專利名稱：用作干細(xì)胞標(biāo)記的Tctex-1調(diào)控序列區(qū)的制作方法
用作干細(xì)胞標(biāo)記的Tctex-1調(diào)控序列區(qū)交叉引用相關(guān)申請(qǐng)本申請(qǐng)要求對(duì)以下美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)的優(yōu)先權(quán)2009年9月18日申請(qǐng)的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)61/243，841，此申請(qǐng)?jiān)诖巳膮⒖疾⑷?。關(guān)于聯(lián)邦資助的研究或開發(fā)的說明
本發(fā)明根據(jù)由國(guó)家衛(wèi)生研究院(National Institutes of Health)授予的合同EYl 1307得到政府資助，政府對(duì)于本發(fā)明擁有一定權(quán)利。
背景技術(shù)：
本披露的ー個(gè)方面涉及神經(jīng)前體細(xì)胞特異性的分離的基因調(diào)控序列，以及使用所述調(diào)控序列標(biāo)記、分離和操縱神經(jīng)前體細(xì)胞的方法。中樞神經(jīng)系統(tǒng)的干細(xì)胞研究是腦損傷以及其他人類疾病的創(chuàng)新性療法開發(fā)的重大希望。研究人員對(duì)成人干細(xì)胞興趣濃厚，因?yàn)檫@不存在由胚胎干細(xì)胞引起的倫理問題。成人干細(xì)胞研究的最終目標(biāo)之ー是更好地理解這些細(xì)胞的功能，使得科學(xué)家能夠開發(fā)出在損傷的腦部直接操縱這些細(xì)胞的方法。在海馬體的齒狀回區(qū)(DG)，新的神經(jīng)元在我們一生中持續(xù)不斷地從顆粒細(xì)胞下層(subgranular zone,SGZ)的固定干細(xì)胞/前體細(xì)胞中產(chǎn)生(Altman and Das, 1965 ；Cameronet al. , 1993 ；Eriksson et al. , 1998 ；Kornack and Rakic, 1999)。成人生成的顆粒神經(jīng)元與周圍其他顆粒神經(jīng)元在形態(tài)、突觸連接和電生理學(xué)特性上沒有分別(Cameron et al.,1993 ；Hastings and Gould, 1999 ；Markakis and Gage, 1999 ；van Praag et al. ,2002)。因此，這些成人生成的細(xì)胞似乎參與了學(xué)習(xí)和記憶的功能。根據(jù)形態(tài)的不同和表達(dá)的分子標(biāo)記，可以在成人的SGZ中分出至少三類部分重疊的細(xì)胞群(Ehninger and Kempermann, 2008 ；Zhao et al. ,2008)。I 類前體細(xì)胞(或神經(jīng)干樣細(xì)胞，B類細(xì)胞(Seri et al.，2001))，是ー種幾乎不分裂的細(xì)胞，通過其表達(dá)的膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)和巢蛋白(Fukuda et al.，2003)，以及其通過高度細(xì)化分支進(jìn)入分子層的放射狀突起(Mignone et al. , 2004),可以鑒別此類細(xì)胞。核轉(zhuǎn)錄蛋白Sox2也被認(rèn)為是大多數(shù)I類細(xì)胞的標(biāo)記(Steiner et al.，2006)。至少有兩類過渡擴(kuò)增前體細(xì)胞。II類細(xì)胞(或D類細(xì)胞(Seri et al. ,2001))是SGZ中增殖性最強(qiáng)的細(xì)胞，有短的水平結(jié)構(gòu)，并表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子Tbr2 (T-box brain gene 2) (Hodge et al. , 2008)和低水平的神經(jīng)系細(xì)胞標(biāo)記，例如雙腎上腺皮質(zhì)激素(DCX)。III類前體細(xì)胞代表神經(jīng)定向的(commited to neuralfate)低増殖性細(xì)胞，并在完成細(xì)胞周期之后成為有絲分裂后的神經(jīng)元。這些細(xì)胞在形態(tài)上變化多樣，并具有垂直定向突起(vertically orientated process),表現(xiàn)出DCX、PSA_NCAM和TuJ I。然而在成人海馬齒狀回中的神經(jīng)干細(xì)胞的身份一直存在爭(zhēng)議(Garcia et al.，2004 ；Palmer et al. , 1997 ；Seaberg and van der Kooy, 2002 ；Seri et al., 2001),主導(dǎo)的觀點(diǎn)認(rèn)為I類前體細(xì)胞是產(chǎn)生過渡擴(kuò)增前體細(xì)胞的主要前體，這些過渡擴(kuò)增前體細(xì)胞隨后分化成星形膠質(zhì)細(xì)胞和顆粒神經(jīng)元(Seri et al. , 2004 ；Seri et al. , 2001) 靶向于調(diào)控序列的選擇已經(jīng)從原理上證明，能夠從成人海馬體中分離到高產(chǎn)量和高純度的神經(jīng)系細(xì)胞特異性前體細(xì)胞。然而，前述的調(diào)控序列的組織特異性較弱。例如，T a -tubulin啟動(dòng)子也是神經(jīng)元的祀標(biāo)；GFAP啟動(dòng)子也是星形膠質(zhì)細(xì)胞的祀標(biāo)。盡管很多研究著重于神經(jīng)干細(xì)胞的特征描述和利用，但是許多研究已經(jīng)表明，處于細(xì)胞周期中的(cycling)II類和III類前體細(xì)胞，而不是I類前體細(xì)胞，對(duì)各種調(diào)控影響有最大的反應(yīng)性(Jessberger et al. ,2005 ；Kempermann et al. , 1998 ；Kronenberg etal.，2003)，因此它們非常有望在研究、開發(fā)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中用于操作和使用。Tctex-I (或DYNLTl (Pfister et al. , 2005))之前被認(rèn)為是細(xì)胞質(zhì)動(dòng)カ蛋白(Kinget al. ,1996)的輕鏈，最近發(fā)現(xiàn)，它在成人齒狀回區(qū)(DG)的干樣細(xì)胞和處于細(xì)胞周期中的前體細(xì)胞中選擇性富集，但是不在成熟的顆粒細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞中富集(Chuanget al.,2001 ；Dedesma et al. , 2006)。通過原位雜交,證實(shí)了 Tctex-1在SGZ中富集的表達(dá)類型， 表明Tctex-I的表達(dá)主要在轉(zhuǎn)錄水平受到調(diào)節(jié)。本申請(qǐng)披露了在成人海馬區(qū)和Tctex-I GFP報(bào)告小鼠的齒狀前體細(xì)胞中引導(dǎo)(Specifying)Tctex-I表達(dá)的基因組序列，Tctex-I GFP報(bào)告小鼠中的成人海馬干樣細(xì)胞和前體細(xì)胞帶有基因標(biāo)記。本披露還涉及在神經(jīng)前體細(xì)胞中引導(dǎo)Tctex-I表達(dá)的基因組序列。本披露進(jìn)ー步涉及Tctex-I-GFP報(bào)告基因的構(gòu)建體以及神經(jīng)前體細(xì)胞和干細(xì)胞被標(biāo)記的小鼠。發(fā)明概述本披露涉及在神經(jīng)前體細(xì)胞中，包括在I類、II類和III類前體細(xì)胞中，具有轉(zhuǎn)錄活性的分離的Tctex-I的調(diào)控序列。本披露還涉及ー種方法，通過將置于前述調(diào)控序列控制下的效應(yīng)序列導(dǎo)入細(xì)胞群，從而在前述的細(xì)胞群中選擇性地表達(dá)目標(biāo)核酸，所述效應(yīng)序列可以是siRNA,反義分子，microRNA,適配子或者是編碼目標(biāo)效應(yīng)蛋白的序列。本披露還涉及一種標(biāo)記所述細(xì)胞的方法，通過將置于所述調(diào)控序列控制下的標(biāo)記導(dǎo)入細(xì)胞群，以選擇性地獲得神經(jīng)前體細(xì)胞。本披露也涉及從腦部獲得的這類細(xì)胞群的內(nèi)容和性質(zhì)。另外，本披露涉及評(píng)估細(xì)胞群中神經(jīng)前體細(xì)胞和干細(xì)胞水平變化的方法，通過將置于所述調(diào)控序列控制下的標(biāo)記導(dǎo)入所述細(xì)胞群，并測(cè)量在不同條件下所述標(biāo)記的空間和時(shí)間變化。在某個(gè)實(shí)施方式中，所述不同的條件是神經(jīng)疾病和正常對(duì)照。附圖簡(jiǎn)述圖I :鑒定Tctex-I基因的調(diào)控元件，其以發(fā)育的新生大腦皮質(zhì)的VZ/SVZ為特異性靶標(biāo)。(A)小鼠TCTEX-I基因示意圖(上圖)和編碼融合3’端與Tctex-I的前五個(gè)殘基的GFP的P/E-Tctex-1 GFP報(bào)告基因結(jié)構(gòu)示意圖(下圖)。外顯子用框表示；內(nèi)含子用水平線表示；堿基I由外顯子I的第一個(gè)核苷酸開始；ATG :啟動(dòng)密碼子；pA :兔P球蛋白聚腺嘌呤，來源于PCAG載體。(B)用P/E-Tctex-1 :GFP (綠色)和pCAG_HcRed (紅色)共轉(zhuǎn)染后的皮質(zhì)切片的共聚焦圖象。點(diǎn)劃線表示腦室邊界。箭形指向放射狀神經(jīng)膠質(zhì)纖維，其末梢與腦室和軟膜表面相連接。標(biāo)尺=IOy m。圖2 :共定位研究表明，P/E-Tctex-1 GFP靶向于發(fā)育的新生大腦皮質(zhì)中的放射狀神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和中間前體細(xì)胞的混合物。P/E-Tctex-1 :GFP轉(zhuǎn)染的皮質(zhì)切片用Pax6 (A)，Tbr2(B)或Tbrl(C)共同標(biāo)記的共聚焦圖象。插圖是框區(qū)域的放大圖。尺度=20i!m;4 u m(插圖)圖3 :啟動(dòng)子活性譜測(cè)定表明，P/E-Tctex-1 GFP靶向于發(fā)育的新生大腦皮質(zhì)中的放射狀神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和中間前體細(xì)胞的混合物。顯示了從經(jīng)P/E-Tctex-1 :GFP和P/GLAST DsRed共轉(zhuǎn)染(A)或P/E-Tctex-1 :GFP和P/T a-I :DsRed共轉(zhuǎn)染(B)的腦部得到的皮質(zhì)切片。用P/E-Tctex-1 :DsRed和E/nestin :hGFP構(gòu)建體共同電穿孔的皮質(zhì)切片顯示,表達(dá)GFP和DsRed的細(xì)胞群幾乎完全重疊(C)。尺度=20 ii m ;4 ii m(插圖)圖4 :成體小鼠(小鼠品系4)腦部的P/E-Tctex-1 :GFP細(xì)胞的表達(dá)模式。表達(dá)GFP的細(xì)胞在DG(A)和側(cè)腦室(B)中的分布模式。(C-F)顯示了在第三腦室的表達(dá)GFP的細(xì)胞具有內(nèi)源性Tctex-I (紅色)的標(biāo)記。(G，H)在成人SGZ中的三重標(biāo)記GFP，Sox2 (紅色，G，H)和GFAP (青色，G)或巢蛋白(青色，H)。GFP+細(xì)胞通常對(duì)Sox2 (箭形，G，H)有免疫反應(yīng)。GFP+細(xì)胞突起對(duì)GFAP (箭頭，G)或巢蛋白(箭頭，H)呈陽性。(I)GFP，Tctex-I (紅色)和巢蛋白(青色)的三重標(biāo)記顯示內(nèi)源性的Tctex-I位于nestin+/GFP+突起(箭頭)和GFP+細(xì)胞體(箭形)。(J)共聚焦圖象顯示，Ki67標(biāo)記的SGZ細(xì)胞不表達(dá)Tctex-1 :GFP。標(biāo)尺50ym(A) ；20 u m(B, C, J), 5 u m(G, H) ; IOum (I)。圖5 :表達(dá)轉(zhuǎn)基因P/E-Tctex-1 GFP的細(xì)胞在顯示成體神經(jīng)發(fā)生的大腦區(qū)域富集， 這些細(xì)胞同時(shí)表達(dá)內(nèi)源性Tctex-I (小鼠品系17)。顯示了在表達(dá)P/E-Tctex-1 GFP的轉(zhuǎn)基因小鼠中，DG(A),側(cè)腦室(B)和第三腦室(C)的表達(dá)GFP的細(xì)胞分布模式。放大圖顯示在DG(D-G)和第三腦室區(qū)(H-J)的Tctex-I (紅色)和GFP(綠色)共標(biāo)記。許多Tctex-I+的SGZ細(xì)胞有不規(guī)則的細(xì)胞核和水平導(dǎo)向表現(xiàn)(箭形)。標(biāo)尺=20 u m0圖6 :表達(dá)Tctex-I-GFP轉(zhuǎn)基因的細(xì)胞是增殖的有絲分裂SGZ細(xì)胞(小鼠品系17)。