專利名稱：：以高效價制備用于疫苗制備的脊髓灰質(zhì)炎病毒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及細胞培養(yǎng)和脊髓灰質(zhì)炎病毒制備的領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及用于培養(yǎng)細胞和由此細胞制備用于制備脊髓灰質(zhì)炎疫苗的脊髓灰質(zhì)炎病毒的改進方法。
背景技術(shù)：
：脊髓灰質(zhì)炎病毒為小RNA病毒科(Picornaviridae)腸道病毒屬(Enterovirus)的成員。脊髓灰質(zhì)炎病毒為小型非包膜病毒，具有封裝單鏈正義RNA基因組的衣殼。脊髓灰質(zhì)炎病毒有三種類型1型、2型和3型。脊髓灰質(zhì)炎病毒引起的易感個體的感染可導致麻痹型脊髓灰質(zhì)炎。脊髓灰質(zhì)炎具有高度傳染性?，F(xiàn)已開發(fā)出兩種不同的脊髓灰質(zhì)炎疫苗，即Mlk的滅活脊髓灰質(zhì)炎病毒疫苗(IPV)和Sabin的活的減毒口服脊髓灰質(zhì)炎病毒疫苗(OPV)。兩種疫苗均是安全且有效的。每一種疫苗具有其特定的優(yōu)點和缺點，且兩種疫苗均在脊髓灰質(zhì)炎的控制中起到重要作用。對于脊髓灰質(zhì)炎病毒和脊髓灰質(zhì)炎疫苗的綜述參見如Kewetal，2005o口服脊髓灰質(zhì)炎疫苗(OPV)便宜且方便，并已被大量使用。然而，臨時接受者會因疫苗中的回復體(revertant)而患上疫苗相關(guān)麻痹型脊髓灰質(zhì)炎(VAPP)。而且，已在未完全免疫的人群中觀察到減毒的Sabin脊髓灰質(zhì)炎病毒株已經(jīng)歷足以引起麻痹病發(fā)作的突變，這種麻痹病在臨床上和流行病學上難以與天然發(fā)生的野生型脊髓灰質(zhì)炎疾病相區(qū)另Ij；這些突變體被稱為循環(huán)的疫苗衍生脊髓灰質(zhì)炎病毒或cVDPV(參見如Kewetal,2005；WrightandModlin，2008；Yakovenkoetal，2009)。越來越多的觀點認為，將滅活脊髓灰質(zhì)炎病毒疫苗(IPV)在與現(xiàn)有OPV策略結(jié)合使用會有助于更快速消滅野生型脊髓灰質(zhì)炎病毒并控制突發(fā)的cVDPV(WrightandModlin，2008John,2009)。然而，IPV的制備更昂貴(參見如John，2009)，且在對脊髓灰質(zhì)炎疫苗仍有很強需求的欠發(fā)達和最不發(fā)達國家中更是高的驚人的昂貴。用于制備可用在疫苗中的大量脊髓灰質(zhì)炎病毒材料，特別是非減毒脊髓灰質(zhì)炎病毒的培養(yǎng)體系很大程度上導致了相對高的成本。因此，本領(lǐng)域仍需要高效的培養(yǎng)體系來制備疫苗中用的脊髓灰質(zhì)炎病毒。脊髓灰質(zhì)炎病毒在HEK293細胞中的增殖已被描述為用于研究脊髓灰質(zhì)炎病毒的神經(jīng)元特異性復制表型的體系，且描述了減毒型脊髓灰質(zhì)炎病毒，如在Sabin株的IRES元件中含點突變的脊髓灰質(zhì)炎病毒，在HEK293細胞中表現(xiàn)出減少的增殖(Campbelletal,2005)。El永生化人胚胎視網(wǎng)膜(HER)細胞，特別是PER.C6細胞已被描述為適用于各種病毒，尤其是流感病毒的增殖(Pauetal，2001；WO01/38362)。雖然WO01/38362描述了各種流感病毒株以及1型和2型單純皰疹病毒(HSV)、麻疹病毒和輪狀病毒在PER.C6細胞中增殖的實例，但是WO01/38362中未例舉脊髓灰質(zhì)炎病毒的增殖。而且，脊髓灰質(zhì)炎病毒在此類細胞中復制的條件也未描述，此條件在不相關(guān)病毒在這些細胞中復制的基礎上是不容易預期的。因此，至今尚不知道是否能夠在產(chǎn)業(yè)規(guī)模上經(jīng)濟地制備脊髓灰質(zhì)炎病毒以用于在這些細胞中制備疫苗的目的。為了大規(guī)模制備滅活脊髓灰質(zhì)炎疫苗，脊髓灰質(zhì)炎病毒通常在源自猴的Vero細胞中增殖。Vero細胞被廣泛用于疫苗制備，包括滅活以及活體減毒脊髓灰質(zhì)炎疫苗，因此至今是被監(jiān)管機構(gòu)最廣泛接受的用于病毒疫苗制備的連續(xù)細胞系，且預期本領(lǐng)域技術(shù)人員會更多將這些細胞用于疫苗制備。Montagnon等在1982和1984年已描述了用于滅活脊髓灰質(zhì)炎病毒疫苗的Vero細胞的大規(guī)模微載體培養(yǎng)。使用Vero細胞大規(guī)模制備脊髓灰質(zhì)炎疫苗的方法和所得疫苗也描述在美國專利4，525，349中。Merten等在1997年描述了在病毒生產(chǎn)期在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)前，當將微載體上的Vero細胞在含血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)時，高效價脊髓灰質(zhì)炎病毒(Sabin1型)制備(幾乎hl09TCID5(l/ml)的條件，但是鑒于使用血清的缺點，這些作者已經(jīng)表明需要完全無血清的方法，且在此優(yōu)化的完全無血清的方法中，這些作者能夠獲得6.3xl08TCID50/ml的效價。KreeftenbergetalO006)涉及在產(chǎn)業(yè)規(guī)模上制備用于疫苗制備的脊髓灰質(zhì)炎病毒，也提及了脊髓灰質(zhì)炎病毒的各種野生型和Sabin株在微載體上生長的Vero細胞中的產(chǎn)率，對于不同株此產(chǎn)率類似，效價的對數(shù)值在8.1至8.6之間。這些作者也描述了對于制備最終疫苗所需的病毒量而言，IPV顯著高于0PV，這導致IPV的單位劑量生產(chǎn)成本顯著高于0PV。Card等在2005年也已描述了使用在微載體上培養(yǎng)的Vero細胞來無血清制備脊髓灰質(zhì)炎病毒，且雖然產(chǎn)率水平低于靜態(tài)培養(yǎng)物，但是微載體培養(yǎng)物被描述為更易于按比例擴大。盡管這些基于微載體的Vero細胞培養(yǎng)物的功效和工業(yè)實用性，大量脊髓灰質(zhì)炎病毒的制備仍成本很高，因此仍需要此缺點更小的用于脊髓灰質(zhì)炎病毒的替代制備體系。已經(jīng)描述了使用懸浮Vero細胞制備脊髓灰質(zhì)炎病毒，這導致比在常規(guī)微載體Vero細胞中觀察到的那些病毒效價更低的病毒效價(ltlIogCCID50/ml在6.5至7.9之間)(vanEikenhorstetal，2009)o本發(fā)明的目的是提供一種可用于大規(guī)模和經(jīng)濟制備在疫苗中使用的脊髓灰質(zhì)炎病毒的適合方法。這可有助于在能維持的基礎上在發(fā)展中國家提供能夠花費得起的脊髓灰質(zhì)炎疫苗。