專利名稱：與Tie2蛋白特異性結(jié)合的配體多肽及藥物輸送系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是一種醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域的配體多肽及藥物輸送系統(tǒng)，具體是一種 與Tie2 (Tyrosine kinase with Ig and EGF homology domains, 血管生成素
受體)蛋白特異性結(jié)合的配體多肽及藥物輸送系統(tǒng)。
背景技術(shù)：
化療技術(shù)廣泛應(yīng)用于腫瘤治療中，但是，抗腫瘤藥物全身分布所造成的對正 常組織的損傷，極大地限制了此類藥物的應(yīng)用范圍，劑量和療效。為此，提高藥 物向腫瘤部位的耙向性分布，對提高化療效果有重要意義?；蛑委熥鳛橐环N新 興的腫瘤治療方法，得到了很大的發(fā)展?；蛑委煹脑硎抢没蜣D(zhuǎn)移技術(shù)， 使特定的基因轉(zhuǎn)入靶細胞并表達，產(chǎn)生特定功能，從而抑制腫瘤細胞生長甚至直 接殺傷腫瘤細胞。非病毒載體介導(dǎo)的基因輸送技術(shù)是一種安全有效的候選途徑， 但基因的靶向輸送及有效表達，是此項技術(shù)尚待突破的瓶頸。
Folkman博士在1995年首先發(fā)現(xiàn)了腫瘤血管生成的現(xiàn)象，并研究了其發(fā)生 機制。研究發(fā)現(xiàn)，血管生成對實體瘤的生成，發(fā)展以及轉(zhuǎn)移起著非常關(guān)鍵的作用。 針對此過程，科學(xué)界研究了許多新的腫瘤治療策略。 一方面，抗血管生成的藥物 可以阻斷此過程，使實體腫瘤因為缺乏氧氣和營養(yǎng)供給，生長受到抑制而死亡； 另一方面，新生血管具有較大的通透性，易于大分子藥物以及載體的停留和透過， 從而使更多的藥物進入腫瘤組織發(fā)揮治療作用。
配體或抗體介導(dǎo)的主動靶向輸送是抗腫瘤藥物輸送的重要手段。不少文獻報 道了針對表皮生長因子受體，血管內(nèi)皮生長因子受體，整合素ave"促血管生 長因子受體等分子的藥物及基因輸送系統(tǒng)。這些受體分子在血管生成機制中起到 非常關(guān)鍵的作用。如羅氏公司的人重組VEGFR (血管內(nèi)皮細胞生長因子受體)抗 體Avastin，商品名稱阿瓦斯丁"； EGFR受體酪氨酸激酶抑制劑Tarceva，商 品名稱特羅凱TM以及英國AstraZeneca公司的藥物Iressa，商品名稱易瑞沙
TMTie2是促血管生長因子的受體。1992年由Partanen J在內(nèi)皮細胞表面所發(fā) 現(xiàn)，為受體型酪氨酸激酶。該蛋白由1124個氨基酸殘基組成的跨膜蛋白。該受 體由胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)組成，胞外區(qū)由兩個免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域，三個 EGF同源基序和三個纖連蛋白III型重復(fù)序列組成。胞內(nèi)區(qū)是酪氨酸激酶催化功 能域。其中，免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域是與配體的結(jié)合位點。
Angiopoietin-l (促血管生成素-l)和Angiopoietin-2 (促血管生成素-2) 是其兩個主要的天然配體分子。Angiopoietin-l (Ang-1)與已知的血管生成因子 或其他蛋白酪氨酸激酶受體的配體不同，在體外不能直接促進血管內(nèi)皮細胞生 長，而起到在血管生成過程后期起到使新生血管再組織，穩(wěn)定化和成熟的作用。 Angi叩oietin-2 (Ang-2)亦可與Tie2蛋白結(jié)合，與Ang-l起到拮抗作用，參與 內(nèi)皮細胞分裂和血管網(wǎng)重建的過程。
研究證明，Tie2是腫瘤脈管系統(tǒng)重要的生物標志物，在各種腫瘤新生血管 內(nèi)皮細胞上均檢測出高表達。同時，某些腫瘤細胞也會直接高表達Tie2蛋白。 因此，作為一個重要的惡性腫瘤標志物，Tie2可作為惡性腫瘤治療的新靶點。 直接利用天然配體可以達到靶向結(jié)合的效果，同時，人源化抗體技術(shù)也可以達到 此項目的，但是，天然Tie2配體以及人源化抗體的人工制備，技術(shù)復(fù)雜，規(guī)模 化制備成本高昂，價格昂貴，而且儲存，運輸?shù)鹊纫罂量蹋荒軡M足臨床使用 的要求。而特異性Tie2分子靶向的配體多肽則能夠克服上述問題。因此，基于 Tie2的配體多肽的靶向型腫瘤藥物輸送體系有著良好的開發(fā)應(yīng)用前景。