從攜帶P/E-Tctex-1 GFP的轉(zhuǎn)基因小鼠得到的成體DG切片，用GFP和NeuN(A)，Ki67(B，C)，I-h(BrdU) (D)共同標(biāo)記得到的共聚焦圖象。插圖顯示Tctex-I-GFP與NeuN+信號(hào)是互相排斥的(A)。然而Tctex-1 =GFP的SGZ細(xì)胞卻經(jīng)常表現(xiàn)出Ki67+或BrdU+(箭形，B，D)。也顯示了一個(gè)處于分裂期的Ki67+/TcteX-l GFP+細(xì)胞(箭頭，C ;藍(lán)色DAPI)。比例尺=20 y m ;4 y m(摘圖)。圖7 :表示了 II類和III類過渡擴(kuò)增前體細(xì)胞的成體SGZ Tctex-I-GFP細(xì)胞。從P/E-Tctex-1 :GFP 小鼠得到的成體 DG 切片用 Tbr2 (A)，DCX(B), GFAP(C)或 Nestin (D)共同標(biāo)記得到的共聚焦圖象。插圖顯示了兩組放大圖片。(A)中的箭形顯示所有的Tbr2+細(xì)胞都是Tctex-1 GFP+0 (B)中的箭形、空箭形和箭頭分別指Tctex-1 :GFP+/DCX, Tctex-I GFP-/DCX+和Tctex-1 GFP+/DCX細(xì)胞群。(C)中的箭形顯示GFAP+突起經(jīng)常與Tctex-I GFP+細(xì)胞相鄰。但是，Tctex-1 :GFP細(xì)胞不表達(dá)GFAP。(D)中的箭形顯示Tctex-1 :GFP+細(xì)胞偶爾被巢蛋白標(biāo)記的纖維包圍。標(biāo)尺=50 u m ；5 u m(插圖)圖8 :示意圖，顯示了成體SGZ中特異性標(biāo)記和報(bào)告基因表達(dá)的估算時(shí)間軸。圖9(本申請(qǐng)中顯示為圖9A-C):合成構(gòu)建體的核苷酸序列，包括小鼠Tctex-I調(diào)控序列的核苷酸序列和編碼修飾的綠色熒光蛋白的核苷酸序列(SEQ ID NO 6) 在5’端的6個(gè)核苷酸和3’端的6個(gè)核苷酸是內(nèi)切核酸酶的限制性位點(diǎn)。核苷酸序列5’-GGGGATCCACCGGTCGCCACC-3’ (SEQ ID NO 7)是一段接合序列。還列出了修飾的綠色熒光蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO 8)

圖10 (本申請(qǐng)中顯示為圖10A-C):人類Tctex-I調(diào)控序列的核苷酸序列與一段部分編碼人類Tctex-I的核苷酸序列可操作地連接(SEQ ID NO :9)。還列出了兩段人類Tctex-I片段的氨基酸序列(SEQ ID NO :10和11)。發(fā)明詳述
在以下的描述中，引用了作為本申請(qǐng)一部分的附圖，其通過例舉的方式來展示可以使用和采用的具體實(shí)施方式
。詳細(xì)描述了這些實(shí)施方式，以使本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠?qū)嵤┍景l(fā)明。應(yīng)理解，也可以使用其他實(shí)施方式，可以做出結(jié)構(gòu)和邏輯的改變但仍然在本發(fā)明的范圍以內(nèi)。因此，對(duì)示例實(shí)施方式的下列描述不應(yīng)認(rèn)為具有限制作用，本發(fā)明的范圍由所附的權(quán)利要求所界定。定義為方便起見，說明書中的特定的術(shù)語羅列于此。這些定義應(yīng)適用于本申請(qǐng)的整個(gè)內(nèi)容，并且作為本領(lǐng)域技術(shù)人員來理 解。冠詞“一”和“一個(gè)”在本申請(qǐng)中指代一個(gè)或者超過ー個(gè)的語法上的對(duì)象。例如，“ー個(gè)元件”表示一個(gè)元件或者超過ー個(gè)的元件。術(shù)語“氨基酸” g在包括所有天然和人工合成的分子，包括同時(shí)有氨基官能團(tuán)和酸官能團(tuán)并且能夠形成天然氨基酸聚合物的分子。示例的氨基酸包括天然氨基酸；其類似物、衍生物和同類物；有不同側(cè)鏈的氨基酸類似物和前述項(xiàng)目的所有立體異構(gòu)體?！叭诤系鞍住被颉叭诤隙嚯摹敝傅氖潜绢I(lǐng)域已知的嵌合蛋白，并可以通過本領(lǐng)域已知的方法制備。在許多融合蛋白的例子中，有兩種不同的多肽序列，在一定情況下，可以會(huì)有更多。這些連接的序列可以在表達(dá)框內(nèi)。融合蛋白可以包含一個(gè)結(jié)構(gòu)域，其存在于表達(dá)所述第一種蛋白的某種生物體中(雖然在不同蛋白中)，或者它可以由不同種類的生物體表達(dá)的“種間”、“基因間”等融合。在多種實(shí)施方式中，融合多肽可以包含與第一多肽相連接的一種或者多種氨基酸序列。在第一多肽與超過ー種氨基酸序列融合的情況下，融合序列可以存在同樣序列的多個(gè)拷貝，或者，也可以是不同的氨基酸序列。融合多肽可以與第一個(gè)多肽的N端、或者C端、或者同時(shí)與N端和C端融合。示例的融合蛋白包括，含有谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶標(biāo)簽(GST-tag)、組氨酸標(biāo)簽(His-tag)、免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域、免疫球蛋白結(jié)合的結(jié)構(gòu)域、或熒光蛋白的多肽。術(shù)語“分離的多肽”指的是ー種多肽，在一些實(shí)施方式中，其由重組的、合成來源、或其組合來源的DNA或RNA所制備，所述多肽(I)與它在自然界中正常存在時(shí)所關(guān)聯(lián)的蛋白不在一起，(2)與它正常存在的細(xì)胞相分離，(3)基本上與同樣細(xì)胞來源的其他蛋白相分離，⑷由不同物種的細(xì)胞表達(dá)，或(5)不存在于自然界中。術(shù)語“分離的核酸”指的是ー種多核苷酸，其來源于基因組、cDNA、或人工合成、或其組合，所述核酸(I)與它在自然界中正常存在時(shí)所關(guān)聯(lián)的多核苷酸不在一起，(2)所述多核苷酸的核酸序列可操作地連接于其他多核苷酸的核苷酸序列，條件是這兩段序列在自然界中沒有可操作地相連接。術(shù)語“哺乳動(dòng)物”在本領(lǐng)域已知，示例的哺乳動(dòng)物包括人類、靈長(zhǎng)類、牛科(例如，奶牛)、豬、犬科(例如，狗)、貓科(例如，貓)和嚙齒類(例如，小鼠和大鼠)。術(shù)語“標(biāo)記”在本領(lǐng)域已知，在本申請(qǐng)中是指核酸序列，不是指在細(xì)胞染色體上通常包含內(nèi)含子的DNA序列，那在本領(lǐng)域通常用術(shù)語“基因”來表示。這里，術(shù)語“標(biāo)記”是指任何編碼蛋白、多肽或者核酸的DNA序列，條件是所述編碼的蛋白、多肽、或核酸的存在能夠被檢測(cè)或測(cè)量。本領(lǐng)域公知，標(biāo)記所編碼的蛋白、多肽或核酸也能夠被例如抗體等的試劑所識(shí)別。術(shù)語“調(diào)節(jié)”當(dāng)用于功能特性、生物活性或者生物反應(yīng)過程(例如，酶活性或者受體結(jié)合)時(shí)，是指上調(diào)(例如，活化或者刺激)、下調(diào)(例如，抑制或者阻遏)的能力，或者改變所述功能特性，生物活性或者生物反應(yīng)過程的質(zhì)和量的能力。術(shù)語“調(diào)節(jié)因子”指的是具有調(diào)節(jié)能力的多肽、核酸、大分子、復(fù)合物、分子、小分子、化合物、物種等(天然或非天然)，或是從生物物質(zhì)例如細(xì)菌細(xì)胞、植物細(xì)胞或組織、真菌細(xì)胞、動(dòng)物細(xì)胞或組織中制備的具有調(diào)節(jié)能力的提取物?？梢酝ㄟ^實(shí)驗(yàn)，評(píng)估調(diào)節(jié)因子作為功能特性、生物活性或生物過程或其組合的(直接或間接)抑制劑或激活劑的潛在活性(例如，作為激動(dòng)劑、部分拮抗劑、部分激動(dòng)劑、反向激動(dòng)劑、拮抗劑、抗菌劑、抑制微生物感染或者増殖的抑制劑等)。在這些實(shí)驗(yàn)中，可以同時(shí)篩選許多調(diào)節(jié)因子。調(diào)節(jié)因子的活性可以是已知的、未知的或者部分已知的。術(shù)語“神經(jīng)的”指的是中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)。神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞的實(shí)例包括，神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的實(shí)例包括，中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)中的少突膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞。術(shù)語“神經(jīng)疾病、紊亂或病癥”指的是，神經(jīng)系統(tǒng)功能、結(jié)構(gòu)或者兩者的失調(diào)，歸因 于比如在發(fā)育中的遺傳或者胚胎缺陷，或例如毒藥、外傷或神經(jīng)疾病等外在因素。例如，ネ申經(jīng)系統(tǒng)紊亂包括，但不限干，中風(fēng)(急性和慢性)、脊髄損傷、腦或脊髄外傷、腦和脊髄外傷、多發(fā)性硬化、肌萎縮側(cè)索硬化癥、陣發(fā)紊亂(例如，癲癇)，自主神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙(例如，動(dòng)脈性高血壓)、運(yùn)動(dòng)紊亂(例如，活動(dòng)過多癥)，運(yùn)動(dòng)障礙例如休息性震顫，基底神經(jīng)節(jié)活動(dòng)過多癥(例如，亨廷頓舞蹈癥和偏側(cè)投擲癥)，神經(jīng)精神紊亂(例如，狂躁癥，精神病，強(qiáng)迫癥和成癮，阿爾茨海默病，帕金森病)，下丘腦紊亂例如，高乳酸血癥，顱咽管瘤，促性腺缺陷，生長(zhǎng)激素缺乏，加壓素缺乏，催乳素瘤，肥胖，神經(jīng)性源痛綜合癥，肢體疼痛癥，腓骨肌萎縮癥，糖尿病性神經(jīng)病變，神經(jīng)壓迫綜合癥，神經(jīng)痛，神經(jīng)肌肉接頭疾病，POEMS綜合征，視神經(jīng)損傷疾病(例如，青光眼)，嗅覺紊亂例如嗅覺喪失，嗅覺衰退，嗅覺過敏和嗅覺學(xué)習(xí)和記憶受損和各種視網(wǎng)膜變性疾病(例如，色素性視網(wǎng)膜炎、黃斑變性)。術(shù)語“神經(jīng)疾病、紊亂或病癥”也指在發(fā)育的任何階段與神經(jīng)發(fā)生缺乏或過度、或神經(jīng)突生長(zhǎng)缺乏或過度有關(guān)的疾病、紊亂或者病癥，包括學(xué)習(xí)障礙和其他例如癡呆、創(chuàng)傷后神經(jīng)緊張性障礙、和包括焦慮和抑郁在內(nèi)的情緒失調(diào)。術(shù)語“神經(jīng)突”指的是神經(jīng)元向外生長(zhǎng)的任何過程。這里的術(shù)語神經(jīng)突包括從神經(jīng)元向外生長(zhǎng)的所有的細(xì)胞突起(包括軸突和樹突)。術(shù)語“神經(jīng)突生長(zhǎng)”指的是細(xì)胞從神經(jīng)元向外生長(zhǎng)的過程，或者指細(xì)胞群，其中的單個(gè)細(xì)胞突起構(gòu)成了神經(jīng)元向外生長(zhǎng)的過程。術(shù)語“核酸”指的是核苷酸的聚合形式，可以是核糖核苷酸、脫氧核苷酸或者任一種核苷酸的修飾形式。該術(shù)語應(yīng)該理解為包括由核苷酸類似物得到的RNA或DNA的類似物。在一些實(shí)施方式中，核酸的核苷酸序列可以是目標(biāo)基因的正義或反義序列。在一些實(shí)施方式中，第一核酸與第二核酸可以形成雙鏈結(jié)構(gòu)，其中第二核酸與第一核酸有至少部分互補(bǔ)序列。在一些實(shí)施方式中，在核苷酸序列中有一部分與另一部分至少部分互補(bǔ)的單個(gè)核酸也可以形成雙鏈結(jié)構(gòu)。術(shù)語“可操作地連接干”，當(dāng)在說明兩個(gè)核苷酸序列之間的關(guān)系時(shí)，指的是ー種鄰近的位置關(guān)系，其中所述核苷酸序列之間的關(guān)系使得它們能夠以預(yù)期的方式產(chǎn)生功能。例如，“可操作地連接于”編碼序列的操控序列是位于鄰近的位置，使得在操控序列容許的條件下，如當(dāng)適當(dāng)?shù)姆肿?例如，誘導(dǎo)物和聚合酶)與操控或調(diào)控序列結(jié)合時(shí)，能夠?qū)崿F(xiàn)編碼序列的表達(dá)?！盎颊摺薄ⅰ皩?duì)象”或“宿主” g在包括人類和非人類的動(dòng)物。非人類的動(dòng)物包括所有的脊椎動(dòng)物，例如哺乳動(dòng)物和非哺乳動(dòng)物，例如非人類的靈長(zhǎng)類、羊、狗、貓、牛、馬、雞、大象和爬行動(dòng)物，但哺乳動(dòng)物更為優(yōu)選，例如非人類的靈長(zhǎng)類、羊、狗、貓、牛和馬?！盎颊摺薄ⅰ皩?duì)象”或“宿主”也可以是家畜動(dòng)物，例如牛、豬、羊、家禽和馬，或家養(yǎng)動(dòng)物，例如狗和貓?！盎颊摺?、“對(duì)象”或“宿主”可以是雄性或者雌性，可以是老年，可以是成年、青少年、兒童或者嬰Ao術(shù)語“幼年”指的是嬰兒、兒童、青少年、或介于出生和神經(jīng)系統(tǒng)成熟之間的任何生物體。