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明基于脊髓灰質(zhì)炎病毒在PER.C6細胞中的高效增殖的論證，其中根據(jù)本文所述的方法獲得了脊髓灰質(zhì)炎病毒的意想不到的高效價。此高效價的獲得比在Vero細胞中制備脊髓灰質(zhì)炎病毒具有顯著的經(jīng)濟優(yōu)點，其無法基于其他病毒在此類細胞中的復制而預期，而且也無法預測適用于產(chǎn)業(yè)上可行方法的條件，這是因為所述條件和可獲得的優(yōu)點對于具有很大不同性質(zhì)的各種不同類型病毒而言變化很大。因此，本發(fā)明提供了用于制備脊髓灰質(zhì)炎病毒的方法，包括以下步驟a)提供細胞的無血清懸浮培養(yǎng)物，所述細胞為以ECACC號9602^40保藏的PER.C6細胞，b)在MlO6細胞/ml至150xl06細胞/ml的細胞密度下用脊髓灰質(zhì)炎病毒感染所述細胞，和c)在感染后12至48小時收獲脊髓灰質(zhì)炎病毒。在某些實施方式中，所述感染在約切106細胞/ml至20xl06細胞/ml的細胞密度下進行，例如約8xl06細胞/ml至15xl06細胞/ml，如約IOxlO6細胞/ml。在某些實施方式中，所述收獲脊髓灰質(zhì)炎病毒在感染后約18至30小時進行，如在感染后約M小時。這些條件能夠在相對短的方法中獲得很高的脊髓灰質(zhì)炎病毒效價(約IOltVml,其顯著地為通常使用用于野生型脊髓灰質(zhì)炎株的基于微載體的Vero細胞所獲得的效價的10倍)，因此比目前用于疫苗制備的脊髓灰質(zhì)炎病毒的制備方法具有顯著的經(jīng)濟優(yōu)點。這在全部三種類型的脊髓灰質(zhì)炎病毒(1型(Brunenders株)、2型(MEF株)和3型(Saukett株))中均有證實。因此，在某些實施方式中，所述脊髓灰質(zhì)炎病毒為野生型強毒脊髓灰質(zhì)炎病毒，如1型脊髓灰質(zhì)炎病毒、2型脊髓灰質(zhì)炎病毒或3型脊髓灰質(zhì)炎病毒。在某些實施方式中，所述脊髓灰質(zhì)炎病毒為1型脊髓灰質(zhì)炎病毒株Mahoney或Brunenders、〗型脊髓灰質(zhì)炎病毒株MEF(或MEF-1)或3型脊髓灰質(zhì)炎病毒株Saukett。在其它實施方式中，所述脊髓灰質(zhì)炎病毒為減毒脊髓灰質(zhì)炎病毒(更低的神經(jīng)毒力)，如Sabin株(其也可為1型、2型或3型)。本發(fā)明進一步提供了制備脊髓灰質(zhì)炎疫苗的方法，包括根據(jù)本發(fā)明制備脊髓灰質(zhì)炎病毒的方法，進一步包括純化、任選地滅活、和配制收獲的脊髓灰質(zhì)炎病毒以獲得脊髓灰質(zhì)炎疫苗。對于IPV，滅活通過福爾馬林或其它方法進行。對于0PV，不需要滅活的步驟。在本文中也公開以提供用于制備脊髓灰質(zhì)炎疫苗的脊髓灰質(zhì)炎病毒批量制備物(bulk)，所述脊髓灰質(zhì)炎病毒批量制備物可通過根據(jù)本發(fā)明的制備脊髓灰質(zhì)炎病毒的方法獲得且包括培養(yǎng)基和至少1094CCID5(l/ml的脊髓灰質(zhì)炎病毒效價，如約109_5至IO11CCID5q/ml，如約IO98至IOiatCID5(l/ml。在某些實施方式中，所述批量制備物具有1至1000升的體積。在其它實施方式中，所述批量制備物包含根據(jù)本發(fā)明方法所用的細胞和/或細胞碎片。在某些實施方式中，所述批量制備物存在于生物反應器中。在其它實施方式中，所述批量制備物已從所述生物反應器中移出并存在于適合的容器中。還公開了可根據(jù)本發(fā)明的方法獲得的脊髓灰質(zhì)炎病毒和脊髓灰質(zhì)炎疫苗。所述脊髓灰質(zhì)炎病毒和/或疫苗不含猴的蛋白，優(yōu)選不含非人的蛋白。其將也不含其它非人的宿主細胞殘留物。相反，已根據(jù)常規(guī)方法制備的脊髓灰質(zhì)炎病毒將包含來自細胞培養(yǎng)期間所用的宿主細胞和/或來自細胞培養(yǎng)期間所用的血清的殘留的非人的蛋白和/或其它非人的殘留物。因此，與使用常規(guī)方法制備的脊髓灰質(zhì)炎病毒相比，根據(jù)本發(fā)明制備的脊髓灰質(zhì)炎病毒受到因制備方法導致的非人的雜質(zhì)的污染更小。本發(fā)明還提供了用于在細胞培養(yǎng)物中獲得效價為至少約1094、優(yōu)選至少1098、更優(yōu)選至少101°,如IOia5至IOiiCCID5qAiI的脊髓灰質(zhì)炎病毒制備物的方法，包括以下步驟a)提供細胞的無血清懸浮培養(yǎng)物，所述細胞為PER.C6細胞，b)在hlO6細胞/ml至150xl06細胞/ml的細胞密度下，用脊髓灰質(zhì)炎病毒感染所述細胞，和c)在感染后12至48小時收獲脊髓灰質(zhì)炎病毒，以獲得具有所述濃度的脊髓灰質(zhì)炎病毒制備物。根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選實施方式與上述用于制備脊髓灰質(zhì)炎病毒的方法相同。圖1:在粘附PER.C6和Vero細胞中制備脊髓灰質(zhì)炎病毒。圖2在感染時，在不同MOI和不同細胞密度下，在不同無血清培養(yǎng)基的懸浮PER.C6細胞中制備1型脊髓灰質(zhì)炎病毒。圖3溫度和收獲時間對在無血清培養(yǎng)基的懸浮PER.C6細胞中制備1型、2型和3型脊髓灰質(zhì)炎病毒的影響。圖4感染時細胞密度、溫度和收獲時間對在無血清培養(yǎng)基的懸浮PER.C6細胞中制備1型脊髓灰質(zhì)炎病毒的影響。圖5在高細胞密度的無血清懸浮PER.C6細胞中高效制備1型、2型和3型脊髓灰質(zhì)炎病毒。具體實施例方式本發(fā)明方法所用的細胞為PER.C6細胞，此細胞為永生化細胞，在本領(lǐng)域也稱為連續(xù)細胞系，因此具有無限壽命的潛能(參見如Barrettetal，2009)。用于本申請目的的PER.C6細胞是指在1996年2月四日以ECACC號9602^40保藏的細胞。本領(lǐng)域技術(shù)人員明白此定義將包括來自這些保藏細胞的上游或下游傳代，或上游或下游傳代的子代的細胞。PER.C6細胞描述在美國專利5，994，1觀和i^allauxetal，1998中。這些細胞非常適用于流感病毒制備以制備基于細胞的流感疫苗，這是因為它們可被感染并以高效率增殖病毒，如Pauetal，2001和WO01/38362所述。PER.C6細胞能夠在無血清下懸浮生長，如Yallopetal，2005所述。本文表明這些細胞也非常適合在無血清懸浮培養(yǎng)中以高水平制備脊髓灰質(zhì)炎病毒。而且，所用的條件在經(jīng)濟上和監(jiān)管上是有利的。與廣泛使用的通過Vero細胞的方法相反，本發(fā)明無需使用微載體。微載體導致使用基于常規(guī)Vero細胞的方法制備的脊髓灰質(zhì)炎病毒成本很高。根據(jù)本發(fā)明的“無血清”是指用于細胞生長和感染的培養(yǎng)基缺少全血清作為組分。