專利名稱：Slit-robo介導的淋巴管形成及其應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及領(lǐng)域為Slit-Robo信號傳導相關(guān)疾病的預防、診斷和治療；特別是癌癥發(fā)生及轉(zhuǎn)移的診斷與治療。
背景技術(shù)：
癌癥在晚期的轉(zhuǎn)移是癌癥病人死亡的主因。已有大量工作投入于研究癌癥及其治療，尤其是研究調(diào)控癌癥的成長和轉(zhuǎn)移的機制。但癌癥轉(zhuǎn)移的分子機制仍不清楚。一般的癌轉(zhuǎn)移過程是這樣的癌細胞從原發(fā)灶浸潤入血液循環(huán)系統(tǒng)或淋巴循環(huán)系統(tǒng)，然后通過循環(huán)系統(tǒng)到達并進入新的組織，成長為新的病灶。癌細胞的淋巴結(jié)高轉(zhuǎn)移率表明淋巴系統(tǒng)在癌癥轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要作用。淋巴系統(tǒng)對體內(nèi)體液平衡的保持、免疫反應和脂肪酸的吸收都具有重要作用。除了這些正常的生理作用，淋巴系統(tǒng)對淋巴結(jié)腫大和炎癥反應也有重要作用。在研究中發(fā)現(xiàn)， 很多發(fā)生癌癥轉(zhuǎn)移的病人都伴隨淋巴管的增多，這表明淋巴系統(tǒng)在癌癥轉(zhuǎn)移的過程中有重要促進作用。可是，淋巴系統(tǒng)在癌癥轉(zhuǎn)移中究怎樣發(fā)揮作用還沒有研究清楚。由于淋巴系統(tǒng)在癌癥的轉(zhuǎn)移中扮演重要角色，將腫瘤的淋巴轉(zhuǎn)移作為治療靶點就成為一種治療癌癥的有效手段。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個方面是有關(guān)針對Slit蛋白引起疾病的預防和治療的方法。其中一個具體方法是利用一種能夠調(diào)節(jié)或抑制Slit和Robo蛋白相互作用的物質(zhì)來調(diào)控淋巴管的形成，從而達到預防或治療疾病的目的。該物質(zhì)可以是針對Slit的抗體、針對Robo的抗體、一段Robo胞外區(qū)的蛋白或者是一段Robo胞外區(qū)的融合蛋白。Slit蛋白可能是Slit2， Robo蛋白可能是Robol或Robo4。本發(fā)明的另一方面是有關(guān)針對能夠預防和治療Slit蛋白引起的疾病的藥物。其中一種合成藥物包括一種能夠調(diào)節(jié)或抑制Slit-Robo信號相互作用從而調(diào)控淋巴管的形成的物質(zhì)與藥物賦形劑、攜帶劑和溶解劑。該物質(zhì)可以是針對Slit的抗體、針對Robo的抗體、一段Robo胞外區(qū)的蛋白或者是一段Robo胞外區(qū)的融合蛋白。Slit蛋白可能是Slit2， Robo蛋白可能是Robol或Robo4。本發(fā)明的一個方面是有關(guān)針對Slit蛋白引起的疾病的診斷的方法。其中一種針對Slit蛋白引起的疾病的診斷的方法如下(a)首先從檢測目標得到檢測樣本，檢測單獨的Slit蛋白或Robo蛋白的表達水平或Slit蛋白和Robo蛋白兩者的表達水平；(b)其次從正常人群眾取得樣品作為對照，檢測該樣品的單獨的Slit蛋白或Robo蛋白的表達水平或Slit蛋白和Robo蛋白兩者的表達水平；(c)然后比較(a)和(b)檢測到的表達結(jié)果，來確定該檢測目標是否有Slit蛋白引起的疾病。Slit蛋白可能是Slit2，Robo蛋白可能是 Robol或Robo4。所做的檢測可以是DNA水平、RNA水平和(或)蛋白水平的檢測。本發(fā)明的其他方面的權(quán)益將在隨后的描述和附加聲明中闡明。


圖1展示了 Slit2蛋白在癌癥中的表達情況。(a)用Slit2抗體通過免疫印跡實驗檢測多株來源于不同癌癥的細胞株裂解液的Slit2蛋白表達情況。S1U2/293細胞株作為檢測的陽性對照，V/293細胞株作為檢測的隱性對照。(b)用Slit2抗體通過免疫組織化學檢測人癌癥樣本的Slit2蛋白表達情況。箭頭指示Slit2蛋白在腫瘤細胞中表達。上圖的標尺代表100 μ m，下圖的標尺代表10 μ m。(c)用Slit2抗體通過免疫組織化學檢測人乳腺癌浸潤樣本展示的Slit2分布梯度。箭頭指示腫瘤內(nèi)部的細微管狀結(jié)構(gòu)。上圖的標尺代表100 μ m，下圖的標尺代表40 μ m。圖2展示Slit2轉(zhuǎn)基因小鼠的構(gòu)建。(a)用于做轉(zhuǎn)基因小鼠的攜帶人 Slit2(hSlit2)基因的表達載體的示意圖。(b)斑點雜交法檢測9#小鼠為hSlit2轉(zhuǎn)基因陽性小鼠。(c)南方墨點法檢測9#小鼠為hSlit2轉(zhuǎn)基因陽性小鼠。(d)用hSlit2單克隆抗體5A5通過免疫印跡法檢測hSlit2轉(zhuǎn)基因小鼠胰腺部位的hSlit2表達情況。同型免疫球蛋白G作為陰性對照。HS1U2/293細胞裂解液作為陽性對照。(e)用FLAG單克隆抗體M2 通過免疫印跡法檢測Flag-hSlit2轉(zhuǎn)基因小鼠胰腺部位的hSlit2表達情況。(f)用RT-PCR 方法分析hSlit2轉(zhuǎn)基因小鼠中FLAG的表達。C57小鼠作為陰性對照。(g)用免疫組織化學方法檢測正常小鼠胰腺組織沒有hSlit2的表達(左上圖)，其余的圖用連續(xù)切片進行免疫組化，展示Rip_Tag2轉(zhuǎn)基因小鼠的胰腺組織的胰島素的表達，hSlit2的表達，Robol的表達載，及vWF的表達。(h)免疫組織化學分析hSlit2/Ripl-Tag2轉(zhuǎn)基因小鼠胰腺組織的 Slit2表達顯著高于Ripl-Tag2轉(zhuǎn)基因小鼠的表達。*p < 0. 05 ；標尺=IOym0圖3展示Slit2促進胰腺腫瘤的生長。比較Ripl_Tag2和SlitZ/Ripl-hgZ轉(zhuǎn)基因小鼠的(a)血性胰島數(shù)目，(b)腫瘤體積，(c)腫瘤數(shù)目，(d)胰腺與血液的白細胞數(shù)目。 (e)轉(zhuǎn)基因小鼠胰腺瘤的熒光染色。(f)轉(zhuǎn)基因小鼠胰腺瘤的蘇木精伊紅染色。熒光染色和蘇木精伊紅染色都展示了 Slit2/Ripl-Tag2轉(zhuǎn)基因小鼠比Ripl_Tag2轉(zhuǎn)基因小鼠擁有更大的腫瘤，更多的血管。免疫組織化學方法比較Ripl_Tag2和Slit2/Ripl-Tag2轉(zhuǎn)基因小鼠的(g)血管密度，(h)增殖指數(shù)，和(i)凋亡指數(shù)，展示出Slit2/Ripl-Tag2轉(zhuǎn)基因小鼠比Ripl-Tag2轉(zhuǎn)基因小鼠擁有更多的新生血管，更高的增殖和更少的凋亡。標尺50 μ m ；* ρ < 0. 05 ；** :p < 0. 01。圖4展示14周齡Slit2/Ripl-Tag2轉(zhuǎn)基因小鼠腫瘤淋巴轉(zhuǎn)移的組織學鑒定和轉(zhuǎn)移率分析。Slit2/Ripl-Tag2轉(zhuǎn)基因小鼠展示(a)原位胰島素瘤，腸系膜淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶和腸壁轉(zhuǎn)移灶解剖示意圖(箭頭所示)，(b-c)轉(zhuǎn)移灶的蘇木精伊紅染色(箭頭所示為轉(zhuǎn)移的腫瘤細胞)。(d-h)用T-antigen抗體進行免疫組化確證腸系膜淋巴結(jié)和腸壁的轉(zhuǎn)移灶都是由胰島β腫瘤細胞形成的。(i)Ripl_Tag2和Slit2/Ripl-Tag2兩種轉(zhuǎn)基因小鼠轉(zhuǎn)移率的統(tǒng)計，統(tǒng)計結(jié)果顯示Slit2過表達顯著促進胰島腫瘤細胞的腸系膜淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率。(j)圖顯示 14周齡兩種小鼠胰島素瘤的體積沒有明顯差異，說明轉(zhuǎn)移率的上升不是由于腫瘤生長加快間接引起的，而是由于Slit2過表達直接引起的。(k)圖顯示Slit2/Ripl-Tag2小鼠的生存率明顯下降。圖5展示Slit2過表達促進體內(nèi)胰島素瘤的淋巴管新生及Slit2重組蛋白誘導體外人淋巴內(nèi)皮細胞遷移及形成管狀結(jié)構(gòu)。免疫組化檢測淋巴管標記蛋白，結(jié)果顯示晚期Slit2/Ripl-Tag2小鼠腫瘤淋巴管新生明顯高于Ripl-Tag2小鼠(a_c)。用免疫熒光的方法檢測到Robol在胰腺淋巴管上表達(d)。同時Robol表達于原代淋巴內(nèi)皮細胞膜上(e-f)。 重組的Slit2. 1蛋白通過作用于其受體Robol促進淋巴內(nèi)皮細胞在Matrigel上的管腔形成(g_h)，并趨化淋巴內(nèi)皮細胞遷移(i-j)；遷移和管狀結(jié)構(gòu)的形成都能被R5特異性抑制 (g-j)?！?” 是陰性對照。VEGF-C 是陽性對照·。* :p < 0. 05 ；** :p < 0. 01。圖6展示(A)hRobo-Fc與hSlit2重組蛋白相互作用；(B) R5 (針對Robol蛋白第一個Immunoglobulin-Iike區(qū)段的單克隆抗體)抑制hRobo_Fc與hSlit2重組蛋白的相互作用。圖7展示用標記了辣根過氧化氫酶的兔抗人免疫球蛋白檢測分子量約為85道爾頓的重組hRobo-Fc蛋白。圖8展示Slit2單克隆抗體的特異性分析及在多種人腫瘤組織的檢測。免疫印跡實驗被用于檢測抗體Sl和S3對Slit2蛋白全長或片段的識別。(a)Sl通過與Slit2氮端結(jié)合識別全長Slit2。9E10和S3通過與Slit2碳端結(jié)合識別全長Slit2?？贵wSl和S3都能特異性識別Sli2，同時Sl也能識別Slitl和Slit3蛋白。9E10作為陽性對照。Sl單克隆抗體用于檢測結(jié)腸癌和乳腺癌(b)，原位肺癌和轉(zhuǎn)移肺癌(c)，和有淋巴轉(zhuǎn)移和無淋巴轉(zhuǎn)移的結(jié)腸癌(d)中Slit2的表達。mlgG作為陰性對照(免疫組織化學分析)。標尺10μπι。
