專利名稱：：具有生物活性的膠原基復(fù)合角膜替代物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種具有生物活性的復(fù)合角膜替代物及其制備方法，屬于組織工程領(lǐng)域中的角膜移植材料技術(shù)。
背景技術(shù)：
：角膜病是一種發(fā)病率高、治療困難的致盲性眼病。目前，角膜病的治療方法主要以角膜移植為主，但是角膜供體來源的匱乏及術(shù)后的高排斥率限制了角膜移植的臨床應(yīng)用。所以，研究者們就開始嘗試用角膜替代物來幫助角膜患者恢復(fù)視力。從1859年，Heusser首次實施對人的人工角膜植入術(shù)至今，人工角膜的發(fā)展已經(jīng)有一百多年的歷史，聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、硅橡膠、聚甲基丙烯酸羥乙酯(PHEMA)以及氟碳多聚體均被成功地用做角膜替代物的材料。早期的人工角膜材料均為合成材料，其生物相容性差，不利于細(xì)胞粘附和增殖。因此，這些合成材料不能完全地替代角膜組織。近年來，許多研究者開始在體外重建組織工程人工角膜。組織工程角膜是利用生物材料作為活細(xì)胞培養(yǎng)的支架，構(gòu)建組織以替代供體角膜。通過組織工程重建組織的必需要素是支架材料和種子細(xì)胞。目前制約組織工程化角膜替代物發(fā)展的瓶頸是載體的構(gòu)建，理想的組織工程支架材料應(yīng)具備以下性能①良好的生物相容性，具有適合細(xì)胞生長和黏附的微環(huán)境；②可制備成三維立體結(jié)構(gòu)，具有多孔性和高孔隙率，有利于細(xì)胞的貼附和長入；③生物可降解性，材料在組織形成過程中逐漸降解，而不影響新生組織的結(jié)構(gòu)和功能；④便于加工成所需的形狀，并有一定的機(jī)械強(qiáng)度。從査閱文獻(xiàn)來看，膠原基角膜替代物在上述性能中顯示出其優(yōu)勢。I型膠原占角膜干重的75%，是天然細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的成分，具有特異分子識別信號，可調(diào)控細(xì)胞行為，介導(dǎo)種子細(xì)胞的黏附和增長。1999年加拿大Griffith等以0.020.04。/。戊二醛交聯(lián)I型膠原和硫酸軟骨素復(fù)合材料，進(jìn)行角膜細(xì)胞的三維培養(yǎng)，得到形態(tài)、透明性與正常人角膜相似的替代物。最近幾年，Griffith研究組[LiuY,GanL,CarlssonDJ.,WatskyMA.，MungerR，HodgeWG.:PriestD,GriffithM.ASimple,Cross-linkedCollagenTissueSubstituteforCornealImplantation.InvestigativeOphthalmology&VisualScience.2006,47(5):1869-75.]又成功制備了EDC和NHS交聯(lián)的膠原基角膜替代物。目前己成功用于兔、豬的深板層移植，術(shù)后一年顯示上皮細(xì)胞的重建，且觀察到角膜神經(jīng)的再生。但是，對于圓錐形角膜、酸堿燒傷角膜、糖尿病性角膜等金屬基質(zhì)蛋白酶或膠原酶分泌過高的情況，單純EDC和NHS交聯(lián)的膠原角膜替代物降解會更快，無法完成最終的修復(fù)目的。在后續(xù)工作中，Liu等[LiuW,DengC,McLaughlinCR,etal.Collagen-phosphorylcholineinterpenetratingnetworkhydrogelsascornealsubstitutes.Biomaterials.2009,30(8):1551-1559]將EDC和NHS交聯(lián)的膠原與聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA)交聯(lián)的2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰膽堿(MPC)形成互穿聚合物網(wǎng)絡(luò)(IPN)凝膠，MPC聚合物網(wǎng)絡(luò)的引入明顯提高了IPN凝膠在膠原酶中的穩(wěn)定性。