專利名稱：預(yù)防和治療高滲透性的方法
預(yù)防和治療高滲透性的方法本發(fā)明涉及預(yù)防和治療內(nèi)皮細胞和上皮細胞中的高滲透性的方法。內(nèi)皮細胞和上皮細胞在人類和動物體的所有組織和器官中具有重要的功能。內(nèi)皮由內(nèi)皮細胞的薄層組成。內(nèi)皮細胞的層尤其形成血管(如靜脈和毛細血管)的內(nèi)表面，以及在血液和血管外壁之間的屏障。內(nèi)皮細胞內(nèi)襯整個血液系統(tǒng)，從大的血管到最小的毛細血管。上皮細胞形成單層或多層的細胞層，其覆蓋人類和動物器官的所有內(nèi)部和外部體表。上皮細胞相互緊鄰，有豐富的細胞接觸。對于上皮細胞，朝向外部或腔的外側(cè)、 頂面以及基底面可以產(chǎn)生區(qū)別。此外，上皮細胞具有粘附復(fù)合物(連接復(fù)合物)，由閉鎖小帶 (緊密連接)、附著小帶(附著連接)和橋粒(斑點附著)組成，其一方面呈現(xiàn)出物理化學(xué)的屏障，另一方面互連相鄰的上皮細胞。對于所有動物和人類器官和細胞器的生理功能，完整性，特別是限制細胞和細胞層的完整性是極其重要的。如果，例如，存在著內(nèi)皮細胞的損傷或血管的內(nèi)皮的損傷，液體可以逃離血管，引起整個生物體的生命力的大的擾動。如果，例如，存在著上皮細胞的損傷或器官的上皮的損傷，液體可以逃離器官，或者液體可能穿透，因而嚴(yán)重破壞器官的功能性。內(nèi)皮和上皮的損傷可以導(dǎo)致所謂的高滲透性(Hyperpermeabilit^it)，S卩，液體從血管到生命重要器官和組織的不受控制的穿過。除了機械原因之外，感染或毒素的影響可能引起高滲透性。微生物毒素是結(jié)合膽固醇的成孔分子，其由革蘭氏陽性細菌釋放。由于毒素的作用，首先在細胞膜中形成孔洞， 然后是形成大孔。因而，細胞層變?yōu)閷τ谝后w和其中含有的物質(zhì)是可透過的。已知的毒素由，尤其是，來自單核細胞增多性利斯特氏^Listeria ffloflc^j^ogefles)的禾Ij其jf特菌素，以及來自月市炎鏈球菌("ire/ 如⑶⑶狀腫的月市炎球菌溶血素。這些毒素可以引起細胞中反應(yīng)性氧分子的形成。由毒素引起的反應(yīng)性氧分子然后引起對內(nèi)皮和上皮的損傷，尤其是由于細胞的屏障功能被破壞的事實。為了保留內(nèi)皮細胞層和上皮細胞層的屏障功能，細胞通過蛋白質(zhì)纖維相互連接。 這樣的蛋白質(zhì)纖維的成分有，例如，肌球蛋白輕鏈。然而，由于肌球蛋白輕鏈的磷酸化，在細胞和細胞-細胞連接中產(chǎn)生壓力，并形成細胞間的空隙，從而液體可以以不受控制的方式流入和流出。在上皮細胞和內(nèi)皮細胞的屏障功能的調(diào)節(jié)中進一步的成分是蛋白激酶C。對于蛋白激酶C，已知多種同工酶，例如，蛋白激酶α和ζ。這些蛋白激酶C同工酶被反應(yīng)性氧分子、過氧化氫、微生物毒素如肺炎球菌溶血素和利斯特菌素以及親水性冠狀病毒蛋白質(zhì)活化。活化的蛋白激酶C另外引起上皮的鈉通道(ENaC)表達的降低，其對上皮細胞中鈉和液體轉(zhuǎn)運負責(zé)，因而，活化的蛋白激酶C實質(zhì)上促進高滲透性的形成。在肺中高滲透性的形成的另一原因是，例如，病毒，如流感病毒、嚴(yán)重急性呼吸綜合征相關(guān)冠狀病毒(SARS-C0V)或呼吸道合胞體病毒，它們可以引起內(nèi)皮和上皮的高滲透性，以及非典型性肺炎。已知的是，SARS-CoV蛋白質(zhì)由于蛋白激酶C同種型的活化引起上皮鈉通道的大小和活性的降低，其促使高滲透性發(fā)生。還已知的的是，對于這些肺部病毒疾病，經(jīng)常使用的β 2-腎上腺素能的激動劑不顯示效果。因而，總起來說，已知的是，微生物毒素引起內(nèi)皮和上皮細胞中反應(yīng)性氧分子的提高的水平。這導(dǎo)致肌球蛋白輕鏈的磷酸化，其進而引起細胞-細胞相互作用的紊亂以及高滲透性的形成。微生物毒素、反應(yīng)性氧分子以及病毒蛋白質(zhì)引起蛋白激酶C同工酶的活化。蛋白激酶C的活化然后引起上皮鈉通道(ENaC)的表達的降低以及它的活性的抑制。這些機制也引起內(nèi)皮和上皮中高滲透性的形成。肺組織的高滲透性是肺部各種疾病的重要部分，例如，急性肺損傷、急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)、肺炎(Pneumonie)。當(dāng)前，對于治療內(nèi)皮和上皮的高滲透性沒有標(biāo)準(zhǔn)的療法。US 2003/0185791 Al、EP 2009023 Al、WO 2006/013183 Al、EP 1264559 Al 和 Marquardt 等人(J. Pept. Sci. 13 (2007) 803-810)公開了用于治療水腫的 TNF-衍生的肽。因而本發(fā)明的目的是提供手段和方法，通過所述手段和方法，在治療中防止上皮細胞和內(nèi)皮細胞的高滲透性起到重要作用的那些疾病，特別是肺部疾病，如急性肺損傷、 ARDS或病毒性肺部疾病可以被預(yù)防或治療。特別地，本發(fā)明提供了生物學(xué)有效的分子，用于內(nèi)皮和上皮的高滲透性的預(yù)防和治療，以及用于急性肺損傷和肺炎的結(jié)果的預(yù)防和治療。因而，本發(fā)明涉及一種肽，其由7-17個相鄰的氨基酸組成，并且包含六聚體 TX1EX2X3E,其中W和\能夠是任何天然或非天然氨基酸，其中所述肽沒有TNF受體結(jié)合活性，并且是環(huán)化的，用于上皮細胞和內(nèi)皮細胞的高滲透性的預(yù)防和治療。優(yōu)選地，本發(fā)明涉及一種肽，其由7-17個相鄰的氨基酸組成，并且包含六聚體 TPEGAE (SEQ ID NO. 4)，其中所述肽沒有TNF受體結(jié)合活性，并且是環(huán)化的，用于上皮細胞和內(nèi)皮細胞的高滲透性的預(yù)防和治療。本發(fā)明的一個特別優(yōu)選的實施方案涉及由選自以下以及其至少7個氨基酸的片段構(gòu)成的組的連續(xù)氨基酸的序列組成的環(huán)化的肽
-QRETPEGAEAKPffY (SEQ ID No. 5) -PKDTPEGAELKPffY (SEQ ID No. 6) -CGQRETPEGAEAKPffYC (SEQ ID No. 1)禾口 -CGPKDTPEGAELKPffYC (SEQ ID No. 7)
