專利名稱：一種具有腫瘤細(xì)胞增殖抑制活性的熒光探針及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于熒光探針技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種具有腫瘤細(xì)胞增殖抑制活性的熒光探針 及其制備方法。
背景技術(shù)：
目前，腫瘤已經(jīng)成為當(dāng)今世界危害人類健康的重大疾病，抗腫瘤藥物的研究越來(lái) 越受到人們的重視。近年來(lái)，隨著分子腫瘤學(xué)、分子藥理學(xué)的發(fā)展，腫瘤疾病的本質(zhì)已逐步 被揭示。在藥物研究中，氣相色譜、液相色譜以及紫外光譜是進(jìn)行藥物分析的基本技術(shù)。20 世紀(jì)70年代以來(lái)，特別是近年來(lái)相繼出現(xiàn)的各種靈敏度高的熒光分析法已有效地用于藥 物制劑以及生物體液中藥物的分析。如同步掃描熒光技術(shù)可用于違禁品中苯丙胺和嗎啡加 奎寧的測(cè)定；熒光偏振免疫分析法可用于血清中的慶大霉素、地答新、茶葉堿、戊巴比妥、苯 巴比妥等多種藥物的檢測(cè)，還可進(jìn)行燒傷患者體內(nèi)萘替米星的藥代動(dòng)力學(xué)研究；特異性熒 光偏振免疫法可用來(lái)監(jiān)測(cè)腎移植后環(huán)孢素A的全血濃度；熒光猝滅法用來(lái)測(cè)定苦參堿和氧 化苦參堿的含量；固體表面熒光測(cè)定法用于血清中茶葉堿，以及其它多種抗菌藥、抗氣喘病 藥、抗驚風(fēng)病藥等的臨床熒光分析；電解熒光光度法測(cè)定片劑中卡馬西平的含量等等。其 中，熒光探針技術(shù)已經(jīng)發(fā)展成為借助熒光顯微鏡在分子水平上進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)的重要手段。 這種技術(shù)靈敏度高，可視性強(qiáng)，而且對(duì)研究的生物大分子或細(xì)胞干擾少，因此得到廣泛應(yīng) 用。分子熒光探針對(duì)金屬離子、生物小分子和生物大分子的響應(yīng)，使得人們能夠用熒 光顯微鏡、熒光光譜，特別是熒光成像技術(shù)來(lái)實(shí)時(shí)檢測(cè)活細(xì)胞內(nèi)分子或離子濃度以及生物 大分子結(jié)構(gòu)的變化過(guò)程。其中，應(yīng)用綠色熒光蛋白(GFP)及其變體(如CFP、YEP等)或者小 分子熒光染料標(biāo)記的蛋白質(zhì)探針在各種細(xì)胞事件的實(shí)時(shí)可視化及示蹤細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)表達(dá) 和定位等方面已經(jīng)得到廣泛的應(yīng)用。由于綠色熒光蛋白具有分子小、熒光穩(wěn)定、檢測(cè)方便、 對(duì)活細(xì)胞無(wú)傷害等優(yōu)點(diǎn)，因此用其對(duì)目的物進(jìn)行標(biāo)記，分析目的物在細(xì)胞中的變化情況，如 酶分子分布狀態(tài)、生物活性、受體、離子通道等變化，從而，在眾多的化合物中篩選出與體內(nèi) 信號(hào)分子功能相似的“潛力”化合物，這樣的方法簡(jiǎn)便易行。因此綠色熒光蛋白作為一種熒 光探針成為了藥物篩選及藥物作用機(jī)制研究中的有力工具。實(shí)際上，許多藥物或具有藥物 活性的小分子自身都是受體的外源性配體。因此，它們也理所當(dāng)然地可被用作探針的配體 部分，從而對(duì)藥物在體內(nèi)的代謝過(guò)程進(jìn)行跟蹤，而且也可以通過(guò)實(shí)時(shí)成像技術(shù)來(lái)監(jiān)測(cè)病變 組織。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明解決的技術(shù)問(wèn)題在于提供一種具有腫瘤細(xì)胞增殖抑制活性及熒光特性的 雙功能探針的制備方法，該熒光探針可作為一種靶向工具分子，與腫瘤細(xì)胞直接作用，通過(guò) 其熒光性能的變化，進(jìn)行藥物作用機(jī)制和作用效果研究。
本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)—種具有腫瘤細(xì)胞增殖抑制活性的熒光探針，是在聯(lián)苯衍生物Ta-dD的一個(gè)或兩 個(gè)酚羥基上連接熒光發(fā)色團(tuán)；所述的聯(lián)苯衍生物Ta-dD的結(jié)構(gòu)式為
所述的熒光發(fā)色團(tuán)為香豆素類、吲哚類、羅丹明類或熒光素類，其結(jié)構(gòu)式分別為 香豆素類
COOH羅丹明類熒光素類其中，R1為羥基或氨基；R2為氫原子、甲基或乙基；R3為氯原子、溴原子或氟原子。所述的熒光發(fā)色團(tuán)是含有羥基的熒光發(fā)色團(tuán)，通過(guò)碳原子數(shù)為2 6的直鏈烴基 與Ta-dD連接；或者是含有羧基的熒光發(fā)色團(tuán)，通過(guò)?；cTa-dD連接或者是含有氨基的熒 光發(fā)色團(tuán)，通過(guò)酰亞胺基與Ta-dD連接。所述在聯(lián)苯衍生物Ta-dD的一個(gè)或兩個(gè)酚羥基上連接熒光發(fā)色團(tuán)得到的熒光探 針為 F-Ta-dD-OH、F-Ta_dD-NH2、F-Ta-dD-Rod、F-Ta-dD-Fluo 或 F-Ta-dD-indo。 所述的聯(lián)苯衍生物Ta-dD的一個(gè)酚羥基與熒光發(fā)色團(tuán)連接，另一個(gè)酚羥基與 2-氯-N-(3-氯-4-氟苯)乙酰胺連接。所述在聯(lián)苯衍生物Ta-dD的一個(gè)酚羥基上連接熒光發(fā)色團(tuán)得到的熒光探針為 F-Ta-dD-dOH 或 F-Ta-dD_dNH2。一種具有腫瘤細(xì)胞增殖抑制活性的熒光探針的制備方法，包括以下步驟a、聯(lián)苯衍生物Ta-dD的合成1) 3-羥基-4-甲氧基苯甲醛在鐵粉催化作用下，與液溴在醋酸緩沖液中反應(yīng)得到2-溴3-羥基-4-甲氧基苯甲醛；2)以氯化芐作為保護(hù)試劑，對(duì)2-溴3-羥基-4-甲氧基苯甲醛的酚羥基進(jìn)行保護(hù)， 得到3-芐氧基-2-溴-4-甲氧基苯甲醛；3)以過(guò)氧化氫-亞氯酸鈉體系作為氧化劑，將3-芐氧基-2-溴-4-甲氧基苯甲醛 氧化得到3-芐氧基-2-溴-4-甲氧基苯甲酸；4)先將3-芐氧基-2-溴-4-甲氧基苯甲酸溶解在無(wú)水二氯甲烷中，通過(guò)?；?