專(zhuān)利名稱(chēng)：治療流行性感冒的組合物和方法
治療流行性感冒的組合物和方法相關(guān)申請(qǐng)案本申請(qǐng)案主張于2008年6月19日申請(qǐng)的PCT專(zhuān)利申請(qǐng)案第PCT/US08/67471號(hào) 和于2009年5月四日申請(qǐng)的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)案第61/1擬614號(hào)的優(yōu)先權(quán)和權(quán)利。所述優(yōu)先 權(quán)申請(qǐng)案的內(nèi)容以全文引用的方式并入本文中。
背景技術(shù)：
流行性感冒是一種常見(jiàn)的呼吸系統(tǒng)傳染性疾病，其與正粘病毒科 (Orthomyxoviridae)家族病毒相關(guān)聯(lián)。由于此病毒具有高度變異性，所以通常每年都需要 用考慮到病毒株變異并經(jīng)重新調(diào)配的疫苗接種。美國(guó)(the United States)每年所研制的 疫苗組合物都由食品與藥物管理局疫苗和相關(guān)生物制劑咨詢委員會(huì)部門(mén)(the Department of Food and Drug Administration Vaccines and the Related Biologicals Advisory Committee)確定。世界衛(wèi)生組織(World Health Organization, WHO)也類(lèi)似地運(yùn)用一 個(gè)全球?qū)嶒?yàn)室監(jiān)測(cè)網(wǎng)絡(luò)來(lái)檢測(cè)新的流行性感冒變異體，例如參見(jiàn)拉旺希(Lavanchy)，疫苗 (Vaccine) 17 :S24 (1999)。進(jìn)行選擇的基礎(chǔ)是近來(lái)分離的流行性感冒病毒的抗原分析、抗原 變異體的傳播模式、和近來(lái)接種的個(gè)體的抗體反應(yīng)。A和B型流行性感冒是引起流行性人類(lèi)疾病的兩種類(lèi)型流行性感冒病毒。A型流 行性感冒病毒基于以下兩種表面抗原進(jìn)一步分成亞型血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(N)。B 型流行性感冒病毒未分成亞型。從1977年以來(lái)，A型(HlNl)流行性感冒病毒、A型(H3N2) 流行性感冒病毒和B型流行性感冒病毒已在全球范圍內(nèi)進(jìn)行傳播。對(duì)于處于由流行性感冒 感染所引起的嚴(yán)重疾病和相關(guān)并發(fā)癥的高風(fēng)險(xiǎn)中的個(gè)體來(lái)說(shuō)，接種公認(rèn)是預(yù)防或削弱流行 性感冒的單一最有效方式。接種由滅活流行性感冒病毒制備的抗原可刺激特異性抗體的產(chǎn) 生。但僅僅預(yù)防的是那些制成疫苗的病毒株或密切相關(guān)的病毒株。每年的疫苗都含有三種病毒株(通常為兩種A型和一種B型)，這三種病毒株代表 著認(rèn)為在即將到來(lái)的冬天可能傳播的流行性感冒病毒。當(dāng)前和出現(xiàn)的流行性感冒病毒株的 抗原特征為選擇每年的疫苗內(nèi)所包括的病毒株提供基礎(chǔ)。WHO每年都檢查世界流行病學(xué)情 況，且必要時(shí)會(huì)基于當(dāng)前的流行病學(xué)證據(jù)，提出新的病毒株。盡管重新構(gòu)成，但疫苗不可能包括世界上在特定季節(jié)期間主動(dòng)感染個(gè)體的所有 不同病毒株。另外，調(diào)配和制備足量的疫苗劑量以應(yīng)對(duì)流感感染的季節(jié)性增加也需要花 費(fèi)相對(duì)較長(zhǎng)的時(shí)間。通常制備一種疫苗要花費(fèi)6個(gè)月以上。因此，新的或忽略的流行性 感冒病毒株可在這6個(gè)月時(shí)間內(nèi)突顯，引發(fā)一場(chǎng)流行病。2009年4月，首次檢測(cè)到新的豬 源性A(HlNl)型流行性感冒病毒。相較于先前所述的Hmi亞型，其為四重基因重配病毒 (quadruple reassortant)。病毒開(kāi)始是爆發(fā)于墨西哥(Mexico)，但此流行病穿過(guò)邊界迅速 席卷美國(guó)和加拿大(Canada)，目前幾乎所有國(guó)際上的國(guó)家都報(bào)道有新的病例。所屬領(lǐng)域中 對(duì)治療流行性感冒的改良組合物和方法仍然存在需要。明確地說(shuō)，需要針對(duì)WHO所提出的 季節(jié)性流行性感冒病毒株和新出現(xiàn)的大流行性感冒病毒株(例如新的豬源性A(HlNl)型流 行性感冒病毒)具有廣泛免疫原性的組合物。

發(fā)明內(nèi)容
本申請(qǐng)案提供可用于治療流行性感冒的組合物和方法。如本文所述，所述組合物 和方法是基于對(duì)流行性感冒顯示免疫原性的肽和肽組合的研制。在一些實(shí)施例中，肽組合誘發(fā)針對(duì)多個(gè)流行性感冒病毒株，例如季節(jié)性流行性感 冒病毒株或甚至新的豬源性A(HlNl)型大流行性感冒病毒的保護(hù)性反應(yīng)。在一些實(shí)施例中，組合物不經(jīng)腸投予(例如通過(guò)肌肉內(nèi)注射)。在一些實(shí)施例中， 不經(jīng)腸組合物包括包含非離子型表面活性劑的微脂粒(vesicle)。在一些實(shí)施例中，不經(jīng) 腸組合物包括TLR-4激動(dòng)劑佐劑。在一些實(shí)施例中，不經(jīng)腸組合物中所存在的至少一部分 TLR-4激動(dòng)劑佐劑與微脂粒物理締合。雖然目前流行性感冒疫苗局限于上述不經(jīng)腸投藥途徑(例如肌肉內(nèi)注射)，但我 們已經(jīng)鑒別出經(jīng)口投予時(shí)誘發(fā)保護(hù)性反應(yīng)的組合物。因此，在一些實(shí)施例中，組合物經(jīng)口投 予。在一些實(shí)施例中，口服組合物包括膽汁鹽體(bilosome)。在一些實(shí)施例中，口服組合物 包括TLR-3激動(dòng)劑佐劑。在一些實(shí)施例中，口服組合物中所存在的至少一部分TLR-3激動(dòng) 劑佐劑與膽汁鹽體物理締合。


圖IA-B展示如競(jìng)爭(zhēng)微量中和分析所檢測(cè)，示范性肽組合物的特異性。稀釋人類(lèi)血 清，并與所選肽組合物一起培育，隨后與流行性感冒病毒一起培育。培育后，加入MDCK(馬 丁-達(dá)比狗腎(Madin-Darby Canine Kidney))細(xì)胞，且培養(yǎng)板在18-22個(gè)小時(shí)后顯影。 (A)使用人類(lèi)血清，檢測(cè)針對(duì)新喀里多尼亞流行性感冒(influenza New Caledonia) (A/ NC/20/99)的競(jìng)爭(zhēng)微量中和。(B)使用人類(lèi)血清，檢測(cè)針對(duì)威斯康星流行性感冒(influenza Wisconsin) (A/ffis/67/05)的競(jìng)爭(zhēng)微量中和。圖2展示如IFN γ-ELISP0T分析所檢測(cè)，由示范性肽組合物所引發(fā)的細(xì)胞介導(dǎo)的 免疫反應(yīng)，表示為每百萬(wàn)個(gè)細(xì)胞的斑點(diǎn)形成細(xì)胞(SFC)。在所選肽存在下培養(yǎng)流行性感冒
接種個(gè)體的周?chē)簡(jiǎn)魏思?xì)胞(PBMC)。2天后，培養(yǎng)板顯影，且放大并計(jì)數(shù)每孔中的斑點(diǎn)數(shù)目。圖3展示相較于未接種的對(duì)照動(dòng)物，接種肽組合物INF-61P的動(dòng)物中用IX IO6個(gè) 空斑形成單位(Pfu)的H3N2(A/威斯康星/200 病毒激發(fā)后10天時(shí)間內(nèi)的中值日發(fā)熱計(jì) 數(shù)。發(fā)熱計(jì)數(shù)定義為動(dòng)物每分鐘的體溫為40°C或40°C以上；每3小時(shí)計(jì)算每組4只動(dòng)物的 中值發(fā)熱計(jì)數(shù)。對(duì)照和接種動(dòng)物具有類(lèi)似的起始體溫(參見(jiàn)第0天)。圖4展示相較于未接種的對(duì)照動(dòng)物，接種肽組合物INF-61P的動(dòng)物中用IX IO6個(gè) Pfu的H3N2(A/威斯康星/200 病毒激發(fā)后10天時(shí)間內(nèi)的重量損失。圖5展示在經(jīng)肽組合物INF-61P免疫的雪貂的直腸洗液(上圖)和鼻洗液樣品 (下圖)中可見(jiàn)的針對(duì)流行性感冒病毒的粘膜IgA反應(yīng)(流感靈(FLUVIRAL))。資料表示 為每只動(dòng)物中相對(duì)于接種前反應(yīng)的增加倍數(shù)，且相對(duì)于不同樣品中所存在的IgA總量標(biāo)準(zhǔn) 化。還提供用市售流行性感冒疫苗(流感靈)獲得的比較資料。圖6展示在經(jīng)肽組合物SFV2免疫的雪貂血清中可見(jiàn)的針對(duì)B型流行性感冒(俄 亥俄州(Ohio))的重組HA蛋白質(zhì)的血清IgA反應(yīng)。成對(duì)的左列和右列分別展示每只動(dòng)物
13接種前和接種后血清樣品中通過(guò)ELISA所測(cè)得的反應(yīng)(報(bào)道為光學(xué)密度)。在動(dòng)物4850號(hào) 和4860號(hào)中可以看到強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng)。圖7展示以脂質(zhì)化肽組合物INF-09L-A誘發(fā)的廣泛反應(yīng)性細(xì)胞(CTL)免疫。用組 合物接種成年(> 12個(gè)月)HLA(A*0201)轉(zhuǎn)基因小鼠三次，此組合物靶向A型流行性感冒的 核蛋白中的可變區(qū)。組合物還包括明礬(alum)佐劑。對(duì)照組僅僅接收佐劑。用多個(gè)亞型 的不同流行性感冒病毒株來(lái)感染脾細(xì)胞H3N2(A/HK/1/18、A/維多利亞(Victoria)/3/75) 和Hmi (A/NC/20/99、A/PR/8/34)。斑點(diǎn)表示對(duì)各病毒株具有特異性的IFN γ分泌T細(xì)胞 的頻率，且誤差線表示每組小鼠中的標(biāo)準(zhǔn)偏差(n = 3)。結(jié)果從左至右如下呈現(xiàn)Η3Ν2(Α/ ΗΚ/1/18)、Η3Ν2 (A/ 維多利亞 /3/75)和 Hmi (A/NC/20/99)和 Hmi (A/PR/8/34)。圖8展示在有或者沒(méi)有TLR-3激動(dòng)劑佐劑(poly I:C)下對(duì)經(jīng)口投予的肽組合物 的免疫反應(yīng)。小鼠(每組η = 4)經(jīng)口免疫4次(第0、3、14和17天)。接種后收獲脾細(xì) 胞，并在活體外用相同肽組合物刺激。使用IFN γ ELISP0T分析測(cè)量反應(yīng)。如圖8中所示， 接收佐劑的動(dòng)物反應(yīng)比接收單獨(dú)疫苗的動(dòng)物反應(yīng)大得多。圖 9 展示 SEQ ID NO 16、17 禾口 18 的序列。圖10Α-Β展示針對(duì)A型流行性感冒以下亞型的重組血凝素(rHA)蛋白質(zhì)的血清 IgG反應(yīng)(通過(guò)ELISA來(lái)測(cè)量):(A/所羅門(mén)島(Solomon Island)/03/06) Hmi或(A/威斯 康星/67/05) H3N2，在經(jīng)肌肉內(nèi)投予的肽組合物SFV2免疫的雪貂中測(cè)量。免疫后血清顯示， 對(duì)于經(jīng)肌肉內(nèi)投予的肽組合物SFV2免疫的雪貂，ELISA中對(duì)rHA所羅門(mén)㈧與威斯康星⑶ 的免疫反應(yīng)均為顯著的。未檢測(cè)到針對(duì)B型流行性感冒(B/馬來(lái)西亞(Malaysia)/2506/04) 的rHA的IgG反應(yīng)(資料未示)。還提供用市售流行性感冒疫苗(凡爾靈(VAXIGRIP))獲 得的比較資料。圖11展示經(jīng)肌肉內(nèi)投予的肽組合物SFV2免疫，接著經(jīng)受病毒激發(fā)的雪貂鼻洗液 的病毒載量。用免疫原性肽組合物SFV2接種動(dòng)物，且用2 X IO5個(gè)pfu Hmi (A/所羅門(mén)島 /03/06)激發(fā)，并在病毒血癥最高峰(第2天)時(shí)通過(guò)空斑分析來(lái)測(cè)量鼻洗液樣品的病毒載 量。各符號(hào)表示個(gè)別動(dòng)物中所測(cè)得的病毒載量。還提供用市售流行性感冒疫苗(凡爾靈) 獲得的比較資料。圖12展示經(jīng)肌肉內(nèi)投予的肽組合物SFV2免疫的雪貂中針對(duì)潛在大流行性感冒病 毒株的體液免疫。在接種兩周后(在病毒激發(fā)前)從動(dòng)物中收集血清，并通過(guò)ELISA來(lái)測(cè) 試樣品與假定大流行性豬(H1N1/加利福尼亞(California)/2009)分離株的重組血凝素 (rHA)蛋白質(zhì)的反應(yīng)性。還提供用市售流行性感冒疫苗(凡爾靈)獲得的比較資料。圖13展示示范性TLR-4激動(dòng)劑佐劑PHAD(來(lái)自亞拉巴馬州(AL)阿拉巴斯特市 (Alabaster)的雅凡蒂極性脂質(zhì)公司(Avanti Polar Lipids, Inc.)的磷酸化己酰二糖)的 化學(xué)結(jié)構(gòu)。圖14展示另一示范性TLR-4激動(dòng)劑佐劑(來(lái)自亞拉巴馬州阿拉巴斯特市的雅凡 蒂極性脂質(zhì)公司)二 [3-脫氧-D-甘露-辛酮糖?；鵠-脂質(zhì)A (銨鹽)的化學(xué)結(jié)構(gòu)。
具體實(shí)施例方式定義整個(gè)本申請(qǐng)案中，采用若干個(gè)如以下段落中所定義的術(shù)語(yǔ)。
如本文所用的術(shù)語(yǔ)“免疫反應(yīng)”是指在動(dòng)物中引起的反應(yīng)。免疫反應(yīng)可指細(xì)胞免 疫、體液免疫或可包含兩者。免疫反應(yīng)也可限于免疫系統(tǒng)的一部分。舉例來(lái)說(shuō)，在一些實(shí)施 例中，免疫原性組合物可誘發(fā)IFNy反應(yīng)增加。在一些實(shí)施例中，免疫原性組合物可誘發(fā)粘 膜IgA反應(yīng)(例如在鼻和/或直腸洗液中測(cè)量)。在一些實(shí)施例中，免疫原性組合物可誘發(fā) 全身性IgG反應(yīng)(例如在血清中測(cè)量)。如本文所用的術(shù)語(yǔ)“免疫原性”意指能夠使在宿主動(dòng)物中對(duì)非宿主實(shí)體(例如流 行性感冒病毒)產(chǎn)生免疫反應(yīng)。在一些實(shí)施例中，此免疫反應(yīng)構(gòu)成由針對(duì)特定傳染性有機(jī) 體(例如流行性感冒病毒)的疫苗引起的保護(hù)性免疫的基礎(chǔ)。如本文所用的術(shù)語(yǔ)“肽”是指一串至少三個(gè)通過(guò)肽鍵連接在一起的氨基酸。一般 說(shuō)來(lái)，肽中氨基酸的數(shù)目沒(méi)有上限。肽一般僅含有天然氨基酸；然而，可包括非天然氨基酸 (即天然不存在，但可并入多肽鏈中的氨基酸)。本發(fā)明肽中的一個(gè)或一個(gè)以上氨基酸也可 以例如通過(guò)添加例如碳水化合物基團(tuán)、磷酸酯基、法呢基、異法呢基、脂肪酸基、用于結(jié)合、 官能化或其它修飾的連接子等化學(xué)實(shí)體來(lái)修飾。在各個(gè)實(shí)施例中，修飾可產(chǎn)生更穩(wěn)定的肽 (例如活體內(nèi)半衰期更長(zhǎng))。合適的修飾可包括環(huán)化肽、并入D-氨基酸等。在各個(gè)實(shí)施例中， 修飾可產(chǎn)生免疫原性更強(qiáng)的肽。合適的修飾可包括共價(jià)連接一個(gè)或一個(gè)以上脂質(zhì)(例如 但不限于軟脂?；⑷舛罐Ⅴ；?、硬脂酰基、月桂酰基、辛?；?、癸酰基等)、融合于載體蛋白 (例如但不限于結(jié)核菌素純蛋白衍生物(purified protein derivative of tuberculin, PPD)、破傷風(fēng)類(lèi)毒素(tetanus toxoid)、霍亂毒素(cholera toxin)和其B亞單位、卵白蛋 白、牛血清白蛋白、大豆胰蛋白酶抑制劑、胞壁酰二肽和其類(lèi)似物、細(xì)胞因子或其片段等)寸。如本文所用的術(shù)語(yǔ)“同源性百分比”是指如本申請(qǐng)案中所定義的最佳比對(duì)后兩 種序列之間的序列一致性百分比。如果在經(jīng)比對(duì)以達(dá)成如下所述的最大對(duì)應(yīng)時(shí)兩種序列 中的氨基酸序列相同，那么可以說(shuō)兩種氨基酸序列“一致”。通常通過(guò)在一個(gè)區(qū)域或“比較 窗”上比較兩種最佳比對(duì)序列的序列以鑒別和比較序列相似性區(qū)域，進(jìn)行兩種氨基酸序列 之間的序列比較。用于比較的序列可以通過(guò)史密斯(Smith)和沃特曼(Waterman)，應(yīng)用 數(shù)學(xué)進(jìn)展(Ad. App. Math.) 2 =482(1981)的局部同源性算法，通過(guò)尼德曼(Neddleman)和 伍茲(Wunsch)，分子生物學(xué)雜志(J. Mol. Biol.) 48 =443(1970)的同源性比對(duì)算法，通過(guò)皮 爾森(Pearson)和李普曼(Lipman)，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊(Proc. Natl. Acad. ki. USA) 85 2444(1988)的相似法探究，通過(guò)這些算法的計(jì)算機(jī)化執(zhí)行或通過(guò)目測(cè)來(lái)進(jìn)行最佳比對(duì)。