胞分離液分離后取白膜層細胞；(2)白膜層細胞經(jīng)反復(fù)洗滌2次后即為單個核細胞，調(diào)節(jié)細胞數(shù)至IXIO6 2X 106/ml 接種到重組人纖維蛋白和聚類分化群3抗體包被的培養(yǎng)瓶中，同時加胸、腹水上清；(3)M小時后，加入白介素II 1000 1500U/ml，以后每隔2 3天加含白介素II 1000 1500u/ml、胸水上清的無血清培養(yǎng)基擴瓶、傳代培養(yǎng)；(4)在培養(yǎng)的第12 13天加入凋亡調(diào)節(jié)蛋白生存素和粘蛋白-1，進一步激活TIL細胞的殺傷活性，第14天收獲細胞。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)腫瘤浸潤淋巴細胞的方法，其特征在于步驟(1)中，在無菌條件下抽取患者胸水、腹水，離心，取上清，沉淀加無血清培養(yǎng)基混勻，用淋巴細胞分離液分離后取白膜層細胞。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)腫瘤浸潤淋巴細胞的方法，其特征在于步驟(1)中，將手術(shù)切除的腫瘤組織在無菌環(huán)境下，用含慶大霉素100 160IU/ml的無菌生理鹽水沖洗 2 3次；在培養(yǎng)皿中加10 20ml培養(yǎng)液，放入一塊200目金屬網(wǎng)，將腫瘤組織剪成小塊； 將腫瘤組織塊碾碎，細胞流入到培養(yǎng)皿中；收集培養(yǎng)皿中細胞懸液，用淋巴細胞分離液分離后取白膜層細胞。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種有效培養(yǎng)腫瘤浸潤淋巴細胞的方法。從患者胸腹水或腫瘤組織中提取單個核細胞，洗滌后接種到重組人纖維蛋白和聚類分化群3抗體包被的培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)24小時后，加入白介素Ⅱ，之后每隔2-3天用含白介素Ⅱ、胸腹水上清的無血清培養(yǎng)基擴瓶、傳代培養(yǎng)，第12～13天加入凋亡調(diào)節(jié)蛋白生存素和粘蛋白-1激活殺傷活性，第14天收獲細胞。該方法大大縮短培養(yǎng)時間(只需14天)，使患者的住院時間大大縮短，減輕患者的住院負擔。同時，解決了細胞增殖速度慢，增殖倍率低的問題，使培養(yǎng)后的細胞數(shù)能夠達到臨床要求。培養(yǎng)出的TIL細胞特異性更強，增強了臨床療效。
文檔編號A61P35/00GK102174469SQ20111002825
公開日2011年9月7日 申請日期2011年1月26日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月26日
發(fā)明者宋鑫, 楊金艷 申請人:宋鑫, 楊金艷