專利名稱：人骨橋蛋白siRNA的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于抑制人骨橋蛋白(Osteopontin，0ΡΝ)表達(dá)的siRNA。
背景技術(shù)：
多細(xì)胞生物，是由細(xì)胞-組織-器官-個(gè)體進(jìn)行階段性地構(gòu)成，通過(guò)最小單位的細(xì) 胞相互粘附或者與細(xì)胞外的物質(zhì)進(jìn)行粘附而形成。對(duì)于組織的構(gòu)成，在細(xì)胞-細(xì)胞間的粘 附的同時(shí)，也有細(xì)胞-細(xì)胞外基質(zhì)之間的粘附。在這種細(xì)胞間的粘附中，存在于細(xì)胞外基 質(zhì)、膜中的細(xì)胞粘附分子以及細(xì)胞粘附分子的細(xì)胞內(nèi)的作為結(jié)合物的細(xì)胞骨架起著重要的 作用。參與細(xì)胞一細(xì)胞外基質(zhì)間粘附的細(xì)胞粘附分子，基于細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)合，起到了細(xì)胞 分化、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的作用。因此，通過(guò)分析細(xì)胞粘附分子與細(xì)胞外基質(zhì)的粘附機(jī)構(gòu)，解析各種 疾病中的機(jī)理，進(jìn)而惠及治療。作為一種細(xì)胞外基質(zhì)的骨橋蛋白(OPN)，是分子量約為41kDa的分泌型酸性磷酸 化糖蛋白，分子中心部存在在與α ν等的整合蛋白(integrin)之間的粘附中起重要作用 的GRGDS序列，緊跟其后存在凝血酶裂解位點(diǎn)(R168S169)。此外，緊跟GRGDS序列后存在的 SVVYGLR序列，與參與炎癥的稱為α9β1、α4β1、α 4 β 7的整合蛋白相結(jié)合。關(guān)于OPN的報(bào)道有細(xì)胞粘附、細(xì)胞遷移、控制一氧化氮(NO)產(chǎn)生、參與免疫系統(tǒng)等 多種功能，已指出其參與了癌轉(zhuǎn)移、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和多發(fā)性硬化癥等慢性炎癥疾病、自身免 疫疾病等多種難治疾病的病狀。特別是指出了其直接參與炎癥性疾病。作為OPN的受體的α 9整合蛋白在嗜中性 粒細(xì)胞上進(jìn)行表達(dá)，α 4整合蛋白在淋巴細(xì)胞上進(jìn)行表達(dá)，因此考慮通過(guò)抑制OPN功能來(lái)抑 制包括嗜中性粒細(xì)胞的白細(xì)胞的遷移，以此期待有抗炎癥作用。事實(shí)上，已有報(bào)道OPN缺陷小鼠對(duì)腫瘤、風(fēng)濕性(rheumatism)關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化 癥(EAE)、動(dòng)脈硬化等疾病顯示出抵抗性(非專利文獻(xiàn)1 4)。此外，也有報(bào)道是采用相對(duì) 于OPN的中和抗體，對(duì)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎有緩解(非專利文獻(xiàn)5)。因此，基于對(duì)OPN功能的抑制，認(rèn)為能夠期待其治療效果，研究了在作為新型分子 特異性敲低(knock down)法的RNAi(RNA干擾RNA interference)法的治療方面的應(yīng)用。所謂RNAi法，是指采用小片段干擾性dsRNA(siRNA(小片段干擾性RNA small interfering RNA))，對(duì)特定基因的表達(dá)在基因水平上迅速進(jìn)行表達(dá)抑制的技術(shù)(非專利文 獻(xiàn)6和7)。從OPN的mRNA序列中，選擇2個(gè)以上靶序列，合成該siRNA，通過(guò)使OPN敲低以 關(guān)聯(lián)于對(duì)疾病的治愈。在專利文獻(xiàn)1中，記載有編碼骨橋蛋白部分的RNA在涉及IL-Ιβ的結(jié)締組織疾病 的治療中的應(yīng)用。