人類“患者”或“對(duì)象”可以是高加索人，或非洲人、亞洲人、閃族人，或其他種族或所述種族背景的混合。優(yōu)選的“患者”或“對(duì)象”包括患有本發(fā)明所述神經(jīng)疾病、病癥或者紊亂或者處于這些疾病風(fēng)險(xiǎn)的人。短語“藥學(xué)上可接受”，用于藥物組合物時(shí)，指的是成分和劑量都在醫(yī)學(xué)評(píng)判標(biāo)準(zhǔn) 之內(nèi)的藥物成分，適用于人和動(dòng)物的組織，且沒有過度的毒性、刺激、過敏反應(yīng)或其他問題或并發(fā)癥，具有適當(dāng)?shù)囊嫣?風(fēng)險(xiǎn)比。短語“藥學(xué)上可接受的載劑”，指的是藥學(xué)上可接受的物質(zhì)、成分或者載劑，例如液體或固體填料、稀釋劑、賦形劑、溶液或包封材料，其參與將任何補(bǔ)充劑或組合物或其中的組分從身體的ー個(gè)器官或部分向身體的另ー個(gè)器官或部分運(yùn)輸。術(shù)語“藥學(xué)上可接受的載齊U”指的是能夠“接受”的載劑，其意義是能與其他藥物成分兼容并且對(duì)其接受者無害?？梢杂米鳌八帉W(xué)上可接受的載劑”的實(shí)例包括(I)糖，例如乳糖、葡萄糖和蔗糖；(2)淀粉，例如玉米淀粉和馬鈴薯淀粉；(3)纖維素及其衍生物，例如羧甲基纖維素鈉，こ基纖維素和醋酸纖維素；⑷西黃蓍膠粉；(5)麥芽；(6)明膠；(7)滑石；⑶輔藥，例如可可脂和栓劑蠟類；(9)油脂,例如花生油,棉花油,紅花油,芝麻油,橄欖油,玉米油和大豆油；(10) ニ醇類，例如丙二醇；(11)多元醇，例如甘油，山梨糖醇，甘露糖醇和聚こ二醇；(12)酯類，例如油酸こ酯和十二酸こ酯；(13)瓊脂；(14)緩沖劑，例如氫氧化鎂和氫氧化鋁；(15)海藻酸；(16)無熱原水;(17)等滲鹽水；(18)林格氏溶液；(19)こ醇；(20)磷酸鹽緩沖液；和(21)藥物制劑中其他的無毒性相容性物質(zhì)。 術(shù)語“多肽”、“蛋白”和“肽”在這里可以互相交換使用。術(shù)語“多肽”指的是氨基酸殘基的聚合物。示例的多肽包括基因產(chǎn)物、天然蛋白、前述物質(zhì)的同系物、直系物、旁系物、片段和其他等價(jià)物、變體和類似物。術(shù)語“多肽片段”或“片段”，當(dāng)用于參比多肽時(shí)，指的是這樣一種多肽，其與參比多肽本身相比缺少氨基酸殘基，但是其具有的氨基酸序列通常與參比多肽中處于對(duì)應(yīng)位置的氨基酸序列相同。就參比多肽而言，所述缺失可以在參比多肽的氨基末端、或羧基末端、或兩端都有。片段通常長(zhǎng)為至少5、6、8或10個(gè)氨基酸、至少14個(gè)氨基酸，至少20、30、40或50個(gè)氨基酸，至少75個(gè)氨基酸、或者至少100、150、200、300、500或更多個(gè)氨基酸。片段可以保留參比多肽的ー種或者更多生物活性。進(jìn)ー步地，片段可以包含特定區(qū)域的亞片段，所述亞片段保留了其來源區(qū)域的功能。術(shù)語“前體”，當(dāng)用于ー種細(xì)胞時(shí)，是指未完全分化的細(xì)胞。在身體正常細(xì)胞損耗以及組織損傷的情況下，會(huì)發(fā)生前體細(xì)胞的分化。前體細(xì)胞能夠處于不同的分化階段，可以是單能的、多潛能的、多功能的，或可以無限分裂。披露的前體細(xì)胞包括肌肉中的衛(wèi)星細(xì)胞、成血管細(xì)胞或上皮前體細(xì)胞(EP)等等。也披露了中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)干樣細(xì)胞和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的過渡擴(kuò)增前體細(xì)胞，所述神經(jīng)干樣細(xì)胞很少分裂，并具有復(fù)雜的結(jié)構(gòu)；所述過渡擴(kuò)增前體細(xì)胞更易于增殖，并在形態(tài)上更加多祥。在某些實(shí)施方式中，前體細(xì)胞是分化較少，是“干細(xì)胞樣的”和/或多潛能的，很難在原位與干細(xì)胞區(qū)分開來。術(shù)語“純化的”，當(dāng)用于目標(biāo)物質(zhì)時(shí)，指的是所述目標(biāo)物質(zhì)在制備物中處于主導(dǎo)地位(例如，該物質(zhì)在制備物中的摩爾數(shù)比其他物質(zhì)的大)?！凹兓某煞帧笔侵俯`種制備物，其中目標(biāo)物質(zhì)(在摩爾數(shù)上)至少是存在的其他所有物質(zhì)的50%。在測(cè)定溶液或分散體系中目標(biāo)物質(zhì)的純度時(shí)，用于溶解或分散物質(zhì)的溶劑或基質(zhì)通常不包括在所述測(cè)定中；反之，只考慮溶解或分散的物質(zhì)(包括目標(biāo)物質(zhì))。一般地，純化的成分含有一種物質(zhì)，其占組合物中存在的所有物質(zhì)的約80%以上，或占存在的所有物質(zhì)的超過85%、90%、95%、99%甚至更高。目標(biāo)物質(zhì)能被純化至基本上為同質(zhì)物(即，傳統(tǒng)檢測(cè)方法無法檢測(cè)出組合物中的雜質(zhì))，其中組合物基本上只含有一種物質(zhì)。技術(shù)人員可利用本披露中蛋白純化的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來純化本披露中的蛋白?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的許多方法來檢測(cè)多肽的純度，例如通過氨基末端的氨基酸序列分析、凝膠電泳和質(zhì)譜分析。 術(shù)語“選擇性”指的是亞群中的活性。例如，目標(biāo)蛋白的“選擇性表達(dá)”指的是目標(biāo)蛋白被細(xì)胞群中的某個(gè)細(xì)胞亞群表達(dá)。術(shù)語“重組蛋白”或“重組多肽”指的是通過重組DNA技術(shù)得到的多肽。這樣的技術(shù)的實(shí)例包括，向合適的表達(dá)載體中插入編碼表達(dá)蛋白的DNA序列，并將所述載體用于轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞以產(chǎn)生所述DNA編碼的蛋白或多肽。術(shù)語“調(diào)控序列”是ー個(gè)在說明書中通篇使用的概括性術(shù)語，指的是例如起始信號(hào)、增強(qiáng)子、操縱子和啟動(dòng)子等多核苷酸序列，需要或優(yōu)選通過所述多核苷酸序列，來影響與之可操作地連接的編碼或非編碼序列的表達(dá)。Goeddel ；Gene Expression Technology Methods in Enzymology, Academic Press, San Diego, CA(1990)中描述了不例的調(diào)控序列，包括，例如SV40的早期和晩期啟動(dòng)子、腺病毒或巨細(xì)胞病毒立即早期啟動(dòng)子、Iac系統(tǒng)、trp系統(tǒng)、TAC或TRC系統(tǒng)、通過17 RNA聚合酶直接表達(dá)的17啟動(dòng)子、lambda噬菌體的主操縱子和啟動(dòng)區(qū)、fd包被蛋白的調(diào)控區(qū)，3-磷酸甘油酯激酶或其他糖酵解酶的啟動(dòng)子、酸性磷酸酶的啟動(dòng)子，例如，Pho5、酵母a交配因子的啟動(dòng)子、桿狀病毒群的多面體啟動(dòng)子和其他已知的控制原核和真核細(xì)胞及其病毒基因表達(dá)的序列及其各種組合。調(diào)控序列的特性和適應(yīng)性因宿主生物而異。在原核生物中，所述調(diào)控序列通常包括啟動(dòng)子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄終止序列。術(shù)語“調(diào)控序列”狹義上包括影響表達(dá)的組件，也包括有益的添加組件，例如，前導(dǎo)序列和融合伴侶序列。在一些實(shí)施方式中，在需要表達(dá)的細(xì)胞類型中，多核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄是在啟動(dòng)子(或其他調(diào)控序列)的控制下進(jìn)行的?？梢岳斫?，控制多核苷酸的調(diào)控序列也可以是與控制天然形式的所述多核苷酸表達(dá)相同或者不同的調(diào)控序列。在某個(gè)實(shí)施方式中，調(diào)控序列是具有一段Tctex-I調(diào)控序列的核苷酸序列的分離的核酸。術(shù)語“序列同源性”指的是兩段核苷酸序列之間的堿基匹配比例或兩段氨基酸序列之間的氨基酸匹配比例。當(dāng)序列同源性用百分比來表示時(shí)，例如，50%，所述百分比表示一段序列的一部分與另一段序列的一部分匹配的比例。可以引入空缺(兩段中的任意序列)以使匹配度最大化；通常采用15個(gè)堿基或更少的空缺，更通常地6個(gè)堿基或更少的空缺，最通常地2個(gè)堿基或更少的空缺。術(shù)語“序列同一性”是指比較窗口中相同的序列。術(shù)語“序列同一性百分比”是通過將在比較窗ロ中兩條被優(yōu)化比對(duì)的序列進(jìn)行比較來計(jì)算，確定兩個(gè)序列中均出現(xiàn)相同氨基酸的位點(diǎn)數(shù)，以得到匹配位點(diǎn)數(shù)，用匹配位點(diǎn)數(shù)除以在比較窗口中總的位點(diǎn)數(shù)，然后將結(jié)果乘以100，得到序列同一性百分比。計(jì)算序列同一性的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知，井下面進(jìn)ー步詳細(xì)說明。短語“全身給藥”，“進(jìn)行全身給藥”，“外周給藥”和“進(jìn)行外周給藥”的意思是，對(duì)患者、對(duì)象或宿主給予物質(zhì)、補(bǔ)充劑、組合物、治療劑或其他物質(zhì)，而不是直接對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)給藥，因此這些物質(zhì)會(huì)受到代謝和其他類似過程的影響。在某個(gè)實(shí)施方式中，給藥方式是皮下給藥。 術(shù)語“Tctex-1”是“t-復(fù)合物相關(guān)的睪丸表達(dá)物I”或“T-復(fù)合物睪丸特異性蛋白I”的縮寫。這兩個(gè)術(shù)語對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說可以相互交換使用。本領(lǐng)域技術(shù)人員還使用其他術(shù)語用以指代人類Tctex-I蛋白，包括“CAG33212”、“TCTEL1”、“AAB03318”和“CW-lp”。所述術(shù)語包括在2007年I月11日公開的，PCT國(guó)際公開號(hào)W0/2007/005733中描述的突變Tctex-I蛋白，此公開文本在此全文參考并入。術(shù)語“治療有效劑量”指的是當(dāng)對(duì)需要治療的患者或者對(duì)象給藥時(shí)，足以產(chǎn)生有效治療效果的調(diào)節(jié)劑、藥物或者其他分子的量。治療有效劑量會(huì)因?yàn)閷?duì)象和治療的病情、患者或?qū)ο蟮捏w重和年齡、病情嚴(yán)重程度、給藥方式等的不同而不同，這可以由本領(lǐng)域普通人員很容易地判斷。術(shù)語“治療”在這里g在包括治愈和改善病癥或疾病的至少ー種癥狀。術(shù)語“載體”指的是ー種核酸，其能夠轉(zhuǎn)移與之相連接的核酸。在某個(gè)實(shí)施方式中，載體是一種游離體，即具有染色體外復(fù)制能力的核酸。其他披露的載體包括能夠自主復(fù)制并表達(dá)與之相連接的核酸的載體。在本申請(qǐng)中，將能夠引導(dǎo)與之可操作地連接的基因表達(dá)的載體叫做“表達(dá)載體”。通常，重組DNA技術(shù)中的表達(dá)載體通常是“質(zhì)粒”的形式，質(zhì)粒指的是，在載體形態(tài)下與染色體不相連的環(huán)狀雙鏈DNA分子。感染性表達(dá)載體，例如重組桿狀病毒，用于在培養(yǎng)的細(xì)胞中表達(dá)蛋白。其他感染性表達(dá)載體，例如重組腺病毒和疫苗病毒，用作疫苗，以在被免疫者中表達(dá)外來抗原。然而，本發(fā)明g在包括其他形式的表達(dá)載體，它們具有同等的功能，并在之后為本領(lǐng)域所知。除非特別說明，所有表示成分和反應(yīng)條件的量等等的數(shù)字在所有情況下都理解為被術(shù)語“大約”所修飾。因此，除非有相反的說明，否則精確的數(shù)字參數(shù)可以隨個(gè)別實(shí)施方式而變化。在成人腦部的未成熟區(qū)域，Tctex-I免疫反應(yīng)性在增殖性神經(jīng)前體細(xì)胞和干細(xì)胞中選擇性地富集，但不在成熟的神經(jīng)元中富集。本申請(qǐng)公開了 Tctex-I基因的調(diào)控區(qū)，其特征在于能夠引導(dǎo)轉(zhuǎn)基因表達(dá)，所述轉(zhuǎn)基因表達(dá)重現(xiàn)了內(nèi)源性Tctex-I在空間與時(shí)間上的表達(dá)類型。在某些實(shí)施方式中，Tctex-I調(diào)控序列的長(zhǎng)度是約lkbp、約2kbp、約3kbp、約4kbp、5kbp、約 6kbp、約 7kbp、約 8kbp、約 9kbp、約 IOkbp、約 I lkbp、約 12kbp、約 13kbp、約 14kbp和約15kbp。在某些實(shí)施方式中，Tctex-I調(diào)控序列的長(zhǎng)度是約6kbp到約IOkbp。在某些實(shí)施方式中，Tctex-I調(diào)控序列的長(zhǎng)度是約9kbp到約I lkbp、約8kbp到約12kbp、約7kbp到約13kbp、約6kbp到約14kbp和約5kbp到約15kbp。在一些實(shí)施方式中，Tctex-I調(diào)控序列的長(zhǎng)度是約5kbp到約7kbp,約4kbp到約8kbp,約3kbp到約9kbp,約2kbp到約IOkbp和約Ikbp到約I lkbp。
