專利名稱：特異于流感h5血凝素主要中和表位的單克隆抗體的制作方法
特異于流感H5血凝素主要中和表位的單克隆抗體序列提交本申請(qǐng)連同電子形式的序列表一起提交。所述序列表命名為2577_203_sequence_listing, txt,創(chuàng)建于在2010年8月20日。電子形式序列表的信息以其整體援引嫁入本文。
背景技術(shù)：
本發(fā)明涉及特異于流感H5血凝素主要中和表位的鼠單克隆抗體4C2或者嵌合或人源化單克隆抗體及其活性片段。本發(fā)明還涉及使用所述鼠或者嵌合或人源化單克隆抗體或其片段來(lái)預(yù)防和治療H5N1流感的方法和組合物。本文用于說(shuō)明本發(fā)明背景或提供有關(guān)實(shí)施的補(bǔ)充細(xì)節(jié)的出版物和其他材料被引入作為參考，為了方便起見(jiàn)在文獻(xiàn)目錄中分別分組。最近出現(xiàn)的甲型流感病毒H5N1菌株以及它們?cè)谌祟?lèi)中造成的高死亡率引起了關(guān)于未來(lái)流感大流行的憂慮。抗流行性H5N1菌株的預(yù)防和治療措施引起大量興趣，全世界范圍都在努力來(lái)預(yù)防另一次大流行的爆發(fā)。但現(xiàn)有的疫苗策略受到流感菌株抗原變異的阻礙。需要抗體內(nèi)源合成的現(xiàn)有疫苗策略在大流行病情況下無(wú)法提供針對(duì)H5N1感染的立刻預(yù)防。目前得到許可的抗病毒藥物包括M2離子通道抑制劑(Rimantidine和Amantidine)和神經(jīng)氨酸酶抑制劑(Oseltamivir和Zanamivir)。已知H5N1病毒對(duì)M2離子通道抑制劑有抗性(Beigel等，2005)。H5N1病毒的新毒株正被分離，它們還對(duì)神經(jīng)氨酸酶抑制劑即oseltamivir 和 zanamivi r 有抗性(Le 等,2005, de Jong 和 Hien, 2006)。神經(jīng)氨酸酶抑制劑還需要高劑量和延長(zhǎng)的治療(de Jong和Hien，2006)，增加了有害副作用的可能性。因此，流感治療的交替性策略被準(zhǔn)許。使用單克隆抗體(mAb)的被動(dòng)免疫療法已經(jīng)被看作治療許多傳染病的可靠選擇。目前，對(duì)使用抗流感病毒HAl蛋白的中和抗體的治療方法存在大量關(guān)注。這種蛋白方便作為靶標(biāo)，因?yàn)樗诓《镜谋砻?，針?duì)該蛋白的抗體可以有效的中和病毒。因此，抗H5血凝素(HA)中和表位的單克隆抗體可以是激活人免疫的有吸引力的選擇，尤其是針對(duì)那些處于流感感染高風(fēng)險(xiǎn)的個(gè)體，即，對(duì)主動(dòng)免疫反應(yīng)較差的免疫受損患者，嬰兒，幼兒或老人。通過(guò)輸注人恢復(fù)期血清的被動(dòng)免疫與流感大流行期間死亡率的50%降低有關(guān)，證明有效的抵抗H5N1甲型流感病毒感染(Kong and Zhou, 2004; Luke等，2006)。重要的是任何mAb產(chǎn)品應(yīng)當(dāng)提供抗H5N1流感流行毒株的廣泛預(yù)防，并且應(yīng)當(dāng)防止體內(nèi)中和滲漏突變體(escapemutant)的選擇。發(fā)明概述本發(fā)明涉及特異于流感H5血凝素主要中和表位的單克隆抗體及其活性片段。本發(fā)明還涉及使用所述單克隆抗體或其片段預(yù)防和治療H5N1流感的方法和組合物。因此，在第一個(gè)方面，本發(fā)明提供特異于流感H5血凝素主要中和表位的單克隆抗體及其活性片段，即抗原結(jié)合片段(本文中也稱為抗體片段)。在一個(gè)實(shí)施方案中，單克隆抗體是鼠單克隆抗體4C2。在第二個(gè)實(shí)施方案中，單克隆抗體是嵌合或人源化的單克隆抗體。具體來(lái)說(shuō)，所述嵌合或人源化的單克隆抗體特異性地結(jié)合鼠單克隆抗體4C2所特異性結(jié)合的H5血凝素的構(gòu)象表位。在一個(gè)實(shí)施方案中，單克隆抗體(鼠單克隆抗體或嵌合或人源化的單克隆抗體)或其片段特異性結(jié)合H5血凝素(HA)的構(gòu)象表位，其中所述構(gòu)象表位包含成熟HA蛋白的氨基酸155 (Ser)和189(Arg)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，輕鏈可變區(qū)的互補(bǔ)決定區(qū)(⑶幻(IXDR)在SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列之內(nèi)(本文中也稱為HM448828，其是小鼠輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列)。在另外的實(shí)施方案中，輕鏈可變CDR的氨基酸序列是:LCDRl:QDISGH(SEQ ID NO:5);LCDR2:HGT(SEQ ID NO:6);和 LCDR3:VQYVQFPWT(SEQID N0:7)。在一個(gè)實(shí)施方案中，重鏈可變區(qū)的互補(bǔ)決定區(qū)(⑶R) (HCDR)在SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列之內(nèi)(本文中也稱為HM448827，其是小鼠重鏈可變區(qū)的氨基酸序列)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，重鏈可變⑶R的氨基酸序列是:HCDRl:GYTFTTYW (SEQ IDNO:8);HCDR2:1DPYDSET(SEQ ID NO:9);和 HCDR3:VRGGSTVAYFGV(SEQ ID NO:10)。在一個(gè)實(shí)施方案中，編碼HM448828的DNA包含SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，編碼HM448827的DNA包含SEQ ID NO: 3所示的核苷酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，輕鏈可變區(qū)包含SEQ ID N0:2所示的氨基酸序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，重鏈可變區(qū)包含SEQ ID N0:4所示的氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)克隆技術(shù)從人抗體生成細(xì)胞獲得重鏈和輕鏈恒定區(qū)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，人重鏈恒定區(qū)是人IgGl重鏈恒定區(qū)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，人IgGl重鏈恒定區(qū)包含SEQ ID NO: 22 (GenBank登錄號(hào)AAX09634.1)所示的氨基酸序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，編碼該氨基酸序列的核酸序列如SEQ ID N0:21(GenBank登錄號(hào)AY885218.1)所示。在一個(gè)實(shí)施方案中，人輕鏈恒定區(qū)是人K輕鏈恒定區(qū)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，人K輕鏈恒定區(qū)包含SEQ ID NO:24(GenBank登錄號(hào)AAA58989.1)所示的氨基酸序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，編碼該序列的核酸序列如SEQID N0:23(GenBank 登錄號(hào) J00241.1)所示。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供核酸，其編碼本文描述的鼠單克隆抗體4C2或者嵌合或人源化單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段。核酸序列的實(shí)例包括本文描述的那些。在另外的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含所述核酸的載體。在另外的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含并表達(dá)所述載體的細(xì)胞。