但是，對(duì)于作為siRNA的應(yīng)用，沒(méi)有任何公開(kāi)。在專利文獻(xiàn)2中記載，F(xiàn)GFR(成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體fibroblast growth factor receptors)的siRNA和FGFR使OPN基因的表達(dá)亢進(jìn)。但是，對(duì)于OPN的siRNA，沒(méi) 有任何公開(kāi)和啟示。此外，利用載體以離體方式形成雙鏈RNA，并將其采用RNaseIII核酸分解酶家族之一的dicer來(lái)切割而得到的由siRNA的群體所構(gòu)成的基因操作使用的試劑盒已在 市面上出售(SuperSilencing (注冊(cè)商標(biāo))人(Human) SPPl siRNA 試劑盒(Secreted phosphoprotein 1 (分泌型磷蛋白質(zhì) 1) (osteopontin(骨橋蛋白)，bone sialoprotein I (骨唾液酸蛋白I)，early T-Iymphocyte activation 1 (早期Τ-淋巴細(xì)胞活化1)))，非 專利文獻(xiàn)8)。但是，該試劑盒是以研究基因表達(dá)為目標(biāo)，用于采用siRNA抑制特定基因的表 達(dá)，而對(duì)于siRNA的醫(yī)藥用途并沒(méi)有任何公開(kāi)。此外，由上述制備方法所得到的siRNA，還含 有非分子特異性的短RNA片段，因此，存在所謂基因敲低特異性低的缺點(diǎn)。最近，作為有效用于處理由骨橋蛋白亢進(jìn)引起的疾病的藥品等的作為OPN的 siRNA,從小鼠、大鼠以及人的OPN的mRNA中得到siRNA (專利文獻(xiàn)3)?，F(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)1 日本特開(kāi)平8-191693專利文獻(xiàn)2 美國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)第2003/0143676A1號(hào)說(shuō)明書(shū)專利文獻(xiàn)3 日本特開(kāi)2005-323591非專利文獻(xiàn) 1 :Nemoto H,Rittling SR,Yoshitake H,Furuya K,Amagasa Τ,Tsuji K,Nifuji A,Denhardt DT,Noda Μ. Osteopontin deficiency reduces experimental tumor cell metastasis to bone and soft tissues. JBone Miner Res. 16 :652-9,2001.非專利文獻(xiàn)2 =Yumoto K, Ishijima Μ, Rittling SR, Tsuji K, Tsuchiya Y, Kon S, Nifuji A, Uede Τ, Denhardt DT, Noda Μ. Osteopontin deficiency protects joints against destruction in anti-type II collagen antibody-induced arthritis in mice.Proc Natl Acad Sci U S A. 99 :4556-4561,2002.非專利文獻(xiàn)3 :Chal3as D, Baranzini SE, Mitchell D, Bernard CC, Rittling SR, Denhardt DT,Sobel RA,Lock C,Karpuj M,Pedotti R,Heller R,Oksenberg JR,Steinman L. The influence of the proinflammatory cytokine, osteopontin, on autoimmune demyelinating disease. Science. 