專(zhuān)利名稱(chēng)：：兩親性聚合物和屬于bmp家族的成骨蛋白之間的復(fù)合物的制作方法兩親性聚合物和屬于BMP家族的成骨蛋白之間的復(fù)合物本發(fā)明涉及兩親性聚合物和屬于骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)家族的成骨蛋白之間的水溶性原始復(fù)合物的形成，所述復(fù)合物是在物理和化學(xué)上穩(wěn)定的并因此改善了在體外和在體內(nèi)BMP的物理和化學(xué)穩(wěn)定性。骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)是參與骨誘導(dǎo)機(jī)制的生長(zhǎng)因子。也稱(chēng)為成骨蛋白(OP)的BMP最初于1965年由Urist進(jìn)行了表征(UristMR.Science1965；150,893)這些從骨密質(zhì)分離出的蛋白質(zhì)具有在許多動(dòng)物中誘導(dǎo)骨形成的能力(UristMR.Science1965；150,893)。BMP以前肽的形式進(jìn)行表達(dá)，后者在翻譯后成熟之后，具有104至139個(gè)殘基的長(zhǎng)度。它們彼此之間具有很大的序列同源性并且具有類(lèi)似的三維結(jié)構(gòu)。特別地，它們具有6個(gè)在形成“半胱氨酸結(jié)(cysteineknot)，，的分子內(nèi)二硫鍵中所牽涉的半胱氨酸殘基(ScheuflerC.2004J.Mol.Biol.1999；287，103；SchluneggerMP,J.Mol.Biol.1993；231，445)。它們中的某些具有還在導(dǎo)致二聚體形成的分子間二硫鍵中所牽涉的第7個(gè)半胱氨酸(ScheuflerC.2004J.Mol.Biol.1999；287103)。在其活性形式下，BMP裝配成同二聚體，甚至異二聚體，如Israel等人所描述的那樣(IsraelDI，GrowthFactors.1996；13(3-4)，291)。二聚體BMP與BMPR類(lèi)型的跨膜受體相互作用(Mundy等人，GrowthFactors，2004，22(4)，233)。該識(shí)別引發(fā)尤其牽涉Smad蛋白的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)級(jí)聯(lián)，如此導(dǎo)致靶基因的激活或抑制。BMP(除了BMP1禾Π3夕卜)對(duì)于間充質(zhì)細(xì)胞的分化起著直接或間接的作用，導(dǎo)致它們分化為成骨細(xì)胞(ChengH.,J.BoneandJointSurgery,2003,85A1544-1552)。此外，它們還具有趨化性并且誘導(dǎo)增殖、分化和血管發(fā)生。某些重組人BMP，尤其是rhBMP-2和rhBMP_7，清楚地顯示出在人中于體內(nèi)誘導(dǎo)骨形成的能力并且已被批準(zhǔn)用于某些醫(yī)學(xué)應(yīng)用。因此，將重組人BMP-2(根據(jù)國(guó)際通用命名為代勃特明-α)配制在以inFUSE的名稱(chēng)(在美國(guó))和以InductOs的名稱(chēng)(在歐洲)進(jìn)行銷(xiāo)售的產(chǎn)品中。該產(chǎn)品被指定用于腰椎的融合和脛骨的骨再生(對(duì)于稱(chēng)為骨不連合的骨折)。在用于腰椎融合的InFUSE的情況下，外科手術(shù)首先在于用rhBMP-2的溶液浸透膠原海綿，然后將海綿放置入預(yù)先植入到椎骨之間的空心支架(LT支架)中。重組人BMP-7(根據(jù)國(guó)際通用命名為依托特明-α)具有與BMP-2相同的治療適應(yīng)癥并且構(gòu)成了兩種產(chǎn)品的基礎(chǔ)用于脛骨的開(kāi)放性骨折的0Ρ-1Implant和用于腰椎融合的0P-1Putty。