專利名稱：一種長效抗菌藥物油乳劑及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是一種抗菌藥物劑型的改變，更具體地說，涉及的是一種獸藥抗菌藥物特別是獸藥抗菌藥物的長效緩釋劑型的改變，本發(fā)明還涉及該劑型的制備方法。

背景技術(shù)：
近年來，獸用長效制劑(Long-acting Preparations)倍受關(guān)注，其開發(fā)和應(yīng)用現(xiàn)已成為一個新的熱點。由于長效制劑在減少給藥次數(shù)和用量等多方面的優(yōu)勢，有效地節(jié)約了成本、減少動物應(yīng)激和人力支出以及環(huán)境污染，因此獸用長效制劑成為廣大養(yǎng)殖用戶期待的理想產(chǎn)品。長效制劑是現(xiàn)代藥物制劑中一種新型的制劑，其優(yōu)點是可持久的釋放和傳遞藥物，減少用藥次數(shù)，提供平穩(wěn)的血藥濃度，降低血藥濃度“峰谷”現(xiàn)象，提高藥效和安全度。制備長效制劑的原理主要是基于溶出速率的減少和擴散速率的減慢，使藥物的吸收速率減慢，從而達到緩釋和延長療效的目的。長效制劑在臨床上是倍受歡迎的劑型，該劑型具有省時省力，降低不良反應(yīng)，減少動物對注射的應(yīng)激，降低獸藥對環(huán)境污染，減少敏感菌的耐藥性，減少或杜絕藥物殘留，具有高效長效的特點。
長效制劑以混懸乳劑、脂質(zhì)體為多，現(xiàn)有混懸乳劑長效藥物，主要以油性溶媒為分散介質(zhì)制成一種長效緩釋制劑，是將抗菌藥物分散于油相然后讓攜帶藥物的油滴懸浮在水相中制成的混懸液，靜置時，分為兩層，用時搖勻，讓油相在水相中充分懸浮?，F(xiàn)有混懸乳劑在生產(chǎn)實踐中應(yīng)用時尚有許多不足之處首先是應(yīng)用范圍受限，難以全面推廣應(yīng)用，因為水溶性藥物很難分散于油相中，目前的混懸乳劑長效制劑均為不溶于水或在水溶液中不穩(wěn)定的抗菌藥物，但問題是絕大多數(shù)抗菌活性成分藥物易溶于水，這一部分的抗菌活性成分的藥物卻較難制成混懸乳劑類型的長效制劑。另外，目前的混懸乳劑，在臨床應(yīng)用中毒副作用較大，在應(yīng)用長效制劑時，往往一次性藥物用量較大，而在混懸乳劑中，分散在油相中的大量抗菌藥物由于緩釋作用，難以在短時間內(nèi)被運送到肝臟等器官而被迅速代謝，因此使藥物的毒副作用加倍呈現(xiàn)。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的旨在研發(fā)一種新型長效抗菌藥物劑型，該劑型可充分緩釋抗菌藥活性成分的抗菌作用、節(jié)省養(yǎng)殖成本、減少環(huán)境污染等，可適用于與各種水溶性或油溶性抗菌藥的活性成分的配制。在藥物預(yù)防和治療疾病方面為健康養(yǎng)殖提供相應(yīng)的技術(shù)保障。
所述的長效抗菌藥物劑型，包括含有抗菌藥物的水相、油相、乳化劑及穩(wěn)定劑，油相采用的是7#或15#白油；其中水相乳化劑為吐溫-80，油相乳化劑為司盤-80；所述水相被油包覆分散于油相中。
穩(wěn)定劑包括水相穩(wěn)定劑和油相穩(wěn)定劑。水相穩(wěn)定劑選自羧甲基纖維素和丙三醇兩種。油相的穩(wěn)定劑選自鯨蠟醇和蜂蠟兩種。
本發(fā)明的吐溫-80在水相中優(yōu)選的添加重量含量為6-10％。司盤-80在油相中優(yōu)選的添加重量含量為5-12％。
水相穩(wěn)定劑在水相中優(yōu)選的添加重量含量為4-8％。油相穩(wěn)定劑在油相中優(yōu)選的添加重量含量為1-5％。
水相與油相優(yōu)選的體積比為1∶1-2。
本發(fā)明最優(yōu)選的重量配比為 油相采用的是7#或15#白油，司盤-80在油相中的添加量為9-10％，鯨蠟醇1.5-2.5％，蜂蠟1-2％； 吐溫-80在水相中的添加量為6.5-8％，羧甲基纖維素2.5-3％，丙三醇3.5-4％，水相中余下的為抗菌藥水溶液；油相與水相的體積比為1∶1。
所述的含有抗菌藥物的水相中還可將抗菌藥物與甲氧芐啶等抗菌增效劑混合，制成復(fù)方抗菌藥物。
本發(fā)明的制備方法包括以下步驟 水相的制備在40-45℃下攪拌加入水相穩(wěn)定劑至水中，使水溶液溫度降至室溫溶解抗菌藥物或復(fù)方抗菌藥物，最后加入吐溫-80并充分?jǐn)嚢枋蛊淙芙庾鳛樗唷?br> 油相的制備將7#或15#白油加熱至65-130℃加入油相穩(wěn)定劑攪拌使其充分溶解后，冷卻至50-60℃加入司盤-80充分?jǐn)嚢枋蛊淙咳芙庾鳛橛拖唷?br> 最后將水相、油相混合乳化、 滅菌。
所述的乳化是將油相與水相緩慢混合，邊混合邊攪拌；混勻后用膠體磨充分乳化，直到油乳劑經(jīng)11000-13000r/min離心不分層為乳化完全。
本發(fā)明的油相和水相最優(yōu)選制備過程為 水相的制備將丙三醇溶解于注射用水，然后加熱至40-45℃邊攪拌邊加入羧甲基纖維素，使該溶液溫度降至室溫溶解抗菌藥物或復(fù)方抗菌藥物，最后加入吐溫-80并充分?jǐn)嚢枋蛊淙芙庾鳛樗唷?br> 油相的制備將白油加熱至65-70℃加入蜂蠟攪拌使其充分溶解后，繼續(xù)加熱至120-130℃溶解鯨蠟醇，冷卻至50-60℃加入司盤-80充分?jǐn)嚢枋蛊淙咳芙庾鳛橛拖唷?br> 本發(fā)明作為一種新的抗菌藥物緩釋劑，將減緩藥物在機體吸收和釋放，釋放藥物為恒速或接近恒速，血藥濃度更加平穩(wěn)，藥物的釋放速率不受環(huán)境和酶等外界因素的影響，同時將抗菌藥物包裹于油顆粒中，使其不與機體直接接觸從而降低毒副作用，是一種具有創(chuàng)新性的長效制劑。本發(fā)明的產(chǎn)品具有應(yīng)用前景廣闊、市場潛力較大。
本發(fā)明將抗菌藥物或復(fù)方抗菌藥物制備成油包水型(W/O)乳劑劑型，本發(fā)明的劑型所包覆的是抗菌藥物顆粒相對于油乳劑滅活疫苗中的免疫原都是生物大分子而言，都是小分子(如抗生素，人工合成的抗菌化合物，具有抗菌能力的中成藥等)，抗菌藥物顆粒極其容易從油包水顆粒中穿透而出，同時破壞油乳劑的油包水結(jié)構(gòu)，因此很難制成穩(wěn)定的油包水的抗菌藥物油乳劑。本發(fā)明所提供的劑型可以很好地解決以上問題，具有良好的油包水的效果，并創(chuàng)造性設(shè)計出制備油乳劑的工藝流程，從而首次創(chuàng)造出制備抗菌藥物類生物小分子油包水顆粒及工藝流程。
本發(fā)明中特別篩選了7#或15#白油，而是通過反復(fù)試驗，證明只有7#或15#白油是安全無毒，刺激性小能制備出油包水劑型的油類，而現(xiàn)有的油乳劑長效制劑中的油類，難以用于制備油包水型油乳劑，基于以上重要發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明選用了7#或15#白油作為油相。
與普通注射制劑相比，本發(fā)明的長效制劑所具有優(yōu)勢和特點(1)減少給藥次數(shù)；(2)血藥濃度平穩(wěn)，避免“峰谷”現(xiàn)象，降低藥物的毒副作用；(3)增加藥物治療的穩(wěn)定性；(4)減少用藥總劑量。