培養(yǎng)基可并非完全不含血清衍生的制品如牛血清白蛋白(BSA)，然而在優(yōu)選實施方式中，此類組分也不存在，或已在無任何動物源組分下重組制備。在優(yōu)選實施方式中，完整的方法在無直接源自動物的任何組分(如血清或血清成分等)下進行。在優(yōu)選實施方式中，制備疫苗的方法在無動物組分的條件下進行。這是指用于細胞生長和感染的培養(yǎng)基全無任何動物源成分。而且，在疫苗制備過程期間補加到培養(yǎng)基中的任何添加劑也不含動物源組分。在制備所述脊髓灰質(zhì)炎疫苗的方法中無動物組分提供了可控性更強且更安全的方法。因此，作為完全表征的人細胞且遵循GLP/GMP開發(fā)出的PER.C6細胞非常適用于疫苗制備。可使用不同的培養(yǎng)基，且選擇用于細胞的最佳培養(yǎng)基和所用條件是本領(lǐng)域技術(shù)人員日常工作的一部分。因此，用于本發(fā)明目的的適合培養(yǎng)基是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，且可通常從商業(yè)渠道大量獲得，或根據(jù)標準方法由常規(guī)制備獲得。培養(yǎng)可使用分批、補料分批、連續(xù)體系等在培養(yǎng)皿、轉(zhuǎn)瓶或生物反應器中完成。為了通過細胞培養(yǎng)實現(xiàn)病毒的大規(guī)模(連續(xù)的)制備，本領(lǐng)域優(yōu)選能夠在懸浮液中生長的細胞，且優(yōu)選能夠在無動物或人源血清，或動物或人源血清組分下培養(yǎng)的細胞。適合培養(yǎng)細胞的條件是已知的(參見如TissueCulture，AcademicPressiKruseandPaterson，editors(1973)，禾口R.I.Freshney，Cultureofanimalcells:Amanualofbasictechnique，fourthedition(WiIey-LissInc.,2000，ISBN0-471-34889-9)?？筛鶕?jù)本發(fā)明方法使用的無血清培養(yǎng)基包括但不限于可訂購自培養(yǎng)基提供商目錄的標準培養(yǎng)基，包括CDM4PERMAb(ThermoScientificHyClone,目錄號SH30871，SH30872)。而且，定制的培養(yǎng)基如Permexcis(Lonza)是適合的。其它可適用于本發(fā)明方法的無血清培養(yǎng)基的實例為AEMdnvitrogen，目錄號12582-011)、EX-CELLVPRO培養(yǎng)基(JRHBiosciences,目錄號14561)和CDM4Retino(HyClone，目錄號SH30520，SH30519)。在某些可選和非限定性實施方式中，在本發(fā)明的方法中可向無血清培養(yǎng)基中補加脂質(zhì)和/或水解物和/或其他補加物，以進一步改進產(chǎn)率。本公開中數(shù)值所用的術(shù)語“約”(“about”或“around”)是指此值士10%。在根據(jù)本發(fā)明的方法中使用脊髓灰質(zhì)炎病毒感染細胞和/或病毒增殖適合如在約33°C至38°C的溫度下進行。在優(yōu)選實施方式中，所述感染和/或病毒增殖在約34°C至36°C的溫度下進行，在某些實施方式中，在約34.5°C至35.5°C下，如在約35°C下進行。在根據(jù)本發(fā)明的方法中，用脊髓灰質(zhì)炎病毒感染細胞可以如0.001至10的感染復數(shù)(MOI)適當?shù)剡M行。在某些實施方式中，所述感染以約1至3的MOI進行，如以約2的MOI進行。在此相對高MOI(>0.1，優(yōu)選約1或更高)下感染可進一步增強此高效率、高產(chǎn)率的方法。根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選在高細胞密度下，用脊髓灰質(zhì)炎病毒感染細胞。在某些方面，當細胞具有約IxlO6細胞/ml至150xl06細胞/ml，優(yōu)選hlO6細胞/ml至150xl06細胞/ml的密度時，脊髓灰質(zhì)炎病毒的感染發(fā)生。在某些優(yōu)選實施方式中，所述感染在約切106細胞/ml至20xl06細胞/ml，例如約8xl06細胞/ml至15xl06細胞/ml，如約IOxlO6細胞/ml的細胞密度下進行。據(jù)我們所知，本發(fā)明的方法提供了非腺病毒疫苗制備的最高的細胞濃度。根據(jù)本發(fā)明的這些方法的優(yōu)點為可獲得極高效價，即至少比現(xiàn)有技術(shù)的常規(guī)Vero方法高一個數(shù)量級的脊髓灰質(zhì)炎病毒。在根據(jù)本發(fā)明的方法中，脊髓灰質(zhì)炎病毒在感染后12至48小時收獲。在某些實施方式中，所述收獲脊髓灰質(zhì)炎病毒在感染后約18至30小時進行，如在感染后約20至觀小時，約22至沈小時，如在感染后約M小時。因此，可使用根據(jù)本發(fā)明的方法來極快地獲得高效價的脊髓灰質(zhì)炎病毒，這也有助于使得本發(fā)明的方法比常規(guī)現(xiàn)有技術(shù)的更長時間方法在經(jīng)濟上更具有吸引力。大多數(shù)大規(guī)模懸浮培養(yǎng)以分批或補料分批方法運行，這是因為這些方法是最直接地運行和按比例擴大，且此類方法原理上適用于本發(fā)明的方法。然而，基于灌注原理的連續(xù)方法正在變得更為普遍。在本發(fā)明的某些實施方式中，生產(chǎn)者細胞(producercell)在灌注體系中培養(yǎng)。分批、補料分批、灌注和灌注制備方法已與PER.C6細胞一起使用，如用于重組抗體制備。在分批培養(yǎng)中，通常實現(xiàn)存活細胞的濃度大于12xl06細胞/ml。已使用補料分批多次證實存活細胞濃度至高為40xl06細胞/ml。在灌注方法中，常規(guī)地實現(xiàn)大于150xl06細胞/ml的峰值細胞濃度(Kraietal，2009)。細胞的灌注培養(yǎng)在本領(lǐng)域具有其常規(guī)含義，即其是指在培養(yǎng)期間，細胞通過分離裝置被保留，在分離裝置中，存在具有比分離前更低細胞密度的液體流出，和細胞培養(yǎng)基流入。使用灌注培養(yǎng)以應對在高密度(如10-50xl06存活細胞/mL)下生長細胞的挑戰(zhàn)。為了增加密度，將培養(yǎng)基不斷地或間歇地用新鮮補充物替換，以彌補營養(yǎng)缺陷并去除毒性產(chǎn)物。灌注也使得能更好控制培養(yǎng)環(huán)境(pH、d02、營養(yǎng)水平等)。使新鮮培養(yǎng)基灌注通過培養(yǎng)物可通過使用各種分離裝置(如細網(wǎng)格旋轉(zhuǎn)過濾器、中空纖維或平板膜過濾器、沉降管)保留細胞來實現(xiàn)。在某些實施方式中，分離裝置是包括中空纖維即管狀膜的過濾器模塊。管的內(nèi)徑通常為0.3至6.Omm,如0.5至2.Omm0在某些實施方式中，選擇膜中的網(wǎng)格大小(孔大小)，使得網(wǎng)格中的孔大小接近細胞的直徑，在確保細胞高保留的同時使細胞碎片可通過過濾器。