反應(yīng)制成3-芐氧基-2-溴-4-甲氧基苯甲酰氯，然后再與甲胺水溶液反應(yīng)得到3-芐氧 基-2-溴-4-甲氧基-N-甲基甲酰胺；5) 3-芐氧基-2-溴-4-甲氧基_N_甲基甲酰胺通過(guò)UlImarm反應(yīng)制得芐基保護(hù)的 聯(lián)苯雙酰胺化合物6’ 6- 二芐氧基-5’ 5- 二甲氧基聯(lián)苯-2’ 2- 二 N-甲基甲酰胺；6)5，5’ - 二甲氧基_6，6’ - 二芐氧基聯(lián)苯_2，2’ - 二苯甲酰甲胺通過(guò)催化氫化脫 去芐基保護(hù)基，得到帶有兩個(gè)酚羥基的聯(lián)苯衍生物Ta-dD ；b、熒光發(fā)色團(tuán)衍生物的合成利用熒光發(fā)色團(tuán)中含有的羥基與二鹵代烷發(fā)生醚化反應(yīng)，生成帶有鹵代直鏈烴的 熒光發(fā)色團(tuán)衍生物；或者利用熒光發(fā)色團(tuán)中含有的羧基發(fā)生酰氯化反應(yīng)，生成帶有酰氯結(jié)構(gòu)的熒光發(fā) 色團(tuán)衍生物；或者利用熒光發(fā)色團(tuán)中含有的氨基發(fā)生酰胺化反應(yīng)，生成帶有酰胺結(jié)構(gòu)的熒光發(fā) 色團(tuán)衍生物；C、熒光探針的合成向有機(jī)溶劑中按照聯(lián)苯衍生物Ta-dD:熒光發(fā)色團(tuán)衍生物無(wú)水碳酸鉀= 1 (1 2) (3 6)的摩爾比，首先加入聯(lián)苯衍生物Ta-dD和無(wú)水碳酸鉀，60 80°C充 分混合后，然后加入熒光發(fā)色團(tuán)衍生物，60 80°C回流充分反應(yīng)；反應(yīng)完成后轉(zhuǎn)移到冰水 中，待固體完全析出后，抽濾，并將所得固體物干燥后，進(jìn)行硅膠柱層析，以乙酸乙酯和甲醇 的混合溶劑，或者乙酸乙酯和石油醚的混合溶劑進(jìn)行洗脫，得到具有腫瘤細(xì)胞增殖抑制活 性的熒光探針。所述的二鹵代烷為碳原子個(gè)數(shù)為2 6的直鏈鹵代烴，兩個(gè)鹵原子分別連接于首 位碳原子上，含羥基的熒光發(fā)色團(tuán)與二鹵代烷的摩爾比為1 1;含羧基的熒光發(fā)色團(tuán)與氯化亞砜發(fā)生酰氯化反應(yīng)，兩者的摩爾比為1 1;含氨基的熒光發(fā)色團(tuán)與氯乙酰氯發(fā)生酰胺化反應(yīng)，兩者的摩爾比為1 1。所述的熒光發(fā)色團(tuán)衍生物為7-(2_溴乙氧基)-4_甲基香豆素、2-氯-N_(4-甲 基-2-氧雜-2-氫-苯并吡喃-7-基)-乙酰胺、2-氯-N-(5-氯-1-氫-吲哚-6-基)乙 酰胺、羅丹明B酰氯或熒光素酰氯；所述的有機(jī)溶劑為N，N- 二甲基甲酰胺或丙酮。所述的用于柱分離的洗脫溶劑，以體積比計(jì)，乙酸乙酯和甲醇的混合溶劑為乙酸 乙酯甲醇=30 1 10 1，乙酸乙酯和石油醚的混合溶劑為乙酸乙酯石油醚= 1 3。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益的技術(shù)效果本發(fā)明構(gòu)建的具有腫瘤細(xì)胞增殖抑制活性的熒光探針，以聯(lián)苯衍生物Ta-dD作為基礎(chǔ)分子結(jié)構(gòu)，在其酚羥基上通過(guò)醚化或者酰胺化與熒光發(fā)色團(tuán)進(jìn)行連接；而由于聯(lián)苯衍 生物Ta-dD具有兩個(gè)酚羥基，那么其中的一個(gè)酚羥基連接熒光發(fā)色團(tuán)，而另外一個(gè)酚羥基 還可以連接其他具有特定功能的分子結(jié)構(gòu)。現(xiàn)有的熒光示蹤劑，以綠色熒光蛋白為例，僅僅作為一種報(bào)告基因，轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞 后，通過(guò)判斷腫瘤細(xì)胞熒光消失與否，來(lái)確定腫瘤細(xì)胞是否死亡，從而達(dá)到對(duì)抗癌藥物療效 的評(píng)價(jià)。而與現(xiàn)有的熒光示蹤劑相比，本發(fā)明公開(kāi)的熒光探針既保持了對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖抑 制活性，又具有一定的熒光性能。作為一種靶向工具分子，可與腫瘤細(xì)胞直接作用，通過(guò)其 熒光性能的變化，來(lái)進(jìn)行藥物作用機(jī)制和作用效果研究。聯(lián)苯衍生物Ta-dD和酚羥基連接的功能分子保持對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖抑制活性，而指 示性的熒光是由熒光發(fā)色團(tuán)發(fā)出的。在制備熒光探針的時(shí)候熒光發(fā)色團(tuán)是以熒光發(fā)色團(tuán)衍 生物的形式與聯(lián)苯衍生物Ta-dD的酚羥基醚化或者酰胺化，從而形成連接，這就要求熒光 發(fā)色團(tuán)具有活性的羥基、羧基或者氨基。聯(lián)苯衍生物Ta-dD是由本發(fā)明公開(kāi)的方法合成， 熒光發(fā)色團(tuán)可以是合成的或者是購(gòu)買的，具體可以為香豆素類、吲哚類、羅丹明類和熒光素 類。


圖1為熒光探針F-Ta-dD-OH的熒光吸收?qǐng)D譜；圖2為熒光探針F-Ta-ClD-NH2的熒光吸收?qǐng)D譜；圖3為熒光探針F-Ta-dD-dOH的熒光吸收?qǐng)D譜；圖4為熒光探針F-Ta-dD-dNH2的熒光吸收?qǐng)D譜；圖5為熒光探針F-Ta-dD-dOH、F-Ta-dD_NH2對(duì)乳腺腫瘤細(xì)胞細(xì)胞株MCF-7、 MDA-MB-231增殖抑制率直方圖；圖6為熒光探針F-Ta-dD-dOH、F-Ta-dD_NH2對(duì)乳腺腫瘤細(xì)胞細(xì)胞株ZR-75-30、 SK-BR-3增殖抑制率直方圖；圖7為熒光探針F-Ta-dD-dOH、F-Ta-dD_dNH2對(duì)乳腺腫瘤細(xì)胞胞株MCF-7、 MDA-MB-231增殖抑制率直方圖；圖8為熒光探針F-Ta-dD-dOH、F-Ta-dD_NH2對(duì)乳腺腫瘤細(xì)胞細(xì)胞株ZR-75-30、 SK-BR-3增殖抑制率直方圖。
具體實(shí)施例方式下面具體結(jié)合實(shí)例和其制備方法對(duì)具有腫瘤細(xì)胞增殖抑制活性的熒光探針的合 成、熒光性能及對(duì)乳腺腫瘤細(xì)胞不同細(xì)胞株增殖抑制作用，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明， 所述是對(duì)本發(fā)明的解釋而不是限定。本發(fā)明提供的具有腫瘤細(xì)胞增殖抑制活性的熒光探針，是在聯(lián)苯衍生物Ta-dD的
一個(gè)或兩個(gè)酚羥基上連接熒光發(fā)色團(tuán)，其結(jié)構(gòu)通式表示為 其中，熒光發(fā)色團(tuán)通過(guò)三種方式與Ta-dD連接，也即^\；\1\；\]~\選自以下三種 連接結(jié)構(gòu)1)碳原子數(shù)為2 6的直鏈烴基-(CH2)n-，n = 2、3、4、5、6 ；熒光發(fā)色團(tuán)的羥基通 過(guò)取代連接帶有鹵素取代的直鏈烴基，再與Ta-dD的酚羥基發(fā)生鹵素取代而連接，兩者形 成醚的結(jié)構(gòu)；2)酰基C = 0，熒光發(fā)色團(tuán)的羧基生成酰氯結(jié)構(gòu)，再與Ta-dD的酚羥基發(fā)生鹵素 取代而連接，兩者形成酯的結(jié)構(gòu)；3)酰亞胺基-NH-C = 0，熒光發(fā)色團(tuán)的氨基生成酰胺結(jié)構(gòu)，再與Ta_dD的酚羥基 發(fā)生取代而連接，兩者形成酰胺的結(jié)構(gòu)。實(shí)施例1具有腫瘤細(xì)胞增殖抑制活性的熒光探針的合成1)聯(lián)苯衍生物Ta-dD的合成，其合成路線圖如下 其具體的合成步驟為