在第二個(gè)方面，本發(fā)明提供使用所述鼠單克隆抗體4C2或嵌合或人源化單克隆抗體或其片段來(lái)預(yù)防和治療H5N1流感的方法和組合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種藥物組合物，其包含本文描述的鼠單克隆抗體4C2或嵌合或人源化的單克隆抗體以及藥用可接受的稀釋劑或載體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，藥物組合物包含本文所述單克隆抗體的抗原結(jié)合片段和藥用可接受的稀釋劑或載體。在另外的實(shí)施方案中，藥物組合物包含編碼所述抗體或抗體片段的核酸分子和藥用可接受的稀釋劑或載體。在另外的實(shí)施方案中，藥物組合物包含含有所述核酸的載體和藥用可接受的稀釋劑或載體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，藥物組合物包含表達(dá)所述載體的細(xì)胞和藥用可接受的稀釋劑或載體。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種方法，以減少對(duì)象的流感H5N1病毒感染，或降低對(duì)象流感H5N1病毒感染的風(fēng)險(xiǎn)，抑制對(duì)象被一種或更多種流感H5N1病毒毒株或分離物感染，或預(yù)防一種或更多種流感H5N1病毒毒株或分離物的流感感染或疾病。在這種實(shí)施方案中，所述方法包括向有需要的對(duì)象施用治療有效量的本文所述鼠單克隆抗體4C2或嵌合或人源化單克隆抗體，或其抗原結(jié)合片段，包含編碼所述抗體或抗體片段的多核苷酸的核酸分子；包含所述多核苷酸的載體；或表達(dá)所述載體的細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)象是免疫受損的，是嬰兒，是幼兒或是老人。在另一個(gè)實(shí)施方案中，施用提供治療益處。在另外的實(shí)施方案中，治療益處包括在對(duì)象中抑制流感病毒滴度的增加，降低流感病毒滴度，抑制流感病毒復(fù)制的增加，降低流感病毒復(fù)制，抑制流感病毒增殖的增加或降低流感病毒增殖，或降低與流感病毒感染相關(guān)的一種或更多種癥狀或并發(fā)癥的進(jìn)展，嚴(yán)重性，頻率，持續(xù)時(shí)間或概率。在一個(gè)實(shí)施方案中，癥狀或并發(fā)癥選自惡寒，發(fā)燒，咳嗽，喉晚痛，鼻充血，竇充血，鼻感染，竇感染，身體疼痛，頭痛，疲勞，肺炎，支氣管炎，耳感染，耳痛和死亡。在另一個(gè)實(shí)施方案中，治療益處包括促進(jìn)對(duì)象從流感H5N1病毒感染的康復(fù)。在另外的實(shí)施方案中，給對(duì)象施用的物質(zhì)在對(duì)象的流感H5N1病毒感染之前，基本上同時(shí)或之后進(jìn)行施用。附圖簡(jiǎn)述

圖1A和IB顯示4C2mAb在小鼠中的預(yù)防功效。在用來(lái)自進(jìn)化枝IA/HK/213/2003(圖1A)或進(jìn)化枝2.1病毒A/TLL013/06 (圖1B)的5MLD5(I小鼠適應(yīng)的印度尼西亞HPAI H5N1攻擊前一天,每組小鼠用2.5mg/kg, 5mg/kg或10mg/kg的4C2mAb進(jìn)行預(yù)治療。在整個(gè)14天觀察期監(jiān)測(cè)小鼠的存活。結(jié)果表示為存活百分比。圖2A和2B顯示4C2mAb在小鼠中的治療功效。在用來(lái)自進(jìn)化枝IA/HK/213/2003(圖2A)和進(jìn)化枝2.1病毒A/TLL013/06 (圖2B)的小鼠適應(yīng)的印度尼西亞HPAI H5N1攻擊后一天，每組小鼠用2.5mg/kg, 5mg/kg和10mg/kg的4C2mAb進(jìn)行治療。在整個(gè)14天觀察期監(jiān)測(cè)小鼠的存活。結(jié)果表示為存活百分比。圖3A和3B顯示嵌合4C2在小鼠中的預(yù)防功效。在用來(lái)自進(jìn)化枝IA/HK/213/2003(圖3A)或進(jìn)化枝2.1病毒A/TLL013/06 (圖3B)的5MLD5(I小鼠適應(yīng)的印度尼西亞HPAI H5N1攻擊前一天,每組小鼠用2.5mg/kg, 5mg/kg或10mg/kg的ch4C2進(jìn)行預(yù)治療。在整個(gè)14天觀察 期監(jiān)測(cè)小鼠的存活。結(jié)果表示為存活百分比。圖4A和4B顯示嵌合4C2在小鼠中的治療功效。在用來(lái)自進(jìn)化枝IA/HK/213/2003(圖4A)和進(jìn)化枝2.1病毒A/TLL013/06 (圖4B)的小鼠適應(yīng)的印度尼西亞HPAIH5N1攻擊后一天，每組小鼠用2.5mg/kg, 5mg/kg和10mg/kg的ch4C2進(jìn)行治療。在整個(gè)14天觀察期監(jiān)測(cè)小鼠的存活。結(jié)果表示為存活百分比。發(fā)明詳述本發(fā)明涉及對(duì)流感H5血凝素的主要中和表位特異的鼠單克隆抗體4C2或嵌合或人源化單克隆抗體及其活性片段。本發(fā)明還涉及使用所述鼠或嵌合或人源化單克隆抗體或其片段預(yù)防和治療H5N1流感的方法和組合物?！胺蛛x的”表示不含與其天然存在的至少一些組分的生物分子。如本文使用的術(shù)語(yǔ)“抗體”是本領(lǐng)域公知的術(shù)語(yǔ)，應(yīng)被理解為表示結(jié)合已知抗原的分子或分子的活性片段，尤其表示免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即，包含特異性結(jié)合抗原的結(jié)合位點(diǎn)的分子。免疫球蛋白是一種蛋白，其包括基本上由免疫球蛋白K和λ、α、Υ、δ、ε和μ恒定區(qū)基因，以及眾多的免疫球蛋白可變區(qū)基因編碼的一種或更多種多肽。輕鏈被分為K或λ。重鏈被分為γ、μ、α、δ或ε ,分別依次定義免疫球蛋白類(lèi)型，IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。重鏈的亞型也是已知的。例如，人的IgG重鏈可以是IgGl、IgG2、IgG3和IgG4亞型中的任一種。本發(fā)明的免疫球蛋白可以具有任意類(lèi)型(IgG, IgM, IgD, IgE、IgA 和 IgY)或亞型(IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl 和 IgA2)。如本文使用的涉及抗體的“特異性結(jié)合”表示與結(jié)構(gòu)不同的抗原相比，抗體與其靶抗原以更大的親和力結(jié)合。
已知典型的免疫球蛋白結(jié)構(gòu)單位包括四聚體。每個(gè)四聚體由多肽鏈的兩個(gè)相同對(duì)組成，每對(duì)具有一條“輕”鏈(大約25kD)和一條“重”鏈(大約50-70kD)。每條鏈的N端限定一個(gè)大約100到110個(gè)或者更多個(gè)氨基酸的可變區(qū)，主要負(fù)責(zé)抗原識(shí)別。術(shù)語(yǔ)可變輕鏈(Vl)和可變重鏈(Vh)分別表示這些輕鏈和重鏈?？贵w以以下形式存在:全長(zhǎng)完整的抗體或大量的良好表征的片段(通過(guò)用各種肽酶肽酶或化學(xué)試劑消化而產(chǎn)生)。因此，例如，胃蛋白酶在鉸鏈區(qū)的二硫鍵處消化抗體產(chǎn)生F(ab)’2，F(xiàn)ab的二聚體，其自身是通過(guò)二硫鍵與Vh-CH1連接的輕鏈。在溫和條件下F(ab)’2可以被還原以斷裂鉸鏈區(qū)的二硫鍵從而將F(ab’)2 二聚體轉(zhuǎn)化為Fab’單體。Fab’單體基本上是具有鉸鏈區(qū)部分的Fab (對(duì)于其他抗體片段更詳細(xì)的說(shuō)明參見(jiàn)，F(xiàn)undamentalImmunology, ff.E.Paul, ed., Raven Press, N.Y.(1993))。盡管各種抗體片段是根據(jù)完整抗體的消化來(lái)限定，技術(shù)人員將理解任意的各種抗體片段可以從頭合成或化學(xué)合成或利用重組DNA方法合成。因此，如本文使用的術(shù)語(yǔ)抗體還包括通過(guò)完整抗體的修飾或從頭合成產(chǎn)生的抗體片段或利用重組DNA方法獲得的抗體和片段。本發(fā)明范圍內(nèi)的“抗體”期包括嵌合或人源化單克隆抗體，及其活性片段。結(jié)合已知抗原的分子的活性片段的實(shí)例包括分離的輕鏈和重鏈，F(xiàn)ab, Fab/c, Fv, Fab’，和F(ab’)2片段，包括Fab免疫球蛋白表達(dá)文庫(kù)的產(chǎn)物和上文提及的任意抗體和片段的表位結(jié)合片段。通過(guò)多種技術(shù)這些活性片段可以來(lái)源于本發(fā)明的抗體。例如，可以用酶諸如胃蛋白酶切割單克隆抗體，并進(jìn)行HPLC凝膠過(guò)濾。然后收集包含F(xiàn)ab片段的相應(yīng)組分，并通過(guò)膜過(guò)濾等進(jìn)行濃縮。關(guān)于分離抗體活性片段的常規(guī)技術(shù)的進(jìn)一步說(shuō)明參見(jiàn)例如Khaw等(1982);Rousseaux 等(1986)。