OP-IImplant由待接納在0.9%鹽水溶液中的包含rhBMP-7和膠原的粉末組成。然后，將所獲得的糊狀物在外科手術(shù)期間應(yīng)用在骨折處。0P-1Putty以?xún)煞N粉末的形式存在一種包含rhBMP-7和膠原，另一種包含羧甲基纖維素(CMC)。在外科手術(shù)過(guò)程中，CMC用0.9%鹽水溶液進(jìn)行重構(gòu)并與rhBMP-7和膠原相混合。將如此獲得的糊狀物應(yīng)用在待處理的部位上。在目前已商業(yè)化的所有蛋白質(zhì)中，BMP由于其強(qiáng)烈的疏水性和其聚集的能力(這導(dǎo)致在生理PH下非常低的溶解度)而顯得突出。在BMP-2的情況下，這些性質(zhì)已在為了其臨床開(kāi)發(fā)而進(jìn)行的研究的范圍內(nèi)被證明。它們?cè)谏項(xiàng)l件下溶解性差并且具有聚集的傾向(Schmoekel，2004J.Orthop.Res.2004；22(2)，376；Friess,W.，DrugDeliverySystemsBasedonCollagen,ShakerVerlag,ThesisAachenGermany1999；SchwartzDH,ThesisMunchenGermany2005)。因此，Abbatiello禾口Porter(ProteinSci.1997,6,Suppl299)已顯示，在低離子強(qiáng)度的緩沖液中，當(dāng)PH增加至4.5以上時(shí)，BMP-2變得越來(lái)越不溶。對(duì)于高于6.5的pH，觀察到蛋白質(zhì)發(fā)生沉淀，但在氯離子和/或硫酸根離子存在下在稍低的pH下(pH5.8,50mMNaCl；和ρΗ5·5,5mMNa2SO4)也觀察到沉淀，正如由Friess(Friess，W.，DrugDeliverySystemsBasedonCollagen,ShakerVerlag,ThesisAachenGermany1999)所顯示的。因此，在生理?xiàng)l件下BMP-2的配制完全是一個(gè)問(wèn)題。BMP的物理不穩(wěn)定性這個(gè)問(wèn)題的另一個(gè)例子由Biopharm在專(zhuān)利US2004132653中用BMP-14類(lèi)的蛋白質(zhì)GDF-5(生長(zhǎng)和分化因子(GrowthandDifferentiationFactor)，也稱(chēng)為MP-52)進(jìn)行了揭示。GDF-5的性質(zhì)與BMP-2非常相似，并且已觀察到凍干物的不穩(wěn)定性，所述凍干物具有在溶液重構(gòu)過(guò)程中凝縮和不能完全再溶解的傾向。這兩個(gè)現(xiàn)象與蛋白質(zhì)的不可逆聚集有關(guān)。為了解決這個(gè)問(wèn)題，在凍干之前添加甘露醇，從而使得能夠在固體狀態(tài)下防止這些問(wèn)題。然而，甘露醇僅提供了體外的低的穩(wěn)定化而不能防止體內(nèi)的物理不穩(wěn)定性?？紤]到由這些生長(zhǎng)因子的物理性質(zhì)所施加的約束，產(chǎn)品InFUSE應(yīng)當(dāng)在酸性pH(乙酸緩沖液，pH4)下和在表面活性劑聚山梨醇酯80存在下進(jìn)行配制，以便確保rhBMP-2的溶解性和物理穩(wěn)定性。然而，基于治療性蛋白質(zhì)的藥物的制造商極度地受到所述蛋白質(zhì)的物理穩(wěn)定性問(wèn)題的困擾。這是因?yàn)?，BMP聚集體的形成可以導(dǎo)致生物學(xué)活性種類(lèi)的數(shù)量的減少，生物活性或吸收速度的改變，針對(duì)這些聚集體的可能的免疫應(yīng)答，由于產(chǎn)品的乳光而引起的不希望的外觀，·過(guò)濾設(shè)備和注射裝置的阻塞。