含有聚乙二醇(PEG)修飾的脂質(zhì)的長循環(huán)脂質(zhì)體能夠通過抑制脂質(zhì)體與血 漿成分之間的相互作用，降低體內(nèi)清除速率，以達到緩釋的目的；同時，基于腫 瘤組織血管的增強滲透作用(EPR effect),能達到藥物的被動腫瘤耙向的目的。 上市藥物阿霉素長循環(huán)脂質(zhì)體楷萊(Caelyx)正是基于此原理。但被動靶向的腫 瘤特意性靶向效果有一定限度，而且聚乙二醇的修飾雖然提高了腫瘤部位的藥物 濃度，但同時削弱了脂質(zhì)體與腫瘤細胞之間的相互作用，影響了藥物的細胞吸收， 無法達到有效的細胞內(nèi)作用位點，影響了療效。
經(jīng)對現(xiàn)有技術(shù)的文獻檢索，中國專利CN200810134581.2 (公開號CN 101327190A,
公開日2008.12.24)，名稱為 一種供注射用的抗腫瘤長循環(huán)靶 向脂質(zhì)體，該技術(shù)利用整合素分子與細胞黏著分子靶向性多肽修飾脂質(zhì)體，有效 的提高腫瘤部位的藥物濃度，但均與本發(fā)明所述的靶點有顯著不同；中國專利
5CN200310122830. 3 (公開號:CN 1634595A,
公開日2003.12.26)，名稱為Tie2 受體介導(dǎo)的靶向性腫瘤基因治療的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)，該技術(shù)利用了 Tie2受體靶向 性多肽GA5修飾基因輸送載體，用于靶向性腫瘤基因治療，與Tie2有不同的結(jié) 合部位，不同的多肽亦有助于克服耐受性問題，而且該技術(shù)僅限于基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種與Tie2蛋白特異性結(jié)合 的配體多肽。本發(fā)明的配體多肽結(jié)構(gòu)清楚，不易發(fā)生多肽與多肽之間的空間位阻 效應(yīng)，無Fc段的干擾；幾乎沒有免疫原性，副作用小，容易制備和生產(chǎn)，使用 方便，可作為靶向肽用于藥物輸送系統(tǒng)及基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)。
本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的，本發(fā)明涉及一種與Tie2蛋白特異性結(jié) 合的配體多肽，包含SEQ ID N0.1所示的氨基酸序列。
所述與Tie2蛋白特異性結(jié)合的配體多肽含有大于或等于兩個如SEQ ID NO. 1 所示的氨基酸序列。
所述與Tie2蛋白特異性結(jié)合的配體多肽包括SEQ ID NO. 1所示序列的變異 形式1-5個氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加1-20 個氨基酸。
所述與Tie2蛋白特異性結(jié)合的配體多肽能被連接于以下任一納米粒子上 聚合物粒子、金屬納米粒子、脂質(zhì)體、囊泡、固體脂質(zhì)微粒、膠束、碳納米管、 量子點、樹突狀納米球、微囊，細胞，脂蛋白。
所述與Tie2蛋白特異性結(jié)合的配體多肽的酰胺、酯、或其鹽，或配體多肽 形成的活性片段及活性衍生物。
所述與Tie2蛋白特異性結(jié)合的配體多肽形成的游離型多肽、融合型多肽、 嵌合類多肽、或以配體多肽為單體的聚合物。
本發(fā)明還涉及一種藥物輸送系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括與Tie2蛋白特異性結(jié)合的 配體多肽、載藥系統(tǒng)、至少一種活性物質(zhì)。
所述載藥系統(tǒng)具體為脂質(zhì)體，形成脂質(zhì)體的脂質(zhì)分子為磷脂酰膽堿、磷脂酰 乙醇胺、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、磷脂酰絲氨酸、磷脂酸、心磷脂、鞘磷脂、 腦苷脂，神經(jīng)節(jié)苷脂、麥角固醇、膽固醇、陽離子脂質(zhì)、溶血磷脂、聚乙二醇修 飾的脂質(zhì)或配體多肽修飾的脂質(zhì)中的一種或多種。