在其它實施方式中，網(wǎng)格大小顯著小于細胞的直徑。優(yōu)選地，網(wǎng)格大小為約0.1-30μm,如0.1至3μm，如約0.2μm。包括中空纖維的過濾器模塊可從如GeneralElectric(formerlyAmersham)商購。使用灌注以將某些代謝物保持在所希望的水平并去除及由此降低培養(yǎng)基中的雜質(zhì)。通常的情況是，灌注并非在培養(yǎng)期間的全部時間進行，而通常是根據(jù)需要僅在培養(yǎng)期間分段進行。例如，灌注通常在某些培養(yǎng)基成分如葡萄糖開始耗盡且需要替換之后才開始。一些灌注體系是本領(lǐng)域已知的且原理上適用于本發(fā)明的方法。術(shù)語“灌注體系”是指與分離裝置連接的生物反應器的組合。分離裝置或者可裝入生物反應器中(如細網(wǎng)格旋轉(zhuǎn)過濾器)，或者保留在生物反應器之外(如中空纖維)。在兩種情況中，如上所述，分離裝置防止細胞團塊被從反應器中洗出且使得培養(yǎng)基更新。在某些實施方式中，生物反應器通過交替切向流(ATF)灌注體系(如ATFSystem,RefineTechnology,Co.，EastHanover,NJ)來運行(連接至交替切向流(ATF)灌注體系)。切向流可根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法實現(xiàn)，且其描述在如US6，544，似4中。ATF灌注體系的運行已有描述且是可升級的(Furey,2002)oATF體系允許細胞被培養(yǎng)更長的時間，并實現(xiàn)高細胞密度而不阻塞過濾器。確實，大于ΙΟΟχΙΟ6存活細胞/mL的極高細胞密度可通過使用ATF灌注體系，如使用PER.C6細胞獲得(參見如私110etal，2005andWO2005/095578)。然而，在那些更早期的報道中，PER.C6細胞在灌注體系中被用于抗體的重組制備，即完全不同的目的，且不用脊髓灰質(zhì)炎病毒感染。在某些實施方式中，使用如ATF體系的灌注在預培養(yǎng)階段(即在用脊髓灰質(zhì)炎病毒感染前)是有利的，這是因為其允許獲得極高細胞密度，且細胞處于良好狀態(tài)以適于隨后脊髓灰質(zhì)炎病毒的感染。為了達到所得高細胞密度，在一些實施方式中，在細胞生長的部分時間內(nèi)，至少部分灌注培養(yǎng)基。在一些實施方式中，當細胞密度達到約Mio6存活細胞/mL至8xl06存活細胞/mL時，開始灌注。在本發(fā)明的方法中，用脊髓灰質(zhì)炎病毒感染細胞。通常，在允許吸收病毒的最佳條件下，將病毒暴露于合適的生產(chǎn)者細胞。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道如何獲得其它最佳條件，即對于攪拌、PH、溶解氧((102或00)的最佳條件。通常，最佳攪拌為約50至300rpm，通常約100-200，如約150；通常的DO為5-60%；最佳pH為6.7至7.7。通常，脊髓灰質(zhì)炎病毒自發(fā)地感染本發(fā)明的細胞，且使細胞開始接觸脊髓灰質(zhì)炎病毒顆粒足以導致細胞感染。通常，將脊髓灰質(zhì)炎病毒種子儲備液(seedstock)加入至培養(yǎng)物中以啟動感染，隨后脊髓灰質(zhì)炎病毒在細胞中增殖。根據(jù)本發(fā)明，在高細胞密度，即約IOxlO6細胞/mL下用脊髓灰質(zhì)炎病毒感染細胞培養(yǎng)物是有利的，并獲得很高的脊髓灰質(zhì)炎病毒效價(大于IOkiCCID5ciAiI)。在某些實施方式中，感染前細胞培養(yǎng)物的存活力保持大于75%，這表示培養(yǎng)物中細胞總量的至少75%在感染時是存活的。在某些實施方式中，感染時細胞培養(yǎng)物的存活力至少為80%，在其它實施方式中為至少85%。存活力可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員可利用的常規(guī)方法，如臺盼藍拒染、Casy細胞計數(shù)等來測定。在某些實施方式中，感染時細胞密度為約IOxlO6至50xl06存活細胞/mL，如約IOxlO6至20xl06存活細胞/mL，如約IOxlO6至15xl06存活細胞/mL。這些細胞密度允許高病毒產(chǎn)率以及細胞屑和宿主細胞DNA的有限積累，這使得脊髓灰質(zhì)炎病毒收獲的下游加工受益于這些實施方式的優(yōu)點。因此，本發(fā)明提供了用于制備脊髓灰質(zhì)炎病毒、產(chǎn)生高效價的脊髓灰質(zhì)炎病毒、同時提供仍可處理以用于下游加工目的收獲材料的最佳方法。在其它實施方式中，感染時細胞密度為約15xl06至150xl06細胞/mL，如約15xl06至80xl06細胞/mL，如約20xl06至50xl06細胞/mL。在這些細胞密度下感染甚至可產(chǎn)生更高的病毒濃度。在本發(fā)明的某些實施方式中，提供用于制備至少IOkiCCID5ciAII效價的脊髓灰質(zhì)炎病毒批量制備物的方法。效價以CCID5tl，即50%的細胞培養(yǎng)物感染劑量來表示。其有時也稱為TCID5tl(50%的組織培養(yǎng)物感染劑量)，但因為其通過細胞培養(yǎng)物確定，所述本文使用術(shù)語CCID5tlt5將病毒接觸細胞放置，以使得此病毒感染所述細胞并增殖。例如，將一批病毒種子加入至細胞培養(yǎng)物中并使其吸附在細胞上，持續(xù)如約30分鐘并輕微攪拌(如約30rpm)，隨后可加入另外的培養(yǎng)基，并根據(jù)需要調(diào)節(jié)PH，可調(diào)節(jié)攪拌速度并保持培養(yǎng)。在感染步驟后，發(fā)生大量病毒顆粒的擴增。當然，此步驟也優(yōu)選在無血清下懸浮培養(yǎng)的PER.C6細胞中進行，且更優(yōu)選在完全不含直接源自動物的組分的條件下進行。此步驟可適合于在如1至20，000升、如10至2000升、如50至1000升規(guī)模的生物反應器中進行，此規(guī)模可很容易根據(jù)對疫苗的需要來調(diào)節(jié)。在某些實施方式中，生物反應器為一次性生物反應器(SUB)。在脊髓灰質(zhì)炎病毒在細胞中增殖后，從細胞培養(yǎng)物中收獲病毒或其組分。這可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員同樣已知的常規(guī)方法來完成。在細胞培養(yǎng)基中產(chǎn)生和釋放的病毒可通過常規(guī)方法如離心或超濾從細胞的生物量中分離，并在上清液中收獲。在此情況中，離心或過濾為收獲步驟。可使用常規(guī)方法來收獲病毒，如US4，525，349中所述的那些方法。簡而言之，通常將含病毒的液體培養(yǎng)基懸液移出、過濾并通過如超濾來濃縮。例如，在培養(yǎng)結(jié)束時，通過收集含病毒懸液的培養(yǎng)基來進行收獲。收獲物可使用如0.22μm過濾器來過濾并任選地儲存在4°C。