通過(guò)在比較窗上比較兩個(gè)最佳比對(duì)的序列來(lái)測(cè)定“序列一致性百分比”，其中比較 窗中的部分氨基酸序列可包含相較于參考序列(不包含添加或缺失)的添加或缺失(即間 隙)，以最佳比對(duì)兩個(gè)序列。此百分比如下計(jì)算通過(guò)測(cè)定兩個(gè)序列中相同氨基酸殘基所在 位置的數(shù)目以得到匹配位置的數(shù)目，將匹配位置的數(shù)目除以比較窗中總位置數(shù)并將此結(jié)果 乘以100，得到序列一致性百分比。以上所給出的序列一致性定義是所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員所 使用的定義。定義自身不需要任何算法的幫助。所述算法僅僅是有助于促進(jìn)序列的最佳比 對(duì)，而不是計(jì)算序列一致性。由所述定義可見(jiàn)兩個(gè)比較序列之間只存在明確的一個(gè)序列一 致性值，此值對(duì)應(yīng)于針對(duì)最佳比對(duì)所獲得的值。如本文所用的術(shù)語(yǔ)“治療有效量”是指足以在所治療個(gè)體中展示有意義益處的量。 免疫原性組合物的治療有效量可視例如所需生物學(xué)終點(diǎn)、組合物的性質(zhì)、投藥途徑、所治療個(gè)體的健康、體型和/或年齡等因素而變化。如本文所用的術(shù)語(yǔ)“治療”是指免疫原性組合物投予患有流行性感冒、具有流行性 感冒癥狀或具有發(fā)展成流行性感冒的誘因的個(gè)體，以達(dá)到緩和、減輕、改變、改善、好轉(zhuǎn)或影 響流行性感冒、流行性感冒癥狀或發(fā)展成流行性感冒的誘因的目的。在一些實(shí)施例中，術(shù)語(yǔ) “治療”是指接種個(gè)體。一些實(shí)施例的詳細(xì)描述本申請(qǐng)案提供可用于治療流行性感冒的組合物和方法。如本文所述，所述組合物 和方法是基于對(duì)流行性感冒顯示免疫原性的肽和肽組合的研制。在一些實(shí)施例中，肽組合誘發(fā)針對(duì)多個(gè)流行性感冒病毒株，例如季節(jié)性流行性感 冒病毒株或甚至新的豬源性A(HlNl)型大流行性感冒病毒的保護(hù)性反應(yīng)。在一些實(shí)施例中，組合物不經(jīng)腸投予(例如通過(guò)肌肉內(nèi)注射)。在一些實(shí)施例中， 組合物包括TLR-4激動(dòng)劑佐劑。在一些實(shí)施例中，組合物包括包含非離子型表面活性劑的 微脂粒。在一些實(shí)施例中，組合物中所存在的至少一部分TLR-4激動(dòng)劑佐劑與微脂粒物理
φ π O雖然目前流行性感冒疫苗局限于上述不經(jīng)腸投藥途徑(例如肌肉內(nèi)注射)，但我 們已經(jīng)鑒別出經(jīng)口投予時(shí)誘發(fā)保護(hù)性反應(yīng)的組合物。因此，在一些實(shí)施例中，組合物經(jīng)口投 予。在一些實(shí)施例中，組合物包括TLR-3激動(dòng)劑佐劑。在一些實(shí)施例中，組合物包括膽汁鹽 體。在一些實(shí)施例中，組合物中所存在的至少一部分TLR-3激動(dòng)劑佐劑與膽汁鹽體物理締
口 OI.肽一方面，本申請(qǐng)案提供可單獨(dú)或組合使用，產(chǎn)生用于治療流行性感冒的免疫原性 組合物的肽。應(yīng)了解，任何所述肽都包括在免疫原性組合物中，且本申請(qǐng)案涵蓋包括所述肽 的任何排列或組合的組合物。下文第II部分將描述一些示范性肽組合。A型流行性感冒血凝素(HA)亞型1 (Hl)肽實(shí)例中的表2-6描述來(lái)源于A型流行性感冒血凝素(HA)亞型1 (Hl)蛋白質(zhì)的若 干種肽的氨基酸序列。如表2-5和序列表中所示，一些肽是常見(jiàn)一致序列的變異體。在一些實(shí)施例中，本申請(qǐng)案提供包含SEQ ID NO. 2 (參見(jiàn)表2)的至少20個(gè)相鄰氨 基酸的肽。應(yīng)了解，涵蓋由SEQ ID NO. 2的一致序列所描述的任一變異序列的任何20個(gè)相 鄰氨基酸。在一些實(shí)施例中，肽可包含SEQ ID而.2的至少21、22、23、24、25或沈個(gè)相鄰 氨基酸。本申請(qǐng)案還提供包含兩種或兩種以上所述肽的免疫原性組合物。因此，在一些實(shí) 施例中，免疫原性組合物可包含2、3、4、5、6、7或8種包含SEQ IDN0. 2的至少20個(gè)相鄰氨 基酸的不同肽。在一些實(shí)施例中，免疫原性組合物可包含2n種各自包含SEQ ID NO. 2的不 同氨基酸序列的不同肽，其中η = 1-3。在一些實(shí)施例中，η = 1。在一些實(shí)施例中，η = 2。 在一些實(shí)施例中，η = 3。在一些實(shí)施例中，本申請(qǐng)案提供包含SEQ ID NO. 3 (參見(jiàn)表3)的至少20個(gè)相鄰氨 基酸的肽。應(yīng)了解，涵蓋由SEQ ID NO. 3的一致序列所描述的任一變異序列的任何20個(gè) 相鄰氨基酸。在一些實(shí)施例中，肽可包含SEQ ID N0. 3的至少21、22、23、24、25、26、27、28、 四、30、31、32或33個(gè)相鄰氨基酸。本申請(qǐng)案還提供包含兩種或兩種以上所述肽的免疫原性 組合物。因此，在一些實(shí)施例中，免疫原性組合物可包含2、3、4、5、6、7或8種包含SEQ ID
16NO. 3的至少20個(gè)相鄰氨基酸的不同肽。在一些實(shí)施例中，免疫原性組合物可包含2n種各 自包含SEQ ID NO. 3的不同氨基酸序列的不同肽，其中η = 1_3。在一些實(shí)施例中，η = 1。 在一些實(shí)施例中，η = 2。在一些實(shí)施例中，η = 3。在一些實(shí)施例中，本申請(qǐng)案提供包含SEQ ID NO. 4 (參見(jiàn)表4)的至少20個(gè)相鄰氨 基酸的肽。應(yīng)了解，涵蓋由SEQ ID NO. 4的一致序列所描述的任一變異序列的任何20個(gè)相 鄰氨基酸。在一些實(shí)施例中，肽可包含SEQ ID NO. 4的至少21、22、23、24、25、26、27、28、29 或30個(gè)相鄰氨基酸。本申請(qǐng)案還提供包含兩種或兩種以上所述肽的免疫原性組合物。因 此，在一些實(shí)施例中，免疫原性組合物可包含2、3或4種包含SEQ ID N0. 4的至少20個(gè)相 鄰氨基酸的不同肽。在一些實(shí)施例中，免疫原性組合物可包含2n種各自包含SEQ ID N0. 4 的不同氨基酸序列的不同肽，其中η = 1-2。在一些實(shí)施例中，η = 1。在一些實(shí)施例中，η =2。在一些實(shí)施例中，本申請(qǐng)案提供包含SEQ ID NO. 5 (參見(jiàn)表5)的至少20個(gè)相鄰氨 基酸的肽。應(yīng)了解，涵蓋由SEQ ID N0. 5的一致序列所描述的任一變異序列的任何20個(gè)相 鄰氨基酸。在一些實(shí)施例中，肽可包含SEQ ID N0. 5的至少21、22、23、M、25J6、27J8或 四個(gè)相鄰氨基酸。本申請(qǐng)案還提供包含兩種或兩種以上所述肽的免疫原性組合物。因此， 在一些實(shí)施例中，免疫原性組合物可包含2、3、4、5、6、7或8種包含SEQ ID N0. 5的至少20 個(gè)相鄰氨基酸的不同肽。在一些實(shí)施例中，免疫原性組合物可包含2n種各自包含SEQ ID N0. 5的不同氨基酸序列的不同肽，其中η = 1-3。在一些實(shí)施例中，η = 1。在一些實(shí)施例 中，η = 2。在一些實(shí)施例中，η = 3。在一些實(shí)施例中，本申請(qǐng)案提供包含與SEQ ID NO. 6 (參見(jiàn)表6)的至少40個(gè)相鄰 氨基酸具有至少80%同源性的區(qū)域的肽。在一些實(shí)施例中，同源性可為至少85^、卯1^、 95%或 99%。在一些實(shí)施例中，本申請(qǐng)案提供包含SEQ ID N0. 6的至少40個(gè)相鄰氨基酸的肽。 在一些實(shí)施例中，本申請(qǐng)案提供包含SEQ ID N0. 6的至少50、60、70或80個(gè)相鄰氨基酸的 肽。因此，肽可包含SEQ ID N0. 6的氨基酸1-81。肽也可包含SEQ ID N0. 6的氨基酸82-88。 在一些實(shí)施例中，肽可包含SEQ ID N0. 6的整個(gè)序列。在其它實(shí)施例中，肽可基本上由SEQ ID N0. 6組成。在其它實(shí)施例中，肽可由SEQ ID N0. 6組成。除上述外，本申請(qǐng)案還提供包含與SEQ ID NO. 16(參見(jiàn)圖9)的20-100個(gè)相鄰氨基 酸具有至少80%同源性的區(qū)域的肽種類(lèi)，其中所述肽包括來(lái)自A型流行性感冒血凝素(HA) 蛋白質(zhì)的少于100個(gè)的相鄰氨基酸。此種類(lèi)涵蓋上述其它Hl肽。在一些實(shí)施例中，肽可包 含與SEQ ID N0. 16的20-100個(gè)相鄰氨基酸具有至少85%、90%、95%或99%同源性的區(qū) 域。在一些實(shí)施例中，肽可包含與SEQ ID N0. 16的20-50個(gè)相鄰氨基酸具有至少80%同源 性的區(qū)域。在一些實(shí)施例中，肽可包含與SEQ ID N0. 16的50-100個(gè)相鄰氨基酸具有至少 80%同源性的區(qū)域。在一些實(shí)施例中，任何上述Hl肽都可包含少于30個(gè)的氨基酸。然而，如本文所討 論，在一些實(shí)施例中，包含任一確定區(qū)域的肽也可以包含在較大肽中。A型流行性感冒血凝素(HA)亞型3 (H3)肽實(shí)例中的表9-11描述來(lái)源于A型流行性感冒血凝素(HA)亞型3 (H3)蛋白質(zhì)的若 干種肽的氨基酸序列。如表9-11和序列表中所示，這些肽都是SEQ ID NO. 17(參見(jiàn)圖9)的一致序列的變異體。在一些實(shí)施例中，本申請(qǐng)案提供包含SEQ ID W). 17的序列的肽。應(yīng)了解，涵蓋由 SEQ ID NO. 17的一致序列所描述的任一變異序列。在一些實(shí)施例中，本申請(qǐng)案提供包含SEQ ID NO. 9 (參見(jiàn)表9)的序列的肽。應(yīng)了 解，涵蓋由SEQ ID NO. 9的一致序列所描述的任一變異序列。本申請(qǐng)案還提供包含兩種或 兩種以上所述肽的免疫原性組合物。因此，在一些實(shí)施例中，免疫原性組合物可包含2、3、4、 5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16種包含SEQ ID NO. 9的序列的不同肽。在一些實(shí)施例 中，免疫原性組合物可包含2n種各自包含SEQ ID NO. 9的不同氨基酸序列的不同肽，其中η =1-4。在一些實(shí)施例中，η = 1。在一些實(shí)施例中，η = 2。在一些實(shí)施例中，η = 3。在一 些實(shí)施例中，η = 4。應(yīng)了解本申請(qǐng)案還提供基本上由SEQ ID Ν0. 9的氨基酸序列組成、或 由SEQ ID N0. 9的氨基酸序列組成的肽。在一些實(shí)施例中，本申請(qǐng)案提供包含SEQ ID NO. 10(參見(jiàn)表10)的序列的肽。應(yīng) 了解，涵蓋由SEQ ID NO. 10的一致序列所描述的任一變異序列。本申請(qǐng)案還提供包含兩種 或兩種以上所述肽的免疫原性組合物。因此，在一些實(shí)施例中，免疫原性組合物可包含2、3、 4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15 或 16 種包含 SEQ ID NO. 10 的序列的不同肽。在一些實(shí) 施例中，免疫原性組合物可包含2n種各自包含SEQ ID NO. 10的不同氨基酸序列的不同肽， 其中n = 1-40在一些實(shí)施例中，η = 1。在一些實(shí)施例中，η = 2。在一些實(shí)施例中，η =
3。在一些實(shí)施例中，η= 4。應(yīng)了解本申請(qǐng)案還提供基本上由SEQ ID NO. 10的氨基酸序列 組成、或由SEQ ID NO. 10的氨基酸序列組成的肽。在一些實(shí)施例中，本申請(qǐng)案提供包含SEQ ID NO. 11 (參見(jiàn)表11)的序列的肽。應(yīng) 了解，涵蓋由SEQ ID NO. 11的一致序列所描述的任一變異序列。本申請(qǐng)案還提供包含兩種 或兩種以上所述肽的免疫原性組合物。因此，在一些實(shí)施例中，免疫原性組合物可包含2、3、
4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或 16 種包含 SEQ ID NO. 11 的序列的不同肽。在一些實(shí) 施例中，免疫原性組合物可包含2n種各自包含SEQ ID W). 11的不同氨基酸序列的不同肽， 其中n = 1-40在一些實(shí)施例中，η = 1。在一些實(shí)施例中，η = 2。在一些實(shí)施例中，η = 3。在一些實(shí)施例中，η = 4。應(yīng)了解本申請(qǐng)案還提供基本上由SEQ ID NO. 11的氨基酸序列 組成、或由SEQ ID NO. 11的氨基酸序列組成的肽。在一些實(shí)施例中，任何上述H3肽都可包含少于30個(gè)的氨基酸。然而，如本文所討 論，在一些實(shí)施例中，包含任一確定區(qū)域的肽也可以包含在較大肽中。實(shí)例中的表7描述來(lái)源于A型流行性感冒血凝素(HA)亞型3 (H3)蛋白質(zhì)的另一 種肽的氨基酸序列。本申請(qǐng)案提供包含與SEQ ID N0. 7的至少20個(gè)相鄰氨基酸具有至少 80%同源性的區(qū)域的肽，其中所述肽包括來(lái)自A型流行性感冒血凝素蛋白質(zhì)的少于100個(gè) 的相鄰氨基酸。在一些實(shí)施例中，肽可包含與SEQ ID N0. 7的至少20個(gè)相鄰氨基酸具有至 少85%、90%、95%或99%同源性的區(qū)域。在一些實(shí)施例中，肽可包含與SEQ ID N0. 7的至 少50、60、70或80個(gè)相鄰氨基酸具有至少80%同源性的區(qū)域。在一些實(shí)施例中，肽可包含 SEQ ID N0. 7的整個(gè)序列。在其它實(shí)施例中，肽可基本上由SEQ ID N0. 7組成。在其它實(shí)施 例中，肽可由SEQ ID N0. 7組成。在一些實(shí)施例中，肽可包含少于100個(gè)的氨基酸，例如少 于90、80、70、60、50或40個(gè)的氨基酸。然而，如本文所討論，在一些實(shí)施例中，包含任一確 定區(qū)域的肽也可以包含在較大肽中。
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B型流行性感冒血凝素(HA)肽實(shí)例中的表8和12描述來(lái)源于B型流行性感冒血凝素(HA)蛋白質(zhì)的若干種肽的
