專(zhuān)利名稱(chēng)：用于治療癌癥的具鵝膏蕈毒素的靶結(jié)合部分的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及腫瘤治療。在一個(gè)方面，本發(fā)明涉及可用于治療癌癥的靶結(jié)合部分和毒素的綴合物。具體而言，毒素為鵝膏蕈毒素(amatoxin)，靶結(jié)合部分(例如抗體)針對(duì)腫瘤相關(guān)抗原，例如上皮細(xì)胞黏附分子(迎ithelial cell adhesion molecule, EpCAM)。在另一方面，本發(fā)明涉及包含這種靶結(jié)合部分毒素綴合物的藥物組合物和這種靶結(jié)合部分毒素綴合物在制備這種藥物組合物中的用途。本發(fā)明的靶結(jié)合部分毒素綴合物和藥物組合物可用于治療癌癥，尤其是腺癌，例如胰腺癌、膽管癌、乳腺癌和結(jié)直腸癌。發(fā)明背景和技術(shù)狀態(tài)鵝膏蕈毒素鵝膏蕈毒素是由8個(gè)氨基酸組成的環(huán)肽。它們可分離自毒鵝膏(Amanita phalloides)蘑菇，或通過(guò)合成從結(jié)構(gòu)單元制備。鵝膏蕈毒素特異性抑制哺乳動(dòng)物細(xì)胞的 DNA依賴(lài)的RNA聚合酶II，因此亦抑制受影響細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄及蛋白質(zhì)生物合成。在細(xì)胞中抑制轉(zhuǎn)錄引起生長(zhǎng)和增殖停止。盡管不是共價(jià)結(jié)合，但鵝膏蕈堿(amanitin)和RNA-聚合酶 II之間的復(fù)合物非常緊密(KD = 3nM)。鵝膏蕈堿與酶解離是非常緩慢的過(guò)程，這使得受影響的細(xì)胞不可能恢復(fù)。當(dāng)轉(zhuǎn)錄抑制持續(xù)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)時(shí)，細(xì)胞將經(jīng)歷程序性細(xì)胞死亡(細(xì)胞凋亡)。上皮細(xì)胞黏附分子上皮細(xì)胞黏附分子(EpCAM，⑶326)是人腫瘤上研究得最為透徹的靶抗原之一 (Trzpis等，2007 ；Baeuerle和Gires, 2007)。其代表表觀分子量為40kDa的314個(gè)氨基酸的I型膜糖蛋白(Balzar等，1999)。其在大部分腺癌中過(guò)表達(dá)(Winter等，2003 ；Went等， 2004)。具體而言，在結(jié)節(jié)陽(yáng)性乳腺癌、上皮卵巢癌、膽管癌、胰腺癌和鱗狀細(xì)胞頭頸癌中， EpCAM表達(dá)增強(qiáng)。EpCAM表達(dá)增加在乳腺癌和膽囊癌中表示預(yù)后差(Gastl等，2000 ;Varga 等，2004 ；Spizzo等，2002 ；Spizzo等，2004)。重要的是，在乳房癌、結(jié)直腸癌和胰腺癌中通過(guò)腫瘤起始或癌癥干細(xì)胞來(lái)表達(dá)EpCAM(Al-Hajj等，2003 ；Dalerba等，2007 ；Li等，2007)。業(yè)已將EpCAM特異性單克隆抗體作為診斷工具用于檢測(cè)癌癥患者中少見(jiàn)的循環(huán)腫瘤細(xì)胞(Allard等，2004 ;Nagrath等，2007)。目前在臨床研究中調(diào)查幾種工程改造的抗-EpCAM抗體。鵝膏蕈毒素和抗體的綴合物本發(fā)明人早先的專(zhuān)利申請(qǐng)EP 1 859 811 Al (2007年11月28日公開(kāi))描述了其中 β-鵝膏蕈堿與清蛋白或與單克隆抗體HEA125、0KT3和PA-I偶聯(lián)的綴合物。此外，研究了這些綴合物對(duì)乳腺癌細(xì)胞(MCF-7)、伯基特氏淋巴瘤細(xì)胞(Raji)和T-淋巴瘤細(xì)胞(Jurkat) 增殖的抑制作用。構(gòu)成本發(fā)明基礎(chǔ)的技術(shù)問(wèn)題現(xiàn)有技術(shù)中需要靶結(jié)合部分毒素綴合物以極低濃度發(fā)揮其對(duì)靶細(xì)胞或組織的毒性作用。此外，現(xiàn)有技術(shù)中還需要治療其它疾病類(lèi)型，尤其是治療其它類(lèi)型的癌癥，特別是那些對(duì)實(shí)際腫瘤治療有治療抗性或反應(yīng)差的癌癥。
本發(fā)明滿(mǎn)足這些和其它的需要。例如，發(fā)明人在構(gòu)成本發(fā)明基礎(chǔ)的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，包含鵝膏蕈毒素和新的嵌合抗體huHEA125的綴合物能夠以比現(xiàn)有技術(shù)所述綴合物低得多的濃度抑制腫瘤細(xì)胞增殖。具體而言，包含鵝膏蕈毒素和嵌合抗體huHEA125的綴合物以在使用現(xiàn)有技術(shù)的綴合物時(shí)所需濃度的約百分之一的濃度發(fā)揮其抑制作用。此外，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)， 包含鵝膏蕈毒素和EpCAM特異性抗體的綴合物不僅能抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖，而且意想不到地亦能夠抑制胰腺癌細(xì)胞、結(jié)直腸癌細(xì)胞和膽管癌細(xì)胞的增殖。另外，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)選擇綴合物的鵝膏蕈毒素部分中的特定連接點(diǎn)，產(chǎn)生高度有效的靶結(jié)合部分毒素綴合物(尤其抗體毒素綴合物)，其以極低濃度(IC5tl大約ZxIO-12^xIO-11M)發(fā)揮其對(duì)靶細(xì)胞的毒性活性，并對(duì)其靶細(xì)胞具有高度特異性。不希望受特定理論的束縛，該后一優(yōu)點(diǎn)可得到解釋?zhuān)驗(yàn)轾Z膏蕈毒素是在靶細(xì)胞內(nèi)而不是在靶細(xì)胞外從靶結(jié)合部分鵝膏蕈毒素綴合物上被有效釋放。上述概述未必闡述本發(fā)明解決的所有問(wèn)題。發(fā)明簡(jiǎn)述在第一方面，本發(fā)明涉及一種用于治療患者的胰腺癌、膽管癌或結(jié)直腸癌的抗體毒素綴合物，其中綴合物包含(i)特異性結(jié)合上皮細(xì)胞黏附分子(EpCAM)表位的抗體或其抗原結(jié)合片段；(ii)鵝膏蕈毒素；和(iii)任選的連接體Li。在第二方面，本發(fā)明涉及一種抗體毒素綴合物，其包含(i)特異性結(jié)合上皮細(xì)胞黏附分子(EpCAM)的抗體或其抗原結(jié)合片段，其中抗體或其抗原結(jié)合片段包含(a) huHEA125重鏈，其中重鏈選自(al)SEQ ID NO=I的重鏈的膜結(jié)合形式，其中SEQ ID NO 3 所示的重鏈可變域VH，包含位于VH框架區(qū)中的0-10個(gè)氨基酸交換、0-10個(gè)氨基酸缺失和/ 或0-10個(gè)氨基酸插入，SEQ ID NO 26所示的重鏈恒定域包含0_10個(gè)氨基酸交換、0_10個(gè)氨基酸缺失和/或0-10個(gè)氨基酸插入；和(a2)SEQ ID NO 2的重鏈的可溶形式，其中SEQ ID NO 3所示的重鏈可變域VH包含位于VH框架區(qū)中的0_10個(gè)氨基酸交換、0_10個(gè)氨基酸缺失和/或0-10個(gè)氨基酸插入，SEQ ID NO :27所示的重鏈恒定域包含0-10個(gè)氨基酸交換、 0-10個(gè)氨基酸缺失和/或0-10個(gè)氨基酸插入；和(b)SEQ ID NO 11的huHEA125輕鏈，其中SEQ ID NO :12所示的輕鏈可變域VL包含位于VL框架區(qū)中的0-10個(gè)氨基酸交換、0-10 個(gè)氨基酸缺失和/或0-10個(gè)氨基酸插入，SEQ ID NO :28所示的輕鏈恒定域CL包含0-10 個(gè)氨基酸交換、0-10個(gè)氨基酸缺失和/或0-10個(gè)氨基酸插入；(ii)鵝膏蕈毒素；和(iii) 任選的連接體L2。在第三方面，本發(fā)明涉及一種用于醫(yī)藥的第二方面的抗體毒素綴合物。在第四方面，本發(fā)明涉及一種用于治療患者癌癥的第二方面的抗體毒素綴合物， 其中所述癌癥選自胰腺癌、膽管癌、乳腺癌和結(jié)腸癌。在第五方面，本發(fā)明涉及一種靶結(jié)合部分毒素綴合物，其包含(i)靶結(jié)合部分； (ii)鵝膏蕈毒素；和(iii)任選的連接體L3 ；其中所述鵝膏蕈毒素通過(guò)鵝膏蕈毒素3號(hào)氨基酸的δ C-原子與所述靶結(jié)合部分或可能存在的連接體L3連接。在第六方面，本發(fā)明涉及一種用于醫(yī)藥的第五方面的靶結(jié)合部分毒素綴合物。在第七方面，本發(fā)明涉及一種用于治療患者癌癥的第五方面的靶結(jié)合部分毒素綴合物，其中所述癌癥選自胰腺癌、膽管癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌、肺癌、前列腺癌、卵巢癌、胃癌、 腎癌、惡性黑色素瘤、白血病和惡性淋巴瘤。在第八方面，本發(fā)明涉及一種藥物組合物，其包含第一方面或第二方面的抗體毒素綴合物或第五方面的靶結(jié)合部分毒素綴合物，且還包含一種或多種藥學(xué)上可接受的稀釋劑、載體、賦形劑、填充劑、粘合劑、潤(rùn)滑劑、助流劑、崩解劑、吸附劑和/或防腐劑。該發(fā)明概述未必闡述本發(fā)明的所有特征。附圖簡(jiǎn)述

圖1顯示不同鵝膏蕈毒素的結(jié)構(gòu)式。粗體數(shù)字(1-8)指出形成鵝膏蕈毒素的8個(gè)氨基酸的標(biāo)準(zhǔn)編號(hào)。用希臘字母α、β、Y和δ標(biāo)出3號(hào)氨基酸中最重要的碳原子。亦顯示(取代的)色氨酸即4號(hào)氨基酸側(cè)鏈的原子編號(hào)(1’ _7’號(hào))。圖2顯示通過(guò)結(jié)合競(jìng)爭(zhēng)分析比較的huHEA125-Ama和huHEA125與靶細(xì)胞的結(jié)合親和力。將表達(dá)EpCAM的Colo205細(xì)胞與固定量的直接FITC-標(biāo)記的小鼠HEA125抗體孵育。 通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析與靶細(xì)胞的結(jié)合。漸增量的huHEA125-Ama或huHEA125的結(jié)合競(jìng)爭(zhēng)顯示對(duì)靶抗原的親和力極為相似。圖3顯示通過(guò)間接免疫熒光檢測(cè)的不同癌細(xì)胞系中EpCAM抗原的表面表達(dá)圖 3A Capan-I (人胰腺癌)；圖3B Colo205 (人結(jié)腸腺癌)；圖3C OZ (人膽管癌)；和圖3D MCF-7(人乳腺癌系)；圖3E BxPC-3(人胰腺癌)；和圖3F PC_3(人前列腺癌)。各圖左邊的灰色陰影柱狀圖顯示用對(duì)照抗體Xolair 獲得的結(jié)果；各圖右邊具有白色區(qū)域的柱狀圖顯示用抗體huHEA125獲得的結(jié)果。圖4顯示由具鵝膏蕈堿的抗體huHEA125、具鵝膏蕈堿的對(duì)照抗體Xolair 和游離鵝膏蕈堿引起的抑制Capan-I細(xì)胞增殖的比較。圖5顯示由具鵝膏蕈堿的抗體huHEA125、具鵝膏蕈堿的對(duì)照抗體Xolair 和游離鵝膏蕈堿引起的抑制Colo205細(xì)胞增殖的比較。圖6顯示由具鵝膏蕈堿的抗體huHEA125、具鵝膏蕈堿的對(duì)照抗體Xolair 和游離鵝膏蕈堿引起的抑制MCF-7細(xì)胞增殖的比較。圖7顯示由具鵝膏蕈堿的抗體huHEA125、具鵝膏蕈堿的對(duì)照抗體Xolair 和游離鵝膏蕈堿引起的抑制OZ細(xì)胞增殖的比較。圖8顯示由具鵝膏蕈堿的抗體huHEA125、具鵝膏蕈堿的對(duì)照抗體Xolair 和游離鵝膏蕈堿引起的抑制BxPC-3細(xì)胞增殖。圖9顯示用huHEA125_鵝膏蕈堿治療后在N0D/SCID小鼠中的BxPC_3腫瘤異種移植物的生長(zhǎng)抑制。圖10顯示用huHEA125_鵝膏蕈堿治療后在N0D/SCID小鼠中的PC_3腫瘤異種移植物的生長(zhǎng)抑制。發(fā)明詳述^X在下文詳述本發(fā)明之前，應(yīng)該理解本發(fā)明不限于本文所述的特定方法、方案和試劑，因?yàn)檫@些可變化。亦應(yīng)理解本文所用術(shù)語(yǔ)僅用于描述特定實(shí)施方案的目的，并非旨在限制僅由所附權(quán)利要求限定的本發(fā)明范圍。除非另外定義，否則本文所用所有技術(shù)及科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所通常理解的相同含義。優(yōu)選本文所用術(shù)語(yǔ)按照以下文獻(xiàn)所述進(jìn)行定義“A multilingual glossary of biotechnological terms (IUPAC Recommendations) Leuenberger, H. G. W, Nagel, B.禾口 Kolbl, H.主編(1995), Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel, Switzerland)。