①化合物2-溴3-羥基-4-甲氧基苯甲醛(中間產(chǎn)物2)的合成向裝有滴液漏斗、溫度計(jì)的三頸瓶中加入25g(0. 164mol)3-羥基-4-甲氧基苯甲 醛(化合物1)、26. 94g(0. 325mol)醋酸鈉及0. 75g (0. 015mol)鐵粉，用150mL冰醋酸溶解， 室溫?cái)嚢?0min ；將9mLBr2與40mL冰醋酸混合，滴入到上述混合液中，控溫23°C 25 V。 滴加完畢，將混合液室溫?cái)嚢?，TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)進(jìn)程，3h后倒入冰水混合液中，繼續(xù)攪拌lh。靜 置后抽濾、洗滌沉淀，粗品用乙醇重結(jié)晶，得灰白色固體。產(chǎn)率為81%，m. p. 214 215°C。核磁1H NMR (300MHz, CDCl3) δ (ppm) :10. 26 (s，1H)，7. 58 (d，J = 8·5Ηζ，1Η)，
6.93 (d, J = 8. 5Hz，lH)，6. 07(s，lH)，4. 01(s，3H).紅外 FT-IR(KBr)，υ /cm1 :3235，2890， 1669，1593.②化合物3-芐氧基-2-溴-4-甲氧基苯甲醛(中間產(chǎn)物3)的合成將15. Og (0. 065mol) 2_溴3_羥基_4_甲氧基苯甲醛加入到250mL圓底燒 瓶中，用150mL無(wú)水乙醇溶解，加入27g(0. 196mol)無(wú)水K2C03。攪拌30min后，加入 11. 3mL(0. 098mol)氯化芐，回流攪拌4h。冷卻，蒸除部分溶劑(1/4 1/2體積)后，倒入 冰水混合物中，有黃色固體析出。靜置后抽濾、洗滌沉淀，粗品用乙醇重結(jié)晶，得淡黃色針狀 固體。產(chǎn)率 72%，m. ρ· 82 83°C。核磁IH NMR (300MHz, CDC13) δ (ppm) :10· 27 (s，1H)，7· 76 (d，J = 8·4Ηζ，1Η)，
7.54 7. 35(m，5H)，6· 98 (d, J = 9. 2Hz, 1H)，5. 03(s，2H)，3· 96(s，3H).紅外 FT-IR(KBr)， υ/cm-1 2940,2839，1626. 9，1713，1593.③化合物3-芐氧基-2-溴-4-甲氧基苯甲酸(中間產(chǎn)物4)的合成20. 87g(0. 065mol)3-芐氧基-2-溴-4-甲氧基苯甲醛加入到200mL四氫呋喃中， 再加入60mL蒸餾水和4. 68g(0. 039mol)NaH2PO4,混合液室溫?cái)嚢鐸Omin后，向上述混合液 中緩慢滴加含19. 40g(0. 215mol) NaClO2的30% H2O2溶液。滴加完畢，室溫繼續(xù)攪拌3h后， 減壓蒸除四氫呋喃，殘?jiān)靡宜嵋阴?150mLX2)萃取，萃取所得有機(jī)相再用水(50mLX3) 洗滌，然后再用2mOl/LNa0H(50mLX5)萃取，所得水相用鹽酸酸化，收集產(chǎn)生的固體。產(chǎn)率 78%, m. ρ· 172 173°C。核磁1H NMR (300MHz，CDCl3) δ (ppm) 7. 87 (d，J = 9. IHz，1H)，7. 56 7. 37 (m，5H)， 6. 93 (d, J = 9. 2Hz, 1H), 5. 03 (s, 1H), 3. 94(s,3H).紅外 FT-IR(KBr)，υ /cm1 2940，2639， 1695.④化合物3-芐氧基-2-溴-4-甲氧基苯甲酰氯(中間產(chǎn)物5)的合成3. 37g(0. Olmol) 3-芐氧基_2_溴_4_甲氧基苯甲酸溶于60mL無(wú)水二氯甲烷中， 將3mL SOCl2溶于20mL無(wú)水二氯甲烷中，于20min內(nèi)滴加到上述混合液中。室溫?cái)嚢?h， 蒸除溶劑后，得到液體產(chǎn)物。⑤化合物3-芐氧基-2-溴-4-甲氧基-N-甲基甲酰胺(中間產(chǎn)物6)的合成50mL甲胺水溶液置于冰浴中冷卻，將步驟④合成的3_芐氧基_2_溴_4_甲氧基 苯甲酰氯溶于35mL無(wú)水二氯甲烷中，緩慢滴入甲胺水溶液中，滴加完后，冰浴攪拌，TLC監(jiān) 測(cè)反應(yīng)進(jìn)程。反應(yīng)完畢，產(chǎn)物用二氯甲烷稀釋，并依次用2mol/L HCl、H20、飽和Na2CO3、飽 和NaCl萃取，有機(jī)相用無(wú)水Na2SO4干燥。蒸除溶劑后，收集產(chǎn)生的白色固體。產(chǎn)率77%， m. ρ· 147 148°C。核磁1H NMR (300MHz, CDCl3) δ (ppm) :7· 55 (d, J = 7. OHz，1H)，7. 37-7. 56 (m, 5H)，6. 91 (d, J = 7. 2Ηζ，1Η)，6· 13 (br, 1Η), 5. 01 (s, 2Η), 3. 89(s，3H)，3. 00 (d, J = 4. 3Hz，3H). 紅外 FT-IR(KBr)，υ /cm1 :3272，1635，1295，1029，977，695.⑥化合物6’ 6- 二芐氧基-5’ 5- 二甲氧基聯(lián)苯_2’ 2_ 二 N-甲基甲酰胺(中間產(chǎn) 物7)的合成22. 34g(0. 064mol) 3_芐氧基_2_溴_4_甲氧基-N-甲基甲酰胺溶于150mL干燥的 N，N- 二甲基甲酰胺中，加入40. 96g(0. 64mol)活化的銅粉，氮?dú)獗Ｗo(hù)下，150 160°C，回流 4小時(shí)。待反應(yīng)液冷卻至室溫后，過(guò)濾，濾液傾倒入冰水中，收集產(chǎn)生的固體，干燥。粗品經(jīng) 硅膠柱分離，5cmX40cm色譜柱，石油醚裝柱。采用乙酸乙酯石油醚=1 3進(jìn)行洗脫，收 集產(chǎn)生的白色固體。產(chǎn)率62%，m.p. 174 175°C。核磁1HNMR(300MHz, CDCl3) δ (ppm) :7· 33(d, J = 8. 4Hz，2H)，6· 94-7. 19 (m, 12H)， 4. 82 (d, J = 10. 8Hz, 1H)，4· 73 (d, J = 10. 9Hz, 1H)，3. 87(s，6H)，2· 65 (d, J = 4. 6Hz，6H). 紅外 FT-IR(KBr)，υ /cm1 =3269,2935,1628，1561，1324，989.⑦taspine聯(lián)苯衍生物Ta_dD的合成10. 53g(0. 019mol)6，6_ 二芐氧基 _5，5_ 二甲氧基聯(lián)苯 _2，2-二 N-甲基甲酰胺 溶于300mL無(wú)水甲醇中，加入0. Ig 10%Pd/C作為催化劑。在H2氛圍下，室溫?cái)嚢?，TLC監(jiān) 測(cè)反應(yīng)進(jìn)程，直至無(wú)初始原料。過(guò)濾除去Pd/C，并反復(fù)用甲醇洗滌，收集濾液，蒸除溶劑，收 集產(chǎn)生的白色固體。