任選地可將過濾的收獲物超濾以濃縮病毒懸液，隨后脊髓灰質(zhì)炎病毒可使用如凝膠過濾和/或離子交換層析，如按照US4，525，349或VanWezeletal，1978中所述的方法來純化。任選地地可將所得的濃縮病毒懸液稀釋，且為了制備IPV，可使用常規(guī)方法將本文的脊髓灰質(zhì)炎病毒滅活。用于收獲和純化脊髓灰質(zhì)炎病毒或病毒組分的方法以及由此的疫苗制備在本領(lǐng)域中已使用數(shù)十年，因此是公知的且已詳細描述在如VanWezeletal,1978；Montagnonetal,1984；WO2007/007344；US4，525，349中，它們?nèi)客ㄟ^引用并入本文。脊髓灰質(zhì)炎疫苗基于活病毒或滅活病毒。它們包含作為重要保護性抗原的脊髓灰質(zhì)炎病毒D抗原。病毒產(chǎn)率可通過標準病毒滴定技術(shù)來測定，而D抗原濃度的測定也通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)如D抗原ELISA分析進行。免疫原性可通過如動物體內(nèi)測試測定。效價(Potency)可使用D抗原ELISA和在來自預先免疫大鼠血清上的脊髓灰質(zhì)炎病毒中和細胞培養(yǎng)物分析測定。通常，將每種脊髓灰質(zhì)炎病毒株用單獨的方法培養(yǎng)，且如果例如制備含三種類型脊髓灰質(zhì)炎病毒的三價疫苗，則將(IPV用的滅活的)病毒混合并配制單獨劑量的制劑。在某些實施方式中，例如，每劑量(如0.5ml)的最終疫苗可包含如40D抗原單位(DU)的1型脊髓灰質(zhì)炎病毒、8DU的2型脊髓灰質(zhì)炎病毒和32DU的3型脊髓灰質(zhì)炎病毒，這通過與參比制劑的比較來確定。脊髓灰質(zhì)炎病毒的滅活可根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法，如通過福爾馬林或β-丙內(nèi)酯(BPL)完成(參見如Jiangetal，1986)。在某些實施方式中，滅活通過福爾馬林，如通過以下方法進行將純化的病毒懸液通過0.22μm膜過濾，穩(wěn)定的磁攪拌下加熱至37°C，持續(xù)24小時，隨后加入福爾馬林溶液以達到1/4，000的濃度。在將病毒懸液保持在37°C的同時，在最初4天繼續(xù)磁攪拌。在第6天，將病毒懸液通過0.22μm膜過濾，在37°C懸浮下繼續(xù)滅活，直至第12天。將滅活的病毒懸液均質(zhì)化且可儲存在如4°C下。在此步驟后，濃縮的和/或用于施用的最終批料可通過如混合所需制劑來制備。在一些實施方式中，將純化的脊髓灰質(zhì)炎病毒或病毒組分配制為藥物組合物。這可根據(jù)各種方法和根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的全部常規(guī)方法使用各種緩沖劑完成。通常，這需要將脊髓灰質(zhì)炎病毒顆粒置于包括脊髓灰質(zhì)炎病毒和至少一種藥學上可接受的賦形劑的藥學上可接受的組合物中。此類組合物可在本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的條件下制備，且在一些實施方式中，此類組合物適用于向人類施用。在某些實施方式中，組合物可包括緩沖的培養(yǎng)基，所述緩沖的培養(yǎng)基任選地為用作某些注冊的常規(guī)滅活脊髓灰質(zhì)炎病毒疫苗的配制緩沖劑的MediumM-199。此外，可使用磷酸鹽緩沖鹽水，且最終制劑可包括如每劑量為0.5%的2-苯氧基乙醇和最高0.02%的甲醛作為抗微生物防腐劑。藥學上可接受的載體或賦形劑和稀釋劑是本領(lǐng)域熟知的且廣泛地用在大量治療產(chǎn)品中。優(yōu)選地，應用在疫苗中適用的載體。在某些實施方式中，疫苗進一步包括佐劑，如明礬。本領(lǐng)域已知佐劑可進一步增加對所用抗原決定簇的免疫應答。為了向人類施用，本發(fā)明可應用包括脊髓灰質(zhì)炎病毒和藥學上可接受的載體或賦形劑的藥物組合物。在本文中，術(shù)語“藥學上可接受的”是指載體或賦形劑的所用劑量和濃度將不會在所施用的對象中引起任何不希望的或有害的后果。此類藥學上可接受的載體和賦形劑是本領(lǐng)域熟知的(參見Remington'sPharmaceuticalSciences,18thedition,A.R.Gennaro,Ed.,MackPublishingCompany[1990]；PharmaceuticalFormulationDevelopmentofPeptidesandProteins,S.FrokjaerandL.Hovgaard,Eds.,Taylor&Francis[2000]；禾口HandbookofPharmaceuticalExcipients,3rdedition,A.Kibbe,Ed.，PharmaceuticalPress[2000])0優(yōu)選將純化的滅活脊髓灰質(zhì)炎病毒或其免疫原性部分作為無菌溶液配制和施用。無菌溶液通過無菌過濾或本領(lǐng)域已知的其它方法來制備。溶液隨后被凍干或填充入藥物劑量容器。溶液的PH通常為pH3.0至9.5，如pH5.0至7.5。脊髓灰質(zhì)炎病毒或其免疫原性部分通常在具有適合藥學上可接受的緩沖劑的溶液中，且脊髓灰質(zhì)炎病毒的溶液也可包括鹽。任選地，可存在穩(wěn)定劑，如白蛋白。在某些實施方式中，加入去污劑。在某些實施方式中，可將疫苗配制為可注射的制劑。這些制劑包含有效量的脊髓灰質(zhì)炎病毒或其免疫原性部分，為無菌液體溶液、液體懸液或凍干形式，且任選地包括穩(wěn)定劑或賦形劑。脊髓灰質(zhì)炎疫苗可為單價(包含一種類型的脊髓灰質(zhì)炎病毒，如1型、2型或3型)，或二價(包含兩種類型的脊髓灰質(zhì)炎病毒，如1型和2型、1型和3型、或2型和3型)，或三價(包含三種類型的脊髓灰質(zhì)炎病毒，即1型、2型和3型)?？蓮囊吧图顾杌屹|(zhì)炎病毒制備IPV?；蛘?，IPV可從無毒力活脊髓灰質(zhì)炎病毒如從Sabin株制備，這將進一步降低由IPV制備而再次引入野生型脊髓灰質(zhì)炎病毒的風險(參見如WO2007/007344和Doietal，2001)。本發(fā)明適用于制備野生型脊髓灰質(zhì)炎病毒(1型、2型和3型，如1型株Mahoney、2型株MEF或3型株Saukett)以及無毒力型脊髓灰質(zhì)炎病毒(如Sabin株)。因此，本發(fā)明可用于制備IPV以及OPV用的脊髓灰質(zhì)炎病毒。用于制備IPV的本發(fā)明的方法可將成本降低至欠發(fā)達和最不發(fā)達國家能使用IPV的程度。雖然當根據(jù)常規(guī)方法制備時OPV通常比IPV便宜，但是本發(fā)明的高效方法仍可降低OPV所用大量材料的成本，因此也降低OPV的成本。脊髓灰質(zhì)炎疫苗的施用可根據(jù)本領(lǐng)域公知的方法，通過如經(jīng)肌肉、經(jīng)皮下或經(jīng)口服來進行。