除非上下文另有要求，否則貫穿本說(shuō)明書(shū)及以上權(quán)利要求，用詞“包含”及變體例如“包括”和“含有”應(yīng)理解為表示包括所述整數(shù)或步驟或者整數(shù)群或步驟群，但不排除任何其它的整數(shù)或步驟或者整數(shù)群或步驟群。本說(shuō)明書(shū)通篇引用若干文獻(xiàn)。本文引用的每篇文獻(xiàn)(包括所有專(zhuān)利、專(zhuān)利申請(qǐng)、科學(xué)出版物、制造商說(shuō)明書(shū)、操作指南、GenBank登錄號(hào)序列提交等)，不管是上文還是下文， 皆以其整體通過(guò)引用結(jié)合到本文中。本文不應(yīng)解釋為承認(rèn)本發(fā)明無(wú)權(quán)由于先前發(fā)明而早于這些公開(kāi)。本文所用術(shù)語(yǔ)“靶結(jié)合部分”指可特異性結(jié)合靶分子或靶表位的任何分子或分子部分。本申請(qǐng)上下文中的優(yōu)選靶結(jié)合部分為(i)抗體或其抗原結(jié)合片段；(ii)抗體樣蛋白質(zhì)；和(iii)核酸適配體。適合用于本發(fā)明的“靶結(jié)合部分”通常具有40000Da(40kDa)以上的分子量。本申請(qǐng)上下文中，術(shù)語(yǔ)“靶分子”和“靶表位”分別指各由靶結(jié)合部分特異性結(jié)合的抗原和抗原表位，優(yōu)選靶分子為腫瘤相關(guān)抗原，特別是與非腫瘤細(xì)胞表面相比以增加的濃度和/或不同空間構(gòu)型存在于一種或多種腫瘤細(xì)胞類(lèi)型表面上的抗原或表位。優(yōu)選所述抗原或表位存在于一種或多種腫瘤細(xì)胞類(lèi)型表面而非非腫瘤細(xì)胞表面上。本文所用術(shù)語(yǔ)“抗體或其抗原結(jié)合片段”指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即含有免疫特異性結(jié)合抗原的抗原結(jié)合位點(diǎn)的分子。亦包含通過(guò)包括諸如噬菌體展示等技術(shù)選擇的特異性結(jié)合靶分子(例如靶蛋白EpCAM)的免疫球蛋白樣蛋白質(zhì)。本發(fā)明免疫球蛋白分子可為免疫球蛋白分子的任何類(lèi)型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、 IgA和IgY)、種類(lèi)(例如IgGU IgG2、IgG3、IgG4、IgAl和IgA2)或亞類(lèi)。適合用于本發(fā)明的“抗體及其抗原結(jié)合片段”，包括但不限于多克隆抗體、單克隆抗體、單價(jià)抗體、雙特異性抗體、異種綴合抗體、多特異性抗體、人抗體、人源化抗體(特別是CDR-嫁接的)、去免疫化(deimmunized)抗體或嵌合抗體、單鏈抗體(例如scFv)、Fab片段、F(ab' )2片段、由 Fab表達(dá)文庫(kù)產(chǎn)生的片段、雙抗體或四抗體(tetrabody) (Holliger P.等，1993)、納米抗體 (nanobody)、抗獨(dú)特型(抗-Id)抗體(包括例如抗本發(fā)明抗體的抗-Id抗體)和以上任一種的表位結(jié)合片段。在某些實(shí)施方案中，抗原結(jié)合片段為本發(fā)明的人抗原結(jié)合抗體片段，包括但不限于Fab、Fab'和F(ab' ) 2、Fd、單鏈Fv (scFv)、單鏈抗體、二硫鍵連接的Fv (dsFv)和包含VL 或VH結(jié)構(gòu)域的片段。包括單鏈抗體在內(nèi)的抗原結(jié)合抗體片段可包含單獨(dú)的一個(gè)或多個(gè)可變域，或與以下的整體或部分組合的一個(gè)或多個(gè)可變域鉸鏈區(qū)、CL、CHU CH2和CH3結(jié)構(gòu)域。亦包括在本發(fā)明中的是還包含一個(gè)或多個(gè)可變域與鉸鏈區(qū)、CL、CH1、CH2和CH3結(jié)構(gòu)域的任何組合的抗原結(jié)合片段?？捎糜诒景l(fā)明的抗體可來(lái)自任何動(dòng)物來(lái)源，包括鳥(niǎo)類(lèi)和哺乳動(dòng)物。優(yōu)選抗體來(lái)源為人、嚙齒動(dòng)物(例如小鼠和大鼠)、驢、綿羊、兔、山羊、豚鼠、駱駝、馬或雞。特別優(yōu)選抗體為人或鼠來(lái)源。本文所用“人抗體”包括具有人免疫球蛋白氨基酸序列的抗體，并包括分離自人免疫球蛋白文庫(kù)或分離自一種或多種人免疫球蛋白的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(其不表達(dá)內(nèi)源免疫球蛋白)的抗體，如例如Kucherlapati和Jakobovits的美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5，939，598所述。術(shù)語(yǔ)“抗體樣蛋白”指業(yè)已經(jīng)過(guò)工程改造(例如通過(guò)環(huán)誘變)以特異性結(jié)合靶分子的蛋白質(zhì)。通常這樣的抗體樣蛋白包含至少一個(gè)兩端均與蛋白質(zhì)支架連接的可變肽環(huán)。這種雙重結(jié)構(gòu)約束將抗體樣蛋白的結(jié)合親和力大大提高到可與抗體的結(jié)合親和力相比的水平?？勺冸沫h(huán)的長(zhǎng)度通常由10-20個(gè)氨基酸組成。支架蛋白可為具有良好溶解性的任何蛋白質(zhì)。優(yōu)選支架蛋白為小球狀蛋白?？贵w樣蛋白包括但不限于親和體(affibody)、抗運(yùn)載蛋白(anticalin)和設(shè)計(jì)的錨蛋白重復(fù)蛋白(綜述參見(jiàn)Binz等，2005)?？贵w樣蛋白可源自大的突變體文庫(kù)，例如可自大的噬菌體展示文庫(kù)淘選，并可以以與常規(guī)抗體類(lèi)似的方式分離。同樣，可通過(guò)組合誘變球狀蛋白質(zhì)上的表面暴露殘基來(lái)獲得抗體樣結(jié)合蛋白。術(shù)語(yǔ)“核酸適配體”指通過(guò)多輪體外選擇或SELEX(指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化 (systematic evolution of ligands by exponential enrichment))進(jìn)工禾呈改造以與靶分子結(jié)合的核酸分子(綜述參見(jiàn)Brody和Gold，2000)。核酸適配體可為DNA或RNA分子。適配體可含有修飾，例如修飾核苷酸，例如2’ -氟取代的嘧啶。術(shù)語(yǔ)“鵝膏蕈毒素”包括分離自鵝膏屬(Amanita)并在參考資料(Wieland， Τ.和Faulstich H.，1978)中描述的由8個(gè)氨基酸組成的所有環(huán)肽；還包括其所有的化學(xué)衍生物；還包括其所有的半合成類(lèi)似物；還包括其所有根據(jù)天然化合物的主結(jié)構(gòu)由結(jié)構(gòu)單元構(gòu)建的合成類(lèi)似物(環(huán)狀，8個(gè)氨基酸)；還包括含有非羥基化氨基酸取代羥基化氨基酸的所有合成或半合成類(lèi)似物；還包括這樣的所有合成或半合成類(lèi)似物其中硫醚亞砜部分被硫化物(sulfide)、砜取代，或被不同于硫的原子取代，例如被鵝膏蕈堿的卡巴類(lèi)似物 (carbaanalog)中的碳原子取代。鵝膏蕈毒素在功能上被定義為抑制哺乳動(dòng)物RNA聚合酶II的肽或酯肽。優(yōu)選鵝膏蕈毒素為具有可與連接體分子或蛋白質(zhì)(例如抗體或抗體片段)反應(yīng)的官能團(tuán)(例如羧基、氨基、羥基、硫醇基或硫醇捕獲基團(tuán))的那些。特別適于本發(fā)明綴合物的鵝膏蕈毒素為圖1所示的α-鵝膏蕈堿、β-鵝膏蕈堿、Y-鵝膏蕈堿、ε-鵝膏蕈堿、鵝膏素(amanin)、 三羥鵝膏毒肽酰胺(amaninamide)、鵝膏無(wú)毒環(huán)肽(amanullin)和一羥鵝膏毒肽羧酸 (amanullinic acid)以及其鹽、化學(xué)衍生物、半合成類(lèi)似物和合成類(lèi)似物。特別優(yōu)選用于本發(fā)明的鵝膏蕈毒素為α-鵝膏蕈堿、鵝膏蕈堿和三羥鵝膏毒肽酰胺。本文所用化合物的“衍生物”，指具有與該化合物相似的化學(xué)結(jié)構(gòu)但含有至少一個(gè)該化合物中不存在的化學(xué)基團(tuán)和/或缺乏至少一個(gè)該化合物中存在的化學(xué)基團(tuán)的物質(zhì)。該化合物相對(duì)于其衍生物被稱(chēng)為“母體”化合物。通?？稍谝粋€(gè)或多個(gè)化學(xué)反應(yīng)步驟中從母體化合物產(chǎn)生“衍生物”。本文所用化合物的“類(lèi)似物”與該化合物在結(jié)構(gòu)上相關(guān)但不相同，并表現(xiàn)出該化合物的至少一種活性。該化合物相對(duì)于其類(lèi)似物被稱(chēng)為“母體”化合物。前述活性包括但不限于與另一化合物的結(jié)合活性；抑制活性，例如酶抑制活性；毒性作用；激活活性，例如激活酶的活性。不要求類(lèi)似物表現(xiàn)出與母體化合物同樣的程度的這樣的活性。在本申請(qǐng)上下文中將某化合物認(rèn)為是類(lèi)似物的條件是，其表現(xiàn)出母體化合物活性的至少(更優(yōu)選至少5%、更優(yōu)選至少10%、更優(yōu)選至少20%、更優(yōu)選至少30%、更優(yōu)選至少40%和更優(yōu)選至少50% )程度的相關(guān)活性。因而，本文所用“鵝膏蕈毒素類(lèi)似物”指這樣的化合物其在結(jié)構(gòu)上與圖1所示的α-鵝膏蕈堿、β-鵝膏蕈堿、γ-鵝膏蕈堿、鵝膏蕈堿、鵝膏素、三羥鵝膏毒肽酰胺、鵝膏無(wú)毒環(huán)肽和一羥鵝膏毒肽羧酸中的任何一種相關(guān)，且與α-鵝膏蕈堿、鵝膏蕈堿、Y-鵝膏蕈堿、鵝膏蕈堿、鵝膏素、三羥鵝膏毒肽酰胺、鵝膏無(wú)毒環(huán)肽和一羥鵝膏毒肽羧酸中的至少一種相比，表現(xiàn)出對(duì)哺乳動(dòng)物RNA聚合酶II的抑制活性的至少1 % (更優(yōu)選至少5 %、更優(yōu)選至少10 %、更優(yōu)選至少20 %、更優(yōu)選至少30 %、更優(yōu)選至少 40%和更優(yōu)選至少50%)。適合用于本發(fā)明的“鵝膏蕈毒素類(lèi)似物”甚至可表現(xiàn)出比α-鵝膏蕈堿、β-鵝膏蕈堿、γ-鵝膏蕈堿、鵝膏蕈堿、鵝膏素、三羥鵝膏毒肽酰胺、鵝膏無(wú)毒環(huán)肽或一羥鵝膏毒肽羧酸中任何一種更強(qiáng)的針對(duì)哺乳動(dòng)物RNA聚合酶II的抑制活性。可通過(guò)測(cè)定發(fā)生50%抑制的濃度(IC5tl值)來(lái)測(cè)量抑制活性。本申請(qǐng)上下文中的“連接體”，指增加兩個(gè)組分之間距離的分子，例如以便減少靶結(jié)合部分和鵝膏蕈毒素之間的空間干擾，否則這種干擾可能降低鵝膏蕈毒素與RNA聚合酶 II相互作用的能力。連接體可服務(wù)于另一個(gè)目的，因?yàn)槠淇纱龠M(jìn)鵝膏蕈毒素在由靶結(jié)合部分靶向的細(xì)胞中的特異性釋放。優(yōu)選連接體和優(yōu)選一側(cè)的連接體和鵝膏蕈毒素之間的鍵和另一側(cè)的連接體和抗體之間的鍵在細(xì)胞外的生理?xiàng)l件(例如血液)下穩(wěn)定，同時(shí)其可在細(xì)胞內(nèi)被切割，特別是在靶細(xì)胞內(nèi)，例如癌癥細(xì)胞或免疫細(xì)胞內(nèi)。為了提供這種選擇性的穩(wěn)定性，連接體可包含優(yōu)選對(duì)PH敏感的官能性，以產(chǎn)生對(duì)ρΗ敏感的連接體，例如S. Fletcher, Μ. R. Jorgensens 和 A. D. Miller ；Org. Lett. 2004，6 (23)，第 4245-4248 頁(yè)中所述；或可包含對(duì)蛋白酶敏感的官能性，以產(chǎn)生對(duì)蛋白酶敏感的連接體，例如L. DA Ibsen, Blood 2003， 102,1458-65 Francisco JA, Cerreny CG, Meyer DL, Nat. Biotechnol 2003,21,778-84 中所述。或者，連接連接體與靶結(jié)合部分的鍵可提供選擇性的穩(wěn)定性。