重組制備的抗體可以是常規(guī)的全長(zhǎng)抗體，已知來(lái)源于蛋白水解消化的活性抗體片段，獨(dú)特的活性抗體片段諸如Fv或單鏈Fv (scFv),結(jié)構(gòu)域缺失的抗體等。Fv抗體的大小約50Kd，包括輕鏈和重鏈的可變區(qū)。單鏈Fv (“sFv”)多肽是共價(jià)連接的VH:: VL異二聚體，其可以由直接連接或通過(guò)肽編碼接頭連接的包括VH-和VL-編碼序列的核酸來(lái)表達(dá)。參見(jiàn)Huston等(1988)。將抗體V區(qū)的天然聚集的，但化學(xué)分離的輕和重多肽鏈轉(zhuǎn)化為sFv分子的大量結(jié)構(gòu)，所述sFv分子將折疊形成與抗原結(jié)合簇結(jié)構(gòu)基本上類(lèi)似的三維結(jié)構(gòu)。參見(jiàn)，例如美國(guó)專利號(hào) 5，091，513; 5，132，405 和 4，956，778。結(jié)合位點(diǎn)是指參與抗原結(jié)合的抗體分子部分。抗原結(jié)合簇由重("H")和輕("L")鏈的N端可變("V")區(qū)氨基酸殘基組成?？贵w可變區(qū)包括3個(gè)高度變異的伸展(stretch)(稱為“高變區(qū)”或“互補(bǔ)決定區(qū)”(CDR))，其插入稱為“骨架區(qū)”(FR)的更保守的側(cè)翼伸展之間。在抗體分子中，輕鏈的3個(gè)高變區(qū)(IXDR1，IXDR2和IXDR3)和重鏈的3個(gè)高變區(qū)(HCDR1，HCDR2和HCDR3)在三維空間中彼此相對(duì)排列以形成抗原結(jié)合表面或口袋。因此抗體結(jié)合位點(diǎn)表示組成抗體CDR的氨基酸和組成結(jié)合位點(diǎn)口袋的任意框架殘基?？梢岳帽绢I(lǐng)域公知的方法確定特定抗體中構(gòu)成結(jié)合位點(diǎn)的氨基酸殘基的性質(zhì)。參見(jiàn)，例如，美國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)2010/0080800?？梢允褂帽绢I(lǐng)域公知的方法諸如分子建模和X射線結(jié)晶來(lái)確定特定抗體中氨基酸殘基的性質(zhì)，所述氨基酸殘基在CDR之外，但通過(guò)具有側(cè)鏈(其是結(jié)合位點(diǎn)內(nèi)層的一部分)仍構(gòu)成結(jié)合位點(diǎn)的一部分(即，它可以用于通過(guò)結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行鏈接)。參見(jiàn)，例如，Riechmann等(1988)。
嵌合抗體是其中一個(gè)或更多個(gè)抗體區(qū)域來(lái)源于一個(gè)動(dòng)物物種，而一個(gè)或更多個(gè)抗體區(qū)域來(lái)自于不同動(dòng)物物種的抗體。優(yōu)選的嵌合抗體是包括來(lái)自靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物免疫球蛋白區(qū)域的嵌合抗體。用于人臨床使用的嵌合抗體通常理解為具有來(lái)自非人動(dòng)物例如嚙齒類(lèi)的可變區(qū)以及來(lái)自人的恒定區(qū)。與此相反，人源化抗體使用來(lái)自非人抗體的CDR，而大部分或全部可變框架區(qū)和全部恒定區(qū)來(lái)自人免疫球蛋白。人嵌合抗體通常理解為具有來(lái)自嚙齒類(lèi)的可變區(qū)。典型的人嵌合抗體具有人重鏈恒定區(qū)和人輕鏈恒定區(qū)，而重鏈和輕鏈的可變區(qū)來(lái)自于嚙齒類(lèi)抗體。嵌合抗體可以包括人恒定區(qū)天然氨基酸序列和天然嚙齒類(lèi)可變區(qū)序列的一些變化?？梢岳帽绢I(lǐng)域公知的方法制備嵌合和人源化抗體，包括CDR移植方法(參見(jiàn)，例如，美國(guó)專利號(hào) 5，843，708; 6，180，370; 5，693，762; 5，585，089; 5，530，101)，鏈改組策略(參見(jiàn)，例如，美國(guó)專利號(hào)5，565，332; Rader等(1998))，分子建模策略(美國(guó)專利號(hào)5，639，641)，等等。就雙鏈抗體來(lái)說(shuō)如本文使用的“人源化抗體”是其中至少一條鏈被人源化的抗體。人源化抗體鏈具有可變區(qū)，其中一個(gè)或更多個(gè)框架區(qū)是人的。單鏈的人源化抗體是其中所述鏈具有可變區(qū)(其中一個(gè)或更多個(gè)框架區(qū)是人的)的抗體。人源化抗體鏈或其片段的可變區(qū)的非人部分來(lái)源于非人來(lái)源，尤其是非人抗體，通常是嚙齒類(lèi)來(lái)源。對(duì)人源化抗體的非人貢獻(xiàn)通常以至少一個(gè)CDR區(qū)域(其間置在來(lái)源于一個(gè)(或更多個(gè))人免疫球蛋白的框架區(qū)之間)的形式提供。此外，可以改變框架支持物殘基以保持結(jié)合親和力。人源化抗體還可以包括恒定區(qū)(例如，就輕鏈來(lái)說(shuō)，至少一個(gè)恒定區(qū)或其部分，和就重鏈來(lái)說(shuō)，優(yōu)選的3個(gè)恒定區(qū))。如果存在，人源化抗體的恒定區(qū)通常是人的。獲得“人源化抗體”的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。參見(jiàn)，例如，美國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)2010/0080800。如本文使用的術(shù)語(yǔ)恒定區(qū)(CR)是指免疫球蛋白的恒定區(qū)基因。恒定區(qū)基因編碼提供效應(yīng)物功能的抗體分子部分。對(duì)于嵌合人抗體和人源化抗體來(lái)說(shuō)，通常非人(例如，鼠)恒定區(qū)被人恒定區(qū)取代。所述嵌合或人源化抗體的恒定區(qū)通常來(lái)源于人免疫球蛋白。重鏈恒定區(qū)可以選自5種同種型中的任一種:α、δ、ε、Y或μ。此外，各種亞型(諸如重鏈的IgG亞型)的重鏈負(fù)責(zé)不同的效應(yīng)物功能，因此，通過(guò)選擇所需的重鏈恒定區(qū)，可以產(chǎn)生具有所需效應(yīng)物功能的抗體?？稍诒景l(fā)明范圍內(nèi)使用的恒定區(qū)是Yl(IgGl),尤其是Yl(IgGl)同種型的Fe區(qū)，Y3(IgG3)，特別是Y4(IgG4)。輕鏈恒定區(qū)可以具有κ或λ型，優(yōu)選的具有K型。在一個(gè)實(shí)施方案中，輕鏈恒定區(qū)是人K恒定鏈(Hieter等(1980))，重恒定鏈?zhǔn)侨薎gG4恒定鏈。如本文使用的術(shù)語(yǔ)可變區(qū)(VR)是指抗體每對(duì)輕鏈和重鏈中的結(jié)構(gòu)域，它們直接參與抗體與抗原的結(jié)合。每條重鏈在一端具有可變區(qū)(Vh)，然后是大量恒定區(qū)。每條輕鏈在一端具有可變區(qū)(VJ，在另一端具有恒定區(qū)；輕鏈的恒定區(qū)與重鏈的第一恒定區(qū)連接，輕鏈可變區(qū)與重鏈可變區(qū)連接。如本文使用的術(shù)語(yǔ)框架區(qū)(FR)是指位于抗體重鏈和輕鏈可變區(qū)內(nèi)的一個(gè)或更多個(gè)框架區(qū)(參見(jiàn) Kabat 等(1992) ; Johnson and Wu (2001) ; http:\\immun0.bme.nwa.edu)。這類(lèi)表述包括插入抗體輕鏈和重鏈可變區(qū)的CDR之間的那些氨基酸序列區(qū)域。