具體實施例方式本發(fā)明主要針對Slit蛋白引起的疾病的診斷、預防和治療方法，尤其是與淋巴管形成相關(guān)的疾病。這些Slit蛋白引起的疾病與Slit蛋白與其受體Robo蛋白的結(jié)合有關(guān)， 這些疾病包括腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移，比如腫瘤的淋巴轉(zhuǎn)移。具體而言，本發(fā)明第一方面提供了一種預防或治療由Slit蛋白引起的病癥的方法，包含向個體施與有療效劑量的可調(diào)節(jié)或阻斷Slit蛋白與一種Robo蛋白相互作用的藥物，其特征在于，所述病癥與淋巴管形成相關(guān)。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述Slit蛋白是Slit2。在另一個優(yōu)選的實施方案中，所述Robo蛋白是Robol或Robo4。在另一個優(yōu)選的實施方案中，所述藥物是針對于Slit蛋白的一種抗體。在另一個優(yōu)選的實施方案中，所述藥物是針對Robo蛋白的一種抗體。在另一個優(yōu)選的實施方案中，所述的抗體是一種單克隆抗體，優(yōu)選是人源化的抗體。在另一個優(yōu)選的實施方案中，所述藥物是Robo蛋白胞外區(qū)的某一片段。所述的片段優(yōu)選來源于Rob0蛋白的第一個免疫球蛋白樣區(qū)域。在另一個優(yōu)選的實施方案中，所述藥物是一種Robo融合蛋白，優(yōu)選是Robo-Fc融
合蛋白ο本發(fā)明第二方面提供了一種預防治療Slit介導的疾病的藥物。這種藥物包含能調(diào)節(jié)或干擾Slit蛋白與Robo蛋白相互作用的藥物，和一種藥物賦形劑、載體或溶劑，其中 Slit介導的疾病是與淋巴管形成有關(guān)。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述Slit蛋白是Slit2。在另一個優(yōu)選的實施方案中，所述能調(diào)節(jié)或干擾Slit蛋白與Robo蛋白相互作用的藥物是針對于Slit蛋白或Robo蛋白的一種抗體。在另一個優(yōu)選的實施方案中，所述抗體是一種單克隆抗體，優(yōu)選人源化抗體。在另一個優(yōu)選的實施方案中，所述能調(diào)節(jié)或干擾Slit蛋白與Robo蛋白相互作用的藥物是Rob0蛋白胞外區(qū)的某一片段。所述片段優(yōu)選來源于Robo蛋白的第一個免疫球蛋白樣區(qū)域。在另一個優(yōu)選的實施方案中，所述能調(diào)節(jié)或干擾Slit蛋白與Robo蛋白相互作用的藥物是一種Robo融合蛋白，優(yōu)選Robo-Fc融合蛋白。本發(fā)明第三方面提供了一種針對Slit蛋白引起的疾病的診斷的方法如下(a)首先從檢測目標得到檢測樣本，檢測單獨的Slit或Robo的水平或Slit和Robo兩者的水平； (b)其次從正常人取得樣品作為對照，檢測該樣品的單獨的Slit或Robo的水平或Slit和 Robo兩者的水平；(c)然后比較(a)和(b)檢測到的表達結(jié)果，來確定該檢測目標是否有 Slit蛋白引起的疾病。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述Slit蛋白是Slit2。在另一個優(yōu)選的實施方案中，所述Robo蛋白是Robol或Robo4。在另一個優(yōu)選的實施方案中，所述水平是DNA水平，RNA水平，蛋白水平，或綜合上列2者或3者的水平。在另一個優(yōu)選的實施例方案中，所述疾病是與Slit-Robo信號傳導通路相關(guān)的疾病。在另一個優(yōu)選的實施方案中，所述疾病是是癌癥或與淋巴管形成相關(guān)的疾病。在另一個優(yōu)選的實施方案中，所述疾病是癌癥，優(yōu)選轉(zhuǎn)移性癌癥。在另一個優(yōu)選的實施方案中，所述癌癥是下列癌癥之一結(jié)腸癌，胃癌，食道癌，肺癌，肝癌，乳腺癌，和膀胱癌。本發(fā)明第四方面提供了能夠檢測到Slit蛋白或Robo蛋白或它們所對應的mRNA 或它們的編碼基因的物質(zhì)在制備用于檢測Slit蛋白介導的病癥的診斷試劑中的應用，所述檢測包括以下步驟(a)從檢測目標得到檢測樣本，利用能夠檢測到Slit蛋白或Robo蛋白或它們所對應的mRNA或它們的編碼基因的物質(zhì)檢測單獨的Slit或Robo的水平或Slit和Robo兩者的水平；(b)從正常人取得樣品作為對照，利用能夠檢測到Slit蛋白或Robo蛋白或它們所對應的mRNA或它們的編碼基因的物質(zhì)檢測該樣品的單獨的Slit或Robo的水平或Slit和 Robo兩者的水平；(c)比較(a)和(b)檢測到的表達結(jié)果，來確定該檢測目標是否有Slit蛋白引起的疾病，如果檢測樣本的Slit或Robo水平高于對照，則表明該檢測目標患有所述疾病。在一個優(yōu)選實施方案中，所述能夠檢測到Slit蛋白或Robo蛋白或它們所對應的 mRNA或它們的編碼基因的物質(zhì)選自與Slit蛋白特異性結(jié)合的物質(zhì)，優(yōu)選與Slit蛋白特異性結(jié)合的抗體，更優(yōu)選與Slit蛋白特異性結(jié)合的單克隆抗體；與Robo蛋白特異性結(jié)合的物質(zhì)，優(yōu)選與Robo蛋白特異性結(jié)合的抗體，更優(yōu)選與Robo蛋白特異性結(jié)合的單克隆抗體； 與Slit或Robo的mRNA或編碼基因結(jié)合的物質(zhì)(如引物)。本發(fā)明的發(fā)明者意外地發(fā)現(xiàn)Slit蛋白與Robo蛋白(Slit蛋白的受體)之間的相互作用(相互結(jié)合作用)的信號傳導能促進淋巴管形成。那么能夠調(diào)控或影響Slit蛋白與它的受體(Robo蛋白)相互作用的試劑就有可能應用于調(diào)控淋巴管的形成或與淋巴管形成相關(guān)疾病的診斷、治療，例如癌癥的淋巴轉(zhuǎn)移。本發(fā)明的一些具體部分是調(diào)控或影響Slit蛋白與它的受體(Robo蛋白)相互作用的一些試劑。這些試劑可以是Slit或Robo蛋白的蛋白片段或相似物(包括融合蛋白或蛋白片段)，或者Slit或Robo蛋白的抗體(多克隆抗體、單克隆抗體或人源化抗體)。本發(fā)明的另一些具體部分是針對Slit-Robo相互作用引起疾病的診斷、預防或治療的方法， 尤其是癌癥進程和癌癥轉(zhuǎn)移。隨后的本發(fā)明的具體示例中用Slit2作為Slit蛋白的一個代表，用Robol和 Robo4作為Robo蛋白的代表。當然，本發(fā)明也包括其它的影響淋巴管形成的slit蛋白和 Robo蛋白。Slit基因編碼一類在神經(jīng)發(fā)育中極為重要的分泌蛋白。這些蛋白的功能主要是誘導神經(jīng)遷移。在哺乳動物里，已知有三個Slit基因Slitl，Slit2，和Slit3。這些基因在非神經(jīng)系統(tǒng)里也有表達(Holmes, G. P. et al. Mech. Dev. 79 :57-72 (1998))。例如，Slit2 和 Slit3的mRNA在大鼠內(nèi)皮細胞也有被發(fā)現(xiàn)(沒有發(fā)現(xiàn)Slitl) (ffu,J. Y. et al. Nature 410 948-952(2001)).結(jié)構(gòu)上，Slit具有4個富含亮氨酸的重復序列、9個表皮生長因子(EGF)樣功能域、1個位于第6和第7個EGF功能域間的ALPS片段，以及1個位于羧基端的胱氨酸結(jié)。 Slit雖是一種可溶性蛋白，但大部分附著在細胞表面。Slit蛋白與它們的受體Roundabout (Robo)蛋白結(jié)合。Slit和Robo蛋白共同作用在神經(jīng)軸突導向與分叉及神經(jīng)元遷移中起排斥作用(Kidd，T.et al.Cell 92 201-215(1998) ；Wang, K. -H. et al. Cell 96:771-784(1999) ；ffu, W. et al. Nature 400 331-336(1999))。另外Slit-Robo相互作用還能抑制內(nèi)源白細胞化學趨向性(ffu, J. Y. et al. Nature 410 :948-952(2001)) 因為能抑制內(nèi)源白細胞化學趨向性，Slit蛋白(例如Slit2蛋白)和體內(nèi)發(fā)炎反應有關(guān)。(Wu，J.Y.et al. Nature 410 :948-952 Q001))。在炎癥進程中，白細胞粘附于血管內(nèi)皮細胞，穿越毛細血管壁，進入病損或感染的組織或器官，是炎癥發(fā)生和發(fā)展過程中的重要環(huán)節(jié)，也是一個研究了數(shù)百年的生物學現(xiàn)象。隨著生物學研究方法和技術(shù)的進步，近十年來對此現(xiàn)象的分子機制有了比較清楚的了解。目前普遍認為，白細胞粘連和穿壁運動是由多種分子，如趨化因子，細胞粘附分子、細胞骨架蛋白和金屬酶分子等，在時間和空間上的協(xié)調(diào)作用來完成的。有文獻報道，Slit2在體外能抑制趨化因子引起的白細胞的趨化運動， 并且這一作用可被Robo胞外可溶性片段(RoboN)所阻斷，證明Slit對白細胞的這一作用也是基于其受體Robo所介導的信號通路(Wu et al.，2001Nature 410:948)。Slit蛋白的受體Robo是一類一次跨膜蛋白，目前在哺乳動物中發(fā)現(xiàn)了四個 Robo基因Robol，Robo2, Robo3和Robo4。Robo蛋白在神經(jīng)系統(tǒng)外也有表達(Piper， Μ. et al. Mech. Dev. 94 :213-217 (2000)) 例如，小鼠白細胞發(fā)現(xiàn) Robol mRNA (ffu, J.Y.et al. Nature 410 :948-952 (2001)) 人內(nèi)皮細胞表達 Robo4 (Huminiecki，L. et al. Genomics. 79 :547-552 (2002))。當有配體(例如Slit蛋白)結(jié)合，Robo受體將信號傳導至細胞內(nèi)最終導致各種排斥性生物過程的發(fā)生，包括神經(jīng)軸突導向和分叉，神經(jīng)元細胞遷移，和白細胞化學趨向性運動。像上面提到的那樣，受體Robo是一類一次跨膜蛋白。結(jié)構(gòu)上，RoboU2和3的胞外段具有5個免疫球蛋白(Ig)樣結(jié)構(gòu)域和3個III型膠原重復序列，其中Ig樣結(jié)構(gòu)域是 Robo結(jié)合全長Slit及Slit富含亮氨酸重復序列所必須的；胞內(nèi)段含多個結(jié)構(gòu)域，其中包括CCO、CC1、CC2和CC3序列，已經(jīng)證明這些結(jié)構(gòu)與細胞內(nèi)部的信號傳遞有關(guān)。而Robo4的胞外段僅含2個Ig樣結(jié)構(gòu)域，其胞內(nèi)段僅含CCO和CC2序列。Slit2 蛋白與 Robol 的第一個 Ig 結(jié)構(gòu)域結(jié)合(Chen et al.，J Neurosci. 200121 1548-1556)。一個特異識別Robol第一個Ig結(jié)構(gòu)域的單克隆抗體R5能夠中和Slit2誘導的血管生成(Wang et al.