產(chǎn)率93%，m. p. 143 144°C。核磁1HNMR(300MHz, CDCl3) δ (ppm) :7. 16 (d，J = 8. 5Hz，2H)，6. 89 (d，J = 8. 4Hz， 2H)，3. 92(s，6H)，2. 74(d，J = 4. 2Hz，6H).紅夕卜 FT-IR(KBr)，u/cm—1 :3370，3114，1622， 1552，1479，1276，1230，1019.在上述合成方法中，所述TLC監(jiān)測(cè)所用溶劑為石油醚、乙酸乙酯、甲醇或三氯甲焼。2)熒光發(fā)色團(tuán)及其衍生物的合成根據(jù)熒光發(fā)色團(tuán)種類及活性位點(diǎn)不同，選取不同鏈接結(jié)構(gòu)，采用不同方法進(jìn)行合 成。①熒光發(fā)色衍生物含碳鏈結(jié)構(gòu)的合成向無(wú)水丙酮中，加入含活性羥基的熒光發(fā)色團(tuán)、無(wú)水K2CO3，加熱至回流后，加入二 鹵代烷，其中含活性羥基的熒光發(fā)色團(tuán)無(wú)水K2CO3:二鹵代烷的反應(yīng)摩爾比為1 3 1.2。 繼續(xù)回流攪拌12h，倒入冰水中，待固體完全析出，抽濾，干燥。干燥所得粗品進(jìn)行柱分離得 到帶有鹵代直鏈烴的熒光發(fā)色團(tuán)衍生物。②熒光發(fā)色衍生物含酰氯結(jié)構(gòu)的合成向無(wú)水二氯甲烷中，加入含活性羧基的熒光發(fā)色團(tuán)，將其置于冰浴中冷卻待用。與 熒光發(fā)色團(tuán)摩爾比為1 1的氯化亞砜溶于適量的無(wú)水二氯甲烷中，于20min內(nèi)滴加到上 述混合液中。室溫?cái)嚢?h，蒸除溶劑后，得帶有酰氯結(jié)構(gòu)的熒光發(fā)色團(tuán)衍生物。③熒光發(fā)色衍生物含酰胺結(jié)構(gòu)的合成向無(wú)水二氯甲烷中，加入含活性氨基的熒光發(fā)色團(tuán)，將其置于冰浴中冷卻待用。與 熒光發(fā)色團(tuán)摩爾比為1 1的氯乙酰氯溶于適量的無(wú)水二氯甲烷中，緩慢滴入上述冷卻液 中。滴完后，冰浴攪拌，TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)進(jìn)程。反應(yīng)完畢，產(chǎn)物用二氯甲烷稀釋，并依次用2mol/ L HC1、H20、飽和Na2CO3、飽和NaCl萃取，有機(jī)相用無(wú)水Na2SO4干燥。蒸除溶劑后，收集產(chǎn)生的灰白色固體，得到帶有酰胺結(jié)構(gòu)的熒光發(fā)色團(tuán)衍生物。3)功能性探針化合物的合成向有機(jī)溶劑中按照聯(lián)苯衍生物Ta-dD:熒光發(fā)色團(tuán)衍生物無(wú)水碳酸鉀= 1 (1 3) (3 6)的摩爾比，首先加入聯(lián)苯衍生物Ta-dD和無(wú)水碳酸鉀，60 80°C充 分混合后，然后加入熒光發(fā)色團(tuán)衍生物，60 80°C回流充分反應(yīng)；反應(yīng)完成后轉(zhuǎn)移到冰水 中，待固體完全析出后，抽濾，并將所得固體物干燥后，進(jìn)行硅膠柱層析(53 75 μ m的柱層 析硅膠)，以乙酸乙酯和甲醇的混合溶劑，或者乙酸乙酯和石油醚的混合溶劑進(jìn)行洗脫，得 到具有腫瘤細(xì)胞增殖抑制活性的熒光探針。實(shí)施例2香豆素型功能性探針化合物F-Ta-dD-OH的合成(熒光發(fā)色團(tuán)為香豆素 類結(jié)構(gòu)，其中R1為0H，R2為CH3 ；熒光發(fā)色團(tuán)通過(guò)碳原子為2的直鏈烷烴與Ta-dD連接)1)聯(lián)苯衍生物Ta-dD的合成與實(shí)施例1相同。2)熒光發(fā)色團(tuán)7-羥基-4-甲基香豆素的合成步驟如下 5. 5g (0. 05mol)間苯二酚溶于50mL濃硫酸中，待完全溶解后，緩慢滴入 6. 4mL(0. 05mol)乙酰乙酸乙酯，室溫?cái)嚢?0min，然后轉(zhuǎn)移冰水中，抽濾收集形成的固體。 粗品用95%乙醇重結(jié)晶，得白色針狀晶體。產(chǎn)率85%，m. p. 184 185°C。3)熒光發(fā)色團(tuán)衍生物7-(2-溴乙氧基)-4-甲基香豆素的合成，合成步驟如下 3. 53g(0. 02mol)7-羥基-4-甲基香豆素溶于 50mL 丙酮中，加入 8. 34g(0. 06mol) 無(wú)水K2CO3,60°C回流30min后，加入3mL(0. 03mol) 1,2- 二溴乙烷，繼續(xù)回流攪拌12h，倒 入冰水中，待固體完全析出，靜置后抽濾，真空干燥。將干燥所得的粗品進(jìn)行硅膠柱分離， 5cmX40cm色譜柱，石油醚裝柱。采用乙酸乙酯石油醚=1 3進(jìn)行洗脫，得白色固體，產(chǎn) 率 75%。m. ρ· 117 118°C。核磁1H NMR(400MHz, CDCl3) δ (ppm) 7. 522 (d, J = 8. 4Hz, 1H) ,6. 895 (d, J = 9. 2Hz, 1H) ,6. 822 (d, J = 2. 4Hz，1H)，6· 164 (s，1H)，4· 374 4· 344 (t，J = 6Ηζ，2Η)， 3. 696 3. 666 (t，J = 6Hz,2H)，2. 411 (s，3H) ·紅外 FT-IR(KBr)，υ /cm1 :3412，1716，1614， 1388，1263，1067,850.4)香豆素型功能性探針化合物F-Ta-dD-OH的合成，合成步驟如下3. 60g(0. 0Imo 1)Ta-dD 溶于 IOOmL 丙酮中，加入 4. 17g(0. 03mol)無(wú)水 K2CO3,60°C 回流30min后，再加入6. 77g(0. 024mol) 7-(2-溴乙氧基)_4_甲基香豆素，60°C繼續(xù)回流 攪拌反應(yīng)18h，然后轉(zhuǎn)移倒入冰水中，待固體完全析出，靜置后抽濾，真空干燥。將干燥所得的粗品進(jìn)行硅膠柱分離，5cmX40cm色譜柱，乙酸乙酯裝柱。采用乙酸乙酯與甲醇按體積比
30 1
-10 1進(jìn)行梯度洗脫，得淡黃色固體，產(chǎn)率58%。m.p.212 上述合成反應(yīng)式表示如下 所得熒光探針的鑒定為核磁1HNMR(400MHz, CDCl3) δ (ppm) 7. 408 (d, J = 8. 8Ηζ，2Η)，7· 299 (d，J = 8. 4Hz，2H)，6· 899 (d，J = 8. 4Hz，2H)，6· 715 (d，J = 6. 8Hz，2H)， 6. 599(s，2H)，6. 113(s，2H)，4. 251 3. 848 (m，12H)，2. 681 (d，J = 4. 8Hz，4H)，2. 379 (s， 4H)，1. 586(s，6H).紅夕卜 FT-IR(KBr)，υ/cm—1 :3414，2938，1721，1617，1294，1264，1145， 1068.實(shí)施例3香豆素型熒光探針化合物F-Ta-ClD-NH2的合成(熒光發(fā)色團(tuán)為香豆素類 結(jié)構(gòu)，其中R1為NH2, R2為CH3 ；熒光發(fā)色團(tuán)通過(guò)酰胺結(jié)構(gòu)與Ta-dD連接)1)聯(lián)苯衍生物Ta-dD的合成與實(shí)施例1相同。