根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)序列限定法(Kabat等(1992))和結(jié)構(gòu)限定法(例如，諸如Chothia和Lesk(1987))確定⑶R和FR殘基。當(dāng)這兩種方法導(dǎo)致稍微不同的⑶R鑒別時(shí)，結(jié)構(gòu)限定法是優(yōu)選的，但通過(guò)序列限定方法鑒別的殘基被認(rèn)為是用于確定將何種框架殘基引入共有序列的重要FR殘基。術(shù)語(yǔ)“單克隆抗體”也是本領(lǐng)域公知的，表示作為單克隆抗體生成細(xì)胞產(chǎn)物的抗體。通常通過(guò)將常規(guī)短壽命的產(chǎn)生抗體的B細(xì)胞與快速生長(zhǎng)的細(xì)胞(諸如癌細(xì)胞(有時(shí)稱為“永生化”細(xì)胞))融合來(lái)制備單克隆抗體。獲得的雜交細(xì)胞，或雜交瘤，快速增殖，制備出產(chǎn)生抗體的克隆。術(shù)語(yǔ)“片段”是指抗體或抗體鏈的一部分，其包括比完整或全部抗體或抗體鏈更少的氨基酸殘基?？梢酝ㄟ^(guò)完整或全部抗體或抗體鏈的化學(xué)或酶處理來(lái)獲得片段。還可通過(guò)重組方法獲得片段。示例性片段包括Fab、Fab’、F (ab’)2、Fabc和/或和Fv片段。術(shù)語(yǔ)“抗原結(jié)合片段”是指免疫球蛋白或抗體的多肽片段，其結(jié)合抗原或與完整抗體(即，與作為它們來(lái)源的完整抗體)競(jìng)爭(zhēng)進(jìn)行抗原結(jié)合(即，特異性結(jié)合)。通過(guò)重組DNA技術(shù)或者通過(guò)酶或者化學(xué)切割完整的免疫球蛋白來(lái)產(chǎn)生結(jié)合片段。結(jié)合片段包括Fab、Fab’、F(ab’)2、Fabc、Fv、單鏈、和單鏈抗體。具有降低免疫原性的人源化抗體是指相對(duì)于親本抗體(例如，鼠抗體)顯示降低免疫原性的人源化抗體?；旧媳Ａ粲H本抗體結(jié)合特性的人源化抗體是指一種人源化抗體，其保留特異性結(jié)合被親本抗體(用于產(chǎn)生所述人源化抗體)識(shí)別的抗原的能力。優(yōu)選的人源化抗體將顯示與親本抗體相同的或基本上相同的抗原結(jié)合親和力和親合力。理想地，抗體的親和力不低于親本抗體親和力的10%，更優(yōu)選的不低于約30%，和最優(yōu)選的親和力不低于親本抗體的50%。用于測(cè)定抗原結(jié)合親和力的方法是本領(lǐng)域公知的，包括半最大結(jié)合測(cè)定，競(jìng)爭(zhēng)測(cè)定，和Scatchard 分析。此外，術(shù)語(yǔ)“治療有效量”是指當(dāng)給人或動(dòng)物施用時(shí)，足以在所述人或動(dòng)物中產(chǎn)生治療功效的抗體量。本領(lǐng)域技術(shù)人員按照常規(guī)方法可以方便的確定有效量。如本文使用的，術(shù)語(yǔ)“治療”和“預(yù)防”是指由于施用預(yù)防或治療劑引起的對(duì)象中一種或更多種病癥癥狀復(fù)發(fā)或發(fā)作的預(yù)防。在第一個(gè)方面，本發(fā)明提供對(duì)流感H5血凝素的主要中和表位特異的單克隆抗體及其活性片段，即抗原結(jié)合片段(本文中也稱為抗體片段)。在一個(gè)實(shí)施方案中，單克隆抗體是鼠單克隆抗體4C2。鼠單克隆抗體4C2由小鼠雜交瘤4C2產(chǎn)生。根據(jù)布達(dá)佩斯條約(Budapest Treaty)，在2010年8月3日將小鼠雜交瘤4C2保藏于美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection), 10801University Blvd., Manassas, VA20110, USA,分配的登錄號(hào)為PTA-11241。本發(fā)明還涉及產(chǎn)生鼠單克隆抗體4C2的雜交瘤。在第二個(gè)實(shí)施方案中，單克隆抗體是嵌合或人源化的單克隆抗體。具體來(lái)說(shuō)，所述嵌合或人源化的單克隆抗體與鼠單克隆抗體4C2特異性結(jié)合的H5血凝素的構(gòu)象表位特異性結(jié)合。在一個(gè)實(shí)施方案中，單克隆抗體(鼠單克隆抗體或嵌合或人源化的單克隆抗體)或其片段特異性結(jié)合H5血凝素(HA)的構(gòu)象表位，其中所述構(gòu)象表位由成熟HA蛋白的氨基酸155 (Ser)和189(Arg)組成。在另一個(gè)實(shí)施方案中，輕鏈可變區(qū)的互補(bǔ)決定區(qū)(OTR) (IXDR)位于SEQ ID N0:2所示的氨基酸序列內(nèi)(本文中也稱為HM448828，其是小鼠輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，輕鏈可變⑶R的氨基酸序列是:IXDR1:QDISGH(SEQ IDNO:5) ;LCDR2:HGT(SEQ ID NO:6);和 LCDR3:VQYVQFPWT(SEQ ID NO:7)。在一個(gè)實(shí)施方案中，重鏈可變區(qū)的互補(bǔ)決定區(qū)(OTR) (HCDR)位于SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列內(nèi)(本文中也稱為HM448827，其是小鼠重鏈可變區(qū)的氨基酸序列)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，重鏈可變CDR 的氨基酸序列是:HCDR1:GYTFTTYW (SEQ ID NO: 8) ; HCDR2:1DPYDSET (SEQ ID NO: 9) ;HCDR3:VRGGSTVAYFGV(SEQ ID NO:10)。在一個(gè)實(shí)施方案中，編碼HM448828的DNA包含SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，編碼HM448827的DNA包含SEQ ID NO: 3所示的核苷酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，輕鏈可變區(qū)包含SEQ ID N0:2所示的氨基酸序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，重鏈可變區(qū)包含SEQ ID N0:4所示的氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，重鏈和輕鏈恒定區(qū)是人的。在另一個(gè)實(shí)施方案中，人重鏈恒定區(qū)是人IgGl重鏈恒定區(qū)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，人IgGl重鏈恒定區(qū)包含SEQ ID NO: 22 (GenBank登錄號(hào)AAX09634.1)所示的氨基酸序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，編碼該氨基酸序列的核酸序列如SEQ ID NO: 21 (GenBank登錄號(hào)AY885218.1)所示。在一個(gè)實(shí)施方案中，人輕鏈恒定區(qū)是人kappa輕鏈恒定區(qū)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，人kappa輕鏈恒定區(qū)包括SEQ ID NO: 24 (GenBank登錄號(hào)AAA58989.1)所示的氨基酸序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，編碼該序列的核酸序列如SEQ ID勵(lì):23(661^&1^登錄號(hào)川0241.1)所
/Jn ο在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種核酸，其編碼本文描述的鼠單克隆抗體4C2或嵌合或人源化單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段。核酸序列的實(shí)例包括本文描述的那些。在另外的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包括所述核酸的載體。在另外的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包括并表達(dá)所述載體的細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，利用本文描述的技術(shù)，以及技術(shù)人員公知的技術(shù)，通過(guò)將人重鏈和輕鏈恒定區(qū)與小鼠重鏈和輕鏈可變區(qū)組合來(lái)制備人源化抗體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，制備人源化抗體，其中編碼人源化\和Vh序列(其分別包含本文描述的小鼠輕鏈和重鏈可變區(qū)的CDR)的DNA序列是合成的。用于合成編碼已知序列蛋白的DNA的方法是本領(lǐng)域公知的。使用這種方法，合成編碼本發(fā)明所述 人源化抗體的DNA序列，然后在適于表達(dá)重組抗體的載體系統(tǒng)中進(jìn)行表達(dá)。這可以在任意載體系統(tǒng)中實(shí)現(xiàn)，所述載體系統(tǒng)提供本發(fā)明所述的人源化抗體序列，諸如包括人恒定區(qū)序列和小鼠可變區(qū)序列(其被連接以產(chǎn)生功能性(抗原結(jié)合)抗體)的融合蛋白的表達(dá)。