與國內(nèi)現(xiàn)有混懸乳劑長效制劑相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)勢與創(chuàng)新(1)本發(fā)明制備的是超長效制劑，半衰期可達15-20d，而現(xiàn)有的只有1-3d；能更加延長藥物在動物體內(nèi)的作用時間，更減少動物的給藥次數(shù)，并能進一步降低藥物在體內(nèi)的殘留。(2)本發(fā)明可制備長效復(fù)方制劑，隨著抗菌藥物在臨床上應(yīng)用的增加，細(xì)菌的耐藥性也逐漸增強，為克服細(xì)菌耐藥性和延長藥物作用時間，本發(fā)明利用油乳劑滅活疫苗抗原緩釋技術(shù)與藥用乳劑制備技術(shù)相結(jié)合，根據(jù)藥物配伍規(guī)律，將抗菌藥物與甲氧芐啶制備成復(fù)方乳劑，這將打破傳統(tǒng)的長效制劑研制方法，可望進一步提高長效制劑的治療效果。(3)本發(fā)明制備得到的抗菌藥物，便于推廣應(yīng)用，水溶性的抗菌藥物以抗菌藥物水溶液制備水相，脂溶性的抗菌藥物以抗菌藥物的混懸液制備水相，均能成功制備油包水型超長效制劑。(4)本研究篩選的油包水型(W/O)乳劑突破了傳統(tǒng)長效劑型(如混懸劑、脂質(zhì)體等)的生產(chǎn)工藝復(fù)雜、成本價格高以及安全性和穩(wěn)定性差的技術(shù)瓶頸。按本發(fā)明制備的超長效乳劑成本低、抗菌效果強、安全性和穩(wěn)定性均良好，且該乳劑已具備了規(guī)?；a(chǎn)和推廣應(yīng)用的多項關(guān)鍵性條件。本發(fā)明乳劑應(yīng)用于畜牧養(yǎng)殖，可有效地保證動物健康養(yǎng)殖，對環(huán)境保護和改善養(yǎng)殖業(yè)條件具有重要意義，社會效益明顯，產(chǎn)業(yè)化前景廣闊。



本發(fā)明制備的油乳劑顆粒顯微照片及模式圖。
圖1油包水乳劑顆粒(100X)。
圖2乳劑顆粒結(jié)構(gòu)模式圖。

具體實施例方式 以下實施例旨在說明本發(fā)明而不是對本發(fā)明的進一步限定。
實施例1 超長效環(huán)丙沙星復(fù)方油乳劑的制備和應(yīng)用 環(huán)丙沙星(Ciprofloxacin，CPLX)，又名環(huán)丙氟哌酸，是目前獸醫(yī)臨床應(yīng)用的氟喹諾酮類藥物中對革蘭氏陰性菌抗菌活性最強的一種，其作用機理主要通過抑制細(xì)菌DNA旋轉(zhuǎn)酶而發(fā)揮其快速殺菌作用。環(huán)丙沙星具有脂溶性高、抗菌后效應(yīng)時間長、體內(nèi)分布廣及不良反應(yīng)少等優(yōu)點因而在國內(nèi)外被廣泛應(yīng)用于獸醫(yī)臨床來治療感染性疾病。但這種優(yōu)良的藥物目前在獸醫(yī)臨床主要只有口服制劑和普通注射劑，需多次給藥方可達到較好的防治效果。因此，開發(fā)一種環(huán)丙沙星的長效新劑型，充分發(fā)揮其在獸醫(yī)臨床上的良好效果對防治動物細(xì)菌性疾病具有廣闊的應(yīng)用前景。
制備方法將環(huán)丙沙星和甲氧芐啶按4∶1溶于水，并加入吐溫-80(水相8％)、羧甲基纖維素(水相5.5％)和丙三醇(水相7％)配成環(huán)丙沙星(水相20％)水溶液作為水相；將鯨臘醇(油相5％)和蜂臘(油相1％)溶于7#或15#白油后加入司盤-80(油相8％)，加熱溶解后，121℃，30min滅菌，冷卻至室溫，將水相緩慢加入油相(水相∶油相＝1∶1)，邊加邊攪拌，然后將混合好的水相和油相轉(zhuǎn)移至膠體磨充分乳化，直到乳劑經(jīng)6000r/m，10min離心不分層即可。
復(fù)方環(huán)丙沙星乳劑的安全性評價 為了評價復(fù)方環(huán)丙沙星乳劑的安全性，為獸醫(yī)臨床提供安全的用藥方案。采用動物藥物安全性評價試驗的方法對不同種動物進行了急性毒性試驗、熱原試驗、溶血性試驗、過敏性試驗以及肌肉刺激試驗。結(jié)果表明復(fù)方環(huán)丙沙星乳劑最大耐受量為2916.7mg/kg，相當(dāng)于臨床推薦用量(2.5mg/kg)的1166.7倍，為復(fù)方環(huán)丙沙星溶液LD50的(LD50為1058.93mg/kg，LD5095％可信限為981.26-1136.54mg/kg)2.75倍，無熱源性、溶血性和過敏性，無肌肉刺激反應(yīng)。因此，復(fù)方環(huán)丙沙星乳劑在獸醫(yī)臨床應(yīng)用安全。
1材料和方法 1.1試驗材料 1.1.1藥品與試劑 5％復(fù)方環(huán)丙沙星乳劑(本實驗室和湖南省獸藥工程技術(shù)研究中心共同研制，批號090622，每1ml含50mg乳酸環(huán)丙沙星，10mg乳酸甲氧芐啶)，5％復(fù)方環(huán)丙沙星注射液(本實驗自制，批號090718，每1ml含50mg乳酸環(huán)丙沙星，10mg乳酸甲氧芐啶)，乳酸環(huán)丙沙星原粉(98.3％)、乳酸甲氧芐啶原粉(99.1％)(均由湖南農(nóng)大動物藥業(yè)公司提供)，氯化鈉注射液(0.9％，批號B080412，四川科倫股份有限公司)，滅菌蒸餾水 1.1.2主要儀器 超凈工作臺(SW-CJ-2FD型，蘇州凈化設(shè)備公司)，電子溫度計()電熱恒溫水溫箱(上海醫(yī)療器械七廠)，恒溫恒濕培養(yǎng)箱(LRH-250-S，廣東省醫(yī)療器械廠)，離心機(Z323K型，德國Hermle)，電子天平(AY220型，日本Electronic Balance)，電熱鼓風(fēng)干燥箱(DHG-9240A型，上海精宏試驗設(shè)備有限公司)，全自動立式電熱壓力蒸汽滅菌器(YXQ-LS-50S II，上海博迅公司醫(yī)療設(shè)備廠)，可調(diào)電爐(長沙市遠(yuǎn)東電爐廠)，移液器，燒杯，量筒，培養(yǎng)皿，試管，試管架。
1.1.3實驗動物 健康昆明系小鼠120只，體重18～22g，雌雄各半；健康家兔12只，體重2.5kg左右；豚鼠6只，體重250～350g之間，雌雄各半。所有實驗動物和飼料均由中南大學(xué)實驗動物中心提供。
1.2方法 1.2.1急性毒性試驗 1.2.1.1注射液急性毒性試驗預(yù)實驗 根據(jù)參考文獻中環(huán)丙沙星的半數(shù)致死量的報道，將50只小鼠隨機平均分成5組，雌雄各半，分別按500，750，1000，1250mg/kg和1500mg/kg的劑量于小白鼠腹腔一次性注射給藥， 連續(xù)觀察其死亡情況，反復(fù)試驗摸索出Pm＝100％的劑量(Dm)和Pn＝0的劑量(Dn)，確定組數(shù)(n)以及各組劑量公比(r)。
1.2.1.2注射液急性毒性試驗正式實驗 根據(jù)預(yù)實驗的結(jié)果，將60只小鼠平均分成6組，分別按1333.3，1155.7，1000.6，866.3，750mg/kg和0.5ml/kg氯化鈉注射液對照組于小鼠腹腔一次性注射給藥；與七天內(nèi)觀察給藥后小鼠的毒性反應(yīng)，記錄死亡數(shù)。重點記錄飲食、精神活動及死亡情況，對死亡小鼠及時進行剖檢，肉眼觀察各組織、器官的病理變化，用改良寇氏法計算LD50及LD50的95％平均可置信區(qū)間。