為了獲得的所希望的治療效果，必需采用非常大的、高于生理劑量10000倍的BMP的治療劑量。這種情況特別是在用產(chǎn)品例如InFUSE進(jìn)行椎骨融合的治療時(shí)，因?yàn)槭┯脦缀量说膔hBMP-2。這種待施用的BMP的巨大數(shù)量意味著必須在大約1.5mg/ml的BMP溶液的高濃度下進(jìn)行工作。在這樣的濃度，BMP非常容易聚集，因而不是在物理上穩(wěn)定的。所提供的溶液采用酸性緩沖液和表面活性劑。然而，從治療應(yīng)用的角度看，采用酸性且包含表面活性劑的溶液是有問(wèn)題的。已開(kāi)發(fā)了幾種方法以解決物理和化學(xué)穩(wěn)定性的這些問(wèn)題。首先，公知肝素和硫酸乙酰肝素用于使生長(zhǎng)因子(包括BMP)穩(wěn)定，因?yàn)檫@些多糖是內(nèi)源的穩(wěn)定分子(Ruppert等人，Eur.J.Biochem.1996，237，295)。然而，肝素和硫酸乙酰肝素具有非常強(qiáng)的抗凝和抗補(bǔ)體活性，因而不能用于藥物組合物。Hubbell描述了蛋白質(zhì)的嫁接方法，其在于在蛋白質(zhì)和載體之間形成化學(xué)鍵以便在纖維蛋白類(lèi)型的基質(zhì)中穩(wěn)定所述蛋白質(zhì)。所述鍵借助于可被酶切割的融合蛋白來(lái)建立。在出版物Biotechno.Bioeng.2005，89，3，253中所報(bào)道的這種方法使得能夠通過(guò)阻止聚集而有效地在物理上穩(wěn)定該蛋白質(zhì)。然而，該方法導(dǎo)致采用了BMP-2的類(lèi)似物，其迄今還未顯示出其治療效力和其無(wú)害性。在專(zhuān)利US20050209145中，Stupp等人描述了用于生長(zhǎng)因子(特別是BMP-2)的載體化的兩親性肽。這些兩親性肽由末端烷基鏈、親水性肽序列和允許BMP-2的粘附的表位構(gòu)成。這些肽在溶液中進(jìn)行組織排列，從而形成小棍類(lèi)型的大分子結(jié)構(gòu)，其中疏水基團(tuán)重集聚在中心。周?chē)陌被崾沟媚軌蛱峁┡c水的相容性和蛋白質(zhì)的粘附。然而，這些肽由于其復(fù)雜的一級(jí)結(jié)構(gòu)而具有免疫風(fēng)險(xiǎn)。在專(zhuān)利US6258382中，Takaoka等人所感興趣的是BMP的載體化以用于骨再生的應(yīng)用。這些作者開(kāi)發(fā)出了基于乳酸和/或乙醇酸、對(duì)-二氧雜環(huán)己酮、聚乙二醇的新型聚合物，其允許控制這些蛋白質(zhì)的釋放。然而，這些作者沒(méi)有解決任何在物理或化學(xué)穩(wěn)定性方面的與該生長(zhǎng)因子有關(guān)的問(wèn)題。此外，這些聚合物在水中是不溶的，但吸附水從而形成凝膠。相反地，這些聚合物在有機(jī)介質(zhì)中是可溶的，并且溶于丙酮。因此，聚合物-BMP-2制劑的制備需要采用有機(jī)溶劑，這意味著蛋白質(zhì)變性的風(fēng)險(xiǎn)(NatureBiotechnology,2001,19,332)0在專(zhuān)利US2005/0287135中，Wyeth描述了通過(guò)疏水基團(tuán)(芐醇)進(jìn)行修飾的乙酰透明質(zhì)酸，用于BMP的載體化。在這些聚合物中，疏水基團(tuán)的比率為50至100%，以致該聚合物在水中不溶但是可以吸附水。在這種情況下，這些吸濕的聚合物不能與該蛋白質(zhì)形成水溶性復(fù)合物，以便使得能夠解決BMP的穩(wěn)定性問(wèn)題。在FidiaetGeneticslnstitute的EP1454640中，也描述了相同類(lèi)型的制劑，然而，所描述的制劑不形成復(fù)合物，所例示的多糖不溶于水并且包含多于50%的疏水性酯基團(tuán)。