氨基酸序列。在一些實(shí)施例中，本申請(qǐng)案提供包含與SEQ ID NO. 18(參見(jiàn)圖9)的位置2_49或 68-121的至少20個(gè)相鄰氨基酸具有至少80%同源性的區(qū)域的肽，其中所述肽包括來(lái)自B 型流行性感冒血凝素蛋白質(zhì)的少于100個(gè)的相鄰氨基酸。在一些實(shí)施例中，肽可包含與SEQ ID NO. 18的位置2-49或68-121的至少20個(gè)相鄰氨基酸具有至少85%、90%、95%或99% 同源性的區(qū)域。在一些實(shí)施例中，肽可包含與SEQ ID NO. 18的位置2_49或68-121的至少 25、30、35、40或45個(gè)相鄰氨基酸具有至少80%同源性的區(qū)域。在一些實(shí)施例中，肽可包含與SEQ ID NO. 12 (參見(jiàn)表12)的整個(gè)序列具有至少 80%同源性的區(qū)域。在一些實(shí)施例中，同源性程度可為至少85%、90%、95%或99%。在一 些實(shí)施例中，肽可包含SEQ ID NO. 12的整個(gè)序列。在一些實(shí)施例中，肽可基本上由SEQ ID N0. 12組成。在一些實(shí)施例中，肽可由SEQ ID N0. 12組成。在一些實(shí)施例中，肽可包含與SEQ ID N0. 13 (參見(jiàn)表12)的整個(gè)序列具有至少 80%同源性的區(qū)域。在一些實(shí)施例中，同源性程度可為至少85%、90%、95%或99%。在一 些實(shí)施例中，肽可包含SEQ ID N0. 13的整個(gè)序列。在一些實(shí)施例中，肽可基本上由SEQ ID N0. 13組成。在一些實(shí)施例中，肽可由SEQ ID N0. 13組成。在一些實(shí)施例中，肽可包含與SEQ ID N0. 18的位置2_49的至少20個(gè)相鄰氨基酸 具有至少80%同源性的第一區(qū)域和與SEQ ID N0. 18的位置68-121的至少20個(gè)相鄰氨基酸 具有至少80%同源性的第二區(qū)域。在一些實(shí)施例中，同源性可更高，例如至少85^^90%, 95%或99%。在一些實(shí)施例中，第一和/或第二區(qū)域中的同源性可覆蓋SEQ ID N0. 18的位 置2-49或68-121的至少25、20、35、40或45個(gè)相鄰氨基酸。在一些實(shí)施例中，肽可包含與SEQ ID NO. 8 (參見(jiàn)表8)的整個(gè)序列具有至少80% 同源性的區(qū)域。在一些實(shí)施例中，同源性程度可為至少85^^90^^95%或99%。在一些實(shí) 施例中，肽可包含SEQ ID N0. 8的整個(gè)序列。在其它實(shí)施例中，肽可基本上由SEQ ID N0. 8 的序列組成，或由SEQ ID N0. 8的序列組成。在一些實(shí)施例中，任何上述的B型HA肽都可包含少于100個(gè)的氨基酸，例如少于 90、80、70、60、50或40個(gè)的氨基酸。然而，如本文所討論，在一些實(shí)施例中，包含任一確定區(qū) 域的肽也可以包含在較大肽中。A型流行性感冒核蛋白(NP)肽實(shí)例中的表13和14描述來(lái)源于A型流行性感冒核蛋白(NP)的若干種肽的氨基酸 序列。表13中的肽是SEQ ID N0. 14的一致序列的變異體。表14中的肽是SEQ ID N0. 15 的一致序列的變異體。在一些實(shí)施例中，本申請(qǐng)案提供包含SEQ ID N0. 14(參見(jiàn)表13)的序列的肽，其 中所述肽包括來(lái)自A型流行性感冒核蛋白的少于20個(gè)的相鄰氨基酸。應(yīng)了解，涵蓋由SEQ ID N0. 14的一致序列所描述的任一變異序列。本申請(qǐng)案還提供包含兩種或兩種以上所述肽 的免疫原性組合物。因此，在一些實(shí)施例中，免疫原性組合物可包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、 11、12、13、14、15或16種包含SEQ ID N0. 14的序列的不同肽。在一些實(shí)施例中，免疫原性 組合物可包含2n種各自包含SEQ ID N0. 14的不同氨基酸序列的不同肽，其中η = 1_4。在一些實(shí)施例中，η = 1。在一些實(shí)施例中，η = 2。在一些實(shí)施例中，η = 3。在一些實(shí)施例 中，η = 4。應(yīng)了解本申請(qǐng)案還提供基本上由SEQ ID NO. 14的氨基酸序列組成、或由SEQ ID NO. 14的氨基酸序列組成的肽。在一些實(shí)施例中，本申請(qǐng)案提供包含SEQ ID NO. 15 (參見(jiàn)表14)的序列的肽，其 中所述肽包括來(lái)自A型流行性感冒核蛋白的少于20個(gè)的相鄰氨基酸。應(yīng)了解，涵蓋由SEQ ID NO. 15的一致序列所描述的任一變異序列。本申請(qǐng)案還提供包含兩種或兩種以上所述肽 的免疫原性組合物。因此，在一些實(shí)施例中，免疫原性組合物可包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、 11、12、13、14、15或16種包含SEQ ID NO. 15的序列的不同肽。在一些實(shí)施例中，免疫原性 組合物可包含2n種各自包含SEQ ID N0. 15的不同氨基酸序列的不同肽，其中η = 1_4。在 一些實(shí)施例中，η = 1。在一些實(shí)施例中，η = 2。在一些實(shí)施例中，η = 3。在一些實(shí)施例 中，η = 4。應(yīng)了解本申請(qǐng)案還提供基本上由SEQ ID Ν0. 15的氨基酸序列組成、或由SEQ ID N0. 15的氨基酸序列組成的肽。在一些實(shí)施例中，任何上述NP肽都可包含少于30個(gè)的氨基酸。然而，如本文所討 論，在一些實(shí)施例中，包含任一確定區(qū)域的肽也可以包含在較大肽中。其它流行性感冒肽本申請(qǐng)案提供包括來(lái)自一種以上流行性感冒蛋白質(zhì)的序列的其它肽。因此，在一 些實(shí)施例中，本申請(qǐng)案提供包含SEQ ID N0. 1(參見(jiàn)表1)的氨基酸序列的肽。如表1和序 列表中所示，SEQ ID NO. 1為一致序列。一致序列來(lái)源于B型流行性感冒HA蛋白質(zhì)和A型 流行性感冒HA H3蛋白質(zhì)中的序列。應(yīng)了解，涵蓋由SEQ ID NO. 1的一致序列所描述的任一 變異序列。本申請(qǐng)案還提供包含兩種或兩種以上所述肽的免疫原性組合物。因此，在一些 實(shí)施例中，免疫原性組合物可包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16種包含SEQ ID NO. 1的序列的不同肽。在一些實(shí)施例中，免疫原性組合物可包含2n種各自包含SEQ ID NO. 1的不同氨基酸序列的不同肽，其中η = 1-4。在一些實(shí)施例中，η = 1。在一些實(shí)施例 中，η = 2。在一些實(shí)施例中，η = 3。在一些實(shí)施例中，η = 4。應(yīng)了解本申請(qǐng)案還提供基 本上由SEQ ID NO. 1的氨基酸序列組成、或由SEQ ID NO. 1的氨基酸序列組成的肽。還應(yīng) 了解，在一些實(shí)施例中，肽可包含少于30個(gè)的氨基酸。然而，如本文所討論，在一些實(shí)施例 中，包含任一確定區(qū)域的肽也可以包含在較大肽中。II.肽組合—方面，本申請(qǐng)案提供包括第I部分中所描述肽的組合的免疫原性組合物。應(yīng)了 解，以下示范性組合沒(méi)有限制性，且本申請(qǐng)案涵蓋第I部分中所描述肽的所有變更和組合。 還應(yīng)了解，其它肽(包括現(xiàn)有流行性感冒疫苗中發(fā)現(xiàn)的傳統(tǒng)流行性感冒蛋白質(zhì)抗原)可加 入本文所述的任何免疫原性組合物中。在一些實(shí)施例中，免疫原性組合物中的每種肽都獨(dú) 立地具有免疫原性。在一些實(shí)施例中，至少一種肽包含具有20個(gè)或20個(gè)以上來(lái)自非流行性感冒蛋白 質(zhì)的相鄰氨基酸的區(qū)域。在一些實(shí)施例中，每種肽都包含具有20個(gè)或20個(gè)以上來(lái)自非流 行性感冒蛋白質(zhì)的相鄰氨基酸的區(qū)域。在一些實(shí)施例中，組合物的至少兩種肽存在于單個(gè) 蛋白質(zhì)內(nèi)。在一些實(shí)施例中，本申請(qǐng)案提供包括來(lái)自第I部分的一種或一種以上A型流行性 感冒HA Hl肽和一種或一種以上A型流行性感冒HA H3肽的免疫原性組合物。
在一些實(shí)施例中，本申請(qǐng)案提供包括來(lái)自第I部分的一種或一種以上A型流行性 感冒HA Hl肽和一種或一種以上B型流行性感冒HA肽的免疫原性組合物。在一些實(shí)施例中，本申請(qǐng)案提供包括來(lái)自第I部分的一種或一種以上A型流行性 感冒HA H3肽和一種或一種以上B型流行性感冒HA肽的免疫原性組合物。在一些實(shí)施例中，本申請(qǐng)案提供包括來(lái)自第I部分的一種或一種以上A型流行性 感冒HA Hl肽、一種或一種以上A型流行性感冒HA H3肽和一種或一種以上B型流行性感 冒HA肽的免疫原性組合物。在一些實(shí)施例中，來(lái)自第I部分的一種或一種以上A型流行性感冒NP肽可包括在 任一上述組合中。在一些實(shí)施例中，本申請(qǐng)案提供包含以下的免疫原性組合物第一肽，其包含與 SEQ ID NO. 16的20-100個(gè)相鄰氨基酸具有至少80%同源性的區(qū)域，其中第一肽包括來(lái)自A 型流行性感冒血凝素蛋白質(zhì)的少于100個(gè)的相鄰氨基酸；第二肽，其包含SEQ ID NO. 17的 氨基酸序列；和第三肽，其包含與SEQ ID NO. 18的位置2_49或68-121的至少20個(gè)相鄰氨 基酸具有至少80%同源性的區(qū)域，其中第三肽包括來(lái)自B型流行性感冒血凝素蛋白質(zhì)的少 于100個(gè)的相鄰氨基酸。在一些實(shí)施例中，第一肽和第三肽包含少于100個(gè)的氨基酸，且第 二肽包含少于30個(gè)的氨基酸。在一些實(shí)施例中，還包括包含SEQ ID NO. 14或15的氨基酸序列的第四肽，其中第 四肽包括來(lái)自A型流行性感冒核蛋白的少于20個(gè)的相鄰氨基酸。示范性第一肽(A型流行性感冒HA Hl)在一些實(shí)施例中，第一肽可包含與SEQ ID NO. 16的20-100個(gè)相鄰氨基酸具有至 少85%、90%、95%或99%同源性的區(qū)域。在一些實(shí)施例中，第一肽可包含與SEQ ID N0. 16 的20-50個(gè)相鄰氨基酸具有至少80%同源性的區(qū)域。在一些實(shí)施例中，第一肽可包含與SEQ ID N0. 16的50-100個(gè)相鄰氨基酸具有至少80%同源性的區(qū)域。在一些實(shí)施例中，第一肽可包含SEQ ID N0. 2(參見(jiàn)表2)的至少20個(gè)相鄰氨基酸。 應(yīng)了解，涵蓋由SEQ ID N0. 2的一致序列所描述的任一變異序列的任何20個(gè)相鄰氨基酸。 在一些實(shí)施例中，第一肽可包含SEQ ID N0. 2的至少21、22、23、24、25或沈個(gè)相鄰氨基酸。 本申請(qǐng)案還提供包含兩種或兩種以上所述第一肽的免疫原性組合物。因此，在一些實(shí)施例 中，免疫原性組合物可包含2、3、4、5、6、7或8種包含SEQ ID N0. 2的至少20個(gè)相鄰氨基酸 的不同第一肽。在一些實(shí)施例中，免疫原性組合物可包含2n種各自包含SEQ ID N0. 2的不 同氨基酸序列的不同第一肽，其中η = 1-3。在一些實(shí)施例中，η = 1。在一些實(shí)施例中，η =2。在一些實(shí)施例中，η = 3。在一些實(shí)施例中，第一肽可包含SEQ ID Ν0. 3(參見(jiàn)表3)的至少20個(gè)相鄰氨基酸。 應(yīng)了解，涵蓋由SEQ ID N0. 3的一致序列所描述的任一變異序列的任何20個(gè)相鄰氨基酸。 在一些實(shí)施例中，第一肽可包含 SEQ ID N0. 3 的至少 21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、 32或33個(gè)相鄰氨基酸。本申請(qǐng)案還提供包含兩種或兩種以上所述第一肽的免疫原性組合 物。因此，在一些實(shí)施例中，免疫原性組合物可包含2、3、4、5、6、7或8種包含SEQ ID N0. 3 的至少20個(gè)相鄰氨基酸的不同第一肽。在一些實(shí)施例中，免疫原性組合物可包含2n種各自 包含SEQ ID N0. 3的不同氨基酸序列的不同第一肽，其中η = 1_3。在一些實(shí)施例中，η = 1。在一些實(shí)施例中，η = 2。在一些實(shí)施例中，η = 3。
在一些實(shí)施例中，第一肽可包含SEQ ID NO. 4(參見(jiàn)表4)的至少20個(gè)相鄰氨基酸。 應(yīng)了解，涵蓋由SEQ ID NO. 4的一致序列所描述的任一變異序列的任何20個(gè)相鄰氨基酸。 在一些實(shí)施例中，第一肽可包含SEQ ID NO. 4的至少21、22、23、24、25、26、27、28、四或30個(gè) 相鄰氨基酸。本申請(qǐng)案還提供包含兩種或兩種以上所述第一肽的免疫原性組合物。因此， 在一些實(shí)施例中，免疫原性組合物可包含2、3或4種包含SEQ ID NO. 4的至少20個(gè)相鄰氨 基酸的不同第一肽。在一些實(shí)施例中，免疫原性組合物可包含2n種各自包含SEQ ID NO. 4 的不同氨基酸序列的不同第一肽，其中η = 1-2。在一些實(shí)施例中，n = I0在一些實(shí)施例 中，η = 2。在一些實(shí)施例中，第一肽可包含SEQ ID Ν0. 5(參見(jiàn)表5)的至少20個(gè)相鄰氨基酸。 應(yīng)了解，涵蓋由SEQ ID N0. 5的一致序列所描述的任一變異序列的任何20個(gè)相鄰氨基酸。 在一些實(shí)施例中，第一肽可包含SEQ ID N0. 5的至少21、22、23、24、25、洸、27、沘或四個(gè)相 鄰氨基酸。本申請(qǐng)案還提供包含兩種或兩種以上所述第一肽的免疫原性組合物。因此，在 一些實(shí)施例中，免疫原性組合物可包含2、3、4、5、6、7或8種包含SEQ ID N0. 5的至少20個(gè) 相鄰氨基酸的不同第一肽。在一些實(shí)施例中，免疫原性組合物可包含2n種各自包含SEQ ID N0. 5的不同氨基酸序列的不同第一肽，其中η = 1-3。在一些實(shí)施例中，η = 1。在一些實(shí) 施例中，η = 2。在一些實(shí)施例中，η = 3。在一些實(shí)施例中，第一肽可包含與SEQ ID NO. 6 (參見(jiàn)表6)的至少40個(gè)相鄰氨 基酸具有至少80%同源性的區(qū)域。在一些實(shí)施例中，同源性可為至少85^^90^^95%或 99%。在一些實(shí)施例中，第一肽可包含SEQ ID N0. 6的至少40個(gè)相鄰氨基酸。在一些實(shí)施 例中，第一肽可包含SEQ ID N0.6的至少50、60、70或80個(gè)相鄰氨基酸。因此，第一肽可包 含SEQ ID N0. 6的氨基酸1-81。第一肽也可包含SEQ ID N0. 6的氨基酸82-88。在一些實(shí) 施例中，第一肽可包含SEQ ID N0. 6的整個(gè)序列。在其它實(shí)施例中，第一肽可基本上由SEQ ID N0. 6組成。在其它實(shí)施例中，第一肽可由SEQ ID N0. 6組成。在一些實(shí)施例中，任何上述第一肽都可包含少于30個(gè)的氨基酸。然而，如本文所 討論，在一些實(shí)施例中，包含任一確定區(qū)域的第一肽也可以包含在較大肽中。示范性第二肽(A型流行性感冒HA H3)在一些實(shí)施例中，第二肽可包含SEQ ID N0. 17的序列。應(yīng)了解，涵蓋由SEQ ID N0. 17的一致序列所描述的任一變異序列。在一些實(shí)施例中，第二肽可包含SEQ ID NO. 9 (參見(jiàn)表9)的序列。應(yīng)了解，涵蓋由 SEQ ID N0. 9的一致序列所描述的任一變異序列。本申請(qǐng)案還提供包含兩種或兩種以上所 述第二肽的免疫原性組合物。因此，在一些實(shí)施例中，免疫原性組合物可包含2、3、4、5、6、7、 8、9、10、11、12、13、14、15或16種包含SEQ ID N0. 9的序列的不同第二肽。在一些實(shí)施例 中，免疫原性組合物可包含2n種各自包含SEQ ID N0. 9的不同氨基酸序列的不同第二肽， 其中n = 1-40在一些實(shí)施例中，η = 1。在一些實(shí)施例中，η = 2。在一些實(shí)施例中，η = 3。在一些實(shí)施例中，η = 4。應(yīng)了解本申請(qǐng)案還提供基本上由SEQ ID Ν0. 9的氨基酸序列 組成、或由SEQ ID N0. 9的氨基酸序列組成的第二肽。在一些實(shí)施例中，第二肽可包含SEQ ID NO. 10(參見(jiàn)表10)的序列。應(yīng)了解，涵蓋 由SEQ ID NO. 10的一致序列所描述的任一變異序列。本申請(qǐng)案還提供包含兩種或兩種以 上所述第二肽的免疫原性組合物。因此，在一些實(shí)施例中，免疫原性組合物可包含2、3、4、
225、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16種包含SEQ ID NO. 10的序列的不同第二肽。在一些