1.2.1.3乳劑的急性毒性試驗 在預(yù)試驗中，發(fā)現(xiàn)復(fù)方環(huán)丙沙星乳劑以極限容量1mL/只(含量50mg/ml，為臨床用量的555.6倍)腹腔注射后，小鼠無死亡，不能進行LD50值的測定，因此進行最大耐受量實驗。在多次預(yù)試驗基礎(chǔ)上，取小白鼠20只，雌雄各半，隨機分為兩組，一組注射復(fù)方環(huán)丙沙星注射液，劑量為972.2mg/kg.bw，腹腔注射0.7mL，另一組按2916.7mg/kg.bw給小白鼠腹腔注射復(fù)方環(huán)丙沙星乳劑(相當(dāng)于環(huán)丙沙星臨床用量的1166.7倍)分3次在24h內(nèi)給藥完畢(受制備方法的影響，無法得到高濃度且穩(wěn)定的復(fù)方環(huán)丙沙星乳劑，所以分多次給藥以達到所需劑量)。給藥后，觀察并記錄7d內(nèi)動物外觀體征、飲食欲、行為活動、大小便、中樞神經(jīng)系統(tǒng)癥狀及死亡動物數(shù)。如有動物死亡，及時尸檢，肉眼觀察，如有病變組織則進行切片鏡檢。
1.2.2熱源試驗 挑選健康無傷家兔8只，體重1.7-3.0kg，雌兔應(yīng)無孕，試驗前在實驗室內(nèi)觀察1周，體重應(yīng)不減輕，精神、食欲、排泄等不得有異?，F(xiàn)象。將家兔在17℃-28℃室溫條件下飼養(yǎng)3天，給藥前用電子溫度計進入直腸(6cm)測定直腸溫度4次(1h/次)，每次體溫均在38.0-39.6℃之間。挑選符合要求的家兔3只，測定正常體溫后15min內(nèi)，將復(fù)方環(huán)丙沙星乳劑溫?zé)嶂?8℃，按0.5mg/kg體重大腿肌肉注射， 然后進行1h/次測溫，共測4次，每次1.5min。
1.2.3體外溶血性試驗 1.2.3.1 2％紅細(xì)胞混懸液的制備 健康家兔1只，自心臟采新鮮血液20mL，置三角燒瓶中，用竹簽反復(fù)攪拌以除去纖維蛋白，再用生理鹽水沖洗3～5次，每次加生理鹽水10ml混勻后2000r/min離心10min，去除上清液，再加入生理鹽水混勻離心，反復(fù)洗4～5次，至上清液為無色透明方可用于實驗。將所得紅細(xì)胞按其容積，用生理鹽水稀釋成2％的混懸液。
1.2.3.2溶血試驗 取試管7支并編號，按表1中依次加入各種溶液，第6管不加供試品溶液，作為空白對照管；第7管仍不加供試品溶液，用蒸餾水代替生理鹽水，作為完全溶血的對照。輕輕搖勻各試管并置于37℃水浴保溫，2h取出后對照表2判斷標(biāo)準(zhǔn)并記錄結(jié)果。
表1溶血試驗操作表(單位ml) Table 1
注試管7用蒸餾水代替生理鹽水 表2溶血性實驗結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn) Table 2 Standard of haemolytic test
結(jié)果判斷一般認(rèn)為，2h后凡第3管或第3管以前的各管出現(xiàn)溶血、部分溶血或出現(xiàn)凝集反應(yīng)的制劑，不宜做靜脈注射用；以0.3mL注射液(第三管)在2h內(nèi)不發(fā)生溶血作用者認(rèn)為可供注射用。
1.2.4刺激性試驗[11-12] 1.2.4.1肌肉刺激性試驗 取體重2～3kg健康家兔6只，分三組，每組雌雄各半。第一組左側(cè)股四頭肌注射0.5ml/kg的復(fù)方環(huán)丙沙星乳劑，右側(cè)注射0.5ml/kg生理鹽水；第二組均于同樣部位注射0.5ml/kg的生理鹽水，進針角度以為30°～45°為準(zhǔn)；第三組為空白對照組。48h后家兔應(yīng)健康如常。放血致死家兔，解剖取出股四頭肌，縱向切開觀察注射部位跟對照組比較有無明顯病理變化。肌肉刺激反應(yīng)評分標(biāo)準(zhǔn)見表3。
表3注射樣品對肌肉刺激反應(yīng)評分標(biāo)準(zhǔn) Table 3 Standard of stimulus response of injection samples on muscle
凡2只家兔的平均反應(yīng)級數(shù)在2以下的可供肌肉注射之用；平均反應(yīng)超過3的不能供肌肉注射之用；平均反應(yīng)級數(shù)在2～3之間的可進行復(fù)試或結(jié)合其他項目考慮其臨床試用問題。凡刺激性試驗不能達到肌肉注射要求的制劑一般也不宜供皮下注射或黏膜面給藥和創(chuàng)面給藥。
1.2.4.2腹腔刺激性試驗 取昆明系小鼠20只，平均體重18～22克，雌雄各半，設(shè)置兩組。一組腹腔注射復(fù)方環(huán)丙沙星乳劑0.5ml/只g；另一組腹腔注射同劑量的滅菌生理鹽水。注射后觀察小鼠活動情況，若有扭體反應(yīng)為有刺激性，無扭體反應(yīng)為無刺激性。
1.2.5過敏性試驗[12] 取豚鼠6只，體重250～350g，雌雄各半，隔天肌肉注射復(fù)方環(huán)丙沙星乳劑0.5ml/只，連續(xù)三次。將豚鼠平均分成兩組。第一組在首次注射后的第14天由腹腔注射乳劑3ml/只進行攻擊，并觀察注射后豚鼠有無用爪搔鼻、噴嚏、豎毛、抽搐、呼吸困難、大小便失禁、休克和死亡等現(xiàn)象。第二組于首次注射后的第21天同樣方法操作，并觀察動物反應(yīng)。過敏反應(yīng)登記表見表4。
表4豚鼠過敏反應(yīng)級數(shù) Table 4
如果兩組豚鼠均為出現(xiàn)明顯過敏反應(yīng)，可認(rèn)為該供試品反應(yīng)試驗陰性；如果有反應(yīng)可按表4的標(biāo)準(zhǔn)分級，從而判斷是否合格。反應(yīng)等級數(shù)達2級以上(包括2級)時，可認(rèn)為該供試品過敏反應(yīng)試驗陽性。
2結(jié)果 2.1急性毒性試驗結(jié)果 2.1.1復(fù)方環(huán)丙沙星注射液急性毒性預(yù)試驗結(jié)果 經(jīng)過反復(fù)摸索從而確定復(fù)方環(huán)丙沙星注射液Pm＝100％的劑量為(Dm)為1333.3mg/kg和Pn＝0的劑量(Dn)為750mg/kg，分為5組，各組劑量公比(r)為1.155。則D5＝1333.3mg/kg，D4＝1155.7mg/kg，D3＝1000.6mg/kg，D2＝866.3mg/kg D1＝750mg/kg。
2.1.2復(fù)方環(huán)丙沙星注射液急性毒性正式試驗結(jié)果 按預(yù)實驗結(jié)果各劑量組給藥后，小鼠逐漸出現(xiàn)活動減少，被毛逆亂，對外界刺激反應(yīng)遲鈍，有的俯臥不動，呼吸困難，腹式呼吸明顯，糞便變軟等中毒癥狀。高劑量組少數(shù)動物后肢癱瘓，并于5h內(nèi)出現(xiàn)死亡。對死亡動物剖檢，藥物吸收完全，注射部位無異常，高劑量組動物肝臟有黑色小斑點，未發(fā)現(xiàn)其他病理變化。復(fù)方環(huán)丙沙星注射液急性毒性實驗結(jié)果見表5。
表5 復(fù)方環(huán)丙沙星注射液急性毒性實驗結(jié)果 Table 5 Results of acute toxicity of

根據(jù)上表顯示的動物用藥劑量以及死亡數(shù)量的實驗數(shù)據(jù)，按改良寇氏法計算半數(shù)致死量，求得LD50為1058.93mg/kg，LD5095％可信限為981.26-1136.54mg/kg?？瞻讓φ战M無死亡情況，生長正常。