所述片段包含六聚體TPEGAE，用于制造用于預(yù)防和治療上皮細胞和內(nèi)皮細胞的高滲透性的藥物。根據(jù)本發(fā)明的肽優(yōu)選地被用于預(yù)防肺炎、急性肺損傷、急性呼吸窘迫綜合征 (ARDS)或細菌或病毒性肺部疾病，特別是單核細胞增多性利斯特氏菌、肺炎鏈球菌、流感病毒、SARS或RSV的感染的爆發(fā)，或用于治療它們。根據(jù)本發(fā)明可以被治療或預(yù)防的肺炎的病因與肺炎的病因無關(guān)，并且與它是急性還是慢性炎癥無關(guān)。因而，根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選的，由細菌、病毒、支原體、原生動物、蠕蟲或真菌的感染引起的肺炎可以被治療，還有毒性地(例如， 通過有毒物質(zhì)的吸入)或免疫性地引起肺炎，或由輻射引起的肺炎(例如，X-射線、在癌癥患者中放射治療)。特別是對于由有毒物質(zhì)的吸入或輻射引起的肺炎，本發(fā)明的預(yù)防性的方面是特別關(guān)鍵的，然而，對于臥床不起的人，特別是老年人或免疫受損的人，如HIV患者或移植患者也是一樣。特別地，根據(jù)本發(fā)明，當(dāng)在χ-射線上還未能識別到損傷時可以對抗或預(yù)防肺炎。原發(fā)性肺炎病原體大多數(shù)是肺炎球菌、葡萄球菌、流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae)、支原體、衣原體、軍團菌(嗜肺性軍團病桿菌(Legionella pneumophila)) 和病毒如流感病毒、腺病毒和副流感病毒。對于繼發(fā)性肺炎，病原體的譜移動到皰疹病毒 (CVM, HSV)、真菌、耶氏肺孢子蟲(Pneumocystis jirovecii)、原生動物(弓形體病)以及厭氧細菌。特別地，根據(jù)本發(fā)明，由這些病原體引起的肺炎分別是特別優(yōu)選的可治療或(特別是對于繼發(fā)性肺炎)可預(yù)防的。根據(jù)本發(fā)明的肽例如是根據(jù)歐洲專利EP 1264599 Bl已知的，在現(xiàn)有技術(shù)中被提出用于液體積存(肺水腫)的治療，特別是用于這些液體積存的重吸收，其中水腫液體從肺組織的肺泡返回到毛細血管，即，泵出肺泡。根據(jù)本發(fā)明，完全地令人驚訝地展現(xiàn)的是，這些肽還影響通過毛細血管的內(nèi)皮進入肺部上皮的反向的液體流動，然而，是以相反的方式對于水腫的治療來說，液體的運出需要開放和完全活性的泵送機制，根據(jù)本發(fā)明，液體進入肺部的通路被停止；因而首先阻止了流入(Zustrom)。因而根據(jù)EP 1264599 Bl通過根據(jù)本發(fā)明的肽的水腫再吸收的活化看起來與根據(jù)本發(fā)明的高滲透性的降低相比是基于完全不同的機制，——按照相反的方向和以調(diào)節(jié)的方式運動，本發(fā)明基于內(nèi)皮和上皮層的損傷，從而通過避免液體轉(zhuǎn)移到肺泡中防止了水腫。因而，使用本發(fā)明，對于根據(jù)本發(fā)明的肽打開了全新的和令人驚訝的適應(yīng)癥，——除了根據(jù)EP 1264599 Bl的水腫治療之外的(其僅在疾病進程的后期階段出現(xiàn))。因而，本發(fā)明基于這樣的狀況，其也在本發(fā)明的起作用過程內(nèi)出現(xiàn)，在EP 1 264 599 Bl中定義的根據(jù)本發(fā)明使用的肽影響毒素、反應(yīng)性氧分子的作用、蛋白激酶C的活化、 肌球蛋白輕鏈的磷酸化以及上皮鈉通道的表達。這是根據(jù)關(guān)于這些肽的現(xiàn)有知識不可預(yù)計的。根據(jù)本發(fā)明的非常特別優(yōu)選的肽由氨基酸序列CGQRETPEGAEAKPWYC組成，并且通過C殘基(處在位置1和17的)環(huán)化。根據(jù)本發(fā)明的肽的環(huán)化可以通過用N和C末端處的兩個C殘基之間的二硫鍵直接環(huán)化，或通過通過這兩個半胱氨酸偶聯(lián)到載體物質(zhì)上來實現(xiàn)。因此，在根據(jù)本發(fā)明的肽中，半胱氨酸殘基優(yōu)選地提供在分子的開頭和結(jié)尾。也可以使用實現(xiàn)肽的環(huán)化的其他官能團，例如，用與胺或醇產(chǎn)生酰胺或酯環(huán)閉合的酸基團(對于這些，例如，氨基酸天冬氨酸和谷氨酸可以與絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺或賴氨酸優(yōu)選地分子內(nèi)環(huán)化)。因而，根據(jù)本發(fā)明的進一步優(yōu)選的肽是，例如，CGQKETPEGAEAKPffYC (SEQ ID NO. 8), CGQRETPEGAEARPffYC (SEQ ID NO. 9)、CGQRETPEGAEAKPC (SEQ ID NO. 10)、 CQRETPEGAEAKPffYC (SEQ ID NO. 11)或 CGQRETPEGAEAKFWYC (SEQ ID NO. 12)。作為載體物質(zhì)，可以使用所有常見的藥學(xué)上可用的物質(zhì)，例如，其能夠與半胱氨酸的SH基團形成共價鍵，其中常見的載體蛋白，如鑰孔戚血藍素(KLH)、破傷風(fēng)毒素等等是特別適合的。也可以在載體上提供相鄰的雙功能殘基(例如，在胺或醇基團旁邊的酸基團)。在這一點上，重要的是“環(huán)化”包含分子內(nèi)的環(huán)閉合，以及載體的整合(從結(jié)合的肽從所述載體上突出(肽的N和C末端結(jié)合到載體上))，其中以這樣的方式環(huán)化的肽顯示了環(huán)狀的空間結(jié)構(gòu)，并且被相應(yīng)穩(wěn)定化。根據(jù)本發(fā)明的肽可以優(yōu)選地用于保護上皮細胞和內(nèi)皮細胞對抗由反應(yīng)性氧分子或由細菌毒素引起的高滲透性。根據(jù)本發(fā)明的肽還可以用于抑制肌球蛋白輕鏈的磷酸化，抑制所述蛋白激酶C的活化或提高上皮鈉通道的表達。這一點上，根據(jù)本發(fā)明的肽可以用于治療由反應(yīng)性氧分子、微生物毒素、革蘭氏陽性微生物或肺部的病毒感染引起的高滲透性。根據(jù)進一步的方面，本發(fā)明涉及含有根據(jù)本發(fā)明的肽(或根據(jù)本發(fā)明的各種肽的混合物)和藥物載體的藥物組合物。