實(shí)施例中，免疫原性組合物可包含2n種各自包含SEQ ID NO. 10的不同氨基酸序列的不同 第二肽，其中η = 1-4。在一些實(shí)施例中，η = 1。在一些實(shí)施例中，η = 2。在一些實(shí)施例 中，η = 3。在一些實(shí)施例中，η = 4。應(yīng)了解本申請(qǐng)案還提供基本上由SEQ ID NO. 10的氨 基酸序列組成、或由SEQ ID NO. 10的氨基酸序列組成的第二肽。在一些實(shí)施例中，第二肽可包含SEQ ID NO. 11(參見(jiàn)表11)的序列。應(yīng)了解，涵蓋 由SEQ ID NO. 11的一致序列所描述的任一變異序列。本申請(qǐng)案還提供包含兩種或兩種以 上所述第二肽的免疫原性組合物。因此，在一些實(shí)施例中，免疫原性組合物可包含2、3、4、 5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16種包含SEQ ID NO. 11的序列的不同第二肽。在一些 實(shí)施例中，免疫原性組合物可包含2n種各自包含SEQ ID NO. 11的不同氨基酸序列的不同 第二肽，其中η = 1-4。在一些實(shí)施例中，η = 1。在一些實(shí)施例中，η = 2。在一些實(shí)施例 中，η = 3。在一些實(shí)施例中，η = 4。應(yīng)了解本申請(qǐng)案還提供基本上由SEQ ID NO. 11的氨 基酸序列組成、或由SEQ ID NO. 11的氨基酸序列組成的第二肽。在一些實(shí)施例中，任何上述第二肽都可包含少于30個(gè)的氨基酸。然而，如本文所 討論，在一些實(shí)施例中，包含任一確定區(qū)域的第二肽也可以包含在較大肽中。示范性第三肽(B型流行性感冒HA)在一些實(shí)施例中，第三肽可包含與SEQ ID N0. 18的位置2_49或68-121的至少20 個(gè)相鄰氨基酸具有至少85%、90%、95%或99%同源性的區(qū)域。在一些實(shí)施例中，第三肽可 包含與SEQ ID N0. 18的位置2_49或68-121的至少25、30、35、40或45個(gè)相鄰氨基酸具有 至少80%同源性的區(qū)域。在一些實(shí)施例中，第三肽可包含與SEQ ID NO. 12(參見(jiàn)表12)的整個(gè)序列具有至 少80%同源性的區(qū)域。在一些實(shí)施例中，同源性程度可為至少85%、90%、95%或99%。在 一些實(shí)施例中，第三肽可包含SEQ ID N0. 12的整個(gè)序列。在一些實(shí)施例中，第三肽可基本 上由SEQ ID N0. 12組成。在一些實(shí)施例中，第三肽可由SEQ ID N0. 12組成。在一些實(shí)施例中，第三肽可包含與SEQ ID NO. 13(參見(jiàn)表12)的整個(gè)序列具有至 少80%同源性的區(qū)域。在一些實(shí)施例中，同源性程度可為至少85%、90%、95%或99%。在 一些實(shí)施例中，第三肽可包含SEQ ID N0. 13的整個(gè)序列。在一些實(shí)施例中，第三肽可基本 上由SEQ ID N0. 13組成。在一些實(shí)施例中，第三肽可由SEQ ID N0. 13組成。在一些實(shí)施例中，第三肽可包含與SEQ ID N0. 18的位置2_49的至少20個(gè)相鄰氨 基酸具有至少80%同源性的第一區(qū)域和與SEQ ID N0. 18的位置68-121的至少20個(gè)相鄰 氨基酸具有至少80%同源性的第二區(qū)域。在一些實(shí)施例中，同源性可更高，例如至少85%、 90^^95%或99%。在一些實(shí)施例中，第一區(qū)域和/或第二區(qū)域中的同源性可覆蓋SEQ ID N0. 18的位置2-49或68-121的至少25、20、35、40或45個(gè)相鄰氨基酸。在一些實(shí)施例中，第三肽可包含與SEQ ID N0. 8的整個(gè)序列具有至少80%同源性 的區(qū)域。在一些實(shí)施例中，同源性程度可為至少85%、90%、95%或99%。在一些實(shí)施例中， 第三肽可包含SEQ ID N0. 8的整個(gè)序列。在其它實(shí)施例中，第三肽可基本上由SEQ ID N0. 8 的序列組成，或由SEQ ID N0. 8的序列組成。在一些實(shí)施例中，免疫原性組合物可包括兩種不同的第三肽，其中一者包含與SEQ ID N0. 18的位置2-49的至少20個(gè)相鄰氨基酸具有至少80%同源性的區(qū)域，而另一者包含與SEQ ID NO. 18的位置68-121的至少20個(gè)相鄰氨基酸具有至少80%同源性的區(qū)域。在 一些實(shí)施例中，所述肽的一或兩者中同源性程度可為至少85 %、90 %、95 %或99 %。在一些實(shí)施例中，任何上述第三肽都可包含少于100個(gè)的氨基酸，例如少于90、 80、70、60、50或40個(gè)的氨基酸。然而，如本文所討論，在一些實(shí)施例中，包含任一確定區(qū)域 的第三肽也可以包含在較大肽中。示范性第四肽(A型流行性感冒NP)在一些實(shí)施例中，任選的第四肽可包含SEQ ID NO. 14(參見(jiàn)表13)的序列。應(yīng)了 解，涵蓋由SEQ ID NO. 14的一致序列所描述的任一變異序列。本申請(qǐng)案還提供包含兩種或 兩種以上所述第四肽的免疫原性組合物。因此，在一些實(shí)施例中，免疫原性組合物可包含2、 3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15 或 16 種包含 SEQ ID NO. 14 的序列的不同第四肽。在 一些實(shí)施例中，免疫原性組合物可包含2n種各自包含SEQ IDN0. 14的不同氨基酸序列的不 同第四肽，其中η = 1-4。在一些實(shí)施例中，η = 1。在一些實(shí)施例中，η = 2。在一些實(shí)施 例中，η = 3。在一些實(shí)施例中，η = 4。應(yīng)了解免疫原性組合物也可包括基本上由SEQ ID NO. 14的氨基酸序列組成、或由SEQ ID N0. 14的氨基酸序列組成的第四肽。在一些實(shí)施例中，任選的第四肽可包含SEQ ID NO. 15(參見(jiàn)表14)的序列。應(yīng)了 解，涵蓋由SEQ ID N0. 15的一致序列所描述的任一變異序列。本申請(qǐng)案還提供包含兩種或 兩種以上所述第四肽的免疫原性組合物。因此，在一些實(shí)施例中，免疫原性組合物可包含2、 3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15 或 16 種包含 SEQ ID N0. 15 的序列的不同第四肽。在 一些實(shí)施例中，免疫原性組合物可包含2n種各自包含SEQ ID N0. 15的不同氨基酸序列的不 同第四肽，其中η = 1-4。在一些實(shí)施例中，η = 1。在一些實(shí)施例中，η = 2。在一些實(shí)施 例中，η = 3。在一些實(shí)施例中，η = 4。應(yīng)了解免疫原性組合物也可包括基本上由SEQ ID Ν0. 15的氨基酸序列組成、或由SEQ ID N0. 15的氨基酸序列組成的第四肽。在一些實(shí)施例中，任何上述第四肽都可包含少于30個(gè)的氨基酸。然而，如本文所 討論，在一些實(shí)施例中，包含任一確定區(qū)域的第四肽也可以包含在較大肽中。示范性肽組合在一些實(shí)施例中，免疫原性組合物可包括包含與SEQ ID N0. 6具有至少80%同源 性的區(qū)域的第一肽、包含與SEQ ID N0. 8具有至少80%同源性的區(qū)域的第三肽、和2n種各 自包含SEQ ID W).9、10或11的不同氨基酸序列的不同第二肽，其中η = 1_4。在一個(gè)實(shí)施 例中，第二肽各自包含SEQ ID NO. 11的不同氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施例中，η = 4。在一個(gè) 實(shí)施例中，組合物另外包含2m種各自包含SEQ ID N0. 14的不同氨基酸序列的不同第四肽， 其中m= 1-4。在一個(gè)實(shí)施例中，組合物另外包含2m種各自包含SEQ ID N0. 15的不同氨基 酸序列的不同第四肽，其中m= 1-4。在一個(gè)實(shí)施例中，m = 4。在一些實(shí)施例中，免疫原性組合物可包括包含與SEQ ID N0. 6具有至少90%同源 性的區(qū)域的第一肽、包含與SEQ ID N0. 8具有至少90%同源性的區(qū)域的第三肽、和2n種各 自包含SEQ ID W).9、10或11的不同氨基酸序列的不同第二肽，其中η = 1_4。在一個(gè)實(shí)施 例中，第二肽各自包含SEQ ID NO. 11的不同氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施例中，η = 4。在一個(gè) 實(shí)施例中，組合物另外包含2m種各自包含SEQ ID N0. 14的不同氨基酸序列的不同第四肽， 其中m= 1-4。在一個(gè)實(shí)施例中，組合物另外包含2m種各自包含SEQ ID N0. 15的不同氨基 酸序列的不同第四肽，其中m= 1-4。在一個(gè)實(shí)施例中，m = 4。
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在一些實(shí)施例中，免疫原性組合物可包括包含與SEQ ID NO. 6具有至少95%同源 性的區(qū)域的第一肽、包含與SEQ ID NO. 8具有至少95%同源性的區(qū)域的第三肽、和2n種各 自包含SEQ ID W).9、10或11的不同氨基酸序列的不同第二肽，其中η = 1_4。在一個(gè)實(shí)施 例中，第二肽各自包含SEQ ID NO. 11的不同氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施例中，η = 4。在一個(gè) 實(shí)施例中，組合物另外包含2m種各自包含SEQ ID NO. 14的不同氨基酸序列的不同第四肽， 其中m= 1-4。在一個(gè)實(shí)施例中，組合物另外包含2m種各自包含SEQ ID NO. 15的不同氨基 酸序列的不同第四肽，其中m= 1-4。在一個(gè)實(shí)施例中，m = 4。在一些實(shí)施例中，免疫原性組合物可包括包含SEQ ID NO. 6的第一肽、包含SEQ ID NO. 8的第三肽、和2n種各自包含SEQ ID NO. 9、10或11的不同氨基酸序列的不同第二肽， 其中n =丨-4。在一個(gè)實(shí)施例中，第二肽各自包含SEQ ID NO. 11的不同氨基酸序列。在一 個(gè)實(shí)施例中，η = 4。在一個(gè)實(shí)施例中，組合物另外包含2m種各自包含SEQ ID NO. 14的不同 氨基酸序列的不同第四肽，其中m= 1-4。在一個(gè)實(shí)施例中，組合物另外包含2m種各自包含 SEQ ID NO. 15的不同氨基酸序列的不同第四肽，其中m = 1_4。在一個(gè)實(shí)施例中，m = 4。在一些實(shí)施例中，免疫原性組合物可包括基本上由SEQ ID N0. 6組成的第一肽、基 本上由SEQ ID N0. 8組成的第三肽、和2"種各自基本上由SEQ ID N0. 9、10或11的不同氨 基酸序列組成的不同第二肽，其中η = 1-4。在一個(gè)實(shí)施例中，第二肽各自基本上由SEQ ID NO. 11的不同氨基酸序列組成。在一個(gè)實(shí)施例中，η = 4。在一個(gè)實(shí)施例中，組合物另外包 含2-種各自基本上由SEQ ID W). 14的不同氨基酸序列組成的不同第四肽，其中m= 1-4。 在一個(gè)實(shí)施例中，組合物另外包含2-種各自基本上由SEQ ID N0. 15的不同氨基酸序列組 成的不同第四肽，其中m = 1-4。在一個(gè)實(shí)施例中，m = 4。在一些實(shí)施例中，免疫原性組合物可包括由SEQ ID N0. 6組成的第一肽、由SEQ ID N0. 8組成的第三肽、和2"種各自由SEQ ID N0. 9、10或11的不同氨基酸序列組成的不同第 二肽，其中η= 1-4。在一個(gè)實(shí)施例中，第二肽各自由SEQ ID NO. 11的不同氨基酸序列組 成。在一個(gè)實(shí)施例中，η = 4。在一個(gè)實(shí)施例中，組合物另外包含2-種各自由SEQ ID Ν0. 14 的不同氨基酸序列組成的不同第四肽，其中m= 1-4。在一個(gè)實(shí)施例中，組合物另外包含2m 種各自由SEQ ID N0. 15的不同氨基酸序列組成的不同第四肽，其中m = 1_4。在一個(gè)實(shí)施 例中，m = 4。III.肽合成本文所述的肽可使用所屬領(lǐng)域中的任何已知方法(包括重組方法)合成。在各個(gè) 實(shí)施例中，肽可通過(guò)固相肽合成法(SPPS)來(lái)合成。在SPPS中，C端氨基酸通過(guò)與連接分子 所形成的酸不穩(wěn)定鍵連接于固相(通常為交聯(lián)樹(shù)脂，例如含聚苯乙烯或聚乙二醇的樹(shù)脂)。 所用固相一般不溶于合成所用的溶劑中，從而可相對(duì)簡(jiǎn)單且快速地沖洗掉過(guò)量的試劑和副 產(chǎn)物。N端用在酸中穩(wěn)定，但可通過(guò)堿來(lái)除去的保護(hù)基(例如Fmoc基團(tuán))保護(hù)。側(cè)鏈官能 團(tuán)用堿穩(wěn)定而酸不穩(wěn)定的基團(tuán)保護(hù)。SPSS技術(shù)接著包含將N-α上經(jīng)保護(hù)的氨基酸并入生 長(zhǎng)肽鏈中，而C端仍然連接于固相。實(shí)例1描述示范性SPSS工藝。一般說(shuō)來(lái)，此工藝可自動(dòng)操作，且市售裝置可用于常規(guī)合成長(zhǎng)度為20個(gè)或20個(gè)以 上氨基酸的肽。當(dāng)制備長(zhǎng)肽(例如長(zhǎng)度超過(guò)40個(gè)氨基酸)時(shí)，可證明適宜在一系列通過(guò)使 用適當(dāng)保護(hù)基接合的片段中產(chǎn)生肽。如本文所述，某些肽組合物可包括單個(gè)肽序列的多個(gè)變異體(例如在相同序列中的2個(gè)或2個(gè)以上位置具有2個(gè)或2個(gè)以上不同氨基酸)。雖然指定組中的各變異體可個(gè) 別合成，但通常適宜在單一合成中合成變異體子集或整組變異體。在各個(gè)實(shí)施例中，此可使 用分開(kāi)-組合法(split-combine method)實(shí)現(xiàn)。因此，如果此組變異體經(jīng)設(shè)計(jì)以在指定位 置包括兩種不同氨基酸的一種，那么樹(shù)脂可分成兩個(gè)同等部分，且各部分可與兩種氨基酸 的一種偶合，形成兩種不同的肽鏈。一旦偶合結(jié)束，即可將兩個(gè)部分重新組合，以便后來(lái)的 氨基酸可加入兩鏈中。或者，可使用一鍋法，其中兩個(gè)替代性氨基酸加入同一反應(yīng)中。通常 兩種氨基酸以等摩爾量加入；然而，在某些情況下(例如在其各別反應(yīng)動(dòng)力學(xué)差異顯著的 情況下)，優(yōu)選非等摩爾量。接著可使用凱撒茚三酮試驗(yàn)(Kaiser ninhydrin test)監(jiān)測(cè)肽 反應(yīng)是否結(jié)束。以下參考文獻(xiàn)描述制備肽混合物的一些示范性方法霍頓(Houghten)，美國(guó)國(guó)家 科學(xué)院院刊82 =5131 (1985)；蓋森(Geysen)等人，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊81 :3998(1984)和 美國(guó)專(zhuān)利第5，010，175號(hào)。IV.佐劑在一些實(shí)施例中，免疫原性組合物可包括一種或一種以上佐劑。如所屬領(lǐng)域中所 熟知，佐劑是增強(qiáng)免疫反應(yīng)的試劑。佐劑為所屬領(lǐng)域中所熟知(例如參見(jiàn)“疫苗設(shè)計(jì)亞單 位和佐劑方法(Vaccine Design :The Subunit and Adjuvant Approach) ”，制藥學(xué)生物技 術(shù)(Pharmaceutical Biotechnology)，第 6 卷，鮑威爾(Powell)和紐曼(Newman)編，普萊 南出版社(Plenum Press)，紐約(New York)和倫敦(London)，1995)。示范性佐劑包括完全弗氏佐劑(complete Freund' s adjuvant, CFA)、不完全弗 氏佐劑(IFA)、角鯊烯、角鯊?fù)楹兔鞯\(氫氧化鋁)，所述佐劑都是所屬領(lǐng)域中熟知的物質(zhì)且 可從若干來(lái)源購(gòu)得。在一些實(shí)施例中，鋁或鈣鹽(例如氫氧化物或磷酸鹽)可用作佐劑。明 礬(氫氧化鋁)已用于許多現(xiàn)有的疫苗中。通常每一劑量可包括約40至約700 μ g的鋁。在各個(gè)實(shí)施例中，水包油乳液或油包水乳液也可用作佐劑。舉例來(lái)說(shuō)，油相可包括 角鯊烯或角鯊?fù)楹捅砻婊钚詣?。在各個(gè)實(shí)施例中，可使用非離子型表面活性劑，例如脫水山 梨糖醇和二縮甘露醇(marmide)的單-和二-C12-Cm脂肪酸酯。油相優(yōu)選占免疫原性肽的 約0.2重量％至約15重量％ (例如約0. 2%至)。PCT公開(kāi)案第WO 95/17210號(hào)描述 示范性乳液。命名為QS21的佐劑是一種具有佐劑活性的免疫活性皂苷部分，其來(lái)源于南美樹(shù) 木智利皂莢樹(shù)(Quillaja Saponaria Molina)的樹(shù)皮，且其生產(chǎn)方法揭示于美國(guó)專(zhuān)利第 5，057，540號(hào)中。智利皂莢樹(shù)皂苷的半合成和合成衍生物也是適用的，例如美國(guó)專(zhuān)利第 5，977，081號(hào)和第6，080, 725號(hào)中所述的皂苷衍生物。TLR是與果蠅Toll受體同源的蛋白質(zhì)家族，其識(shí)別病原體相關(guān)分子模式，因此幫 助身體區(qū)分自身分子與非自身分子。病毒病原體中常見(jiàn)的物質(zhì)通過(guò)TLR識(shí)別為病原體相關(guān) 分子模式。舉例來(lái)說(shuō)，TLR-3識(shí)別雙股RNA中的模式，TLR-4識(shí)別脂多糖中的模式，而TLR-7/8 識(shí)別病毒和細(xì)菌RNA和DNA中含有腺苷的模式。當(dāng)通過(guò)此模式識(shí)別引發(fā)TLR時(shí)，發(fā)生一系 列信號(hào)傳導(dǎo)事件，引起發(fā)炎和先天性和適應(yīng)性免疫反應(yīng)的活化。大量含有各種TLR所識(shí)別 的分子模式的合成配體正研制成為佐劑，且可包括在如本文所述的免疫原性組合物中。舉例來(lái)說(shuō)，聚核糖肌苷酸聚核糖胞苷酸或poly(I:C)(得自加利福尼亞州(CA) 圣地亞哥市(San Diego)的英孚杰公司(InvivoGen))是雙股RNA(病毒感染相關(guān)分子模式)的合成類(lèi)似物，并且為示范性TLR-3激動(dòng)劑佐劑(例如參見(jiàn)菲爾德(Field)等 人，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊58 :1004(1967)和拉維(Levy)等人，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊62 357(1969))。下文實(shí)例11將證明此佐劑用于示范性口服肽組合物的益處。在一些實(shí)施 例中，poly(I:C)可與其它試劑組合，以提高穩(wěn)定性(例如通過(guò)核糖核酸酶的活性來(lái)減 少降解)。舉例來(lái)說(shuō)，美國(guó)專(zhuān)利第3，952，097號(hào)、第4，024，241號(hào)和第4，349，538號(hào)描述 poly (I:C)與聚L-賴氨酸的復(fù)合物。聚精氨酸加入到poly (I:C)中也已展示通過(guò)核糖核 酸酶的活性來(lái)減少降解。