294 1731-5,2001.非專利文獻(xiàn)4 =Matsui Y, Rittling SR, Okamoto H, Inobe Μ, Jia N, Shimizu Τ, Akino Μ, Sugawara Τ, Morimoto J, Kimura C, Kon S, Denhardt D, Kitabatake A, Uede Τ. Osteopontin Deficiency Attenuates Atherosclerosis in Female Apolipoprotein Ε-Deficient Mice.Arterioscler Thromb Vasc Biol. 23 :1029—34，2003.非專禾Ij文獻(xiàn) 5 :Yamamoto N, Sakai F, Kon S, Morimoto J, Kimura C, Yamazaki H, OkazakiI, Seki N, Fujii T, Uede T.Essential role of the cryptic epitope SLAYGLR within osteopontin in a murine model of rheumatoid arthritis. J Clin Invest. 112 181-8,2003.非專禾Ij 文獻(xiàn) 6 :Fire A, Xu S, Montgomery MK, Kostas SA，Driver SE，Mello CC.Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391 :806-11,1998.非專利文獻(xiàn)7:Elbashir SM, Harborth J, Lendeckel W, Yalcin A,Weber K, Tuschl T. Duplexes of 21—nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells. Nature. 411 :494-8,2001.非專利文獻(xiàn)8 =SuperArray社，SuperSilencing(注冊(cè)商標(biāo))產(chǎn)品說(shuō)明，[平成16年(2004 年)3 月 22 日檢索]。網(wǎng)絡(luò)地址 <URL :http://www. superarray. com/sirnaqa. php>

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明要解決的課題在這種狀況下，希望開(kāi)發(fā)出一種比過(guò)去的SiRNA能更有效地針對(duì)人骨橋蛋白的亢 進(jìn)所引起的人類疾病的治療的siRNA。解決課題的方法本申請(qǐng)的發(fā)明人通過(guò)精心研究，發(fā)現(xiàn)了一種siRNA能夠比已知的siRNA更特異且 更強(qiáng)地抑制人骨橋蛋白的表達(dá)，從而完成了本發(fā)明。于是，本發(fā)明提供下述RNA、siRNA或含 有它們的組合物和藥品。(1)RNA、RNA的互補(bǔ)鏈或它們的衍生物，其中，RNA由序列號(hào)3、4、5、6或7所示的序 列構(gòu)成。(2)雙鏈RNA或雙鏈RNA的衍生物，其中，雙鏈RNA由序列號(hào)3、4、5、6或7所示的 序列構(gòu)成的RNA與它們各自的互補(bǔ)鏈所構(gòu)成。(3)用于抑制骨橋蛋白的表達(dá)的醫(yī)藥組合物，其中，含有上述( 所述的雙鏈RNA 或雙鏈RNA的衍生物。(4)用于抑制骨橋蛋白的表達(dá)的藥品，其中，作為有效成分含有上述(2)所述的雙 鏈 RNA。(5)用于處理由骨橋蛋白的亢進(jìn)所引起的疾病的藥品，其中，作為有效成分含有上 述⑵所述的雙鏈RNA或雙鏈RNA的衍生物。(6)上述(5)所述的藥品，其中，上述由骨橋蛋白的亢進(jìn)所引起的疾病，是腫瘤、肝 炎、動(dòng)脈硬化、多發(fā)性硬化癥、關(guān)節(jié)炎、風(fēng)濕病或肺纖維癥。(7) siRNA表達(dá)載體，其中，含有上述⑴所述的RNA。發(fā)明的效果本發(fā)明的siRNA，與過(guò)去的相對(duì)于人OPN mRNA的siRNA相比，以不同人OPN的mRNA 的位點(diǎn)作為對(duì)象位點(diǎn)，使得人的OPN的基因進(jìn)行敲低的效果顯著高。因此，更適于作為人骨 橋蛋白的亢進(jìn)所引起疾病的治療用的藥品等。