將綠色熒光蛋白(GFP)報(bào)告基因置于小鼠Tctex-I的控制之下，其含有6kb的5’上游序列、2kb的內(nèi)含子I和0.2kb的內(nèi)含子2。當(dāng)通過子宮內(nèi)電穿孔向小鼠新生大腦皮質(zhì)遞送吋，這個(gè)構(gòu)建體特異性地在nestin+/PaX6+/GLAST+放射狀膠質(zhì)細(xì)胞和Tbr2+中間前體細(xì)胞中靶向表達(dá)。對(duì)在同一個(gè)調(diào)控元件的控制下表達(dá)GFP轉(zhuǎn)基因的小鼠進(jìn)行鑒定，表明GFP的表達(dá)忠實(shí)于內(nèi)源性Tctex-I在成人腦部齒狀回顆粒下層(SGZ)、側(cè)腦室的腦室區(qū)/室下區(qū)和第三腦室的室管膜層的表達(dá)。在四種獨(dú)立的小鼠品系中對(duì)成人SGZ進(jìn)行免疫定位與溴脫氧尿苷摻入的研究，結(jié)果證明，在兩種小鼠品系(4和13)中，Tctex-1 :GFP報(bào)告基因選擇性地標(biāo)記nestin+/Pax6+/GLAST+神經(jīng)干樣細(xì)胞。在另兩種小鼠品系(17和18)中，Tctex-1 =GFP選擇性地在II類和III類過渡擴(kuò)增前體細(xì)胞和ー小類初期神經(jīng)元子代中表達(dá)。P/E-Tctex-1報(bào)告小鼠的研究獨(dú)立地證實(shí)了，Tctex-I在成體SGZ干細(xì)胞/前體細(xì)胞中的特異性富集。此外，這些研究表明類似的轉(zhuǎn)錄程序可以用于調(diào)控胚胎大腦皮層和成體海馬體中的神經(jīng)發(fā)生。Tctex-I基因組序列引導(dǎo)GFP報(bào)告基因在發(fā)育的新生大腦皮質(zhì)的神經(jīng)干細(xì)胞和前體細(xì)胞中特異性表達(dá)
近期的報(bào)告表明，類似的轉(zhuǎn)錄程序可以在成人SGZ和胚胎大腦皮層中控制神經(jīng)生成(Hodge et al.，2008)。因此，在Tctex-I基因組區(qū)域中尋找一段能夠引導(dǎo)在成人SGZ選擇性表達(dá)的序列，使用了新生大腦皮質(zhì)作為表達(dá)模型系統(tǒng)，因?yàn)镮UE模型能夠?qū)?bào)告基因迅速遞送至新生大腦皮質(zhì)(Saito and Nakatsuji, 2001 ；Tabata and Nakajima, 2001)。依據(jù)不同物種Tctex-I基因的比對(duì)，設(shè)計(jì)并生成了ー個(gè)GFP報(bào)告基因構(gòu)建體，在此構(gòu)建體中，GFP的cDNA由小鼠Tctex-I的進(jìn)化上保守的約6kb 5’上游區(qū)域、約2kb的內(nèi)含子I和約0. 2kb的內(nèi)含子的2片段驅(qū)動(dòng)，我們稱之為P/E-Tctex-1 GFP(圖1A)P/E-Tctex-1 GFP質(zhì)粒與一個(gè)控制性的報(bào)告質(zhì)粒(CAG啟動(dòng)子引導(dǎo)的HcRed)通過子宮內(nèi)電穿孔(IUE) —起共轉(zhuǎn)染入13. 5日胎齡的小鼠新生大腦皮層。對(duì)轉(zhuǎn)染40小時(shí)之后得到的皮質(zhì)部分進(jìn)行共焦檢測(cè)，結(jié)果證明，大部分具有強(qiáng)紅色熒光的HcRed轉(zhuǎn)染細(xì)胞與有絲分裂后的初期神經(jīng)元相似；它們具有多極分化過程并且遷移進(jìn)入中間區(qū)(IZ)。剰余的在腦室(VZ)和室下區(qū)(SVZ)的HcRed+細(xì)胞顯示很弱的紅色熒光，表明啟動(dòng)子活性減弱(圖1B)。與此相反，含有大多數(shù)表達(dá)GFP的細(xì)胞的細(xì)胞體分散在VZ和SVZ區(qū)(圖1B)。許多這些細(xì)胞都有放射狀膠質(zhì)(RG)細(xì)胞的特征，具有延伸的放射狀突起(extended radialprocesses),其末梢與腦室和軟膜表面相連接(圖1B,箭形)。為進(jìn)ー步鑒定Tctex-I調(diào)控序列靶向作用的細(xì)胞類型，對(duì)幾種轉(zhuǎn)錄因子(例如Pax6，Tbr2，Tbrl)進(jìn)行免疫染色，以標(biāo)記在新生皮質(zhì)發(fā)育的不同階段的細(xì)胞(圖2) ,8x6在RG細(xì)胞中特異性表達(dá)，RG細(xì)胞的細(xì)胞體在VZ中富集(Englund et al. ,2005 ；Gotz et al.，1998)。Tbr2在中間前體細(xì)胞(或過渡擴(kuò)增前體細(xì)胞)中表達(dá)，其主要分布在SVZ (Englundet al. ,2005 ；Hodge et al. , 2008) 之前發(fā)現(xiàn)有絲分裂后的神經(jīng)元表達(dá)Tbrl，該神經(jīng)元主要分布于IZ、底板和骨皮質(zhì)(Englund et al. , 2005 ；Hevner et al. ,2001)。免疫染色的結(jié)果表明76% ±3%和33% ±1%的Tctex-I-GFP+細(xì)胞(3組獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中的300個(gè)細(xì)胞)也分別表達(dá)Pax6和Tbr2，實(shí)際上幾乎沒有Tctex-I-GFP+細(xì)胞是Tbrl+的(圖2)。已證實(shí)，幾種細(xì)胞類型特異性的報(bào)告基因能夠靶向標(biāo)記不同的新生皮質(zhì)細(xì)胞群(Gal et al. ,2006 ；ffang et al.，2007)。例如，T a-I報(bào)告子優(yōu)先靶向中間前體細(xì)胞和有絲分裂后的初期神經(jīng)細(xì)胞(Wang et al.，2000)。GLAST啟動(dòng)子優(yōu)先靶向RG細(xì)胞(Galet al. ,2006) o為了獨(dú)立分析Tctex-I調(diào)控序列靶向的細(xì)胞類型，將pGLAST_DsRed2或PT a -I-DsRed與P/E-Tctex-1 GFP質(zhì)粒通過電穿孔共同導(dǎo)入新生大腦皮質(zhì)，并檢測(cè)同時(shí)表達(dá)GFP和DsRed的細(xì)胞。對(duì)轉(zhuǎn)染40小時(shí)后的腦部切片進(jìn)行共焦顯微檢測(cè)，結(jié)果表明80%±4%和31% ±3%的GFP+細(xì)胞也表達(dá)GLAST-和T a -I-啟動(dòng)子引導(dǎo)的DsRed2(圖3A，B)。最后，已報(bào)道，由巢蛋白(例如E/nestin hGFP)的增強(qiáng)子元件驅(qū)動(dòng)的報(bào)告基因構(gòu)建體能在胚胎大腦中同時(shí)靶向RG和中間前體細(xì)胞(Gal et al.，2006)。在新生大腦皮層中通過電穿孔，共同導(dǎo)入E/nestin hGFP報(bào)告基因構(gòu)建體與含有在P/E-Tctex-1控制下的DsRed基因的報(bào)告基因質(zhì)粒，并且比較它們的表達(dá)方式。轉(zhuǎn)染的大腦皮層切片顯示，幾乎100%的DsRed+細(xì)胞也表達(dá)GFP(圖3C)。啟動(dòng)子分析以及免疫染色研究表明，識(shí)別的Tctex-I調(diào)控序列在新生大腦皮層中的RG細(xì)胞和中間前體細(xì)胞中引導(dǎo)特異性的基因表達(dá)。P/E-Tctex-1 :GFP轉(zhuǎn)基因小鼠的產(chǎn)生與鑒定為了評(píng)估鑒定在新生大腦皮層前體細(xì)胞中引導(dǎo)特異性表達(dá)的Tctex-I的基因片段是否也在成體神經(jīng)干細(xì)胞/前體細(xì)胞中有轉(zhuǎn)錄活性，生成了攜帯P/E-Tctex-1 GFP基因的轉(zhuǎn)基因小鼠。我們一共獲得總共十六個(gè)獨(dú)立品系的該種小鼠。其中，所有四個(gè)原始獨(dú)立品系的測(cè)試小鼠產(chǎn)生了穩(wěn)定表達(dá)轉(zhuǎn)基因的后代。對(duì)所有四個(gè)品系(4，13，17，18)的8周齡小鼠腦部進(jìn)行GFP免疫染色檢測(cè)，結(jié)果顯示，表達(dá)Tctex-1 =GFP的細(xì)胞與表達(dá)內(nèi)源性Tctex-I的細(xì)胞相似，在DG的SGZ (圖4A，圖5AJD-G)和側(cè)腦室(圖4B，圖5B)中富集。另外，在第三腦區(qū)中幾乎所有細(xì)胞都發(fā)現(xiàn)有顯著的GFP信號(hào)(圖4C-F，圖5C，H)，因此確認(rèn)內(nèi)源性Tctex-I的特異性富集(圖C-F，圖5H-J)。然而，DG區(qū)域的深入檢測(cè)表明，這四個(gè)品系的小 鼠分為兩組，DG區(qū)域的GFP+細(xì)胞的鑒定將在以下単獨(dú)描述。P/E-Tctex-1 GFP 主要在 sox2+/nestin+/GFAP+ 干樣 SGZ 細(xì)胞中顯著表達(dá)在兩個(gè)獨(dú)立品系(即品系4和品系13)小鼠中，DG區(qū)域的表達(dá)Tctex-I :GFP的細(xì)胞表現(xiàn)出長(zhǎng)突起(long processes),其在顆粒層放射狀擴(kuò)散并在分子層分支伸展。這些細(xì)胞在形態(tài)上和這部分腦部區(qū)域的神經(jīng)干樣細(xì)胞相似(Mignone et al. ,2004)。事實(shí)上,大量表達(dá)GFP的細(xì)胞呈Sox2陽性(圖4G，H中的箭形)，Sox2是主要與DG區(qū)域神經(jīng)干樣細(xì)胞相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子(Komitova and Eriksson, 2004)。此外，用GFAP (圖4G中的箭頭)和nestin+(圖4H中的箭頭)免疫標(biāo)記GFP+/Sox2+細(xì)胞的放射狀突起。在這些GFP+細(xì)胞的細(xì)胞體和突起中檢測(cè)到內(nèi)源性Tctex-I (圖41)。最后，大多數(shù)SGZ Tctex-I+細(xì)胞是Ki67陰性，Ki67是處于細(xì)胞周期中的細(xì)胞的標(biāo)記(圖4J中的箭頭)。這些結(jié)果共同表明，這兩個(gè)轉(zhuǎn)基因品系的小鼠中，GFP在成體SGZ的Sox2+/GFAP+/nestin+神經(jīng)干樣細(xì)胞中顯著表達(dá)。P/E-Tctex-1 GFP在成體DG區(qū)域中的過渡擴(kuò)增前體細(xì)胞中顯著表達(dá)對(duì)小鼠品系17和18的DG區(qū)域的檢測(cè)顯示，Tctex-1 =GFP+細(xì)胞和NeuN+成熟顆粒神經(jīng)元是互相排斥的(圖6A)。與小鼠品系4和13中的Tctex-1 =GFP細(xì)胞相比，相當(dāng)部分的Tctex-1 :GFP細(xì)胞是Ki67陽性(即品系17和18中分別有48%和42%的Ki67+細(xì)胞也表達(dá)GFP，圖6B，C)。使用BrdU摻入分析方法，鑒定Tctex-1 =GFP+細(xì)胞的增殖能力。在這些實(shí)驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在6小時(shí)內(nèi)連續(xù)接受3次BrdU注射，并且在最后一次注射之后存活I(lǐng)小時(shí)、24小時(shí)或72小時(shí)。大約26±4%的I小時(shí)BrdU摻入細(xì)胞也是Tctex-1 :GFP+;這些細(xì)胞最可能是過渡擴(kuò)增前體細(xì)胞。與此一致，這些細(xì)胞傾向于有切線方向的細(xì)胞體和短的水平結(jié)構(gòu)(圖6D，箭形)。存活時(shí)間延長(zhǎng)使得在總的BrdU+細(xì)胞中的Tctex-1 GFP+/BrdU+細(xì)胞增加(即24小時(shí)收獲組為55±6%和72小時(shí)收獲組為70±3. 3% )，表明在后者的前體細(xì)胞中也表達(dá)Tctex-1 :GFP。使用標(biāo)記II類和III類前體細(xì)胞的抗體進(jìn)行共定位研究，以分析這些小鼠品系中的Tctex-1 GFP SGZ細(xì)胞的身份。細(xì)胞核Tbr2標(biāo)記主要顯示II類前體細(xì)胞和一部分的III類前體細(xì)胞(Hodge et al.，2008)。相反，由DCX衍生的突起的標(biāo)記主要分布在III類前體細(xì)胞和有絲分裂后的初期神經(jīng)元中。在低倍觀察下，在SGZ中，DCX+細(xì)胞在數(shù)量上超過Tctex-1 :GFP+細(xì)胞,后者在數(shù)量上超過Tbr2+細(xì)胞。詳細(xì)的共焦檢測(cè)顯示,基本上所有的Tbr2免疫反應(yīng)細(xì)胞也是Tctex-1 =GFP+(圖7A，箭形)。