所述至少一種活性物質(zhì)為任何需要被輸送到體內(nèi)特定位置的物質(zhì)。所述至少一種活性物質(zhì)選自抗腫瘤藥物、抗代謝藥物、紡錘體毒性生物堿、 細胞毒性/抗腫瘤抗生素、拓撲異構(gòu)酶抑制劑、光敏劑、激酶抑制劑、抗生素、 抗真菌素、抗炎藥物、免疫抑制劑、抗感染藥物、抗病毒藥物、驅(qū)蟲藥、抗寄生 蟲的化合物，用于超聲造影、放射造影、核醫(yī)學(xué)造影劑的診斷試劑，目的基因、 反義癌基因、自殺基因、細胞凋亡基因、細胞因子基因，或上述基因的組合，或 含有上述基因的真核表達載體DNA。
本發(fā)明涉及能與Tie2蛋白特異性結(jié)合的配體多肽以及基于該配體多肽的藥 物輸送系統(tǒng)，本發(fā)明的藥物輸送系統(tǒng)包含特異性結(jié)合于Tie2受體的配體多肽、 脂質(zhì)體或其他載藥系統(tǒng)、活性物質(zhì)。本發(fā)明的藥物輸送系統(tǒng)可將外源DNA，治療 性化合物和診斷試劑輸送到靶細胞。本藥物輸送系統(tǒng)通過配體多肽與Tie2蛋白 的特異性結(jié)合以及受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用，將相關(guān)活性物質(zhì)耙向性地導(dǎo)入腫瘤新生 血管內(nèi)皮細胞和表達Tie2受體的腫瘤細胞。 本發(fā)明具有如下的有益效果
(1) 本發(fā)明從蛋白分子相互作用的機理出發(fā)，以小分子多肽模擬人天然Tie2 配體與Tie2進行結(jié)合，與單抗比較，小分子多肽結(jié)構(gòu)清楚，與Tie2結(jié)合位點局 限，不易發(fā)生多肽與多肽之間的空間位阻效應(yīng)，也沒有Fc段的干擾；
(2) 小分子多肽幾乎沒有免疫原性，副作用小，容易制備和大規(guī)模生產(chǎn)以 及使用方便；
(3) 本發(fā)明物中的配體多肽由于能夠與細胞表面Tie2受體蛋白結(jié)合可能通 過激活或阻斷Tie2信號傳導(dǎo)通路達到調(diào)節(jié)血管新生的功能，因而可作為臨床藥 物研制的前提或藥物組合物，它包含編碼本發(fā)明有關(guān)多肽的DNA及本發(fā)明有關(guān)多 肽的抗體；本發(fā)明中的配體多肽可以作為靶向肽用于藥物輸送系統(tǒng)及基因轉(zhuǎn)移系 統(tǒng)，進行針對Tie2受體高表達的腫瘤新生血管內(nèi)皮細胞和腫瘤細胞的靶向基因 治療；本發(fā)明中的配體多肽可以作為耙向肽連接放射性核素、化學(xué)藥物、生物毒 素用于惡性腫瘤及Tie2系統(tǒng)功能失調(diào)性疾病的耙向化學(xué)藥物治療作用；本發(fā)明 中的配體多肽可以作為靶向肽連接造影劑，用于針對Tie2受體高表達部位如腫 瘤新生血管，炎癥組織，卵巢等的造影診斷；本發(fā)明中的配體多肽及其編碼該多 肽的DNA序列還可作為檢測或診斷試劑。
本發(fā)明涉及的大腸桿菌ER2738菌株可通過公開市售的商業(yè)渠道取得，如美 國New England Biolabs公司，公司地址240 County Road， Ipswich, MA， USA01938-2723。
本發(fā)明涉及的含有Tie2包外區(qū)cDNA序列以及6x組氨酸標簽的真核表達質(zhì)粒 已在文獻《Xianghua Wu， Ruijiao Zhao, Zonghai Li, et aL A novel small peptide as a targeting ligand for receptor tyrosine kinase Tie2， Biochemical and Biophysical Research Communications, 315 (2004) 1004-1010》中公開。
本發(fā)明涉及的HEK293細胞，SPC-Al細胞，H1299細胞，SMMC-7721細胞以及 H460細胞可通過公開市售的商業(yè)渠道取得，如中科院上海生命科學(xué)研究院細胞 資源中心，公司地址上海市岳陽路320號。