2)熒光發(fā)色團(tuán)為7-氨基-4-甲基香豆素，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行化合物2-氯-N- (4_甲 基-2-氧雜-2-氫-苯并吡喃-7-基)乙酰胺的合成，合成步驟如下 3. 60g (0. 02mol) 7~氨基_4_甲基香豆素溶于50mL無(wú)水二氯甲烷中，置于冰浴中 冷卻，然后緩慢滴入溶解有IOmL氯乙酰氯的無(wú)水二氯甲烷溶液(IOmL氯乙酰氯溶于35mL 無(wú)水二氯甲烷)滴完后，冰浴攪拌，TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)進(jìn)程。反應(yīng)完畢，產(chǎn)物用二氯甲烷稀釋，并 依次用2mol/L HC1、H20、飽和Na2CO3、飽和NaCl萃取，有機(jī)相用無(wú)水Na2SO4干燥。蒸除溶劑 后，收集產(chǎn)生的灰白色固體。產(chǎn)率62%，m. p. 283 284°C。
核磁1H NMR (400MHz, CDCl3) δ (ppm) :7. 692 (s，1H)，7. 591 7. 538 (m，2H)， 6. 235(s，1H)，4. 245(s，2H)，1. 582(s，3H).紅外 FT-IR(KBr)，υ/cm—1 3430，2979，2947， 2603，2495，1686，1478，1395，1174，1037.3)香豆素型功能性探針化合物F-Ta-ClD-NH2的合成，合成步驟如下
3. 60g(0. 01mol)Ta-dD 溶于 IOOmL 丙酮中，加入 4. 17g(0. 03mol)無(wú)水 K2CO3,60°C
回流30min后，再加入6. Og (0. 024mol) 2-氯-N- (4-甲基-2-氧雜-2-氫-苯并吡喃_7_基) 乙酰胺，60°C繼續(xù)回流攪拌20h，然后轉(zhuǎn)移倒入冰水中，待固體完全析出，靜置后抽濾，真空 干燥。將干燥所得的粗品進(jìn)行硅色譜分離，5cmX40cm色譜柱，乙酸乙酯裝柱。采用采用乙酸 乙酯與甲醇按體積比30 1 10 1進(jìn)行梯度洗脫，得白色固體，產(chǎn)率55%。m. p. 152 153°C。核磁1H NMR (400MHz, CDCl3) δ (ppm) :9· 022 (s，2H)，7· 733 (s，2H)，7· 602 7. 523 (m, 6H)，7. 346 (d, J = 8. 4Hz，2H)，6. 892 (d, J = 8. 8Hz，2H)，4. 462 (d，J = 14. 8Hz， 4H)，4· 214 (d，J = 14. 4Ηζ，4Η)，3· 861(s，6H)，2· 768 (d, J = 4. 8Hz，6H)，2· 418(s，6H).紅外 FT-IR(KBr)，υ /cm1 =3342,2939,1731，1692，1617，1526，1147，1064，1025.實(shí)施例4香豆素型功能性探針化合物F-Ta-dD-dOH的合成(熒光發(fā)色團(tuán)為香豆素 類結(jié)構(gòu)，其中R1為0H，R2為CH3 ；熒光發(fā)色團(tuán)與Ta-dD通過(guò)碳原子為2的碳鏈連接)1)聯(lián)苯衍生物Ta-dD、化合物7-(2_溴乙氧基)-4_甲基香豆素的合成，與實(shí)施例 2相同；2) 2-氯-N-(3-氯-4-氟苯)乙酰胺的合成，合成步驟如下 2. 91g(0. 02mol)3-氯_4_氟苯胺溶于50mL無(wú)水二氯甲烷中，置于冰浴中冷卻。 1.92mL氯乙酰氯溶于IOmL無(wú)水二氯甲烷中，緩慢滴入上述溶液中，滴完后，室溫?cái)嚢柽^(guò)夜， TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)進(jìn)程。反應(yīng)完畢，產(chǎn)物用二氯甲烷稀釋，并依次用2mo 1/L HCl、H20、飽和Na2C03、 飽和NaCl萃取，有機(jī)相用無(wú)水Na2SO4干燥。蒸除溶劑后，收集產(chǎn)生的黃白色固體。產(chǎn)率 76%, m. ρ· 95 96°C。核磁1H NMR (400MHz, CDCl3) δ (ppm) :8. 219 (s，1H)，7. 753 7. 732 (m, 1H), 7. 399 7. 368 (m, 1H), 7. 155 7. 112 (m, 1H) ,4. 200(s，2H).紅外 FT-IR(KBr), υ /cm1 3459，3311，2927，1670，1614，1557，1497，1398.3)6-(2-(3_氯-4-氟-苯胺)-2_羰乙氧基)_6，-羥基_5，5，- 二甲氧基-2，
2’ - 二甲酰甲胺的合成，合成步驟如下
3. 60g (0. Olmol) Ta-dD 溶于 IOOmL 干燥的 N, N-
甲基甲
酰胺中，加入2.08g(0.015mol)無(wú)水K2CO3,80 °C攪拌30min后，加入 2. 65g(0. 012mol)2-氯-N-(3-氯-4-氟苯)乙酰胺，保持80°C溫度，繼續(xù)攪拌24h，然后轉(zhuǎn) 移倒入冰水中，待固體完全析出，靜置后抽濾，真空干燥。將干燥所得粗品進(jìn)行硅膠柱色譜 分離，5cmX40cm色譜柱，乙酸乙酯裝柱。采用乙酸乙酯甲醇=15 1進(jìn)行洗脫，得淡黃 色固體，產(chǎn)率72%。m. p. 110 112°C。核磁 1H NMR (300MHz, CDCl3) δ (ppm) :8· 92 (s，1H)，8· 00 (d，J = 6·3Ηζ，1Η)， 7. 26-7. 29 (m, 3Η)，7. 08 (d, J = 8. 7Hz, 1Η)，6. 95 (d, J = 7. 9Hz, 1Η)，6. 72 (d, J = 7. 8Hz,1H)，6. 33 (br, 1H)，5. 72 (br, 1H)，4. 64 (s, 1H)，4. 59 (s, 1H)，3. 91 (s,3H)，3. 83 (s,3H)， 2. 84 (s，3H)，2. 63 (s, 3H) ·紅外 FT-IR(KBr)，υ /cm1 :3332，2938，1680，1635，1268，1024.4)香豆素型功能性探針化合物F-Ta-dD-dOH的合成，合成步驟如下 5.458(0.0111101)6-(2-(3-氯-4-氟-苯胺)-2-羰乙氧基)-6，-羥基 _5，5，-二 甲氧基-2，2’_二甲酰甲胺溶于IOOmL干燥的Ν，Ν-二甲基甲酰胺中，加入2. 08g(0. 015mol) 無(wú)水K2CO3,80°C攪拌30min后，加入3. 38g (0. 012mol) 7- (2-溴乙氧基)_4_甲基香豆素。保 持80°C繼續(xù)攪拌24h，然后轉(zhuǎn)移倒入冰水中，待固體完全析出，靜置后抽濾，真空干燥。粗品 進(jìn)行柱色譜分離，5cmX40cm色譜柱，乙酸乙酯裝柱。采用乙酸乙酯甲醇=20 1進(jìn)行洗 脫，得白色固體，產(chǎn)率61%。m.p. 108 109°C。核磁1H NMR(400MHz, CDCl3) δ (ppm) :7. 683 (s，2H)，7. 477 (d，J = 8. 8Ηζ，1Η)， 7. 306 (d, J = 8. 8Hz, 1H)，7. 195 (d, J = 8. 4Hz, 1H)，7. 106 7. 062 (t, J = 8. 8Hz, 1H)， 6. 842 6. 820 (m, 1H)，6. 728 (d, J = 8. 4Hz, 1H)，6. 640 (s, 1H)，6. 425 (d, J = 4. 8Hz, 1H)，