然而，也存在GFP_/Tbr2_細(xì)胞群(圖7A，箭形)。DCX共定位的研究顯示，檢測(cè)到了所有DCX+/GFP+細(xì)胞(圖7B，箭形)、DCX+/GFP-細(xì)胞(圖7B，空箭形)和DCX-/GFP+細(xì)胞(圖7B，箭頭)三類細(xì)胞群。最后，幾乎沒有表達(dá)GFP的SGZ細(xì)胞對(duì)Sox、巢蛋白或GFAP呈陽性(圖7C，D)。雖然GFAP標(biāo)記的突起與GFP+突起通常極為接近,但其中的大多數(shù)并不重合(coincidental) (圖7C，D)。相似地，巢蛋白標(biāo)記的放射狀突起沒有顯示出可檢測(cè)的GFP+。 在所有測(cè)試的4個(gè)P/E-Tctex-1 GFP小鼠品系中，實(shí)際上沒有GFP+細(xì)胞在DG、SVZ或第三腦區(qū)表達(dá)成熟神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)記NerN(圖5A)。然而，檢測(cè)了這4個(gè)品系小鼠中表達(dá)GFP報(bào)告基因的成體SGZ細(xì)胞，結(jié)果顯示，一組小鼠(即品系4和13)的GFP選擇性標(biāo)記了 I類神經(jīng)干樣細(xì)胞，而另一組小鼠(即品系17和18)帶有GFP標(biāo)記的II類和III類神經(jīng)前體細(xì)胞。本申請(qǐng)公開了表達(dá)Tctex-1 =GFP的細(xì)胞，其代表了 II類和III類前體細(xì)胞。發(fā)育中腦部和成體腦部中的神經(jīng)前體細(xì)胞有類似的基因調(diào)控途徑在某個(gè)實(shí)施方式中，新生大腦皮層和成體SGZ前體細(xì)胞有共同的基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制，這與近期提出的在新生大腦皮質(zhì)和成人DG區(qū)域的轉(zhuǎn)錄因子(例如，Pax6，Tbr2)平行串聯(lián)的概念相一致(Hodge et al.，2008)。在某個(gè)實(shí)施方式中，不同來源或者不同發(fā)育階段的神經(jīng)前體細(xì)胞可以顯示重疊的細(xì)胞特性。雖然轉(zhuǎn)基因小鼠是篩選基因表達(dá)調(diào)控元件的傳統(tǒng)方法，但是卻耗時(shí)、耗カ和耗財(cái)。如果ー種方法能夠?qū)⑥D(zhuǎn)基因方法的優(yōu)勢(shì)和確定性與快速篩選技術(shù)相結(jié)合，那么將能夠使研究人員迅速確定參與目標(biāo)基因空間調(diào)控的DNA區(qū)域。本申請(qǐng)公開了 Tctex-I基因的基因組片段，其在成體大腦中引導(dǎo)報(bào)告基因的表達(dá)。本申請(qǐng)還公開了“組織轉(zhuǎn)染”的方便和快速的方法，用于在幾類視網(wǎng)膜細(xì)胞中對(duì)啟動(dòng)子和增強(qiáng)子進(jìn)行體內(nèi)鑒定。最近提出，第三腦區(qū)是在側(cè)腦室的SGZ和室下區(qū)(SVZ)之外的另ー個(gè)顯示出神經(jīng)活性的位點(diǎn)(Xu et al.，2005)。雖然數(shù)量很少，但是有絲分裂的前體細(xì)胞似乎存在于成體小鼠第三腦區(qū)的室管膜層，這些細(xì)胞能夠分化成神經(jīng)細(xì)胞，其可遷移并融入下丘腦。這部分的神經(jīng)活性很容易受到各種刺激物的上調(diào)(Xu et al. ,2005) o有趣的是，最近顯示，Sox2啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的GFP在第三腦區(qū)室管膜細(xì)胞中富集(Brazel et al.，2005)。我們巧合地觀察到第三腦區(qū)室管膜細(xì)胞有高水平的Tctex-I啟動(dòng)子/增強(qiáng)子的活性和內(nèi)源性Tctex-I，這進(jìn)ー步提示，第三腦區(qū)細(xì)胞可能具有與SGZ和SVZ前體細(xì)胞相似的固有特性；然而，一種尚未探明的抑制子能在正常的生理?xiàng)l件下抑制它們的有絲分裂活性。
引導(dǎo)成體SGZ神經(jīng)前體細(xì)胞的新型調(diào)控元件的鑒定在所有測(cè)試的4個(gè)P/E-Tctex-1 GFP小鼠品系中，實(shí)際上沒有GFP+細(xì)胞在DG、SVZ或第三腦區(qū)表達(dá)成熟神經(jīng)元標(biāo)記NeuN(圖5A)。然而，測(cè)定了這4個(gè)品系小鼠中表達(dá)GFP報(bào)告基因的成體SGZ細(xì)胞，結(jié)果顯示，一組小鼠(即品系4和13)的GFP選擇性標(biāo)記了 I類神經(jīng)干樣細(xì)胞，而另一組小鼠(即品系17和18)具有GFP標(biāo)記的II類和III類神經(jīng)前體細(xì)胞。在品系17和18中，BrdU和共定位研究表明，GFP報(bào)告基因水平在處于細(xì)胞周期的前體細(xì)胞中暫時(shí)較高，但一旦神經(jīng)細(xì)胞分化后即迅速減少。雖然Tctex-1 :GFP和內(nèi)源性Tctex-I在成體SGZ中的分布類型在性質(zhì)上是一致的，但是BrdU的出生標(biāo)記實(shí)驗(yàn)表明，GFP-Tctex-I的表達(dá)與內(nèi)源性Tctex-I相比有輕微的延遲。我們先前的結(jié)果顯示，BrdU標(biāo)記2小時(shí)的II類前體細(xì)胞中，約90%具有內(nèi)源性Tctex-1 (Dedesma et al. ,2006) BrdU 標(biāo)記I小時(shí)的細(xì)胞中，少于30%的細(xì)胞表現(xiàn)出Tctex-1 :GFP。相反，BrdU標(biāo)記72小時(shí)的III類前體細(xì)胞中，較高比例的細(xì)胞表達(dá)Tctex-1 :GFP。在轉(zhuǎn)基因小鼠品系中，觀察到靶向于成體SGZ細(xì)胞的報(bào)告基因的表達(dá)延遲(圖7)。例如，由巢蛋白基因增強(qiáng)子/啟動(dòng)子控制的GFP不僅在I類細(xì)胞(有內(nèi)源性巢蛋白)中有表達(dá)，而且在II類細(xì)胞(沒有內(nèi)源性巢蛋白；Filippov et al. , 2003 ；Steiner et al. , 2006)中也有表達(dá)。DCX啟動(dòng)子引導(dǎo)的DsRed不僅在III類前體細(xì)胞中表達(dá)，而且在NeuN+成熟膠質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞中也表達(dá)(Couillard-Despreset al.，2006)。已經(jīng)分離了ー些在成體神經(jīng)干細(xì)胞/前體細(xì)胞中引導(dǎo)特異性表達(dá)的基因組片段(Couillard-Despres et al. ,2006 ；Filippov et al. , 2003 ；Fukuda et al. , 2003 ；Steineret al.，2006)。不過，分離到靶向于SGZ前體細(xì)胞且具有更高特異性的相對(duì)較小的基因組片段，這為這些細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)操作増加了ー種額外的有用工具。例如，該調(diào)控區(qū)域能夠用于對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行選擇性地功能失活或者功能激活的研究。另外，識(shí)別這些細(xì)胞的工具可以允許直接檢測(cè)這些細(xì)胞在體內(nèi)的發(fā)育情況(即命運(yùn)圖譜分析)。這些研究共同掲示了這些細(xì)胞的善意身份(bona fide identity)、生物特性及操作它們的有效方法。成體干細(xì)胞/神經(jīng)前體細(xì)胞中Tctex-I的潛在功能通過免疫組織學(xué)和原位研究，首先描述了成體SGZ中神經(jīng)干細(xì)胞/前體細(xì)胞中Tctex-I 的選擇性富集(Chuang et al. , 2001 ；Dedesma et al. , 2006)來說明。Tctex-I的調(diào)控區(qū)域引導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因GFP報(bào)告基因具有相似的表達(dá)類型，這獨(dú)立證明了這些細(xì)胞中Tctex-I的特異性富集。已經(jīng)報(bào)道了 Tctex-I的幾種細(xì)胞功能，依賴或不依賴于細(xì)胞質(zhì)動(dòng)力蛋白(Chuang et al. , 2005 ；Machado et al. , 2003 ；Mueller et al. , 2002 ；Nadano etal. , 2002 ；Nagano et al. , 1998 ；Schwarzer et al. , 2002 ；Tai et al. , 1999 ；Tai et al.,2001)。非常有意思的是，Tctex-1與G蛋白信號(hào)2 (AGS2)的活化劑同義，該活化劑與G @亞基結(jié)合，并且參與非典型不依賴于受體的G蛋白信號(hào)途徑(Sachdev et al. , 2007 ；Takesonoet al.，1999)。非典型不依賴于受體的G蛋白信號(hào)途徑在蒼蠅成神經(jīng)細(xì)胞和秀麗線蟲的胚胎的細(xì)胞分裂対稱性中起到關(guān)鍵作用(Gotta et al.，2003 ；Schaefer et al.，2001)，但是還沒有顯示AGS2是哺乳動(dòng)物神經(jīng)干細(xì)胞或前體細(xì)胞的標(biāo)記。最近表明，哺乳動(dòng)物G蛋白信號(hào)3(AGS3)的活化劑(不與Tctex-I同義)在新生大腦皮層發(fā)育中參與神經(jīng)前體細(xì)胞的命運(yùn)決定(Sanada and Tsai,2005)。
腸前體細(xì)胞對(duì)腸前體細(xì)胞的鑒定(Barker et al, 2007)及其在癌癥中的作用(Barker etal. ,2009)在最近引起了不小的興趣。在許多芯片研究中發(fā)現(xiàn)，Tctex-I在腸前體細(xì)胞中富集(Mills et al 2002)，因而這里描述的調(diào)控序列也可用于靶向腸前體細(xì)胞。Tctex-I 調(diào)控序列在某個(gè)實(shí)施方式中，調(diào)控序列的核苷酸序列如SEQ ID NO :1所示，即人類tctex-1調(diào)控序列。在某個(gè)實(shí)施方式中，調(diào)控序列的核苷酸序列如SEQ ID NO :2所示，即小鼠tctex-1調(diào)控序列。
在另ー個(gè)實(shí)施方式中，調(diào)控序列的核苷酸序列如SEQ ID NO :3所示，S卩小鼠tctex-1調(diào)控序列可操作地連接于編碼GFP的核苷酸序列。在另ー個(gè)實(shí)施方式中，調(diào)控序列與如SEQ ID NO :I所示的核苷酸序列或如SEQ IDNO 2所示的核苷酸序列具有至少95%的序列同源度。在另ー個(gè)實(shí)施方式中，調(diào)控序列與如SEQ ID NO :I所示的核苷酸序列或如SEQ IDNO 2所示的核苷酸序列具有至少90%的序列同源度。在另ー個(gè)實(shí)施方式中，調(diào)控序列與如SEQ ID NO :I所示的核苷酸序列或如SEQ IDNO :2所示的核苷酸序列具有至少85%的序列同源度。在另ー個(gè)實(shí)施方式中，調(diào)控序列與如SEQ ID NO :I所示的核苷酸序列或如SEQ ID NO :2所示的核苷酸序列具有至少80%的序列問源度。本申請(qǐng)公開了對(duì)有神經(jīng)疾病、紊亂或病癥的對(duì)象進(jìn)行治療的方法，包括向?qū)ο蠼o藥藥物組合物的步驟，由此治療所述有神經(jīng)疾病、紊亂或病癥的對(duì)象。本申請(qǐng)公開了在細(xì)胞群中的前體細(xì)胞中選擇性地表達(dá)目標(biāo)核酸的方法，所述方法包括將所述目標(biāo)核酸置于Tctex調(diào)控序列的控制之下，所述Tctex調(diào)控序列在所述前體細(xì)胞中選擇性地發(fā)揮功能，以及將置于所述Tctex調(diào)控序列控制下的目標(biāo)核酸導(dǎo)入所述細(xì)胞群，由此在所述細(xì)胞群中的所述前體細(xì)胞中選擇性地表達(dá)所述目標(biāo)核酸。本申請(qǐng)公開了在細(xì)胞群中標(biāo)記前體細(xì)胞的方法，所述方法包括將標(biāo)記基因置于Tctex調(diào)控序列的控制之下，所述Tctex調(diào)控序列在所述前體細(xì)胞中選擇性發(fā)揮功能；將置于Tctex調(diào)控序列控制下的所述標(biāo)記基因?qū)胨黾?xì)胞群，并在所述前體細(xì)胞中使得所述標(biāo)記基因表達(dá)，由此在細(xì)胞群中標(biāo)記所述前體細(xì)胞。本申請(qǐng)公開了從細(xì)胞群中分離標(biāo)記細(xì)胞的方法，所述方法包括將標(biāo)記基因置于Tctex調(diào)控序列的控制之下，所述Tctex調(diào)控序列在所述前體細(xì)胞中選擇性發(fā)揮功能；將置于Tctex調(diào)控序列控制下的所述標(biāo)記基因?qū)胨黾?xì)胞群，并在所述前體細(xì)胞中使得所述標(biāo)記基因表達(dá)，由此標(biāo)記在細(xì)胞群中表達(dá)所述標(biāo)記基因的細(xì)胞；以及從所述細(xì)胞群中分離所述標(biāo)記的細(xì)胞。本申請(qǐng)公開了評(píng)估細(xì)胞群中前體細(xì)胞的活性，所述方法包括將標(biāo)記基因置于Tctex調(diào)控序列的控制之下，所述Tctex調(diào)控序列在所述前體細(xì)胞中選擇性發(fā)揮功能；將置于Tctex調(diào)控序列控制下的所述標(biāo)記基因?qū)胨黾?xì)胞群，并在所述前體細(xì)胞中使得所述標(biāo)記基因表達(dá)，由此評(píng)估細(xì)胞群中前體細(xì)胞的活性。實(shí)用性