具體來(lái)說(shuō)適于表達(dá)重組抗體和人源化抗體的表達(dá)載體、宿主細(xì)胞以及適于表達(dá)這類(lèi)抗體的方法是本領(lǐng)域公知的。參見(jiàn)，例如，美國(guó)專利號(hào)7，074，406。已知能夠表達(dá)功能免疫球蛋白的宿主細(xì)胞包括舉例來(lái)說(shuō)哺乳動(dòng)物細(xì)胞諸如中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞，COS細(xì)胞，骨髓瘤細(xì)胞，細(xì)菌諸如大腸桿菌，酵母細(xì)胞諸如釀酒酵母，以及其他宿主細(xì)胞。在這些細(xì)胞中，考慮到它們有效表達(dá)和分泌免疫球蛋白的能力，許多研究人員使用CHO細(xì)胞?；旧希ㄟ^(guò)兩種常規(guī)方法之一實(shí)現(xiàn)人源化抗體的重組表達(dá)。在第一種方法中，用單個(gè)載體(其提供融合到所選恒定區(qū)的重鏈和輕鏈可變序列的表達(dá))轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞。在第二種方法中，用兩種載體(其分別提供融合到所選恒定區(qū)的可變重鏈或輕鏈序列的表達(dá))轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞。在第二個(gè)方面，本發(fā)明提供使用所述鼠單克隆抗體4C2或嵌合或人源化單克隆抗體或其片段來(lái)預(yù)防和治療H5N1流感的方法和組合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種藥物組合物，其包括本文描述的鼠單克隆抗體4C2或嵌合或人源化的單克隆抗體以及藥用可接受的稀釋劑或載體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，藥物組合物包括本文所述單克隆抗體的抗原結(jié)合片段和藥用可接受的稀釋劑或載體。在另外的實(shí)施方案中，藥物組合物包括編碼所述抗體或抗體片段的核酸分子和藥用可接受的稀釋劑或載體。在另外的實(shí)施方案中，藥物組合物包括包含所述核酸的載體和藥用可接受的稀釋劑或載體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，藥物組合物包括表達(dá)所述載體的細(xì)胞和藥用可接受的稀釋劑或載體。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種方法，以減少對(duì)象的流感H5N1病毒感染、或降低對(duì)象流感H5N1病毒感染的風(fēng)險(xiǎn)、抑制一種或更多種流感H5N1病毒毒株或分離物對(duì)對(duì)象的感染、或預(yù)防一種或更多種流感H5N1病毒毒株或分離物的流感感染或疾病。在這種實(shí)施方案中，所述方法包 括向有需要的對(duì)象施用治療有效量的本文所述鼠單克隆抗體4C2或嵌合或人源化單克隆抗體，或其抗原結(jié)合片段，包括編碼所述抗體或抗體片段的多核苷酸的核酸分子；包括所述多核苷酸的載體；或表達(dá)所述載體的細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)象是免疫受損的，是嬰兒，是幼兒或是老人。在另一個(gè)實(shí)施方案中，施用提供治療益處。在另外的實(shí)施方案中，治療益處包括在對(duì)象中抑制流感病毒滴度的增加，降低流感病毒滴度，抑制流感病毒復(fù)制的增加，降低流感病毒復(fù)制，抑制流感病毒增殖的增加或降低流感病毒增殖，或降低與流感病毒感染相關(guān)的一種或更多種癥狀或并發(fā)癥的進(jìn)展，嚴(yán)重性，頻率，持續(xù)時(shí)間或概率。在一個(gè)實(shí)施方案中，癥狀或并發(fā)癥選自惡寒，發(fā)燒，咳嗽，喉晚痛，鼻充血，竇充血，鼻感染，竇感染，身體疼痛，頭痛，疲勞，肺炎，支氣管炎，耳感染，耳痛和死亡。在另一個(gè)實(shí)施方案中，治療益處包括促進(jìn)對(duì)象從流感H5N1病毒感染的康復(fù)。在另外的實(shí)施方案中，給對(duì)象施用的物質(zhì)在對(duì)象的流感H5N1病毒感染之前，基本上同時(shí)或之后進(jìn)行施用。利用已知技術(shù)，可以將本發(fā)明的抗體制備為生理上可接受的制劑，并包括藥用可接受的載體，稀釋劑和/或賦形劑。例如，本發(fā)明的抗體及如本文所述包括任意功能等同的抗體或其功能部分與藥用可接受的載體，稀釋劑和/或賦形劑混合以形成治療組合物。合適的藥物載體，稀釋劑和/或賦形劑是本領(lǐng)域公知的，包括，例如，磷酸緩沖鹽溶液，水，乳液諸如油/水乳液，各種類(lèi)型的濕潤(rùn)劑，無(wú)菌溶液，等等?？梢愿鶕?jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)方法實(shí)現(xiàn)本發(fā)明藥物組合物的制備。參見(jiàn)，例如，Remington:The Science and Practice of Pharmacy, 21st Ed., Ed.D.B.Troy, Lippincott, ffilliams&ffilkins, Baltimore, 2006,其援引加入本文。可以按照合適的藥學(xué)有效量給對(duì)象施用固體、液體或氣霧劑形式的本發(fā)明組合物。固體組合物的實(shí)例包括丸劑，乳劑，和可植入的劑量單位。丸劑可以口服施用。治療乳劑可以局部施用?？芍踩氲膭┝繂挝豢梢跃植渴┯?，例如，在腫瘤部位，或例如皮下植入用于治療組合物的全身釋放。液體組合物的實(shí)例包括適合于肌內(nèi)，皮下，靜脈內(nèi)，動(dòng)脈內(nèi)注射的制劑，以及用于局部和眼內(nèi)施用的制劑。氣霧劑的實(shí)例包括用于給肺施用的吸入劑?？梢酝ㄟ^(guò)標(biāo)準(zhǔn)施用途徑施用組合物。通常，可以通過(guò)局部、口服、直腸、鼻、皮內(nèi)(interdermal)、腹腔內(nèi)、或腸胃外(例如，靜脈內(nèi)、皮下、或肌內(nèi))途徑施用組合物。此外，組合物可以摻入緩釋基質(zhì)諸如可生物降解的聚合物，可植入所需輸送位置(例如，腫瘤部位)附近的多聚體。所述方法包括施用單劑量，按照預(yù)定時(shí)間間隔施用重復(fù)劑量，以及持續(xù)施用預(yù)定時(shí)間段。如本文使用的緩釋基質(zhì)是由材料(通常是可通過(guò)酶或酸/堿水解或通過(guò)溶解可降解的多聚體)制成的基質(zhì)。一旦插入身體，基質(zhì)受到酶和體液的作用。緩釋基質(zhì)希望選自生物相容性材料諸如脂質(zhì)體，多乳酸化合物(聚乳酸)，聚乙醇酸交酯(羥基乙酸的多聚體)，聚乳酸共乙交酯(乳酸和羥基乙酸的共聚物)，聚酐，聚(鄰)酯，多肽，透明質(zhì)酸，膠原，硫酸軟骨素，羧酸，脂肪酸，磷脂，多糖，核酸，聚氨基酸，氨基酸諸如苯丙氨酸，酪氨酸，異亮氨酸，多核苷酸，聚乙烯丙烯，聚乙烯吡咯烷酮和硅酮。優(yōu)選的可生物降解基質(zhì)是以下基質(zhì)中的一種:聚乳酸，聚乙醇酸交酯，或聚乳酸共乙交酯(乳酸和羥基乙酸的共多聚體)。所述組合物可以與包括生物活性物質(zhì)或化合物(尤其至少一種化合物)的其它組合物聯(lián)合施用，所述化合物選自抗氧化應(yīng)激化合物，抗凋亡化合物，金屬螯合劑，DNA修復(fù)抑制劑諸如Pirenz印in和代謝物，3-氨基-1-丙烷磺酸(3APS)，I, 3-丙烷二磺酸鹽(1,3PDS), α-分泌酶活化劑，β_和Y-分泌酶抑制劑，tau蛋白，神經(jīng)遞質(zhì)，β _片層結(jié)構(gòu)破壞劑，淀粉樣β清除/去除細(xì)胞組分的引誘劑，N端截短淀粉樣β包括焦谷氨酸化淀粉樣β3-42的抑制劑，抗炎分子，“非典型抗精神病藥”諸如，例如氯氮平，齊拉西酮，利培酮，阿立哌唑或奧氮平或膽堿酯酶抑制劑(ChEI)諸如他克林，利斯的明，多奈哌齊，和/或加蘭他敏，Ml激動(dòng)劑和其他藥物包括任意淀粉樣或tau調(diào)節(jié)藥物和營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑諸如，例如，維生素B12，半胱氨酸， 乙酰膽堿前體，卵磷脂，膽堿，銀杏，乙?；?L-肉堿，艾地苯醌，丙戊茶堿，或黃嘌呤衍生物，以及本發(fā)明的抗體和，任選的，藥用可接受的載體和/或稀釋劑和/或賦形劑以及用于治療疾病的方法。蛋白藥學(xué)活性物質(zhì)的量是每劑量Ing到IOmg的量。