圖1是表示人OPN siRNA的靶序列及其位置以及本發(fā)明的hOPN siRNA (hOPN siRNA-5,7,8,9,10)的圖。圖2是表示實(shí)施例中所用的人OPN siRNA序列的圖。圖3是表示基于人OPN siRNA的HT1080細(xì)胞中的OPN分泌抑制效果的柱狀圖。圖4是表示基于人OPN siRNA的NRC-12細(xì)胞中的OPN分泌抑制效果的柱狀圖。圖5是表示基于人OPN siRNA的G361細(xì)胞中的OPN分泌抑制效果的柱狀圖。
具體實(shí)施例方式下面，就本發(fā)明的實(shí)施方式進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，提供了來(lái)自人的骨橋蛋白基因的序列號(hào)3、4、5、6或7所示的序列構(gòu)成的RNA、它們的互補(bǔ)鏈或它們的衍生物。此外，本說(shuō)明書(shū)中，有時(shí)稱這些 RNA或其衍生物為“本發(fā)明的RNA”。本說(shuō)明書(shū)中，所謂“骨橋蛋白”或“人骨橋蛋白”，也稱作分泌型磷蛋白質(zhì) Ksecreted phosphoprotein 1)，是骨的基質(zhì)(matrix)中含有的一種粘附蛋白質(zhì)，是指由 序列號(hào)1所示的氨基酸序列構(gòu)成的人骨橋蛋白的蛋白質(zhì)。骨橋蛋白，具有與整合蛋白相結(jié) 合的RGD序列，具有將破骨細(xì)胞和造骨細(xì)胞雙方粘附于骨組織周?chē)淖饔?。此外，骨橋蛋?帶有的電荷形成強(qiáng)的陰性，具有使羥磷灰石沉積，保持骨的鈣質(zhì)的作用。人骨橋蛋白基因的堿基序列，如序列號(hào)2所示。圖1中顯示了人骨橋蛋白基因的堿基序列以及本發(fā)明的SiRNA的靶序列。在本說(shuō)明書(shū)中，所謂相對(duì)于某個(gè)RNA序列“其互補(bǔ)鏈”的情況，是指相對(duì)于具有 規(guī)定堿基序列的RNA，而具有基于A:U和G:C堿基對(duì)關(guān)系而形成的堿基互補(bǔ)關(guān)系的RNA。在 DNA(脫氧核糖核酸)的互補(bǔ)的雙鏈中，編碼蛋白質(zhì)的鏈，即，具有與mRNA相同序列的鏈為正 義鏈，具有與正義鏈堿基互補(bǔ)關(guān)系的序列的鏈為反義鏈。在本說(shuō)明書(shū)中，關(guān)于RNA的所謂“其衍生物”的情況，是指為了提高RNA的穩(wěn)定性 而施以修飾的該RNA的衍生物的意思。作為所述衍生物的例子，例如，在3‘端添加數(shù)個(gè)dT、 優(yōu)選為2 4個(gè)、更優(yōu)選為2或3個(gè)、最優(yōu)選為2個(gè)dT而進(jìn)行加成的3'外伸型衍生物；以 聚乙二醇、膽固醇或2' -ο-甲基等進(jìn)行修飾的衍生物；為了整合于所謂串聯(lián)型、P Ψ K 夕"、siRNA表達(dá)載體而使2個(gè)啟動(dòng)子(例如U6啟動(dòng)子)、正義RNA和反義RNA進(jìn)行結(jié)合 的衍生物，具體而言是使U6啟動(dòng)子、正義RNA、5個(gè)T、U6啟動(dòng)子、反義RNA、5個(gè)T進(jìn)行結(jié)合 的衍生物；為了整合于所謂莖環(huán)型siRNA表達(dá)載體，通過(guò)短發(fā)夾型RNA產(chǎn)生siRNA，而使啟 動(dòng)子(例如U6啟動(dòng)子)、正義RNA、環(huán)序列和反義RNA進(jìn)行結(jié)合的衍生物，具體而言，是使U6 啟動(dòng)子、正義RNA、環(huán)序列(例如，可以舉出gtgtgctgtcc)、反義RNA進(jìn)行結(jié)合的衍生物等。