研究和開發(fā)分離的Tctex-I調(diào)控序列能以很強(qiáng)的特異性靶向于前體細(xì)胞，為這些細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)操作提供了有用的工具。含有由Tctex-I調(diào)控片段控制的標(biāo)記的細(xì)胞、細(xì)胞系和小鼠提供了獨(dú)特的工具，用于檢測(cè)行為或前體細(xì)胞，包括研究成體和發(fā)育中的神經(jīng)發(fā)生、和研究腸前體細(xì)胞在腸生理和疾病例如癌癥中的作用。首先，它們能夠通過對(duì)GFP+的處于細(xì)胞周期的細(xì)胞進(jìn)行簡(jiǎn)單地評(píng)分，來檢測(cè)不同的實(shí)驗(yàn)試劑和條件對(duì)前體細(xì)胞行為的影響。與[3-H]-胸苷相似，BrdU也能摻入到正在進(jìn)行DNA合成的細(xì)胞的DNA中。 摻入的BrdU能夠被抗BrdU的抗體檢測(cè)。雖然這個(gè)方法很有效，但是也有幾個(gè)缺點(diǎn)有細(xì)胞毒性，毎次細(xì)胞分裂后BrdU被稀釋；和免疫標(biāo)記中需要冗長(zhǎng)的過程。含有由Tctex-I調(diào)控片段控制的標(biāo)記的細(xì)胞、細(xì)胞系和小鼠提供了工具，用于研究外傷、疾病或者衰老如何影響前體細(xì)胞。特別對(duì)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，它們可用于研究腦部微環(huán)境和成體幼芽區(qū)細(xì)胞的増殖和神經(jīng)性能力。對(duì)于腸，它們可用于研究腸隱窩微環(huán)境及其中細(xì)胞的増殖。它們可用于命運(yùn)圖譜分析實(shí)驗(yàn)將含有Tctex-I調(diào)控序列的轉(zhuǎn)基因小鼠與雙重報(bào)告基因的小鼠(例如,Z/EG)雜交，其中Tctex-I調(diào)控序列引導(dǎo)可誘導(dǎo)形式的Cre重組酶的表達(dá)(例如，CreEKT2)，從而在體內(nèi)可追蹤成體產(chǎn)生的細(xì)胞的個(gè)體發(fā)育、壽命和發(fā)育。細(xì)胞和細(xì)胞系可用于體外鑒定，和/或與從其他小鼠分離得到的I類細(xì)胞相比較。與之類似，它們能夠用來對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行選擇性地功能失活或者功能激活的研究。另外，這些研究工具可用于發(fā)現(xiàn)和評(píng)估影響前體細(xì)胞的藥物。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)，這些藥物的適應(yīng)癥可涉及成體神經(jīng)發(fā)生中與年齡、病癥或疾病相關(guān)缺陷的逆轉(zhuǎn)。相反，如果前體細(xì)胞參與了中樞神經(jīng)系統(tǒng)的癌癥，則適應(yīng)性可涉及治療所述癌癥。在腸中，這些藥物的適應(yīng)癥可涉及上皮更新中與年齡、病癥或疾病相關(guān)缺陷的逆轉(zhuǎn)。相反，如果前體細(xì)胞參與了腸癌，包括結(jié)腸癌，則適應(yīng)性可涉及治療所述癌癥。置于Tctex-I調(diào)控序列控制之下的療法Tctex-I調(diào)控序列可用于選擇性地導(dǎo)入ー種分子，以操控前體細(xì)胞的活性，通過將編碼該分子的核酸置于Tctex-I調(diào)控序列的控制下。所述序列能夠編碼具有治療作用的蛋白。能夠影響前體細(xì)胞命運(yùn)的蛋白，例如控制或影響細(xì)胞功能，例如細(xì)胞周期、増殖、神經(jīng)生成、細(xì)胞遷移、細(xì)胞分化、細(xì)胞生長(zhǎng)和指導(dǎo)、細(xì)胞附著、突觸形成和其他功能，這樣的蛋白被稱為“目標(biāo)蛋白”。目標(biāo)蛋白樣品在表A中羅列。置于Tctex-I調(diào)控序列控制之下的分子也可以編碼siRNA、microRNA、反義分子或適配子。這樣的核酸分子被稱為效應(yīng)核酸。本申請(qǐng)公開的目標(biāo)效應(yīng)核酸是siRNA、microRNA.反義分子或適配子，其被置于Tctex-I調(diào)控序列的控制下，這些效應(yīng)核酸的產(chǎn)物能夠抑制目標(biāo)蛋白的轉(zhuǎn)錄或者翻譯，或者調(diào)節(jié)目標(biāo)蛋白的功能。效應(yīng)核酸的產(chǎn)物能夠用來下調(diào)或者上調(diào)神經(jīng)生成的水平或腸上皮更新的水平。目標(biāo)效應(yīng)核酸可以是置于Tctex-I調(diào)控序列控制之下的一段序列，該序列編碼效應(yīng)蛋白并調(diào)節(jié)目標(biāo)蛋白的功能。效應(yīng)蛋白可用于下調(diào)或者上調(diào)神經(jīng)生成或腸上皮更新。目標(biāo)蛋白樣品(表A)神經(jīng)生成階段膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP);巢蛋白；T-box腦部基因2蛋白(Tbr_2蛋白)；雙腎上腺皮質(zhì)激素(CDX);唾液酸神經(jīng)細(xì)胞附著分子(PSA-NCAM);青色熒光蛋白(CFP) ;Ho/rac鳥嘌呤交換因子(GEF) 2 (Lf c);維生素；性別決定區(qū)Y_box2 (S0X-2);腦部脂肪酸結(jié)合蛋白(BFABP);普洛斯彼羅相關(guān)同源框I(Prox-I) ; P III微管蛋白；神經(jīng)細(xì)胞核(neuN);鈣結(jié)合蛋白；睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(CNTF)。細(xì)胞增通:PEgf、Fgf2、I13、Nrpl、Ptn、Vegfa.Alk、Bail、Cxcll、Ndn、Notch2、0dzl.Ache、Cdk5rl> Cdk5rapl> Cdk5rap3> Erbb2、Mdk、Ndph> S100a6、SlOOb0細(xì)胞周期基因Apbbl>Inhba、Mill、Notch2、Apbbl> Inhba、Ep300、Fgf2> Hdac4、Hdac7、Mdk、Ndn, Pard6b、S100a6、SlOOb0細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性與細(xì)胞遷移調(diào)控Flna、Ntnl、Pafahlbl、Pard6b、Slit2、Stat3、Vegfa。細(xì)胞分化調(diào)控Cdk5rI、Cdk5rap I、Cdk5rap2、Cdk5rap3、Ywhah、Dl 11、Notch2、Shh、AsclK Hdac4、Hdac7、Inhba、Mdk、Ncoa6、Neurodl> Nog、Nrcam、Nrgl> Pax5、Pax6。生長(zhǎng)因子與細(xì)胞因子Artn、Bdnf、Bmpl5>Bmp2> Bmp4> Bmp8b> CxclI、GpiI、Egf、 Fgf 13> Fgf2> Gdnf、113、Inhba、Mdk、Ndph, Nrgl> Ptn、S100a6、Vegfa. Bmpl5、Bmp2> Bmp4>Bmp8b、CxclK Gpil> 113, Inhba、Mdk、Ptn。突觸功能相關(guān)基因Apoe、Grinl、SlOOb、Ywhah>Chrm2、Dlg4、Drd2、Drd5、Grinl、Nptxl、Ache、Nrcam、Pou4f 10細(xì)胞凋亡Gdnf、Notch2、Sema4d、Adoral、Apoe>Inhba、Notch2、SlOOb, Adora2a>Ep300、Ntnl、Pax3、Rtn4、Vegfa、Ywhah。細(xì)胞附著RoboI、Ache、Bai I、Dl 11、Efnb I、Fez I、Nrcam、Nrp I、Nrp 2 > Pard3、Rac I、Sema4d、Slit2、Tnr0神經(jīng)生成相關(guān)細(xì)胞信號(hào)基因D111、Notch2、Dvl3、Adoral、Adora2a、Bail、Chrm2、Cxcll> Drd2> Drd5> GnaoI > Ncoa6、Notch2?；蚱渌绢I(lǐng)域已知的基因，包括2007年I月11日公開的W0/2007/005733中突變的Tctex-I基因，此文件在此全文參考并入。分離的細(xì)胞群本申請(qǐng)公開了使用任何本申請(qǐng)說明的或者本領(lǐng)域已知的標(biāo)記方法，來分離Tctex-I標(biāo)記的細(xì)胞的方法。Tctex-I基因在哺乳動(dòng)物中高度保守(人和小鼠之間為2/133的堿基變化)。還公開了收獲tctex-1-GFP標(biāo)記的神經(jīng)前體細(xì)胞的方法，包括用于神經(jīng)移植的細(xì)胞。例如，在帕金森癥中，存在進(jìn)行性的神經(jīng)細(xì)胞損失，特別是影響黑質(zhì)紋狀體的多巴胺能神經(jīng)元。胎兒多巴胺前體細(xì)胞的移植能夠改善患者的臨床癥狀。用Tctex-I調(diào)控序列分離的細(xì)胞群可以用于減輕本申請(qǐng)所述的疾病、病癥和紊亂的臨床癥狀。神經(jīng)生成由于不愿受到任何特定理論的束縛，以下只是關(guān)于神經(jīng)生成的一種觀點(diǎn)；然而，其他有效的理論可以并且會(huì)存在。神經(jīng)發(fā)育在原腸胚細(xì)胞形成過程中，細(xì)胞遷移進(jìn)入胚胎內(nèi)部，形成三個(gè)胚層-內(nèi)胚層(最內(nèi)部層)、中胚層和外胚層(表面層)一所有的組織和器官都從中生成。簡(jiǎn)單地說，外胚層生成皮膚和神經(jīng)系統(tǒng)，中胚層生成內(nèi)臟而內(nèi)胚層生成其他器官。在所有的脊椎動(dòng)物中，在原腸胚形成之后就是神經(jīng)胚形成，從胚胎的外胚層中形成神經(jīng)管。在原腸胚形成后，從中胚層中形成脊索一一種沿胚胎背部延伸的有彈性的桿狀體。脊索向上面覆蓋的外胚層發(fā)出信號(hào)，誘導(dǎo)其成為神經(jīng)外胚層。這最后使得沿著胎兒的背部形成一條神經(jīng)干細(xì)胞條帯。這條帶稱為神經(jīng)板，是整個(gè)神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)源。神經(jīng)板在懷孕第三周向外折疊形成神經(jīng)槽。從未來的頸部區(qū)域開始，神經(jīng)槽的折疊逐漸形成神經(jīng)管。神經(jīng)管的前部叫做基板；后部叫做翼板。中間叫做神經(jīng)椎板。在懷孕第四周后，神經(jīng)管(神經(jīng)孔)的開放末端封閉。在第四周后期，神經(jīng)管的上級(jí)結(jié)構(gòu)在未來的中腦區(qū)一中腦ー彎曲。在中腦上方是前腦(將來的前腦)，下方是菱腦(將來的后腦)。胚胎神經(jīng)管細(xì)胞有三層腦室區(qū)，之后稱為室管膜，在神經(jīng)管的中央管區(qū)；中間區(qū)，由腦室區(qū)的分生細(xì)胞產(chǎn)生(包括早期放射狀膠質(zhì)細(xì)胞類型)，并在腦室區(qū)表面和外層(軟膜)之間延伸；以及外邊緣區(qū)，由中間區(qū)的神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生。中間區(qū)，或套層，増加細(xì)胞構(gòu)成并通過神經(jīng)生成和前體細(xì)胞分化而變成灰質(zhì)。腦室區(qū)和室下區(qū)通過神經(jīng)生成和前體細(xì)胞分化也成熟。邊緣區(qū)的神經(jīng)細(xì)胞和其他細(xì)胞突起都變成有鞘膜的白質(zhì)。