根據(jù)本發(fā)明，這種藥物組合物被用于預(yù)防和治療高滲透性，如上所述，特別是用于預(yù)防和治療肺炎、急性肺損傷、急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)或病毒性肺部疾病，特別是單核細胞增多性利斯特氏菌、肺炎鏈球菌、SARS、RSV或流感病毒，特別是A型流感病毒的感染。術(shù)語“藥物組合物”是指包含上文定義的肽的任何組合物，所述肽防止、增強或治愈在此描述的狀況。特別地，術(shù)語“藥物組合物”是指具有如上所述的肽和藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑(兩個術(shù)語可互換地使用)的組合物。技術(shù)人員已知的適合的載體或賦形劑是食鹽水溶液、林格液、葡萄糖溶液、Hank-溶液、不揮發(fā)油類、油酸乙酯、 5%葡萄糖食鹽水溶液、改善等滲性和化學(xué)穩(wěn)定性的溶液、緩沖液和防腐劑。進一步適合的載體包括任何載體，其不誘導(dǎo)自身抗體的產(chǎn)生，所述抗體對于接受組合物的個體是有害的， 例如，蛋白質(zhì)、多糖、聚乳酸、聚羥基乙酸、聚氨基酸和氨基酸共聚物。這一點上，根據(jù)本發(fā)明的肽可以通過直接共價鍵環(huán)化到這些載體上。這種藥物組合物可以(作為藥物)使用技術(shù)人員已知的任何適合的方法來施用。優(yōu)選的施用途徑是胃腸外的，特別是通過吸入(用氣霧劑)或靜脈內(nèi)的施用。對于胃腸外施用，本發(fā)明的藥物與上文定義的藥學(xué)上可接受的賦形劑一起被配制在可注射的單位劑型中，如溶液、懸浮液或乳劑。然而，劑量和施用類型取決于個體。一般地，如此施用藥物，使得本發(fā)明的肽以1 yg/kg和10 mg/kg之間、更優(yōu)選的10 yg/kg和5 mg/kg、最優(yōu)選的0. 1和2 mg/kg之間的劑量施用。優(yōu)選的，它作為推注劑量 (Bolus-Dosis)來施用。也可以使用連續(xù)的輸注。在這種情況下，藥物可以以5和20 μ g/ kg/分鐘之間、更優(yōu)選的7和15 μ g/kg/分鐘之間的劑量輸注。根據(jù)本發(fā)明，根據(jù)本發(fā)明的特別優(yōu)選的肽具有以下氨基酸序列SEQ ID NO. 1 (NH2 ) Cys-Gly-Gln-Arg-Glu-Thr-Pro-Glu-Gly-Ala-Glu-Ala-Lys-Pro-Trp-Tyr-Cys (COOH)0培養(yǎng)的肺部的內(nèi)皮細胞中反應(yīng)性氧分子濃度的測定表明，在21%的標(biāo)準(zhǔn)氧含量 (含氧量正常的氣體混合物)下內(nèi)皮細胞的培養(yǎng)時，僅有反應(yīng)性氧分子的少量形成。然而，缺少氧時(0. 1%的氧，低氧含量氣體混合物)，存在著3倍高的反應(yīng)性氧分子形成。然而，如果根據(jù)本發(fā)明的肽，特別是SEQ ID NO. 1的肽被添加給在缺少氧(氧含量0.1%，低氧含量氣體混合物)下培養(yǎng)的內(nèi)皮細胞，令人驚訝地，內(nèi)皮細胞沒有形成反應(yīng)性氧分子。進一步的分析通過在添加微生物毒素肺炎球菌溶血素和利斯特菌素之前、期間和之后的電學(xué)的細胞-底物阻抗分析的方式，確定了人類內(nèi)皮和上皮細胞的細胞層的電阻。 實驗表明，向培養(yǎng)的人類內(nèi)皮細胞添加125 ng/ml和250 ng/ml的利斯特菌素，啟動了高滲透性的形成。這個過程通過250 ng/ml的利斯特菌素毒素濃度進一步增強。向培養(yǎng)的人類內(nèi)皮細胞添加62. 5 ng/ml的肺炎球菌溶血素也引起高滲透性的形成。這個過程通過125ng/ml的肺炎球菌溶血素毒素濃度進一步增強。然而，令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，添加根據(jù)本發(fā)明的肽，特別是50 yg/ml的肽SEQ ID NO. 1，肺炎球菌溶血素誘導(dǎo)的以及利斯特菌素誘導(dǎo)的高滲透性被抑制。進一步的分析表明，高滲透性也可以通過微生物毒素在人上皮細胞中誘導(dǎo)。因而， 人上皮細胞與ι μ g/mi利斯特菌素的孵育引起明確的高滲透性。然而，令人驚訝地發(fā)現(xiàn)的是，添加根據(jù)本發(fā)明的肽，特別是50 μ g/ml的肽SEQ ID NO. 1，高滲透性被抑制。進一步的分析表明，向人類內(nèi)皮肺細胞添加125 ng/ml的毒素利斯特菌素引起磷酸化的肌球蛋白輕鏈的含量的提高。這個效應(yīng)通過250 ng/ml的利斯特菌素毒素濃度進一步增強。向人類內(nèi)皮肺細胞添加62. 5 ng/ml的毒素肺炎球菌溶血素也引起磷酸化的肌球蛋白輕鏈的相對含量的提高。這個效應(yīng)通過125ng/ml的肺炎球菌溶血素毒素濃度進一步增強。然而，令人驚訝地發(fā)現(xiàn)的是，添加根據(jù)本發(fā)明的肽，特別是50 μ g/ml的肽SEQ ID NO. 1，抑制了由毒素利斯特菌素和肺炎球菌溶血素引起的肌球蛋白輕鏈的磷酸化。進一步的分析表明，在小鼠中毒素的氣管內(nèi)施用，小鼠肺部的高滲透性被觸發(fā)，通過從血管進入肺組織的伊文思藍染料的穿過所證實。然而，令人驚訝地發(fā)現(xiàn)的是，根據(jù)本發(fā)明的肽的氣管內(nèi)的施用，特別是50 yg的肽SEQ ID NO. 1，導(dǎo)致對毒素引起的高滲透性的抑制。進一步的分析表明，通過觸發(fā)小鼠肺部的高滲透性，由毒素例如250 ng肺炎球菌溶血素的氣管內(nèi)施用所觸發(fā)，在支氣管肺泡的液體中存在提高數(shù)量的白細胞。然而令人驚訝地發(fā)現(xiàn)的是，根據(jù)本發(fā)明的肽的氣管內(nèi)施用，特別是50 μ g的肽SEQ ID NO. 1，高滲透性的毒素相關(guān)的形成被抑制，并且在小鼠的肺部中支氣管肺泡液中存在明顯更少的白細胞。進一步的分析表明，細菌毒素引起肺部的人類內(nèi)皮細胞中活化的蛋白激酶C α的含量的大幅度提高。然而令人驚訝地發(fā)現(xiàn)的是，根據(jù)本發(fā)明的肽的添加，特別是肽SEQ ID Ν0. 1，抑制了這種毒素介導(dǎo)的效應(yīng)，因而引起上皮鈉通道的表達的提高。