美國(guó)專(zhuān)利公開(kāi)案第20090041809號(hào)描述具有一種或一種以上鎖核 酸(LNA)核苷的雙股核酸，其可充當(dāng)TLR-3激動(dòng)劑。所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員將能夠鑒別其它 適合的TLR-3激動(dòng)劑佐劑。諸如單磷酰基脂質(zhì)A(MPL)和3-脫?；鶈瘟柞；|(zhì)A(3D-MPL)等減毒脂質(zhì)A 衍生物(ALD)是示范性TLR-4激動(dòng)劑佐劑。ALD是類(lèi)脂質(zhì)A分子，其經(jīng)改變或構(gòu)筑，以使分 子顯示更少或不同的脂質(zhì)A的不良影響。這些不良影響包括致熱性、局部什瓦茨曼反應(yīng)性 (Shwarzman reactivity)和毒性，如雞胚50%致死劑量分析(CELD5tl)中所評(píng)估。MPL和 3D-MPL分別描述于美國(guó)專(zhuān)利第4，436，727和4，912，094號(hào)中。MPL最初來(lái)源于作為腸細(xì)菌 脂多糖(LPQ的組分的脂質(zhì)A，脂多糖是一種有效但毒性高的免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)劑。3D-MPL與 MPL的不同之處在于酯連接于位置3的還原末端葡糖胺的?；鶜埢堰x擇性地除去。應(yīng)了 解，MPL和3D-MPL可包括脂肪酸鏈長(zhǎng)變化的大量脂肪酸取代型式(即庚酰基、己?；?、戊酰 基等)的混合物。因此，本發(fā)明涵蓋MPL和3D-MPL的各種形式，包括其混合物在內(nèi)。在一些實(shí)施例中，這些ALD可與海藻糖二霉菌酸酯(TDM)和細(xì)胞壁骨架(CWS)組 合于例如2%角鯊烯/Tween 80乳液中(例如參見(jiàn)英國(guó)專(zhuān)利第2122204號(hào))。以PHAD (磷 酸化己?；?，可從亞拉巴馬州阿拉巴斯特市的雅凡蒂極性脂質(zhì)公司獲得MPL。圖13 展示PHAD的化學(xué)結(jié)構(gòu)。下文實(shí)例13證明此佐劑用于示范性不經(jīng)腸肽組合物的益處。圖 14中展示另一示范性TLR-4激動(dòng)劑佐劑二 [3-脫氧-D-甘露-辛酮糖酰基]-脂質(zhì)A(銨 鹽)的化學(xué)結(jié)構(gòu)(也來(lái)自亞拉巴馬州阿拉巴斯特市的雅凡蒂極性脂質(zhì)公司)。所屬領(lǐng)域的 技術(shù)人員將能夠鑒別其它適合的TLR-4激動(dòng)劑佐劑。舉例來(lái)說(shuō)，其它脂多糖已經(jīng)描述于WO 98/01139、美國(guó)專(zhuān)利第6，005，099號(hào)和歐洲專(zhuān)利第729473號(hào)中。咪喹莫特(Imiquimod) (1_異丁基_1Η_咪唑并W，5_c]喹啉_4_胺)是小分子 TLR-7/8激動(dòng)劑，其也適宜包括在如本文所述的免疫原性組合物中。V.微脂粒在一些實(shí)施例中，組合物中的一種或一種以上肽可與微脂粒組合。如所屬領(lǐng)域中 所熟知，微脂粒一般具有經(jīng)一個(gè)或一個(gè)以上包括親水脂分子(例如脂肪酸、脂質(zhì)、類(lèi)固醇 等)的雙層圍住的水性隔室。一種或一種以上肽可存在于微脂粒的水性核心中。視肽的疏 水性而定，肽也可以與雙層締合(例如通過(guò)疏水性相互作用和/或氫鍵或離子鍵)。應(yīng)了 解，任何微脂粒都可用于如本文所述的免疫原性組合物，且雙層的親水脂分子可為離子型 和/或非離子型。在一些實(shí)施例中，微脂粒可包含非離子型兩性分子(例如非離子型表面活性劑)。 具有適當(dāng)兩性分子特性的任何非離子型表面活性劑都可用以形成此類(lèi)微脂粒。適合的表面 活性劑的實(shí)例包括但不限于基于甘油的酯連接表面活性劑。所述甘油酯可包含例如各?；?部分中含有至少10個(gè)碳原子的兩種高級(jí)脂族?；囊环N?；谒龈视王サ谋砻婊钚詣?br> 27可包含一個(gè)以上甘油單元，例如多達(dá)5個(gè)甘油單元?？墒褂酶视蛦熙ィ绾蠧12-C2tl烷酰 基或烯?；糠?，例如己酰基、月桂?；?、肉豆蔻?；④浿；⒂王；蛴仓；母视?單酯。一個(gè)示范性表面活性劑為ι-單棕櫚?；视汀Ｃ堰B接的表面活性劑也可用作非離子型表面活性劑。舉例來(lái)說(shuō)，適合的是基于甘 油或具有含至多4個(gè)碳原子的低級(jí)脂族二醇的二醇的醚連接表面活性劑。基于所述二醇的 表面活性劑可包含一個(gè)以上二醇單元，例如多達(dá)5個(gè)二醇單元(例如二乙二醇鯨蠟基醚和 /或聚氧乙烯-3-月桂基醚)?？墒褂枚蓟蚋视蛦蚊?，包括含有C12-C2tl烷基或烯基部分， 例如辛基(capryl)、月桂基、肉豆寇基、鯨蠟基、油基(oleyl)或硬脂基的二醇或甘油單醚。 可使用的環(huán)氧乙烷縮合產(chǎn)物包括PCT公開(kāi)案第W088/06882號(hào)中所揭示的環(huán)氧乙烷縮合產(chǎn) 物(例如聚氧乙烯高級(jí)脂族醚和胺表面活性劑)。示范性的醚連接表面活性劑包括ι-單鯨 蠟基甘油醚和二乙二醇鯨蠟基醚。在一些實(shí)施例中，包含非離子型表面活性劑的微脂?？闪硗獍x子型兩性分 子，例如使微脂粒帶負(fù)電荷。舉例來(lái)說(shuō)，此可有助于穩(wěn)定微脂粒并提供有效分散。不受限制 地，例如高級(jí)鏈烷酸和鏈烯酸(例如棕櫚酸、油酸)的酸性物質(zhì)或包括磷酸酯(例如二烷基 磷酸酯(例如二鯨蠟基磷酸酯或磷脂酸或磷脂酰絲氨酸))和硫酸單酯(例如高級(jí)烷基硫 酸酯(例如鯨蠟基硫酸酯))在內(nèi)的含有酸基的其它化合物都可用于達(dá)成此目的。離子型 兩性分子如果存在，那么其通常占非離子型表面活性劑的1重量％與30重量％之間。例如 2重量％與20重量％之間或5重量％與15重量％之間。在一些實(shí)施例中，微脂粒組分可與具有高分子量且能夠形成雙層的適當(dāng)疏水性物 質(zhì)(例如類(lèi)固醇，例如固醇，例如膽固醇)混合。在一些實(shí)施例中，類(lèi)固醇的存在可有助于 形成決定微脂粒物理性質(zhì)的雙層。類(lèi)固醇如果存在，那么其通常占非離子型表面活性劑的 20重量％與120重量％之間。例如25重量％與90重量％之間或35重量％與75重量％之 間。在一些實(shí)施例中，微脂?？蔀槟懼}體(參見(jiàn)例如美國(guó)專(zhuān)利第5，876，721號(hào))。如 本文所用的“膽汁鹽體”是包含非離子型表面活性劑和促進(jìn)類(lèi)脂質(zhì)分子傳輸穿過(guò)粘膜的傳 輸增強(qiáng)分子的微脂粒。如美國(guó)專(zhuān)利第5，876，721號(hào)中所述，多種分子可用作傳輸增強(qiáng)劑。舉 例來(lái)說(shuō)，側(cè)鏈的C23碳原子攜帶羧酸和/或其衍生物的膽固醇衍生物可以用作傳輸增強(qiáng)劑。 所述衍生物包括(但不限于)“膽汁酸”膽酸和鵝脫氧膽酸、其與甘氨酸或?；撬岬慕Y(jié)合產(chǎn) 物(例如甘氨膽酸和牛磺膽酸)、包括脫氧膽酸和熊脫氧膽酸在內(nèi)的衍生物、和這些酸各自 的鹽。其它傳輸增強(qiáng)劑包括酰氧化氨基酸，例如?；鈮A和其鹽。舉例來(lái)說(shuō)，諸如棕櫚酰 基肉堿等含有C6_2(l烷?；蛳；糠值孽；鈮A可以用作傳輸增強(qiáng)劑。如本文所用的術(shù) 語(yǔ)酰氧化氨基酸意欲涵蓋一級(jí)、二級(jí)和三級(jí)氨基酸以及α、β和Y氨基酸。?；鈮A為酰 氧化Y氨基酸的實(shí)例。應(yīng)了解，免疫原性組合物所包括的膽汁鹽體可包含一種以上類(lèi)型的傳輸增強(qiáng)劑， 例如一種或一種以上不同膽汁鹽和一種或一種以上?；鈮A。還應(yīng)了解，膽汁鹽體也可以合并離子型兩性分子，例如使膽汁鹽體帶負(fù)電荷。舉例 來(lái)說(shuō)，此可有助于穩(wěn)定膽汁鹽體并提供有效分散。不受限制地，例如高級(jí)鏈烷酸和鏈烯酸 (例如棕櫚酸、油酸)的酸性物質(zhì)或包括磷酸酯(例如二烷基磷酸酯(例如二鯨蠟基磷酸酯或磷脂酸或磷脂酰絲氨酸))和硫酸單酯(例如高級(jí)烷基硫酸酯(例如鯨蠟基硫酸酯))在 內(nèi)的含有酸基的其它化合物都可用于達(dá)成此目的。在一些實(shí)施例中，膽汁鹽體組分可與具有高分子質(zhì)量且能夠形成雙層的適當(dāng)疏水 性物質(zhì)(例如類(lèi)固醇，例如固醇，例如膽固醇)混合。在一些實(shí)施例中，類(lèi)固醇的存在可有 助于形成決定膽汁鹽體物理性質(zhì)的雙層。膽汁鹽體內(nèi)所存在的傳輸增強(qiáng)劑的存在量一般以非離子型表面活性劑計(jì)介于40 重量％與400重量％之間(例如60重量％與100重量％之間或70重量％與90重量％之 間)。類(lèi)固醇如果存在，那么其通常占非離子型表面活性劑的20重量％與120重量％之間 (例如25重量％與90重量％之間或35重量％與75重量％之間)。離子型兩性分子如果 存在，那么其通常占非離子型表面活性劑的1重量％與30重量％之間(例如2重量％與20 重量％之間或5重量％與15重量％之間)。存在多種已知用于制備包含非離子型表面活性劑的微脂粒的技術(shù)，例如PCT公 開(kāi)案第WO 1993/019781號(hào)中所提及的技術(shù)。應(yīng)了解，任何這些已知的方法可用以制備適 合的微脂粒且可以通過(guò)修改任何這些技術(shù)來(lái)制備膽汁鹽體。一種示范性技術(shù)為旋轉(zhuǎn)膜 蒸發(fā)法，其中通過(guò)從有機(jī)溶劑(例如烴或氯化烴溶劑，諸如氯仿)中旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)來(lái)制備非 離子型表面活性劑膜，例如參見(jiàn)拉塞爾(Russell)和亞歷山大(Alexander)，免疫學(xué)雜志 (J. Immunol.) 140 1274 (1988)。所得薄膜接著在傳輸增強(qiáng)劑存在下在碳酸氫鹽緩沖液中再 水合。另一種用于產(chǎn)生用以制備膽汁鹽體的微脂粒的方法為柯林斯(Collins)等人，藥 學(xué)與藥理學(xué)雜志(J. Pharm. Pharmacol.) 42 :53(1990)所揭示的方法。此方法包含使非離子 型表面活性劑、類(lèi)固醇(在使用的情況下)和離子型兩性分子(在使用的情況下)的混合 物熔融，及在用力混合下在水性緩沖液存在下水合。傳輸增強(qiáng)劑可通過(guò)與其它組分一起包 括在熔融混合物中(即通過(guò)共熔融)或伴隨用以截留肽的過(guò)程中并入微脂粒中。另一種方法包含在剪切力存在下水合?？捎糜谑┘铀黾羟辛Φ脑O(shè)備為熟知的適 合裝置(參見(jiàn)例如PCT公開(kāi)案第W088/06882號(hào))。聲波處理和超聲波處理也是形成微脂粒 或改變其粒徑的有效手段。一種或一種以上肽可與微脂粒以任何方式組合。舉例來(lái)說(shuō)，在旋轉(zhuǎn)膜蒸發(fā)技術(shù) 中，此可通過(guò)在肽連同傳輸增強(qiáng)劑存在下膜的水合來(lái)實(shí)現(xiàn)。在其它方法中，一種或一種以 上肽可與預(yù)先形成的微脂粒通過(guò)脫水-再水合法組合，在所述方法中存在于水相中的肽通 過(guò)閃凍、接著凍干來(lái)截留，例如參見(jiàn)卡比(Kirby)和格雷格狄斯(Gregoriadis)，生物技術(shù) (Biotechnology) 2 :979(1984)。或者，可使用凍融技術(shù)，其中微脂粒與肽混合，并在液氮中 重復(fù)閃凍，且升溫至約例如60°C的溫度(即超過(guò)有關(guān)表面活性劑的轉(zhuǎn)變溫度)，例如參見(jiàn)皮 克(Pick)，生物化學(xué)與生物物理學(xué)集刊(Arch. Biochem. Biophys. )212 :195(1981)。除截留 肽外，脫水-再水合法和凍融技術(shù)也能夠?qū)⑵渌鼈鬏斣鰪?qiáng)劑伴隨并入微脂粒中。在每一所述方法中，微脂粒組分的懸浮液可在足以維持微脂粒形成混合物處于熔 融狀態(tài)的高溫下若干次擠壓通過(guò)微孔聚碳酸酯膜。此過(guò)程的優(yōu)點(diǎn)在于可產(chǎn)生尺寸均一的微 脂粒。根據(jù)本發(fā)明可使用的微脂粒(包括膽汁鹽體)可具有任何直徑。在一些實(shí)施例中，組 合物可包括直徑在約IOnm至約ΙΟμπι范圍內(nèi)的微脂粒。在一些實(shí)施例中，微脂粒的直徑在 約IOOnm至約5 μ m之間。在一些實(shí)施例中，微脂粒的直徑在約500nm至約2 μ m之間。在一些實(shí)施例中，微脂粒的直徑在約SOOnm至約1. 5 μ m之間。VI.劑量和投藥本發(fā)明的方法適用于治療包括成人和兒童在內(nèi)的人類(lèi)的流行性感冒。然而，一般 說(shuō)來(lái)，其可適用于任何動(dòng)物。在一些實(shí)施例中，本文中的方法可用于獸醫(yī)學(xué)應(yīng)用，例如犬科 和貓科應(yīng)用。必要時(shí)，本文中的方法也可以用于農(nóng)畜，例如羊、禽、牛、豬和馬等種類(lèi)。本文所述的組合物一般以誘發(fā)免疫反應(yīng)所需或足以誘發(fā)免疫反應(yīng)的量和次數(shù)投 予。給藥方案可由一段時(shí)間內(nèi)單個(gè)劑量或多個(gè)劑量組成。待要投予的肽組合物的精確量可 隨各個(gè)體而變化，且可視若干因素而定。因此，應(yīng)了解，一般說(shuō)來(lái)，所用的準(zhǔn)確劑量將由執(zhí)業(yè) 醫(yī)師確定，且不僅取決于個(gè)體的體重和投藥途徑，而且也取決于個(gè)體的年齡和癥狀的嚴(yán)重 程度和/或感染的風(fēng)險(xiǎn)。在一些實(shí)施例中，免疫原性組合物中肽的劑量可在約0. 01至50mg 范圍內(nèi)。舉例來(lái)說(shuō)，在一些實(shí)施例中，范圍可在0. 1與5mg之間，例如0. 1與2mg之間。實(shí) 例14描述示范性投藥方案，其包含兩次連續(xù)肌肉內(nèi)注射0. 2或Img肽劑量(第0天和第觀 天)。一般說(shuō)來(lái)，組合物可通過(guò)任何途徑投予個(gè)體。實(shí)例中的結(jié)果證明本文所述的免疫 原性肽組合物不僅在通過(guò)傳統(tǒng)的不經(jīng)腸途徑投予時(shí)可誘發(fā)保護(hù)性反應(yīng)，而且在經(jīng)口投予時(shí) 也誘發(fā)保護(hù)性反應(yīng)。因此，在一些實(shí)施例中，組合物可經(jīng)口(包括經(jīng)頰、舌下和通過(guò)洗胃或 其它人工供應(yīng)手段)投予。所述經(jīng)口傳遞可使用例如呈片劑、膠囊、多顆粒、凝膠、膜、胚珠 (ovule)、酏劑、溶液、懸浮液等形式的固體或液體組合物實(shí)現(xiàn)。在一些實(shí)施例中，當(dāng)使用液 體組合物時(shí)，組合物可結(jié)合堿性組合物(例如碳酸氫鹽溶液)投予以中和胃的PH值。在一 些實(shí)施例中，堿性組合物可在肽組合物之前和/或之后投予。在一些實(shí)施例中，堿性組合物 可在投藥之前與肽組合物組合，或與肽組合物同時(shí)服用。應(yīng)了解，考慮到經(jīng)口傳遞優(yōu)于任何形式的注射，所以尤其期望口服途徑。還應(yīng)了 解，根據(jù)所有已知的流行性感冒疫苗迄今都是不經(jīng)腸投予的事實(shí)，結(jié)果是令人意外的。根據(jù) 本文所述的免疫原性組合物中所包括的肽比當(dāng)前流行性感冒疫苗中所用的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)抗 原短得多的事實(shí)，能夠通過(guò)經(jīng)口傳遞誘發(fā)保護(hù)性反應(yīng)尤其是出乎意外。實(shí)際上，長(zhǎng)期以來(lái)所 屬領(lǐng)域中對(duì)短肽用作免疫原與經(jīng)口傳遞蛋白質(zhì)疫苗兩者存在著偏見(jiàn)。在一些實(shí)施例中，口服組合物包含一種或一種以上肽、膽汁鹽體和佐劑。在一些實(shí) 施例中，佐劑為T(mén)LR-3激動(dòng)劑。在一些實(shí)施例中，佐劑可與膽汁鹽體混合。在一些實(shí)施例中， 佐劑可與膽汁鹽體締合(例如通過(guò)將佐劑與一種或一種以上肽和/或膽汁鹽體組分在用以 產(chǎn)生膽汁鹽體的過(guò)程中合并)。在一些實(shí)施例中，組合物經(jīng)調(diào)配，用于例如通過(guò)注射等方式不經(jīng)腸傳遞。在所述實(shí) 施例中，可例如通過(guò)靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮內(nèi)或皮下或通過(guò)輸注或無(wú)針注射技術(shù)投藥。對(duì)于所 述不經(jīng)腸投藥，組合物以常規(guī)凍干組合物形式制備和維持，并在投藥前用醫(yī)藥學(xué)上可接受 的鹽水溶液(例如0.9%鹽水溶液)復(fù)原。如所屬領(lǐng)域中已知，可用例如甲烷磺酸等醫(yī)藥 學(xué)上可接受的酸調(diào)整可注射組合物的PH值?？刹捎玫钠渌山邮艿拿絼┖腿軇┌指?氏溶液(Ringer' s solution)和U. S. P。此外，無(wú)菌的不揮發(fā)性油常規(guī)用作溶劑或懸浮介 質(zhì)。出于此目的，可采用包括合成單酸甘油酯或二酸甘油酯在內(nèi)的任何無(wú)刺激性的不揮發(fā) 性油。此外，例如油酸等脂肪酸用于制備注射劑?？衫缤ㄟ^(guò)經(jīng)過(guò)細(xì)菌截留過(guò)濾器過(guò)濾或 者通過(guò)并入殺菌劑，將可注射調(diào)配物殺菌，呈無(wú)菌固體組合物形式，這些無(wú)菌固體組合物可在臨使用前溶解或分散于無(wú)菌水或其它無(wú)菌可注射介質(zhì)中。