神經(jīng)遷移是神經(jīng)元從它們的起源或者生成地向它們?cè)谀X部的最終位置遷移的方法。有幾種遷移的方法，例如放射狀遷移和切線遷移。神經(jīng)前體細(xì)胞在新生大腦皮層的腦室區(qū)増殖。第一批有絲分裂后的細(xì)胞遷移形成前板，其最終定向?yàn)樾纬蒀ajal-Retzius細(xì)胞和底板神經(jīng)元。這通過神經(jīng)元體細(xì)胞的遷移來實(shí)現(xiàn)。放射狀神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的纖維作為細(xì)胞遷移的骨架，能夠自身分裂，或轉(zhuǎn)定位到皮質(zhì)層板并分化成星形膠質(zhì)細(xì)胞或神經(jīng)細(xì)胞。神經(jīng)元體細(xì)胞遷移能夠在發(fā)育的任何時(shí)間發(fā)生。后繼批次的神經(jīng)元通過沿著放射狀膠質(zhì)纖維遷移，將前板分割形成皮質(zhì)板。每個(gè)批次的遷移細(xì)胞以由內(nèi)而外的方式通過前面的細(xì)胞層，這意味著最新的神經(jīng)元最靠近表層。成體神經(jīng)生成從出生之后到貫穿整個(gè)成年期間，新的神經(jīng)元持續(xù)在腦部的兩個(gè)主要區(qū)域生成I)在側(cè)腦室邊緣(lining)的腦室區(qū)(SVZ),其中新細(xì)胞通過側(cè)遷移流遷往嗅球。室下區(qū)(SGZ)，其為海馬區(qū)齒狀回的部分區(qū)域。許多在SGZ的新細(xì)胞在出生后不久就死亡，但他們當(dāng)中的一部分從功能上融入到周圍的海馬區(qū)腦組織中。有證據(jù)表明成人神經(jīng)生成也可以在腦部的其他區(qū)域例如大腦皮層、小腦和下腦丘中發(fā)生。成體SGZ神經(jīng)生成的階段根據(jù)各自不同的形態(tài)和特異性分子標(biāo)記的表達(dá)，鑒定了至少三種部分重疊的SGZ細(xì)胞群(Ehninger and Kempermann, 2008) ； (Duan et al. , 2008 ；Zhao et al. , 2008) 這在圖7中有示意說明。I類前體細(xì)胞(或神經(jīng)干樣細(xì)胞，B類細(xì)胞(Seri et al.，2001))，是ー種幾乎不分裂的細(xì)胞，通過其表達(dá)的膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)和巢蛋白(Fukuda et al.，2003)，以及其通過高度細(xì)化的分支進(jìn)入分子層的放射狀突起(Mignone et al. , 2004),可以鑒別此類細(xì)胞。也認(rèn)為核轉(zhuǎn)錄蛋白Sox2是大多數(shù)I類細(xì)胞的標(biāo)記(Steiner et al. , 2006)。至少有兩類GFP-/Nestin-的過渡擴(kuò)增前體細(xì)胞11類SGZ前體細(xì)胞有短的水平結(jié)構(gòu)，并表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子Tbr2 (T-box brain gene 2) (Hodge et al. , 2008)和低水平的神經(jīng)系細(xì)胞標(biāo)記，例如雙腎上腺皮質(zhì)激素(DCX)和唾液酸神經(jīng)細(xì)胞附著分子(PSA-NCAM)。III類前體細(xì)胞代表神經(jīng)定向的細(xì)胞，并在它們過渡成為有絲分裂后的神經(jīng)元期間，這些細(xì)胞具有垂直的突起，并選擇性表達(dá)神經(jīng)DCX、PSA-NCAM和Tull。在這個(gè)腦部區(qū)域的細(xì)胞周期中的前體細(xì)胞(即II類和III類細(xì)胞)是操控的完美靶標(biāo)，因?yàn)樗鼈冊(cè)隗w內(nèi)對(duì)多種調(diào)控影響有強(qiáng)烈反應(yīng)的能力(Kempermann et al. , 1998 ；Kronenberg et al. , 2003) 成體SVZ神經(jīng)生成的階段與齒狀回中成體神經(jīng)生成相反，腦室區(qū)生成的細(xì)胞要向其目標(biāo)位置，嗅球，遷移較長(zhǎng)的距離。這段長(zhǎng)距離遷移使得嗅覺神經(jīng)生成的時(shí)間跨度不同于齒狀回神經(jīng)生成遷移(2-6天)新生的細(xì)胞沿著側(cè)遷移流(RMS)呈鏈狀遷移，側(cè)遷移流是ー種由特定的星形膠質(zhì)細(xì)胞維持的結(jié)構(gòu)。在新生的神經(jīng)元到達(dá)OB中間之后，它們從鏈狀結(jié)構(gòu)上脫離，并呈放射狀遷移。神經(jīng)細(xì)胞分化(15-30天)在未成熟的神經(jīng)細(xì)胞達(dá)到OB之后，開始分化為兩種不同的局部中間神經(jīng)細(xì)胞類型。超過95%分化為氨基丁酸能(GABA)的顆粒神經(jīng)細(xì)胞，另外的成為球旁神經(jīng)細(xì)胞，其表達(dá)作為神經(jīng)遞質(zhì)的GABA或多巴胺?？梢詫⑿律w粒細(xì)胞分為不會(huì)穿越僧帽狀細(xì)胞層的樹突狀細(xì)胞和其他達(dá)到外部叢狀細(xì)胞層的無樹突的細(xì)胞。整合進(jìn)入神經(jīng) 網(wǎng)絡(luò)(15-30天)新生顆粒細(xì)胞和球旁神經(jīng)元整合進(jìn)入OB網(wǎng)絡(luò)并且對(duì)嗅覺刺激做出反應(yīng)。幼年的神經(jīng)生成幼年發(fā)育階段對(duì)神經(jīng)成熟，尤其是大腦皮質(zhì)和大腦邊緣部位，和行為成熟，尤其是復(fù)雜的學(xué)習(xí)能力例如社交技能很重要。幼年發(fā)育的特征也在于激素和生長(zhǎng)因子的顯著變化。在這高度可塑的發(fā)展階段中，重要的神經(jīng)化學(xué)和神經(jīng)解剖學(xué)重構(gòu)能形成神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)和行為特征，并維持到成年期。多個(gè)使用幼年嚙齒動(dòng)物模型的研究顯示，在青春期早期，軸突和樹突過量產(chǎn)生，并在之后的青少年期內(nèi)快速減少，這可能導(dǎo)致腦部的成熟和進(jìn)入成年期。在幼年期后，在前腦、齒狀回和脊椎海馬體的神經(jīng)生成大量減少(He and Crews 2007)。在幼年大腦的高水平的神經(jīng)生成可以反映出成熟過程中的高水平的神經(jīng)可塑性。
實(shí)施例實(shí)施例I :質(zhì)粒和轉(zhuǎn)基因小鼠的廣生從Dr. Connie Cepko (Harvard)處獲得了 由雞 actin-CMV (CAG)啟動(dòng)子引導(dǎo)的 HcRecL 從 Dr. Neeta Roy(Weill Medical College)處獲得了 的 E/neatin :hGFP(Roy et al. , 2000a ；Roy et al. , 2000b ；ffang et al.,2000) 從 Dr. NicholasGaiano (Johns Hopkins University School of Medicine)處獲得了 pGLAST_DsRed2 和pTa -l-DsRed2 (Ever and Gaiano，2005)。為了產(chǎn)生 P/E-Tctex-1 :GFP 和 P/E-Tctex-1 :DsRed的報(bào)告構(gòu)建體，從小鼠Tctex-I的細(xì)菌人工染色體重疊片段中提取(cloneRP23-122p23, CHORE) 一段 EcoRl 片段(跨越 Tctex-I 基因組序列的-5873NT 到 2861NT)。在NT155和NT165之間的序列被GFP和DsRed編碼序列替代(圖1A)。最后，一段約9. 5kb片段，其含有完整的Tctex-I調(diào)控區(qū)域和以上構(gòu)建子中的報(bào)告基因，被轉(zhuǎn)入并插入pCAGIG載體(從from Connie Cepko (Matsuda and Cepko, 2004)獲得)的骨架來產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因P/E-Tctex-I GFP(圖 1A)和 P/E-Tctex-1 =DsRed0為生成轉(zhuǎn)基因小鼠，通過膠回收，從P/E-Tctex-1 :GFP構(gòu)建體中獲得約IOkb的SfoI/StuI 片段，并用于原核轉(zhuǎn)染(Hogan et al.，1986)。將 DNA 注入由 C57BL/6JxCBA/J的Fl代小鼠交配后獲得的F2代受精卵中。通過基因組Southern blot分析和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，使用識(shí)別 GFP 的引物(5，-GAGGAGCTGITCACCGGGGTG-3’ (SEQ ID NO 4)和5’-GTGGITGTCGGGCAGCAGCAC-3’ (SEQ ID NO :5))，發(fā)現(xiàn) 47 個(gè)存活的小鼠中有 16 個(gè)被確定為轉(zhuǎn)基因陽性。在實(shí)驗(yàn)中使用兩個(gè)獨(dú)立品系的成年動(dòng)物(13和17)。通過與CDl小鼠配種，繁殖各品系。所有的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方法均得到威爾康奈爾醫(yī)學(xué)院的動(dòng)物保護(hù)和利用委員會(huì)的批準(zhǔn)。實(shí)施例2:抗體我們使用的ー抗(Abs)是NeuN (免疫原從小鼠腦部純化的細(xì)胞核，純化的小鼠 IgGLl 400，貨號(hào) MAB377，Chemicon, Temecula, CA)，本研究中還使用了 GFAP (免疫原純化的神經(jīng)膠質(zhì)纖維，小鼠克隆G-A-5，I 400，貨號(hào)G3893，Sigma, (Debus et al.，1983))，fcdU(大鼠 IgG2a，克隆 BUI/75 ;貨號(hào) MAS250C，I 200, Harlan Sera-Lab Ltd.,Loughborough, United Kingdom ;免疫原BrdU-牛血清白蛋白結(jié)合物，小鼠IgGl,克隆BMC9318，貨號(hào) 1170376，I 200, Roche Applied Science，Indianapolis，IN)，雙腎上腺皮質(zhì)激素(DCX)(免疫原人類DCX的C末端，山羊IgG，貨號(hào)sc-8066，I 500，Santa CruzBiotechnologies, Santa Cruz, CA), Sox2 (兔 Ab, I : 100, Stem Cell Tech),和巢蛋白(免 疫原多聚甲醒固定的15天的大鼠胚胎脊髓,純化小鼠IgGl,克隆大鼠401 (Hockfield andMcKay, 1985)，I 1，000，貨號(hào) 556309，BD Pharmingen, San Jose, CA)，DsRed 兔 Ab (免疫原Discosoma sp.紅色突光蛋白，兔多克隆抗體,貨號(hào)632496, Clontech, Mountain View,CA)，GFP兔Ab (免疫原綠色熒光蛋白，兔血清，貨號(hào)A6455，I 1000, Molecular Probes,Eugene，0R)，GFP雞Ab (免疫原綠色熒光蛋白，雞IgY，I 1，000，分類號(hào)abl3970，Abeam, Cambridge, MA), Tbrl,和 Tbr2 兔抗體(I : 1000,兔抗體，由 Dr Robert Hevner贈(zèng)送)(Englund et al.，2005)，Ki67 (免疫原Ki67，兔多克隆抗體，I 1,000，分類號(hào)NCL_Ki67p, Novacostral, Newcastle, UK),和 ax6 小鼠 MAb (免疫原Pax6,純化的小鼠IgGl,I : 200, DevelopmentalStudies Hybridoma Bank, tne University of Iowa, IA)。使用了 Alexa染料共軛(Invitrogen),生物素共軛的第二抗體(Vector),和Cy5共軛的第ニ饑體 UacKson ImmunoResearch, West Grove, PA)。實(shí)施例3 :子宮內(nèi)電穿孔按照此前的描述，實(shí)施子宮內(nèi)電穿孔(IUE) (Saito and Nakatsuji, 2001 ；Tabataand Nakaj ima, 2001)。簡(jiǎn)而言之，⑶I小鼠(懷孕期13. 5天)經(jīng)腹腔注射氯胺酮/甲苯噻嗪混合物麻酔。使用拉長(zhǎng)的毛細(xì)玻璃管(Drummond Scientific),通過子宮向胚胎的革巴向腦部區(qū)域注射無內(nèi)毒素的質(zhì)粒DNA(總體積為Iii I,含有2 ii g單質(zhì)粒,或雙質(zhì)粒各liig)。通常將胚胎沿著前-后軸向平行排列，使用醫(yī)用鉗狀電極，通過子宮對(duì)胚胎傳遞電壓脈沖(37V, 50msec ；BTX Square Wave gene pulser)。實(shí)施例4 :溴脫氧尿苷(BrdU)處理和免疫組織化學(xué)根據(jù)熒光蛋白的表達(dá)確定轉(zhuǎn)染陽性的胚胎腦部，并在40小時(shí)后收獲，在4°C下用含有4%的PFA的0. IM磷酸鹽緩沖液固定。對(duì)于收獲的成體腦部，用4%的PFA灌注動(dòng)物(Chuang et al. ,2001 ；Dedesmaet al. , 2006) 用 Leica 切片機(jī)獲得 40 U m 的冠狀切片(Leica, Nussloch, Germany)。使用之前說明的自由浮動(dòng)方法進(jìn)行免疫染色(Chuang etal.，2001)，但在Tbrl和Tbr2的檢測(cè)中使用了抗原獲得過程(Hevner et al. ,2001)。使用常規(guī)方法進(jìn)行GFP和DsRed免疫標(biāo)記，用于檢測(cè)電穿孔的腦切片中的報(bào)告蛋白。陰性對(duì)照(例如，去除第一抗體)在所有研究中沒有任何特定的信號(hào)。在Leica共聚焦顯微鏡下觀察所有的免疫標(biāo)記樣品。姆個(gè)實(shí)驗(yàn)中至少分析3只小鼠。使用GraphPad Prism 4. Ob軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析(GraphPad Software, Inc)。為進(jìn)行BrdU標(biāo)記，將動(dòng)物注射單劑量的BrdU (100 u g/g體重)。重復(fù)注射3次，每次間隔兩小時(shí)。動(dòng)物在最后一次BrdU給藥之后的I小時(shí)、24小時(shí)和72小時(shí)生存時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行多次灌注。如前所述，進(jìn)行腦部切片、染色和打分(Dedesma et al. , 2006) □參考文獻(xiàn)Altman J，Das GD.1965. Autoradiographic and histological evidence ofpostnatal hippocampal neurogenesis in rats. J Comp Neurol 124 :319-335. Barker N，et al (2007)Identification of stem cells in small intestine andcolon by marker gene Lgr5. 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權(quán)利要求