令人驚訝地還發(fā)現(xiàn)的是，根據(jù)本發(fā)明的肽向人上皮的細胞添加，特別是肽SEQ ID N0. 1，引起了上皮鈉通道 (ENaC)的表達的大幅度提高?，F(xiàn)在將在以下的實施例和附圖的基礎(chǔ)上更詳細地解釋本發(fā)明，本發(fā)明不應(yīng)限于所述實施例和附圖。附圖IA顯示了具有氨基酸序列SEQ ID NO. 1的蛋白質(zhì)的HPLC層析譜。單位y 軸“吸收，單位為mAU” ；χ軸“時間，單位為分鐘”。附圖IB顯示了具有氨基酸序列SEQ ID N0. 2的蛋白質(zhì)的HPLC層析譜。單位y 軸“吸收，單位為mAU” ；χ軸“時間，單位為分鐘”。附圖IC顯示了具有氨基酸序列SEQ ID N0. 3的蛋白質(zhì)的HPLC層析譜。單位y 軸“吸收，單位為mAU” ；χ軸“時間，單位為分鐘”。附圖2A顯示了內(nèi)皮細胞的電子順磁共振(EPR)譜，它們是在21%氧氣(含氧量正常的氣體混合物)或0. 1%氧氣(含氧量低的氣體混合物)中培養(yǎng)的，分別有和沒有肽SEQ ID NO. 1或肽SEQ ID N0. 3的添加。附圖2B顯示了內(nèi)皮細胞中反應(yīng)性氧分子(過氧化物)的相對含量，它們是在21%氧氣(含氧量正常的氣體混合物)或0. 1%氧氣(含氧量低的氣體混合物)下分別有和沒有添加肽SEQ ID NO. 1培養(yǎng)的，或在0. 1%氧氣(含氧量低的氣體混合物)下有和沒有添加肽SEQ ID N0. 3培養(yǎng)的。
附圖3A顯示了沒有添加毒素利斯特菌素以及在添加125 ng/ml的利斯特菌素 (125 ng/ml的LL0)之后和在添加500 ng/ml的利斯特菌素(500 ng/ml的LL0)之后人類肺部上皮細胞的電阻的曲線。附圖;3B顯示了沒有添加毒素肺炎球菌溶血素以及在添加62. 5 ng/ml的肺炎球菌溶血素(62. 5 ng/ml的PLY)之后和在添加250 ng/ml的肺炎球菌溶血素(250 ng/ml的 PLY)之后人類肺部上皮細胞的電阻曲線。附圖3C顯示了沒有添加毒素肺炎球菌溶血素/肽SEQ ID NO. 1 (對照)以及在添加125 ng/ml的肺炎球菌溶血素(125 ng/ml的PLY)之后，和在添加125 ng/ml的肺炎球菌溶血素/50 μ g/ml 的肽 SEQ ID NO. 1 (125 ng/ml 的 PLY/50 μ g/ml 的肽 SEQ ID NO. 1)之后人類肺部上皮細胞的電阻曲線。附圖3D顯示了沒有添加毒素利斯特菌素/肽SEQ ID NO. 1 (對照)以及在添加 500 ng/ml的利斯特菌素(500ng/ml的LL0)之后，和在添加500ng/ml的利斯特菌素/50 μ g/ml 的肽 SEQ ID NO. 1 (500 ng/ml 的 LL0/50 μ g/ml 的肽 SEQ ID NO. 1)之后人類肺部上皮細胞的電阻曲線。附圖3E顯示了沒有添加毒素利斯特菌素/肽SEQ ID NO. 1 (對照)以及在添加1 μ g/ml的利斯特菌素(1 μ g/ml的LL0)之后，和在添加1 μ g/ml的利斯特菌素/50 μ g/ ml 的肽 SEQ ID NO. 1 (1 μ g/ml 的 LL0/50 μ g/ml 的肽 SEQ ID NO. 1)之后人類肺部上皮細胞的電阻曲線。附圖4A顯示了取決于毒素利斯特菌素的濃度(125 ng/ml的LL0，250 ng/ml的 LL0, 500 ng/ml的LL0)，人類肺部內(nèi)皮細胞中磷酸化的肌球蛋白輕鏈的相對含量。附圖4B顯示了取決于毒素肺炎球菌溶血素的濃度(62. 5 ng/ml的PLY，125ng/ml 的PLY，250ng/ml的PLY)，人類肺部內(nèi)皮細胞中磷酸化的肌球蛋白輕鏈的相對含量。附圖4C顯示了取決于添加50 μ g/ml的肽SEQ ID N0. 1、250 ng/ml的毒素利斯特菌素(LL0)，50 μ g/ml 的肽 SEQ ID NO. 1/250 ng/ml 的毒素利斯特菌素(LL0)，50 μ g/ ml的肽SEQ ID NO. 3/250 ng/ml的毒素利斯特菌素(LL0)，人類肺部內(nèi)皮細胞中磷酸化的肌球蛋白輕鏈的相對含量。附圖4D顯示了取決于添加50 μ g/ml的肽SEQ ID N0. 1、125ng/ml的毒素肺炎球菌溶血素(PLY)，50 μ g/ml的肽SEQ ID NO. l/125ng/ml的毒素肺炎球菌溶血素(PLY)， 50 μ g/ml的肽SEQ ID NO. 3/125ng/ml的毒素肺炎球菌溶血素(PLY)，人類肺部內(nèi)皮細胞中磷酸化的肌球蛋白輕鏈的相對含量。附圖5A顯示了在以劑量250 ng肺炎球菌溶血素每小鼠(250 ng的PLY)和500 ng肺炎球菌溶血素每小鼠(500 ng的PLY)的毒素肺炎球菌溶血素氣管內(nèi)的施用之后5. 5 小時小鼠肺組織中伊文思藍染料的含量。附圖5B顯示了在250 ng毒素肺炎球菌溶血素每小鼠的氣管內(nèi)的施用之后，以及 250 ng毒素肺炎球菌溶血素和50 μ g肽SEQ ID NO. 1每小鼠的氣管內(nèi)的施用之后5. 5小時，小鼠肺組織中伊文思藍染料的含量。附圖5C顯示了在250 ng毒素肺炎球菌溶血素每小鼠的氣管內(nèi)施用之后，以及250 ng毒素肺炎球菌溶血素和50 μ g肽SEQ ID NO. 1每小鼠的氣管內(nèi)施用之后5. 5小時，肺部中支氣管肺泡液中白細胞的含量。
附圖6表明了取決于人類內(nèi)皮肺細胞與250 ng/ml的毒素肺炎球菌溶血素(250 ng/ml的PLY)和由250 ng/ml毒素肺炎球菌溶血素和50 μ g/ml肽SEQ ID NO. 1組成的混合物(250 ng/ml的PLY/50 μ g/ml肽SEQ ID NO. 1)的孵育，相對于蛋白激酶C α的總體含量的，活化的蛋白激酶C α的含量。附圖7顯示了與沒有進行添加，在添加50 μ g/ml的肽SEQ ID NO. 1之后，以及添加50 μ g/ml的肽SEQ ID NO. 3之后的細胞培養(yǎng)物條件相比，在人肺上皮細胞中上皮鈉通道(ENaC)的表達。ENaC的mRNS的含量使用“實時PCR”測定。附圖8顯示了患有病毒性肺炎(組1 陰性對照(PBS);組2 陽性對照(通過鼻子的 A型流感)；組3:通過鼻子的A型流感+氣管內(nèi)的10 yg肽SEQ ID NO. 1)的測試動物的體重的改變。附圖9顯示了這些組1到3的測試動物的體溫的改變。附