2.1.3復(fù)方環(huán)丙沙星乳劑最大耐受性試驗 以972.2mg/kg.bw劑量注射復(fù)方環(huán)丙沙星注射劑的小鼠，有9只小鼠立即出現(xiàn)精神委靡，肌肉震顫直至抽搐，7d內(nèi)小鼠死亡4只。以2916.7mg/kg.bw劑量注射的小鼠在給藥后7d內(nèi)，未見有小鼠死亡，但有15％以上的小鼠在最后一次注射后，產(chǎn)生行走減少、嗜睡的癥狀，2-3h后恢復(fù)正常?？芍獜?fù)方環(huán)丙沙星乳劑對小鼠的最大耐受量大于2916.7mg/kg.bw，此量相當(dāng)于臨床用量的1166.7倍。結(jié)果表明復(fù)方環(huán)丙沙星乳劑的毒性顯著低于復(fù)方環(huán)丙沙星注射液。
2.2熱源性試驗結(jié)果 經(jīng)試驗的3只家兔的體溫數(shù)據(jù)見表6 表6熱源性試驗體溫結(jié)果(℃) Table 5
每只家兔體溫升高均小于0.5℃，并且3只家兔體溫升高總和(1.0℃)，小于1.4℃，符合《中華人民共和國藥典》[10]規(guī)定。從而確定復(fù)方環(huán)丙沙星乳劑無熱源反應(yīng)。
2.3體外溶血試驗結(jié)果 復(fù)方環(huán)丙沙星乳劑體外溶血性試驗結(jié)果見表7 表7復(fù)方環(huán)丙沙星乳劑溶血試驗結(jié)果(單位ml) Table 7 hemolytic test result
注“-”為不溶血； “+”為溶血 試驗結(jié)果表明復(fù)方環(huán)丙沙星乳劑無溶血現(xiàn)象。
2.4刺激試驗結(jié)果 2.4.1肌肉刺激性試驗結(jié)果 試驗動物中乳劑注射部位同生理鹽水對照組相比肌肉組織無任何差異，組織病理學(xué)檢查，肌纖維未見充血、水腫、炎細(xì)胞浸潤等，肌肉刺激反應(yīng)為0級。
2.4.2腹腔刺激性試驗結(jié)果 受試動物經(jīng)乳劑和生理鹽水對照組腹腔注射后，無扭體等異常刺激反應(yīng)，判定復(fù)方環(huán)丙沙星乳劑為無腹腔刺激性反應(yīng)。
2.5過敏性試驗結(jié)果 兩組豚鼠在經(jīng)過腹腔注射后均無明顯反應(yīng)，根據(jù)判定標(biāo)準(zhǔn)[12]得出復(fù)方環(huán)丙沙星乳劑過敏性試驗為0級，無過敏性反應(yīng)。
復(fù)方環(huán)丙沙星乳劑的研制及體外抑菌實驗 為了充分發(fā)揮環(huán)丙沙星在獸醫(yī)臨床上的效果，克服其半衰期短和連續(xù)用藥導(dǎo)致的不良反應(yīng)，研制了一種復(fù)方環(huán)丙沙星乳劑。采用油乳劑滅活疫苗抗原緩釋技術(shù)與藥物乳劑制備技術(shù)相結(jié)合，將環(huán)丙沙星和乳酸TMP按5∶1比例制備成一種油乳劑，并對其性狀及穩(wěn)定性進行研究。用復(fù)方環(huán)丙沙星注射液作為對照，進行了該乳劑對五種細(xì)菌(大腸桿菌、巴氏桿菌、沙門氏菌、金黃葡萄球菌和鏈球菌)的體外抑菌試驗。結(jié)果表明復(fù)方環(huán)丙沙星乳劑為淡黃色、油乳狀，pH值為6.3～6.6，顆粒平均大小為7.6μm，穩(wěn)定性良好；復(fù)方環(huán)丙沙星乳劑對五種細(xì)菌的MIC值和MBC值顯著強于復(fù)方環(huán)丙沙星注射液(P＜0.01)。
1材料與方法 1.1實驗試劑與儀器 乳酸環(huán)丙沙星原粉(98.3％)、乳酸甲氧芐啶原粉(乳酸TMP，99.1％)(均由湖南農(nóng)大動物藥業(yè)公司提供)，7#白油(北京石油化工科學(xué)研究院)，span-80、tween-80(批號F20080723、F20080213國藥集團化學(xué)試劑有限公司)，硬脂酸鋁(批號080728天津市申泰化學(xué)試劑有限公司)，5％復(fù)方環(huán)丙沙星注射液(本實驗室自制，批號090718，每1ml含50mg乳酸環(huán)丙沙星，10mg乳酸甲氧芐啶)，膠體磨(JM-L50型，鄭州玉祥機械設(shè)備有限公司)，全自動立式電熱壓力蒸汽滅菌器(YXQ-LS-50S II，上海博迅公司醫(yī)療設(shè)備廠)，超凈工作臺(SW-CJ-2FD型，蘇州凈化設(shè)備公司)，恒溫恒濕培養(yǎng)箱(LRH-250-S，廣東省醫(yī)療器械廠)，冷凍離心機(Z323K型，德國Hermle)，電子天平(AY220型，日本Electronic Balance)，光學(xué)顯微鏡(Nikon Eclipse E200日本)，便攜式pH計(PHB-1型，杭州科盛機電設(shè)備有限公司)。
1.2試驗菌種及培養(yǎng)基 大腸埃希氏菌(C83901)、多殺性巴氏桿菌(Kober-6)、鼠傷寒沙門氏菌(C77-31)、金黃色葡萄球菌(C56023)、豬獸疫鏈球菌(C55138)均購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，營養(yǎng)瓊脂(批號200902 15北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司)，普通肉湯培養(yǎng)基。
1.3乳劑的性狀檢測 1.3.1乳劑的物理性狀 通過肉眼觀察每個批號復(fù)方環(huán)丙沙星乳劑的顏色和性狀；利用便攜式pH計測定每種批號乳劑的pH值；采用顯微鏡觀察乳劑顆粒大小并拍照，運用Nikon編輯軟件測定乳劑顆粒直徑大小，計算平均值。
1.3.2乳劑穩(wěn)定性測定方法及判斷標(biāo)準(zhǔn) 1)加速老化法，高溫37℃貯存10天若不破乳(不分層)，可穩(wěn)定存放一年。
2)離心加速分層法，可通過離心乳劑的方法測定在半徑為10cm的離心機中，以3000r/min離心15min，不分層為合格。
3)粘度測定取內(nèi)口直徑為1.2mm的吸管，在25℃條件下吸滿1ml乳劑，垂直放出0.4ml所需時間為5s為合格。
1.4體外抑菌試驗 1.4.1菌液制備及細(xì)菌計數(shù) 將保存的大腸桿菌、巴氏桿菌、沙門氏菌、金黃葡萄球菌及鏈球菌菌種接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中活化(其中鏈球菌需加5％新生牛血清)，37℃恒溫箱中培養(yǎng)18h。
采用試管10倍稀釋法將每種活化的菌液在試管中依次進行10倍稀釋，然后對第4、5、6、7管平皿菌落計數(shù)，平行三次求平均值。
1.4.2最低抑菌濃度(MIC)的測定 采用試管液體二倍稀釋法測定將藥液(復(fù)方環(huán)丙沙星乳劑和復(fù)方環(huán)丙沙星注射液)試管進行二倍稀釋至第24管，每管加入菌液使其濃度為105cfu/mL，同時平行進行前23管陰性和第24管陽性對照。以目測法與對照組比較法判斷結(jié)果，以完全無細(xì)菌生長的最低藥物濃度作為細(xì)菌對該藥物的敏感度，即為該藥物最低抑菌濃度(MIC)。相同過程重復(fù)3次，求平均值。
1.4.3最小殺菌濃度(MBC)的測定 采用平皿菌落計數(shù)法將藥物組無菌生長的試管中的混合液分別取0.1mL接種于平皿瓊脂培養(yǎng)基上，每個做三個重復(fù)，置37℃恒溫箱中培養(yǎng)18h，菌落計數(shù)，低于5個的平皿所對應(yīng)的藥物濃度為該藥物的殺菌濃度，求平均值，濃度最低者即為該藥物的最小殺菌濃度(MBC)。