圖1為配體多肽PHI與Tie2蛋白結(jié)合表面等離子共振(SPR)分析圖； 圖2為配體多肽rai與Tie2蛋白特異結(jié)合解離常數(shù)曲線示意圖； 圖3為帶有配體多肽PHI的熒光脂質(zhì)體與細胞表面Tie2受體特異性結(jié)合的 熒光共聚焦顯微鏡結(jié)果示意圖4為帶有配體多肽PHI的載藥脂質(zhì)體細胞毒性試驗示意圖5為帶有配體多肽PH1的熒光脂質(zhì)體荷瘤小鼠體內(nèi)分布示意圖6為實施例4中阿霉素瘤內(nèi)分布圖。
具體實施例方式
結(jié)合具體實施方案，進一步闡述本發(fā)明。這些實施例僅用于說明而非限制本 發(fā)明的范圍。下列實施方案中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件， 例如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照試劑生產(chǎn)廠商所建議條件。
本發(fā)明采用生化命名委員會IUPCA-IUB推薦的命名法表示堿基和氨基酸的 縮寫。其中，除特別說明外，氨基酸一般為L型。所描述的多肽，按照慣例，左 側(cè)末端是氨基酸末端(N-末端)，右側(cè)末端是羧基末端(C-末端)。通常當C-末 端是羧基(-C00H)或羧酸鹽(-C00-)時，它可以是酰胺(-C00NH2)或酯(-C00R) 形式。酯殘基R包括Cl-6垸基(如甲基、乙基、n-丙基、異丙基、n-丁基等)、 C3-8環(huán)烷基(如環(huán)戊基、環(huán)己基等)、C6-12芳基(如苯基、a-萘基等)、C7-14 烷基(如節(jié)基、苯乙基等)。
實施例1配體多肽的篩選 相關(guān)試劑
氫化豆磷脂(HSPC)以及1， 2—二硬酯酰磷脂酰乙醇胺一聚乙二醇2000— 馬來酸酯(DSPE-PEG2000-Mal)購自日本油脂公司(NOF Corporation);
膽固醇以及聚乙二醇化磷脂1， 2 — 二硬酯酰磷脂酰乙醇胺一聚乙二醇2000 (DSPE-PEG2000)購自美國Avanti Polar Lipids公司;
熒光脂質(zhì)LissamineiM羅丹明DHPE (羅丹明B 1， 2-雙十六烷基磷脂酰乙醇 胺，1， 2 — dihexadecanoyi-sn-glycero-3-phosphoethanolamine)購自美國 invitrogen公司.，
N-Succinimidyl 3-(2-pyridyldithio) propionate (N-琥珀酰亞胺3_(2-吡使基二硫)丙酸酯，SPDP)和tris(2-carboxyethyl) phosphine (三羧甲基磷 酸，TCEP)購自美國Pierce Biotechnology公司;
Cy5. 5-NHS (Cy5. 5_N-羥基琥珀酰亞胺)酯購自美國GE Healthcare公司；
噻唑藍(MTT)購自上海普飛生物技術(shù)公司；
重組人Tie2蛋白購自美國RnD公司；
隨機十二肽噬菌體展示文庫Ph. D. -12TM購自美國New England Biolabs公 司；其他化學(xué)試劑購自中國國藥化學(xué)試劑公司。
Tie2特異性結(jié)合蛋白由噬菌體文庫生物淘洗篩選而成。其中，多肽序列以 蛋白-間隔多肽-多肽的融合形式展示。融合多肽形式為噬菌體衣殼蛋白 pill-Gly-Gly-Gly-Ser-隨機十二肽，活性片斷為隨機十二肽，噬菌體上含有多 個融合蛋白形式的衣殼蛋白pIII。將重組Tie2/Fc蛋白溶于10mM pH為7. 4的 TBS溶液，直至重組Tie2/Fc蛋白的濃度為50ug/ml;加100ulTie2蛋白溶液于 96孔微孔板，4'C包被過夜。用含0.5% (w/v)的牛血清白蛋白的TBS溶液(含 0. 1°/。 (v/v)吐溫-20) 25攝氏度下封閉1小時。用含有O. 1% (w/v)吐溫-20的 TBS溶液洗板6次，加入4X 101Q空斑形成單位的文庫噬菌體，25匸孵育40分 鐘。利用TBS洗板十次，以洗去結(jié)合力弱的噬菌體，然后利用100ul 0.2M的甘 氨酸-鹽酸緩沖液(pH值為2.2)洗下結(jié)合緊密的噬菌體，并迅速用15ul lMTris-鹽酸緩沖液(pH值為9. 1)中和。收獲的噬菌體，利用大腸桿菌ER2738菌株擴 增，并進行下一篩選循環(huán)。篩選三次后，所得到的噬菌體利用LB/IPTG/Xgal平 板擴增檢驗，挑選12個藍斑進行測序，測序引物為5' -CCC TCA TAG TTA GCG TAA