通常,施用方案應(yīng)當(dāng)在0.1 μ g到IOmg本發(fā)明抗體的范圍內(nèi)，特別是1.0 μ g到1.0mg的范圍內(nèi)，更特別的是1.0 μ g到100 μ g的范圍內(nèi)，而位于這些范圍內(nèi)的單個(gè)數(shù)值也屬于本發(fā)明。如果通過(guò)連續(xù)輸注進(jìn)行施用，更合適的劑量是在0.01 μ g到IOmg單位/公斤體重/小時(shí)的范圍內(nèi)，而位于這些范圍內(nèi)的單個(gè)數(shù)值也屬于本發(fā)明。施用通常是腸胃外的，例如靜脈內(nèi)。用于腸胃外施用的制劑包括無(wú)菌水性或非水性溶液，懸液和乳液。非水性溶劑包括但不限于，丙二醇，聚乙二醇，植物油諸如橄欖油，和注射用有機(jī)酯諸如油酸乙酯。水性溶劑可以選自水，醇/水溶液，乳液或懸液包括鹽水和緩沖培養(yǎng)基。腸胃外賦形劑包括氯化鈉溶液，Ringer’s葡萄糖，葡萄糖和氯化鈉，乳酸鹽Ringer’S，或非揮發(fā)油。靜脈內(nèi)賦形劑包括液體和營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充物，電解質(zhì)補(bǔ)充物(諸如基于Ringer’s葡萄糖的那些)等等。還可以存在防腐劑,諸如,例如,抗菌劑、抗氧化劑、螯合劑、惰性氣體等等。藥物組合物還可以包括蛋白載體諸如，例如，血清白蛋白或免疫球蛋白，尤其是人來(lái)源的。根據(jù)預(yù)期用途，本發(fā)明的藥物組合物中還可以存在生物活性劑。在本發(fā)明中，通過(guò)表位作圖來(lái)表征抗HA2gp單克隆抗體(mAb)組的相應(yīng)表位。在用HPAI H5N1病毒感染攻擊的小鼠中鑒定這些mAb的治療和預(yù)防功效。在鼠模型中鑒定這些mAb中的一種針對(duì)兩種來(lái)自進(jìn)化枝I和2.1的高致病性H5N1病毒株的預(yù)防和治療功效。通過(guò)觀察體重減輕，存活率以及感染小鼠肺中病毒載量清除的動(dòng)力學(xué)來(lái)確定功效。從這種mAb制備嵌合或人源化mAb。除非另外指出，本發(fā)明的實(shí)施使用以下常規(guī)技術(shù):化學(xué)，分子生物學(xué)，微生物學(xué)，重組DNA，遺傳學(xué)，免疫學(xué)，細(xì)胞生物學(xué)，細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)基因生物學(xué)，這都在本領(lǐng)域技術(shù)范圍內(nèi)。參見(jiàn)，例如，Maniatis 等，1982，Molecular Cloning (Cold Spring Harbor LaboratoryPress, Cold Spring Harbor, New York);Sambrook 等，1989，Molecular Cloning,2ndEd.(Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor, New York);Sambrookand Russell，2001，Molecular Cloning, 3rd Ed.(Cold Spring Harbor LaboratoryPress,Cold Spring Harbor, New York);Ausubel 等，1992)，Current Protocols inMolecular Biology (John Wiley&Sons, including periodic updates);Glover，1985，DNACloning (IRL Press,Oxford) ;Russell, 1984,Molecular biology of plants: alaboratory course manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold SpringHarbor, N.Y.);Anandj Techniques for the Analysis of Complex Genomes, (AcademicPress, New York，1992);Guthrie and Fink，Guide to Yeast Genetics and MolecularBiology(Academic Press, New York, 1991);Harlow and Lane，1988，Antibodies，(ColdSpring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York) ;NucleicAcid Hybridization(B.D.Hames&S.J.Higgins eds.1984) ;Transcription AndTranslation (B.D.Hames&S.J.Higgins eds.1984) ;Culture Of Animal Cells(R.1.Freshneyj Alan R.Lissj Inc., 1987) ;Immobilized Cells And Enzymes(IRLPress, 1986) ;B.Perbalj A Practical Guide To Molecular Cloning(1984) ;thetreatise，Methods In Enzymology(Academic Press, Inc.，N.Y.) ;Methods InEnzymologyjVols.154andl55(Wu 等 eds.), Immunochemical Methods In Cell AndMolecular Biology (Mayer and Walker, eds., Academic Press, London, 1987);HandbookOf Experimental Immunology, Volumes 1-1V (D.M.Weir and C.C.Blackwell, eds.，1986) ;Riottj Essential Immunology, 6th Edition,Blackwell ScientificPublications, Oxford,1988;Fire 等，RNA Interference Technology:From BasicScience to Drug Development,Cambridge University Press,Cambridge, 2005;SchepersjRNA Interference in Practice, Wi ley - VCHj2005;Engelkej RNAInterference (RNAi): The Nuts&Bolts of siRNA Technol`ogy, DNA Press,2003;Gottj RNAInterference, Editing,and Modification: Methods and Protocols (Methods inMolecular Biology)，Human Press, Totowaj NJj 2004;Sohailj Gene Silencing by RNAInterference:Technology and Application，CRC，2004。
實(shí)施例
本發(fā)明參考下列實(shí)施例進(jìn)行描述，提供所述實(shí)施例是為了說(shuō)明而不是旨在以任何方式限制本發(fā)明。使用本領(lǐng)域公知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)或下文具體描述的技術(shù)。實(shí)施例1:材料和方法病毒:H5N1人流感病毒，來(lái)自進(jìn)化枝2.1A/印度尼西亞/⑶C669/2006，A/印度尼西亞/TLL012/2006, A/印度尼西亞/TLL013/2006, A/印度尼西亞/TLL014/2006和A/印度尼西亞/⑶C326/2006獲自印度尼西亞的衛(wèi)生部(MOH)。通過(guò)反向遺傳學(xué)(RG) (WHO, 2005)拯救來(lái)自不同進(jìn)化枝(進(jìn)化枝O-A/香港/156/97，進(jìn)化枝1.0-A/香港/213/2004，進(jìn)化枝