2結(jié)果與分析 2.1乳劑的性狀 2.1.1物理性狀 復(fù)方環(huán)丙沙星乳劑為淡黃色乳劑，其pH值為6.3～6.6。(該藥物中乳酸環(huán)丙沙星和乳酸TMP的總含量為60mg/mL，比例為5∶1)。顯微鏡拍照及軟件計算結(jié)果乳劑顆粒直徑平均大小7.6μm，符合獸用注射乳劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[16]，圖片見圖1。根據(jù)油包水型(W/O)乳劑理論構(gòu)建乳劑顆粒結(jié)構(gòu)模式圖見圖2。
2.1.2穩(wěn)定性及粘度結(jié)果 O∶W按1∶1，2∶1，3∶1，3∶2四種容量比的復(fù)方環(huán)丙沙星乳劑穩(wěn)定性及粘度結(jié)果見表1 表1四種復(fù)方環(huán)丙沙星乳劑的穩(wěn)定性及粘度結(jié)果 Table 1 The stability and viscosity of four kinds of Compound CiprofloxacinEmulsion
結(jié)果表明O∶W的乳劑穩(wěn)定性很好，完全可在常溫下可存放一年以上不破乳、不分層。二者粘度測定所需時間為4s，表明乳劑粘度小，注射時通針性良好。O∶W按1∶1容量比的乳劑為最佳配比。
2.2體外抑菌試驗結(jié)果 復(fù)方環(huán)丙沙星乳劑和注射液對五種不同細(xì)菌的最低抑菌濃度(MIC)和最低殺菌濃度(MBC)見表2和表3。
表2復(fù)方環(huán)丙沙星乳劑和注射液對五種不同細(xì)菌的平均MIC值(μg/ml) Table 2 The average MIC values of the Emulsion and Injection of CompoundCiprofloxacin for five different kinds of bacteria(μg/ml)
表3復(fù)方環(huán)丙沙星乳劑和注射液對五種不同細(xì)菌的平均MBC值(μg/ml) Table 3 The average MBC values of the Emulsion and Injection of CompoundCiprofloxacin for five different kinds of bacteria(μg/ml)

將上述實驗數(shù)據(jù)通過SAS8.1和EXCEL2003進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計及方差分析，結(jié)果表明復(fù)方環(huán)丙沙星乳劑對五種細(xì)菌的最低抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC)均明顯優(yōu)于復(fù)方環(huán)丙沙星注射液(P＜0.01)。
2.3體外抑菌試驗結(jié)果分析 由表2和表3可知，復(fù)方環(huán)丙沙星乳劑和復(fù)方環(huán)丙沙星注射液對五種菌都表現(xiàn)了較強的體外抑菌效果，說明復(fù)方環(huán)丙沙星為廣譜、強效抗菌藥，此結(jié)果與文獻表述一致；兩種劑型對五種細(xì)菌中的大腸桿菌效果較為顯著，特別是乳劑對其MIC值達到了0.00976μg/ml，對巴氏桿菌和沙門氏菌的抑菌效果也非常明顯，說明了環(huán)丙沙星對革蘭氏陰性菌是一類很強的氟喹諾酮類藥物；根據(jù)段傳可[18]等報道環(huán)丙沙星注射液對大腸桿菌和金黃葡萄球菌的MIC值均為0.06μg/ml，說明復(fù)方環(huán)丙沙星乳劑和注射劑均有較強的抑菌能力。統(tǒng)計結(jié)果顯示復(fù)方環(huán)丙沙星乳劑對五種細(xì)菌的MIC和MBC明顯強于復(fù)方環(huán)丙沙星注射液(P＜0.01)，說明復(fù)方環(huán)丙沙星通過劑型的改變其體外抑菌效果發(fā)生了顯著的提升。
實施例2 超長效恩諾沙星復(fù)方油乳劑的制備和應(yīng)用 恩諾沙星又名乙基環(huán)丙沙星、恩氟沙星。系統(tǒng)命名1-環(huán)丙基-7-(4-乙基-1-哌嗪基)-6-氟-1，4-二氫-4-氧代-3-喹啉羧酸。本品目前被國家指定為動物專用藥。藥動學(xué)內(nèi)服和肌注的吸收迅速和較完全，0.5-2小時血藥度達高峰。除了中樞神經(jīng)系統(tǒng)外，幾乎所有的組織的藥物濃度都高于血漿，這有利于全身感染和深部組織感染的治療。本品通過腎和非腎方式進行消除，約15％-50％的藥物原形通過尿排泄。在動物體內(nèi)的代謝主要是脫去乙基而成為環(huán)丙沙星。藥理作用本品為廣譜殺菌藥，對支原體有特效。對大腸桿菌、克雷白桿菌、沙門氏菌、變形桿菌、綠膿桿菌、嗜血桿菌、多殺性巴氏桿菌、溶血性巴氏桿菌、金葡菌、鏈球菌等都有殺菌效用。
制備方法恩諾沙星不溶于水，將恩諾沙星和甲氧芐啶按4∶1混勻后加入水中，并加入吐溫-80(水相8％)、羧甲基纖維素(水相5.5％)和丙三醇(水相7％)配成恩諾沙星(水相20％)混懸液作為水相；將鯨臘醇(油相5％)和蜂臘(油相1％)溶于7#或15#白油后加入司盤-80(油相8％)，加熱溶解后，121℃，30min滅菌，冷卻至室溫，將水相緩慢加入油相(水相∶油相＝1∶1)，邊加邊攪拌，然后將混合好的水相和油相轉(zhuǎn)移至膠體磨充分乳化，直到乳劑經(jīng)6000r/m，10min離心不分層即可。
復(fù)方恩諾沙星乳劑的安全性評價 為了評價復(fù)方恩諾沙星乳劑的安全性，為獸醫(yī)臨床提供安全的用藥方案。采用動物藥物安全性評價試驗的方法對不同種動物進行了急性毒性試驗、熱原試驗、溶血性試驗、過敏性試驗以及肌肉刺激試驗。結(jié)果表明復(fù)方恩諾沙星乳劑最大耐受量為3021.5mg/kg，相當(dāng)于臨床推薦用量(2.5mg/kg)的1208.8倍，為復(fù)方恩諾沙星溶液LD50的(LD50為1163.58mg/kg，LD5095％可信限為995.37-1213.25mg/kg)3.12倍，無熱源性、溶血性和過敏性，無肌肉刺激反應(yīng)。因此，復(fù)方環(huán)丙沙星乳劑在獸醫(yī)臨床應(yīng)用安全。
1材料和方法 1.1試驗材料 1.1.1藥品與試劑 5％復(fù)方恩諾沙星乳劑(本實驗室和湖南省獸藥工程技術(shù)研究中心共同研制，批號090622，每1ml含50mg乳酸恩諾沙星，10mg乳酸甲氧芐啶)，5％復(fù)方恩諾沙星注射液(本實驗自制，批號090718，每1ml含50mg乳酸恩諾沙星，10mg乳酸甲氧芐啶)，乳酸恩諾沙星原粉(98.3％)、乳酸甲氧芐啶原粉(99.1％)(均由湖南農(nóng)大動物藥業(yè)公司提供)，氯化鈉注射液(0.9％，批號B080412，四川科倫股份有限公司)，滅菌蒸餾水 1.1.2主要儀器 超凈工作臺(SW-CJ-2FD型，蘇州凈化設(shè)備公司)，電子溫度計()電熱恒溫水溫箱(上海醫(yī)療器械七廠)，恒溫恒濕培養(yǎng)箱(LRH-250-S，廣東省醫(yī)療器械廠)，離心機(Z323K型，德國Hermle)，電子天平(AY220型，日本Electronic Balance)，電熱鼓風(fēng)干燥箱(DHG-9240A型，上海精宏試驗設(shè)備有限公司)，全自動立式電熱壓力蒸汽滅菌器(YXQ-LS-50S II，上海博迅公司醫(yī)療設(shè)備廠)，可調(diào)電爐(長沙市遠(yuǎn)東電爐廠)，移液器，燒杯，量筒，培養(yǎng)皿，試管，試管架。