本發(fā)明還在其它實(shí)施方式中，提供了序列號(hào)3、4、5、6或7所示的序列所構(gòu)成的RNA 與其各自的互補(bǔ)鏈所構(gòu)成的雙鏈RNA或其衍生物。在本說(shuō)明書(shū)中，所謂“siRNA(小片段干擾性RNA:small interfering RNA) ”是指 由21 27bp構(gòu)成的雙鏈RNA，其是能夠誘導(dǎo)RNA干擾(RNA interference =RNAi)的雙鏈 RNA。此外，所謂RNA干擾，是指基于雙鏈RNA抑制與該RNA有相同序列的基因的表達(dá)的現(xiàn)象。RNAi能夠破壞具有特定序列的基因，因此，對(duì)基因功能的解析和特定基因的表達(dá) 抑制是有用的。此外，其具有對(duì)細(xì)胞有少量的導(dǎo)入量即有較長(zhǎng)時(shí)間持續(xù)效果的特點(diǎn)。本發(fā)明的來(lái)自人骨橋蛋白基因的序列號(hào)3、4、5、6或7所示的序列構(gòu)成的RNA與其 各自的互補(bǔ)鏈所構(gòu)成的雙鏈RNA或其衍生物，能夠作為具有這種RNAi效果的siRNA進(jìn)行使 用。本說(shuō)明書(shū)中，有時(shí)稱這些siRNA或其衍生物為“本發(fā)明的siRNA”或“本發(fā)明的人OPN siRNA”。本發(fā)明的siRNA，能夠采用通常的方法進(jìn)行合成，可采用市面上出售的DNA/RNA合 成儀，例如Applied Biosystems394型來(lái)進(jìn)行。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，提供一種擔(dān)載本發(fā)明的RNA的siRNA表達(dá)載體。本 發(fā)明的載體，可用于在靶細(xì)胞中表達(dá)本發(fā)明的siRNA。本發(fā)明的siRNA表達(dá)載體，可依照通常的方法進(jìn)行制備。在串聯(lián)型的情況下，能夠這樣進(jìn)行制備利用PCR，通過(guò)含有正義鏈、反義鏈序列的引物，對(duì)啟動(dòng)子部分進(jìn)行擴(kuò)增，將 擴(kuò)增的片斷用限制酶進(jìn)行切割后，通過(guò)在載體的啟動(dòng)子(例如U6啟動(dòng)子)的下游插入來(lái)制 備。在莖環(huán)情況下，能夠這樣進(jìn)行制備使含有正義鏈-環(huán)-反義鏈序列的寡核苷酸進(jìn)行合 成退火，通過(guò)在載體的啟動(dòng)子(例如TO啟動(dòng)子)的下游插入來(lái)制備。在本發(fā)明的其它實(shí)施方式中，提供了一種含有本發(fā)明的SiRNA的用于抑制骨橋蛋 白的表達(dá)的組合物。在本發(fā)明進(jìn)一步的其它實(shí)施方式中，提供了一種作為有效成分含有本 發(fā)明的siRNA的用于抑制骨橋蛋白的表達(dá)的藥品或者作為有效成分含有本發(fā)明的siRNA的 處理由骨橋蛋白亢進(jìn)引起的疾病的藥品。進(jìn)而，含有本發(fā)明的siRNA的組合物，其自身直接或者與公知的藥學(xué)上可接受的 載體(包括賦形劑、增量劑、粘合劑、潤(rùn)滑劑等)、慣用的添加劑等相混合而制備成醫(yī)藥組合 物，能夠用于處理人的疾病。本發(fā)明的siRNA，具有抑制骨橋蛋白表達(dá)的效果，因此，作為有 效成分含有本發(fā)明的siRNA的醫(yī)藥組合物，能夠用于處理由骨橋蛋白的表達(dá)亢進(jìn)所引起的 疾病(有代表性的有腫瘤、肝炎、動(dòng)脈硬化、多發(fā)性硬化癥、關(guān)節(jié)炎、風(fēng)濕病或肺纖維癥)。本 發(fā)明的醫(yī)藥組合物，作為在生物體內(nèi)穩(wěn)定性以及向體內(nèi)傳送的方法，能夠應(yīng)用與脂質(zhì)體等 傳送載體、位點(diǎn)特異性抗體或細(xì)胞種類特異性功能性肽結(jié)合等的技術(shù)。此外，根據(jù)制備的方 式(片劑、丸劑、膠囊劑、散劑、顆粒劑、糖漿劑等口服劑；注射劑、外用劑、栓劑等非口服藥 劑)等，能夠設(shè)定口服用藥或非口服用藥。給藥量因有效成分的種類、給藥方式、給藥對(duì)象 或患者年齡、體重、癥狀等不同而不能一概進(jìn)行規(guī)定，通常，作為1天的給藥量為數(shù)mg 2g 左右，優(yōu)選為數(shù)十mg左右，能夠分為1天1次 數(shù)次進(jìn)行給藥。下面，通過(guò)出示實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更詳細(xì)的說(shuō)明，但本發(fā)明的范圍并不局限于 此。