優(yōu)選連接體具有至少 1 個(gè)、優(yōu)選 1-20 個(gè)原子的長(zhǎng)度(例如 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、 19或20個(gè)原子)，其中連接體一側(cè)與鵝膏蕈毒素反應(yīng)，另一側(cè)與靶結(jié)合部分反應(yīng)。在本發(fā)明上下文中，連接體優(yōu)選為任選取代的C1J-烷基、CV2tl-雜烷基、c2_2(1-烯基、c2_2(1-雜烯基、 c2_20-炔基、c2_2(l-雜炔基、環(huán)烷基、雜環(huán)烷基、芳基、雜芳基、芳烷基或雜芳烷基。連接體可含有一種或多種結(jié)構(gòu)元件，例如酰胺、酯、醚、硫醚、二硫化物、烴部分等。連接體亦可含有這些結(jié)構(gòu)元件中兩種以上的的組合。這些結(jié)構(gòu)元件中每一種可在連接體中出現(xiàn)多于一次，例如兩次、三次、四次、五次或六次。在某些實(shí)施方案中，連接體可包含二硫鍵。應(yīng)該理解，連接體必須在單個(gè)步驟或在兩個(gè)以上后續(xù)步驟中與鵝膏蕈毒素和靶結(jié)合部分連接。為此，連接體應(yīng)攜帶兩個(gè)基團(tuán)，優(yōu)選在近端和遠(yuǎn)端，其可(i)與優(yōu)選為鵝膏蕈毒素或靶結(jié)合肽上的活化基團(tuán)的基團(tuán)形成共價(jià)鍵；或(ii)其可被或被活化以與鵝膏蕈毒素上的基團(tuán)形成共價(jià)鍵。 因此，若存在連接體，則優(yōu)選化學(xué)基團(tuán)在連接體的遠(yuǎn)端和近端，其為諸如酯、醚、尿烷、肽鍵等這樣的偶聯(lián)反應(yīng)的結(jié)果。任選存在“連接體”，即在本發(fā)明靶結(jié)合部分毒素綴合物的某些實(shí)施方案中毒素可直接與靶結(jié)合部分的殘基連接。優(yōu)選連接體經(jīng)由鍵直接與靶向部分優(yōu)選在其末端連接。若靶結(jié)合部分包含游離氨基、羧基或巰基，例如呈可包含在多肽中的Asp、 Glu, Arg, Lys, Cys殘基形式，那么優(yōu)選連接體與這樣的基團(tuán)偶聯(lián)。如本文所用，若第一種化合物(例如抗體)對(duì)于第二種化合物(例如抗原，例如靶蛋白質(zhì))具有以下解離常數(shù)KD，則認(rèn)為其與所述第二種化合物“特異性結(jié)合” 100 μ M或更小、優(yōu)選50 μ M或更小、優(yōu)選30 μ M或更小、優(yōu)選20 μ M或更小、優(yōu)選10 μ M或更小、優(yōu)選5 μ M 或更小、更優(yōu)選ι μ M或更小、更優(yōu)選900ηΜ或更小、更優(yōu)選800ηΜ或更小、更優(yōu)選700ηΜ或更小、更優(yōu)選600ηΜ或更小、更優(yōu)選500ηΜ或更小、更優(yōu)選400ηΜ或更小、更優(yōu)選300ηΜ或更小、更優(yōu)選200ηΜ或更小、甚至更優(yōu)選IOOnM或更小、甚至更優(yōu)選90ηΜ或更小、甚至更優(yōu)選 80ηΜ或更小、甚至更優(yōu)選70ηΜ或更小、甚至更優(yōu)選60ηΜ或更小、甚至更優(yōu)選50ηΜ或更小、 甚至更優(yōu)選40ηΜ或更小、甚至更優(yōu)選30ηΜ或更小、甚至更優(yōu)選20ηΜ或更小和甚至更優(yōu)選IOnM或更小。本文所用“患者”意指可從用本文所述靶結(jié)合部分毒素綴合物治療獲益的任何哺乳動(dòng)物或鳥(niǎo)。優(yōu)選“患者”選自實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物(例如小鼠或大鼠)、家畜(包括例如豚鼠、兔、 驢、綿羊、山羊、雞、駱駝、馬、貓或狗)或包括人的靈長(zhǎng)類(lèi)。特別優(yōu)選“患者”為人。本文所用“治療”疾病或病癥意指實(shí)現(xiàn)以下一種或多種目的(a)減輕病癥的嚴(yán)重程度；(b)限制或預(yù)防待治療的病癥的癥狀特征的發(fā)展；(c)抑制待治療的病癥的癥狀特征惡化；(d)限制或預(yù)防先前患有病癥的患者的病癥的復(fù)發(fā)；和(e)限制或預(yù)防先前有病癥癥狀的患者的癥狀復(fù)發(fā)。本文所用"給予"包括體內(nèi)給予以及直接給予離體組織，例如靜脈移植物。“有效量”是治療劑足以實(shí)現(xiàn)預(yù)期目的的量。給定治療劑的有效量會(huì)隨多種因素變化，例如藥物的特性、給藥途徑、接受治療藥的動(dòng)物的大小和物種及給藥目的?？捎杉夹g(shù)人員按照本領(lǐng)域已建立的方法從經(jīng)驗(yàn)上確定每一單獨(dú)病例的有效量?！八帉W(xué)上可接受的，，意指由聯(lián)邦或州政府管理機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)，或在美國(guó)藥典或其它通用公認(rèn)藥典中列出用于動(dòng)物，更尤其是用于人。本發(fā)明實(shí)施方案現(xiàn)在將進(jìn)一步闡述本發(fā)明。在以下段落中，更詳細(xì)地解釋了本發(fā)明的不同方面。除非明確指出與此相反，否則所解釋的每一個(gè)方面可與任何其它一個(gè)或多個(gè)方面組合。特別地，指出為優(yōu)選或有利的任何特征可與任何其它指出為優(yōu)選或有利的特征組合。在第一方面，本發(fā)明涉及一種用于治療患者的胰腺癌、膽管癌或結(jié)直腸癌的抗體毒素綴合物，其中所述綴合物包含(i)特異性結(jié)合上皮細(xì)胞黏附分子(EpCAM)表位的抗體或其抗原結(jié)合片段；(ii)鵝膏蕈毒素；和(iii)任選的連接體。在第一方面的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，抗體或其抗原結(jié)合片段選自雙抗體、四抗體、 納米抗體、嵌合抗體、去免疫化抗體、人源化抗體或人抗體。在第一方面的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，抗原結(jié)合片段選自Fab、F(ab，)2、Fd、Fv、單鏈Fv和二硫鍵連接的Fv (dsFv)。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，EpCAM表位為人EpCAM表位。在第一方面的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，抗體或其抗原結(jié)合片段包含(a)huHEA125 重鏈的CDR3結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO 22)；和/或(b) huHEA125輕鏈的CDR3結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO: 25)。在一個(gè)特別優(yōu)選實(shí)施方案中，抗體或其抗原結(jié)合片段包含SEQ ID N0:22和SEQ ID NO 25所示的這兩種CDR3結(jié)構(gòu)域。優(yōu)選抗體或其抗原結(jié)合片段另外包含以下一種或多種(a) huHEA125 重鏈的 CDR2 結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO 21) ； (b)huHEA125 重鏈的 CDRl 結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO 20) ； (c)huHEA125 輕鏈的 CDR2 結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO 24)；禾口 (d)huHEA125 輕鏈的 CDRl 結(jié)構(gòu)域(SEQ ID N0:23)。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，抗體或其抗原結(jié)合片段包含huHEA125重鏈的 CDR3 結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO 22)、CDR2 結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO 21)和 CDRl 結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO 20)。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，抗體或其抗原結(jié)合片段包含huHEA125輕鏈的CDR3結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO :25)、CDR2 結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO 24)和 CDRl 結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO 23)。在一個(gè)特別優(yōu)選實(shí)施方案中，抗體或其抗原結(jié)合片段包含重鏈和輕鏈的CDR3結(jié)構(gòu)域、CDR2結(jié)構(gòu)域和CDRl結(jié)構(gòu)域，即抗體或其抗原結(jié)合片段包含SEQ ID NO :20、21、22、23、24和25所示的氨基酸序列。在第一方面的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，抗體或其抗原結(jié)合片段包含huHEA125重鏈可變域(=VH) (SEQ ID NO 3)禾口 / 或 huHEA125 輕鏈可變域(=VL) (SEQ ID NO :12)。在一個(gè)特別優(yōu)選實(shí)施方案中，抗體或其抗原結(jié)合片段包含huHEA125的VH結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO 3)和 VL 結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO 12) 二者。在第一方面的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，抗體或其抗原結(jié)合片段包含huHEA125重鏈 (可溶形式，SEQ ID NO 2)和/或huHEA125輕鏈(SEQ ID N0:11)。在一個(gè)實(shí)施方案中， huHEA125重鏈和/或huHEA125輕鏈相互獨(dú)立地各包含可達(dá)20(例如1、2、3、4、5、6、7、8、 9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)個(gè)氨基酸交換、缺失或插入，其中這些氨基酸交換、缺失或插入可位于重鏈恒定域和/或輕鏈恒定域和/或重鏈可變域的框架區(qū)和/或輕鏈可變域的框架區(qū)中。在一個(gè)特別優(yōu)選實(shí)施方案中，抗體為包含huHEA125兩條重鏈(SEQ ID NO 2)和huHEA125兩條輕鏈(SEQ ID NO 11)的完全I(xiàn)gG抗體，其中一條重鏈經(jīng)由二硫鍵與一條輕鏈連接，兩條重鏈通過(guò)一個(gè)或兩個(gè)(優(yōu)選兩個(gè))二硫鍵彼此連接。在第一方面的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，抗體或其抗原結(jié)合片段包含huHEA125重鏈 (膜結(jié)合形式，SEQ ID NO 1)和/或huHEA125輕鏈(SEQ ID NO: 11)。在一個(gè)實(shí)施方案中， huHEA125重鏈和/或huHEA125輕鏈相互獨(dú)立地各包含可達(dá)20(例如1、2、3、4、5、6、7、8、 9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)個(gè)氨基酸交換、缺失或插入，其中這些氨基酸交換、缺失或插入可位于重鏈恒定域和/或輕鏈恒定域和/或重鏈可變域的框架區(qū)和/或輕鏈可變域的框架區(qū)中。在一個(gè)特別優(yōu)選實(shí)施方案中，抗體為包含huHEA125的兩條重鏈(SEQ ID NO 1)和huHEA125的兩條輕鏈(SEQ ID NO 11)的完全I(xiàn)gG抗體，其中一條重鏈經(jīng)由二硫鍵與一條輕鏈連接，兩條重鏈通過(guò)一個(gè)或兩個(gè)(優(yōu)選兩個(gè))二硫鍵彼此連接。