一年以上的小型豬角膜移植同樣顯示滿意的修復(fù)效果。但是所用的MPC極易吸潮，且容易水解。研究表明，甜菜堿型兩性電解質(zhì)除了上述的磷酸型之外，還有羧酸型和磺酸型兩種，我們研究組使用的3-(甲基丙烯酰胺)丙基-二甲基(3-磺丙)胺(MPDSAH)屬于磺酸型兩性電解質(zhì)，其生物相容性良好，它與MPC都具有抑制非特異性蛋白吸附的性能，但MPDSAH結(jié)構(gòu)和性質(zhì)較MPC穩(wěn)定，因此我們將構(gòu)建膠原和MPDSAH互穿聚合物網(wǎng)絡(luò)角膜替代物，以改進(jìn)MPC易吸潮水解的不足，同時包覆一定濃度的生長因子，構(gòu)建具有生物活性的復(fù)合角膜替代物，以促進(jìn)角膜的愈合。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種具有生物活性的復(fù)合角膜替代物及其制備方法，該角膜替代物與人眼組織具有良好的生物相容性，性能良好，在膠原酶中降解緩慢，可以促進(jìn)角膜上皮細(xì)胞和基質(zhì)膠原生成，且可以長期保存和運輸，制備方法簡單。本發(fā)明的另一個目的在于提供一種負(fù)載生長因子的具有生物活性的復(fù)合角膜替代物，可以克服以前角膜替代物難于保存的缺點，提供了一種長期保存角膜替代物的簡單方法。本發(fā)明提供的一種具有生物活性的復(fù)合角膜替代物主要是以膠原、3-(甲基丙烯酰胺)丙基-二甲基(3-磺丙)胺(MPDSAH)為原料，以水為溶劑，以碳二亞胺(EDC)為交聯(lián)劑對膠原進(jìn)行交聯(lián)，聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA)(平均分子量為575)為交聯(lián)劑，室溫下對MPDSAH進(jìn)行交聯(lián)，以Irgacure2959為光引發(fā)劑進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物再經(jīng)過澆注成膜加工工藝制備而成，其組成和配比EDC與膠原(以膠原分子上氨基數(shù)目計)的摩爾比為0.3-3.0:1;EDC與NHS的摩爾比為1:1;PEGDA與MPDSAH的質(zhì)量比為0.2-0.5:1;光引發(fā)劑Irgacure2959與MPDSAH的摩爾比為0.01-0.10:1。所述的膠原為豬皮I型膠原、重組人I型膠原或重組人III型膠原。本發(fā)明提供的一種包覆生長因子的具有生物活性的復(fù)合角膜替代物是上述的復(fù)合角膜替代物包覆生長因子組成，每毫克凍干復(fù)合角膜替代物包覆0.10.9ng的生長因子。本發(fā)明提供的具有生物活性的復(fù)合角膜替代物的制備方法包括以下步驟1)按計量將13.7%的膠原水溶液、80%-90%的MPDSAH水溶液、20%-30%的EDC和NHS等物質(zhì)的量水溶液與引發(fā)劑Irgacure2959的無水乙醇溶液均勻混合反應(yīng)，用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH為5.5;2)將混合反應(yīng)溶液澆注到模具內(nèi)，再放入夾具中夾緊固定，于紫外固化箱中固化40min，取出后室溫反應(yīng)16h，再移入37'C的烘箱內(nèi)熟化5h;3)去除夾具，打開模具取出角膜樣品放入p^7.4的磷酸鹽緩沖液(PBS)中浸泡，每隔12h更換新鮮的PBS，清洗7天后，將樣品放入含有P/。氯仿的pH^.4的PBS中，于4。