圖10顯示了這些組1到3的測試動物的存活率。
實施例實施例IA 具有氨基酸序列SEQ ID NO. 1的肽的合成
具有氨基酸序列SEQ ID NO. 1的肽使用Fmoc固相合成按照以下步驟完全自動化地合
成
步驟過程產(chǎn)物1氨基酸的偶聯(lián)結(jié)合到固相的肽2從固相脫離在溶液中的肽3純化作為TFA鹽的純化的肽4純化/鹽交換作為乙酸鹽的純化的肽5分析實驗純化的肽
隨后，肽SEQ ID NO. 1通過氨基酸半胱氨酸(位置1)和半胱氨酸(位置17)的側(cè)鏈之間二硫鍵的氧化形成來環(huán)化。隨后，使用反相HPLC來檢查所述肽，其中獲得在附圖IA中顯示的結(jié)果。肽SEQ ID NO. 1的純度高于95%。附圖IB 具有氨基酸序列SEQ ID N0. 2的肽的合成 SEQ ID No. 2
(NH2) Lys-Ser-Pro-Gly-Gln-Arg-Glu-Thr-Pro-Glu-Gly-Ala-Glu-Ala-Lys-Pro-Trp-Tyr-Glu (C00H)，
其中在賴氨酸Lys (1)的側(cè)鏈的氨基基團與谷氨酸Glu (19)的側(cè)鏈的羧基基團之間形成酰胺鍵。具有氨基酸序列SEQ ID N0. 2的肽使用Fmoc固相合成以以下步驟完全自動化地合成
步驟過程產(chǎn)物1氨基酸的偶聯(lián)結(jié)合到固相的肽2從固相脫離在溶液中的肽3純化作為TFA鹽的純化的肽4純化/鹽交換/氧化環(huán)化作為乙酸鹽的純化的肽5分析實驗純化的肽
環(huán)化通過用谷氨酸(位置19)的Y-羧基基團與賴氨酸(位置1)的氨基基團的連
9接形成酰胺鍵來發(fā)生。例如，這通過將谷氨酰胺基團的Y-羧基基團借助二環(huán)己基碳二亞胺(DHC)轉(zhuǎn)變?yōu)榛钚缘孽?，所述活性酯隨后與賴氨酸的ε -氨基基團自發(fā)地反應(yīng)，形成肽中的環(huán)閉合來實現(xiàn)。隨后，使用反相HPLC來檢查所述肽，其中獲得在附圖IB中顯示的結(jié)果。肽SEQ ID NO. 2的純度高于95%。附圖IC 具有氨基酸序列SEQ ID NO. 3的肽的合成 SEQ ID No. 3
(NH2) Cys-Gly-Gln-Arg-Glu-Ala-Pro-Ala-Gly-Ala-Ala-Ala-Lys-Pro-Trp-Tyr-Cys (COOH)
(NH2) Cys-Gly-Gln-Arg-Glu-Thr-Pro-Glu-Gly-Ala-Glu-Ala-Lys-Pro-Trp-Tyr-Cys (COOH)
具有氨基酸序列SEQ ID NO. 3的肽使用Fmoc固相合成以以下步驟完全自動化地合
成
步驟過程產(chǎn)物1氨基酸的偶聯(lián)結(jié)合到固相的肽2從固相脫離在溶液中的肽3純化作為TFA鹽的純化的肽4純化/鹽交換作為乙酸鹽的純化的肽5分析實驗純化的肽
隨后，肽SEQ ID NO. 3通過氨基酸半胱氨酸(位置1)和半胱氨酸(位置17)的側(cè)鏈之間二硫鍵的氧化形成來環(huán)化。隨后，使用反相HPLC來檢查所述肽，其中獲得在附圖IC中顯示的結(jié)果。肽SEQ ID NO. 3的純度高于95%。肽SEQ ID N0. 3和肽SEQ ID NO. 1之間的差異在于，肽SEQ ID NO. 1的氨基酸 Thr (6)、Glu (8)禾口 Glu (11)在肽 SEQ ID N0. 3 中被 Ala (6)、Ala (8)禾口 Ala (11)替代。實施例2 肽SEQ ID NO. 1對反應(yīng)性氧分子的影響內(nèi)皮細胞的細胞培養(yǎng)
內(nèi)皮細胞的細胞培養(yǎng)借助添加和不添加50 μ g/ml的肽SEQ ID N0. 1，或添加和不添加50 μ g/ml的肽SEQ ID NO. 3來進行。對于反應(yīng)性氧分子的產(chǎn)生，動脈的內(nèi)皮細胞在0. 1%氧氣、5% 二氧化碳和94. 9%氮氣的缺氧的氣體混合物(含氧量低的氣體混合物)中培養(yǎng)。在對照實驗中，氣體濃度是21% 氧氣、5% 二氧化碳和74%氮氣(含氧量正常的氣體混合物)。在缺氧條件下90分鐘之后，內(nèi)皮細胞用21%氧氣進一步培養(yǎng)30分鐘。此后，將由 20 口]\11-羥基-3-甲氧羰基-2，2，5，5-四甲基吡咯燒!1(1((腿)、20 μ M DPBS.25 μ M 去鐵草酰胺和5 μ M 二乙基二硫代氨基甲酸酯組成的20 μ 1的溶液以及2 μ 1的DMSO添加至細胞。細胞的胰蛋白酶消化
在細胞培養(yǎng)之后，通過添加胰蛋白酶溶液以實驗室中常規(guī)的方式分離細胞。內(nèi)皮細胞經(jīng)洗滌并懸浮在35 μ 1的溶液中，所述溶液由DPBS和25 μ M去鐵草酰胺和5 μ M 二乙基二硫代氨基甲酸酯組成。
電子順磁共振(EPR)的測量
電子順磁共振(Era)，也稱為電子自旋共振的測量提供了順磁物質(zhì)的探查，例如，用于反應(yīng)性氧分子中不成對電子(氧的自由基)的檢測。為此，將早先處理的細胞置入50 μ 1毛細管，在Magnettech公司(Berlin，德國) 的MinKcope MS200 ESR中以40 mW微波、3000 mG調(diào)幅、100 kHz調(diào)頻下檢查。如附圖2A和2B所示，21%的標(biāo)準(zhǔn)氧濃度(含氧量正常的氣體混合物)下，僅少量形成反應(yīng)性氧分子。在缺氧(0. 1%氧氣，含氧量低的氣體混合物)下，存在著反應(yīng)性氧分子的 3倍高的形成。然而，如果肽SEQ ID NO. 1被添加給在缺氧(氧含量0. 1%，含氧量低的氣體混合物)下培養(yǎng)的內(nèi)皮細胞，則沒有由內(nèi)皮細胞形成的反應(yīng)性氧分子。與肽SEQ ID NO. 1相反，向在缺氧(氧含量0. 1%，含氧量低的氣體混合物)下培養(yǎng)的內(nèi)皮細胞添加肽SEQ ID NO. 3不引起內(nèi)皮細胞的反應(yīng)性氧分子形成的抑制作用。肽SEQ ID NO. 3和肽SEQ ID NO. 1之間的差異在于，肽SEQ ID NO. 1的氨基酸 Thr (6)、Glu (8)和 Glu (11)在肽 SEQ ID N0. 3 中被替換為 Ala (6)、Ala (8)禾口 Ala (11)。實施例3 通過肽SEQ ID NO. 1的內(nèi)皮細胞和上皮細胞中高滲透性的抑制作用材料