9CG-3'。測序得到7個不同的，能與Tie2蛋白有潛在結(jié)合能力的噬菌體衣殼蛋 白pIII-Gly-Gly-Gly-Ser-十二肽的融合多肽序列。其中，融合多肽的活性片斷 為間隔多肽Gly-Gly-Gly-Ser以后的十二肽序列。最終得到7個不同的十二肽(活 性片斷)序列，其中序列PH1 (如SEQ ID No. l所示)重復(fù)出現(xiàn)5次。此多肽融 合表達于噬菌體上，作為作用活性片斷，表現(xiàn)出良好的Tie2蛋白結(jié)合能力，使 噬菌體有效，牢固的與Tie2蛋白結(jié)合的能力，擁有優(yōu)良的Tie2靶向潛力。 實施例2
利用表面等離子共振實驗測量配體多肽與Tie2蛋白包外區(qū)的結(jié)合能力 步驟一，穩(wěn)定表達Tie2包外區(qū)細胞系的建立
選取含有Tie2包外區(qū)cDNA序列以及6x組氨酸標簽的真核表達質(zhì)粒，利用轉(zhuǎn)染 試劑PEI(聚亞乙基亞胺)把Tie2表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)入HEK293細胞，加入10% (v/v)胎牛 血清，700ug/ml G418的培養(yǎng)液篩選，陽性表達克隆利用有限稀釋法篩選，并利 用西方印跡法(western blot)檢測Tie2包外區(qū)蛋白表達。
步驟二，配體多肽的合成
配體多肽rai由蘇州中科天馬肽工程中心有限公司合成并純化，并利用高效 液相色譜及質(zhì)譜進行結(jié)構(gòu)和純度鑒定，合成方法為固相合成法。如圖1所示，所 合成多肽確為配體多肽PH1，純度為95%。
步驟三，表面等離子共振(Biacore)分析
培養(yǎng)并收集穩(wěn)定表達Tie2包外區(qū)的HEK293細胞，利用5ml去離子水重懸， 并利用凍融法裂解細胞。裂解液以12000轉(zhuǎn)/分鐘速度離心10分鐘，得到上清液 利用0. 22um濾膜過濾。多肽-蛋白結(jié)合試驗在GE healthcare公司的Biacore X100 上進行，并利用NTA芯片。
先把NTA芯片介入Biacore X100系統(tǒng)，利用NTA溶液(10mM HEPES， 150raM 氯化鈉，50uM EDTA， 0.005% v/v表面活性劑P_20， pH為7.4)重新管路。先 加入500uM氯化鎳溶液活化芯片，然后加入含有Tie2蛋白的HEK293細胞裂解液， 經(jīng)過420秒的作用，把含有6x組氨酸標簽的Tie2包外區(qū)蛋白結(jié)合到芯片上。然 后利用NTA溶液洗去非特異性結(jié)合的蛋白。接著，將0.3uM、 luM、 3uM、 10uM、 30uM、 100uM梯度濃度的多肽注射入NTA芯片，與芯片表面的Tie2蛋白作用180 秒，最后，芯片表面由0.35MpH8.3的EDTA溶液進行再生，洗去表面接合蛋白。 數(shù)據(jù)由系統(tǒng)自帶的軟件Biacore X100 Evaluation Software進行分析。如圖2所示，多月太PHI :TMGFTAPRFPHY (SEQ ID No. l)在與Tie2蛋白作用后，迅速與Tie2 蛋白結(jié)合，并達到飽和。信號達到峰值后，有所緩慢下降，約100秒后，信號重 新輕微上升。多肽停止與蛋白結(jié)出后，迅速解離。如圖3所示，基于實驗數(shù)據(jù)計 算，配體多肽穩(wěn)態(tài)親和常數(shù)擬合為1.58 x l(TM.
結(jié)果證實，配體多肽PH1能與Tie2蛋白特異性結(jié)合。
實施例3
偶聯(lián)PH1多肽的脂質(zhì)體與細胞表面Tie2受體特異性結(jié)合體外試驗 步驟一，偶聯(lián)配體多肽PH1與脂質(zhì)DSPE-PEG咖。-Mal
配體多肽PH1通過連接劑SPDP與脂質(zhì)偶聯(lián)。多肽PH1先溶于PBS (含lmM EDTA， pH7. 5)至2mg/ml，然后以摩爾比1:1. 2加入溶于DMS0的SPDP (N-琥珀 酰亞胺-3-2-吡啶二硫代-丙酸酯)，充分混勻，24。C反應(yīng)1小時，凍干，然后重 懸于事先除氣并用氮氣飽和的40mMpH7. 4的HEPES緩沖液。以摩爾比1: 2加入 TCEP (三(2-羰基乙基)磷)，TCEP能與連接了 SPDP的多肽作用，暴露出裸露的 巰基。24。C反應(yīng)1小時后，以2:1摩爾比加入DSPE-PEG誦-Mal脂質(zhì)，氮氣保護 下l(TC反應(yīng)24小時，得到多肽偶聯(lián)的脂質(zhì)PH1-PEG誦-DSPE。