C下保存?zhèn)溆谩Ｋ龅呢?fù)載生長因子的具有生物活性的復(fù)合角膜替代物的制備方法包括以下步驟1)按計量將權(quán)利要求1或2所述的復(fù)合角膜替代物冷凍干燥后浸入在500pl-l(^g/ml生長因子溶液中，4"C下放置34天，以保證角膜完全恢復(fù)形變；2)取負(fù)載生長因子的復(fù)合角膜替代物，放入37r的pH-7.4PBS中，每24h將釋放液取出，同時補(bǔ)充新鮮的PBS，收集的釋放液在冰箱凍存，以備后期測定釋放的生長因子濃度。所述的生長因子是神經(jīng)生長因子、表皮細(xì)胞生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子和成纖維細(xì)胞生長因子。本發(fā)明的復(fù)合角膜替代物與現(xiàn)有的產(chǎn)品和技術(shù)相比具有如下的優(yōu)點(1)本發(fā)明構(gòu)建的復(fù)合角膜替代物具有良好的生物安全性，能夠促進(jìn)角膜細(xì)胞在其上生長繁殖，并隨角膜的再生而做順應(yīng)性降解；(2)MPDSAH聚合物網(wǎng)絡(luò)的引入明顯提高了IPN凝膠在膠原酶中的穩(wěn)定性及其角膜替代物的力學(xué)強(qiáng)度；(3)本發(fā)明制備的角膜替代物具有與人角膜相似的力學(xué)性能、光學(xué)性能，制作方法簡單，易于加工處理；(4)本發(fā)明制備的角膜替代物，凍干后為白色海綿狀，具有三維多孔結(jié)構(gòu)，易于吸附各種生長因子，可以長期保存，使用時吸水膨脹即可恢復(fù)角膜形狀；(5)本發(fā)明制備的角膜替代物通過復(fù)合生長因子，促進(jìn)角膜上皮細(xì)胞再生及基質(zhì)膠原的生成，加快神經(jīng)生長速度，最終可形成與正常角膜相似的結(jié)構(gòu)。本發(fā)明制備的復(fù)合角膜替代物具有與人眼角膜相似的特征，組織相容性好，可誘導(dǎo)和促進(jìn)角膜再生，可隨角膜再生而生物降解，角膜細(xì)胞生長因子的引入可以促進(jìn)自體生長因子的富集，維持角膜的健康，減少術(shù)后并發(fā)癥的出現(xiàn)，同時本發(fā)明為我們提供了角膜替代物長期保存的方法。圖1為本發(fā)明制備的角膜替代物外觀照片。圖2為本發(fā)明制備的凍干角膜替代物外觀照片。圖3為本發(fā)明制備的凍干角膜替代物吸水恢復(fù)形變后的照片。圖4為本發(fā)明制備的角膜替代物力學(xué)性能(A)拉伸強(qiáng)度，(B)楊氏模量，(C)斷裂伸長率圖5為本發(fā)明實施例1-5制備的角膜替代物在膠原酶中的降解曲線。具體實施方式實施例1:本生物活性復(fù)合角膜替代物各組分比例如下-豬皮I型膠原MPDSAH(質(zhì)量比)3:1MPDSAH:PEGDA(質(zhì)量比)2:1膠原EDC:NHS(摩爾比)1:1:1用上述各組分制備本生物活性復(fù)合角膜替代物的步驟如下(1)復(fù)合角膜替代物的制備取0.5gl3.7。/。的豬皮I型膠原溶液到注射器內(nèi)，并通過T型容器連接另一注射器密封；取與膠原質(zhì)量比為1:3的MPDSAH溶于水中，用微量注射器通過密封墊移入T型容器內(nèi)，反復(fù)推拉混合均勻，然后用微量注射器依次注入交聯(lián)劑EDC、NHS和光引發(fā)劑Irgacure2959，其中EDC:NHS:膠原=1:1:1(摩爾比)，引發(fā)劑Irgacure2959:MPDSAH=1:25(摩爾比)，反復(fù)推拉混合均勻，然后加入適量2mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH在5.5左右?；旌暇鶆蚝髮⑷芤簼沧⒌侥＞邇?nèi)，再放入夾具中夾緊固定，于紫外固化箱中固化40min，取出后室溫反應(yīng)16h，再移入37°C的烘箱內(nèi)熟化5h。去除夾具，打開模具去除角膜樣品，放入20ml磷酸鹽緩沖液(PBS，pH=7.4)中浸泡，每隔12h更換新鮮的PBS，清洗7天后，將樣品放入含有P/。氯仿的PBS溶液中，于4'C下保存?zhèn)溆?。制得的?fù)合角膜替代物厚500(im，直徑12mra。按相同步驟制備片狀角膜替代物樣品，進(jìn)行力學(xué)性能、光學(xué)性能、酶降解性能的測試。