H441型的人類肺部上皮細胞獲自ATTC公司。分離自肺的毛細管的人類肺部內(nèi)皮細胞獲自Lonza公司。微生物毒素利斯特菌素(LLO)和肺炎球菌溶血素(PLY)獲自Giessen大學(xué)。細胞培養(yǎng)
分離自肺的毛細管的人類肺部內(nèi)皮細胞以實驗室常規(guī)方式培養(yǎng)。H441型肺上皮細胞在帶有添加劑2 mM L 一谷氨酰胺、1. 5 g/Ι碳酸氫鈉、4. 5 g/1 葡萄糖、10 mM HEPES緩沖液pH 7. 4、10%牛血清的商業(yè)的RPMI 1640培養(yǎng)基中以實驗室常規(guī)方式培養(yǎng)。ECIS實驗在無血清培養(yǎng)基中進行。高滲透性
為了引起高滲透性，即，內(nèi)皮細胞和上皮細胞的損傷，人肺上皮細胞以及人肺內(nèi)皮細胞以實驗室常規(guī)方式培養(yǎng)，直到形成連續(xù)的細胞層，隨后，分別添加毒素利斯特菌素或肺炎球菌溶血素。穿內(nèi)皮電阻的測定
在向人類內(nèi)皮細胞添加微生物毒素肺炎球菌溶血素和利斯特菌素之前、期間和之后， 通過電學(xué)的細胞-底物阻抗分析的方式檢測細胞層的電阻(穿內(nèi)膜電阻)。如附圖3A顯示的，隨著向培養(yǎng)的人類內(nèi)皮細胞添加125 ng/ml的利斯特菌素，電阻降低。這導(dǎo)致高滲透性形成。這種作用在使用更高數(shù)量的500 ng/ml的利斯特菌素時更加顯著。如附圖;3B顯示的，隨著向培養(yǎng)的人類內(nèi)皮細胞添加62. 5 ng/ml的肺炎球菌溶血素，電阻降低。這導(dǎo)致高滲透性形成。這種作用在使用更高數(shù)量的250 ng/ml的肺炎球菌溶血素時更加顯著。如附圖3C顯示的，隨著向培養(yǎng)的人類內(nèi)皮細胞添加125 ng/ml的肺炎球菌溶血素，電阻降低。這導(dǎo)致高滲透性形成。然而，由毒素肺炎球菌溶血素的添加引起的高滲透性通過添加50 μ g/ml的肽SEQ ID NO. 1被抑制。如附圖3D顯示的，隨著向培養(yǎng)的人類內(nèi)皮細胞添加500 ng/ml的利斯特菌素，電阻降低。這導(dǎo)致高滲透性形成。然而，由毒素利斯特菌素的添加引起的高滲透性通過添加 50 μ g/ml 的肽 SEQ ID NO. 1 被抑制。如附圖3E顯示的，隨著向培養(yǎng)的人類上皮細胞添加1 μ g/ml的利斯特菌素，電阻降低。這導(dǎo)致高滲透性形成。然而，由毒素利斯特菌素的添加引起的高滲透性通過添加50 μ g/ml的肽SEQ ID NO. 1被抑制。實施例4 通過肽SEQ ID NO. 1的肌球蛋白輕鏈磷酸化的抑制作用材料
分離自肺的毛細管的人類肺部內(nèi)皮細胞獲自Lonza公司。微生物毒素利斯特菌素(LLO)和肺炎球菌溶血素(PLY)獲自Giessen大學(xué)。細胞培養(yǎng)
分離自肺的毛細管的人類肺部內(nèi)皮細胞以實驗室常規(guī)方式培養(yǎng)。肌球蛋白輕鏈磷酸化的測定
為了測定肌球蛋白輕鏈的磷酸化以及肽SEQ ID NO. 1對磷酸化的影響，早先培養(yǎng)的人類肺部內(nèi)皮細胞用含有ImM原釩酸鹽的磷酸鹽緩沖液pH 7. 4洗滌。細胞內(nèi)含物通過用20 mM Tris緩沖液(pH 7. 4),150 mM mol/1 NaClU mM EDTAU mM EGTAU % Triton X-100、 2.5 mM焦磷酸鈉、1 mM β-甘油磷酸酯、1 mM釩酸鈉、1 μ g/ml的亮肽素、1 mM苯甲磺酰氟的溶液孵育來裂解。此外，細胞用超聲消化。細胞溶胞產(chǎn)物進行離心以獲得可溶組分?？扇艿募毎馨a(chǎn)物隨后以實驗室常規(guī)的方式施加到變性的十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳上，根據(jù)蛋白質(zhì)的質(zhì)量分離蛋白質(zhì)。此后，蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝化纖維膜上。蛋白質(zhì)印跡用0. 1% Tween 20和5%干奶粉的溶液以實驗室中常規(guī)的方式處理1小時。隨后，蛋白質(zhì)印跡與對準(zhǔn)(richten gegen)肌球蛋白輕鏈或磷酸化的肌球蛋白輕鏈的抗體孵育。為了使得肌球蛋白輕鏈或磷酸化的肌球蛋白輕鏈可見，以實驗室中常規(guī)的方式利用化學(xué)發(fā)光在診斷薄膜上使得抗體可見。使用光密度測定法測量信號強度，測定肌球蛋白輕鏈與磷酸化的肌球蛋白輕鏈的比例。如附圖4A所示，向人類內(nèi)皮肺細胞添加125 ng/ml的毒素利斯特菌素引起磷酸化的肌球蛋白輕鏈的相對含量的提高。這個效應(yīng)通過250ng/ml的利斯特菌素毒素濃度進一步增強。如附圖4B所示，向人類內(nèi)皮肺細胞添加62. 5 ng/ml的毒素肺炎球菌溶血素引起磷酸化的肌球蛋白輕鏈的相對含量的提高。這個效應(yīng)通過125ng/ml的肺炎球菌溶血素毒
素濃度進一步增強。如附圖4C所示，向人類內(nèi)皮肺細胞添加125 ng/ml的毒素利斯特菌素引起磷酸化的肌球蛋白輕鏈的相對含量的提高。添加50 μ g/ml肽SEQ ID NO. 1對磷酸化的肌球蛋白輕鏈的含量沒有影響。通過添加50 μ g/ml的肽SEQ ID NO. 1,250 ng/ml的毒素利斯特菌素對磷酸化肌球蛋白輕鏈含量的提高被抑制。肽SEQ ID N0. 3對毒素利斯特菌素介導(dǎo)的磷酸化肌球蛋白輕鏈的含量提高沒有影響。如附圖4D所示，向人類內(nèi)皮肺細胞添加125 ng/ml的毒素肺炎球菌溶血素引起磷酸化的肌球蛋白輕鏈的相對含量的提高。添加50 μ g/ml肽SEQ ID NO. 1對磷酸化的肌球蛋白輕鏈的含量沒有影響。通過添加50 μ g/ml的肽SEQ ID NO. 1，125ng/ml的毒素肺炎球菌溶血素對磷酸化肌球蛋白輕鏈含量的提高被抑制。肽SEQ ID NO. 3對毒素肺炎球菌溶血素介導(dǎo)的磷酸化肌球蛋白輕鏈的含量提高沒有影響。肽SEQ ID NO. 3和肽SEQ ID NO. 1之間的差異在于，肽SEQ ID NO. 1的氨基酸 Thr (6)、Glu (8)和 Glu (11)在肽 SEQ ID N0. 3 中被替換為 Ala (6)、Ala (8)禾口 Ala (11)。實施例5 肽SEQ ID NO. 1對動物模型中高滲透性和急性肺破壞的影響小鼠中高滲透性的誘導(dǎo)