1.1.3實驗動物 健康昆明系小鼠120只，體重18～22g，雌雄各半；健康家兔12只，體重2.5kg左右；豚鼠6只，體重250～350g之間，雌雄各半。所有實驗動物和飼料均由中南大學(xué)實驗動物中心提供。
1.2方法 1.2.1急性毒性試驗 1.2.1.1注射液急性毒性試驗預(yù)實驗 根據(jù)參考文獻中恩諾沙星的半數(shù)致死量的報道，將50只小鼠隨機平均分成5組，雌雄各半，分別按500，750，1000，1250mg/kg和1500mg/kg的劑量于小白鼠腹腔一次性注射給藥，連續(xù)觀察其死亡情況，反復(fù)試驗摸索出Pm＝100％的劑量(Dm)和Pn＝0的劑量(Dn)，確定組數(shù)(n)以及各組劑量公比(r)。
1.2.1.2注射液急性毒性試驗正式實驗 根據(jù)預(yù)實驗的結(jié)果，將60只小鼠平均分成6組，分別按1333.3，1155.7，1000.6，866.3，750mg/kg和0.5ml/kg氯化鈉注射液對照組于小鼠腹腔一次性注射給藥；與七天內(nèi)觀察給藥后小鼠的毒性反應(yīng)，記錄死亡數(shù)。重點記錄飲食、精神活動及死亡情況，對死亡小鼠及時進行剖檢，肉眼觀察各組織、器官的病理變化，用改良寇氏法計算LD50及LD50的95％平均可置信區(qū)間。
1.2.1.3乳劑的急性毒性試驗 在預(yù)試驗中，發(fā)現(xiàn)復(fù)方恩諾沙星乳劑以極限容量1mL/只(含量50mg/ml，為臨床用量的555.6倍)腹腔注射后，小鼠無死亡，不能進行LD50值的測定，因此進行最大耐受量實驗。在多次預(yù)試驗基礎(chǔ)上，取小白鼠20只，雌雄各半，隨機分為兩組，一組注射復(fù)方恩諾沙星注射液，劑量為995.4mg/kg.bw，腹腔注射0.7mL，另一組按3021.5mg/kg.bw給小白鼠腹腔注射復(fù)方恩諾沙星乳劑(相當(dāng)于恩諾沙星臨床用量的1166.7倍)分3次在24h內(nèi)給藥完畢(受制備方法的影響，無法得到高濃度且穩(wěn)定的復(fù)方環(huán)丙沙星乳劑，所以分多次給藥以達到所需劑量)。給藥后，觀察并記錄7d內(nèi)動物外觀體征、飲食欲、行為活動、大小便、中樞神經(jīng)系統(tǒng)癥狀及死亡動物數(shù)。如有動物死亡，及時尸檢，肉眼觀察，如有病變組織則進行切片鏡檢。
1.2.2熱源試驗 挑選健康無傷家兔8只，體重1.7-3.0kg，雌兔應(yīng)無孕，試驗前在實驗室內(nèi)觀察1周，體重應(yīng)不減輕，精神、食欲、排泄等不得有異?，F(xiàn)象。將家兔在17℃-28℃室溫條件下飼養(yǎng)3天，給藥前用電子溫度計進入直腸(6cm)測定直腸溫度4次(1h/次)，每次體溫均在38.0-39.6℃之間。挑選符合要求的家兔3只，測定正常體溫后15min內(nèi)，將復(fù)方恩諾沙星乳劑溫?zé)嶂?8℃，按0.5mg/kg體重大腿肌肉注射，然后進行1h/次測溫，共測4次，每次1.5min。
1.2.3體外溶血性試驗 1.2.3.12％紅細(xì)胞混懸液的制備 健康家兔1只，自心臟采新鮮血液20mL，置三角燒瓶中，用竹簽反復(fù)攪拌以除去纖維蛋白，再用生理鹽水沖洗3～5次，每次加生理鹽水10ml混勻后2000r/min離心10min，去除上清液，再加入生理鹽水混勻離心，反復(fù)洗4～5次，至上清液為無色透明方可用于實驗。將所得紅細(xì)胞按其容積，用生理鹽水稀釋成2％的混懸液。
1.2.3.2溶血試驗 取試管7支并編號，按表1中依次加入各種溶液，第6管不加供試品溶液，作為空白對照管；第7管仍不加供試品溶液，用蒸餾水代替生理鹽水，作為完全溶血的對照。輕輕搖勻各試管并置于37℃水浴保溫，2h取出后對照表2判斷標(biāo)準(zhǔn)并記錄結(jié)果。
表1溶血試驗操作表(單位ml) Table 1
注試管7用蒸餾水代替生理鹽水 表2溶血性實驗結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn) Table 2 Standard of haemolytic test

結(jié)果判斷一般認(rèn)為，2h后凡第3管或第3管以前的各管出現(xiàn)溶血、部分溶血或出現(xiàn)凝集反應(yīng)的制劑，不宜做靜脈注射用；以0.3mL注射液(第三管)在2 h內(nèi)不發(fā)生溶血作用者認(rèn)為可供注射用。
1.2.4刺激性試驗[11-12] 1.2.4.1肌肉刺激性試驗 取體重2～3kg健康家兔6只，分三組，每組雌雄各半。第一組左側(cè)股四頭肌注射0.5ml/kg的復(fù)方恩諾沙星乳劑，右側(cè)注射0.5ml/kg生理鹽水；第二組均于同樣部位注射0.5ml/kg的生理鹽水，進針角度以為30°～45°為準(zhǔn)；第三組為空白對照組。48h后家兔應(yīng)健康如常。放血致死家兔，解剖取出股四頭肌，縱向切開觀察注射部位跟對照組比較有無明顯病理變化。肌肉刺激反應(yīng)評分標(biāo)準(zhǔn)見表3。
表3注射樣品對肌肉刺激反應(yīng)評分標(biāo)準(zhǔn) Table 3 Standard of stimulus response of injection samples on muscle
凡2只家兔的平均反應(yīng)級數(shù)在2以下的可供肌肉注射之用；平均反應(yīng)超過3的不能供肌肉注射之用；平均反應(yīng)級數(shù)在2～3之間的可進行復(fù)試或結(jié)合其他項目考慮其臨床試用問題。凡刺激性試驗不能達到肌肉注射要求的制劑一般也不宜供皮下注射或黏膜面給藥和創(chuàng)面給藥。
1.2.4.2腹腔刺激性試驗 取昆明系小鼠20只，平均體重18～22克，雌雄各半，設(shè)置兩組。一組腹腔注射復(fù)方恩諾沙星乳劑0.5ml/只g；另一組腹腔注射同劑量的滅菌生理鹽水。注射后觀察小鼠活動情況，若有扭體反應(yīng)為有刺激性，無扭體反應(yīng)為無刺激性。
1.2.5過敏性試驗 取豚鼠6只，體重250～350g，雌雄各半，隔天肌肉注射復(fù)方恩諾沙星乳劑0.5ml/只，連續(xù)三次。將豚鼠平均分成兩組。第一組在首次注射后的第14天由腹腔注射乳劑3ml/只進行攻擊，并觀察注射后豚鼠有無用爪搔鼻、噴嚏、豎毛、抽搐、呼吸困難、大小便失禁、休克和死亡等現(xiàn)象。第二組于首次注射后的第21天同樣方法操作，并觀察動物反應(yīng)。過敏反應(yīng)登記表見表4。
表4豚鼠過敏反應(yīng)級數(shù) Table 4
如果兩組豚鼠均為出現(xiàn)明顯過敏反應(yīng)，可認(rèn)為該供試品反應(yīng)試驗陰性；如果有反應(yīng)可按表4的標(biāo)準(zhǔn)分級，從而判斷是否合格。反應(yīng)等級數(shù)達2級以上(包括2級)時，可認(rèn)為該供試品過敏反應(yīng)試驗陽性。
2結(jié)果 2.1急性毒性試驗結(jié)果 2.1.1復(fù)方恩諾沙星注射液急性毒性預(yù)試驗結(jié)果 經(jīng)過反復(fù)摸索從而確定復(fù)方恩諾沙星注射液Pm＝100％的劑量為(Dm)為1333.3mg/kg和Pn＝0的劑量(Dn)為750mg/kg，分為5組，各組劑量公比(r)為1.155。則D5＝1333.3mg/kg，D4＝1155.7mg/kg，D3＝1000.6mg/kg，D2＝866.3mg/kg D1＝750mg/kg。