此角膜替代物樣品命名為IPN3-1。(2)負(fù)載生長因子的復(fù)合角膜替代物的制備及其生長因子的緩釋將上述復(fù)合角膜冷凍干燥，然后取完整的一片浸入到500W-10|ug/ml的神經(jīng)生長因子溶液中，4。C下保存3-4天，以保證角膜完全恢復(fù)形變。改變生長因子溶液的濃度制得生長因子含量不同的復(fù)合角膜樣品。取負(fù)載生長因子的復(fù)合角膜替代物，放入37X:的p^7.4的PBS中，每24h將釋放液取出，同時補(bǔ)充新鮮的PBS。收集的釋放液在冰箱凍存，以備后期測定釋放的生長因子濃度。實施例2:本生物活性的復(fù)合角膜替代物各組分比例如下豬皮I型膠原MPDSAH(質(zhì)量比)2:1MPDSAH:PEGDA(質(zhì)量比)2:1膠原EDC:NHS(摩爾比)1:1:1用上述各組分制備本生物活性復(fù)合角膜替代物的步驟如下(1)復(fù)合角膜替代物的制備取0.5gl3.7。/。的豬皮I型膠原溶液到注射器內(nèi)，并通過T型容器連接另一注射器密封；取與膠原質(zhì)量比為1:2的MPDSAH溶于水中，用微量注射器通過密封墊移入T型容器內(nèi)，反復(fù)推拉混合均勻，然后用微量注射器依次注入交聯(lián)劑EDC、NHS和光引發(fā)劑Irgacure2959，其中EDC:NHS:膠原=1:1:1(摩爾比)，引發(fā)劑Irgacure2959:MPDSAH=h25(摩爾比)，反復(fù)推拉混合均勻，然后加入適量2mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH在5.5左右?；旌暇鶆蚝髮⑷芤簼沧⒌侥＞邇?nèi)，再放入夾具中夾緊固定，于紫外固化箱中固化40min，取出后室溫反應(yīng)16h，再移入37°C的烘箱內(nèi)熟化5h。去除夾具，打開模具去除角膜樣品，放入20ml磷酸鹽緩沖液(PBS，pH=7.4)中浸泡，每隔12h更換新鮮的PBS，清洗7天后，將樣品放入含有1。/。氯仿的PBS溶液中，于4'C下保存?zhèn)溆?。制得的?fù)合角膜替代物厚50(Hrni，直徑12mm。按相同步驟制備片狀角膜替代物樣品，進(jìn)行力學(xué)性能、光學(xué)性能、酶降解性能的測試。此角膜替代物樣品命名為IPN2-1。(2)負(fù)載生長因子的復(fù)合角膜替代物的制備及其生長因子的緩釋將上述復(fù)合角膜冷凍干燥，然后取完整的一片浸入到500nl-10pg/ml的神經(jīng)生長因子溶液中，4'C下保存3-4天，以保證角膜完全恢復(fù)形變。改變生長因子溶液的濃度制得生長因子含量不同的復(fù)合角膜樣品。取負(fù)載生長因子的復(fù)合角膜替代物，放入37'C的raS(pH=7.4)中，每24h將釋放液取出，同時補(bǔ)充新鮮的PBS。收集的釋放液在冰箱凍存，以備后期測定釋放的生長因子濃度。實施例3:本生物活性的復(fù)合角膜替代物各組分比例如下豬皮I型膠原MPDSAH(質(zhì)量比)1:1MPDSAH:PEGDA(質(zhì)量比)2:1膠原EDC:NHS(摩爾比)1:1:1用上述各組分制備本生物活性復(fù)合角膜替代物的步驟如下(1)復(fù)合角膜替代物的制備取0.5gl3.7M的豬皮I型膠原溶液到注射器內(nèi)，并通過T型容器連接另一注射器密封；取與膠原質(zhì)量比為1:1的MPDSAH溶于水中，用微量注射器通過密封墊移入T型容器內(nèi)，反復(fù)推拉混合均勻，然后用微量注射器依次注入交聯(lián)劑EDC、NHS和光引發(fā)劑Irgacure2959，其中EDC:NHS:膠原=1:1:1(摩爾比)，引發(fā)劑Irgacure2959:MPDSAHN1:25(摩爾比)，反復(fù)推拉混合均勻，然后加入適量2mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH在5.5左右?