在準(zhǔn)備肺之前，實驗室小鼠用異氟烷/氧氣的混合物，以及用100 μ 1每小鼠的氯胺酮 /甲苯噻嗪的混合物(1.33:1)氣管內(nèi)地處理。在麻醉之后，靜脈導(dǎo)管植入到小鼠中。為了誘導(dǎo)肺的高滲透性，25 μ 1的液體隨后用精細注射器噴霧到肺中。所述液體含有0.9%食鹽水溶液或250 ng的毒素肺炎球菌溶血素或250 ng/ml的肺炎球菌溶血素/50 μ g/ml肽 SEQ ID NO. 1。通過伊文思藍的高滲透性的可視化
在施用毒素肺炎球菌溶血素之后5. 5小時，溶解在0. 9%食鹽水溶液中的伊文思藍染料以100 mg/kg小鼠體重靜脈內(nèi)地施用給小鼠。在30分鐘后，通過心穿刺的方式從動物抽取血液。隨后，取出肺，用1 ml的EDTA磷酸鹽緩沖液(pH 7. 4)洗滌，在液氮中急凍。對于肺組織中伊文思藍染料含量的測定，肺在冷的磷酸鹽緩沖液中勻化(每100 mg肺1 ml緩沖液)，與甲醛溶液孵育18小時，隨后離心(5，000 X g，30分鐘)。在液體上清液中，然后620 nm 和740nm光度計地測定吸收。在溶于甲醛溶液中的伊文思藍染料的參考曲線的基礎(chǔ)上，扣除血紅蛋白色素的含量，測定肺組織中伊文思藍染料含量。由于毒素肺炎球菌溶血素誘導(dǎo)的高滲透性，伊文思藍染料從毛細管進入肺組織的釋出與血清中染料的數(shù)量建立聯(lián)系。如附圖5A所示，250 ng和500 ng每小鼠的毒素肺炎球菌溶血素的氣管內(nèi)施用引起高滲透性，這可以通過帶有伊文思藍染料的血液從肺毛細管進入肺組織來確定，和在肺組織中來驗證。如附圖5B所示，250 ng每小鼠劑量的毒素肺炎球菌溶血素的氣管內(nèi)施用引起高滲透性，通過帶有伊文思藍染料的血液從肺毛細管通過進入肺組織所確定，可以在肺組織中驗證。通過50 μ g的肽SEQ ID NO. 1的氣管內(nèi)施用，導(dǎo)致毒素介導(dǎo)的高滲透性形成的抑制作用。如附圖5C顯示，250 ng每小鼠的毒素肺炎球菌溶血素的氣管內(nèi)施用由于高滲透性的形成引起小鼠肺中支氣管肺泡液中白細胞數(shù)量提高。通過50 μ g肽SEQ ID NO. 1的氣管內(nèi)施用，導(dǎo)致毒素介導(dǎo)的高滲透性形成的抑制作用，以及小鼠肺中支氣管肺泡液中白細胞數(shù)目的明顯降低。實施例6 通過肽SEQ ID NO. 1的蛋白激酶C的活化的抑制作用材料
分離自肺的毛細管的人類肺部內(nèi)皮細胞獲自Lonza公司。微生物毒素肺炎球菌溶血素(PLY)獲自Giessen大學(xué)。細胞培養(yǎng)
分離自肺的毛細管的人類肺部內(nèi)皮細胞以實驗室常規(guī)方式培養(yǎng)。在細胞培養(yǎng)期間，以250 ng/ml的濃度添加毒素肺炎球菌溶血素，或250 ng/ml濃度的毒素肺炎球菌溶血素和 50 yg/ml 濃度的肽 SEQ ID NO. 1?；罨牡鞍准っ窩 α含量的測定
活化的蛋白激酶C α的含量通過使用對準(zhǔn)活化的蛋白激酶C α (磷酸-蘇氨酸638 蛋白激酶C α )的抗體通過ELISA測量來測定。同時地，蛋白激酶C α的總體含量通過商業(yè)常規(guī)的ELISA分析來測定。如附圖6所示，由于毒素肺炎球菌溶血素的作用，導(dǎo)致與蛋白激酶C α的總體濃度相比活化的蛋白激酶C α含量的強烈提高。通過添加肽SEQ ID NO. 1，導(dǎo)致蛋白激酶C α的活化的抑制作用。實施例7 通過肽SEQ ID NO. 1在上皮細胞中上皮鈉通道(ENaC)的表達的提高材料
H441型的人類肺部上皮細胞獲自ATTC公司。細胞培養(yǎng)
H441型肺上皮細胞在帶有添加劑2 mM L 一谷氨酰胺、1.5 8/1碳酸氫鈉、4.5 g/Ι葡萄糖、10 mM HEPES緩沖液pH 7. 4、10%牛血清的商業(yè)的RPMI 1640培養(yǎng)基中以實驗室常規(guī)方
式培養(yǎng)。上皮鈉通道的表達的驗證
在培養(yǎng)的上皮細胞中，鈉通道(ENaC)的表達通過“實時PCR”的方式測定。這些實驗在沒有或有添加50 yg/ml的肽SEQ ID NO. 1、以及在添加50 yg/ml的肽SEQ ID NO. 3的細胞中進行。如實驗7顯示的，向肺的上皮細胞添加50 μ g/ml的肽SEQ ID N0. 1，導(dǎo)致鈉通道 ENaC的三倍表達。添加50 μ g/ml的肽SEQ ID NO. 3，在鈉通道ENaC的表達方面沒有大幅度提高。肽SEQ ID N0. 3和肽SEQ ID NO. 1之間的差異在于，肽SEQ ID NO. 1的氨基酸 Thr (6)、Glu (8)禾口 Glu (11)在肽 SEQ ID N0. 3 中被 Ala (6)、Ala (8)禾口 Ala (11)替代。實施例8 肽SEQ ID NO. 1對患有病毒肺部感染的小鼠中疾病的進程的作用對于肽SEQ ID NO. 1對病毒肺部感染的作用，檢查以下動物研究組
組1，陰性對照(通過鼻部的PBS )。組2，陽性對照(用約2000單位的A型流感病毒通過鼻部感染)。組3，測試組(用約2000單位的A型流感病毒通過鼻部感染，以及10 μ g肽SEQ ID NO. 1的氣管內(nèi)的施用)。 在每個組中，使用6只BALB/c小鼠。跟蹤以下治療方案 治療的第0天
組1 通過鼻部施用PBS。組2 用A型流感病毒通過鼻部感染小鼠。組3 用A型流感病毒通過鼻部感染小鼠以及施用肽SEQ ID N0. 1。治療的第0、2、4、6、8 天組1 :PBS的氣管內(nèi)的施用。組2 =PBS的氣管內(nèi)的施用。組3 肽SEQ ID NO. 1的氣管內(nèi)的施用。治療的第0到10天
每日觀察測試動物的體溫、體重和存活率。檢查表明，患有病毒肺部感染的測試動物(組2)在10天內(nèi)失去了它們體重的約 20%。與這相比，當(dāng)施用肽SEQ ID NO. 1時(組3)，測試動物的體重僅降低約10%。結(jié)果在附圖8中顯示。另外檢查表明，在患有病毒肺部感染的測試動物(組2)中，在7天后體溫從37. 5°C 降低到33 0C。隨后，體溫提高到35 0C。與這相比，在施用的SEQ ID NO. 1的測試動物(組3)中，在7天后體溫僅降低到 35 °C。隨后，體溫再次提高到37 °C。結(jié)果在附圖9中示出。另外檢查表明，在病毒肺部感染后10天，組2的測試動物的2/3死亡。與這相比，施用肽SEQ ID NO. 1的測試動物(組3)的死亡率在10天后僅1/3。結(jié)果在附圖10中示出?？偲饋?，病毒肺部感染的測試動物的檢查表明，肽SEQ ID NO. 1的施用降低了體重的減低，降低了體溫的減低，導(dǎo)致明顯提高的存活率。實施例9:肽SEQ ID NO. 1 (“AP301 ”)在灌洗誘導(dǎo)的大的動物ARDS模型中的應(yīng)