2.1.2復(fù)方恩諾沙星注射液急性毒性正式試驗結(jié)果 按預(yù)實驗結(jié)果各劑量組給藥后，小鼠逐漸出現(xiàn)活動減少，被毛逆亂，對外界刺激反應(yīng)遲鈍，有的俯臥不動，呼吸困難，腹式呼吸明顯，糞便變軟等中毒癥狀。高劑量組少數(shù)動物后肢癱瘓，并于5h內(nèi)出現(xiàn)死亡。對死亡動物剖檢，藥物吸收完全，注射部位無異常，高劑量組動物肝臟有黑色小斑點，未發(fā)現(xiàn)其他病理變化。復(fù)方環(huán)丙沙星注射液急性毒性實驗結(jié)果見表5。
表5 復(fù)方恩諾沙星注射液急性毒性實驗結(jié)果 Table 5 Results of acute toxicity of
根據(jù)上表顯示的動物用藥劑量以及死亡數(shù)量的實驗數(shù)據(jù)，按改良寇氏法計算半數(shù)致死量，求得LD50為1058.93mg/kg，LD5095％可信限為981.26-1136.54mg/kg?？瞻讓φ战M無死亡情況，生長正常。
2.1.3復(fù)方恩諾沙星乳劑最大耐受性試驗 以995.4mg/kg.bw劑量注射復(fù)方恩諾沙星注射劑的小鼠，有9只小鼠立即出現(xiàn)精神委靡，肌肉震顫直至抽搐，7d內(nèi)小鼠死亡4只。以3021.5mg/kg.bw劑量注射的小鼠在給藥后7d內(nèi)，未見有小鼠死亡，但有15％以上的小鼠在最后一次注射后，產(chǎn)生行走減少、嗜睡的癥狀，2-3h后恢復(fù)正常。可知復(fù)方恩諾沙星乳劑對小鼠的最大耐受量大于3021.5mg/kg.bw，此量相當(dāng)于臨床用量的1208.8倍。結(jié)果表明復(fù)方恩諾沙星乳劑的毒性顯著低于復(fù)方恩諾沙星注射液。
2.2熱源性試驗結(jié)果 經(jīng)試驗的3只家兔的體溫數(shù)據(jù)見表6 表6熱源性試驗體溫結(jié)果(℃) Table 5
每只家兔體溫升高均小于0.5℃，并且3只家兔體溫升高總和(1.0℃)，小于1.4℃，符合《中華人民共和國藥典》[10]規(guī)定。從而確定復(fù)方恩諾沙星乳劑無熱源反應(yīng)。
2.3體外溶血試驗結(jié)果 復(fù)方恩諾沙星乳劑體外溶血性試驗結(jié)果見表7 表7復(fù)方恩諾沙星乳劑溶血試驗結(jié)果(單位ml) Table 7 hemolytic test result
注“-”為不溶血； “+”為溶血 試驗結(jié)果表明復(fù)方恩諾沙星乳劑無溶血現(xiàn)象。
2.4刺激試驗結(jié)果 2.4.1肌肉刺激性試驗結(jié)果 試驗動物中乳劑注射部位同生理鹽水對照組相比肌肉組織無任何差異，組織病理學(xué)檢查，肌纖維未見充血、水腫、炎細(xì)胞浸潤等，肌肉刺激反應(yīng)為0級。
2.4.2腹腔刺激性試驗結(jié)果 受試動物經(jīng)乳劑和生理鹽水對照組腹腔注射后，無扭體等異常刺激反應(yīng)，判定復(fù)方恩諾沙星乳劑為無腹腔刺激性反應(yīng)。
2.5過敏性試驗結(jié)果 兩組豚鼠在經(jīng)過腹腔注射后均無明顯反應(yīng)，根據(jù)判定標(biāo)準(zhǔn)[12]得出復(fù)方恩諾沙星乳劑過敏性試驗為0級，無過敏性反應(yīng)。
復(fù)方恩諾沙星乳劑的研制及體外抑菌實驗 為了充分發(fā)揮恩諾沙星在獸醫(yī)臨床上的效果，克服其半衰期短和連續(xù)用藥導(dǎo)致的不良反應(yīng)，研制了一種復(fù)方恩諾沙星乳劑。采用油乳劑滅活疫苗抗原緩釋技術(shù)與藥物乳劑制備技術(shù)相結(jié)合，將恩諾沙星和乳酸TMP按4∶1比例制備成一種油乳劑，并對其性狀及穩(wěn)定性進行研究。用復(fù)方恩諾沙星注射液作為對照，進行了該乳劑對五種細(xì)菌(大腸桿菌、巴氏桿菌、沙門氏菌、金黃葡萄球菌和鏈球菌)的體外抑菌試驗。結(jié)果表明復(fù)方恩諾沙星乳劑為淡黃色、油乳狀，pH值為6.3～6.6，顆粒平均大小為7.6μm，穩(wěn)定性良好；復(fù)方恩諾沙星乳劑對五種細(xì)菌的MIC值和MBC值顯著強于復(fù)方恩諾沙星注射液(P＜0.01)。
1材料與方法 1.1實驗試劑與儀器 乳酸恩諾沙星原粉(98.3％)、乳酸甲氧芐啶原粉(乳酸TMP，99.1％)(均由湖南農(nóng)大動物藥業(yè)公司提供)，7#白油(北京石油化工科學(xué)研究院)，span-80、tween-80(批號F20080723、F20080213國藥集團化學(xué)試劑有限公司)，硬脂酸鋁(批號080728天津市申泰化學(xué)試劑有限公司)，5％復(fù)方環(huán)丙沙星注射液(本實驗室自制，批號090718，每1ml含50mg乳酸環(huán)丙沙星，10mg乳酸甲氧芐啶)，膠體磨(JM-L50型，鄭州玉祥機械設(shè)備有限公司)，全自動立式電熱壓力蒸汽滅菌器(YXQ-LS-50S II，上海博迅公司醫(yī)療設(shè)備廠)，超凈工作臺(SW-CJ-2FD型，蘇州凈化設(shè)備公司)，恒溫恒濕培養(yǎng)箱(LRH-250-S，廣東省醫(yī)療器械廠)，冷凍離心機(Z323K型，德國Hermle)，電子天平(AY220型，日本Electronic Balance)，光學(xué)顯微鏡(Nikon Eclipse E200日本)，便攜式pH計(PHB-1型，杭州科盛機電設(shè)備有限公司)。
1.2試驗菌種及培養(yǎng)基 大腸埃希氏菌(C83901)、多殺性巴氏桿菌(Kober-6)、鼠傷寒沙門氏菌(C77-31)、金黃色葡萄球菌(C56023)、豬獸疫鏈球菌(C55138)均購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，營養(yǎng)瓊脂(批號20090215北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司)，普通肉湯培養(yǎng)基。
1.3體外抑菌試驗 1.3.1菌液制備及細(xì)菌計數(shù) 將保存的大腸桿菌、巴氏桿菌、沙門氏菌、金黃葡萄球菌及鏈球菌菌種接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中活化(其中鏈球菌需加5％新生牛血清)，37℃恒溫箱中培養(yǎng)18h。
采用試管10倍稀釋法將每種活化的菌液在試管中依次進行10倍稀釋，然后對第4、5、6、7管平皿菌落計數(shù)，平行三次求平均值。
1.3.2最低抑菌濃度(MIC)的測定 采用試管液體二倍稀釋法測定將藥液(復(fù)方恩諾沙星乳劑和復(fù)方環(huán)丙沙星注射液)試管進行二倍稀釋至第24管，每管加入菌液使其濃度為105cfu/mL，同時平行進行前23管陰性和第24管陽性對照。以目測法與對照組比較法判斷結(jié)果，以完全無細(xì)菌生長的最低藥物濃度作為細(xì)菌對該藥物的敏感度，即為該藥物最低抑菌濃度(MIC)。相同過程重復(fù)3次，求平均值。