；旌暇鶆蚝髮⑷芤簼沧⒌侥＞邇?nèi)，再放入夾具中夾緊固定，于紫外固化箱中固化40min，取出后室溫反應(yīng)16h，再移入37'C的烘箱內(nèi)熟化5h。去除夾具，打開模具去除角膜樣品，放入20ml磷酸鹽緩沖液(PBS，pH=7.4)中浸泡，每隔12h更換新鮮的PBS，清洗7天后，將樣品放入含有1。/。氯仿的PBS溶液中，于4'C下保存?zhèn)溆?。制得的?fù)合角膜替代物厚500jum，直徑12rara。按相同步驟制備片狀角膜替代物樣品，進(jìn)行力學(xué)性能、光學(xué)性能、酶降解性能的測試。此角膜替代物樣品命名為IPN1-1。(2)負(fù)載生長因子的復(fù)合角膜替代物的制備及其生長因子的緩釋將上述復(fù)合角膜冷凍干燥，然后取完整的一片浸入到50(^l-10昭/ml的神經(jīng)生長因子溶液中，4。C下保存3-4天，以保證角膜完全恢復(fù)形變。改變生長因子溶液的濃度制得生長因子含量不同的復(fù)合角膜樣品。取負(fù)載生長因子的復(fù)合角膜替代物，放入37匸的PBS(pH=7.4)中，每24h將釋放液取出，同時補(bǔ)充新鮮的PBS。收集的釋放液在冰箱凍存，以備后期測定釋放的生長因子濃度。實施例4:本生物活性的復(fù)合角膜替代物各組分比例如下豬皮I型膠原MPDSAH(質(zhì)量比)1:2MPDSAH:PEGDA(質(zhì)量比)2:1膠原EDC:NHS(摩爾比)1:1:1用上述各組分制備本生物活性復(fù)合角膜替代物的步驟如下(1)復(fù)合角膜替代物的制備取0.5gl3.7。/。的豬皮I型膠原溶液到注射器內(nèi)，并通過T型容器連接另一注射器密封；取與膠原質(zhì)量比為2:1的MPDSAH溶于水中，用微量注射器通過密封墊移入T型容器內(nèi)，反復(fù)推拉混合均勻，然后用微量注射器依次注入交聯(lián)劑EDC、NHS和光引發(fā)劑Irgacure2959，其中EDC:NHS:膠原=1:1:1(摩爾比)，引發(fā)劑Irgacure2959:MPDSAH=1:25(摩爾比)，反復(fù)推拉混合均勻，然后加入適量2mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH在5.5左右?；旌暇鶆蚝髮⑷芤簼沧⒌侥＞邇?nèi)，再放入夾具中夾緊固定，于紫外固化箱中固化40min，取出后室溫反應(yīng)16h，再移入37°C的烘箱內(nèi)熟化5h。去除夾具，打開模具去除角膜樣品，放入20ml磷酸鹽緩沖液(PBS，pH=7.4)中浸泡，每隔12h更換新鮮的PBS，清洗7天后，將樣品放入含有P/。氯仿的PBS溶液中，于4'C下保存?zhèn)溆?。制得的?fù)合角膜替代物厚50(Him，直徑12mm。按相同步驟制備片狀角膜替代物樣品，進(jìn)行力學(xué)性能、光學(xué)性能、酶降解性能的測試。此角膜替代物樣品命名為IPNl-2。(2)負(fù)載生長因子的復(fù)合角膜替代物的制備及其生長因子的緩釋將上述復(fù)合角膜冷凍干燥，然后取完整的一片浸入到500|ul-10|Lig/ml的神經(jīng)生長因子溶液中，4'C下保存3-4天，以保證角膜完全恢復(fù)形變。改變生長因子溶液的濃度制得生長因子含量不同的復(fù)合角膜樣品。取負(fù)載生長因子的復(fù)合角膜替代物，放入37'C的PBS(pH=7.4)中，每24h將釋放液取出，同時補(bǔ)充新鮮的PBS。收集的釋放液在冰箱凍存，以備后期測定釋放的生長因子濃度。實施例5:本生物活性的復(fù)合角膜替代物各組分比例如下豬皮I型膠原MPDSAH1:3MPDSAH:PEGDA2:1膠原EDC:NHS1:1:1用上述各組分制備本生物活性復(fù)合角膜替代物的步驟如下(1)復(fù)合角膜替代物的制備取0.5gl3.7。/。