在第一方面的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，鵝膏蕈毒素選自α-鵝膏蕈堿、鵝膏蕈堿、Y-鵝膏蕈堿、ε_(tái)鵝膏蕈堿、鵝膏素、三羥鵝膏毒肽酰胺、鵝膏無(wú)毒環(huán)肽和一羥鵝膏毒肽羧酸(均示于圖1)以及其鹽、化學(xué)衍生物、半合成類(lèi)似物和合成類(lèi)似物。特別優(yōu)選鵝膏蕈毒素為α-鵝膏蕈堿、鵝膏蕈堿和三羥鵝膏毒肽酰胺以及其鹽、化學(xué)衍生物、半合成類(lèi)似物和合成類(lèi)似物。在第一方面的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，鵝膏蕈毒素通過(guò)鵝膏蕈毒素3號(hào)氨基酸的 Sc-原子(見(jiàn)圖1)與抗體或可能存在的連接體Ll連接。在可用于本發(fā)明的優(yōu)選鵝膏蕈毒素中，所述3號(hào)氨基酸為異亮氨酸、Y-羥基異亮氨酸或Y，δ-二羥基異亮氨酸。在第一方面的優(yōu)選實(shí)施方案中，鵝膏蕈毒素通過(guò)與鵝膏蕈毒素3號(hào)氨基酸的 δ C-原子結(jié)合的氧原子與抗體或可能存在的連接體Ll連接。進(jìn)一步優(yōu)選鵝膏蕈毒素通過(guò)酯鍵、醚鍵或尿烷鍵與抗體或可能存在的連接體Ll連接。在這些實(shí)施方案中，優(yōu)選3號(hào)氨基酸為Y，S-二羥基異亮氨酸。在第一方面的優(yōu)選實(shí)施方案中，抗體通過(guò)抗體中存在的氨基與鵝膏蕈毒素或可能存在的連接體Ll連接。在第一方面的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，連接體Ll為任選取代的烷基、雜烷基、烯基、 雜烯基、炔基、雜炔基、環(huán)烷基、雜環(huán)烷基、芳基、雜芳基、芳烷基或雜芳烷基。在第一方面的另外的優(yōu)選實(shí)施方案中，連接體Ll包含二硫鍵。在第二方面，本發(fā)明涉及一種抗體毒素綴合物，其包含(i)特異性結(jié)合上皮細(xì)胞黏附分子(EpCAM)的抗體或其抗原結(jié)合片段，其中所述抗體或其抗原結(jié)合片段包含(a) huHEA125重鏈，其中所述重鏈選自(al)SEQ ID NO 1的重鏈膜結(jié)合形式，其中SEQ ID NO:3所示的重鏈可變域VH包含位于VH框架區(qū)中的0-10 (例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10) 個(gè)氨基酸交換、0-10(例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)個(gè)氨基酸缺失和/或0_10 (例如0、
1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)個(gè)氨基酸插入，SEQID NO :26所示的重鏈恒定域包含0_10 (例如 0、1、2、3、4、5、6、7、8、9 或 10)個(gè)氨基酸交換、0-10 (例如 0、1、2、3、4、5、6、7、8、9 或 10)個(gè)氨基酸缺失和/或0-10(例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)個(gè)氨基酸插入；和(a2) SEQ ID NO :2的重鏈可溶形式，其中SEQ ID NO :3所示的重鏈可變域VH包含位于VH框架區(qū)中的 0-10(例如 0、1、2、3、4、5、6、7、8、9 或 10)個(gè)氨基酸交換、0-10 (例如 0、1、2、3、4、5、6、7、8、 9或10)個(gè)氨基酸缺失和/或0-10(例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)個(gè)氨基酸插入，SEQ ID NO :27所示的重鏈恒定域包含0-10(例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)個(gè)氨基酸交換、 0-10(例如 0、1、2、3、4、5、6、7、8、9 或 10)個(gè)氨基酸缺失和 / 或 0-10 (例如 0、1、2、3、4、5、6、 7、8、9或10)個(gè)氨基酸插入；和(b) SEQID NO :11的huHEA125輕鏈，其中SEQ ID NO: 12所示的輕鏈可變域VL包含位于VL框架區(qū)中的0-10(例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)個(gè)氨基酸交換、0_10(例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)個(gè)氨基酸缺失和/或0_10(例如0、1、
2、3、4、5、6、7、8、9或10)個(gè)氨基酸插入，SEQID NO :28所示的輕鏈恒定域CL包含0_10 (例如 0、1、2、3、4、5、6、7、8、9 或 10)個(gè)氨基酸交換、0-10 (例如 0、1、2、3、4、5、6、7、8、9 或 10)個(gè)氨基酸缺失和/或0-10(例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)個(gè)氨基酸插入；(ii)鵝膏蕈毒素；和(iii)任選的連接體。在第二方面的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，抗體或其抗原結(jié)合片段包含(a)huHEA125 重鏈，其中所述重鏈選自(al)SEQ ID NO 1的重鏈膜結(jié)合形式，其中SEQ ID NO :3所示的重鏈可變域州包含位于￥!1框架區(qū)中的0-10(例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)個(gè)氨基酸交換、0-10 (例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)個(gè)氨基酸缺失和/或0-10 (例如0、1、2、3、 4、5、6、7、8、9或10)個(gè)氨基酸插入；和(a2) SEQ ID NO :2的重鏈可溶形式，其中SEQ ID NO: 3所示的重鏈可變域VH包含位于VH框架區(qū)中的0-10 (例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10) 個(gè)氨基酸交換、0-10 (例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)個(gè)氨基酸缺失和/或0-10 (例如
0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或 10)個(gè)氨基酸插入；和(b) SEQ ID NO :11 的 huHEA125 輕鏈，其中 SEQ ID NO :12所示的輕鏈可變域VL包含位于VL框架區(qū)中的0-10(例如0、1、2、3、4、5、6、 7、8、9或10)個(gè)氨基酸交換、0-10 (例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)個(gè)氨基酸缺失和/或 0-10(例如 0、1、2、3、4、5、6、7、8、9 或 10)個(gè)氨基酸插入。在第二方面的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，抗體或其抗原結(jié)合片段包含(a)huHEA125 重鏈，其中所述重鏈選自(al)SEQ ID NO 1的重鏈膜結(jié)合形式，其中SEQ ID NO :3所示的重鏈可變域VH包含位于VH框架區(qū)中的0-10(例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)個(gè)氨基酸交換、氨基酸缺失和/或氨基酸插入，SEQ ID NO 26所示的重鏈恒定域包含0_10 (例如0、
1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)個(gè)氨基酸交換、氨基酸缺失和/或氨基酸插入；和(a2)SEQ ID NO :2的重鏈的可溶形式，其中SEQ ID NO :3所示的重鏈可變域VH包含位于VH框架區(qū)中的0-10 (例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)個(gè)氨基酸交換、氨基酸缺失和/或氨基酸插入， SEQ ID N0:27所示的重鏈恒定域包含0-10(例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)個(gè)氨基酸交換、氨基酸缺失和/或氨基酸插入；和(b)SEQ ID NO :11的huHEA125輕鏈，其中SEQ ID NO 12所示的輕鏈可變域VL包含位于VL框架區(qū)中的0-10 (例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或 10)個(gè)氨基酸交換、氨基酸缺失和/或氨基酸插入，SEQ ID NO 28所示的輕鏈恒定域CL包含0-10 (例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)個(gè)氨基酸交換、氨基酸缺失和/或氨基酸插入。在第二方面的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，抗體或其抗原結(jié)合片段包含(a)huHEA125 重鏈，其中所述重鏈選自(al)SEQ ID NO 1的重鏈膜結(jié)合形式，其中SEQ ID NO :3所示的重鏈可變域州包含位于￥!1框架區(qū)中的0-10(例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)個(gè)氨基酸交換，SEQ ID而26所示的重鏈恒定域包含0-10(例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)個(gè)氨基酸交換；和(a2)SEQ ID NO :2的重鏈的可溶形式，其中SEQ ID NO :3所示的重鏈可變域 VH包含位于VH框架區(qū)中的0-10(例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)個(gè)氨基酸交換，SEQ ID NO 27所示的重鏈恒定域包含0-10 (例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)個(gè)氨基酸交換；和 (b)SEQ ID NO :11的huHEA125輕鏈，其中SEQ ID NO 12所示的輕鏈可變域VL包含位于VL 框架區(qū)中的0-10(例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)個(gè)氨基酸交換，SEQ ID N0:28所示的輕鏈恒定域CL包含0-10 (例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)個(gè)氨基酸交換。在第二方面的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，抗體或其抗原結(jié)合片段包含(a)huHEA125 重鏈，其中所述重鏈選自(al)SEQ ID NO 1的重鏈膜結(jié)合形式；和(a2) SEQ ID NO 2的重鏈的可溶形式；和(b)SEQ ID NO 11的huHEA125輕鏈。在第二方面的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，抗體或其抗原結(jié)合片段選自嵌合抗體、去免疫化抗體、人源化抗體或人抗體。在第二方面的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，抗原結(jié)合片段選自 Fab、F(ab，)2 禾口 FcL在第二方面的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，抗體為huHEA125或其抗原結(jié)合片段。在第二方面的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，抗體或其抗原結(jié)合片段與人EpCAM特異性結(jié)