4.0-A/鵝/貴陽(yáng)/337/06和進(jìn)化枝8.0-A/雞/河南/12/04)的病毒。簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，將合成的HA和NA基因克隆入雙啟動(dòng)子質(zhì)粒用于甲型流感反向遺傳學(xué)。雙啟動(dòng)子質(zhì)粒獲自疾病預(yù)防和控制中心(Center for Disease Control and Prevention)，Atlanta, GA, USA。利用Lipofectamine2000 (Invitrogen Corp.USA)將包含HA和NA的質(zhì)粒以及源自A/波多黎各/8/34 (HlNl)的剩余6種基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T和MDCK細(xì)胞的共培養(yǎng)物，拯救重配株病毒。將原病毒苗(stock viruses)在11天齡含胚雞蛋的尿囊腔中35° C增殖36-91小時(shí)。根據(jù)⑶C/NIH和WHO的建議,并得到新加坡農(nóng)業(yè)食品與獸醫(yī)局(Agr1-Food and VeterinaryAgency)和衛(wèi)生部(MOH)的批準(zhǔn)，在BSL3+防范設(shè)施中進(jìn)行所有涉及高致病性病毒的實(shí)驗(yàn)。Mab產(chǎn)生:用溶于0.1ml磷酸緩沖鹽溶液(PBS)的來(lái)自A/印度尼西亞/TLL014/2006的滅活全病毒(用等體積的佐劑Montanide ISA563 (SEPPIC, France)乳化)按照2周的定期間隔給BALB/c小鼠皮下免疫兩次。在將脾細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞融合前3天，小鼠利用相同的病毒抗原進(jìn)行加強(qiáng)。將融合細(xì)胞種于96孔板，并通過(guò)如下所述的免疫熒光測(cè)定篩選它們的上清液。通過(guò)進(jìn)行有限稀釋至少3次，將產(chǎn)生mAb的雜交瘤克隆。如下所述根據(jù)它們的血細(xì)胞凝集抑制活性檢測(cè)陽(yáng)性mAb。按照制造商實(shí)驗(yàn)方案中的描述，使用商品化的分型試劑盒(Amersham Bioscience, England)將來(lái)自所選陽(yáng)性mAb的免疫球蛋白進(jìn)行分型。使用Protein A瓊脂糖凝膠珠(Millipore)純化mAb。通過(guò)SDS-PAGE分析確定抗體純度。然后如下所述，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)血細(xì)胞凝集抑制測(cè)定檢測(cè)mAb的中和活性。免疫熒光測(cè)定(IFA):用AIV H5N1毒株感染在96孔板培養(yǎng)的MDCK細(xì)胞。在感染24-48小時(shí)后，將細(xì)胞在室溫用4%多聚甲醛固定30分鐘，并用磷酸緩沖鹽溶液(PBS)，pH7.4清洗3次。將固定細(xì)胞與雜交瘤培養(yǎng)上清液在37° C溫育I小時(shí)，磷酸緩沖鹽溶液(PBS)清洗，然后與1:40稀釋的偶聯(lián)異硫氰酸熒光(FITC)的兔抗小鼠免疫球蛋白(Dako，Denmark)溫育。再用PBS清洗細(xì)胞，通過(guò)廣視野表面熒光顯微鏡(Olympus 1X71)鑒定抗體結(jié)合。 血細(xì)胞凝集抑制測(cè)定:按照先前的描述(Webster等，1991),進(jìn)行血細(xì)胞凝集抑制(HI)測(cè)定。簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，在V形底96孔板中將mAb系列稀釋(2倍)，并與4HA單位的病毒H5N1病毒混合。將板在室溫下溫育30分鐘，每孔添加1%雞RBCs。血細(xì)胞凝集抑制終點(diǎn)是其中觀察不到凝集的最高mAb稀釋度。滲漏突變體的分離和分析:按照先前的描述(Kaverin等，2007)，通過(guò)滲漏突變體的表征對(duì)mAb4C2識(shí)別的表位作圖。簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，將H5N1病毒與過(guò)量的mAb溫育I小時(shí)，然后接種入11天齡的含胚雞蛋。為了分離體內(nèi)滲漏突變體，將來(lái)自治療小鼠的肺部樣品直接接種入含胚蛋。蛋在37° C溫育48h。收集病毒，用于含胚雞蛋中有限稀釋法的克隆，并噬斑純化滲漏突變體。從尿囊液提取RNA。逆轉(zhuǎn)錄(RT) -PCR擴(kuò)增血凝素基因，并克隆入TA-克隆載體(Promega)，對(duì)數(shù)個(gè)克隆進(jìn)行測(cè)序。通過(guò)與親本病毒的序列進(jìn)行比較，分析單個(gè)克隆的序列。嵌合IgGl表達(dá)質(zhì)粒的克隆:按照(Jostock等，2004)的描述設(shè)計(jì)表達(dá)載體。簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，利用下列引物擴(kuò)增編碼kappa輕鏈和IgGl重鏈的人抗體恒定區(qū):人IgGl恒定重鏈:正向引物 5’ -CTCGAGCGACCTCCACCAAGG-3’ (SEQ ID NO: 11)和反向引物 5’ -TCTAGACTCGGAGAGGGACAGAG-3’ (SEQ ID NO: 12);人恒定 kappa kappa 輕鏈:正向引物5’ -CTGCAGATCACGCGAACTGTGGCT GC-3’ (SEQ ID NO: 13)和反向引物 5’-GGCGCGCCCGAAGTTGTCCCCTCTCACAA TCATC ATC-3’ (SEQ ID NO: 14)。將擴(kuò)增的 kappa 輕鏈和 IgGl 重鏈的恒定區(qū)克隆入改造的pCMV/myc/ER質(zhì)粒,在它們之間插入腦心肌炎病毒的內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)。引入獨(dú)特的限制性酶切位點(diǎn)，以允許在框架與恒定區(qū)之間插入重鏈和輕鏈的可變區(qū)。從mAb4C2雜交瘤細(xì)胞制備mRNA，并用于利用隨機(jī)六聚物的第一鏈cDNA合成。利用小鼠scFv重組抗體曬菌體系統(tǒng)(Amersham Biosciences)的引物和試驗(yàn)方案,利用總cDNA作為模板來(lái)擴(kuò)增可變重鏈和輕鏈。將最終產(chǎn)物克隆入pCR-Script (Stratagene, USA)用于測(cè)序。然后如下設(shè)計(jì)序列特異性引物:4C2特異性可變輕鏈:正向引物5’-GG TAAGGGGTTAACAGTAGCAGG-3’ (SEQ ID NO: 15)和反向引物 5’-CTTTGGCCTCTCTGGGATAGAAG-3’ (SEQ ID NO: 16) ;4C2 特異性可變重鏈:正向引物 5’-CACGATGATAATATGGCCACAACC-3’ (SEQ ID NO: 17)和反向引物 5’ -CACCG GTTGGGGGAAGTAGTACT-3’ (SEQ IDNO: 18)。這些引物用于可變區(qū)的擴(kuò)增，然后將其克隆入表達(dá)載體。4C2特異性可變輕鏈編碼序列如SEQ ID NO: 3所示，4C2特異性可變重鏈編碼序列如SEQ ID NO:1所示。這種構(gòu)建體的表達(dá)產(chǎn)生嵌合抗體，其包含33%的序列作為來(lái)自小鼠的小鼠可變區(qū)和67%的序列作為人IgGl恒定區(qū)。嵌合抗體的瞬時(shí)表達(dá)和純化:利用Freestyle293表達(dá)系統(tǒng)(Invitrogen, USA)表達(dá)嵌合抗體，以獲得在給定的無(wú)血清培養(yǎng)基中產(chǎn)生的抗體。利用293fectin (Invitrogen, USA)將上述構(gòu)建體轉(zhuǎn)染入293-F細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后120小時(shí)收集上清液。利用Protein A瓊脂糖凝膠珠(Millipore)純化嵌合抗體4C2 (ch_mAb4C2或ch4C2)。通過(guò)SDS-PAGE確定嵌合抗體的純度，并使用利用HRP標(biāo)記的抗人Ig(DAKO)的免疫印跡分析來(lái)確認(rèn)人恒定區(qū)的引入。微量中和測(cè)定:按照先前的描述(Prabakaran等，2008),通過(guò)微量中和測(cè)定分析抗H5N1毒株的單克隆抗體的中和活性。簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，將10倍稀釋的mAb進(jìn)一步系列稀釋(2倍)，并與10050%組織培養(yǎng)感染性量(TCID50)的H5N1毒株不同進(jìn)化枝在室溫下溫育I小時(shí)，一式兩份鋪板在96孔板生長(zhǎng)的MDCK細(xì)胞。通過(guò)Reed和Muench方法確定每種H5N1毒株在MDCK細(xì)胞培養(yǎng)物中的TCID50。將其中通過(guò)光學(xué)顯微鏡沒(méi)有觀察到細(xì)胞病變效應(yīng)的最高mAb稀釋度確定為 中和滴度。