在一些實(shí)施例中，不經(jīng)腸組合物包含一種或一種以上肽、包含非離子型表面活性 劑的微脂粒和佐劑。在一些實(shí)施例中，佐劑為T(mén)LR-4激動(dòng)劑。在一些實(shí)施例中，佐劑可與微 脂?；旌?。在一些實(shí)施例中，佐劑可與微脂粒締合(例如通過(guò)將佐劑與一種或一種以上肽 和/或微脂粒組分在用以產(chǎn)生微脂粒的過(guò)程中合并)。組合物也可以通過(guò)鼻內(nèi)或通過(guò)吸入投予，且宜以干粉吸入物(dry powder inhaler)形式或在使用或不使用適合推進(jìn)劑(例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟 乙烷、氫氟烷、二氧化碳或其它適合的氣體)下從加壓容器、泵、噴霧器、霧化器或噴灑器產(chǎn) 生的氣霧劑噴霧呈現(xiàn)形式傳遞。在加壓氣霧劑的狀況下，單位劑量可通過(guò)提供閥傳遞計(jì)量 的量來(lái)確定。加壓容器、泵、噴霧器、霧化器或噴灑器可含有抗體的溶液或懸浮液，所述溶液 或懸浮液例如使用乙醇與推進(jìn)劑的混合物作為溶劑，且可另外含有潤(rùn)滑劑，例如脫水山梨 糖醇三油酸酯。用于吸入器或吹入器的膠囊及藥筒(例如由明膠制成)可經(jīng)調(diào)配，以含有 肽組合物與適合粉末基質(zhì)(例如乳糖或淀粉)的粉末混合物。供直腸投藥的組合物優(yōu)選是栓劑，其可通過(guò)將肽與適合的無(wú)刺激性賦形劑或載劑 (例如可可油、聚乙二醇或栓劑蠟)混合來(lái)制備，這些賦形劑或載劑在周?chē)鷾囟认率枪腆w但 在體溫下是液體，因此在直腸穹(rectal vault)中融化并釋放抗體。如所屬領(lǐng)域中已知， 也可使用保留灌腸和直腸導(dǎo)管。諸如羥丙基纖維素等粘度增強(qiáng)載劑也是供直腸投藥的某些 本發(fā)明載劑，因?yàn)槠溆兄诮M合物保留在直腸內(nèi)。一般說(shuō)來(lái)，所選擇的加入到組合物中的載 劑體積應(yīng)使組合物最大程度地保留。明確地說(shuō)，體積不應(yīng)大到危及所投組合物保留在直腸 穹中。VII.示范性組合物在一些實(shí)施例中，本發(fā)明提供的免疫原性組合物包括TLR-3激動(dòng)劑佐劑以及包含 非離子型表面活性劑和促進(jìn)類(lèi)脂質(zhì)分子傳輸穿過(guò)粘膜的傳輸增強(qiáng)劑的微脂粒。在一些實(shí)施 例中，所述組合物可經(jīng)口投予。在一些實(shí)施例中，TLR-3激動(dòng)劑佐劑包含poly (I: C)。在一 些實(shí)施例中，傳輸增強(qiáng)劑為膽汁酸、其衍生物或任何前述物質(zhì)的鹽(例如脫氧膽酸鈉)。在 一些實(shí)施例中，非離子型表面活性劑為甘油酯(例如1-單棕櫚?；视?。在一些實(shí)施例 中，微脂粒另外包含離子型兩性分子(例如二鯨蠟基磷酸酯)。在一些實(shí)施例中，微脂粒另 外包含類(lèi)固醇(例如膽固醇)。在一些實(shí)施例中，微脂粒包含1-單棕櫚酰基甘油、二鯨蠟基 磷酸酯、膽固醇和脫氧膽酸鈉。在一些實(shí)施例中，組合物另外包含明礬。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明提供的免疫原性組合物包括TLR-4激動(dòng)劑佐劑以及包含 非離子型表面活性劑的微脂粒。在一些實(shí)施例中，所述組合物可不經(jīng)腸投予(例如通過(guò)肌 肉內(nèi)注射)。在一些實(shí)施例中，TLR-4激動(dòng)劑佐劑包含單磷酰基脂質(zhì)A或3-脫?；鶈瘟柞?基脂質(zhì)A。在一些實(shí)施例中，非離子型表面活性劑為甘油酯(例如1-單棕櫚酰甘油)。在 一些實(shí)施例中，微脂粒另外包含離子型兩性分子(例如二鯨蠟基磷酸酯)。在一些實(shí)施例 中，微脂粒另外包含類(lèi)固醇(例如膽固醇)。在一些實(shí)施例中，微脂粒包含ι-單棕櫚?；?油、二鯨蠟基磷酸酯和膽固醇。在一些實(shí)施例中，組合物另外包含明礬。在一些實(shí)施例中，上述免疫原性組合物包括第一肽，其包含與SEQ ID NO. 16的 20-100個(gè)相鄰氨基酸具有至少80%同源性的區(qū)域，其中第一肽包括來(lái)自A型流行性感冒血 凝素蛋白質(zhì)的少于100個(gè)的相鄰氨基酸；第二肽，其包含SEQ ID NO. 17的氨基酸序列；第三
31肽，其包含與SEQ ID NO. 18的位置2_49或68-121的至少20個(gè)相鄰氨基酸具有至少80% 同源性的區(qū)域，其中第三肽包括來(lái)自B型流行性感冒血凝素蛋白質(zhì)的少于100個(gè)的相鄰氨 基酸；和第四肽，其包含SEQ ID NO. 14的氨基酸序列，其中第四肽包括來(lái)自A型流行性感冒 核蛋白的少于20個(gè)的相鄰氨基酸。在一些實(shí)施例中，第一肽包含SEQ ID NO. 6的至少40個(gè)相鄰氨基酸。在一些實(shí)施 例中，第一肽包含SEQ ID NO. 6的氨基酸1-88。在一些實(shí)施例中，第二肽包含SEQ ID NO. 11的氨基酸序列。在一實(shí)施例中，組合 物包含2n種各自包含SEQ ID NO. 11的不同氨基酸序列的不同第二肽，其中η = 1_4。在一 些實(shí)施例中，η = 4。在一些實(shí)施例中，第三肽包含與SEQ ID Ν0. 18的位置2_49或68-121的至少20個(gè) 相鄰氨基酸具有至少90%同源性的區(qū)域。在一些實(shí)施例中，第三肽包含與SEQ ID N0. 18的 位置2-49的至少20個(gè)相鄰氨基酸具有至少80%同源性的第一區(qū)域和與SEQ ID N0. 18的 位置68-121的至少20個(gè)相鄰氨基酸具有至少80%同源性的第二區(qū)域。在一些實(shí)施例中， 組合物包含兩種不同的第三肽，其中一者包含與SEQ ID N0. 18的位置2_49的至少20個(gè)相 鄰氨基酸具有至少80%同源性的區(qū)域，而另一者包含與SEQ ID N0. 18的位置68-121的至 少20個(gè)相鄰氨基酸具有至少80%同源性的區(qū)域。在一些實(shí)施例中，組合物包含兩種不同的 第三肽，其中一者包含SEQ ID N0. 12的氨基酸序列，而另一者包含SEQ ID N0. 13的氨基酸 序列。在一些實(shí)施例中，組合物包含2n種各自包含SEQ ID N0. 14的不同氨基酸序列的 不同第四肽，其中η = 1-4。在一些實(shí)施例中，η = 4。在一些實(shí)施例中，第一肽包含SEQ ID Ν0. 6的氨基酸1_88 ；組合物包含2n種各自 包含SEQ ID NO. 11的不同氨基酸序列的不同第二肽，其中η = 4 ；組合物包含兩種不同的 第三肽，其中一者包含SEQ ID Ν0. 12的氨基酸序列，而另一者包含SEQ ID N0. 13的氨基酸 序列；且組合物包含2m種各自包含SEQ ID N0. 14的不同氨基酸序列的不同第四肽，其中m =4。在一些實(shí)施例中，上述組合物用以治療患季節(jié)性流行性感冒或處于季節(jié)性流行性 感冒風(fēng)險(xiǎn)中的個(gè)體。在一些實(shí)施例中，上述組合物用以治療患有豬源性A(HlNl)型流行性感冒病毒所 引起的流行性感冒或處于此流行性感冒風(fēng)險(xiǎn)中的個(gè)體。實(shí)例以下實(shí)例描述制造和實(shí)踐本文所述的某些組合物和方法的一些示范性方式。應(yīng)了 解，所述實(shí)例僅僅是出于示范性的目的，且不欲限制本文所述的組合物和方法的范圍。實(shí)例1:肽合成本文所述的所有肽都通過(guò)固相肽合成(SPPQ來(lái)合成。一般說(shuō)來(lái)，C端氨基酸通過(guò) 與連接分子所形成的酸不穩(wěn)定鍵連接于交聯(lián)聚苯乙烯(或基于PEG)樹(shù)脂。此樹(shù)脂不溶于 合成所用的溶劑中，從而可相對(duì)簡(jiǎn)單且快速地沖洗掉過(guò)量的試劑和副產(chǎn)物。N端用在酸中穩(wěn) 定，但可通過(guò)堿來(lái)除去的Fmoc基團(tuán)保護(hù)。任何側(cè)鏈官能團(tuán)都用堿穩(wěn)定而酸不穩(wěn)定的基團(tuán)保 護(hù)。合成接著是基于將Ν-α上經(jīng)Fmoc保護(hù)的氨基酸并入生長(zhǎng)肽鏈中，其中鏈的一端仍然 連接于固相。
32
以下為一種用以制造本文所述肽的示范性SPPS法。為開(kāi)始各偶合，用含20%哌 啶的N，N-二甲基甲酰胺(DMF)除去NovaPEG樹(shù)脂結(jié)合的氨基酸/肽上的Fmoc基團(tuán)。接 著清洗，并加入經(jīng)保護(hù)的氨基酸，此氨基酸已在其α -羧基上經(jīng)四氟硼酸2-(1Η-苯并三 唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲活化。使經(jīng)活化的氨基酸和樹(shù)脂結(jié)合的氨基酸在堿存在下 反應(yīng)，形成新的肽鍵。雖然肽通過(guò)分步法合成，但諸如偶合試劑四氟硼酸2-(1Η-苯并三 唑-1-基)-1，1，3，3_四甲基脲(TBTU)、堿、二異丙基乙胺(DIPEA)和去阻斷劑哌啶等所有 可溶性試劑都可通過(guò)在各偶合步驟結(jié)束時(shí)過(guò)濾和清洗，從肽-固體支撐基質(zhì)中除去。重復(fù) 此過(guò)程，直到將所需的肽組裝在樹(shù)脂上為止。用含有至少85%三氟乙酸(TFA)的裂解溶液， 使肽從樹(shù)脂上裂解并脫除肽的保護(hù)基后，通過(guò)從乙醚中沉淀，接著離心來(lái)收集粗肽。接著通 過(guò)HPLC和質(zhì)譜分析純化和表征肽。如本文所述，某些肽組合物可包括單個(gè)肽序列的多個(gè)變異體(例如在相同序列中 的2個(gè)或2個(gè)以上位置具有2個(gè)或2個(gè)以上不同氨基酸)。雖然指定組中的各變異體可個(gè) 別合成，但通常適宜在單一合成中合成變異體子集或整組變異體。舉例來(lái)說(shuō)，此可使用分 開(kāi)-組合法實(shí)現(xiàn)。因此，如果此組變異體經(jīng)設(shè)計(jì)以在指定位置包括兩種不同氨基酸中的一 種，那么樹(shù)脂可分成兩個(gè)同等部分，且各部分可與兩種氨基酸中的一種偶合，形成兩種不同 的肽鏈。一旦偶合結(jié)束，即可將兩個(gè)部分重新組合，以便后來(lái)的氨基酸可加入兩鏈中?；蛘?， 可使用一鍋法，其中兩個(gè)替代性氨基酸加入同一反應(yīng)中。通常兩種氨基酸以等摩爾量加入； 然而，在某些情況下(例如在其各別反應(yīng)動(dòng)力學(xué)差異顯著的情況下)，優(yōu)選非等摩爾量。接 著可使用凱撒茚三酮試驗(yàn)監(jiān)測(cè)肽反應(yīng)是否結(jié)束。實(shí)例2 競(jìng)爭(zhēng)微量中和分析在本實(shí)例中，評(píng)估各種肽組合物結(jié)合流行性感冒中和抗體的能力。用伊斯科夫 改良杜爾貝科培養(yǎng)基(Iscove' s Modified Dulbecco' s Medium, IMDM)稀釋不同的肽 組合物(參見(jiàn)圖1和下表1-9)為SOyg/ml，且50μ1加入96孔平底微量滴定板(納克 (Nunc))中的不同孔中。適當(dāng)時(shí)，各肽組合物可包括所有變異體(例如表1中所示的8個(gè) INF-HA-3-V3肽變異體、表4中的4個(gè)INF-H1-4-V4肽變異體等)。用IMDM以1/40稀釋市 售抗流行性感冒血清和人類(lèi)血清，且50 μ 1加入各孔中，接著培養(yǎng)板在37°C下培育1小時(shí)。 將50 μ 1含1 X IO5個(gè)pfu流行性感冒病毒株威斯康星(A/Wis/67/05)或新喀里多尼亞(A/ NC/20/99)的IMDM加入各孔中，且培養(yǎng)板在37°C下再培育1小時(shí)。隨后，將5 X IO4個(gè)補(bǔ)充 有2%胎牛血清(FCS)的馬丁達(dá)比狗腎(MDCK)細(xì)胞加入各孔中。每個(gè)培養(yǎng)板都含有4個(gè) 細(xì)胞和4個(gè)病毒對(duì)照孔。培養(yǎng)板在37°C下培育18-22小時(shí)。每孔用50 μ 1 70%乙醇固定 細(xì)胞10分鐘，且在室溫下空氣干燥。用含有0. 05% Tween-20的PBS洗滌培養(yǎng)板5次，且 用10% FCS阻斷各孔。在4°C下90分鐘后，50 μ 1經(jīng)阻斷緩沖液以1/500稀釋的針對(duì)A型 流行性感冒核衣殼抗原的單克隆抗體(凱美空(Chemicon))加入各孔中。在4°C下再培育 1小時(shí)后，洗滌培養(yǎng)板5次，且在4°C下將100μ 1山羊抗小鼠IgG過(guò)氧化酶結(jié)合的親和力純 化的抗體(1/10，000)加入各孔中，歷時(shí)30分鐘。洗滌培養(yǎng)板5次，且通過(guò)100 μ 1鄰苯二 胺(0PD 密蘇里州(MO)圣路易斯市(St. Louise)的西格瑪(Sigma))顯影，并在20分鐘后 用INHCl停止酶反應(yīng)。通過(guò)ELISA板式讀數(shù)器(伯樂(lè)公司(Bio-Rad))在490nm波長(zhǎng)下測(cè) 量0D，來(lái)定量反應(yīng)。圖1中展示關(guān)于包含表1、2、3、4、5、6、7、8和9中肽的組合物的結(jié)果。如圖1中所示，市售或免疫血清的加入可抑制活體外細(xì)胞的流行性感冒病毒感染，可通過(guò)ELISA進(jìn)行光學(xué)密度(OD)測(cè)量來(lái)定量。因此，在免疫血清存在下約0.6的OD值 (參見(jiàn)病毒對(duì)照)減少至約0. 2 (參見(jiàn)病毒+血清對(duì)照)。用血清培育各種肽組合物可使肽 結(jié)合于血清中所存在的一些中和抗體，從而逆轉(zhuǎn)其中和活性(例如約0. 3或0. 3以上的OD 值)。表I-SEQ ID NO. 權(quán)利要求
1.一種免疫原性組合物，其包含第一肽，其包含與SEQ ID NO. 16的20-100個(gè)相鄰氨基酸具有至少80%同源性的區(qū)域， 其中所述第一肽包括來(lái)自A型流行性感冒血凝素蛋白質(zhì)的少于100個(gè)的相鄰氨基酸； 第二肽，其包含SEQ ID NO. 17的氨基酸序列；和第三肽，其包含與SEQ ID NO. 18的位置2-49或68-121的至少20個(gè)相鄰氨基酸具有至 少80%同源性的區(qū)域，其中所述第三肽包括來(lái)自B型流行性感冒血凝素蛋白質(zhì)的少于100 個(gè)的相鄰氨基酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述第一肽包含與SEQID NO. 16的20-100個(gè) 相鄰氨基酸具有至少90%同源性的區(qū)域。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述第一肽包含與SEQID NO. 16的20-100個(gè) 相鄰氨基酸具有至少95%同源性的區(qū)域。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述第一肽包含與SEQID N0. 16的20-50個(gè)相 鄰氨基酸具有至少80%同源性的區(qū)域。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述第一肽包含與SEQID N0. 16的50-100個(gè) 相鄰氨基酸具有至少80%同源性的區(qū)域。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述第一肽包含SEQID N0. 2的至少20個(gè)相鄰 氨基酸。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述第一肽包含SEQID N0. 3的至少20個(gè)相鄰氨基酸。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述第一肽包含SEQID N0. 4的至少20個(gè)相鄰氨基酸。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述第一肽包含SEQID N0. 5的至少20個(gè)相鄰氨基酸。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述組合物包含2n種各自包含SEQID N0. 2 的不同氨基酸序列的不同第一肽，其中η = 1-3。
11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述組合物包含2η種各自包含SEQID Ν0. 3 的不同氨基酸序列的不同第一肽，其中η = 1-3。
12.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述組合物包含2η種各自包含SEQID Ν0. 4 的不同氨基酸序列的不同第一肽，其中η = 1-2。
13.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述組合物包含2η種各自包含SEQID Ν0. 5 的不同氨基酸序列的不同第一肽，其中η = 1-3。
14.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述第一肽包含SEQID Ν0. 6的至少40個(gè)相 鄰氨基酸。