用
材料&方法經(jīng)主管的動物保護委員會的同意，在兩只豬(25 kg)中在全身麻醉下通過表面活性劑耗盡(四次支氣管肺泡的灌洗，30 ml/kg體重(KG)每次)誘導(dǎo)肺破壞。隨后，1 mg/kg體重的AP301 (肽SEQ ID NO. 1)氣管內(nèi)地應(yīng)用。動物1 (1)接受總體劑量的深部的氣管注射，而對于動物2 (2)，進行在30分鐘內(nèi)同樣劑量的噴霧。此后，是5小時的通氣時間。動脈氧分壓(PaO2)使用預(yù)先驗證的動脈內(nèi)的實時測量探針(F0XY，Ocean Optics,USA) 來記錄。肺活量測定和血液動力學(xué)持續(xù)地登記，以半小時間隔時間進行PiCCO技術(shù)的測量。結(jié)果在藥物的施用期間，沒有展現(xiàn)不合意的血液動力學(xué)的效應(yīng)。通氣設(shè)置在無保護的范圍內(nèi)持續(xù)地保持(Pmax 40毫巴，潮氣量彡10 ml/kg體重，PEEP彡10毫巴，頻率 25-35/分鐘)以避免治療效果。兩個動物顯示了限于約1. 5小時的增氧的連續(xù)改善，PaO2 提高最大分別是162.8 mmHg (1)或224.6 mmHg (2)。伴隨AP301的噴霧，與深部的氣管應(yīng)用相比這延遲發(fā)生，然而，它是更加顯著的。與氣體交換的改善并行地，與初始值相比，能夠在表面活性劑耗盡之后記錄到血管外肺水的15. 8-52. 5%的降低。這些結(jié)果給人深刻印象地表明，根據(jù)本發(fā)明用于ARDS的治療的新的藥理學(xué)有效的方法，在批準(zhǔn)的大動物模型中用于ARDS的治療也被證明是高效的。序列的概述SEQ ID No.1 CGQRETPSGAEAKPWYC
SEO ID No.2KSPGGQEETPEGAEAKPHYE
SEQ ID No.3CGQREAPAGA&AKPWYC
SEO ID No.4TPEGAE
SEO ID No.5QRETPEGAEAKPWY
SEQ ID Mo.6PKDTPEGAELKPW￥
SEQ ID No,7CGPKDTPEGASLKPHYC
SEQ ID NO.8CGQKETPEGAEAEPWYC
SEQ ID No.9CGQRETPEGASARPW￥C
SEO ID No.10CGQRETPEGAE&KPC
SEQ ID No.11CQRETPEGAEAKPW￥C
SEO ID No.12CGQRETPEGAEAKFWYC 。
權(quán)利要求
1.肽，該肽由7-17個相鄰的氨基酸組成，并且包含六聚體TX1EX2X3E,其中&、)(2和)(3能夠是任何天然或非天然氨基酸，其中所述肽沒有TNF受體結(jié)合活性，并且是環(huán)化的，用于預(yù)防和治療上皮細胞和內(nèi)皮細胞的高滲透性。
2.肽，該肽由7-17個相鄰的氨基酸組成，并且包含六聚體TPEGAE，其中所述肽沒有TNF 受體結(jié)合活性，并且是環(huán)化的，用于預(yù)防和治療上皮細胞和內(nèi)皮細胞的高滲透性。
3.環(huán)化的肽，由選自以下以及其至少7個氨基酸的片段構(gòu)成的組的連續(xù)氨基酸的序列組成-QRETPEGAEAKPffY -PKDTPEGAELKPffY -CGQRETPEGAEAKPffYC,禾口 -CGPKDTPEGAELKPffYC所述片段包含六聚體TPEGAE，用于制造用于預(yù)防和治療上皮細胞和內(nèi)皮細胞的高滲透性的藥物。
4.權(quán)利要求1到3的任一項中定義的肽，用于治療肺炎、急性肺損傷、急性呼吸窘迫綜合征(ADRS)或者細菌或病毒性肺部疾病，特別是單核細胞增多性利斯特氏菌、肺炎鏈球菌、 SARS病毒、RSV或流感病毒的感染。
5.根據(jù)權(quán)利要求1到4的任一項的肽，特征在于它包含氨基酸序列 CGQRETPEGAEAKPffYC并且是通過C殘基環(huán)化的。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的肽，特征在于它是通過所述C殘基之間的二硫鍵環(huán)化的。
7.根據(jù)權(quán)利要求1到6的任一項的肽，特征在于它被用于保護上皮細胞和內(nèi)皮細胞對抗由反應(yīng)性氧分子觸發(fā)的高滲透性。
8.根據(jù)權(quán)利要求1到6的任一項的肽，特征在于它被用于保護上皮細胞和內(nèi)皮細胞對抗由細菌毒素觸發(fā)的高滲透性。
9.根據(jù)權(quán)利要求1到6的任一項的肽，特征在于它被用于抑制肌球蛋白輕鏈的磷酸化。
10.根據(jù)權(quán)利要求1到6的任一項的肽，特征在于它被用于抑制蛋白激酶C的活化。
11.根據(jù)權(quán)利要求1到6的任一項的肽，特征在于它被用于提高上皮鈉通道的表達。
12.根據(jù)權(quán)利要求1到6的任一項的肽，特征在于它被用于治療由反應(yīng)性氧分子、微生物毒素、革蘭氏陽性微生物或肺部病毒感染觸發(fā)的高滲透性。
13.藥物組合物，包含根據(jù)權(quán)利要求1到12的任一項的肽和藥物載體。
全文摘要
描述了肽，其由7-17個相鄰的氨基酸組成，并且包含六聚體TX1EX2X3E，其中X1、X2和X3能夠是任何天然的或非天然的氨基酸，其中所述肽沒有TNF受體結(jié)合活性，并且是環(huán)化的，用于上皮細胞和內(nèi)皮細胞的高滲透性的預(yù)防和治療。
文檔編號A61K38/19GK102355906SQ201080010379
公開日2012年2月15日 申請日期2010年3月5日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月5日
發(fā)明者菲舍爾 B., 盧卡斯 R. 申請人:阿佩普蒂科研究和開發(fā)有限責(zé)任公司