反應(yīng)方程式示意如下
PH1+SPDP—PH1-SPDP (24°C， 1小時)
PHI-SPDP+TCEP—PH1-SH (24°C， 1小時)
PH1-SH+DSPE-PEG誦-Ma1—PHI-PEG2。。。-DSPE (10°C， 24小時)
步驟二，熒光脂質(zhì)體與順鉑脂質(zhì)體的制備
熒光脂質(zhì)體的制備將氫化豆磷脂(HSPC)，膽固醇，DSPE-PEG，。和熒光脂 質(zhì)(羅丹明DHPE)按照摩爾比58:29:3:0.6的比例溶于氯仿。采用薄膜分散水合 法制備脂質(zhì)體。然后，以摩爾比9: 100的比例加入PH1-PEG誦-DSPE膠束，60 。C孵育l小時，利用14kD截留分子量的透析膜室溫透析過夜，除去游離的多肽 PH1及PH1脂質(zhì)。對照組脂質(zhì)體則利用raPEG扁-DSPE膠束替代PH1-PEG扁-DSPE。 順鉑脂質(zhì)體的制備采用逆相蒸發(fā)法制備。HSPC，膽固醇和mPEG2。。。-DSPE以 60:35:5的摩爾比混合，并以藥質(zhì)比1:5(mo1)加入順鉑。PH1-PEG誦-DSPE或 mPEG2。。。-DSPE膠束與順鉑脂質(zhì)體按照摩爾比4:100的比例混合，55'C孵育30分 鐘。產(chǎn)物25'C透析4小時，除去游離的順鉑和多肽。
步驟三，激光共聚焦顯微鏡檢驗多肽熒光脂質(zhì)體與細胞結(jié)合在放置于35毫米細胞培養(yǎng)皿內(nèi)的小玻璃蓋玻片上，接種表達Tie2的SPC-A1 ， H1299細胞以及不表達Tie2蛋白的S麗C-7721細胞。待生長至60%匯合度后，吸 去含血清培養(yǎng)液，更換無血清培養(yǎng)液，并以0.1mg/ml脂質(zhì)濃度加入偶聯(lián)或不偶 聯(lián)多肽PH1的羅丹明熒光脂質(zhì)體，繼續(xù)37'C孵育4小時。用HANKS溶液充分清 洗5次，然后利用激光共聚焦顯微鏡檢測。如附圖4所示，表達Tie2表達陽性 的SPC-A1和H1299細胞中，孵育PH1多肽熒光脂質(zhì)體的細胞羅丹明熒光強度明 顯強于mPEG脂質(zhì)體對照組，而不表達Tie2蛋白的smmc-7721細胞中，兩組的熒 光強度相似且均非常弱。圖4中，靶向多肽PH1修飾的載藥脂質(zhì)體對Tie2陽性 細胞H1299細胞(A)、 SPC-A1細胞(B)顯示出更強的毒性，而于Tie2陰性細胞 S麗C-7721細胞(C)，靶向與非靶向脂質(zhì)體毒性無差異。脂質(zhì)體的毒性也通過試驗 檢測(D),結(jié)果顯示，多肽修飾的靶向脂質(zhì)體與空白脂質(zhì)體毒性非常微弱，細胞 毒殺作用由順鉑所產(chǎn)生。
步驟四，噻唑藍(MTT)法測量順鉑脂質(zhì)體毒性試驗
表達Tie2蛋白的SPC-A1， H1299， HUVEC細胞以及不表達Tie2蛋白的 smmc-7721細胞被分別接種于％孔細胞培養(yǎng)板，并培養(yǎng)24小時。然后，吸去含 血清培養(yǎng)液，加入無血清培養(yǎng)液，并以不同濃度加入偶聯(lián)或不偶聯(lián)PH1多肽的順 鉑脂質(zhì)體，孵育4小時。接著棄去含藥培養(yǎng)液，更換新鮮含血清培養(yǎng)液繼續(xù)孵育 2天。兩天后，棄去培養(yǎng)液，加入新鮮的含MTT 0.5mg/ml的含血清培養(yǎng)液，培 養(yǎng)4小時，最后，小心棄去培養(yǎng)液，并每孔加入200ul 二甲亞砜，混勻，利用酶 標儀測量0D490。如圖5所示，Tie2表達陽性的SPC-Al， H1299及HUVEC細胞中， 偶聯(lián)了 PH1多肽的順鉑脂質(zhì)體均顯示出較mPEG順鉑脂質(zhì)體及游離藥物更強大的 殺傷性，而Tie2表達陰性H1299細胞中，多肽順鉑脂質(zhì)體與mPEG順鉑脂質(zhì)體毒 性相近。試驗證明，偶聯(lián)了多肽PH1的脂質(zhì)體能有效的被表達Tie2的細胞吸附 及吞噬。
實施例4
多肽熒光脂質(zhì)體在荷瘤小鼠的體內(nèi)分布試驗 步驟一，接種腫瘤
將1 X 106 SPC-A1細胞由胰酶消化，并重懸于200ul PBS緩沖液。在5周齡 的裸鼠右腋窩下，皮下注射腫瘤細胞懸液。12天后，腫瘤長至約6mm直徑，即 可使用。
12步驟二， PHI多肽熒光脂質(zhì)體的制備