1.分離的核酸，其特征在于包含Tctex-I啟動(dòng)子的核苷酸序列。
2.如權(quán)利要求I所述的分離的核酸，其中所述核苷酸序列選自SEQID NO :1或SEQ IDNO :2。
3.包含如權(quán)利要求I所述的核酸的載體。
4.如權(quán)利要求3所述的載體，其中所述核酸可操作地連接于標(biāo)記基因。
5.如權(quán)利要求3所述的載體，其中所述核酸可操作地連接于效應(yīng)核酸。
6.如權(quán)利要求3所述的載體，其中所述核酸可操作地連接于編碼目標(biāo)蛋白的核酸。
7.宿主細(xì)胞，其特征在于包含如權(quán)利要求3-6任一所述的載體。
8.含有權(quán)利要求I所述核酸的藥物成分。
9.含有權(quán)利要求3-6任一所述載體的藥物成分。
10.含有權(quán)利要求7所述宿主細(xì)胞的藥物成分。
11.對(duì)有神經(jīng)疾病、紊亂或病癥的對(duì)象進(jìn)行治療的方法，包括向?qū)ο蠼o藥如權(quán)利要求8所述藥物成分的步驟，由此治療所述有神經(jīng)疾病、紊亂或病癥的對(duì)象。
12.對(duì)有神經(jīng)疾病、紊亂或病癥的對(duì)象進(jìn)行治療的方法，包括向?qū)ο蠼o藥如權(quán)利要求9所述藥物成分的步驟，由此治療所述有神經(jīng)疾病、紊亂或病癥的對(duì)象。
13.對(duì)有神經(jīng)疾病、紊亂或病癥的對(duì)象進(jìn)行治療的方法，包括向?qū)ο蠼o藥如權(quán)利要求.10所述藥物成分的步驟，由此治療所述有神經(jīng)疾病、紊亂或病癥的對(duì)象。
14.如權(quán)利要求11所述的方法，其中所述給藥藥物成分的步驟包括鞘內(nèi)給藥所述藥物成分的步驟。
15.含有核酸的試劑盒，其特征在于包括選自SEQID NO :1或SEQ ID NO :2的核苷酸序列。
16.在細(xì)胞群中的前體細(xì)胞中選擇性表達(dá)目標(biāo)核酸的方法，所述方法包括將所述目標(biāo)核酸置于Tctex調(diào)控序列的控制之下，所述Tctex調(diào)控序列在所述前體細(xì)胞中選擇性發(fā)揮功能，以及將置于所述Tctex調(diào)控序列控制下的目標(biāo)核酸導(dǎo)入所述細(xì)胞群，由此在所述細(xì)胞群中的所述前體細(xì)胞中選擇性地表達(dá)所述目標(biāo)核酸。
17.如權(quán)利要求16所述的方法，其中所述調(diào)控序列包含選自SEQID NO :1或SEQ IDNO 2的核苷酸序列。
18.如權(quán)利要求16所述的方法，其中所述導(dǎo)入步驟包括使所述細(xì)胞群與含有所述核酸的病毒接觸。
19.如權(quán)利要求18所述的方法，其中所述病毒是腺病毒。
20.如權(quán)利要求16所述的方法，其中所述導(dǎo)入步驟包括對(duì)所述細(xì)胞群電穿孔。
21.如權(quán)利要求16所述的方法，其中所述導(dǎo)入步驟包括使所述細(xì)胞群與脂質(zhì)體接觸。
22.如權(quán)利要求16所述的方法，其中所述細(xì)胞群選自下組神經(jīng)管細(xì)胞群、脊髄細(xì)胞群或腦部組織細(xì)胞群。
23.如權(quán)利要求18所述的方法，其中所述細(xì)胞群選自下組腦室區(qū)細(xì)胞群、室下區(qū)細(xì)胞群、側(cè)腦室區(qū)細(xì)胞群、齒狀回細(xì)胞群、下腦丘細(xì)胞群、嗅球細(xì)胞群和皮質(zhì)組織細(xì)胞群。
24.如權(quán)利要求16所述的方法，其中所述前體細(xì)胞是神經(jīng)前體細(xì)胞。
25.如權(quán)利要求24所述的方法，其中所述神經(jīng)前體細(xì)胞是I類神經(jīng)前體細(xì)胞，II類神經(jīng)前體細(xì)胞，或者III類神經(jīng)前體細(xì)胞。
26.如權(quán)利要求16所述的方法，其中所述細(xì)胞群包括腸細(xì)胞。
27.如權(quán)利要求16所述的方法，其中所述前體細(xì)胞是腸前體細(xì)胞。
28.如權(quán)利要求16所述的方法，其中所述細(xì)胞群包括胚胎細(xì)胞群、幼年細(xì)胞群或成體細(xì)胞群。
29.如權(quán)利要求16所述的方法，其中所述核酸是效應(yīng)核酸。
30.如權(quán)利要求29所述的方法，其中所述效應(yīng)核酸的產(chǎn)物選自下組siRNA分子、反義分子、microRNA分子和適配子。
31.如權(quán)利要求16所述的方法，其中所述核酸編碼目標(biāo)蛋白。
32.如權(quán)利要求16所述的方法，其中所述核酸是標(biāo)記。
33.在細(xì)胞群中標(biāo)記前體細(xì)胞的方法,所述方法包括 將標(biāo)記基因置于Tctex調(diào)控序列的控制之下，所述Tctex調(diào)控序列在所述前體細(xì)胞中選擇性發(fā)揮功能；將置于Tctex調(diào)控序列控制下的所述標(biāo)記基因?qū)胨黾?xì)胞群，并在所述前體細(xì)胞中使得所述標(biāo)記基因表達(dá)，由此在細(xì)胞群中標(biāo)記所述前體細(xì)胞。
34.從細(xì)胞群中分離標(biāo)記細(xì)胞的方法，所述方法包括 將標(biāo)記基因置于Tctex調(diào)控序列的控制之下，所述Tctex調(diào)控序列在所述前體細(xì)胞中選擇性發(fā)揮功能；將置于Tctex調(diào)控序列控制下的所述標(biāo)記基因?qū)胨黾?xì)胞群，并在所述前體細(xì)胞中使得所述標(biāo)記基因表達(dá)，由此標(biāo)記在細(xì)胞群中表達(dá)所述標(biāo)記基因的細(xì)胞；以及從所述細(xì)胞群中分離所述標(biāo)記的細(xì)胞。
35.如權(quán)利要求33所述的方法，其中所述導(dǎo)入步驟包括使所述細(xì)胞群與病毒接觸。
36.如權(quán)利要求35所述的方法，其中所述病毒是腺病毒。
37.如權(quán)利要求33所述的方法，其中所述導(dǎo)入步驟包括對(duì)所述細(xì)胞群電穿孔。
38.如權(quán)利要求33所述的方法，其中所述導(dǎo)入步驟包括使所述細(xì)胞群與脂質(zhì)體接觸。
39.如權(quán)利要求33所述的方法，其中所述的Tctex-I調(diào)控序列包括選自SEQID N01或SEQ ID NO 2的核苷酸序列。
40.如權(quán)利要求33所述的方法，其中所述細(xì)胞群選自下組神經(jīng)管細(xì)胞群、脊髄細(xì)胞群，或腦細(xì)胞群。
41.如權(quán)利要求40所述的方法，其中腦部組織選自下組腦室區(qū)細(xì)胞群、室下區(qū)細(xì)胞群、側(cè)室區(qū)細(xì)胞群、齒狀回細(xì)胞群、下腦丘細(xì)胞群、嗅球細(xì)胞群和皮層組織細(xì)胞群。
42.如權(quán)利要求33所述的方法，其中所述前體細(xì)胞是神經(jīng)前體細(xì)胞。
43.如權(quán)利要求42所述的方法，其中所述前體細(xì)胞包括I類神經(jīng)前體細(xì)胞，II類神經(jīng)前體細(xì)胞，或者III類神經(jīng)前體細(xì)胞。
44.如權(quán)利要求33所述的方法，其中所述細(xì)胞群包括腸組織。
45.如權(quán)利要求33所述的方法，其中所述前體細(xì)胞是腸前體細(xì)胞。
46.如權(quán)利要求33所述的方法，其中所述細(xì)胞群包括胚胎細(xì)胞群、幼年細(xì)胞群，或成體細(xì)胞群。
47.如權(quán)利要求33所述的方法，其中所述標(biāo)記編碼熒光蛋白。
48.如權(quán)利要求34所述的方法，其中所述分離步驟包括流式細(xì)胞木。
49.前體細(xì)胞的富集制品，其中所述富集制品包括轉(zhuǎn)錄活性的Tctex-I調(diào)控序列區(qū)域。
50.如權(quán)利要求49所述的富集制品，其中所述前體細(xì)胞是神經(jīng)前體細(xì)胞。
51.如權(quán)利要求50所述的富集制品，其中所述神經(jīng)前體細(xì)胞包括I類神經(jīng)前體細(xì)胞，II類神經(jīng)前體細(xì)胞，或者III類神經(jīng)前體細(xì)胞。
52.如權(quán)利要求50所述的富集制品，其中所述前體細(xì)胞是非胚胎腦部神經(jīng)前體細(xì)胞。
53.如權(quán)利要求50所述的富集制品，其中所述前體細(xì)胞分離自下組的組織腦室區(qū)、室下區(qū)、側(cè)室區(qū)、齒狀回、下腦丘、嗅球和皮層組織。
54.如權(quán)利要求50所述的富集制品，其中所述神經(jīng)前體細(xì)胞分離自胚胎細(xì)胞。
55.在細(xì)胞群中分析前體細(xì)胞活性的方法,所述方法包括 將標(biāo)記基因置于Tctex調(diào)控序列的控制之下，所述Tctex調(diào)控序列在所述前體細(xì)胞中選擇性發(fā)揮功能；將置于Tctex調(diào)控序列控制下的標(biāo)記基因?qū)胨黾?xì)胞群，并在所述前體細(xì)胞中使得所述標(biāo)記基因表達(dá)，由此在細(xì)胞群中分析前體細(xì)胞的活性。
56.如權(quán)利要求55所述的方法，其中所述調(diào)控序列包括選自SEQID NO :1或SEQ IDNO 2的核苷酸序列。
57.如權(quán)利要求55所述的方法，還包括羅列的表達(dá)所述標(biāo)記基因的前體細(xì)胞。
58.如權(quán)利要求55所述的方法，還包括定量所述標(biāo)記基因的表達(dá)。
59.如權(quán)利要求55所述的方法，還包括記錄表達(dá)標(biāo)記基因的所述前體細(xì)胞的位置。
60.如權(quán)利要求55所述的方法，還包括在不同的時(shí)間點(diǎn)記錄測(cè)量值。
61.如權(quán)利要求55所述的方法，還包括檢測(cè)超過ー個(gè)的細(xì)胞群。
62.如權(quán)利要求55所述的方法，還包括在所述細(xì)胞群中導(dǎo)入實(shí)驗(yàn)試劑或者對(duì)照試劑。
63.如權(quán)利要求55所述的方法，其中所述標(biāo)記編碼熒光蛋白。
64.如權(quán)利要求55所述的方法,其中所述前體細(xì)胞是神經(jīng)前體細(xì)胞。
65.如權(quán)利要求64所述的方法，還包括評(píng)估神經(jīng)生成的進(jìn)度。
66.如權(quán)利要求64所述的方法，其中所述細(xì)胞群模擬神經(jīng)疾病、紊亂或病癥，并且至少ー個(gè)所述細(xì)胞群是對(duì)照。
67.如權(quán)利要求66所述的方法，其中所述神經(jīng)疾病、紊亂或病癥是神經(jīng)病學(xué)的、神經(jīng)變性的或下腦丘的。
全文摘要
本披露的一個(gè)方面涉及分離的Tctex-1調(diào)控序列，其在成人神經(jīng)前體細(xì)胞和干細(xì)胞中包括I類、II類和III類前體細(xì)胞中，以及在發(fā)育中具有轉(zhuǎn)錄活性。本披露的另一方面涉及在神經(jīng)前體細(xì)胞中選擇性表達(dá)基因序列的方法。在這些細(xì)胞中插入與表達(dá)特定序列能夠用于標(biāo)記、鑒定、分類、跟蹤和操縱神經(jīng)前體細(xì)胞和干細(xì)胞。
文檔編號(hào)A61K48/00GK102791863SQ201080052519
公開日2012年11月21日 申請(qǐng)日期2010年9月20日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月18日
發(fā)明者宋青華, 莊仁正 申請(qǐng)人:康奈爾大學(xué)