6.168 (s，1H)，4. 132 (s, 2H)，4. 132 4. 095 (d, J = 7. 6Hz,2H)，4. 006 3. 970 (d, J =
7.2Hz，2H)，3. 816(s，3H)，3. 759(s，3H)，2· 803 (d, J = 4. 8Ηζ，3Η)，2· 629 (d, J = 4. 8Hz，3H)， 1. 602 (s，3H).紅外 FT-IR(KBr)，υ /cm1 =3326,2938,1723，1618，1294，1263，1145，1021.實(shí)施例5香豆素型功能性探針化合物F-Ta-dD-dNH2的合成(熒光發(fā)色團(tuán)為香豆 素結(jié)構(gòu)，其中R1為0H，R2為CH3 ；鏈接結(jié)構(gòu)為酰胺結(jié)構(gòu))1)聯(lián)苯衍生物Ta-dD、化合物2_氯_N_ (4-甲基_2_氧雜_2_氫-苯并吡 喃-7-基)_乙酰胺的合成與實(shí)施例3相同。2)化合物2-氯-N_(3-氯_4_氟苯)乙酰胺、化合物6-(2_(3_氯_4_氟-苯 胺)-2_羰乙氧基)-6’ -羥基_5，5’ - 二甲氧基_2，2’ - 二甲酰甲胺的合成與實(shí)施例4相 同。
3)香豆素型功能性探針化合物F-Ta-dD-dNH2的合成，合成步驟如下 5.458(0.0111101)6-(2-(3-氯-4-氟-苯胺)-2-羰乙氧基)-6，-羥基 _5，5，-二 甲氧基-2，2’_二甲酰甲胺溶于IOOmL干燥的N，N-二甲基甲酰胺中，加入2. 08g(0. 015mol) 無(wú)水 K2CO3,80°C攪拌 30min 后，加入 3. Olg (0. 012mol) 2-氯-N- (4-甲基-2-氧雜 _2_ 氫-苯 并吡喃-7-基)乙酰胺；保持80°C溫度，繼續(xù)攪拌24h，然后轉(zhuǎn)移倒入冰水中，待固體完全析 出，靜置后抽濾，真空干燥。將干燥所得粗品進(jìn)行硅膠柱色譜分離，5cmX40cm色譜柱，乙酸 乙酯裝柱。采用乙酸乙酯甲醇=25 1進(jìn)行洗脫，得灰白色固體，產(chǎn)率56%。m. p. 179 180 "C。核磁1HNMR(400MHz, CDCl3) δ (ppm) :7. 765 7. 717 (m，1H)，7. 617 7. 524 (m， 2H)，7. 343 7. 306 (m, 2H)，7. 129 7. 068 (m, 3H)，6. 888 (d, J = 8. 4Hz,2H)，6. 211 (s，1H)， 4. 457 4. 405 (m, 2H), 4. 204 (d, J = 14. 8Hz，2H)，3. 872(s，6H)，2. 761 (d, J = 3. 2Hz，6H)， 2.420(s，3H).紅外 FT-IR(KBr)，υ/cm—1 :3373，2935，1703，1621，1528，1499，1407，1146， 1020.實(shí)施例6吲哚型功能性探針化合物F-Ta-dD-indo的合成(熒光發(fā)色團(tuán)為吲哚類 結(jié)構(gòu)，其中R1為NH2, R3為氯原子；鏈接結(jié)構(gòu)為酰胺結(jié)構(gòu))1)聯(lián)苯衍生物Ta-dD的合成與實(shí)施例1相同。2) 2-氯-N-(5-氯-1-氫-吲哚_6_基)乙酰胺的合成，合成步驟如下 3. 32g(0. 02mol)5_氯-6-氨基吲哚溶于30mL無(wú)水二氯甲烷中，置于冰浴中冷卻； 2mL氯乙酰氯溶于IOmL無(wú)水二氯甲烷中，緩慢滴入到上述冷卻后的溶液中，滴完后，室溫?cái)?拌過(guò)夜，TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)進(jìn)程。反應(yīng)完畢后，產(chǎn)物用二氯甲烷稀釋，并依次用2mol/L HCUH2O, 飽和Na2CO3、飽和NaCl萃取，有機(jī)相用無(wú)水Na2SO4干燥。蒸除溶劑后，收集所得固體產(chǎn)物。3)吲哚型功能性探針化合物F-Ta-dD-indo的合成，合成步驟如下 3. 60g(0. 01mol)Ta-dD 溶于 IOOmL 丙酮中，加入 4. 17g(0. 03mol)無(wú)水 K2CO3,60°C 回流30min后，再加入5. 8g (0. 024mol) 2-氯-N- (5-氯-1-氫-吲哚-6-基)乙酰胺，60°C 繼續(xù)回流攪拌20h，然后轉(zhuǎn)移倒入冰水中，待固體完全析出，靜置后抽濾，真空干燥，粗品進(jìn) 行硅膠柱色譜分離后得到熒光探針F-Ta-dD-indo。實(shí)施例7羅丹明型功能性探針化合物F-Ta-dD-Rod的合成(熒光發(fā)色團(tuán)為羅丹明 B結(jié)構(gòu)，其中R2為甲基，R3為氫原子；鏈接結(jié)構(gòu)為酰氯結(jié)構(gòu))1)聯(lián)苯衍生物Ta-dD的合成與實(shí)施例1相同。2)羅丹明B酰氯的合成，合成步驟如下 4. 42g(0. Olmol)羅丹明B溶于IOOmL無(wú)水三氯甲烷中，將3mL SOCl2溶于20mL無(wú) 水三氯甲烷中，于20min內(nèi)滴加到羅丹明B混合液中。室溫?cái)嚢?h，蒸除溶劑后，收集所得 固體產(chǎn)物。3)羅丹明型功能性探針化合物F-Ta-dD-Rod的合成，合成步驟如下1. 80g(0. Olmol) Ta-dD溶于IOOmL干燥的N，N- 二甲基甲酰胺中，加入 2. IOg(0. 15mol)無(wú)水 K2CO3,80°C攪拌 30min 后，加入 9. 08g(0. 02mol)羅丹明 B 酰氯，80°C 下繼續(xù)攪拌36h，TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)進(jìn)程，反應(yīng)完畢，將混合液倒入冰水中，待固體完全析出后， 抽濾，將固體產(chǎn)物干燥，將干燥所得粗品進(jìn)行硅膠柱色譜分離得到熒光探針F-Ta-dD-Rod。上述合成反應(yīng)式表示如下
實(shí)施例8熒光素型功能性探針化合物F-Ta-dD-Fluo的合成(熒光發(fā)色團(tuán)為熒光