I=I O在第二方面的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，鵝膏蕈毒素選自α-鵝膏蕈堿、鵝膏蕈堿、Y-鵝膏蕈堿、ε_(tái)鵝膏蕈堿、鵝膏素、三羥鵝膏毒肽酰胺、鵝膏無(wú)毒環(huán)肽和一羥鵝膏毒肽羧酸(均示于圖1)，以及其鹽、化學(xué)衍生物、半合成類(lèi)似物和合成類(lèi)似物。特別優(yōu)選鵝膏蕈毒素為α-鵝膏蕈堿、鵝膏蕈堿，和三羥鵝膏毒肽酰胺，以及其鹽、化學(xué)衍生物、半合成類(lèi)似物和合成類(lèi)似物。在第二方面的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，鵝膏蕈毒素通過(guò)鵝膏蕈毒素3號(hào)氨基酸的 S C-原子(見(jiàn)圖1)與抗體或可能存在的連接體L2連接。在可用于本發(fā)明的優(yōu)選鵝膏蕈毒素中，所述3號(hào)氨基酸為異亮氨酸、Y-羥基異亮氨酸或Y，δ-二羥基異亮氨酸。在第二方面的優(yōu)選實(shí)施方案中，鵝膏蕈毒素通過(guò)與鵝膏蕈毒素3號(hào)氨基酸的 δ C-原子結(jié)合的氧原子與抗體或可能存在的連接體L2連接。進(jìn)一步優(yōu)選鵝膏蕈毒素通過(guò)酯鍵、醚鍵或尿烷鍵與抗體或可能存在的連接體L2連接。在這些實(shí)施方案中，優(yōu)選3號(hào)氨基酸為Y，S-二羥基異亮氨酸。在第二方面的優(yōu)選實(shí)施方案中，抗體通過(guò)抗體中存在的氨基與鵝膏蕈毒素或可能存在的連接體L2連接。在第二方面的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，連接體L2為任選取代的烷基、雜烷基、烯基、 雜烯基、炔基、雜炔基、環(huán)烷基、雜環(huán)烷基、芳基、雜芳基、芳烷基或雜芳烷基。在第五方面的另外的優(yōu)選實(shí)施方案中，連接體L2包含二硫鍵。在第三方面，本發(fā)明涉及用于醫(yī)藥的第二方面的綴合物。在第四方面，本發(fā)明涉及用于治療患者癌癥的第二方面的綴合物，其中所述癌癥選自胰腺癌、膽管癌、乳腺癌和結(jié)直腸癌。在第五方面，本發(fā)明涉及用于制備用于治療患者癌癥的藥物組合物的第二方面的綴合物，其中所述癌癥選自胰腺癌、膽管癌、乳腺癌和結(jié)直腸癌。在第五方面，本發(fā)明涉及一種靶結(jié)合部分毒素綴合物，其包含(i)靶結(jié)合部分； (ii)鵝膏蕈毒素；和(iii)任選的連接體L3 ；其中鵝膏蕈毒素通過(guò)鵝膏蕈毒素3號(hào)氨基酸、 優(yōu)選通過(guò)鵝膏蕈毒素3號(hào)氨基酸的δ C-原子(見(jiàn)圖1)與靶結(jié)合部分或可能存在的連接體 L3連接。在可用于本發(fā)明的優(yōu)選鵝膏蕈毒素中，所述3號(hào)氨基酸為異亮氨酸、γ-羥基異亮氨酸或Y，S-二羥基異亮氨酸。在第五方面的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，鵝膏蕈毒素通過(guò)與鵝膏蕈毒素3號(hào)氨基酸的S C-原子結(jié)合的氧原子與靶結(jié)合部分或可能存在的連接體L3連接。進(jìn)一步優(yōu)選鵝膏蕈毒素通過(guò)以下方式與靶結(jié)合部分或可能存在的連接體L3連接酯鍵，優(yōu)選呈鵝膏蕈毒素-O-C (0) -L3-靶結(jié)合部分或鵝膏蕈毒素-O-C (0)-靶結(jié)合部分形式，更優(yōu)選呈鵝膏蕈毒素-δ C-O-C (0)-L3-靶結(jié)合部分或鵝膏蕈毒素-δ C-O-C(O)-靶結(jié)合部分形式，最優(yōu)選呈鵝膏蕈毒素-δ CH2-O-C(O) -L3-靶結(jié)合部分或鵝膏蕈毒素-δ CH2-O-C(O)-靶結(jié)合部分形式；醚鍵，優(yōu)選呈鵝膏蕈毒素-0-L3或鵝膏蕈毒素-0-靶結(jié)合部分形式，優(yōu)選呈鵝膏蕈毒素-δ C-0-L3-靶結(jié)合部分或鵝膏蕈毒素-δ C-O-靶結(jié)合部分形式，更優(yōu)選呈鵝膏蕈毒素-δ CH2-0-L3-靶結(jié)合部分或鵝膏蕈毒素-δ CH2-O-靶結(jié)合部分形式；或尿烷鍵，優(yōu)選呈鵝膏蕈毒素-0-C(0)-NH-L3-靶結(jié)合部分或鵝膏蕈毒素-O-C(O)-NH-靶結(jié)合部分形式， 優(yōu)選呈鵝膏蕈毒素_ δ C-O-C(0)-NH-L3-靶結(jié)合部分或鵝膏蕈毒素-δ C-O-C(O)-NH-靶結(jié)合部分形式，即鵝膏蕈毒素_ S CH2-O-C(0)-NH-L3-靶結(jié)合部分或鵝膏蕈毒素-δ CH2-O-C (O)-NH-靶結(jié)合部分形式。在這些實(shí)施方案中，優(yōu)選3號(hào)氨基酸為Y，δ-二羥基異亮氨酸。在第五方面的優(yōu)選實(shí)施方案中，存在連接體L3，且綴合物具有以下結(jié)構(gòu)之一⑴鵝膏蕈毒素-SC-0-C(0)-L3-C(0)-NH-靶結(jié)合部分；(ii)鵝膏蕈毒素-SC-0-L3-C(0)-NH-靶結(jié)合部分；或(iii)鵝膏蕈毒素-SC-0-C(0)-NH-L3-C(0)-NH-靶結(jié)合部分，優(yōu)選⑴鵝膏蕈毒素-δ CH2-O-C(0) -L3-C(0) -NH-靶結(jié)合部分；(ii)鵝膏蕈毒素-δ CH2-0-L3_C(0) -NH-靶結(jié)合部分；或(iii)鵝膏蕈毒素_ δ CH2-O-C(0)-NH-L3-C(O)-NH-靶結(jié)合部分。在第五方面的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，靶結(jié)合部分通過(guò)靶結(jié)合部分中存在的氨基與鵝膏蕈毒素或可能存在的連接體L3連接。在第五方面的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，鵝膏蕈毒素選自α-鵝膏蕈堿、鵝膏蕈堿、Y-鵝膏蕈堿、ε_(tái)鵝膏蕈堿、鵝膏素、三羥鵝膏毒肽酰胺、鵝膏無(wú)毒環(huán)肽或一羥鵝膏毒肽羧酸(均示于圖1)，以及其鹽、化學(xué)衍生物、半合成類(lèi)似物和合成類(lèi)似物。特別優(yōu)選鵝膏蕈毒素為α-鵝膏蕈堿、鵝膏蕈堿，和三羥鵝膏毒肽酰胺，以及其鹽、化學(xué)衍生物、半合成類(lèi)似物和合成類(lèi)似物。在第五方面的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，連接體L3為任選取代的烷基、雜烷基、烯基、 雜烯基、炔基、雜炔基、環(huán)烷基、雜環(huán)烷基、芳基、雜芳基、芳烷基或雜芳烷基。在第五方面的另外的優(yōu)選實(shí)施方案中，連接體L3包含二硫鍵。在第五方面的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，靶結(jié)合部分與存在于腫瘤細(xì)胞上的表位特異性結(jié)合。特別優(yōu)選靶結(jié)合部分與上皮細(xì)胞黏附分子(EpCAM)的表位特異性結(jié)合。在第五方面的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，靶結(jié)合部分選自(i)抗體或其抗原結(jié)合片段；(ii)抗體樣蛋白；和(iii)核酸適配體。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，抗體或其抗原結(jié)合片段選自雙抗體、四抗體、納米抗體、嵌合抗體、去免疫化抗體、人源化抗體或人抗體。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，抗原結(jié)合片段選自Fab、F(ab' )2、Fd、Fv、單鏈Fv和二硫鍵連接的 Fv(dsFv)。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，抗體或其抗原結(jié)合片段包含(a)huHEA125重鏈的膜結(jié)合形式(SEQ ID NO 1)或 huHEA125 重鏈的可溶形式(SEQ ID NO 2)；和 / 或(b)huHEA125 輕鏈(SEQ ID NO :11)。在第六方面，本發(fā)明涉及用于醫(yī)藥的第五方面的靶結(jié)合部分毒素綴合物。在第七方面，本發(fā)明涉及用于治療患者的癌癥的第五方面的靶結(jié)合部分毒素綴合物，其中所述癌癥選自胰腺癌、膽管癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌、肺癌、前列腺癌、卵巢癌、胃癌、腎癌、惡性黑色素瘤、白血病和惡性淋巴瘤。在第八方面，本發(fā)明涉及一種藥物組合物，其包含第一方面或第二方面的抗體毒素綴合物或者第五方面的靶結(jié)合部分毒素綴合物，并還包含一種或多種藥學(xué)上可接受的稀釋劑、載體、賦形劑、填充劑、粘合劑、潤(rùn)滑劑、助流劑、崩解劑、吸附劑；和/或防腐劑。第五到第七實(shí)施方案的靶結(jié)合部分在優(yōu)選實(shí)施方案中是蛋白質(zhì)，尤其是抗體。蛋白質(zhì)尤其是抗體包含允許偶聯(lián)鵝膏蕈毒素的若干氨基酸。優(yōu)選氨基酸具有游離氨基、羥基或羰基，包括LyS、Gln、Glu、Asp、Asn、Thr和Ser。因此，一個(gè)蛋白質(zhì)分子可偶聯(lián)多于一個(gè)的鵝膏蕈毒素分子。每分子的鵝膏蕈毒素?cái)?shù)目增加亦將增加毒性。因此，在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，第一到第四實(shí)施方案的抗體和第五到第七實(shí)施方案的靶結(jié)合部分與鵝膏蕈毒素的比率為1個(gè)蛋白質(zhì)分子比1-15個(gè)鵝膏蕈毒素分子(優(yōu)選1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、 14或15個(gè))。為計(jì)算比率的目的，在IgG等二聚體(dimmer)情況下認(rèn)為該二聚體為一個(gè)分子。若靶結(jié)合部分不是蛋白質(zhì)，優(yōu)選相似的比率。特別優(yōu)選第八方面的藥物組合物可以全身性給予的藥物形式使用。這些包括胃腸外藥物，尤其包含注射劑和輸注劑。注射劑配制為安瓿或所謂即用型注射劑形式，例如即用型注射器或一次性注射器和除此之外的多次抽取的可穿刺瓶。可以以皮下(S. C)、肌內(nèi) (i.m.)、靜脈內(nèi)(i.v.)或皮內(nèi)(i.e.)施用形式給予注射劑。特別是可生產(chǎn)作為晶體混懸液、溶液、納米顆?；蚰z體分散體系(例如水溶膠)的各自合適的注射制劑?？蛇M(jìn)一步產(chǎn)生作為濃縮物的注射制劑，其可用水性等滲稀釋劑溶解或分散。亦可制備等滲溶液、脂肪乳劑、脂質(zhì)體制劑及微乳劑形式的輸注劑。與注射劑相似，亦可制備呈用于稀釋的濃縮物形式的輸注制劑。在住院病人和非臥床病人治療二者中，注射制劑亦可以固定輸注形式施用，例如通過(guò)微型泵。將以下物質(zhì)加到胃腸外藥物制劑中是可能的例如清蛋白、血漿、膨脹劑、表面活性物質(zhì)、有機(jī)稀釋劑、影響PH的物質(zhì)、絡(luò)合物質(zhì)或聚合物質(zhì)，尤其是作為影響本發(fā)明靶結(jié)合部分毒素綴合物吸附到蛋白質(zhì)或聚合物的物質(zhì)，或亦可加入它們旨在降低本發(fā)明靶結(jié)合部分毒素綴合物吸附到注射器械或包裝材料等材料(例如塑料或玻璃)上?？蓪⒈景l(fā)明靶結(jié)合部分毒素綴合物與胃腸外制品中的微載體或納米顆粒結(jié)合，例如與基于聚(甲基)丙烯酸酯、聚乳酸、聚乙醇酸(polyglycolate)、聚氨基酸或聚醚氨酯的細(xì)致分散的顆粒結(jié)合。亦可將胃腸外制劑改變?yōu)殚L(zhǎng)效制劑，例如，若將本發(fā)明靶結(jié)合部分毒素綴合物分別以細(xì)致分散的、分散的及混懸形式或作為藥物中的晶體混懸劑引入，則基于“多單位原理”；或若將本發(fā)明靶結(jié)合部分毒素綴合物包封入制劑中，例如片劑或隨后植入的棒中，則基于“單個(gè)單位原理”。這些在單個(gè)單位或多單位制劑中的植入物或長(zhǎng)效藥物通常由所謂的生物可降解聚合物組成，所述聚合物例如乳酸和乙醇酸的聚酯、聚醚氨酯、聚氨基酸、聚(甲基)丙烯酸酯或聚糖。在制備配制為胃腸外制劑的本發(fā)明藥物組合物期間加入的輔料和載體，優(yōu)選分別為消毒水(無(wú)菌水)；影響PH值的物質(zhì)，例如有機(jī)或無(wú)機(jī)酸或堿以及其鹽、用于調(diào)節(jié)pH值的緩沖物質(zhì)；用于等滲的物質(zhì)，例如氯化鈉、碳酸氫鈉、葡萄糖和果糖；表面活性劑(tenside 和surfactant)；以及乳化劑，例如聚氧乙烯失水山梨糖醇的脂肪酸偏酯(例如Tween )或例如聚氧乙烯的脂肪酸酯(例如Cremophor )，脂肪油例如花生油、大豆油或蓖麻油，脂肪酸的合成酯例如油酸乙酯、肉豆蔻酸異丙酯和中性油(例如Miglyol )；以及聚合物輔料等，例如明膠、右旋糖苷、聚乙烯吡咯烷酮；提高有機(jī)溶劑溶解度的添加劑，例如丙二醇、乙醇、N，N-二甲基乙酰胺、丙二醇；或形成絡(luò)合物的物質(zhì)，例如檸檬酸鹽和脲；防腐劑，例如苯甲酸羥基丙酯和苯甲酸甲酯、苯甲醇；抗氧化劑，例如亞硫酸鈉；和穩(wěn)定劑，例如EDTA。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，當(dāng)將本發(fā)明藥物組合物配制為混懸劑時(shí)，加入增稠劑以防止本發(fā)明靶結(jié)合部分毒素綴合物沉降，或加入表面活性劑及聚合物電解質(zhì)以確保沉淀物的可重懸性和/或加入絡(luò)合物形成劑例如EDTA。亦可獲得活性成分與不同聚合物的復(fù)合物。這樣的聚合物的實(shí)例為聚乙二醇、聚苯乙烯、羧甲基纖維素、Pluronics 或聚乙二醇山梨醇脂肪酸酯。本發(fā)明靶結(jié)合部分毒素綴合物亦可以例如與環(huán)糊精的包合物的形式加入到液體制劑中。在特定的實(shí)施方案中，可加入分散劑作為另外的輔料。對(duì)于冷凍干燥物的制備，可使用支架劑(scaffolding agent)，例如甘露醇、右旋糖苷、蔗糖、人清蛋白、乳糖、PVP 或多種明膠。在另一方面，本發(fā)明涉及一種治療有需要的患者的胰腺癌、膽管癌或結(jié)直腸癌的方法，所述方法包括給予患者有效量的第一方面的抗體毒素綴合物。在另一方面，本發(fā)明涉及一種治療有需要的患者的胰腺癌、膽管癌、乳腺癌或結(jié)直腸癌的方法，所述方法包括給予患者有效量的第三方面的抗體毒素綴合物。在另一方面，本發(fā)明涉及一種治療有需要的患者的胰腺癌、膽管癌、乳腺癌或結(jié)直腸癌的方法，所述方法包括給予患者有效量的第五方面的靶結(jié)合部分毒素綴合物。