攻擊研究:4-6周齡的近交SPF BALB/c小鼠用于攻擊研究。用5MLD50 (小鼠致死劑量50%)的兩種不同H5N1毒株(來(lái)自進(jìn)化枝I的RG-A/香港/213/2003和來(lái)自進(jìn)化枝2.1的A/印度尼西亞/TLL013/06)鼻內(nèi)感染小鼠(每組n=10)。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)都根據(jù)Guidesfor Animal Experiments Performed at NIID 和實(shí)驗(yàn)方案進(jìn)行。預(yù)防功效:為了測(cè)定預(yù)防功效，在病毒攻擊前，用2.5mg/kg、5mg/kg、10mg/kg或0mg/kg(PBS)的單克隆抗體(4C2或ch4C2)腹膜內(nèi)預(yù)治療小鼠。24小時(shí)后，用5MLD50的兩種不同H5N1株攻擊小鼠。每天觀察小鼠的體重和死亡率,直至所有動(dòng)物死亡或直至攻擊后14天。治療功效:為了確定嵌合mAb的治療功效，用5MLD50兩種不同的H5N1毒株攻擊小鼠組。病毒攻擊后24小時(shí),用2.5mg/kg、5mg/kg、10mg/kg或0mg/kg(PBS)的單克隆抗體(4C2或ch4C2)通過(guò)腹膜內(nèi)途徑治療小鼠。每天觀察小鼠的體重和死亡率，直至所有動(dòng)物死亡或直至攻擊后14天。實(shí)施例2:鼠mAb4C2的表征和嵌合針對(duì)不同H5N1病毒株的有效中和，篩選一組抗流感血凝素(HA)的mAb。利用中和滲漏突變體的挑選，分析參與形成4C2mAb表位的氨基酸。包括信號(hào)蛋白的HA蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO: 19所示，成熟HA蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO: 20所示。從4C2mAb的多個(gè)滲漏變體分離的完整HA基因的測(cè)序在氨基酸位置155 (Ser到lie)和189 (Arg到Lys)(相對(duì)于SEQ ID NO: 20所示的成熟HA蛋白)載有單個(gè)點(diǎn)突變?；谄渑cH5N1病毒的反應(yīng)性和高HI活性(表I)和中和滴度(表2)選擇mAb4C2用于小鼠模型的治療研究。表1:抗H5N1毒株不同進(jìn)化枝的4C2mAb的血細(xì)胞凝集抑制滴度
權(quán)利要求
1.特異性結(jié)合H5血凝素的構(gòu)象表位的單克隆抗體或抗體片段，其中所述構(gòu)象表位包含氨基酸155 (Ser)和氨基酸189 (Arg)。
2.權(quán)利要求1的單克隆抗體或抗體片段，其中H5血凝素的構(gòu)象表位是鼠單克隆抗體4C2特異性結(jié)合的表位。
3.權(quán)利要求1的單克隆抗體或片段，其中所述單克隆抗體是鼠單克隆抗體4C2。
4.權(quán)利要求1的單克隆抗體或抗體片段，其中所述單克隆抗體或其片段是來(lái)源于鼠單克隆抗體4C2的嵌合或人源化單克隆抗體。
5.權(quán)利要求1的單克隆抗體或抗體片段，其中H5血凝素包含SEQID NO:20所示的氨基酸序列。
6.權(quán)利要求1到5任一項(xiàng)的單克隆抗體或抗體片段，其中輕鏈可變區(qū)的互補(bǔ)決定區(qū)在SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列之內(nèi)。
7.權(quán)利要求6的單克隆抗體，其中所述互補(bǔ)決定區(qū)是:LCDRl:QDISGH(SEQ ID NO:5); LCDR2:HGT(SEQ ID NO:6);和LCDR3:VQYVQFPWT(SEQ ID NO:7)。
8.權(quán)利要求1到5任一項(xiàng)的單克隆抗體或抗體片段，其中重鏈可變區(qū)的互補(bǔ)決定區(qū)在SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列之內(nèi)。
9.權(quán)利要求8的單克隆抗體，其中所述互補(bǔ)決定區(qū)是:HCDR1:GYTFTTYW(SEQ ID NO:8);HCDR2:1DPYDSET(SEQ ID NO:9);和HCDR3:VRGGSTVAYFGV(SEQ ID NO:10)。
10.權(quán)利要求1到5任一項(xiàng)的單克隆抗體或抗體片段，其中輕鏈可變區(qū)的互補(bǔ)決定區(qū)在SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列之內(nèi)，并且重鏈可變區(qū)的互補(bǔ)決定區(qū)在SEQ ID N0:4所示的氨基酸序列之內(nèi)。
11.權(quán)利要求10的單克隆抗體，其中所述互補(bǔ)決定區(qū)是:LCDRl:QDISGH(SEQ ID NO:5);LCDR2:HGT(SEQ ID NO:6);LCDR3:VQYVQFPWT(SEQ ID NO:7);HCDRl:GYTFTTYff(SEQ ID NO:8);HCDR2:1DPYDSET(SEQ ID NO:9);和HCDR3:VRGGSTVAYFGV(SEQ ID NO:10)。
12.權(quán)利要求1到5任一項(xiàng)的單克隆抗體或抗體片段，其中輕鏈可變區(qū)包含SEQIDNO:2所示的氨基酸序列。
13.權(quán)利要求1到5任一項(xiàng)的單克隆抗體或抗體片段，其中重鏈可變區(qū)包含SEQIDNO:4所示的氨基酸序列。
14.權(quán)利要求1到5任一項(xiàng)的單克隆抗體或抗體片段，其中輕鏈可變區(qū)包含SEQIDNO:2所示的氨基酸序列，并且重鏈可變區(qū)包含SEQ ID N0:4所示的氨基酸序列。
15.核酸，其編碼權(quán)利要求1到14任一項(xiàng)的單克隆抗體或抗體片段。
16.載體,其包含權(quán)利要求16的核酸。
17.細(xì)胞,其包含并表達(dá)權(quán)利要求16的載體。
18.藥物組合物，其包含物質(zhì)和藥用可接受的稀釋劑或載體，其中所述物質(zhì)選自(a)權(quán)利要求I到14任一項(xiàng)的單克隆抗體或抗體片段、(b)包含編碼所述單克隆抗體或抗體片段的核酸的核酸分子、(c)包含所述核酸的載體和(d)表達(dá)所述載體的細(xì)胞。
19.一種方法，其用于減少對(duì)象的流感H5N1病毒感染、或降低對(duì)象感染流感H5N1病毒的風(fēng)險(xiǎn)、或抑制一種或更多種流感H5N1病毒毒株或分離物對(duì)對(duì)象的感染、或預(yù)防一種或更多種流感H5N1病毒毒株或分離物的流感感染或疾病，其包括向有需要的對(duì)象施用治療有效量的物質(zhì)，所述物質(zhì)選自(a)權(quán)利要求1到14任一項(xiàng)的單克隆抗體或抗體片段、(b)包含編碼所述單克隆抗體或抗體片段的核酸的核酸分子、(c)包含所述核酸的載體和(d)表達(dá)所述載體的細(xì)胞。
20.權(quán)利要求19的方法，其中所述對(duì)象是免疫受損的、是嬰兒、是幼兒或是老人。
21.權(quán)利要求19的方法，其中所述施用提供治療益處。
22.權(quán)利要求21的方法，其中所述治療益處包括(a)抑制流感病毒滴度的增加，(b)降低流感病毒滴度，(C)抑制流感病毒復(fù)制的增加，(d)降低流感病毒復(fù)制，(e)抑制流感病毒增殖的增加或降低流感病毒增殖，(f)降低對(duì)象中與流感病毒感染相關(guān)的一種或更多種癥狀或并發(fā)癥的進(jìn)展、嚴(yán)重性、頻率、持續(xù)時(shí)間或概率，或(g)促進(jìn)對(duì)象從流感病毒感染的康復(fù)。
23.權(quán)利要求22的方法，其中所述癥狀或并發(fā)癥選自惡寒、發(fā)燒、咳嗽、喉嚨痛、鼻充血、竇充血、鼻感染、竇感染、體痛、頭痛、疲勞、肺炎、支氣管炎、耳感染、耳痛和死亡。
全文摘要
本發(fā)明涉及特異于流感H5血凝素主要中和表位的鼠單克隆抗體4C2或者嵌合或人源化單克隆抗體，以及其活性片段。本發(fā)明還涉及使用所述鼠或者嵌合或人源化單克隆抗體或其片段預(yù)防和治療H5N1流感的方法和組合物。
文檔編號(hào)A61P31/16GK103180341SQ201080069750
公開(kāi)日2013年6月26日 申請(qǐng)日期2010年8月23日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月23日
發(fā)明者P·木根, F·和, H-S·J·康 申請(qǐng)人:淡馬錫生命科學(xué)研究院有限公司