的豬皮I型膠原溶液到注射器內(nèi)，并通過T型容器連接另一注射器密封；取與膠原質(zhì)量比為3:1的MPDSAH溶于水中，用微量注射器通過密封墊移入T型容器內(nèi)，反復(fù)推拉混合均勻，然后用微量注射器依次注入交聯(lián)劑EDC、NHS和光引發(fā)劑Irgacure2959，其中EDC:NHS:膠原=1:1:1(摩爾比)，引發(fā)劑Irgacure2959:MPDSAH=1:25(摩爾比)，反復(fù)推拉混合均勻，然后加入適量2mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH在5.5左右?；旌暇鶆蚝髮⑷芤簼沧⒌侥＞邇?nèi)，再放入夾具中夾緊固定，于紫外固化箱中固化40min，取出后室溫反應(yīng)16h，再移入37。C的烘箱內(nèi)熟化5h。去除夾具，打開模具去除角膜樣品，放入20ml磷酸鹽緩沖液(PBS，pH=7.4)中浸泡，每隔12h更換新鮮的PBS，清洗7天后，將樣品放入含有"/。氯仿的PBS溶液中，于4C下保存?zhèn)溆?。制得的?fù)合角膜替代物厚50(Him，直徑12mm。按相同步驟制備片狀角膜替代物樣品，進(jìn)行力學(xué)性能、光學(xué)性能、酶降解性能的測試。此角膜替代物樣品命名為IPNl-3。(2)負(fù)載生長因子的復(fù)合角膜替代物的制備及其生長因子的緩釋將上述復(fù)合角膜冷凍干燥，然后取完整的一片浸入到500|il-10|Lig/ml的神經(jīng)生長因子溶液中，4'C下保存3-4天，以保證角膜完全恢復(fù)形變。改變生長因子溶液的濃度制得生長因子含量不同的復(fù)合角膜樣品。取負(fù)載生長因子的復(fù)合角膜替代物，放入37'C的PBS(pH=7.4)中，每24h將釋放液取出，同時補(bǔ)充新鮮的PBS。收集的釋放液在冰箱凍存，以備后期測定釋放的生長因子濃度。實施例6:本生物活性的角膜替代物各組分比例如下豬皮I型膠原MPDSAH(質(zhì)量比)1:0膠原EDC:NHS(摩爾比)1:1:1用上述各組分制備本生物活性角膜替代物的步驟如下(1)交聯(lián)膠原角膜替代物的制備取0.5gl3.7。/。的豬皮I型膠原溶液到注射器內(nèi)，并通過T型容器連接另一注射器密封，反復(fù)推拉混合均勻，然后用微量注射器按計量注入交聯(lián)劑EDC和NHS，其中EDC:NHS:膠原=1:h1(摩爾比)，反復(fù)推拉混合均勻，然后加入適量2mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH在5.5左右?；旌暇鶆蚝髮⑷芤簼沧⒌侥＞邇?nèi)，再放入夾具中夾緊固定，室溫反應(yīng)16h，再移入37'C的烘箱內(nèi)熟化5h。去除夾具，打開模具去除角膜樣品，放入20ml磷酸鹽緩沖液(PBS，pH=7.4)中浸泡，每隔12h更換新鮮的PBS，清洗7天后，將樣品放入含有P/。氯仿的PBS溶液中，于4'C下保存?zhèn)溆?。制得的角膜替代物?00)im，直徑12mm。按相同步驟制備片狀角膜替代物樣品，進(jìn)行力學(xué)性能、光學(xué)性能、酶降解性能的測試。此角膜替代物樣品命名為Collagen。(2)負(fù)載生長因子的角膜替代物的制備及其生長因子的緩釋將上述膠原角膜冷凍干燥，然后取完整的一片浸入到500nl-10ng/ml的神經(jīng)生長因子溶液中，4'C下保存3-4天，以保證角膜完全恢復(fù)形變。改變生長因子溶液的濃度制得生長因子含量不同的角膜樣品。取負(fù)載生長因子的角膜替代物，放入37'C的PBS(pH=7.4)中，每24h將釋放液取出，同時補(bǔ)充新鮮的PBS。收集的釋放液在冰箱凍存，以備后期測定釋放的生長因子濃度。實施例7:本生物活性的角膜替代物各組分比例如下-重組人I型膠原MPDSAH(質(zhì)量比)1:0膠原EDC:NHS(摩爾比)1:h1用上述各組分制備本生物活性角膜替代物的步驟如下(1)交聯(lián)膠原角膜替代物的制備取0.5gl3.7。/。的重組人I型膠原溶液到注射器內(nèi)，并通過T型容器連接另一注射器密封，反復(fù)推拉混合均勻，然后用微量注射器按計量注入交聯(lián)齊!JEDC和NHS，其中EDC:NHS:膠原-l:1:1(摩爾比)，反復(fù)推拉混合均勻，然后加入適量2mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH在5.5左右?