實(shí)施例下面通過(guò)非限制性實(shí)施例來(lái)更詳細(xì)地說(shuō)明本發(fā)明實(shí)施例1 比較抗體huHEA125和抗體毒素綴合物鵝膏蕈堿_huHEA125之間的與靶細(xì)胞的結(jié)合親和力1. 1 嵌合抗體 huHEA125幾年前，發(fā)明人已建立了分泌抗EpCAM小鼠單克隆抗體HEA125的雜交瘤細(xì)胞系 (Moldenhauer等，1987 ；Momburg等，1987)。利用分子生物學(xué)技術(shù)重新構(gòu)建該雜交瘤細(xì)胞系，以產(chǎn)生由小鼠可變域鉤住人κ恒定輕鏈和人IgGl恒定重鏈組成的抗體嵌合版本。得到的抗體huHEA125以高親和力(Kd = 2. 2xlO"9M)和高特異性與EpCAM-表達(dá)細(xì)胞結(jié)合。 huHEA125免疫球蛋白的基因序列和氨基酸序列如下所示
huHEA125 重鏈肽序列重鏈，膜結(jié)合形式(IGHV/IGHD/IGHJ/IGHG1；在 IGHGl 下劃線)(SEQ ID NO 1)EVKLLESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFDFSRFWMTWVRQAPGKGLEWIGEINLDSSTINYTPSLKDKFI ISRDNAKNTLFLQMSKVRSEDTALYYCSRGISMDYffGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKD YFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHT CPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNffYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV YSYLTYLHQDffLNGKEYKCKYSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV EffESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRffQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGLQLDETCAEA QDGELDGLWTTITIFISLFLLSVCYSAAVTLFKVKWIFSSWELKQTLVPE^(匪 IGQAP肽序列重鏈，分泌形式(SEQ ID NO :2)EVKLLESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFDFSRFWMTWVRQAPGKGLEWIGEINLDSSTINYTPSLKDKFI ISRDNAKNTLFLQMSKVRSEDTALYYCSRGISMDYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKD YFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHT CPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK肽序列(IGHV/IGHD/IGHJ= VH 結(jié)構(gòu)域；框架區(qū) FR1、FR2、FR3 和 FR4 下劃線)(SEQ ID NO 3)EVKLLESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFDFSRFffMTffVRQAPGKGLEfflGEINLDSSTINYTPSLKDKFI ISRDNAKNTLFLQMSKVRSEDTALYYCSRGISMDYffGQGTSVTVSS核酸序列(按照IMGT-命名法注解，IGHV/IGHD/IGHJ ； IGHD下劃線；IGHJ雙下劃線)FRl (SEQ ID NO 4)GAAGTGAAGCTTCTCGAGTCTGGAGGTGGCCTGGTGCAGCCTGGAGGATCCCTGAAACTCTCCTGTGCA GCCTCACDRKSEQ ID NO 5)GGATTCGATTTTAGTAGATTCTGGFR2(SEQ ID NO 6)ATGACTTGGGTCCGGCAGGCTCCAGGGAAAGGGCTAGAATGGATTGGAGAACDR2(SEQ ID NO 7)ATTAATCTAGATAGCAGTACGATAFR3(SEQ ID NO 8) AACTATACGCCATCTCTAAAGGATAAATTCATCATCTCCAGGGACAACGCCAAAAATACGCTGTTCCTG CAAATGAGCAAAGTGAGATCTGAGGACACAGCCCTTTATTACTGTCDR3(SEQ ID NO 9)TCAAGA GGTATTTCTATGGACTACFR4(SEQ ID NO 10)TGGGGTCAGGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCAhuHEA125 輕鏈肽序列輕鏈(IGKV/IGKJ/IGKC；在 IGKC 下劃線)(SEQ ID NO 11)DILLTQSPAILSVSPGERVSFSCRASQSIGISLHWYQQRPSDSPRLLIKYASESISGIPSRFSGSGSGT DFTLSINSVESEDIADYYCQQSNIffPTTFGAGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKV QffKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC肽序歹Ij(IGKV/IGKJ = VL 結(jié)構(gòu)域；框架區(qū) FRl、FR2、FR3 和 FR4 下劃線)(SEQ ID NO 12)DILLTQSPAILSVSPGERVSFSCRASQSIGISLHWYQQRPSDSPRLLIKYASESISGIPSRFSGSGSGT DFTLSINSVESEDIADYYCQQSNIffPTTFGAGTKLELK核酸序列(按照IMGT-命名法注解，IGKV/IGKJ ；IGKV下劃線；IGKJ雙下劃線)FRl (SEQ ID NO 13)GACATCTTGCTGACTCAGTCTCCAGCCATCCTGTCTGTGAGTCCAGGAGAAAGAGTCAGTTTCTCCTGC AGGGCCAGTCDRl (SEQ ID NO 14)CAGAGCATTGGCATAAGTFR2(SEQ ID NO 15)TTACACTGGTATCAGCAAAGACCAAGTGATTCTCCAAGGCTTCTCATAAAGCDR2(SEQ ID NO 16)TATGCTTCTFR3(SEQ ID NO 17)GAGTCAATCTCTGGGATCCCTTCCAGGTTTAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTTACTCTTAGCATC AACAGTGTGGAGTCTGAAGATATTGCAGATTATTACTGTCDR3(SEQ ID NO 18 CAACAAAGTAATATCTGGCCAAC CACGFR4(SEQ ID NO 19)
TTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAA A1. 2 對(duì)照抗體 Xolair 對(duì)照抗體Xolair (Omalizumab，針對(duì)人IgE免疫球蛋白的人IgGl抗體)由 Novartis, Germany 生產(chǎn)。1.3α-鵝膏蕈堿抗體綴合物的合成1.3. Ia-鵝膏蕈堿-戊二酸的合成將在真空中經(jīng)P4O10干燥的3. Omg(3. 3 μ mol) a -鵝膏蕈堿溶解于0. 25ml無(wú)水吡啶中，并與0. Iml吡啶中的0.9π^(79μπιΟ1)戊二酐在室溫黑暗處反應(yīng)M小時(shí)。通過(guò)加入 7ml無(wú)水二乙醚使肽沉淀，離心，用二乙醚再次洗滌固體并離心。通過(guò)該反應(yīng)獲得α -鵝膏蕈堿衍生物，其中札=-OH(在圖1中)被R1 =-O-C (0) - (CH2) 3-C00H 取代。1.3.2α-鵝膏蕈堿-戊二酸N-羥基琥珀酰亞胺酯的合成
將3. ^ig的α-鵝膏蕈堿戊二酸(3. 3μπι01)溶解于0. 05ml無(wú)水二甲基甲酰胺 (DMF)中，并加入溶于0.01ml DMF中的2. 4mg(7當(dāng)量)的N-羥基琥珀酰亞胺。在加入0. Olml DMF中的1. 2mg 二環(huán)己基碳二亞胺后，使反應(yīng)繼續(xù)在室溫進(jìn)行16小時(shí)。將所形成的晶體與溶液分離，通過(guò)加入細(xì)1無(wú)水二乙醚使肽沉淀。離心后再用細(xì)1醚洗滌沉淀并離心。將固體溶于0. Iml 二甲基甲酰胺中，并立即用于與抗體溶液反應(yīng)。1.3.3α-鵝膏蕈堿-戊二酸_huHEA125的合成將3. Omg α -鵝膏蕈堿-戊二酸N-羥基琥珀酰亞胺酯的0. Iml溶液加入到 5ml PBS中的IOmg hu_HEA125抗體中，并在緩慢旋轉(zhuǎn)下于5°C在黑暗中反應(yīng)。16小時(shí)后， 將溶液施用到用PBS平衡的S印hadeXG25柱(120x 1. 5cm)上，并收集蛋白質(zhì)流分。用 13. 500cm-1 · Μ—1的鵝膏蕈毒素摩爾消光系數(shù)從蛋白質(zhì)溶液相對(duì)于含有同樣濃度的天然抗體的空白在310nm處的吸收差異，來(lái)分光光度測(cè)定鵝膏蕈堿的載量。該制品的α _鵝膏蕈堿IgG比率為大約8。1.4結(jié)合競(jìng)爭(zhēng)分析在競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)中通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析了鵝膏蕈堿_huHEA125綴合物對(duì)未綴合的 huHEA125抗體的結(jié)合。如以上1. 3. 1-1. 3. 3節(jié)所述合成α -鵝膏蕈堿-huHEA125綴合物。在FACS緩沖液(含熱滅活胎牛血清和0. 疊氮化鈉的Dulbecco氏PBS)中洗滌Colo205靶細(xì)胞(結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移)2次，計(jì)數(shù)并調(diào)整為每毫升hlO7個(gè)細(xì)胞。將50 μ 1細(xì)胞懸液加到96孔U形底微量滴定板的各孔中，用移液管加入50 μ 1/孔FITC-標(biāo)記的huHEA125 抗體。將400 μ g/ml-10ng/ml終稀釋度的鵝膏蕈堿_huHEA125或huHEA125的系列稀釋物一式三份以50 μ 1/孔的體積加入，并在冰上孵育1小時(shí)。隨后將板離心OOOOrpm下2分鐘)， 從細(xì)胞除掉上清液。用150 μ 1 FACS緩沖液重懸細(xì)胞，并再次離心。通過(guò)離心進(jìn)行兩次洗滌步驟后，將細(xì)胞吸收到100 μ 1/孔的碘化丙啶溶液(在FACS緩沖液中1 μ g/ml)中，以使能夠區(qū)分死細(xì)胞。在 FAC^can 細(xì)胞計(jì)數(shù)器(Becton and Dickinson,Heidelberg,Germany) 上利用CellQuest軟件進(jìn)行分析。如圖2所示，用漸增量的huHEA125_鵝膏蕈堿綴合物或未修飾的huHEA125抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合靶細(xì)胞顯示，貫穿競(jìng)爭(zhēng)抗體或抗體綴合物的10ng/ml-400y g/ml濃度范圍的結(jié)合強(qiáng)度類(lèi)似。因此，綴合步驟不顯著改變huHEA125-鵝膏蕈堿與靶細(xì)胞的親和力。實(shí)施例2 通過(guò)間接免疫熒光檢測(cè)EpCAM抗原在不同癌細(xì)胞系上的表面表達(dá)將細(xì)胞系Capan-I、Colo205、0Z、MCF-7、BxPC-3 和 PC-3 首先與 huHEA125 或 Xolair 孵育。在洗滌后，通過(guò)FITC-標(biāo)記的F(ab，)2山羊抗人IgG(H+L)作為第二步的試劑將第一抗體的結(jié)合可視化。結(jié)果示于圖3A (Capan-I)、圖;3B(ColO205)、圖3C (OZ)、圖 3D(MCF-7)、圖3E(BxPC-3)和圖3F(PC_3)中。各圖左邊灰色陰影柱狀圖顯示用對(duì)照抗體 Xolair 獲得的結(jié)果；各圖右邊具有白色區(qū)域的柱狀圖顯示用抗體huHEA125獲得的結(jié)果。實(shí)施例3 通過(guò)鵝膏蕈堿和鵝膏蕈堿/抗體綴合物誘導(dǎo)癌細(xì)胞增殖抑制3.1癌細(xì)胞系將以下癌細(xì)胞系用于生長(zhǎng)抑制研究Capan-I、BxPC-3 人胰腺癌