15.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述第一肽包含SEQID N0. 6的至少60個(gè)相鄰氨基酸。
16.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述第一肽包含SEQID N0. 6的至少80個(gè)相鄰氨基酸。
17.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述第一肽包含SEQID N0. 6的氨基酸1-81。
18.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述第一肽包含SEQID N0. 6的氨基酸82-88。
19.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述第一肽包含SEQID NO. 6的氨基酸1-88。
20.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述第一肽包含少于100個(gè)的氨基酸。
21.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述第二肽包含SEQID NO. 9的氨基酸序列。
22.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述第二肽包含SEQID NO. 10的氨基酸序列。
23.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述第二肽包含SEQID NO. 11的氨基酸序列。
24.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述組合物包含2n種各自包含SEQID NO. 9 的不同氨基酸序列的不同第二肽，其中η = 1-4。
25.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述組合物包含2η種各自包含SEQID NO. 10 的不同氨基酸序列的不同第二肽，其中η = 1-4。
26.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述組合物包含2η種各自包含SEQID NO. 11 的不同氨基酸序列的不同第二肽，其中η = 1-4。
27.根據(jù)權(quán)利要求M至沈中任一權(quán)利要求所述的組合物，其中η= 4。
28.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述第二肽包含少于30個(gè)的氨基酸。
29.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述第三肽包含與SEQID Ν0. 18的位置2_49 或68-121的至少20個(gè)相鄰氨基酸具有至少90%同源性的區(qū)域。
30.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述第三肽包含與SEQID N0. 18的位置2_49 或68-121的至少40個(gè)相鄰氨基酸具有至少80%同源性的區(qū)域。
31.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述第三肽包含與SEQID N0. 18的位置2_49 的至少20個(gè)相鄰氨基酸具有至少80%同源性的第一區(qū)域和與SEQ ID N0. 18的位置68-121 的至少20個(gè)相鄰氨基酸具有至少80%同源性的第二區(qū)域。
32.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述第三肽包含與SEQID N0. 8具有至少80% 同源性的區(qū)域。
33.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述第三肽包含與SEQID N0. 8具有至少90% 同源性的區(qū)域。
34.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述第三肽包含與SEQID N0. 8具有至少95% 同源性的區(qū)域。
35.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述組合物包含兩種不同的第三肽，其中一者 包含與SEQ ID N0. 18的位置2_49的至少20個(gè)相鄰氨基酸具有至少80%同源性的區(qū)域，而 另一者包含與SEQ ID N0. 18的位置68-121的至少20個(gè)相鄰氨基酸具有至少80%同源性 的區(qū)域。
36.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述第三肽包含少于100個(gè)的氨基酸。
37.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述組合物另外包含第四肽，其包含SEQ ID N0. 14的氨基酸序列，其中所述第四肽包括來(lái)自A型流行性感 冒核蛋白的少于20個(gè)的相鄰氨基酸。
38.根據(jù)權(quán)利要求37所述的組合物，其中所述組合物包含2n種各自包含SEQID N0. 14 的不同氨基酸序列的不同第四肽，其中η = 1-4。
39.根據(jù)權(quán)利要求38所述的組合物，其中η= 4。
40.根據(jù)權(quán)利要求37所述的組合物，其中所述第四肽包含少于30個(gè)的氨基酸。
41.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述組合物另外包含第四肽，其包含SEQ ID NO. 15的氨基酸序列，其中所述第四肽包括來(lái)自A型流行性感 冒核蛋白的少于20個(gè)的相鄰氨基酸。
42.根據(jù)權(quán)利要求41所述的組合物，其中所述組合物包含2n種各自包含SEQID NO. 15 的不同氨基酸序列的不同第四肽，其中η = 1-4。
43.根據(jù)權(quán)利要求42所述的組合物，其中η= 4。
44.根據(jù)權(quán)利要求41所述的組合物，其中所述第四肽包含少于30個(gè)的氨基酸。
45.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述第一肽包含與SEQID NO. 6具有至少80% 同源性的區(qū)域，所述第三肽包含與SEQ ID NO. 8具有至少80%同源性的區(qū)域，且所述組合物 包含2n種各自包含SEQ ID NO. 11的不同氨基酸序列的不同第二肽，其中η = 1_4。
46.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述第一肽包含與SEQID Ν0. 6具有至少90% 同源性的區(qū)域，所述第三肽包含與SEQ ID N0. 8具有至少90%同源性的區(qū)域，且所述組合物 包含2n種各自包含SEQ ID NO. 11的不同氨基酸序列的不同第二肽，其中η = 1_4。
47.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述第一肽包含與SEQID Ν0. 6具有至少95% 同源性的區(qū)域，所述第三肽包含與SEQ ID N0. 8具有至少95%同源性的區(qū)域，且所述組合物 包含2n種各自包含SEQ ID NO. 11的不同氨基酸序列的不同第二肽，其中η = 1_4。
48.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述第一肽包含SEQID Ν0. 6，所述第三肽包 含SEQ ID N0. 8，且所述組合物包含2n種各自包含SEQ ID NO. 11的不同氨基酸序列的不同 第二肽，其中η = 1-4。
49.根據(jù)權(quán)利要求45至48中任一權(quán)利要求所述的組合物，其中η= 4。
50.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述第一肽基本上由SEQID Ν0. 6組成，所述 第三肽基本上由SEQ ID N0. 8組成，且所述組合物包含2"種各自基本上由SEQID NO. 11的 不同氨基酸序列組成的不同第二肽，其中η = 1-4。
51.根據(jù)權(quán)利要求50所述的組合物，其中所述組合物另外包含2m種各自包含SEQ IDN0. 14的不同氨基酸序列的不同第四肽，其中m = 1_4。
52.根據(jù)權(quán)利要求51所述的組合物，其中η和/或m= 2。
53.根據(jù)權(quán)利要求51所述的組合物，其中η和/或m= 3。
54.根據(jù)權(quán)利要求51所述的組合物，其中η和/或m= 4。
55.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一權(quán)利要求所述的組合物，其中每個(gè)肽都具有免疫原性。
56.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一權(quán)利要求所述的組合物，其中至少一種肽另外包含具有 20個(gè)或20個(gè)以上來(lái)自非流行性感冒蛋白質(zhì)的相鄰氨基酸的區(qū)域。
57.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一權(quán)利要求所述的組合物，其中每個(gè)肽都另外包含具有20 個(gè)或20個(gè)以上來(lái)自非流行性感冒蛋白質(zhì)的相鄰氨基酸的區(qū)域。
58.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一權(quán)利要求所述的組合物，其中至少兩種肽存在于單個(gè)蛋 白質(zhì)內(nèi)。
59.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一權(quán)利要求所述的組合物，其中所述第一肽和所述第三肽 包含少于100個(gè)的氨基酸，且所述第二肽包含少于30個(gè)的氨基酸。
60.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一權(quán)利要求所述的組合物，其中所述組合物另外包含佐劑。
61.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一權(quán)利要求所述的組合物，其中所述佐劑為明礬(alum)。
62.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一權(quán)利要求所述的組合物，其中所述佐劑為具有佐劑活性的免疫活性皂苷部分，其來(lái)源于南美樹(shù)木智利皂莢樹(shù)(Quillaja Saponaria Molina)的樹(shù) 皮。
63.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一權(quán)利要求所述的組合物，其中所述佐劑為T(mén)LR-3激動(dòng)劑。
64.根據(jù)權(quán)利要求63所述的組合物，其中所述佐劑為聚核糖肌苷酸聚核糖胞苷酸。
65.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一權(quán)利要求所述的組合物，其中所述佐劑為T(mén)LR-4激動(dòng)劑。
66.根據(jù)權(quán)利要求65所述的組合物，其中所述佐劑含有單磷?；|(zhì)A或3-脫?；鶈?磷?；|(zhì)A。
67.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一權(quán)利要求所述的組合物，其中所述佐劑為T(mén)LR-7/8激動(dòng)劑。
68.根據(jù)權(quán)利要求67所述的組合物，其中所述佐劑為1-異丁基-IH-咪唑并[4，5-c] 喹啉-4-胺。
69.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一權(quán)利要求所述的組合物，其中至少一種肽與微脂粒締合。
70.根據(jù)權(quán)利要求69所述的組合物，其中所述微脂粒包含非離子型表面活性劑。
71.根據(jù)權(quán)利要求70所述的組合物，其中所述微脂粒包含甘油酯。
72.根據(jù)權(quán)利要求70所述的組合物，其中所述微脂粒包含二醇或甘油醚。
73.根據(jù)權(quán)利要求70所述的組合物，其中所述微脂粒包含促進(jìn)類(lèi)脂質(zhì)分子傳輸穿過(guò)粘 膜的傳輸增強(qiáng)劑。
74.根據(jù)權(quán)利要求73所述的組合物，其中所述微脂粒包含側(cè)鏈的C23碳原子攜帶羧酸 的膽固醇衍生物。
75.根據(jù)權(quán)利要求73所述的組合物，其中所述微脂粒包含膽酸、鵝脫氧膽酸或其鹽。
76.根據(jù)權(quán)利要求73所述的組合物，其中所述微脂粒包含甘氨膽酸、?；悄懰帷⒚撗跄?酸、熊脫氧膽酸或其鹽。
77.根據(jù)權(quán)利要求73所述的組合物，其中所述微脂粒包含酰氧化氨基酸或其鹽。
78.根據(jù)權(quán)利要求73所述的組合物，其中所述微脂粒包含含有C6_2(l烷?；蛳；?分的?；鈮A或其鹽。
79.根據(jù)權(quán)利要求73所述的組合物，其中所述微脂粒包含離子型表面活性劑。
80.根據(jù)權(quán)利要求73所述的組合物，其中所述微脂粒包含鏈烷酸或鏈烯酸。
81.根據(jù)權(quán)利要求73所述的組合物，其中所述微脂粒包含磷酸酯。
82.根據(jù)權(quán)利要求73所述的組合物，其中所述微脂粒包含二鯨蠟基磷酸酯、磷脂酸或 磷脂酰絲氨酸。
83.根據(jù)權(quán)利要求73所述的組合物，其中所述微脂粒包含硫酸單酯。
84.根據(jù)權(quán)利要求73所述的組合物，其中所述微脂粒包含鯨蠟基硫酸酯。
85.根據(jù)權(quán)利要求73所述的組合物，其中所述微脂粒包含類(lèi)固醇。
86.根據(jù)權(quán)利要求73所述的組合物，其中所述微脂粒包含膽固醇。
87.根據(jù)權(quán)利要求73所述的組合物，其中所述微脂粒的直徑在約IOnm至約IOym范圍內(nèi)。
88.根據(jù)權(quán)利要求73所述的組合物，其中所述微脂粒的直徑在約SOOnm至約1.5μπι范 圍內(nèi)。
89.根據(jù)權(quán)利要求73所述的組合物，其中至少一種肽囊封在所述微脂粒的水性核心內(nèi)。
90.一種免疫原性組合物，其包含包括與SEQ ID NO. 16的20-100個(gè)相鄰氨基酸具有至 少80%同源性的區(qū)域的肽，其中所述肽包括來(lái)自A型流行性感冒血凝素蛋白質(zhì)的少于100 個(gè)的相鄰氨基酸。
91.根據(jù)權(quán)利要求90所述的組合物，其中所述肽包含SEQID NO. 2的至少20個(gè)相鄰氨基酸。
92.根據(jù)權(quán)利要求90所述的組合物，其中所述肽包含SEQID NO. 3的至少20個(gè)相鄰氨基酸。
93.根據(jù)權(quán)利要求90所述的組合物，其中所述肽包含SEQID NO. 4的至少20個(gè)相鄰氨基酸。
94.根據(jù)權(quán)利要求90所述的組合物，其中所述肽包含SEQID NO. 5的至少20個(gè)相鄰氨基酸。
95.根據(jù)權(quán)利要求90所述的組合物，其中所述組合物包含2n種各自包含SEQID N0. 2 的不同氨基酸序列的不同肽，其中η = 1-3。
96.根據(jù)權(quán)利要求90所述的組合物，其中所述組合物包含2η種各自包含SEQID Ν0. 3 的不同氨基酸序列的不同肽，其中η = 1-3。
97.根據(jù)權(quán)利要求90所述的組合物，其中所述組合物包含2η種各自包含SEQID Ν0. 4 的不同氨基酸序列的不同肽，其中η = 1-2。
98.根據(jù)權(quán)利要求90所述的組合物，其中所述組合物包含2η種各自包含SEQID Ν0. 5 的不同氨基酸序列的不同肽，其中η = 1-3。
99.根據(jù)權(quán)利要求90所述的組合物，其中所述肽包含SEQID Ν0. 6的至少40個(gè)相鄰氨 基酸。
100.根據(jù)權(quán)利要求90所述的組合物，其中所述肽包含SEQID N0. 6的至少60個(gè)相鄰氨基酸。
101.根據(jù)權(quán)利要求90所述的組合物，其中所述肽包含SEQID N0. 6的至少80個(gè)相鄰氨基酸。
102.根據(jù)權(quán)利要求90所述的組合物，其中所述肽包含與SEQID N0. 6具有至少90% 同源性的區(qū)域。
103.根據(jù)權(quán)利要求90所述的組合物，其中所述肽包含與SEQID N0. 6具有至少95% 同源性的區(qū)域。
104.根據(jù)權(quán)利要求90所述的組合物，其中所述肽包含SEQID N0. 6的氨基酸1_81。
105.根據(jù)權(quán)利要求90所述的組合物，其中所述肽包含SEQID N0. 6的氨基酸82-88。
106.根據(jù)權(quán)利要求90所述的組合物，其中所述肽包含SEQID N0. 6。
107.根據(jù)權(quán)利要求90所述的組合物，其中所述肽基本上由SEQID N0. 6組成。
108.根據(jù)權(quán)利要求90所述的組合物，其中所述肽由SEQID N0. 6組成。
109.根據(jù)權(quán)利要求90所述的組合物，其中所述肽包含少于30個(gè)的氨基酸。
110.一種免疫原性組合物，其包含包括SEQ ID N0. 17的氨基酸序列的肽。