實(shí)施例(寡核苷酸的制備)采用核糖核苷-3'-亞磷酰胺(GLEN 1J寸一 f (Glen Research)制造)，通過(guò) DNA自動(dòng)合成儀(Applied Biosystem Model 394A)合成了寡核糖核苷酸。各RNA片斷以 1 μ mol的規(guī)模進(jìn)行合成。在合成結(jié)束后，對(duì)合成的寡核苷酸所結(jié)合的CPG(Controlled Pore Glass，可控孔度玻璃)，用濃氨水乙醇(3 1 ν/ν)混合液，在室溫下處理2小時(shí)，然后 將寡核糖核苷酸從CPG樹(shù)脂中切割取出，進(jìn)而在55°C加溫16小時(shí)。作為陽(yáng)性對(duì)照合成了 hOPN siRNA-4以及hOPN siRNA_6 ；作為陰性對(duì)照，合成了具有下述結(jié)構(gòu)的與各個(gè)siRNA序 列不同的GC含量為52%和47%的打亂(scramble)序列Scr. Cont. C8和Scr. Cont. C9。Scr. Cont. C8 5' -ACTCTATCTGCACGCTGAC-3‘(序列號(hào) 10)Scr. Cont. C9 5' -ATTGTATGCGATCGCAGAC-3‘(序列號(hào) 11)對(duì)溶劑進(jìn)行蒸除，在殘?jiān)屑尤隝ml的IM TBAF (四丁基氟化銨)/THF (四氫呋喃) 溶液，在37°C攪拌16小時(shí)。對(duì)此加入5ml的0. IM三乙基乙酸銨(pH 7.0)之后，采用C18(力 才一夕一 < 社制造)開(kāi)管柱色譜法進(jìn)行分離(柱尺寸1.5 X 12cm:通過(guò)采用5-40%的乙腈、 50mM的三乙基碳酸氫銨水溶液的溶劑的濃度梯度進(jìn)行洗脫)。收集以約30%濃度的乙腈得 以洗脫的具有二甲氧基三苯甲基的顯色的片段，對(duì)其加入5ml的0. OlN鹽酸，攪拌15分鐘， 去除二甲氧基三苯甲基。使用0. IN氨水進(jìn)行中和，對(duì)水層以醋酸乙酯(ethyl acetate)進(jìn)行清洗，在蒸除溶劑后，溶解于Iml無(wú)菌水中。對(duì)該組分中的寡核糖核苷酸，采用反相HPLC 進(jìn)行分離，分別收取，然后，再采用離子交換HPLC進(jìn)行分離，分別收取，進(jìn)行提純。將所得到 的寡核苷酸供給后述的實(shí)驗(yàn)。(反相以及離子交換HPLC的條件)反相HPLC柱μ- 夕· 7 7 4 7 — (C-18)柱、Φ 3. 9 X 150mm(waters 公司制造)溶劑=A溶液，5% 乙腈 /0. IM TEAA (pH 7. 0)；B 溶液，25 % 乙腈 /0. IM TEAA (pH 7. 0)。離子交換HPLC柱TSKgelDEAE 2SW 柱，4. 6 X 250匪，東乂一(株式會(huì)社)制造溶劑A溶液，20%乙腈；B溶液，含20%乙腈的2M甲酸銨。(OPN siRNA導(dǎo)入培養(yǎng)細(xì)胞中的方法)通過(guò)使用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑2000 (Invitrogen (Carlsbad, CA)制造)的脂質(zhì)轉(zhuǎn)染法， 在M孔板中增殖的對(duì)數(shù)增殖期的培養(yǎng)細(xì)胞中，導(dǎo)入OPN SiRNA0作為培養(yǎng)細(xì)胞，采用OPN內(nèi) 源性表達(dá)的HT1080細(xì)胞、NRC-12細(xì)胞、G361細(xì)胞。