Cy5.5-NHS， 二硬脂酸乙醇胺(DSPE)脂質(zhì)與三乙胺以3:1:3.5的摩爾比混 合，25。C孵育過夜，制備成Cy5. 5標記的脂質(zhì)Cy5. 5-DSPE。將氫化豆磷脂(HSPC)， 膽固醇，DSPE-PEG2。。。和熒光脂質(zhì)(Cy5. 5-DSPE)按照摩爾比58:29:3:0. 6的比例溶 于氯仿(脂質(zhì)總量為3. 5mg)。采用薄膜分散水合法制備脂質(zhì)體，終濃度為10mg/ml 總脂質(zhì)。然后，以摩爾比9: 100的比例加入PH1-PEG誦-DSPE膠束,60'C孵育1 小時，利用14kD截留分子量的透析膜室溫透析過夜，除去游離的多肽PH1及PH1 脂質(zhì)。對照組脂質(zhì)體則利用mPEG2。。。-DSPE膠束替代PH1-PEG誦-DSPE。
步驟三，熒光脂質(zhì)體體內(nèi)分布檢測
熒光脂質(zhì)體體內(nèi)分布由美國GE healthcare公司的eXplore Optix MX小動 物體內(nèi)成像系統(tǒng)檢測。熒光脂質(zhì)體由尾靜脈注射入荷瘤裸鼠體內(nèi)，分別在不同時 間點測量熒光。利用儀器自帶軟件，去除雜質(zhì)熒光，僅保留在Cy5.5壽命(1.8 ns-2.2ns)內(nèi)的熒光圖象。如附圖5所示，相較于對照組mPEG-Cy5. 5脂質(zhì)體， PH1-Cy5.5脂質(zhì)體顯示出更強，更穩(wěn)定持久以及更特異性的體內(nèi)分布。腫瘤靶向 組的體內(nèi)熒光分布圖象顯示，6個小時以內(nèi)，脂質(zhì)體已經(jīng)集中于腫瘤組織附近， 一直到第四天熒光消失，腫瘤組織一直集中著最高濃度的靶向熒光脂質(zhì)體。而非 耙向脂質(zhì)體對照組中，直到約兩天后熒光脂質(zhì)體才在腫瘤組織達到最高濃度，并 且在大腦、脊椎以及肺部有著較高的分布。
實施例5
長循環(huán)耙向阿霉素脂質(zhì)體在荷瘤小鼠的腫瘤靶向試驗 步驟一，接種腫瘤
將1X106H460細胞由胰酶消化，并重懸于200ul PBS緩沖液。在5周齡的 裸鼠右腋窩下，皮下注射腫瘤細胞懸液。12天后，腫瘤長至約4-6mm直徑，即 可使用。
步驟二，長循環(huán)靶向阿霉素脂質(zhì)體的制備
將氫化豆磷脂(HSPC)，膽固醇，DSPE-PEG加。。按照摩爾比2:1:0. 1的比例溶 于氯仿。采用薄膜分散水合法，以125mM， pH4.0的硫酸銨溶液水合制備脂質(zhì)體， 終濃度為10mg/ml總脂質(zhì)。然后，以摩爾比2: 100的比例加入rai-PEG加。。-DSPE 膠束，6(TC孵育1小時。用200倍體積的10mM， pH7. 4的磷酸緩沖液作為透析液， 利用14kD截留分子量的透析膜室溫透析兩小時，除去游離的多肽PH1及外水相
13的硫酸銨。以藥脂比h 10(w/w)加入阿霉素水溶液，60度孵育兩小時。對照組 脂質(zhì)體則利用mPEG誦-DSPE膠束替代PH1-PEG誦-DSPE。 步驟三，阿霉素的瘤內(nèi)分布檢測
阿霉素的瘤內(nèi)分布由美國安捷倫公司的高效液相色譜系統(tǒng)檢測。阿霉素脂質(zhì) 體由尾靜脈注射入荷瘤裸鼠體內(nèi)，分別在不同時間點測量阿霉素含量。如圖6所 示，相較于對照組mPEG-阿霉素脂質(zhì)體，Ml-阿霉素脂質(zhì)體顯示出阿霉素瘤內(nèi)分 布。通過統(tǒng)計學(xué)分析，在注射后半小時以及6小時，腫瘤組織一直集中著更高濃 度的阿霉素。序列表
〈110>上海交通大學(xué)
〈120〉與Tie2蛋白特異性結(jié)合的配體多肽及藥物輸送系統(tǒng)
<160> 1
〈210> 1
〈211> 12
<212> PRT
〈213〉人工序列
<400> 1
Thr Met Gly Phe Thr Ala Pro Arg Phe Pro His Tyr 1 5 10
1權(quán)利要求
1、一種與Tie2蛋白特異性結(jié)合的配體多肽，其特征在于，包含SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。
2、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的與Tie2蛋白特異性結(jié)合的配體多肽，其特征是， 配體多肽含有大于或等于兩個如SEQ ID NO. l所示的氨基酸序列。