，Cancer Cell. 20034 :19-29)，證明 Slit2 與 Robol 的特異性結(jié)合對Slit2誘導的血管生成是至關(guān)重要的。Slit和Robo蛋白在包括血管發(fā)生在內(nèi)的多種生物活性中發(fā)揮作用。本發(fā)明的發(fā)明者在完全客觀的條件下發(fā)現(xiàn)Slit-Robo相互作用在淋巴生成中也發(fā)揮重要作用(例如淋巴管生成)。更重要的是發(fā)明者還發(fā)現(xiàn)Slit-Robo相互作用引起的淋巴管生成癌癥轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。這樣能夠破壞Slit-Robo相互作用的物質(zhì)就可以被用于癌癥的預防和治療，特別是癌癥轉(zhuǎn)移的預防和治療。Slit2在多種癌癥組織中都有高水平表達(圖1)，而在正常組織或非典型增生組織中則表達很低或不表達。Slit2在癌癥組織的高表達事實提示Slit2可能在癌癥進程和轉(zhuǎn)移過程中有重要作用。下文將會描述Slit2確實在癌癥的進程和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用。一個與此作用相關(guān)的可能的機制就是能夠誘導淋巴管生成。Slit2在腫瘤進程和轉(zhuǎn)移過程中的重要作用已在一些動物模型中被檢測。例如， 如圖2所示，高表達Slit2的轉(zhuǎn)基因小鼠被構(gòu)建，將Slit2轉(zhuǎn)基因小鼠與能夠自發(fā)胰腺瘤的 Ripl-Tag2轉(zhuǎn)基因小鼠雜交得到Slit2/Ripl-Tag2雙轉(zhuǎn)基因小鼠。有關(guān)Slit2/Ripl_Tag2 雙轉(zhuǎn)基因小鼠在示例部分中有詳細描述。這些Slit2/Ripl-Tag2雙轉(zhuǎn)基因小鼠通過免疫組織化學實驗方法檢測可看到高水平的Slit2表達(圖池)。同時，這些老鼠表現(xiàn)出了明顯的淋巴管生成增加、腫瘤大小增大和腫瘤向腸系膜淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移現(xiàn)象(圖幻。這些結(jié)果顯示， Slit2蛋白表達水平的增加與腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的增加密切相關(guān)。Slit2促進胰腺癌的生長和轉(zhuǎn)移。比較Ripl_Tag2和Slit2/Ripl_Tag2轉(zhuǎn)基因小鼠發(fā)現(xiàn)，Slit2能夠增加血性胰島的數(shù)目(圖3a)，腫瘤體積(圖北)，腫瘤數(shù)目(圖3c)，但不影響胰腺和血液中的白細胞數(shù)目(圖3d)。圖!Be展示了轉(zhuǎn)基因小鼠胰島素瘤的血管熒光標記，圖3f展示了轉(zhuǎn)基因小鼠胰島素瘤的蘇木精伊紅染色，可以看到Slit2/Ripl-Tag2轉(zhuǎn)基因小鼠有著比Ripl_Tag2轉(zhuǎn)基因小鼠更大的腫瘤和更多的血管。通過免疫組織化學方法分析比較Slit2/Ripl-Tag2轉(zhuǎn)基因小鼠和Ripl_Tag2轉(zhuǎn)基因小鼠可以發(fā)現(xiàn)，血管密度(圖3g)和增殖指數(shù)(圖3h)都大大增加，凋亡指數(shù)則減少(圖 3i)。這些結(jié)果表明，Slit2/Ripl-Tag2轉(zhuǎn)基因小鼠比Ripl-Tag2轉(zhuǎn)基因小鼠有著更多的新生血管，更高的增殖能力和減少的凋亡潛能。Slit2的過表達能夠增加腫瘤數(shù)目這一現(xiàn)象提示Slit2可能促進腫瘤轉(zhuǎn)移。這個可能性與Slit2能夠影響淋巴管生成這一功能相關(guān)，因為大部分腫瘤轉(zhuǎn)移都與淋巴系統(tǒng)相關(guān)。
圖4展示了 Slit2/Ripl-Tag2轉(zhuǎn)基因小鼠中Slit2蛋白的過表達實際上導致了淋巴管的增生和腫瘤淋巴轉(zhuǎn)移。Slit2/Ripl-Tag2轉(zhuǎn)基因小鼠展示出增多的腫瘤腸系膜淋巴結(jié)和腸壁轉(zhuǎn)移(圖如)，H&E方法對轉(zhuǎn)移灶進行染色，發(fā)現(xiàn)β細胞轉(zhuǎn)移至十二指腸的上皮細胞層與肌層之間；以及腸系膜淋巴結(jié)內(nèi)部(圖4b-c)。用T-antigen的抗體對轉(zhuǎn)移灶組織切片進行免疫組織化學染色，發(fā)現(xiàn)確實是β細胞形成的轉(zhuǎn)移瘤(圖4d-h)。對大量14周齡的Ripl_Tag2和Slit2/Ripl_Tag2小鼠進行了解剖觀察，發(fā)現(xiàn)在Ripl-Tag2小鼠(32只)中，只有2只有腸系膜淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，1只腸壁轉(zhuǎn)移；在Slit2/ Ripl-Tag2小鼠(50只)中，有17只腸系膜淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，8只腸壁轉(zhuǎn)移(圖4i)。Chi-square 檢驗腸系膜淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率有顯著差異。用LYVE-I的抗體進行免疫組化實驗和統(tǒng)計分析，結(jié)果顯示，與Ripl_Tag2轉(zhuǎn)基因小鼠相比，Slit2/Ripl-Tag2轉(zhuǎn)基因小鼠胰腺瘤相關(guān)淋巴管形成明顯上升(圖5a-c)。這些結(jié)果表明Slit2過表達能誘導淋巴管形成和腫瘤淋巴轉(zhuǎn)移。Robol的單克隆抗體R5 (圖5c_e)或能與Slit2結(jié)合的Robol胞外區(qū)片段 RoboN(數(shù)據(jù)沒有展示)能夠特異性阻斷Slit2誘導的淋巴內(nèi)皮細胞的遷移和淋巴管形成， 進一步證實了 Slit2在腫瘤淋巴管生成中的重要作用。圖6展示了 R5能夠特異性破壞 Robol的重組蛋白(hRobo-Fc)(圖7)和Slit2的重組蛋白之間的結(jié)合(圖6A，6B)。上述數(shù)據(jù)清楚的顯示出Slit-Robo相互作用在腫瘤淋巴管生成和腫瘤淋巴轉(zhuǎn)移過程中的重要作用。因此，能夠影響或調(diào)控Slit蛋白與Robo蛋白相互作用的物質(zhì)就可以作為治療劑應用于某部分癌癥的預防或治療。根據(jù)本發(fā)明的研究提示，這些試劑可以包括 Slit的抗體，Robo蛋白的抗體，Robo蛋白的胞外區(qū)片段，等等?？梢詰糜诒景l(fā)明的抗體可以是單克隆抗體或多克隆抗體。并且，該抗體還可以經(jīng)過人源化修飾以減低免疫排斥或并發(fā)癥。依據(jù)本發(fā)明所述，Robo的特異性抗體或胞外區(qū)活性片段可以用于競爭性抑制 Slit-Robo之間的相互作用，從而抑制Slit-Robo信號轉(zhuǎn)導所調(diào)控的生物學功能。同樣， Slit蛋白的特異性抗體也可以用于Slit-Robo信號引起的疾病的診斷、預防和治療。依據(jù)本發(fā)明所述，用于Slit蛋白引起疾病的治療的抗體可以制作成人源化抗體， 以最大程度減低臨床上的免疫排斥反應。制作人源化抗體在技術(shù)上已成熟，本發(fā)明的部分工作涉及到大量制備這一類用于治療的物質(zhì)的方法。這些方法和試劑將在隨后的描述中展
7J\ ο除了預防或治療Slit蛋白引起的疾病，本發(fā)明還涉及到此類疾病的診斷。如上文所述，Slit蛋白的表達在多種癌癥中都有表達上調(diào)的現(xiàn)象。那么，檢測Slit蛋白的表達水平是否增加就有可能用來指示是否存在Slit蛋白引起的疾病。圖8展示了 Slit2蛋白單克隆抗體的特異性分析及應用于人腫瘤樣本的檢測。本實驗應用了三個抗體S1，S3和9E10。我們運用免疫印跡方法來檢測抗體Sl和S3對Slit2 全長或片段的識別情況。如圖8a所示，抗體Sl通過識別Slit2蛋白的氮端與Slit2蛋白結(jié)合，抗體S3通過識別Slit2蛋白的碳端與Slit2蛋白結(jié)合?？贵wSl和S3均能特異性識別Slit2蛋白，同時抗體Sl還能識別人的Slitl蛋白和Slit3蛋白。9E10抗體(購于ATCC 公司)作為陽性對照。如圖8所示，抗體Sl能夠用于檢測人結(jié)腸癌和乳腺癌(圖8b)，原位肺癌及轉(zhuǎn)移肺癌(圖8c)，伴隨淋巴轉(zhuǎn)移或沒有淋巴轉(zhuǎn)移的結(jié)腸癌(圖8d)中的Slit2表達。上述實驗清晰顯示Slit蛋白的特異性抗體可以作為一種手段來各種癌癥進行診斷預報。以下將進一步描述本發(fā)明的具體內(nèi)容。預防或治療與Slit2蛋白調(diào)控淋巴管形成相關(guān)的疾病的方法如上所述，本發(fā)明一方面涉及到針對某一主體預防或治療與Slit2蛋白調(diào)控淋巴管形成相關(guān)的疾病的方法。依據(jù)本發(fā)明可以找到方法，例如，可以在某一主體內(nèi)通過減少或抑制Slit-Robo之間的相互作用達到合適的水平以治療該主體由于Slit-Robo相互作用調(diào)控淋巴管生成所引起的疾病。這些疾病可能與癌癥的進程和轉(zhuǎn)移有關(guān)。Slit2蛋白與Robo蛋白的相互作用(例如Slit2與Robol結(jié)合或Slit2與Robo4 結(jié)合)可以被很多合適的手段抑制。例如，可以通過某些有效物質(zhì)來降低Slit2基因的復制，降低Slit2受體基因的復制，降低Slit2基因的轉(zhuǎn)錄，降低Slit2受體基因的轉(zhuǎn)錄，降低 Slit2mRNA的剪切或翻譯，降低Slit2受體mRNA的剪切或翻譯，降低Slit2前體的成熟或細胞內(nèi)轉(zhuǎn)運，降低Slit2受體前體的成熟或細胞內(nèi)轉(zhuǎn)運，等等。依據(jù)本發(fā)明的另一方面所述，可以通過給對象施加有效劑量的物質(zhì)減少或抑制 Slit2蛋白與Robo蛋白的結(jié)合來降低Slit2-Robo的相互作用。任何合適的物質(zhì)都可以用來減少或阻斷Slit2-Robo蛋白之間的結(jié)合。舉例來說，這些物質(zhì)可包括針對Slit2的抗體，Robo的抗體，或者能與Slit2結(jié)合的Robo的胞外區(qū)蛋白片段。任何合適的針對Slit2 或Robo的抗體都可降低或抑制Slit2-Robo的蛋白結(jié)合，這些抗體可包括多克隆抗體、單克隆抗體、Fab或F(ab' )2抗體片段以及它們的人源化抗體。另外，能與Robo受體直接或間接結(jié)合的受體拮抗劑也包括在內(nèi)。