；旌暇鶆蚝髮⑷芤簼沧⒌侥＞邇?nèi)，再放入夾具中夾緊固定，室溫反應(yīng)16h，再移入37'C的烘箱內(nèi)熟化5h。去除夾具，打開模具去除角膜樣品，放入20ml磷酸鹽緩沖液(PBS，pH=7.4)中浸泡，每隔12h更換新鮮的PBS，清洗7天后，將樣品放入含有P/。氯仿的PBS溶液中，于4'C下保存?zhèn)溆?。制得的角膜替代物?00pm，直徑12腿。按相同步驟制備片狀角膜替代物樣品，進(jìn)行力學(xué)性能、光學(xué)性能、酶降解性能的測試。(2)負(fù)載生長因子的角膜替代物的制備及其生長因子的緩釋將上述膠原角膜冷凍干燥，然后取完整的一片浸入到500nl-10嗎/ml的表皮細(xì)胞生長因子溶液中，4'C下保存3-4天，以保證角膜完全恢復(fù)形變。改變生長因子溶液的濃度制得生長因子含量不同的角膜樣品。取負(fù)載生長因子的角膜替代物，放入37。C的PBS(pH=7.4)中，每24h將釋放液取出，同時補(bǔ)充新鮮的PBS。收集的釋放液在冰箱凍存，以備后期測定釋放的生長因子濃度。實施例8:本生物活性的角膜替代物各組分比例如下重組人III型膠原MPDSAH(質(zhì)量比)1:0膠原EDC:NHS(摩爾比)1:1:1用上述各組分制備本生物活性角膜替代物的步驟如下(1)交聯(lián)膠原角膜替代物的制備取0.5gl3.7e/。的重組人III型膠原溶液到注射器內(nèi)，并通過T型容器連接另一注射器密封，反復(fù)推拉混合均勻，然后用微量注射器按計量注入交聯(lián)齊!JEDC、NHS，其中EDC:NHS:膠原=1:1:1(摩爾比)，反復(fù)推拉混合均勻，然后加入適量2mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH在5.5左右?；旌暇鶆蚝髮⑷芤簼沧⒌侥＞邇?nèi)，再放入夾具中夾緊固定，室溫反應(yīng)16h，再移入37i:的烘箱內(nèi)熟化5h。去除夾具，打開模具去除角膜樣品，放入20ml磷酸鹽緩沖液(PBS，pH=7.4)中浸泡，每隔12h更換新鮮的PBS，清洗7天后，將樣品放入含有P/。氯仿的PBS溶液中，于4'C下保存?zhèn)溆谩Ｖ频玫慕悄ぬ娲锖?00nm，直徑12mm。按相同步驟制備片狀角膜替代物樣品，進(jìn)行力學(xué)性能、光學(xué)性能、酶降解性能的測試。(2)負(fù)載生長因子的角膜替代物的制備及其生長因子的緩釋將上述膠原角膜冷凍干燥，然后取完整的一片浸入到500Ml-10|Lig/ml的表皮細(xì)胞生長因子溶液中，4'C下保存3-4天，以保證角膜完全恢復(fù)形變。改變生長因子溶液的濃度制得生長因子含量不同的角膜樣品。取負(fù)載生長因子的復(fù)合角膜替代物，放入37'C的PBS(pH=7.4)中，每24h將釋放液取出，同時補(bǔ)充新鮮的PBS。收集的釋放液在冰箱凍存，以備后期測定釋放的生長因子濃度。實施例1至實施例6制備的活性復(fù)合角膜替代物性能指標(biāo)參數(shù)如表1所示:表1活性復(fù)合角膜替代物的性能<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>權(quán)利要求1、一種具有生物活性的復(fù)合角膜替代物，其特征在于它主要是以膠原、3-(甲基丙烯酰胺)丙基-二甲基(3-磺丙)胺為原料，以水為溶劑，以碳二亞胺為交聯(lián)劑對膠原進(jìn)行交聯(lián)，聚乙二醇二丙烯酸酯為交聯(lián)劑，室溫下對3-(甲基丙烯酰胺)丙基-二甲基(3-磺丙)胺進(jìn)行交聯(lián)，以2-羥基-4-(2-羥乙氧基)-2-甲基苯丙酮(Irgacure2959)為光引發(fā)劑進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物再經(jīng)過澆注成膜加工工藝制備而成，其原料的組成和配比碳二亞胺與膠原(以膠原分子上氨基數(shù)目計)的摩爾比為0.3-3.0∶1；碳二亞胺與N-羥基琥珀酰亞胺的摩爾比為1∶1；聚乙二醇二丙烯酸酯與3-(甲基丙烯酰胺)丙基-二甲基(3-磺丙)胺的質(zhì)量比為0.2-0.5∶1；光引發(fā)劑Irgacure2959與3-(甲基丙烯酰胺)丙基-二甲基(3-磺丙)胺的摩爾比為0.01-0.10∶1。