在專(zhuān)利NZ530701中，Brodbeck等人采用PLAGA來(lái)用于BMP的載體化。這些聚合物在水中不溶，因此不能與該蛋白質(zhì)形成水溶性復(fù)合物。與申請(qǐng)人相反，所述作者的目標(biāo)是使在由PLAGA構(gòu)成的固體中的BMP不溶于水性介質(zhì)，這仍需要采用有機(jī)溶劑，這意味著蛋白質(zhì)變性的風(fēng)險(xiǎn)。作為例子，可以提及以題目“Effectsofheparin-likepolymersassociatedwithgrowthfactorsonosteoblastproliferationandphenotypeexpression",1998,J.Biomed.Mater.Res.，第44卷，第63-72頁(yè)發(fā)表的Blanquaert等人和Barritault等人的工作，其描述了用被認(rèn)為與各種生長(zhǎng)因子相互作用的芐胺進(jìn)行修飾的葡聚糖的用途。所述聚合物被描述為本身具有治療活性。這些作者還聲稱(chēng)，這些葡聚糖中的某些，更特別是用羧甲基(CM)、芐基酰胺(B)和磺酸(S)基團(tuán)取代的葡聚糖，(化合物CMDBS)，使得能夠在不添加生長(zhǎng)因子的情況下刺激骨重建(1995，Bone,17，6，499-506)。根據(jù)類(lèi)似的方法，在專(zhuān)利FR2794649中，Blanchat等人描述了用芐胺進(jìn)行修飾的葡聚糖和通過(guò)借助于磷酸三甲酯使聚合物鏈交聯(lián)而變得不溶的硫酸酯。這些在水性介質(zhì)中的海綿充當(dāng)BMP的儲(chǔ)庫(kù)，因?yàn)樗鼈兡軌虮Ａ糇≡摰鞍踪|(zhì)。在交聯(lián)之前，兩親性聚合物與BMP-2形成復(fù)合物，如在通過(guò)凝膠電泳進(jìn)行的相互作用分析中所顯示的那樣。然而，所用的聚合物/BMP的質(zhì)量比非常高，大于5000。采用這樣的高比例是由于非常弱的聚合物/蛋白質(zhì)相互作用，其導(dǎo)致復(fù)合物在溶液中解離。此外，沒(méi)有證明BMP的化學(xué)或物理穩(wěn)定性。此種比例對(duì)于開(kāi)發(fā)藥物產(chǎn)品來(lái)說(shuō)是主要障礙。還已知芐胺可能具有一定的毒性和可能損害在前面提及的兩篇專(zhuān)利中所描述的聚合物的生物相容性。用于骨重建的此類(lèi)蛋白質(zhì)的蓋侖氏制劑應(yīng)當(dāng)必須滿(mǎn)足賦形劑的無(wú)害性要求，并且為了到達(dá)這些要求，必需使用生物相容性化合物但還要限制其相對(duì)于活性成分的量。因此，開(kāi)發(fā)出允許使成骨蛋白例如BMP增溶和穩(wěn)定的可注射制劑這一問(wèn)題沒(méi)有得到滿(mǎn)意解決，所述BMP選自BMP-2(代勃特明-α)、ΒΜΡ_4、ΒΜΡ_7(依托特明-α),BMP-14和GDF-5o本發(fā)明使得能夠在成骨蛋白和生物相容性?xún)捎H性聚合物之間以低于700的聚合物/BMP質(zhì)量比形成穩(wěn)定的水溶性復(fù)合物。該復(fù)合物使得能夠避免在體外和在體內(nèi)在生理pH下由于其疏水性而發(fā)生的BMP聚集，在37°C下在細(xì)胞存在下穩(wěn)定BMP。該水溶性復(fù)合物在完全水性的介質(zhì)中形成，而無(wú)需憑借于使用有機(jī)溶劑。