受體的拮抗劑可包括能與Robo結(jié)合的且不影響正常信號轉(zhuǎn)導的小分子或Slit2的結(jié)構(gòu)類似物。本發(fā)明所用方法可用于預防或治療Slit2受體介導的淋巴管形成上的疾病或異常。例如可用于預防或治療Slit2-Robol或者Slit2-Robo4介導的淋巴管形成相關(guān)疾病或異常。Slit2與Robol或者Robo4的相互作用可被任何適當?shù)姆椒ㄒ种?。較好的方法是通過給予有效量的某些物質(zhì)減少或抑制Slit2-Robo或Slit2-Robo4蛋白結(jié)合來降低 Slit2-Robol或Slit2-Robo4的相互作用。這些典型的物質(zhì)包括針對Slit2的抗體、針對 Robol的抗體、針對Robo4的抗體以及能與Slit2結(jié)合的Robol或Robo4的胞外區(qū)段蛋白。任何針對Slit2的抗體適用于本發(fā)明，包括1999年Hu在Neuron上的文章中所述的針對Slit2的抗體。同樣，任何合適的針對Robol的抗體也可以被使用，例如2002年 Hivert在Mol Cell Neurosci上的文章所述的針對Robol的抗體。本發(fā)明中Robol的抗體優(yōu)先為針對Robol的第一個Ig區(qū)的抗體，更為優(yōu)先的是針對Robol第一個Ig區(qū)的R5抗體。任何合適的Robol的胞外片段也能被使用，比如RoboN蛋白。本發(fā)明中所用物質(zhì)可以單獨給藥，更適宜的方法是和藥學上可以接受的載體或賦形劑一起給予。。本發(fā)明適用于預防或治療Slit2介導的淋巴管形成相關(guān)的疾病或異常，例如癌癥，尤其是轉(zhuǎn)移性的癌癥。舉例來說，癌癥可以是惡性黑色素瘤、膀胱鱗狀癌、成神經(jīng)細胞瘤、小細胞肺癌、結(jié)腸癌、膀胱移行細胞癌、乳腺癌、涎腺腺樣囊性癌、肝細胞瘤或橫紋肌肉瘤。本發(fā)明適用于任何主體的Slit2介導的淋巴管形成相關(guān)疾病的預防或治療。優(yōu)先主體是哺乳動物，特別是人類。
本發(fā)明中一些具體部分的主體是人類，相應的物質(zhì)是人源化的單克隆抗體。用于預防或治療Slit2介導的淋巴管形成相關(guān)疾病的藥物組分和藥物組合另一方面，本發(fā)明的具體部分是關(guān)于預防或治療某一主體的Slit2介導淋巴管形成相關(guān)疾病的藥物組分。這些藥物組分包含有效劑量的抑制Slit2-Robo結(jié)合的物質(zhì)，可能還含有藥學上可以接受的載體或賦形劑。藥物的配方、給藥劑量和給藥途徑可參照已有的技術(shù)方案(如Remington =The Scienceand Practice of Pharmacy, Alfonso R. Gennaro(Editor)Mack Publishing Company, April 1997 ；Therapeutic Peptides and Proteins FormuIation, Processing, and Delivery Systems, Banga,1999 ；and Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins, Hovgaard and Frkjr(Ed. ), Taylor & Francis, Inc. ,2000 ； Biopharmaceutical Drug Design and Development, Wu-Pong and Rojanasakul(Ed.), Humana Press,1999)。對于Slit2介導的淋巴管形成相關(guān)疾病或異常的預防或治療，合適的劑量水平為每天每千克重量給藥大約0. 01 500mg。更適宜的劑量水平是每天0. 1 250mg/kg。在有些部分，劑量水平可優(yōu)化在每天0. 1 20mg/kg?？梢杂脝我换蚨喾N合適劑量進行給藥。 特定主體的劑量水平和給藥的頻率是可變的，依賴于多種因素，例如所用化合物的活性、代謝穩(wěn)定性、化合物作用時間、主體年齡、體重、健康水平、性別、飲食、狀態(tài)及給藥時間、排泄速度、藥物聯(lián)合、特定環(huán)境和病人正在經(jīng)受的治療。本發(fā)明的藥物組分可以通過口服、腸胃外、吸入、局部給藥、直腸、鼻腔、口腔、陰道、埋植等任何合適的形式進行給藥。另一方面，本發(fā)明的具體實施方案涉及預防或治療Slit2介導的淋巴管形成相關(guān)疾病的藥物組合。這種藥物組合可以包括1)本發(fā)明中減少或阻斷Slit2-Robo結(jié)合的有效劑量的藥物，幻抑制或阻斷淋巴管形成的有效劑量的其他藥物。對于治療癌癥，任何抗癌藥物可以和本發(fā)明一起聯(lián)合應用?？捎糜诒景l(fā)明中的抗癌藥的實例參見U. S. patent application Ser. No. 2002/044, 919。其中被使用的一種抗癌試劑為抗血管生成試劑?？寡苌稍噭┛梢允腔|(zhì)膜降解抑制劑、細胞遷移抑制劑、內(nèi)皮細胞增生抑制劑及三維組織構(gòu)成抑制劑。這些抗血管生成試劑的具體實例參見Auertach andAuerbach, Pharmacol.Ther. ,63 :265-311 (1994) ；0 ‘ Reilly, Investigational New Drugs, 15 :5-13(1997) J.Nat ‘ 1 Cancer Instit.，88 :786-788 (1996) ;U. S. Pat. Nos. 5，593，990 ；5, 629，327和5，712，291。這些可用的抗癌試劑在另一方面體現(xiàn)為烷化劑、 抗代謝物、天然產(chǎn)物、鉬類配位化合物、蒽二酮、取代脲、甲基胼衍生物、腎上腺皮質(zhì)抑制劑、 激素和拮抗劑。預防或診斷Slit2介導的淋巴管形成相關(guān)疾病的方法和試劑盒本發(fā)明的一些實施方案涉及到用于預防或診斷Slit2介導的淋巴管形成相關(guān)疾病的方法，例如，該實施方式中的一種方法可能包括1)獲得待測主體的檢測樣本及檢測上述樣本中Slit2和(或)Slit2受體(Robo)的水平；幻獲得不發(fā)生Slit2介導的淋巴管形成相關(guān)疾病的對照主體的對照樣本并檢測上述樣本中Slit2和(或)Slit2受體(Robo) 的水平；3)比較1)和2、兩種樣本中Slit2和(或)Slit2受體(Robo)的水平，跟對照主體樣本相比，待測主體樣本的Slit2和(或)其受體水平的上升則表明上述檢測主體發(fā)生了 Slit2介導的淋巴管形成相關(guān)的疾病。此方法中檢測的Slit2的受體可以是Robol或 Robo4。Slit2和(或)其受體在合適的水平的檢測，如可以在核酸水平或蛋白水平。本發(fā)明的實施方案涉及到用于預防或診斷Slit2介導的淋巴管形成相關(guān)疾病的試劑盒，此試劑盒包含1)獲得待測主體或?qū)φ罩黧w檢測樣本的方法；幻評估上述待測或?qū)φ諛颖維lit2和/或Slit2受體表達水平的方法；3)比較上述待測樣本與對照樣本中 Slit2和/或Slit2受體表達水平的方法。依據(jù)本發(fā)明的具體部分，所測的Slit2的受體可以是 Robol 或 Robo4。實施例l)Slit2在多種人類癌細胞上表達為了探求應用價值，我們檢測了不同組織來源的人癌細胞株是否表達Slit2。 圖Ia表明Slit2在惡性黑色素瘤A375細胞株、膀胱鱗狀癌SCaBER細胞株、成神經(jīng)細胞瘤SK-N-SH細胞株、小細胞肺癌NCI-H446細胞株、結(jié)腸癌LoVo細胞株、膀胱移行細胞癌 T24細胞株、乳腺癌ZR-75-30細胞株、涎腺腺樣囊性癌Acc_2和Acc-M細胞株、肝細胞癌 SMMC-7721細胞株及橫紋肌肉瘤A673細胞株上都有表達。但是，Slit2在肺癌A549、宮頸上皮腺癌HeLa、乳腺癌MCF-7及原始腎細胞癌786-0細胞株上都不表達。Slit2在多種腫瘤細胞株上表達與RT-PCR方法檢測到的Slit2在前列腺癌上表達的結(jié)果相一致。此外，圖Ib表明Slit2在人惡性黑色素瘤、結(jié)直腸粘液腺癌、乳腺浸潤性癌及肝細胞癌中都有表達。值得注意的是，在乳腺癌的切片中，腫瘤細胞及血管密集的地方 Slit2的染色比腫瘤細胞及血管稀少的地方強(圖lc)。人肝細胞癌中也有類似的表達模式，但在結(jié)直腸腺癌中沒有(結(jié)果未顯示)。2)Slit2/Ripl-Tag2雙轉(zhuǎn)基因鼠的構(gòu)建圖加所示為CMV啟動子驅(qū)動下融合了 Flag片段的人Slit2基因的表達質(zhì)粒構(gòu)建圖。用此表達載體建立了 3株Slit2轉(zhuǎn)基因純和小鼠。通過點雜交(圖2b)和Southern 印記(圖2c)方法證實了轉(zhuǎn)基因小鼠中人Slit2基因的表達，免疫印跡方法確證了人Slit2 蛋白水平的表達(圖2d)。利用抗Flag的單抗(M2)通過Western免疫印跡和PCR方法分別在蛋白水平和DNA水平檢測到了胰腺組織裂解液Flag標記分子的表達(圖2e_f)。這些結(jié)果確證了表達Slit2的轉(zhuǎn)基因小鼠的成功建立。圖2g (上行左側(cè))顯示正常C57小鼠胰島不表達Slit2，而在12周齡Ripl_Tag2轉(zhuǎn)基因小鼠胰島中表達Slit2(圖2g，上行右側(cè))。用連續(xù)切片進行免疫組化結(jié)果顯示Slit2 的表達部位(圖2g，上行右側(cè))與胰島素的表達部位重疊(圖2g，上行中間)。此結(jié)果表明 Slit2在胰腺β細胞成瘤過程中被上調(diào)表達。此外，連續(xù)切片進行的免疫組化結(jié)果顯示，在 Ripl-Tag2轉(zhuǎn)基因小鼠中，Robol和vWF在血管內(nèi)皮細胞上表達而不表達于胰腺β細胞上 (圖2g，下行)。為了進一步研究Slit2在腫瘤生長上的功能，我們將Slit2轉(zhuǎn)基因小鼠與 Ripl-Tag2轉(zhuǎn)基因小鼠雜交產(chǎn)生Slit2/Ripl-Tag2雙轉(zhuǎn)基因鼠。與同齡10周、13周 Ripl-Tag2小鼠相比，Slit2/Ripl-Tag2小鼠的Slit2蛋白水平明顯增高(圖2h)，表明雜交小鼠Slit2/Ripl-Tag2中Slit2的成功過表達。這些結(jié)果提示胰腺β細胞被誘導分泌 Slit2蛋白，通過旁分泌方式作用于穩(wěn)定表達于胰腺血管內(nèi)皮細胞上的Robol受體，從而激活胰島素瘤生長的信號通路。