3、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的與Tie2蛋白特異性結(jié)合的配體多肽，其特征是， 配體多肽包括SEQ ID NO. l所示序列的變異形式1-5個氨基酸的缺失、插入和 /或取代，以及在C末端和/或N末端添加1-20個氨基酸。
4、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的與Tie2蛋白特異性結(jié)合的配體多肽，其特征是， 配體多肽能被連接于以下任一納米粒子上聚合物粒子、金屬納米粒子、脂質(zhì)體、 囊泡、固體脂質(zhì)微粒、膠束、碳納米管、量子點、樹突狀納米球、微囊、細胞、 脂蛋白。
5、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的與Tie2蛋白特異性結(jié)合的配體多肽，其特征是， 配體多肽的酰胺、酯、或其鹽，或配體多肽形成的活性片段及活性衍生物。
6、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的與Tie2蛋白特異性結(jié)合的配體多肽，其特征是， 形成的游離型多肽、融合型多肽、嵌合類多肽、或以配體多肽為單體的聚合物。
7、 一種藥物輸送系統(tǒng)，其特征在于，該系統(tǒng)包括與包含SEQ ID NO. 1所 示的氨基酸序列的Tie2蛋白特異性結(jié)合的配體多肽、載藥系統(tǒng)、至少一種活性 物質(zhì)。
8、 根據(jù)權(quán)利要求7所述的藥物輸送系統(tǒng)，其特征是，所述載藥系統(tǒng)具體為 脂質(zhì)體，形成脂質(zhì)體的脂質(zhì)分子為磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、磷 脂酰肌醇、磷脂酰絲氨酸、磷脂酸、心磷脂、鞘磷脂、腦苷脂，神經(jīng)節(jié)苷脂、麥角固醇、膽固醇、陽離子脂質(zhì)、溶血磷脂、聚乙二醇修飾的脂質(zhì)或配體多肽修飾 的脂質(zhì)中的一種或多種。
9、 根據(jù)權(quán)利要求7所述的藥物輸送系統(tǒng)，其特征是，所述至少一種活性物 質(zhì)為任何需要被輸送到體內(nèi)特定位置的物質(zhì)。
10、 根據(jù)權(quán)利要求7所述的藥物輸送系統(tǒng)，其特征是，所述至少一種活性物 質(zhì)為抗腫瘤藥物、抗代謝藥物、紡錘體毒性生物堿、細胞毒性/抗腫瘤抗生素、拓撲異構(gòu)酶抑制劑、光敏劑、激酶抑制劑、抗生素、抗真菌素、抗炎藥物、免疫 抑制劑、抗感染藥物、抗病毒藥物、驅(qū)蟲藥、抗寄生蟲的化合物，用于超聲造影、 放射造影、核醫(yī)學(xué)造影劑的診斷試劑，目的基因、反義癌基因、自殺基因、細胞 凋亡基因、細胞因子基因，或上述基因的組合，或含有上述基因的真核表達載體 DNA。
全文摘要
一種醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域的與Tie2蛋白特異性結(jié)合的配體多肽及藥物輸送系統(tǒng)；其中，該配體多肽為包含SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的多肽；本發(fā)明還涉及所述配體多肽的酰胺、酯、或其鹽，或配體多肽形成的活性片段及活性衍生物；所述配體多肽形成的游離型多肽、融合型多肽、嵌合類多肽、或以配體多肽為單體的聚合物；本發(fā)明涉及的藥物輸送系統(tǒng)包括與Tie2蛋白特異性結(jié)合的配體多肽、載藥系統(tǒng)、至少一種活性物質(zhì)。本發(fā)明的配體多肽結(jié)構(gòu)清楚，不易發(fā)生多肽與多肽之間的空間位阻效應(yīng)，無Fc段的干擾；幾乎沒有免疫原性，副作用小，容易制備和生產(chǎn)，使用方便，可作為靶向肽用于藥物輸送系統(tǒng)及基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)。
文檔編號A61P31/10GK101555273SQ20091004873
公開日2009年10月14日 申請日期2009年4月2日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月2日
發(fā)明者徐宇虹, 麥俊華 申請人:上海交通大學(xué)