素結(jié)構(gòu)，其中R3為氫原子；鏈接結(jié)構(gòu)為酰氯結(jié)構(gòu))1)聯(lián)苯衍生物Ta-dD的合成與實(shí)施例1相同。2)熒光素酰氯的合成，合成步驟如下 3. 32g(0. Olmol)熒光素溶于60mL無(wú)水四氫呋喃中，將3mL SOCl2溶于20mL無(wú)水 四氫呋喃中，于20min內(nèi)滴加到上述熒光素混合液中。室溫?cái)嚢?h，蒸除溶劑后，收集所得 固體產(chǎn)物。3)熒光素型功能性探針化合物F-Ta-dD-Fluo的合成，合成步驟如下 1. 80g(0. Olmol) Ta-dD溶于IOOmL干燥的N，N- 二甲基甲酰胺中，加入 2. IOg (0. 15mol)無(wú)水 K2CO3,80°C攪拌 30min 后，加入 5. 25g(0. 015mol)熒光素酰氯，80°C下 繼續(xù)攪拌36h，TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)進(jìn)程，反應(yīng)完畢，將混合液倒入冰水中，待固體完全析出后，抽 濾，真空干燥，將干燥所得粗品進(jìn)行硅膠柱色譜分離得到熒光探針F-Ta-dD-Fluo。具有腫瘤細(xì)胞增殖抑制活性與熒光特性的功能性熒光探針熒光光譜測(cè)定的具體 步驟如下1)待測(cè)物儲(chǔ)備液的配制分別準(zhǔn)確稱取上述制備的F-Ta-dD-OH、F-Ta-dD_NH2、F-Ta-dD-dOH 和 F-Ta-dD-dNH2作為待測(cè)物，用甲醇或DMSO溶解，以甲醇為溶劑，配成1. 0 X lO^mol/L的儲(chǔ)備 液。2)待測(cè)物熒光光譜的測(cè)定應(yīng)用F-4500型分光光度計(jì)對(duì)上述儲(chǔ)備液做熒光光譜的測(cè)量，同時(shí)以Ta_dD、 Coumarin-NH2, Coumarin-NH2-Cl作為比較。測(cè)試條件室溫，調(diào)整激發(fā)波長(zhǎng)λ ex(275 375nm)，樣品池為IcmX IcmX4cm石英比色皿，狹縫寬度10nm，靈敏度為2。F-Ta-dD-0H, F-Ta-dD-NH2、F-Ta-dD-d0H、和F-Ta-dD_dNH2的熒光光譜圖分別如圖1 4所示，其中橫坐 標(biāo)為波長(zhǎng)、縱坐標(biāo)為相對(duì)熒光強(qiáng)度?？梢悦黠@看出，助色團(tuán)不同的兩種香豆素型熒光發(fā)色團(tuán)的引入使功能型探針化合 物具有相同的變化趨勢(shì)香豆素類熒光基團(tuán)7-羥基-4-甲基香豆素(Coumarin-OH)、7_氨 基-4-甲基香豆素(Coumarin-NH2)本身具有優(yōu)良的熒光性能，衍生化后所的產(chǎn)物7-(2-溴乙氧基)-4_甲基香豆素(Coumarin-OH-Br)、2-氯-N-(4-甲基_2_氧雜-2-氫-苯并吡 喃-7-基)乙酰胺(Coumarin-NH2-Cl),熒光強(qiáng)度有所降低。當(dāng)將其衍生物引入到不具有 熒光特性的聯(lián)苯衍生物Ta-dD的結(jié)構(gòu)中后，所得探針化合物F-Ta-dD-OH、F-Ta-dD-NH2、 F-Ta-dD-dOH、F-Ta-dD-dNH2均衍生具有了一定的熒光特性，其最大吸收波長(zhǎng)分別為410nm、 408nm、403nm、408nm。而其他熒光發(fā)生團(tuán)的衍生物引入不具有熒光特性的聯(lián)苯衍生物Ta-dD 的結(jié)構(gòu)中后，所得探針化合物也相應(yīng)的具有一定的熒光特性。具有腫瘤細(xì)胞增殖抑制活性與熒光特性的功能性熒光探針對(duì)乳腺腫瘤細(xì)胞不同 細(xì)胞株增殖的抑制作用，方法采用MTT比色法，具體步驟如下1)將適宜濃度的乳腺腫瘤細(xì)胞的懸液混勻后以每孔180 μ 1接種于96孔板中， 其中，各細(xì)胞株的具體濃度為 MCF-7 = 3Χ1(Γ4Μ、MDA-MB-231 = 4Χ1(Γ4Μ、ZR-75-30 = 3 X 1(Γ4Μ、SK-BR-3 = 5 X 1(Γ4Μ。2)將乳腺腫瘤細(xì)胞在37°C、5% CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)24h，加入功能性熒光探 針，使每種熒光探針的終濃度分別為5 χ 10_5Μ、1 X 10_5M、1 X 10_6M。3)繼續(xù)培養(yǎng)48h后，換無(wú)血清的培養(yǎng)基(具體為MCF-7 :PRMI1640, MDA-MB-231 PRMI1640, ZR-75-30 =RPMI 1640, SK-BR-3 :DMEM)。各孔中加入 5mg/mL 的 MTT 工作液 20 μ L， 繼續(xù)培養(yǎng)4h，棄培養(yǎng)液，每孔加入150 μ L 二甲基亞砜(DMSO)，在室溫下震蕩溶解15min后， 酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定波長(zhǎng)490nm時(shí)各孔的紫外吸收值(0D值)，每個(gè)濃度設(shè)5個(gè)復(fù)孔。4)與陽(yáng)性藥吉非替尼進(jìn)行對(duì)照比較上述合成得到的功能性探針F-Ta-dD-OH、F-Ta-dD_NH2 與 F-Ta-dD-dOH、 F-Ta-dD-dNH2不同濃度時(shí)(5X 1(Γ5Μ、1 X 1(Γ5Μ、1 X I(T6M)對(duì)乳腺腫瘤細(xì)胞細(xì)胞株MCF-7、 MDA-MB-231、ZR-75-30、SK-BR-3增殖的抑制率的直方圖如圖5 6、圖7 8所示，其中橫坐 標(biāo)表示應(yīng)用的陽(yáng)性對(duì)照吉非替尼、熒光探針及所選的乳腺腫瘤細(xì)胞不同的細(xì)胞株，縱坐標(biāo) 表示抑制率?？梢钥闯鰺晒馓结?F-Ta-dD-OH、F-Ta-dD-NH2、F-Ta-dD-dOH、F-Ta-dD-dNH2 對(duì) 不同乳腺腫瘤細(xì)胞細(xì)胞株MCF-7、MDA-MB-231、ZR-75-30、SK-BR-3的增殖均有不同程度的 抑制作用；并且隨著熒光探針化合物的濃度增加，熒光探針對(duì)乳腺腫瘤細(xì)胞增殖的抑制率 也相應(yīng)的增加，針對(duì)不同的細(xì)胞株增加程度會(huì)存在區(qū)別；而當(dāng)熒光探針化合物的濃度達(dá)到 5X ICT5M的濃度時(shí)，都對(duì)乳腺腫瘤細(xì)胞的增殖表現(xiàn)了明顯的抑制，抑制率最高達(dá)到了 60%， 除了 F-Ta-dD-dNH2對(duì)ZR-75-30細(xì)胞株的抑制率，最低也達(dá)到了 10 % ；但是F-Ta-dD_dNH2對(duì) ZR-75-30細(xì)胞株的抑制率在1 X IO-6M低濃度時(shí)，甚至超過(guò)了陽(yáng)性對(duì)照吉非替尼的抑制率。
權(quán)利要求
一種具有腫瘤細(xì)胞增殖抑制活性的熒光探針，其特征在于，是在聯(lián)苯衍生物Ta dD的一個(gè)或兩個(gè)酚羥基上連接熒光發(fā)色團(tuán)；所述的聯(lián)苯衍生物Ta dD的結(jié)構(gòu)式為FDA0000023450340000011.tif
2.如權(quán)利要求1所述的具有腫瘤細(xì)胞增殖抑制活性的熒光探針，其特征在于，所述的熒光發(fā)色團(tuán)為香豆素類、吲哚類、羅丹明類或熒光素類，其結(jié)構(gòu)式分別為 羅丹明類熒光素類 其中，R1為羥基或氨基；R2為氫原子、甲基或乙基；R3為氯原子、溴原子或氟原子。