3) Slit2促進胰腺瘤生長圖3a顯示胰腺中血性胰島的數(shù)目在9周齡Slit2/Ripl_Tag2小鼠中明顯高于 Ripl-Tag2小鼠。圖3b和圖3c顯示10周齡、12周齡Slit2/Ripl-Tag2小鼠胰島素瘤的數(shù)目和體積都明顯高于Ripl-Tag2小鼠。然而，兩種小鼠外周血白細胞和腫瘤浸潤白細胞數(shù)目沒有明顯差異(圖3d)。圖!Be顯示用帶有FITC的Lectin蛋白標記血管后Slit2/Ripl_Tag2 小鼠血性胰島內(nèi)部有更為豐富致密的新生血管。圖3f顯示Slit2/Ripl-Tag2小鼠有更明顯的血管膨大和微出血現(xiàn)象。通過免疫組化統(tǒng)計血管密度，結(jié)果顯示Slit2/Ripl-Tag2小鼠胰島素瘤內(nèi)部的血管密度明顯高于Ripl-iTagZ小鼠(圖3g)。此外，Slit2/Ripl-Tag2小鼠胰島素瘤的增生指數(shù)明顯高于Ripl_Tag2小鼠(圖池)，而凋亡指數(shù)明顯低于Ripl_Tag2 小鼠(圖3i)。這些結(jié)果表明Slit2過表達能夠促進Ripl-Tag2小鼠胰島素瘤的新生血管形成和腫瘤生長。Slit2過表達促進胰腺瘤的淋巴道轉(zhuǎn)移Ripl_Tag2是一種自發(fā)產(chǎn)生胰腺瘤的轉(zhuǎn)基因小鼠，其腫瘤發(fā)育有明顯的階段性 正常胰島階段、血性胰島階段、腫瘤階段和浸潤性腫瘤階段；絕大多數(shù)Ripl_Tag2小鼠在 14-15周齡左右死于胰高血糖癥。對大量14周齡的Ripl-Tag2和Slit2/Ripl_Tag2小鼠進行了解剖觀察，發(fā)現(xiàn)在Ripl_Tag2小鼠(32只)中，只有2只有腸系膜淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，1只腸壁轉(zhuǎn)移；在Slit2/Ripl-Tag2小鼠(50只)中，有17只腸系膜淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，8只腸壁轉(zhuǎn)移(圖 4i)。Chi-square檢驗腸系膜淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率有顯著差異。另外心、肝、脾、肺、腎等組織均無轉(zhuǎn)移。而在此階段，Ripl_Tag2和Slit2/Ripl-Tag2兩種小鼠的胰腺瘤的體積并無明顯差異(圖4j)。用LYVE-I的抗體標記淋巴管內(nèi)皮細胞，免疫組化分析晚期胰腺瘤的淋巴管生成情況，結(jié)果表明相對于同期Ripl_Tag2小鼠，Slit2/Ripl-Tag2小鼠有更多的腫瘤相關(guān)淋巴管生成(圖5a_c)。免疫熒光共標記LYVE-I和Robo 1，發(fā)現(xiàn)淋巴管內(nèi)皮細胞上有Robol表達(圖5d)。以上結(jié)果表明Slit2過表達能促進淋巴管生成和淋巴道轉(zhuǎn)移。重組表達的Slit2蛋白能促進淋巴內(nèi)皮細胞體外遷移和管腔形成用免疫熒光的方法檢測人原代淋巴內(nèi)皮細胞的標志蛋白和Robol的表達定位?？梢钥吹?，兩個標志蛋白Lyve-I和都呈陽性，Lyve-I主要表達在膜上，Prox-I作為轉(zhuǎn)錄因子定位在核中。所用的Robol的抗體為特異識別Robol而不識別Robo2-4的單克隆抗體R4，結(jié)果顯示Robol主要定位于細胞膜上，胞漿中也有少許表達。此結(jié)果表明此原代淋巴內(nèi)皮細胞能夠表達Slit2的受體Robol。應用Boyden Chamber方法檢測重組表達的Slit2. 1蛋白對淋巴內(nèi)皮細胞的遷移有無功能。用VEGF-C蛋白作為陽性對照。圖5i-j顯示Slit2. 1蛋白在200pM以上濃度能促進淋巴內(nèi)皮細胞的遷移；過量的阻斷Slit2與Robol結(jié)合的抗Robol單克隆抗體R5能抑制Slit2誘導的淋巴內(nèi)皮細胞的遷移。應用Matrigel方法檢測Slit2. 1蛋白對淋巴內(nèi)皮細胞的體外管腔形成能力有無功能，同樣也用VEGF-C作為陽性對照。圖5g-h顯示Slit2. 1蛋白在IOnM以上濃度能促進淋巴管腔形成；過量單克隆抗體R5能抑制Slit2介導的淋巴內(nèi)皮管腔形成。這些結(jié)果表明 Slit2通過與其受體Robo結(jié)合從而促進了淋巴內(nèi)皮細胞的遷移和管腔形成。Slit2是癌癥病人淋巴道轉(zhuǎn)移的診斷物質(zhì)
上述結(jié)果提示Slit2可能成為預測癌癥淋巴道轉(zhuǎn)移的標志蛋白。應用病人腫瘤樣 本進行的Slit2免疫組化檢測的結(jié)果支持了這一觀點。圖8a顯示了免疫組化實驗中所用 的各種抗體的識別蛋白的特異性。針對Slit2的單克隆抗體Sl能夠識別Slit2蛋白的全 長和N端。9E10識別融合于Slit2蛋白的c-myc片段。針對Slit2的另一單抗S3可識別 Slit2蛋白的全長和C端片段。Sl也識別人的Slitl和Slit3蛋白(圖8a)。因此，Sl可 用來檢測各種Slit蛋白。我們用Sl對955例病人腫瘤樣本進行免疫組化，結(jié)果有742例 Slit表達呈陽性(表1，圖8b-d)。更為重要的是，在淋巴道轉(zhuǎn)移性的結(jié)腸癌、胃癌和肺癌 中，Slit的表達顯著高于非轉(zhuǎn)移性的同種腫瘤(表2，圖8c-d)。表1 用Sl單抗進行免疫組化檢測病人腫瘤樣本Slit蛋白的表達癌癥類型樣本例數(shù) Slit陽性例數(shù) ％ Slit陽性率結(jié)直腸癌31425681.53胃癌3 23772.7食管癌898696.63肺鱗狀細胞癌433888.37肺腺癌99100肝細胞癌534584.91乳腺浸潤性導管癌 955557. 89膀胱癌261661.54表2 用Sl單抗進行免疫組化檢測淋巴道轉(zhuǎn)移和非轉(zhuǎn)移病人腫瘤樣本中Slit蛋 白的表達% Slit表達陽性率(淋% Slit表達陽性率(非巴道轉(zhuǎn)移樣本中Slit轉(zhuǎn)移樣本中Slit陽性樣癌癥類型 樣本總例數(shù) 陽性樣本數(shù)/淋巴道本數(shù)/非轉(zhuǎn)移樣本數(shù))轉(zhuǎn)移樣本數(shù))結(jié)直腸癌15556.06(37/66)25.84(23/89)胃癌6944.64(25/56)23.08(3/13)肺癌4945.45(10/22)29.63(8/27)上述實例清楚顯示了 Slit-Robo信號通路在調(diào)節(jié)淋巴管形成和腫瘤淋巴道轉(zhuǎn)移 上的重要功能。據(jù)此，能夠調(diào)節(jié)或干擾Slit-Robo相互作用的試劑、技術(shù)和方法都可以用來 治療Slit-Robo信號介導的淋巴管形成和/或淋巴道轉(zhuǎn)移相關(guān)的疾病。舉例來說，Robo蛋白片段(如Robo胞外區(qū)或其融合蛋白hRobo-Fc等)或針對 Slit、Robo的抗體都可用來調(diào)節(jié)干擾Slit-Robo的蛋白結(jié)合，從而提供了針對Slit-Robo信 號的治療相關(guān)疾病的方法。據(jù)此，Robo蛋白的片段如胞外片段可用作誘館蛋白與Slit配 體結(jié)合，從而阻止或減少Slit蛋白與Robo受體結(jié)合。除了治療方面的應用，Slit和Robo 的蛋白片段、特異性的抗體還可以作為標記分子用來診斷或預測疾病。例如，可以應用針對 Slit或Robo的抗體來檢測腫瘤病人Slit和/或Robo蛋白的表達水平，從而評估是否有淋巴道轉(zhuǎn)移。本發(fā)明的一些具體部分有關(guān)基于Slit和/或Robo蛋白的試劑及其在治療、診斷、 預測Slit-Robo信號通路相關(guān)疾病的方法。這些具體部分的實施例描述如下。(7)人Robol胞外IgG樣區(qū)段與人免疫球蛋白Fc區(qū)段的融合蛋白(hRobo-Fc)的構(gòu)建(7a)人免疫球蛋白Fc區(qū)段的克隆以購自US Biological公司的攜帶人免疫球蛋白基因恒定區(qū)的pAc-k-CH3質(zhì)粒為模板，選擇其重鏈C末端最后687個堿基的部分，用hFc forward和hFc reverse作為引物， 通過PCR制備人免疫球蛋白Fc區(qū)段。引物hFc forward和hFc reverse的序列如下hFc forward 5' -AACCGTGCGGCCGCTGTTGTGACAAAACTCACAC-3，； [SEQ IDNO 1]hFc reverse :5，-CGCGGAGATCTTCATTTACCCGGAGACAGGGAGAGGC-3，。[SEQ IDNO :2]將獲得的PCR產(chǎn)物以NotI和BglII雙酶切，然后連接到同樣經(jīng)NotI和BglII雙酶切的PVL1393載體(BD Pharmingen公司)，構(gòu)建得到攜帶人免疫球蛋白Fc區(qū)段的桿狀病毒表達質(zhì)粒pVL1393-hFc。經(jīng)測序確認此質(zhì)粒的Fc區(qū)段DNA序列符合設(shè)計，沒有突變。(7b) Robol基因區(qū)段的克隆以購自O(shè)rigene公司的人Robol cDNA (核酸序列號NM_0(^941. 2，Origene公司貨號SC109739)為模板，選擇其細胞外包括五個Ig樣結(jié)構(gòu)域的區(qū)段，從起始密碼子ATG直到第1621位堿基，用Robol forward和Robol reverse作為引物，通過PCR制備Robol基因區(qū)段cDNA序歹lj。弓I物Robol forward禾口 Robol reverse的序列如下Robol forward 5' -GGCGGCCTCTAGAATGAAATGGAAACATGTTCC-3，； [SEQ IDNO 3]Robol reverse :5，-CTATAAGCGGCCGCCAATGTAAGCACTCCATGTT-3，；[SEQ IDNO 4]將獲得的PCR產(chǎn)物以^CbaI和NotI雙酶切，然后連接到同樣經(jīng))(bal和NotI雙酶切制備的pVL1393-hFc質(zhì)粒，構(gòu)建得到攜帶人Robol基因胞外五個Ig樣結(jié)構(gòu)域和人免疫球蛋白Fc區(qū)段的融合蛋白表達質(zhì)粒pVL1393-hRobo-FC。經(jīng)測序確認此質(zhì)粒的Robol基因片段DNA序列符合設(shè)計，沒有突變，Robol基因片段與hFc區(qū)段的翻譯閱讀框一致，起始密碼子和終止密碼子位置正確。(7c) hRobo-Fc融合蛋白的表達與純化實施例I 利用質(zhì)粒大抽試劑盒^iagen公司)對pVL1393-hRobo-Fc進行大量提取，純化方法根據(jù)Qiagen公司提供的QIAGEN Plasmid Midi Kit使用手冊。 pVL1393-hRobo-Fc質(zhì)粒純化好之后，根據(jù)BD Pharmingen公司的桿狀病毒表達系統(tǒng)使用手冊，制備攜帶hRobo-Fc基因序列的重組桿狀病毒。