1.3.3最小殺菌濃度(MBC)的測定 采用平皿菌落計數(shù)法將藥物組無菌生長的試管中的混合液分別取0.1mL接種于平皿瓊脂培養(yǎng)基上，每個做三個重復(fù)，置37℃恒溫箱中培養(yǎng)18h，菌落計數(shù)，低于5個的平皿所對應(yīng)的藥物濃度為該藥物的殺菌濃度，求平均值，濃度最低者即為該藥物的最小殺菌濃度(MBC)。
2結(jié)果與分析 2.1體外抑菌試驗結(jié)果 復(fù)方恩諾沙星乳劑和注射液對五種不同細(xì)菌的最低抑菌濃度(MIC)和最低殺菌濃度(MBC)見表1和表2。
表1復(fù)方恩諾沙星乳劑和注射液對五種不同細(xì)菌的平均MIC值(μg/ml) Table 2 The average MIC values of the Emulsion and Injection of CompoundCiprofloxacin for five different kinds of bacteria(μ g/ml)
表2復(fù)方恩諾沙星乳劑和注射液對五種不同細(xì)菌的平均MBC值(μg/ml) Table 3 The average MBC values of the Emulsion and Injection of CompoundCiprofloxacin for five different kinds of bacteria(μg/ml)
將上述實驗數(shù)據(jù)通過SAS8.1和EXCEL2003進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計及方差分析，結(jié)果表明復(fù)方恩諾沙星乳劑對五種細(xì)菌的最低抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC)均明顯優(yōu)于復(fù)方恩諾沙星注射液(P＜0.01)。
2.2體外抑菌試驗結(jié)果分析 由表2和表3可知，復(fù)方恩諾沙星乳劑和復(fù)方恩諾沙星注射液對五種菌都表現(xiàn)了較強的體外抑菌效果，說明復(fù)方恩諾沙星為廣譜、強效抗菌藥，此結(jié)果與文獻表述一致；兩種劑型對五種細(xì)菌中的大腸桿菌效果較為顯著，特別是乳劑對其MIC值達到了0.00976μg/ml，對巴氏桿菌和沙門氏菌的抑菌效果也非常明顯，說明了恩諾沙星對革蘭氏陰性菌是一類很強的氟喹諾酮類藥物；恩諾沙星注射液對大腸桿菌和金黃葡萄球菌的MIC值均為0.06μg/ml，說明復(fù)方恩諾沙星乳劑和注射劑均有較強的抑菌能力。統(tǒng)計結(jié)果顯示復(fù)方恩諾沙星乳劑對五種細(xì)菌的MIC和MBC明顯強于復(fù)方恩諾沙星注射液(P＜0.01)，說明復(fù)方恩諾沙星通過劑型的改變其體外抑菌效果發(fā)生了顯著的提升。
權(quán)利要求
1.一種長效抗菌藥物油乳劑，其特征在于，所述的長效抗菌藥物劑型，包括含有抗菌藥物的水相、油相、乳化劑及穩(wěn)定劑，油相采用的是7#或15#白油；其中水相乳化劑為吐溫-80，油相乳化劑為司盤-80；所述水相被油包覆分散于油相中。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種長效抗菌藥物油乳劑，其特征在于，穩(wěn)定劑包括水相穩(wěn)定劑和油相穩(wěn)定劑，水相穩(wěn)定劑選自羧甲基纖維素和丙三醇兩種。油相的穩(wěn)定劑選自鯨蠟醇和蜂蠟兩種。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種長效抗菌藥物油乳劑，其特征在于，本發(fā)明的吐溫-80在水相中添加的重量含量為6-10％。司盤-80在油相中添加的重量含量為5-12％。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種長效抗菌藥物油乳劑，其特征在于，水相穩(wěn)定劑在水相中添加的重量含量為4-8％。油相穩(wěn)定劑在油相中添加的重量含量為1-5％。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種長效抗菌藥物油乳劑，其特征在于，水相與油相優(yōu)選的體積比為1∶1-2。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種長效抗菌藥物油乳劑，其特征在于，
油相采用的是7#或15#白油，司盤-80在油相中的添加量為9-10％，鯨蠟醇1.5-2.5％，蜂蠟1-2％；吐溫-80在水相中的添加量為6.5-8％，羧甲基纖維素2.5-3％，丙三醇3.5-4％，水相中余下的為抗菌藥水溶液；油相與水相的體積比為1∶1。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種長效抗菌藥物油乳劑，其特征在于，所述的含有抗菌藥物的水相中還可將抗菌藥物與抗菌增效劑混合，制成復(fù)方抗菌藥物。
8.權(quán)利要求1所述的一種長效抗菌藥物油乳劑制備方法，其特征在于，包括以下步驟
水相的制備在40-45℃下攪拌加入水相穩(wěn)定劑至水中，使水溶液溫度降至室溫溶解抗菌藥物或復(fù)方抗菌藥物，最后加入吐溫-80并充分?jǐn)嚢枋蛊淙芙庾鳛樗唷?br> 油相的制備將7#或15#白油加熱至65-130℃加入油相穩(wěn)定劑攪拌使其充分溶解后，冷卻至50-60℃加入司盤-80充分?jǐn)嚢枋蛊淙咳芙庾鳛橛拖唷?
最后將水相、油相混合乳化、滅菌。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的一種長效抗菌藥物油乳劑制備方法，其特征在于，所述的乳化是將油相與水相緩慢混合，邊混合邊攪拌；混勻后用膠體磨充分乳化，直到油乳劑經(jīng)11000-13000r/min離心不分層為乳化完全。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的一種長效抗菌藥物油乳劑制備方法，其特征在于，油相和水相制備過程為
水相的制備將丙三醇溶解于注射用水，然后加熱至40-45℃邊攪拌邊加入羧甲基纖維素，使該溶液溫度降至室溫溶解抗菌藥物或復(fù)方抗菌藥物，最后加入吐溫-80并充分?jǐn)嚢枋蛊淙芙庾鳛樗唷?br> 油相的制備將白油加熱至65-70℃加入蜂蠟攪拌使其充分溶解后，繼續(xù)加熱至120-130℃溶解鯨蠟醇，冷卻至50-60℃加入司盤-80充分?jǐn)嚢枋蛊淙咳芙庾鳛橛拖唷?br> 全文摘要
一種長效抗菌藥物油乳劑，為長效抗菌藥物劑型，包括含有抗菌藥物的水相、油相、乳化劑及穩(wěn)定劑，油相采用的是7#或15#白油；其中水相乳化劑為吐溫-80，油相乳化劑為司盤-80；所述水相被油包覆分散于油相中。該劑型可充分緩釋抗菌藥活性成分的抗菌作用、節(jié)省養(yǎng)殖成本、減少環(huán)境污染等，可適用于與各種水溶性或油溶性抗菌藥的活性成分的配制。在藥物預(yù)防和治療疾病方面為健康養(yǎng)殖提供相應(yīng)的技術(shù)保障。
文檔編號A61K47/38GK101766569SQ20101011339
公開日2010年7月7日 申請日期2010年2月24日 優(yōu)先權(quán)日2010年2月24日
發(fā)明者董偉, 李孝文, 孫志良 申請人:湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)