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的復(fù)合角膜替代物，其特征在于所述的膠原為豬皮I型膠原、重組人I型膠原或重組人III型膠原。3、一種包覆生長因子的具有生物活性的復(fù)合角膜替代物，其特征在于它是由權(quán)利要求l或2所述的復(fù)合角膜替代物包覆生長因子組成，每毫克凍干復(fù)合角膜替代物包覆0.10.9ng的生長因子。4、權(quán)利要求1所述的具有生物活性的復(fù)合角膜替代物的制備方法，其特征在于它包括以下步驟1)按計量將13.7%的膠原水溶液、80%-90%的3-(甲基丙烯酰胺)丙基-二甲基(3-磺丙)胺水溶液、20%-30%的碳二亞胺和^羥基琥珀酰亞胺的水溶液與引發(fā)劑Irgacure2959的無水乙醇溶液均勻混合，用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH為5.5;2)將溶液澆注到模具內(nèi)，再放入夾具中夾緊固定，于紫外固化箱中固化40min，取出后室溫反應(yīng)16h,再移入37'C的烘箱內(nèi)熟化5h;3)去除夾具，打開模具取出角膜樣品放入p^7.4的磷酸鹽緩沖液中浸泡，每隔12h更換新鮮的磷酸鹽緩沖液，清洗7天后，將樣品放入含有1%氯仿的pH=7.4的磷酸鹽緩沖液中，于4'C下保存?zhèn)溆谩?、權(quán)利要求3所述的負(fù)載生長因子的具有生物活性的復(fù)合角膜替代物的制備方法，其特征在于包括以下步驟1)按計量將權(quán)利要求1或2所述的復(fù)合角膜替代物冷凍干燥后浸入在500(il-10^ig/ml生長因子溶液中，4r下放置34天，以保證角膜完全恢復(fù)形變；2)取負(fù)載生長因子的復(fù)合角膜替代物，放入37'C的pH-7.4的磷酸鹽緩沖液中，每24h將釋放液取出，同時補(bǔ)充新鮮的磷酸鹽緩沖液，收集的釋放液在冰箱凍存，以備后期測定釋放的生長因子濃度。6、根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于所述的生長因子是神經(jīng)生長因子、表皮細(xì)胞生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子和成纖維細(xì)胞生長因子。全文摘要本發(fā)明提供了一種具有生物活性的膠原基復(fù)合角膜替代物及其制備方法。它主要是以膠原、3-(甲基丙烯酰胺)丙基-二甲基(3-磺丙)胺(MPDSAH)為原料，以水為溶劑。以零長度交聯(lián)劑碳二亞胺(EDC)對膠原進(jìn)行交聯(lián)；以Irgacure2959為光引發(fā)劑，聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA)為交聯(lián)劑對MPDSAH進(jìn)行引發(fā)聚合并交聯(lián)。混合均勻后，注入模具內(nèi)固化成型。上述復(fù)合角膜替代物冷凍干燥后，具有三維多孔結(jié)構(gòu)，可以吸附大量角膜細(xì)胞生長因子，而且凍干角膜替代物可以長期存放，吸水膨脹后可以恢復(fù)凍干前的形狀和性能。本發(fā)明制備的復(fù)合角膜替代物組織相容性好，可誘導(dǎo)和促進(jìn)角膜再生，可隨角膜再生而生物降解，生長因子的引入可以促進(jìn)自體生長因子的富集，減少術(shù)后并發(fā)癥的出現(xiàn)。文檔編號A61F2/14GK101543643SQ20091006834公開日2009年9月30日申請日期2009年4月2日優(yōu)先權(quán)日2009年4月2日發(fā)明者劉文廣,爽梁,王鵬飛申請人:天津大學(xué)