進行噬斑效價測定并對篩選到的重組病毒擴增，感染Sf9昆蟲細胞(使用 Invitrogen公司IPL-41培養(yǎng)基培養(yǎng)于攝氏27°C )進行hRobo-Fc融合蛋白的表達。利用辣根過氧化物酶標記兔抗人IgG (Santa Cruz Biotech)對hRobo-Fc融合蛋白的表達進行檢測，確認其成功表達(圖7)，還原條件下hRobo-Fc融合蛋白為單體，分子量約為8證(1。 根據(jù)BDWmrmingen公司的桿狀病毒表達系統(tǒng)使用手冊，利用攜帶hRobo-Fc基因序列的重組桿狀病毒感染Sf9昆蟲細胞，進行hRobo-Fc融合蛋白的大量表達。收集細胞培養(yǎng)液，利用ftOteinA親和層析介質(zhì)(GE Healthcare公司)純化hRobo-Fc融合蛋白，純化方法根據(jù) GE Healthcare 公司提供的 nProtein A Sepharose 4Fast Flow 使用手冊。從 1 升感染攜帶hRobo-Fc基因序列的重組桿狀病毒的Sf9細胞培養(yǎng)液中，可以純化得到數(shù)毫克級的 hRobo-Fc融合蛋白。對所得到的hRobo-Fc進行功能檢測發(fā)現(xiàn)，hRobo-Fc能與hSlit2蛋白特異性結(jié)合(圖6A)，而且針對Robol結(jié)構(gòu)中的第一個Ig樣結(jié)構(gòu)域的單克隆抗體R5，能特異抑制hRobo-Fc與hSlit2的結(jié)合(圖6B)，充分說明了由本發(fā)明所得到的Robo基因片段融合蛋白具有良好的生物活性和特異性。以上述具體實施例為例，充分說明了本發(fā)明的具體實施方案和效果的可行性及有效性。我們已基于此發(fā)明制備了多種涉及不同種系(如小鼠Robo基因)、不同區(qū)段(如包含1個Ig樣結(jié)構(gòu)域的人Robo胞外區(qū)段)、不同融合蛋白(如GST)和不同蛋白表達系統(tǒng) (如CHO-dhfr 二氫葉酸還原酶缺陷型中國倉鼠卵巢細胞表達系統(tǒng))的Robo基因片段融合蛋白，為進行Slit-Robo信號通路參與的腫瘤和炎癥等疾病相關(guān)的藥物開發(fā)奠定了堅實的基礎(chǔ)。其中部分實施例描述如下。實施例II 利用桿狀病毒表達系統(tǒng)，進行包含小鼠Robol基因胞外區(qū)和小鼠免疫球蛋白1 區(qū)段的融合蛋白(mRobo-Fc)的大量表達。1.小鼠免疫球蛋白Fc區(qū)段的選取和克隆以小鼠IgGa單克隆抗體基因為模板，選擇其重鏈C末端最后720個堿基的部分， 用mFc forward和mFc reverse作為引物，通過PCR制備免疫球蛋白Fc區(qū)段。引物mFc forward 禾口 mFc reverse 的序列如下mFc forward 5' -GCACTCTAGACTTGAGCCCAGCGGGCCCAT-3，； [SEQ ID NO 5]mFc reverse :5，-CTGAGGATCCTCATTTACCCGGAGACCGGG-3，； [SEQ ID NO 6]將獲得的PCR產(chǎn)物以XbaI和BamHI雙酶切，然后連接到同樣經(jīng)XbaI和BamHI雙酶切的PVL1393載體(BD Pharmingen公司)，構(gòu)建得到攜帶小鼠免疫球蛋白Fc區(qū)段的桿狀病毒表達質(zhì)粒pVL1393-mFc。經(jīng)測序確認此質(zhì)粒的Fc區(qū)段DNA序列符合設(shè)計，沒有突變。2.小鼠Robol基因區(qū)段的選取和克隆以小鼠Robol cDNA(核酸序列號NM_019413)為模板，選擇包括其五個Ig樣結(jié)構(gòu)域和3個Fibronectin III結(jié)構(gòu)域的區(qū)段，從起始密碼子ATG直到第M45位堿基，用 mRoboIforward和mRobol reverse作為引物，通過PCR制備小鼠Robol基因區(qū)段cDNA序列。弓I物 mRobol forward 禾口 mRobol reverse 的序列如下mRobol forward :5，-ATCGAGATCTATGATCGCGGAGCCTGCTCACT-3，[SEQ IDNO 7]mRobol reverse 5' -GCTCTCTAGACGCTGCCACCTCCACACTGTA-3，[SEQ ID NO 8]將獲得的PCR產(chǎn)物以BglII和XbaI雙酶切，然后連接到同樣經(jīng)BglII和XbaI雙酶切制備的pVL1393-mFc質(zhì)粒，構(gòu)建得到融合蛋白表達質(zhì)粒pVL1393-mR0b0-Fc。經(jīng)測序確認此質(zhì)粒的小鼠Robol基因片段DNA序列符合設(shè)計，沒有突變，小鼠Robol基因片段與mFc 區(qū)段的翻譯閱讀框一致，起始密碼子和終止密碼子位置正確。利用質(zhì)粒大抽試劑盒(Qiagen公司)對pVL1393-mR0b0-Fc進行大量提取，純化方法根據(jù) Qiagen 公司提供的 QIAGEN Plasmid Midi Kit 使用手冊。pVL1392-mRobo_Fc 質(zhì)粒純化好之后，根據(jù)BD Pharmingen公司的桿狀病毒表達系統(tǒng)使用手冊，利用攜帶mRobo-Fc 基因序列的重組桿狀病毒感染Sf9昆蟲細胞，進行mRobo-Fc融合蛋白的大量表達。收集細胞培養(yǎng)液，利用ftOtein A親和層析介質(zhì)(GE Healthcare公司)純化mRobo-Fc融合蛋白， 純化方法根據(jù)GE Healthcare公司提供的nProtein A Sepharose 4Fast Flow使用手冊。
實施例III 利用桿狀病毒表達系統(tǒng)，進行包含人Robol基因胞外區(qū)(不同長度區(qū)段)和人免疫球蛋白Fc區(qū)段的融合蛋白的大量表達。1.人免疫球蛋白Fc區(qū)段的選取和克隆以人免疫球蛋白基因pAc-k-CH3(US Biological公司)恒定區(qū)為模板，選擇其重鏈C末端最后687個堿基的部分，通過PCR制備免疫球蛋白Fc區(qū)段。引物序列如下hFc forward :5，-AACCGTGCGGCCGCTGTTGTGACAAAACTCACAC-3，[SEQ IDNO 9]hFc reverse 5‘-CGCGGAGATCTTCATTTACCCGGAGACAGGGAGAGGC-3‘[SEQ ID NO 10]將獲得的PCR產(chǎn)物以NotI和BagII雙酶切，然后連接到同樣經(jīng)NotI和BagII雙酶切的PVL1393載體(BD Wiarmingen公司)，構(gòu)建得到桿狀病毒表達質(zhì)粒pVL1393_hFc。經(jīng)測序確認此質(zhì)粒的Fc區(qū)段DNA序列符合設(shè)計，沒有突變。2.人Robol基因區(qū)段的選取和克隆以人Robol cDNA(核酸序列號NM_0(^941. 2，01^861^公司貨號5(109739)為模板， 選擇包括其四個Ig樣結(jié)構(gòu)域的區(qū)段，從起始密碼子ATG直到第1342位堿基，通過PCR制備基因區(qū)段cDNA序列。引物序列如下Robol forward :5，-GGCGGCCTCTAGAATGAAATGGAAACATGTTCC-3，[SEQ IDNO 11]Robo reverse2 :5，-CATTATGCGGCCGCCATCTGTAACTTCCAAATAT-3，[SEQ IDNO 12]以人Robol cDNA(核酸序列號NM_0(^941. 2，01^861^公司貨號5(109739)為模板， 選擇包括其三個Ig樣結(jié)構(gòu)域的區(qū)段，從起始密碼子ATG直到第1051位堿基，通過PCR制備基因區(qū)段cDNA序列。引物序列如下Robol forward :5，-GGCGGCCTCTAGAATGAAATGGAAACATGTTCC-3，[SEQ IDNO 13]Robol reverse3 5 ‘-ATAATAGCGGCCGCGAGGTTCTTGAACAGTCAGAGTA-3 ‘ [SEQ ID NO: 14]以人 Robol cDNA(核酸序列號 NM_0(^941. 2，Origene 公司貨號 SC109739)為模板，選擇包括其兩個Ig樣結(jié)構(gòu)域的區(qū)段，從起始密碼子ATG直到第8 位堿基，通過PCR制備基因區(qū)段cDNA序列。引物序列如下Robol forward :5，-GGCGGCCTCTAGAATGAAATGGAAACATGTTCC-3，[SEQ IDNO 15]Robol reverse4 :5，-ATAATTGCGGCCGCCATCCACAGTTACTGCCAAGTTACT-3，[SEQ ID NO 16]以人 Robol cDNA(核酸序列號 NM_0(^941. 2，Origene 公司貨號 SC109739)為模板，選擇包括其一個Ig樣結(jié)構(gòu)域的區(qū)段，從起始密碼子ATG直到第5 位堿基，通過PCR制備基因區(qū)段cDNA序列。引物序列如下Robol forward :5，-GGCGGCCTCTAGAATGAAATGGAAACATGTTCC-3，[SEQ IDNO 17]Robol reverse5 5，-TTCTATGCGGCCGCAAGGGTTTTGTCTGAAGTCAT-3，[SEQID NO 18]將上述各步驟獲得的PCR產(chǎn)物以^CbaI和NotI雙酶切，然后連接到同樣經(jīng)^CbaI和 NotI雙酶切制備的pVL1393-hFc質(zhì)粒，構(gòu)建得到攜帶人Robol基因胞外不同區(qū)段和人免疫球蛋白Fc區(qū)段的融合蛋白表達質(zhì)粒。經(jīng)測序確認此質(zhì)粒的Robol基因片段DNA序列符合設(shè)計，沒有突變。不同區(qū)段Robol基因片段與hFc區(qū)段的翻譯閱讀框一致，起始密碼子和終止密碼子位置正確。利用質(zhì)粒大抽試劑盒(Qiagen公司)對pVL1393-hRobo-FC進行大量提取，純化方