MCF-7人乳腺癌
Colo205人結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移
OZ人膽管癌
PC-3人前列腺癌3. 2增殖抑制測(cè)定通過(guò)摻入[3H]-胸苷測(cè)定鵝膏蕈堿-IgG綴合物對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制。在96孔平底組織培養(yǎng)微量滴定板的孔中以100 μ 1體積一式三份制備，2Χ10-5Μ-6χ10-13范圍內(nèi)的鵝膏蕈堿-huHEA125、鵝膏蕈堿-Xolair和游離鵝膏蕈堿在完全培養(yǎng)基(補(bǔ)充10%熱滅活FCS、2mM L-谷氨酰胺和ImM丙酮酸鈉的RPMI 1640)中的系列稀釋物。加入每孔50 μ 1體積的密度為hl04/ml的細(xì)胞。在潮濕氣氛下于37°C和5% CO2條件下孵育板72或96小時(shí)。在測(cè)定結(jié)束前的20小時(shí)加入1 μ Ci [3H]-胸苷。隨后用Tomtec細(xì)胞收獲器處理板，通過(guò)液體閃爍 if^ (ffallac BetaplatePerkinElmer Life and Analytical Sciences) 測(cè)定摻入的放射性，并以cpm表示。在胰腺癌細(xì)胞系Capan-I情況下，huHEA125_鵝膏蕈堿免疫毒素以ΙχΚΓ^ΙχΙΟ,Μ 的鵝膏蕈堿濃度誘導(dǎo)生長(zhǎng)停滯，其如圖4中所示。在結(jié)腸癌癥細(xì)胞系Colo205情況下，huHEA125_鵝膏蕈堿免疫毒素以 1χ10-12-4χ10-ηΜ的鵝膏蕈堿濃度誘導(dǎo)生長(zhǎng)停滯，其如圖5中所示。在乳腺癌細(xì)胞系MCF-7情況下，huHEA125-鵝膏蕈堿免疫毒素以lxl(T12-lX10-"M 的鵝膏蕈堿濃度誘導(dǎo)生長(zhǎng)停滯，其如圖6中所示。在膽管癌細(xì)胞系OZ情況下，huHEA125_鵝膏蕈堿免疫毒素以ΙχΚΓ^ΙχΙΟ,Μ的鵝膏蕈堿濃度誘導(dǎo)生長(zhǎng)停滯，其如圖7中所示。在胰腺細(xì)胞系BxPC-3情況下，huHEA125_鵝膏蕈堿免疫毒素以ΜΙΟ-^ΙχΙΟ,Μ的鵝膏蕈堿濃度誘導(dǎo)生長(zhǎng)停滯，其如圖8中所示。實(shí)施例4 利用兩種異種移植物小鼠腫瘤模型通過(guò)鵝膏蕈堿/抗體綴合物體內(nèi)抑制腫瘤生長(zhǎng)將5-6周齡的免疫缺陷NOD/SCID小鼠用于所有實(shí)驗(yàn)。將BxPC_3胰腺腫瘤細(xì)胞或PC-3前列腺腫瘤細(xì)胞(5xl06個(gè)在ΙΟΟμΙ PBS中)皮下移植到小鼠的右脅。10天后，當(dāng) BxPC-3腫瘤達(dá)到30-80mm3體積且PC-3腫瘤達(dá)到40-190mm3體積時(shí)，開(kāi)始治療。動(dòng)物接受 15mg/kg劑量的對(duì)照huHEA125mAb或50 μ g/kg鵝膏蕈堿劑量的huHEA125_鵝膏蕈堿綴合物 (huHEA125-Ama)。單次腹膜內(nèi)注射給予抗體和綴合物。在開(kāi)始治療后監(jiān)測(cè)16天的腫瘤生長(zhǎng)。每隔3天用測(cè)徑器從外部測(cè)量腫瘤大小。按照公式計(jì)算腫瘤體積V = π /6柏補(bǔ)*(3，其中a、b和c為三個(gè)維度上的直徑。數(shù)據(jù)表示為從給予抗體時(shí)間起的相對(duì)腫瘤大小/體積增加。荷有BxPC-3腫瘤的小鼠(n = 6)良好耐受50 μ g/kg鵝膏蕈堿劑量的 huHEA125-Ama給予。小鼠體重未降低，肝酶(實(shí)驗(yàn)的最后一天在血清中測(cè)量LDH、ALT、AST 和AP)亦未升高。腫瘤生長(zhǎng)受到該劑量綴合物的強(qiáng)烈抑制。所有小鼠對(duì)治療有響應(yīng)，從給予綴合物后的第7天開(kāi)始腫瘤體積顯著縮小。在第16天隨訪結(jié)束時(shí)，50%小鼠中腫瘤完全消除。與此相比，在接受未綴合的huHEA125mAb的對(duì)照小鼠中，腫瘤體積增加約880% (圖 9)。在荷有PC-3腫瘤的小鼠情況中，良好耐受50 μ g/kg鵝膏蕈堿劑量的 huHEA125-Ama。未觀察到小鼠體重降低。該劑量的綴合物強(qiáng)烈阻滯腫瘤生長(zhǎng)。在給予huHEA125-Ama 10天后，腫瘤體積與開(kāi)始治療時(shí)相似。與此相比，在接受未綴合的 huHEA125mAb的對(duì)照小鼠中，腫瘤體積增加約550%。由于對(duì)照組的大腫瘤體積，實(shí)驗(yàn)在治療后第10天終止(圖10)。參考文獻(xiàn)Al-HajM. , Wicha M. S. , Benito-Hernandez A. , Morrison S. J. , Clarke Μ. F. Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells (予頁(yè)期鑒定致瘤乳腺癌細(xì)胞).Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100 (7)，3983-3988 (2003)Allard W. J.，Matera J.，Miller Μ. C.，Repollet Μ.，Connelly Μ. C.，Rao C.， Tibbe A. G., Uhr J. W. , Terstappen L. W. Tumor cells circulate in the peripheral blood of all major carcinomas but not in healthy subjects or patients with nonmalignant diseases (腫瘤細(xì)胞在所有主要癌的外周血液中循環(huán)，但在健康對(duì)象或無(wú)惡性病的患者中沒(méi)有).Clin. Cancer Res. 10 (20), 6897-6904 (2004)Baeuerle P. Α.禾口 Gires 0. EpCAM (CD326) finding its role in cancer (發(fā)現(xiàn) EpCAM (CD326)在癌癥中的作用).Br. J. Cancer 96 (3)，417-423 (2007)Balzar Μ. , Winter Μ. J. , de Boer C. J. , Litvinov S. V. The biology of the 17-1A antigen (Ep-CAM)(17-1A 抗原(Ep-CAM)的生物學(xué)).J. Mol. Med. 77(10)， 699-712(1999)Binz H. K. , Amstutz P. , Pliickthun A. Engineering novel binding proteins from nonimmunoglobulin domains (從非免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域工程改造新型結(jié)合蛋白).Nat Biotechnol. 23(10) :1257-1268(2005)Brody Ε. N.禾口 Gold L. ,Aptamers as therapeutic and diagnostic agents (作為治療劑和診斷劑的適配體)· J. Biotechnol. 74 (1) :5-13 (2000)Dalerba P.，Dylla S. J.，Park I. K.，Liu R.，Wang X.，Cho R. W.，Hoey Τ.， Gurney Α. , Huang Ε. H. ,Simeone D. Μ. ,Shelton Α. Α. ,Parmiani G. ,Castelli C. ,Clarke Μ. F. Phenotypic characterization of human colorectal cancer stem cells (人結(jié)直腸癌干細(xì)胞的表型鑒定)· Proc. Natl. Acad. Sci. USA 104 (24)，10158-10163 (2007)Gastl G. , Spizzo G. , Obrist P. , Diinser Μ. , Mikuz G. Ep-CAM overexpression in breast cancer as a predictor of survival (Ep-CAM ^ ^ ^ ] 測(cè))·Lancet 356 (9246)，1981-1982 (2000)Holliger P. , Prospero Τ. , Winter G. Diabodies “ small bivalent and bispecific antibody fragments ( “雙抗體”小的二價(jià)及雙特異性的抗體片段). Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 90 (14)，6444-6448 (1993)Leuenberger, H. G. W, Nage 1, B.禾口 Kolbl, H.主編.‘‘A multilingualglossary of biotechnological terms (IUPAC Recommendations)" , Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel, Switzerland)，1995
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SEQIDNO1 嵌合抗體huHEA125，1■鏈，且_結(jié)合形式
SEQIDNO2 嵌合抗體huHEA125，1I鏈，分泌形式
SEQIDNO3 嵌合抗體huHEA125，1I鏈，VH結(jié)構(gòu)域
SEQIDNO4 嵌合抗體huHEA125，1I鏈，F(xiàn)Rl區(qū)段
SEQIDNO5 嵌合抗體huHEA125，1I鏈，⑶Rl區(qū)段
SEQIDNO6 嵌合抗體huHEA125，1I鏈，F(xiàn)R2區(qū)段
SEQIDNO7 嵌合抗體huHEA125，1I鏈，⑶R2區(qū)段
SEQIDNO8 嵌合抗體huHEA125，1I鏈，F(xiàn)R3區(qū)段
SEQIDNO9 嵌合抗體huHEA125，1I鏈，⑶R3區(qū)段
SEQIDNO10嵌合抗體huHEA125，重鏈，F(xiàn)R4區(qū)段
SEQIDNO11嵌合抗體huHEA125，輕鏈
SEQIDNO12嵌合抗體huHEA125，輕鏈，VL結(jié)構(gòu)域
SEQIDNO13嵌合抗體huHEA125，輕鏈，F(xiàn)Rl區(qū)段
SEQIDNO14嵌合抗體huHEA125，輕鏈，⑶Rl區(qū)段
SEQIDNO15嵌合抗體huHEA125，輕鏈，F(xiàn)R2區(qū)段
SEQIDNO16嵌合抗體huHEA125，輕鏈，CDR2區(qū)段