3.如權(quán)利要求1所述的具有腫瘤細(xì)胞增殖抑制活性的熒光探針，其特征在于，所述的 熒光發(fā)色團(tuán)為含有羥基的熒光發(fā)色團(tuán)，通過(guò)碳原子數(shù)為2 6的直鏈烴基與Ta-dD連接；或者為含有羧基的熒光發(fā)色團(tuán)，通過(guò)酰基與Ta-dD連接；或者為含有氨基的熒光發(fā)色團(tuán)，通過(guò)酰亞胺基與Ta-dD連接。
4.如權(quán)利要求1所述的具有腫瘤細(xì)胞增殖抑制活性的熒光探針，其特征在于，在聯(lián) 苯衍生物Ta-dD的一個(gè)或兩個(gè)酚羥基上連接熒光發(fā)色團(tuán)得到的熒光探針為F-Ta-dD-OH、 F-Ta-dD-NH2、F-Ta-dD-Rod、F-Ta-dD-Fluo 或 F-Ta-dD-indo。
5.如權(quán)利要求1所述的具有腫瘤細(xì)胞增殖抑制活性的熒光探針，其特征在于，所述的 聯(lián)苯衍生物Ta-dD的一個(gè)酚羥基與熒光發(fā)色團(tuán)連接，另一個(gè)酚羥基與2-氯-N- (3-氯-4-氟 苯)乙酰胺連接。
6.如權(quán)利要求1所述的具有腫瘤細(xì)胞增殖抑制活性的熒光探針，其特征在于，在 聯(lián)苯衍生物Ta-dD的一個(gè)酚羥基上連接熒光發(fā)色團(tuán)得到的熒光探針為F-Ta-dD-dOH或 F-Ta-dD-dNH2。
7.一種具有腫瘤細(xì)胞增殖抑制活性的熒光探針的制備方法，其特征在于，包括以下步驟a、聯(lián)苯衍生物Ta-dD的合成1)3-羥基-4-甲氧基苯甲醛在鐵粉催化作用下，與液溴在醋酸緩沖液中反應(yīng)得到2-溴 3-羥基-4-甲氧基苯甲醛；2)以氯化芐作為保護(hù)試劑，對(duì)2-溴3-羥基-4-甲氧基苯甲醛的酚羥基進(jìn)行保護(hù)，得到 3-芐氧基-2-溴-4-甲氧基苯甲醛；3)以過(guò)氧化氫-亞氯酸鈉體系作為氧化劑，將3-芐氧基-2-溴-4-甲氧基苯甲醛氧化 得到3-芐氧基-2-溴-4-甲氧基苯甲酸；4)先將3-芐氧基-2-溴-4-甲氧基苯甲酸溶解在無(wú)水二氯甲烷中，通過(guò)酰化反 應(yīng)制成3-芐氧基-2-溴-4-甲氧基苯甲酰氯，然后再與甲胺水溶液反應(yīng)得到3-芐氧 基-2-溴-4-甲氧基-N-甲基甲酰胺；5)3-芐氧基-2-溴-4-甲氧基-N-甲基甲酰胺通過(guò)Ullmarm反應(yīng)制得芐基保護(hù)的聯(lián)苯 雙酰胺化合物6’ 6- 二芐氧基-5’ 5- 二甲氧基聯(lián)苯-2’ 2- 二 N-甲基甲酰胺；6)5，5’- 二甲氧基_6，6’ - 二芐氧基聯(lián)苯_2，2’ - 二苯甲酰甲胺通過(guò)催化氫化脫去芐 基保護(hù)基，得到帶有兩個(gè)酚羥基的聯(lián)苯衍生物Ta-dD ；b、熒光發(fā)色團(tuán)衍生物的合成利用熒光發(fā)色團(tuán)中含有的羥基與二鹵代烷發(fā)生醚化反應(yīng)，生成帶有鹵代直鏈烴的熒光 發(fā)色團(tuán)衍生物；或者利用熒光發(fā)色團(tuán)中含有的羧基發(fā)生酰氯化反應(yīng)，生成帶有酰氯結(jié)構(gòu)的熒光發(fā)色團(tuán) 衍生物；或者利用熒光發(fā)色團(tuán)中含有的氨基發(fā)生酰胺化反應(yīng)，生成帶有酰胺結(jié)構(gòu)的熒光發(fā)色團(tuán) 衍生物；c、熒光探針的合成向有機(jī)溶劑中按照聯(lián)苯衍生物Ta-dD 熒光發(fā)色團(tuán)衍生物無(wú)水碳酸鉀=1 (1 3) (3 6)的摩爾比，首先加入聯(lián)苯衍生物Ta-dD和無(wú)水碳酸鉀，60 80°C充分混合 后，然后加入熒光發(fā)色團(tuán)衍生物，60 80°C回流充分反應(yīng)；反應(yīng)完成后轉(zhuǎn)移到冰水中，待固 體完全析出后，將固體物分離并干燥，然后進(jìn)行硅膠柱層析分離，以乙酸乙酯和甲醇的混合 溶劑或乙酸乙酯和石油醚的混合溶劑進(jìn)行洗脫，得到具有腫瘤細(xì)胞增殖抑制活性的熒光探 針。
8.如權(quán)利要求7所述的具有腫瘤細(xì)胞增殖抑制活性的熒光探針的制備方法，其特征在 于，所述的二鹵代烷為碳原子個(gè)數(shù)為2 6的直鏈鹵代烴，兩個(gè)鹵原子分別連接于首位碳原 子上，含羥基的熒光發(fā)色團(tuán)與二鹵代烷的摩爾比為1 1;含羧基的熒光發(fā)色團(tuán)與氯化亞砜發(fā)生酰氯化反應(yīng)，兩者的摩爾比為1 1;含氨基的熒光發(fā)色團(tuán)與氯乙酰氯發(fā)生酰胺化反應(yīng)，兩者的摩爾比為1 1。
9.如權(quán)利要求7所述的具有腫瘤細(xì)胞增殖抑制活性的熒光探針的制備方法，其特征在 于，所述的熒光發(fā)色團(tuán)衍生物為7- (2-溴乙氧基)-4-甲基香豆素、2-氯-N- (4-甲基-2-氧 雜-2-氫-苯并吡喃-7-基)-乙酰胺、2-氯-N- (5-氯-1-氫-吲哚-6-基)乙酰胺、羅丹 明B酰氯或熒光素酰氯；所述的有機(jī)溶劑為N，N- 二甲基甲酰胺或丙酮。
10.如權(quán)利要求7所述的具有腫瘤細(xì)胞增殖抑制活性的熒光探針的制備方法，其特征 在于，所述的用于柱分離的洗脫溶劑，以體積比計(jì)，乙酸乙酯和甲醇的混合溶劑為乙酸乙 酯甲醇=30 1 10 1，乙酸乙酯和石油醚的混合溶劑為乙酸乙酯石油醚=1 3。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種具有腫瘤細(xì)胞增殖抑制活性的熒光探針及其制備方法。所述的具有腫瘤細(xì)胞增殖抑制活性的熒光探針，是在聯(lián)苯衍生物Ta-dD的一個(gè)或兩個(gè)酚羥基上連接熒光發(fā)色團(tuán)，所述的熒光發(fā)色團(tuán)為香豆素型、吲哚型、羅丹明型或熒光素型。聯(lián)苯衍生物Ta-dD和酚羥基連接的功能分子保持對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖抑制活性，而指示性的熒光是由熒光發(fā)色團(tuán)發(fā)出的。本發(fā)明公開(kāi)的熒光探針既保持了對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖抑制活性，又具有一定的熒光性能。作為一種靶向工具分子，可與腫瘤細(xì)胞直接作用，通過(guò)其熒光性能的變化，來(lái)進(jìn)行藥物作用機(jī)制和作用效果研究。
文檔編號(hào)A61P35/00GK101921587SQ20101023020
公開(kāi)日2010年12月22日 申請(qǐng)日期2010年7月19日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月19日
發(fā)明者盧聞, 展穎轉(zhuǎn), 張彥民, 張 杰, 李西玲, 王嗣岑, 賀懷貞, 賀浪沖 申請(qǐng)人:西安交通大學(xué)