18法根據(jù) Qiagen 公司提供的 QIAGEN Plasmid Midi Kit 使用手冊。pVL1392-hRobo_Fc 質(zhì)粒純化好之后，根據(jù)BD Pharmingen公司的桿狀病毒表達系統(tǒng)使用手冊，利用攜帶hRobo-Fc 基因序列的重組桿狀病毒感染Sf9昆蟲細胞，進行hRobo-Fc融合蛋白的大量表達。收集細胞培養(yǎng)液，利用ftOtein A親和層析介質(zhì)(GE Healthcare公司)純化hRobo-Fc融合蛋白， 純化方法根據(jù)GE Healthcare公司提供的nProtein A Sepharose 4Fast Flow使用手冊。實施例IV 利用二氫葉酸還原酶缺陷型中國倉鼠卵巢細胞(CHO-dhfr)表達系統(tǒng)， 進行包含人Robol基因胞外區(qū)(不同長度區(qū)段)和人免疫球蛋白！^區(qū)段的融合蛋白的大量表達。1.人Robol基因區(qū)段的選取和克隆以人Robol cDNA(核酸序列號NM_0(^941. 2，01^86加公司貨號5(109739)為模板， 選擇包括其五個Ig樣結(jié)構(gòu)域的區(qū)段，從起始密碼子ATG直到第1760位堿基，通過PCR制備基因區(qū)段cDNA序列。引物序列如下Robol fl760 :5，-GGCCAAGCTTATGAAATGGAAACATGTTCC-3，； [SEQ ID NO 19]Robol rl760:5，-TCCACGGAATTCAAATTTGGTTGCC-3，[SEQ ID NO 20]將上述各步驟獲得的PCR產(chǎn)物以HindIII和EcoRI雙酶切，然后連接到同樣經(jīng) HindIII和EcoRI雙酶切制備的pEGFP-附載體(BD Pharmingen)，構(gòu)建得到攜帶人Robol 基因胞外五個Ig樣結(jié)構(gòu)域的質(zhì)粒pEGFP-Nl-hRobo。經(jīng)測序確認此質(zhì)粒的Robol基因片段 DNA序列符合設(shè)計，沒有突變。2.人免疫球蛋白Fc區(qū)段的選取和克隆以人免疫球蛋白基因pAc-k-CH3(US Biological公司)恒定區(qū)為模板，選擇其重鏈C末端最后714個堿基的部分，通過PCR制備免疫球蛋白Fc區(qū)段。引物序列如下hFc forward2 :5，-AACCGTGAATTCCGTGGACAAGAGAGTTGAGCC-3，； [SEQ IDNO 21]hFc reverse2 5' -TACGGGTCGACTCATTTACCCGGAGACAGGG-3，[SEQ ID NO 22]將獲得的PCR產(chǎn)物以EcoRI和Mil雙酶切，然后連接到同樣經(jīng)EcoRI和Mil雙酶切的pEGFP-Nl-hRobo質(zhì)粒，構(gòu)建得到攜帶人Robol基因胞外五個Ig樣結(jié)構(gòu)域和人免疫球蛋白Fc區(qū)段的質(zhì)粒pEGFP-Nl-hRobo-Fc。經(jīng)測序確認此質(zhì)粒的Fc區(qū)段DNA序列符合設(shè)計，沒有突變。不同區(qū)段Robol基因片段與hFc區(qū)段的翻譯閱讀框一致，起始密碼子和終止密碼子位置正確。將獲得的pEGFP-Nl-hRobo-Fc質(zhì)粒以HindIII和Mil雙酶切，然后連接到同樣經(jīng)HindIII和Mil雙酶切的p3CI-dhfr載體，構(gòu)建得到攜帶人Robol基因胞外五個Ig樣結(jié)構(gòu)域和人免疫球蛋白Fc區(qū)段的質(zhì)粒p3CI-dhfr-hRobo-FC。經(jīng)測序確認此質(zhì)粒不同區(qū)段 Robol基因片段與hFc區(qū)段的翻譯閱讀框一致，起始密碼子和終止密碼子位置正確。利用質(zhì)粒大抽試劑盒^iagen公司)對p3CI-dhfr-hRobo-Fc質(zhì)粒進行大量提取，純化方法根據(jù)Qiagen公司提供的QIAGEN Plasmid Midi Kit使用手冊。 p3CI-dhfr-hRobo-Fc質(zhì)粒純化好之后，根據(jù)hvitrogen公司的Lipofectin使用手冊，感染CHO-dhfr細胞，篩選高表達克隆。收集細胞培養(yǎng)液，利用ftOtein A親和層析介質(zhì)(GE Healthcare公司)純化hRobo-Fc融合蛋白，純化方法根據(jù)GE Healthcare公司提供的 nProtein A Sepharose 4 FastFlow 使用手冊。實施例V 利用桿狀病毒表達系統(tǒng)，進行包含人Robol基因胞外區(qū)和人免疫球蛋白Fc區(qū)段的融合蛋白的大量表達。1. pVL1393-hRobol-Fc 的構(gòu)建以實施例IV中得到的p3CI-dhfr-hRobo-FC質(zhì)粒為模板，通過PCR制備人免疫球蛋白Fc區(qū)段。引物序列如下Robol forward' :5，-AGGCGGCCTCTAGAATGAAATGGAAACATGTTCC-3，； [SEQ IDNO 23]hFc reverse3 5' -TACGGGCGGCCGCTCATTTACCCGGAGACAG-3，[SEQ ID NO 24]將獲得的PCR產(chǎn)物以^CbaI和NotI雙酶切，然后連接到同樣經(jīng))(bal和NotI雙酶切的PVL1393載體(BD Wiarmaingen)，構(gòu)建得到攜帶人Robol基因胞外五個Ig樣結(jié)構(gòu)域和人免疫球蛋白Fc區(qū)段的質(zhì)粒pVL1393-hRobo-FC。經(jīng)測序確認此質(zhì)粒不同區(qū)段Robol基因片段與hFc區(qū)段的翻譯閱讀框一致，起始密碼子和終止密碼子位置正確。 2. hRobo-Fc融合蛋白的表達與純化利用質(zhì)粒大抽試劑盒(Qiagen公司)對pVL1393-hRobo-FC質(zhì)粒進行大量提取，純化方法根據(jù) Qiagen 公司提供的 QIAGEN Plasmid Midi Kit 使用手冊。pVL1393-hRobo_Fc 質(zhì)粒純化好之后，根據(jù)BD Pharmingen公司的桿狀病毒表達系統(tǒng)使用手冊，利用攜帶 hRobo-Fc基因序列的重組桿狀病毒感染Sf9昆蟲細胞，進行hRobo-Fc融合蛋白的大量表達。收集細胞培養(yǎng)液，利用ftOtein A親和層析介質(zhì)(GE Healthcare公司)純化mRobo-Fc 融合蛋白，純化方法根據(jù)GE Healthcare公司提供的nProtein A Sepharose 4Fast Flow 使用手冊。實驗方法RT-PCR 和 Northern 雜交原代HUVECs 細胞培養(yǎng)如文獻(Geng，J.-G. et al. Nature 343 :757-760(1990)) 所述。半定量 RT-PCR 實驗方法如文獻(Ma，Y. -Q. and Geng, J. _G. J. Immunol. 165 558-565 QOOO))所述。本研究中所用引物如下human Robol sense (+4440) 5 ‘ -CCT ACA CAG ATG ATCTTC C_3 ‘ (SEQ ID NO :25)，antisense (-4956) 5 ' -CAG AGG AGC CTG CAG CTC AGC TTTCAG TTT CCT C_3 ' (SEQ ID NO :26) ；human Slit2 sense (+3611) 5' -GGT GAC GGA TCCCAT ATC GCG GTA GAA CTC-3' (SEQ ID NO :27)， antisense (-4574) 5' -GGA CAC CTCGAG CGT ACA GCC GCA CTT CAC-3' (SEQ ID NO: 28) ；human β -actin sense (+1)5' -ATGGAT GAT GAT ATC GCC GC-3' (SEQ ID NO :29)， antisense (-1127) 5' -CTA GAA GCA TTTGCG GTG G_3' (SEQ ID NO :30)。使用 32P 標記的 Slit2或Robol cDNA片段檢測A375細胞和原代HUVECs細胞總RNA?？贵w的制備，免疫印跡和免疫染色Slit2_GST(包括人Slit2第57位到207位堿基)和Robol-GST融合蛋白(包括大鼠Robol第1位到168位堿基或第961位到1217位堿基)構(gòu)建入pGEX_4T_l載體(購自Amersham Pharmacia Biotech公司)。以此融合蛋白為抗原免疫兔或小鼠用以制備 anti-Slit2或anti-Robol多克隆抗體和單克隆抗體。免疫組織化學實驗方法如文獻(Liu， L. -P. et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 286 :281-291 (2001))所述。Slit2和RoboN蛋白的分離純化穩(wěn)定表達全長人Slit2蛋白(羧基端融合myc標簽)的人胚腎四3細胞系 Slit2/293 建系方法如文獻(Li, H. S. et al. Cell 96:807-818(1999) ；Wang, K. -H. etal.Cell 96 :771-784(1999))所述。收集細胞培養(yǎng)液，利用抗myc標簽的單抗9E10 ( lmg/ ml of Affi-Gel 10 ;Bio_Rad)，使用親和色譜法純化Slit2蛋白。Slit2蛋白的銀染和免疫印跡方法如文獻(Ma, L. et al. J. Biol. Chem. 269 :27739-27746(1994))所述。穩(wěn)定表達Robol胞外區(qū)蛋白(羧基端融合血紅素凝結(jié)素hemoagglutinin標簽)的人胚腎 293 細胞系 RoboN/293 建系方法如文獻(Li，H. S. et al. Cell 96 :807-818(1999)； Wang, K. -H. et al.Cell 96 :771-784 (1999))所述。收集細胞培養(yǎng)液，使用偶聯(lián)抗HA單抗 HAll (購自BAbCO公司)的親和柱純化RoboN蛋白。Boyden Chamber 實驗使用購自Neuro Probe公司的48孔Boyden Chamber進行細胞遷移實驗 (Terranova, V. P. et al. J. Cell. Biol. 101 :2330-2334(1985))。實驗前，待測細胞在 EBM/2%FBS饑餓4-8小時(根據(jù)細胞狀態(tài)而定)。實驗時，8um孔徑的聚碳酸酯膜在1 %明膠中浸泡45-60分鐘。在明膠中浸泡45-60分鐘。Chamber下層中加入Slit2或bFGF (購自Sigma公司)；Chamber上層加入一定密度的細胞懸液(HUVECs、rRobo 1/293和V/^293細胞于FCS/M199培養(yǎng)液中，密度為500000Cell/ml)。細胞遷移的環(huán)境為37°C，孵育時間為4小時。待遷移結(jié)束，小心從Chamber上取下膜，并去除膜上層未遷移的細胞，膜的上層向下浸泡在4%多聚甲醛中4°C固定過夜，然后PBS清洗膜一次并于0. 