根據(jù)本發(fā)明可獲得的脊髓灰質(zhì)炎病毒疫苗可用作獨立的疫苗，但是在其它實施方式中，其可以諸如針對白喉、百日咳、破傷風和脊髓灰質(zhì)炎的組合疫苗的形式與其它疫苗組合，且其任選地進一步包括諸如抗乙型肝炎和/或流感嗜血桿菌等的疫苗組分。因此，脊髓灰質(zhì)炎病毒適用于擴大免疫計劃(EPI)，且可與此計劃中的疫苗組合。與常規(guī)脊髓灰質(zhì)炎病毒疫苗類似，根據(jù)本發(fā)明的疫苗可按單次劑量施用，或優(yōu)選地以初免-加強方案施用，在此初免-加強方案中多個疫苗劑量以適合的時間間隔施用，例如以1-2個月時間間隔注射2次，在6-12個月后加強劑量；或例如，初始口服劑量，在約8周后第二劑量，且在第二劑量后8-12個月第三劑量；或例如，對于嬰兒，在6-12周齡時第一口服劑量，在第一劑量后約8周時第二劑量，且在約6-18月齡時第三劑量；或例如，對于之前免疫過的人，在增加風險時僅單次劑量；等。最佳劑量方案可根據(jù)標準醫(yī)學實踐來確定，且通常將遵循與可用的脊髓灰質(zhì)炎病毒疫苗所用相同的那些策略。本發(fā)明在以下實施例中進一步說明。實施例不以任何方式限制本發(fā)明。實施例僅用于闡明本發(fā)明。實施例實施例1在粘附PER.C6細胞上高效制備脊髓灰質(zhì)炎病毒為了測試脊髓灰質(zhì)炎病毒在粘附PER.C6細胞上的增殖和產(chǎn)生病毒儲備液，從SBL(Sweden)獲得1型(Brunenders)、2型(MEF-I)和3型(Sauckett)脊髓灰質(zhì)炎病毒。每種均在Vero細胞上產(chǎn)生的這些儲備液的效價為約106CCID5(1/ml。PER.C6細胞O^allauxetal,1998)生長在培養(yǎng)基中(含10%FBS和IOmMMgCl2的DMEM)。向三個T175燒瓶中接種在25ml培養(yǎng)基中為30x106PER.C6細胞/燒瓶的每種類型脊髓灰質(zhì)炎病毒，并在第二天在37°C和10%CO2的增濕培養(yǎng)箱中以0.1(0.ICCID50/細胞)的感染復數(shù)(MOI)接種。三天后，收獲細胞和培養(yǎng)基，并通過兩輪凍/融循環(huán)制備粗裂解物。在離心去除細胞碎片后，將上清液分為等分試樣并儲存在-80°C下。平行地，對于每種脊髓灰質(zhì)炎病毒株，向一個T175燒瓶中在25mlVero細胞培養(yǎng)基(添加有4mML-谷氨酰胺的OptiproSFM培養(yǎng)基)中接種6.25xl06Vero細胞并以相同的MOI感染。Vero培養(yǎng)物也在3天后收獲，凍/融兩次并等分以用于儲存。脊髓灰質(zhì)炎病毒的產(chǎn)量通過使用Vero細胞的CCID5tl測定來定量。為此，將1.25xl04Vero細胞接種在具有100μ1培養(yǎng)基的96孔板的每個孔中并在37°C和5%CO2下孵育。第二天，在Vero細胞培養(yǎng)基中制備脊髓灰質(zhì)炎病毒樣品的15個5倍稀釋液系列，且將100μ1的5至15號稀釋液按8個復孔加入至96孔板的1至11列中。12列用作未感染的對照列。7天后，分析孔中出現(xiàn)的致細胞病變(CPE)，并使用Spearman-KSrber方法計算效價終點效價(Iogltl)=X。-d/2+d/n*ΣXi其中X。為最大稀釋(在該稀釋下全部接種物仍為正值)的Iogltl值，d為所用稀釋因子的Iogltl值，η為每個稀釋下的重復數(shù)，且ΣXi為全部孔的總和，全部孔的總和為正值，包括稀釋X。。滴定實驗的結(jié)果描述在圖1中，且顯示對于1型脊髓灰質(zhì)炎病毒，粘附PER.C6細胞上效價是Vero細胞的>5倍，對于2型和3型脊髓灰質(zhì)炎病毒，粘附PER.C6細胞上效價是Vero細胞的>10倍。因為接種了更多的PER.C6細胞，所以預期每個細胞的病毒顆粒的產(chǎn)量差異更小。對于PER.C6和Vero，估計細胞單層的匯合率均為80%。我們從這些實驗推斷在PER.C6細胞的粘附單層上制備脊髓灰質(zhì)炎病毒至少和在Vero細胞上一樣好。實施例2在懸浮PER.C6細胞中高效制備脊髓灰質(zhì)炎病毒為了研究脊髓灰質(zhì)炎病毒在懸浮PER.C6細胞中的增殖，進行小規(guī)模實驗以測試不同的培養(yǎng)基、感染復數(shù)(MOI)和收獲時間(TOH)。為此，PER.C6細胞在三種不同的培養(yǎng)基中培養(yǎng)AEM(Invitrogen),BMIVg(從Lonza以Permexcis商購)和CDM4PERMAb(Hyclone)。在感染時，將在一種類型培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細胞計數(shù)，并在以不同的細胞密度(1.5,2.5,3.5或5XIO6細胞/ml)再接種在相同類型的培養(yǎng)基中，并在37°C下在搖床上的增濕培養(yǎng)箱中以不同Μ0Ι(0.01、0.05或0.ICCID5tl/細胞)感染。搖床(IKAKS260)具有IOmm軌道直徑，且以IOOrpm用于裝有15_20ml培養(yǎng)基的125或250ml搖瓶。對于AEM培養(yǎng)基，因為AEM不支持更高的細胞密度，所以細胞以1.5或2.5XIO6細胞/ml接種。以此方式制備多種培養(yǎng)物，所述培養(yǎng)物在感染后2、3或4天收獲。全部樣品凍/融兩次并保持在-20°C下或更低，直到進一步分析。圖2描述了2天和4天樣品的滴定結(jié)果(3天的數(shù)據(jù)未示出)。雖然BMIVg培養(yǎng)基比PERMAb和AEM培養(yǎng)基提供略低的效價，但是在全部三種培養(yǎng)基中生長和感染的PER.C6細胞能夠產(chǎn)生高效價的1型脊髓灰質(zhì)炎病毒。而且，更長時間的孵育不導致更高的效價。相反，在多數(shù)情況下，2天收獲比3天和4天收獲提供更高的效價。在此實驗中無法看出MOI變化的一致效果。重要地，在感染時使用更高的細胞密度導致更高的體積效價，這顯示出使用高細胞密度的懸浮培養(yǎng)方法有利于產(chǎn)生感染性脊髓灰質(zhì)炎病毒。在接下來的實驗中，比較全部三種脊髓灰質(zhì)炎病毒株在感染期間的收獲時間和溫度。為此，將PER.C6細胞在15ml體積搖瓶中以2.5xl06細胞/ml接種在AEM培養(yǎng)基中，并在37°C和35°C下用各種脊髓灰質(zhì)炎病毒株以0.IMOI感染。如上所述，細胞和培養(yǎng)基在感染后2、3和4天收獲并處理。在不同條件下病毒產(chǎn)生的分析通過上述的CCID5tl值測定來完成，且對于全部三種類型的脊髓灰質(zhì)炎病毒顯示出在35°C下比在37°C下產(chǎn)率增加(圖3)。此外，在多數(shù)情況下，當在2天取得收獲物時，測量出最高效價，這已得到確認并也適用于脊髓灰質(zhì)炎病毒2型和3型。實施例3脊髓灰質(zhì)炎病毒在懸浮PER.C6細胞上的產(chǎn)率在更高細胞密度下增加為了研究是否細胞密度的進一步增加導致病毒效價的增加，比較2.5xl06細胞/ml和IOxlO6細胞/ml下的產(chǎn)量。