111.根據(jù)權(quán)利要求110所述的組合物，其中所述肽包含SEQID N0. 9的氨基酸序列。
112.根據(jù)權(quán)利要求110所述的組合物，其中所述肽包含SEQID NO. 10的氨基酸序列。
113.根據(jù)權(quán)利要求110所述的組合物，其中所述肽包含SEQID NO. 11的氨基酸序列。
114.根據(jù)權(quán)利要求110所述的組合物，其中所述組合物包含2n種各自包含SEQID NO. 9的不同氨基酸序列的不同肽，其中η = 1-4。
115.根據(jù)權(quán)利要求110所述的組合物，其中所述組合物包含2η種各自包含SEQID NO. 10的不同氨基酸序列的不同肽，其中η = 1-4。
116.根據(jù)權(quán)利要求110所述的組合物，其中所述組合物包含2η種各自包含SEQID NO. 11的不同氨基酸序列的不同肽，其中η = 1-4。
117.根據(jù)權(quán)利要求116所述的組合物，其中所述組合物包含2"種各自基本上由SEQID NO. 11的不同氨基酸序列組成的不同肽。
118.根據(jù)權(quán)利要求114至117中任一權(quán)利要求所述的組合物，其中η= 4。
119.根據(jù)權(quán)利要求110所述的組合物，其中所述肽包含少于30個(gè)的氨基酸。
120.一種免疫原性組合物，其包含包括與SEQ ID Ν0. 18的位置2_49或68-121的至少 20個(gè)相鄰氨基酸具有至少80%同源性的區(qū)域的肽，其中所述肽包括來(lái)自B型流行性感冒血 凝素蛋白質(zhì)的少于100個(gè)的相鄰氨基酸。
121.根據(jù)權(quán)利要求120所述的組合物，其中所述肽包含與SEQID N0. 18的位置2_49 或68-121的至少20個(gè)相鄰氨基酸具有至少90%同源性的區(qū)域。
122.根據(jù)權(quán)利要求120所述的組合物，其中所述肽包含與SEQID N0. 18的位置2_49 或68-121的至少40個(gè)相鄰氨基酸具有至少80%同源性的區(qū)域。
123.根據(jù)權(quán)利要求120所述的組合物，其中所述肽包含與SEQID N0. 18的位置2_49 的至少20個(gè)相鄰氨基酸具有至少80%同源性的第一區(qū)域和與SEQ ID N0. 18的位置68-121 的至少20個(gè)相鄰氨基酸具有至少80%同源性的第二區(qū)域。
124.根據(jù)權(quán)利要求120所述的組合物，其中所述肽包含與SEQID N0. 8具有至少80% 同源性的區(qū)域。
125.根據(jù)權(quán)利要求120所述的組合物，其中所述肽包含與SEQID N0. 8具有至少90% 同源性的區(qū)域。
126.根據(jù)權(quán)利要求120所述的組合物，其中所述肽包含與SEQID N0. 8具有至少95% 同源性的區(qū)域。
127.根據(jù)權(quán)利要求120所述的組合物，其中所述肽包含SEQID N0. 8。
128.根據(jù)權(quán)利要求120所述的組合物，其中所述肽基本上由SEQID N0. 8組成。
129.根據(jù)權(quán)利要求120所述的組合物，其中所述肽由SEQID N0. 8組成。
130.根據(jù)權(quán)利要求120所述的組合物，其中所述肽包含與SEQID N0. 18的位置2_49 的至少20個(gè)相鄰氨基酸具有至少80%同源性的區(qū)域，且所述組合物另外包含包括與SEQ ID N0. 18的位置68-121的至少20個(gè)相鄰氨基酸具有至少80%同源性的區(qū)域的不同肽。
131.根據(jù)權(quán)利要求120所述的組合物，其中所述肽包含少于100個(gè)的氨基酸。
132.—種免疫原性組合物，其包含包括SEQ ID N0. 14的氨基酸序列的肽，其中所述肽 包括來(lái)自A型流行性感冒核蛋白的少于20個(gè)的相鄰氨基酸。
133.根據(jù)權(quán)利要求132所述的組合物，其中所述組合物包含2n種各自包含SEQID N0. 14的不同氨基酸序列的不同肽，其中η = 1-4。
134.根據(jù)權(quán)利要求133所述的組合物，其中η= 4。
135.根據(jù)權(quán)利要求132所述的組合物，其中所述肽包含少于30個(gè)的氨基酸。
136.一種免疫原性組合物，其包含包括SEQ ID NO. 15的氨基酸序列的肽，其中所述肽 包括來(lái)自A型流行性感冒核蛋白的少于20個(gè)的相鄰氨基酸。
137.根據(jù)權(quán)利要求136所述的組合物，其中所述組合物包含2n種各自包含SEQID NO. 15的不同氨基酸序列的不同肽，其中η = 1-4。
138.根據(jù)權(quán)利要求137所述的組合物，其中η= 4。
139.根據(jù)權(quán)利要求136所述的組合物，其中所述肽包含少于30個(gè)的氨基酸。
140.—種免疫原性組合物，其包含包括SEQ ID NO. 1的氨基酸序列的肽。
141.根據(jù)權(quán)利要求140所述的組合物，其中所述組合物包含2n種各自包含SEQID NO. 1的不同氨基酸序列的不同肽，其中η = 1-4。
142.根據(jù)權(quán)利要求141所述的組合物，其中η= 4。
143.根據(jù)權(quán)利要求140所述的組合物，其中所述肽包含少于30個(gè)的氨基酸。
144.一種免疫原性組合物，其包含包括與SEQ ID NO. 7的至少20個(gè)相鄰氨基酸具有至 少80%同源性的區(qū)域的肽，其中所述肽包括來(lái)自A型流行性感冒血凝素蛋白質(zhì)的少于100 個(gè)的相鄰氨基酸。
145.根據(jù)權(quán)利要求144所述的組合物，其中所述區(qū)域與SEQID N0. 7的區(qū)域具有至少 90%同源性。
146.根據(jù)權(quán)利要求144所述的組合物，其中所述區(qū)域與SEQID N0. 7的區(qū)域具有至少 95%同源性。
147.根據(jù)權(quán)利要求144所述的組合物，其中所述肽包含SEQID N0. 7的至少40個(gè)相鄰氨基酸。
148.根據(jù)權(quán)利要求144所述的組合物，其中所述肽包含SEQID N0. 7的至少60個(gè)相鄰氨基酸。
149.根據(jù)權(quán)利要求144所述的組合物，其中所述肽包含SEQID N0. 7的至少80個(gè)相鄰氨基酸。
150.根據(jù)權(quán)利要求144所述的組合物，其中所述肽包含SEQID N0. 7。
151.根據(jù)權(quán)利要求144所述的組合物，其中所述肽基本上由SEQID N0. 7組成。
152.根據(jù)權(quán)利要求144所述的組合物，其中所述肽由SEQID N0. 7組成。
153.根據(jù)權(quán)利要求144所述的組合物，其中所述肽包含少于100個(gè)的氨基酸。
154.一種治療患流行性感冒或處于流行性感冒風(fēng)險(xiǎn)中的個(gè)體的方法，所述方法包含向 所述個(gè)體投予治療有效量的根據(jù)前述權(quán)利要求中任一權(quán)利要求所述的組合物。
155.根據(jù)權(quán)利要求巧4所述的組合物，其中所述組合物經(jīng)口投予。
156.根據(jù)權(quán)利要求IM所述的組合物，其中所述組合物不經(jīng)腸投予。
157.根據(jù)權(quán)利要求IM所述的組合物，其中所述組合物通過(guò)肌肉內(nèi)注射投予。
158.根據(jù)權(quán)利要求IM所述的組合物，其中所述組合物經(jīng)鼻內(nèi)或通過(guò)吸入投予。
159.根據(jù)權(quán)利要求IM所述的組合物，其中所述組合物經(jīng)直腸投予。
160.根據(jù)權(quán)利要求IM所述的組合物，其中所述個(gè)體患季節(jié)性流行性感冒或處于季節(jié) 性流行性感冒風(fēng)險(xiǎn)中。
161.根據(jù)權(quán)利要求IM所述的組合物，其中所述個(gè)體患有豬源性A(HlNl)型流行性感冒病毒所引起的流行性感冒或處于所述流行性感冒風(fēng)險(xiǎn)中。
162.一種免疫原性組合物，其包含TLR-3激動(dòng)劑佐劑；微脂粒，其包含非離子型表面活性劑和促進(jìn)類(lèi)脂質(zhì)分子傳輸穿過(guò)粘膜的傳輸增強(qiáng)劑；第一肽，其包含與SEQ ID NO. 16的20-100個(gè)相鄰氨基酸具有至少80%同源性的區(qū)域， 其中所述第一肽包括來(lái)自A型流行性感冒血凝素蛋白質(zhì)的少于100個(gè)的相鄰氨基酸；第二肽，其包含SEQ ID NO. 17的氨基酸序列；第三肽，其包含與SEQ ID NO. 18的位置2-49或68-121的至少20個(gè)相鄰氨基酸具有至 少80%同源性的區(qū)域，其中所述第三肽包括來(lái)自B型流行性感冒血凝素蛋白質(zhì)的少于100 個(gè)的相鄰氨基酸；和第四肽，其包含SEQ ID NO. 14的氨基酸序列，其中所述第四肽包括來(lái)自A型流行性感 冒核蛋白的少于20個(gè)的相鄰氨基酸。
163.根據(jù)權(quán)利要求162所述的組合物，其中所述TLR-3激動(dòng)劑佐劑包含poly(I:C)。
164.根據(jù)權(quán)利要求162至163中任一權(quán)利要求所述的組合物，其中所述傳輸增強(qiáng)劑為 膽汁酸、其衍生物或任何前述物質(zhì)的鹽。
165.根據(jù)權(quán)利要求164所述的組合物，其中所述傳輸增強(qiáng)劑為脫氧膽酸鈉。
166.根據(jù)權(quán)利要求162至165中任一權(quán)利要求所述的組合物，其中所述非離子型表面 活性劑為甘油酯。
167.根據(jù)權(quán)利要求166所述的組合物，其中所述非離子型表面活性劑為1-單棕櫚?；?甘油。
168.根據(jù)權(quán)利要求162至167中任一權(quán)利要求所述的組合物，其中所述微脂粒另外包 含離子型兩性分子。
169.根據(jù)權(quán)利要求168所述的組合物，其中所述離子型兩性分子為二鯨蠟基磷酸酯。
170.根據(jù)權(quán)利要求162至169中任一權(quán)利要求所述的組合物，其中所述微脂粒另外包含類(lèi)固醇。
171.根據(jù)權(quán)利要求170所述的組合物，其中所述類(lèi)固醇為膽固醇。
172.根據(jù)權(quán)利要求162所述的組合物，其中所述微脂粒包含1-單棕櫚?；视?、二鯨 蠟基磷酸酯、膽固醇和脫氧膽酸鈉。
173.根據(jù)權(quán)利要求162至172中任一權(quán)利要求所述的組合物，其中所述組合物另外包 含明礬。
174.一種治療患流行性感冒或處于流行性感冒風(fēng)險(xiǎn)中的個(gè)體的方法，所述方法包含向 所述個(gè)體經(jīng)口投予治療有效量的根據(jù)權(quán)利要求162至173中任一權(quán)利要求所述的組合物。
175.一種免疫原性組合物，其包含TLR-4激動(dòng)劑佐劑；微脂粒，其包含非離子型表面活性劑；第一肽，其包含與SEQ ID NO. 16的20-100個(gè)相鄰氨基酸具有至少80%同源性的區(qū)域， 其中所述第一肽包括來(lái)自A型流行性感冒血凝素蛋白質(zhì)的少于100個(gè)的相鄰氨基酸；第二肽，其包含SEQ ID N0. 17的氨基酸序列；第三肽，其包含與SEQ ID N0. 18的位置2-49或68-121的至少20個(gè)相鄰氨基酸具有至少80%同源性的區(qū)域，其中所述第三肽包括來(lái)自B型流行性感冒血凝素蛋白質(zhì)的少于100 個(gè)的相鄰氨基酸；和第四肽，其包含SEQ ID NO. 14的氨基酸序列，其中所述第四肽包括來(lái)自A型流行性感 冒核蛋白的少于20個(gè)的相鄰氨基酸。
176.根據(jù)權(quán)利要求175所述的組合物，其中所述TLR-4激動(dòng)劑佐劑包含單磷?；|(zhì) A或3-脫酰基單磷?；|(zhì)A。
177.根據(jù)權(quán)利要求175至176中任一權(quán)利要求所述的組合物，其中所述非離子型表面 活性劑為甘油酯。
178.根據(jù)權(quán)利要求177所述的組合物，其中所述非離子型表面活性劑為1-單棕櫚酰基 甘油。
179.根據(jù)權(quán)利要求175至178中任一權(quán)利要求所述的組合物，其中所述微脂粒另外包 含離子型兩性分子。
180.根據(jù)權(quán)利要求179所述的組合物，其中所述離子型兩性分子為二鯨蠟基磷酸酯。
181.根據(jù)權(quán)利要求175至180中任一權(quán)利要求所述的組合物，其中所述微脂粒另外包含類(lèi)固醇。
182.根據(jù)權(quán)利要求181所述的組合物，其中所述類(lèi)固醇為膽固醇。
183.根據(jù)權(quán)利要求175所述的組合物，其中所述微脂粒包含1-單棕櫚?；视汀⒍L 蠟基磷酸酯、膽固醇和脫氧膽酸鈉。
184.根據(jù)權(quán)利要求175至183中任一權(quán)利要求所述的組合物，其中所述組合物另外包 含明礬。
185.—種治療患有流行性感冒或處于流行性感冒風(fēng)險(xiǎn)中的個(gè)體的方法，所述方法包含 向所述個(gè)體不經(jīng)腸投予治療有效量的根據(jù)權(quán)利要求175至184中任一權(quán)利要求所述的組合 物。
186.根據(jù)權(quán)利要求185所述的組合物，其中所述組合物通過(guò)肌肉內(nèi)注射投予。
187.根據(jù)權(quán)利要求162至173或175至184中任一權(quán)利要求所述的組合物，其中所述 第一肽包含SEQ ID NO. 6的至少40個(gè)相鄰氨基酸。
188.根據(jù)權(quán)利要求162至173或175至184中任一權(quán)利要求所述的組合物，其中所述 第一肽包含SEQ ID NO. 6的氨基酸1-88。
189.根據(jù)權(quán)利要求162至173或175至184中任一權(quán)利要求所述的組合物，其中所述 第二肽包含SEQ ID NO. 11的氨基酸序列。
190.根據(jù)權(quán)利要求162至173或175至184中任一權(quán)利要求所述的組合物，其中所述 組合物包含2n種各自包含SEQ ID NO. 11的不同氨基酸序列的不同第二肽，其中η = 1_4。
191.根據(jù)權(quán)利要求190所述的組合物，其中η= 4。
192.根據(jù)權(quán)利要求162至173或175至184中任一權(quán)利要求所述的組合物，其中所述 第三肽包含與SEQ ID Ν0. 18的位置2_49或68-121的至少20個(gè)相鄰氨基酸具有至少90% 同源性的區(qū)域。
193.根據(jù)權(quán)利要求162至173或175至184中任一權(quán)利要求所述的組合物，其中所述 第三肽包含與SEQ ID N0. 18的位置2_49的至少20個(gè)相鄰氨基酸具有至少80%同源性的 第一區(qū)域和與SEQ ID N0. 18的位置68-121的至少20個(gè)相鄰氨基酸具有至少80%同源性的第二區(qū)域。
194.根據(jù)權(quán)利要求162至173或175至184中任一權(quán)利要求所述的組合物，其中所述 組合物包含兩種不同的第三肽，其中一者包含與SEQ ID NO. 18的位置2_49的至少20個(gè)相 鄰氨基酸具有至少80%同源性的區(qū)域，而另一者包含與SEQ ID NO. 18的位置68-121的至 少20個(gè)相鄰氨基酸具有至少80%同源性的區(qū)域。
195.根據(jù)權(quán)利要求162至173或175至184中任一權(quán)利要求所述的組合物，其中所述 組合物包含兩種不同的第三肽，其中一者包含SEQ ID NO. 12的氨基酸序列，而另一者包含 SEQ ID NO. 13的氨基酸序列。
196.根據(jù)權(quán)利要求162至173或175至184中任一權(quán)利要求所述的組合物，其中所述 組合物包含2n種各自包含SEQ ID NO. 14的不同氨基酸序列的不同第四肽，其中η = 1_4。
197.根據(jù)權(quán)利要求196所述的組合物，其中η= 4。
198.根據(jù)權(quán)利要求162至173或175至184中任一權(quán)利要求所述的組合物，其中所述第一肽包含SEQ ID Ν0. 6的氨基酸1-88 ；所述組合物包含2n種各自包含SEQ ID NO. 11的不同氨基酸序列的不同第二肽，其中η =4 ；所述組合物包含兩種不同的第三肽，其中一者包含SEQ ID Ν0. 12的氨基酸序列，而另 一者包含SEQ ID N0. 13的氨基酸序列；且所述組合物包含2m種各自包含SEQ ID N0. 14的不同氨基酸序列的不同第四肽，其中m =4。
全文摘要
本申請(qǐng)案提供可用于治療流行性感冒的組合物和方法。如本文所述，所述組合物和方法是基于對(duì)流行性感冒顯示免疫原性的肽和肽組合的研制。在一些實(shí)施例中，所述肽組合誘發(fā)針對(duì)多個(gè)流行性感冒病毒株(例如季節(jié)性流行性感冒病毒株或甚至新的豬源性A(H1N1)型大流行性感冒病毒)的保護(hù)性反應(yīng)。
文檔編號(hào)A61K38/03GK102123724SQ200980132130
公開(kāi)日2011年7月13日 申請(qǐng)日期2009年6月19日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月19日
發(fā)明者喬斯·V·托里斯, 安德烈·奧格雷爾, 弗朗西斯科·迪亞茲-米托馬, 戴維·E·安德森 申請(qǐng)人:變異生技公司