5%結(jié)晶紫/PBS中染色(室溫4-6小時)，PBS洗去表面浮色，在顯微鏡下觀察并統(tǒng)計遷移的細胞數(shù)目。Directional Migration ^^t蛋白梯度使用文獻(Hopker，V.H. et al. Nature 401 :69-73 (1999))提到實驗方法產(chǎn)生。壓縮空氣鋼瓶為壓力注射器提供氣壓，刺激器發(fā)出一定頻率的脈沖信號，控制壓力注射給藥。使用尖端直徑約為1微米玻璃毛細管給藥，每次噴入0. 15 μ M/p i CO litre Slit2 或 1 μ Μ/ρicolitre bFGF。24 孔板內(nèi)加入 200ul 的 Matrigel (購自 Becton Dickinson Labware)，將待測細胞加入到鋪有Matrigel的孔內(nèi)，在37°C 5% CO2培養(yǎng)箱中溫育。玻璃毛細管調(diào)整至其與細胞距離100微米，使用連接在Olympus 1X70顯微鏡上的CXD照相機 (JVC)將圖像紀錄并保存在電腦中，使用NIH Image或其他合適軟件分析在任意時間點的細胞遷移情況。Tube Formation Assay96孔板和Matrigel事先在冰上預冷。每孔加入IOOul的Matrigel (冰上無菌操作)，37°C放置 30 分鐘(Malinda，K. Μ. et al.，Identification of Iaminin α 1 and β 1 chain peptidesactive for endothelial cell adhesion, tube formation and aortic sprouting, FASEB J. 13 :53-62 (1999))。待其凝固成膠狀后，以 130000Cell/ml 的細胞濃度將HUVEC細胞稀釋在M199/2% FCS溶液中，加IOOul的細胞懸液到鋪有Matrigel的96孔板中。細胞在37°C /5% C02培養(yǎng)12-18小時后，于顯微鏡下觀察拍照并統(tǒng)計網(wǎng)絡(luò)樣結(jié)構(gòu)的長度。Xenograft腫瘤生長實驗A375 細胞用購自 Gibco 公司的 Lipofectin 轉(zhuǎn)染并用 400 μ g πιΓ1 的 hygromycin B(購自Sigma公司)篩選。使用Robol、Slit2或tubulin(作為上樣對照)的抗體，用免疫印跡的方法驗證RoboN/A375_Cl、C2、C3和V/A375細胞。細胞懸浮于DME培液中，在裸鼠腋下皮下注射 0. 2ml 細胞懸液(0' Reilly, M. S. et al.，Endostatin :An endogenousinhibitor ofangiogenesis and tumor growth, Cell 88 :277185 (1997))。對于抗體抑制實驗，注射腫瘤細胞的小鼠采取腹腔注射的方式，每次每只裸鼠注射Img的R5或?qū)φ誌gG2b 抗體，每周注射兩次(Muller，A. et al. Nature 410 :50-56 (2001)) 大約 30 到 35 天以后， 裸鼠取血統(tǒng)計血液中白細胞的數(shù)目，然后處死裸鼠。測量腫瘤塊中的嗜中性粒細胞數(shù)目的髓過氧化物酶 MPO 方法如文獻(Wang，J. _G. et al. Inflamm. Res. 51 :435-43(2002))所述。Cell Proliferation Assay對數(shù)生長期的細胞用胰酶消化，并以5000細胞/毫升懸浮在1640培養(yǎng)液中。將 100微升的細胞懸液加入到96孔板中一孔，放置在37°C、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。在不同的時間點，每孔內(nèi)加入20微升的tetrazolium salt, 37°C放置4小時，再加入100微升的10% SDS/5% isobutanol/孔終止反應。在酶標儀上測量0D570/630值。其他實驗如免疫沉淀實驗，lectin灌注實驗，HE染色和免疫熒光染色同各實驗室公認實驗方法。本發(fā)明將提供如何有效大量制備Robo基因片段融合蛋白的具體技術(shù)方案，包括 Robo基因片段、融合蛋白和表達系統(tǒng)的選擇等。本發(fā)明還可以通過對介導新生血管形成、淋巴管形成和腫瘤淋巴轉(zhuǎn)移的信號通路研究，開發(fā)對腫瘤或炎癥等疾病的治療和診斷方法。 如通過特異性抑制Slit-Robo信號通路，破壞Slit蛋白和其受體Robo蛋白的結(jié)合，進而抑制新生血管形成、淋巴管形成和腫瘤淋巴轉(zhuǎn)移，為進行Slit-Robo信號通路參與的腫瘤和炎癥等疾病相關(guān)的藥物開發(fā)奠定了堅實的基礎(chǔ)。雖然本實驗已經(jīng)闡述了少數(shù)實施方案，但本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員知道在不背離本發(fā)明范圍的條件下此發(fā)明設(shè)計包含其他實施方案。所以，本發(fā)明范圍由附加要求保護界定。
權(quán)利要求
1.物質(zhì)在制備用于預防或治療由Slit蛋白介導的疾病的藥物中的應用，所述物質(zhì)是能調(diào)節(jié)或阻斷Slit蛋白與Robo蛋白相互作用的藥物，所述疾病與淋巴管形成相關(guān)。
2.如權(quán)利要求1所述的應用，其特征在于，所述Slit蛋白是Slit2。
3.如權(quán)利要求1所述的應用，其特征在于，所述Robo蛋白是Robol或Robo4。
4.如權(quán)利要求1-3任一項所述的應用，其特征在于，所述藥物選自針對Slit蛋白的抗體、針對Robo蛋白的抗體、能結(jié)合Slit蛋白的Robo蛋白胞外區(qū)片段、或Robo融合蛋白。
5.如權(quán)利要求4所述的應用，其特征在于，所述的抗體是單克隆抗體。
6.如權(quán)利要求5所述的應用，其特征在于，所述的抗體是人源化抗體。
7.如權(quán)利要求4所述的應用，其特征在于，所述能結(jié)合Slit蛋白的Robo蛋白胞外區(qū)片段來源于Robo蛋白的第一個免疫球蛋白樣區(qū)域。
8.如權(quán)利要求4所述的應用，其特征在于，所述Robo融合蛋白是Robo-Fc融合蛋白。
9.一種預防或治療由Slit蛋白介導的疾病的藥物組合物，其特征在于，所述藥物組合物包含能調(diào)節(jié)或阻斷Slit蛋白與Robo蛋白相互作用的藥物，和藥學上可接受的藥物賦形劑、載體或溶劑，其中所述疾病與淋巴管形成相關(guān)。
10.如權(quán)利要求9所述的藥物組合物，其特征在于，所述Slit蛋白是Slit2。
11.如權(quán)利要求9或10所述的藥物組合物，其特征在于，所述能調(diào)節(jié)或阻斷Slit蛋白與Robo蛋白相互作用的藥物選自針對Slit蛋白的抗體、針對Robo蛋白的抗體、能結(jié)合 Slit蛋白的Robo蛋白胞外區(qū)片段、或Robo融合蛋白。
12.如權(quán)利要求11所述的藥物組合物，其特征在于，所述抗體是單克隆抗體。
13.如權(quán)利要求12所述的藥物組合物，其特征在于，所述抗體是人源化抗體。
14.如權(quán)利要求11所述的藥物組合物，其特征在于，所述能結(jié)合Slit蛋白的Robo蛋白胞外區(qū)片段來源于Robo蛋白的第一個免疫球蛋白樣區(qū)域。
15.如權(quán)利要求11所述的藥物組合物，其特征在于，所述Robo融合蛋白是Robo-Fc融合蛋白ο
16.能夠檢測到Slit蛋白或Robo蛋白或它們所對應的mRNA或它們的編碼基因的物質(zhì)在制備用于檢測Slit蛋白介導的病癥的診斷試劑中的應用，所述檢測包括以下步驟(a)從檢測目標得到檢測樣本，利用能夠檢測到Slit蛋白或Robo蛋白或它們所對應的mRNA或它們的編碼基因的物質(zhì)檢測單獨的Slit或Robo的水平或Slit和Robo兩者的水平；(b)從正常人取得樣品作為對照，利用能夠檢測到Slit蛋白或Robo蛋白或它們所對應的mRNA或它們的編碼基因的物質(zhì)檢測該樣品的單獨的Slit或Robo的水平或Slit和Robo 兩者的水平；(c)比較(a)和(b)檢測到的表達結(jié)果，來確定該檢測目標是否有Slit蛋白引起的疾病，如果檢測樣本的Slit或Robo水平高于對照，則表明該檢測目標患有所述疾病。
17.如權(quán)利要求16所述的應用，其特征在于，所述Slit蛋白是Slit2。
18.如權(quán)利要求16所述的應用，其特征在于，所述Robo蛋白是Robol或Robo4。
19.如權(quán)利要求16所述的應用，其特征在于，所述水平是DNA水平，RNA水平，蛋白水平，或綜合上述2者或3者的水平。
20.如權(quán)利要求1或16所述的應用或權(quán)利要求9所述的藥物組合物，其特征在于，所述疾病是與Slit-Robo信號傳導通路相關(guān)的疾病。
21.如權(quán)利要求1或16所述的應用或權(quán)利要求9所述的藥物組合物，其特征在于，所述疾病是癌癥或與淋巴管形成相關(guān)的疾病。
22.如權(quán)利要求21所述的應用或藥物組合物，其特征在于，所述癌癥是轉(zhuǎn)移性癌癥。
23.如權(quán)利要求21所述的應用或藥物組合物，其特征在于，所述癌癥是下列癌癥之一 結(jié)腸癌，胃癌，食道癌，肺癌，肝癌，乳腺癌，和膀胱癌。
全文摘要
本發(fā)明是關(guān)于一種預防或治療Slit蛋白介導的淋巴管形成相關(guān)疾病的方法，包括給予某一主體有效劑量的調(diào)節(jié)或抑制Slit蛋白與Robo蛋白結(jié)合的某一藥物。一種預防或治療Slit蛋白介導的疾病的合成藥物，包含調(diào)節(jié)或干擾Slit蛋白與Robo蛋白結(jié)合的某種藥物。一種預防或診斷Slit蛋白介導的疾病的方法，包括1)獲得待測主體的檢測樣本及檢測上述樣本中某一Slit2和(或)Robo蛋白的表達水平；2)獲得不發(fā)生疾病的對照主體的對照樣本并檢測上述樣本中某一Slit和(或)Robo蛋白的表達水平；3)比較1)和2)兩種樣本中Slit和(或)Robo的表達水平，以獲得關(guān)于Slit蛋白誘導疾病的相關(guān)結(jié)果。
文檔編號A61K49/00GK102233134SQ201010169208
公開日2011年11月9日 申請日期2010年4月30日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月30日
發(fā)明者楊小妹, 池姍, 耿建國, 陳銘 申請人:中國科學院上海生命科學研究院