HT1080細(xì)胞是纖維肉瘤細(xì)胞，NRC-12細(xì) 胞是腎癌細(xì)胞，G361細(xì)胞是黑素瘤細(xì)胞。在50 μ L的Opti-MEM I培養(yǎng)基(invitrogen制造)中，加入2 μ L脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試 劑2000，放置5分鐘。用另一個(gè)試管，在50μ L的TIL培養(yǎng)基中加入0.8yg的siRNA。將 兩個(gè)試管中的內(nèi)容物混合，放置20分鐘，制備siRNA-脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑2000的復(fù)合物。對(duì) 于細(xì)胞，用TIL培養(yǎng)基進(jìn)行清洗后，加入500 μ L的TIL培養(yǎng)基，再加入siRNA-脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染 試劑2000復(fù)合物，對(duì)其進(jìn)行培養(yǎng)M小時(shí)。接著，回收上清液，采用ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay 酶聯(lián)免疫吸附法)測(cè)定上清液中的OPN表達(dá)水平。(ELISA)對(duì)于人OPN siRNA的RNAi效果，采用人骨橋蛋白檢測(cè)ELISA試劑盒(免疫生物研 究所制造)檢測(cè)由細(xì)胞分泌的OPN的濃度，通過(guò)OPN分泌的抑制進(jìn)行調(diào)查。(OPN siRNA 的治療效果)采用上述ELISA 試劑盒，在 HT1080 (Human Fibrosarcoma cells)細(xì)胞、NRC-12 細(xì)胞、G361細(xì)胞中，對(duì)本發(fā)明的人OPN siRNA的轉(zhuǎn)移抑制能力進(jìn)行調(diào)查。所使用的人OPN siRNA的正義鏈，如下面表1所示(3'末端的dT予以省略)。表 1
序列名序列序列號(hào)hOPN siRNA-55' -CCAAGUAAGUCCAACGAAA-3‘3hOPN siRNA-75' -GGUCAAAAUCUAAGAAGUU-3‘4hOPN siRNA-85' -GGGAAGGACAGUUAUGAM-3 ‘權(quán)利要求
1.RNA、RNA的互補(bǔ)鏈或它們的衍生物，其中，RNA由序列號(hào)3、4、5、6或7所示的序列構(gòu)成。
2.雙鏈RNA或雙鏈RNA的衍生物，其中，雙鏈RNA由序列號(hào)3、4、5、6或7所示的序列構(gòu) 成的RNA和它們各自的互補(bǔ)鏈構(gòu)成。
3.一種用于抑制骨橋蛋白的表達(dá)的醫(yī)藥組合物，其中，含有權(quán)利要求2所述的雙鏈RNA 或雙鏈RNA的衍生物。
4.一種用于抑制骨橋蛋白的表達(dá)的藥品，其中，作為有效成分含有權(quán)利要求2所述的 雙鏈RNA或雙鏈RNA的衍生物。
5.一種用于處理由骨橋蛋白的亢進(jìn)所引起的疾病的藥品，其中，作為有效成分含有權(quán) 利要求2所述的雙鏈RNA或雙鏈RNA的衍生物。
6.如權(quán)利要求5所述的藥品，其中，所述由骨橋蛋白的亢進(jìn)所引起的疾病是腫瘤、肝 炎、動(dòng)脈硬化、多發(fā)性硬化癥、關(guān)節(jié)炎、風(fēng)濕病或肺纖維癥。
7.一種siRNA表達(dá)載體，其中，含有權(quán)利要求1所述的RNA。
全文摘要
本發(fā)明提供一種用于更特異且更強(qiáng)地抑制人骨橋蛋白表達(dá)的siRNA、含有該siRNA的組合物和藥品。
文檔編號(hào)A61K48/00GK102099467SQ20088012961
公開(kāi)日2011年6月15日 申請(qǐng)日期2008年6月6日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月6日
發(fā)明者上出利光 申請(qǐng)人:株式會(huì)社遺傳科技