至此，將PERMAb培養(yǎng)基中的PER.C6細胞以所述細胞密度接種在15ml體積搖瓶中，并一式三份用2CCID50/細胞的1型脊髓灰質(zhì)炎病毒感染。在M和48小時后，收獲細胞和培養(yǎng)基，并通過上述凍/融和離心制備澄清的裂解物。除了之前35°C和37°C的測試溫度外，實驗也在33°C下進行。通過CCID5tl測定的效價分析(圖4)確認，與2.5xl06細胞/ml相比，當細胞以IOxlO6細胞/ml的密度感染時，產(chǎn)率提高。最佳效價在35°C下獲得，這與細胞密度或收獲天數(shù)無關(guān)。而且，對于脊髓灰質(zhì)炎病毒在PER.C6細胞上有效增殖的預示，顯示收獲物也可在M小時后取出，這是因為在M小時或48小時樣品中的產(chǎn)率很相近。在接下來的實驗中，對于其它類型的脊髓灰質(zhì)炎病毒也測試這些條件。PER.C6細胞以IOxlO6細胞/ml接種在PERMAb培養(yǎng)基中，并一式三份在35°C下在搖瓶中用脊髓灰質(zhì)炎病毒的不同儲備液以2CCID50/細胞感染。如上所述，在M和48小時后進行收獲，且將細胞和培養(yǎng)基處理為澄清的裂解物。通過CCID5tl測定的滴定顯示出使用高細胞密度也導致對于2型和3型病毒的高產(chǎn)率(圖5)。這清楚地顯示懸浮的PER.C6細胞的高密度培養(yǎng)物為制備野生型脊髓灰質(zhì)炎病毒提供了優(yōu)異的平臺。因為PER.C6細胞的細胞密度和培養(yǎng)物的大小/體積可使用生物反應器系統(tǒng)、波浪袋(wavebag)或其它類型的培養(yǎng)用更高規(guī)格系統(tǒng)來增加，所以與目前使用Vero細胞培養(yǎng)物的微載體系統(tǒng)相比，脊髓灰質(zhì)炎病毒的產(chǎn)量可顯著提高。制備的脊髓灰質(zhì)炎病毒根據(jù)本領(lǐng)域已知的以及用于在Vero細胞上增殖的脊髓灰質(zhì)炎病毒的方法收獲和純化，并根據(jù)已知方法用福爾馬林滅活，且隨后根據(jù)本領(lǐng)域熟知的方法，使用標準大鼠免疫原性試驗來測試免疫原性(如Bevilacquaetal，1996)。預期由此制備的脊髓灰質(zhì)炎病毒具有可匹配通過使用Vero細胞的常規(guī)方法制備的脊髓灰質(zhì)炎病毒的免疫原性。實施例4在生物反應器中在PER.C6細胞中制備脊髓灰質(zhì)炎病毒細胞從PER.C6工作細胞庫中融化，并在37°C和10%CO2的增濕培養(yǎng)箱中在無血清培養(yǎng)基中增殖。每3至4天進行繼代培養(yǎng)，直至達到能夠以0.2-0.4xl°6cells/mL的細胞密度接種2L生物反應器的細胞密度。細胞在37°C、40%DO和pH7.3的2L生物反應器中增殖。當達到約&106細胞/mL的細胞密度時(接種后4天)，啟動ATF系統(tǒng)，以使細胞培養(yǎng)一段更長的時間并達到高細胞密度。在約11至12天后，2L生物反應器中的細胞密度達到大于50xl06細胞/mL。此時，將細胞懸液轉(zhuǎn)移至IOL生物反應器。將來自2L生物反應器的細胞懸液用無血清培養(yǎng)基以15稀釋。IOL生物反應器中的細胞密度為10至15xl06細胞/mL。隨后，將IOL生物反應器用脊髓灰質(zhì)炎病毒種子儲備液以2CCID5(1/細胞的MOI感染。脊髓灰質(zhì)炎病毒的制備在35°C、pH7.3和40%DO下進行。在特定時間點從IOL生物反應器取樣以用于細胞計數(shù)和脊髓灰質(zhì)炎病毒制備，且脊髓灰質(zhì)炎病毒的收獲適于在感染后12至48小時進行。參考文獻BarrettPN,MundtW,Kistner0,HowardMK.2009.Verocellplatforminvaccineproduction:movingtowardscellculture-basedviralvaccines.ExpertRev.Vaccines8:607-618.BevilacquaJM,YoungL，ChiuSW,SparkesJD,KreeftenbergJG.1996.Ratimmunogenicityassayofinactivatedpoliovirus.Dev.Biol.Stand.86:121-127.CampbellSA,LinJ，DobrikovaEY,GromeierM.2005.Geneticdeterminantsofcelltype-specificpolioviruspropagationinHEK293cells.J.Virol.796281-6290.CardCJ,SmithT，HunsakerB，BarnettB.2005.Serum-freeproductionofpoliovirus:Acomparativestudyusingmicrocarriers，rollerbottlesandstationarycellculture.In:F.GodiaandM.Fussenegger(Eds.)，AnimalCellTechnologymeetsGenomics,761-765.DoiY，AbeS，YamamotoH，HorieH，etal.2001.ProgresswithinactivatedpoliovirusvaccinesderivedfromtheSabinstrains.In:BrownF(ed)ProgressinPolioEradication:VaccineStrategiesfortheEndGame.Dev.Biol.105:163-169.VanEikenhorstG，BakkerWAM，ThomassenYE，vanderPolLA.2009.Platformtechnologyforviralvaccineproduction!comparisonbetweenattachedandsuspensionVerocells.PosterandAbstractP70.In:21stMeetingoftheEuropeanSocietyforAnimalCellTechnology,ProgrammeandBookofAbstracts.FallauxFJiBoutA,vanderVeldeI,vandenWollenbergDJ，HehirKM，KeeganJ,etal.Newhelpercellsandmatchedearlyregion1—deletedadenovirusvectorspreventgenerationofreplication-competentadenoviruses.HumGeneTher1998Sep1；9(13):1909-17.FureyJ.Scale-upofacellcultureperfusionprocess-Alow-shearfiltrationsystemthatinhibitsfilter—membranefouling.GeneticEngineeringNews.Vol.22，No.7，April2002.JiangS，PyeD，CoxJC.1986.Inactivationofpolioviruswithβ-propiolactone.J.Biol.Stand.14:103-109.JohnJ.2009.Roleofinjectableandoralpoliovaccinesinpolioeradication.ExpertRev.Vaccines8:5-8.Kew0M，SutterRW，deGourvilleEM，DowdleWR,PallanschMA.2005.Vaccine-derivedpoliovirusesandtheendgamestrategyforglobalpolioeradication.Annu.Rev.Microbiol.59:587-635.KralKMiGoldenK，ZijlstraG,SwavingJiNieboerM，ChonJH.2009.AdvancesinhighyieldingplatformproductionprocessesusingthePER.C6humancellline.AbstractP142.In:21stMeetingoftheEuropeanSocietyforAnimalCellTechnology,ProgrammeandBookofAbstracts.Merten0.-W.，WuR，CouveE,CrainicR.1997.Evaluationoftheserum-freemediumMDSS2fortheproductionofpoliovirusonVerocellsinbioreactors.Cytotechnology25:35-44.MontagnonB，Vincent-FalquetJC,FangetB.1982.ThousandlitrescalemicrocarriercultureofVerocellsforkilledpoliovirusvaccine.Promisingresults.Develop.Biol.Standard.55:37-42.MontagnonBJ,FangetB，Vincent-FalquetJC.1984.Industrial-scaleproductionofinactivatedpoliovirusvaccinepreparedbycultureofVerocellsonmicrocarrier.Rev.Infect.Dis.6(suppl.2):S341_S344.PauMGiOphorstCiKoldijkMHiSchoutenGiMehtaliMiUytdehaagF.ThehumancelllinePER.C6providesanewmanufacturingsystemfortheproductionofinfluenzavaccines.Vaccine2001Mar21；19(17-19):2716-21.VanWezelAL，vanSteenisG，HannikCA，CohenH.1978.Newapproachtotheproductionofconcentratedandpurifiedinactivatedpolioandrabiestissueculturevaccines.Develop,biol.Standard.41:159-168.WrightPF,ModlinJF.2008.ThedemiseandrebirthofPolio—AmodernPhoenix？J.Infect.Dis.197:335-336.YakovenkoML,KorotkovaEA，IvanovaOE，EremeevaTPetal.2009.EvolutionoftheSabinvaccineintopathogenicderivativeswithoutappreciablechangesinantigenicproperties:needforimprovementofcurrentpoliovirussurveillance.J.Virol.83:3402-3406.YallopC，CrowleyJ，CoteJ，Hegmans-BrouwerK，LagerwerfF，GagneR，MartinJC,OosterhuisN，OpsteltenDJ,BoutA.Per.C6cellsforthemanufactureofbiopharmaceuticalproteins.ModernBiopharmaceuticals-Design,DevelopmentandOptimization.Vol.3，2005.權(quán)利要求1.一種制備脊髓灰質(zhì)炎病毒的方法，包括以下步驟a)提供細胞的無血清懸浮培養(yǎng)物，所述細胞為以ECACC號9602^40保藏的PER.C6細胞，b)在hlO6細胞/ml至150xl06細胞/ml的細胞密度下，用脊髓灰質(zhì)炎病毒感染所述細胞，和c)在感染后12至48小時收獲脊髓灰質(zhì)炎病毒。2.權(quán)利要求1的方法，其中所述感染和/或病毒增殖在34°C至36°C的溫度下進行。3.前述任一項權(quán)利要求的方法，其中所述感染在切106細胞/ml至20xl06細胞/ml的細胞密度下進行。4.前述任一項權(quán)利要求的方法，其中所述感染在約IOxlO6細胞/ml的細胞密度下進行。5.前述任一項權(quán)利要求的方法，其中所述感染以約1至3，如約2的感染復數(shù)(MOI)進行。6.前述任一項權(quán)利要求的方法，其中所述收獲脊髓灰質(zhì)炎病毒在感染后18至30小時進行，如在感染后約M小時進行。7.前述任一項權(quán)利要求的方法，其中所述脊髓灰質(zhì)炎病毒為1型脊髓灰質(zhì)炎病毒、2型脊髓灰質(zhì)炎病毒或3型脊髓灰質(zhì)炎病毒。8.權(quán)利要求7的方法，其中所述脊髓灰質(zhì)炎病毒為1型脊髓灰質(zhì)炎病毒株Mahoney、2型脊髓灰質(zhì)炎病毒株MEF或3型脊髓灰質(zhì)炎病毒株Saukett。9.權(quán)利要求7的方法，其中所述脊髓灰質(zhì)炎病毒為減毒脊髓灰質(zhì)炎病毒，如Sabin株。10.一種制備脊髓灰質(zhì)炎疫苗的方法，包括前述任一項權(quán)利要求的方法，進一步包括純化、任選地滅活、和配制所述收獲的脊髓灰質(zhì)炎病毒以獲得脊髓灰質(zhì)炎疫苗。全文摘要本發(fā)明提供了用于制備脊髓灰質(zhì)炎病毒的方法，包括以下步驟a)提供細胞的無血清懸浮培養(yǎng)物，所述細胞為PER.C6細胞，b)在2x106細胞/ml至150x106細胞/ml的細胞密度下，用脊髓灰質(zhì)炎病毒感染所述細胞，和c)在感染后12至48小時收獲脊髓灰質(zhì)炎病毒。文檔編號A61K39/13GK102482647SQ201080026814公開日2012年5月30日申請日期2010年7月8日優(yōu)先權(quán)日2009年7月16日發(fā)明者J·A·劉易斯申請人:克魯塞爾荷蘭公司