SEQIDNO17嵌合抗體huHEA125，輕鏈，F(xiàn)R3區(qū)段
SEQIDNO18嵌合抗體huHEA125，輕鏈，CDR3區(qū)段
SEQIDNO19嵌合抗體huHEA125，輕鏈，F(xiàn)R4區(qū)段
SEQIDNO20嵌合抗體huHEA125，重鏈，CDRl結(jié)構(gòu)域
SEQIDNO21嵌合抗體huHEA125，重鏈，CDR2結(jié)構(gòu)域
SEQIDNO22嵌合抗體huHEA125，重鏈，CDR3結(jié)構(gòu)域
SEQIDNO23嵌合抗體huHEA125，輕鏈，CDRl結(jié)構(gòu)域
SEQIDNO24嵌合抗體huHEA125，輕鏈，CDR2結(jié)構(gòu)域
SEQIDNO25嵌合抗體huHEA125，輕鏈，CDR3結(jié)構(gòu)域
SEQIDNO26嵌合抗體huHEA125，重鏈，恒定域，膜結(jié)合形式
SEQIDNO27嵌合抗體huHEA125，重鏈，恒定域，分泌形式
SEQIDNO28嵌合抗體huHEA125，輕鏈，恒定域
權(quán)利要求
1.一種用于治療患者的胰腺癌、膽管癌或結(jié)直腸癌的抗體毒素綴合物，其中所述綴合物包含(i)特異性結(jié)合上皮細(xì)胞黏附分子(EpCAM)表位的抗體或其抗原結(jié)合片段；( )鵝膏蕈毒素；和(iii)任選的連接體Li。
2.權(quán)利要求1的綴合物，其中所述抗體或其抗原結(jié)合片段選自雙抗體、四抗體、納米抗體、嵌合抗體、去免疫化抗體、人源化抗體或人抗體。
3.權(quán)利要求1或2的綴合物，其中所述抗原結(jié)合片段選自Fab、F(ab')2、Fd、Fv、單鏈 Fv和二硫鍵連接的Fv (dsFv)。
4.權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的綴合物，其中所述EpCAM表位為人EpCAM表位。
5.權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的綴合物，其中所述抗體或其抗原結(jié)合片段包含(a)huHEA125重鏈的 CDR3 結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO 22)；禾口 / 或(b)huHEA125輕鏈的 CDR3 結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO 25)。
6.權(quán)利要求5的綴合物，其中所述抗體或其抗原結(jié)合片段另外包含以下一種或多種(a)huHEA125重鏈的 CDR2 結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO 21)；(b)huHEA125重鏈的 CDRl 結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO 20)；(c)huHEA125輕鏈的 CDR2 結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO 24)；禾口(d)huHEA125輕鏈的 CDRl 結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO 23)。
7.權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的綴合物，其中所述抗體或其抗原結(jié)合片段包含huHEA125的 VH 結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO 3)和 / 或 huHEA125 的 VL 結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO 12)。
8.權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的綴合物，其中所述抗體或其抗原結(jié)合片段包含(a)huHEA125重鏈的膜結(jié)合形式(SEQID NO 1)或huHEA125重鏈的可溶形式(SEQ ID NO 2)；和 / 或(b)huHEA125輕鏈(SEQ ID NO :11)。
9.權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)的綴合物，其中所述鵝膏蕈毒素選自α-鵝膏蕈堿、β-鵝膏蕈堿、Y-鵝膏蕈堿、ε_(tái)鵝膏蕈堿、鵝膏素、三羥鵝膏毒肽酰胺、鵝膏無(wú)毒環(huán)肽或一羥鵝膏毒肽羧酸或者其鹽或類(lèi)似物。
10.一種抗體毒素綴合物，其包含(i)特異性結(jié)合上皮細(xì)胞黏附分子(EpCAM)的抗體或其抗原結(jié)合片段，其中所述抗體或其抗原結(jié)合片段包含(a)huHEA125重鏈，其中所述重鏈選自(al)SEQ ID NO :1的重鏈的膜結(jié)合形式，其中SEQ ID NO 3所示的重鏈可變域VH包含位于VH框架區(qū)中的0-10個(gè)氨基酸交換、0-10個(gè)氨基酸缺失和/或0-10個(gè)氨基酸插入，和 SEQ ID NO 26所示的重鏈恒定域包含0_10個(gè)氨基酸交換、0_10個(gè)氨基酸缺失和/或0_10 個(gè)氨基酸插入；和(a2) SEQ ID NO :2的重鏈可溶形式，其中SEQ ID NO :3所示的重鏈可變域VH包含位于 VH框架區(qū)中的0-10個(gè)氨基酸交換、0-10個(gè)氨基酸缺失和/或0-10個(gè)氨基酸插入，和SEQ ID NO ,21所示的重鏈恒定域包含0-10個(gè)氨基酸交換、0-10個(gè)氨基酸缺失和/或0_10個(gè)氨基酸插入；禾口(b) SEQ ID NO 11的huHEA125輕鏈，其中SEQ ID NO 12所示的輕鏈可變域VL包含位于VL框架區(qū)中的0-10個(gè)氨基酸交換、0-10個(gè)氨基酸缺失和/或0-10個(gè)氨基酸插入，和SEQ ID NO 28所示的輕鏈恒定域CL包含0-10個(gè)氨基酸交換、0_10個(gè)氨基酸缺失和/或0_10 個(gè)氨基酸插入。( )鵝膏蕈毒素；和 (iii)任選的連接體L2。
11.權(quán)利要求10的綴合物，其中所述抗體或其抗原結(jié)合片段選自嵌合抗體、去免疫化抗體、人源化抗體或人抗體。
12.權(quán)利要求10或11的綴合物，其中所述抗原結(jié)合片段選自Fab、F(ab，)2和卩(1。
13.權(quán)利要求10-12中任一項(xiàng)的綴合物，其中所述抗體為huHEA125或其抗原結(jié)合片段。
14.權(quán)利要求10-13中任一項(xiàng)的綴合物，其中所述鵝膏蕈毒素選自α-鵝膏蕈堿、 β -鵝膏蕈堿、Y -鵝膏蕈堿、ε -鵝膏蕈堿、鵝膏素、三羥鵝膏毒肽酰胺、鵝膏無(wú)毒環(huán)肽或一羥鵝膏毒肽羧酸或者其鹽或類(lèi)似物。
15.用于醫(yī)藥的權(quán)利要求10-14中任一項(xiàng)的綴合物。
16.用于治療患者癌癥的權(quán)利要求10-14中任一項(xiàng)的綴合物，其中所述癌癥選自胰腺癌、膽管癌、乳腺癌和結(jié)直腸癌。
17.—種靶結(jié)合部分毒素綴合物，其包含(i)特異性結(jié)合上皮細(xì)胞黏附分子(EpCAM)表位的靶結(jié)合部分； ( )鵝膏蕈毒素；和 (iii)任選的連接體L3;其中所述鵝膏蕈毒素通過(guò)鵝膏蕈毒素3號(hào)氨基酸的δ C-原子與所述靶結(jié)合部分或可能存在的所述連接體L3連接。
18.權(quán)利要求17的靶結(jié)合部分毒素綴合物，其中所述鵝膏蕈毒素通過(guò)與鵝膏蕈毒素3 號(hào)氨基酸的δ C-原子結(jié)合的氧原子與所述靶結(jié)合部分或可能存在的所述連接體L3連接。
19.權(quán)利要求17或18的靶結(jié)合部分毒素綴合物，其中所述鵝膏蕈毒素通過(guò)酯鍵、醚鍵或尿烷鍵與所述靶結(jié)合部分或可能存在的所述連接體L3連接。
20.權(quán)利要求17-19中任一項(xiàng)的靶結(jié)合部分毒素綴合物，其中存在所述連接體L3，所述綴合物具有以下結(jié)構(gòu)之一(i)鵝膏蕈毒素-δ C-O-C (0) -L3-C (0) -NH-靶結(jié)合部分； ( )鵝膏蕈毒素_ δ C-0-L3-C (O)-NH-靶結(jié)合部分；或 (iii)鵝膏蕈毒素 _ δ C-O-C(0)-NH-L3-C(O)-NH-靶結(jié)合部分。
21.權(quán)利要求17-20中任一項(xiàng)的靶結(jié)合部分毒素綴合物，其中所述靶結(jié)合部分通過(guò)存在于所述靶結(jié)合部分中的氨基與所述鵝膏蕈毒素或可能存在的所述連接體L3連接。
22.權(quán)利要求17-21中任一項(xiàng)的靶結(jié)合部分毒素綴合物，其中所述鵝膏蕈毒素選自 α-鵝膏蕈堿、β-鵝膏蕈堿、Y-鵝膏蕈堿、鵝膏蕈堿、鵝膏素、三羥鵝膏毒肽酰胺、鵝膏無(wú)毒環(huán)肽或一羥鵝膏毒肽羧酸或者其鹽或類(lèi)似物。
23.權(quán)利要求17-22中任一項(xiàng)的靶結(jié)合部分毒素綴合物，其中所述連接體L3為任選取代的烷基、雜烷基、烯基、雜烯基、炔基、雜炔基、環(huán)烷基、雜環(huán)烷基、芳基、雜芳基、芳烷基或雜芳烷基。
24.權(quán)利要求17-23中任一項(xiàng)的靶結(jié)合部分毒素綴合物，其中所述連接體L3包含二硫鍵。
25.權(quán)利要求17-24中任一項(xiàng)的靶結(jié)合部分毒素綴合物，其中所述靶結(jié)合部分與腫瘤細(xì)胞上存在的表位特異性結(jié)合。
26.權(quán)利要求17-25中任一項(xiàng)的靶結(jié)合部分毒素綴合物，其中所述靶結(jié)合部分選自 (i)抗體或其抗原結(jié)合片段；( )抗體樣蛋白；和 (iii)核酸適配體。
27.權(quán)利要求26的靶結(jié)合部分毒素綴合物，其中所述抗體或其抗原結(jié)合片段選自雙抗體、四抗體、納米抗體、嵌合抗體、去免疫化抗體、人源化抗體或人抗體。
28.權(quán)利要求26或27的靶結(jié)合部分毒素綴合物，其中所述抗原結(jié)合片段選自Fab、 F (ab，)2、Fd、Fv、單鏈 Fv 和二硫鍵連接的 Fv (dsFv)。
29.權(quán)利要求26-27的靶結(jié)合部分毒素綴合物，其中所述抗體或其抗原結(jié)合片段包含(a)huHEA125重鏈的膜結(jié)合形式(SEQID NO 1)或huHEA125重鏈的可溶形式(SEQ ID NO 2)；和 / 或(b)huHEA125輕鏈(SEQ ID NO :11)。
30.用于醫(yī)藥的權(quán)利要求17-29中任一項(xiàng)的靶結(jié)合部分毒素綴合物。
31.用于治療患者癌癥的權(quán)利要求17-30中任一項(xiàng)的靶結(jié)合部分毒素綴合物，其中所述癌癥選自胰腺癌、膽管癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌、肺癌、前列腺癌、卵巢癌、胃癌、腎癌、惡性黑色素瘤、白血病和惡性淋巴瘤。
32.藥物組合物，其包含權(quán)利要求1-14中任一項(xiàng)的抗體毒素綴合物或權(quán)利要求17-29 中任一項(xiàng)的靶結(jié)合部分毒素綴合物，且還包含一種或多種藥學(xué)上可接受的稀釋劑、載體、賦形劑、填充劑、粘合劑、潤(rùn)滑劑、助流劑、崩解劑、吸附劑和/或防腐劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及腫瘤治療。在一個(gè)方面，本發(fā)明涉及可用于治療癌癥的靶結(jié)合部分和毒素的綴合物。具體而言，毒素為鵝膏蕈毒素，靶結(jié)合部分(例如抗體)針對(duì)腫瘤相關(guān)抗原，例如上皮細(xì)胞黏附分子(EpCAM)。在另一方面，本發(fā)明涉及包含這種靶結(jié)合部分毒素綴合物的藥物組合物，以及這種靶結(jié)合部分毒素綴合物在制備這種藥物組合物中的用途。本發(fā)明的靶結(jié)合部分毒素綴合物和藥物組合物可用于治療癌癥，尤其是腺癌，例如胰腺癌、膽管癌、乳腺癌和結(jié)直腸癌。
文檔編號(hào)A61K47/48GK102387815SQ201080016648
公開(kāi)日2012年3月21日 申請(qǐng)日期2010年4月8日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月8日
發(fā)明者F·布雷特林, G·莫爾登豪爾, S·呂特高, 海因茨·福爾斯蒂奇 申請(qǐng)人:德國(guó)癌癥研究中心, 海因茨·福爾斯蒂奇