因此，本發(fā)明涉及在物理和化學(xué)上穩(wěn)定的、可溶于水的兩親性聚合物-BMP復(fù)合物，其特征在于■所述兩親性聚合物由通過(guò)疏水取代基和親水基團(tuán)進(jìn)行官能化的親水性多糖骨架構(gòu)成，根據(jù)下述通式I:Jm1「Iηγη「η1FF'Y一ιIL」yDP=m個(gè)單體單元RR'γIιΓIHyΧL」nLJO_JhL·R,R'，相同或不同，并且表示鍵或包含1至18個(gè)碳的鏈，所述鏈任選地是支化的和/或不飽和的，且包含一個(gè)或多個(gè)雜原子例如0、N或/和S，#F,F'，相同或不同，并且表示酯、硫酯、酰胺、碳酸酯、氨基甲酸酯、醚、硫醚或胺，·X表示親水基團(tuán)，其選自羧酸根、硫酸根、磺酸根、磷酸根、膦酸根，·Y表示親水基團(tuán)，其選自硫酸根、磺酸根、磷酸根、膦酸根，·Hy表示疏水基團(tuán)，其選自下列〇線性或支化的C8-C3tl烷基，其任選地是不飽和的和/或包含一個(gè)或多個(gè)雜原子例如0、N或S，〇線性或支化的C8-C18烷基芳基或芳基烷基，其任選地是不飽和的和/或任選地包含一個(gè)或多個(gè)雜原子例如0、N或S，〇C8-C30多環(huán)，其任選地是不飽和的和/或任選地包含一個(gè)或多個(gè)雜原子例如0、N或S，〇芐胺除外，眷11和0為1至3，·h表示疏水基序相對(duì)于糖單元而言的摩爾份數(shù)，其為0.01至0.5，·χ表示親水基團(tuán)相對(duì)于糖單元而言的摩爾份數(shù)，其為0至2.0，·y表示親水基團(tuán)相對(duì)于糖單元而言的摩爾份數(shù)，其為0至0.5，■所述BMP選自在治療上有活性的BMP(骨形態(tài)發(fā)生蛋白)，■聚合物/BMP的質(zhì)量比小于或等于700。在一個(gè)實(shí)施方案中，在根據(jù)本發(fā)明的復(fù)合物中，所述多糖選自如前面所定義的通式I的多糖，其中y=0。在一個(gè)實(shí)施方案中，在根據(jù)本發(fā)明的復(fù)合物中，所述多糖選自如前面所定義的通式I的多糖，其中X表示羧酸根。在一個(gè)實(shí)施方案中，在根據(jù)本發(fā)明的復(fù)合物中，根據(jù)本發(fā)明的多糖的特征在于基團(tuán)R選自下列基團(tuán)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula>在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及復(fù)合物，其特征在于，聚合物/BMP的質(zhì)量比小于或等于600。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及復(fù)合物，其特征在于，聚合物/BMP的質(zhì)量比小于或等于500。治療用途的BMP的濃度為在溶液中大約1.5mg/ml。當(dāng)所述比例大于700時(shí)，獲得包含1.0g/ml的兩親性聚合物的組合物?；谶@樣的聚合物濃度，制劑具有不再適合于藥學(xué)應(yīng)用的物理化學(xué)行為，例如在粘度方面。本發(fā)明涉及復(fù)合物，其特征在于，所述BMP選自BMP_2(代勃特明-α)、BMP-4、ΒΜΡ-7(依托特明-α)、BMP-14和GDF-5。所述兩親性聚合物的取代基以受控方式或隨機(jī)方式分布。在具有取代基的受控分布的聚合物中，可以提及例如嵌段共聚物和交替共聚物。無(wú)規(guī)共聚物*一單體一單體——單體一單體一單體一單體—*III疏水物疏水物疏水物嵌段共聚物*一單體一單體一單體一單體一單體一單體一*III疏水物疏水物疏水物交替共聚物*一單體一單體一單體一單體一單體一單體一*III疏水物疏水物疏水物因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明還涉及兩親性聚合物-BMP復(fù)合物，其特征在于，所述聚合物選自其取代基以隨機(jī)方式分布的聚合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述多糖選自乙酰透明質(zhì)酸、藻酸鹽、殼聚糖、聚半乳糖醛酸、硫酸軟骨素、葡聚糖、纖維素。纖維素的組由通過(guò)酸進(jìn)行官能化的纖維素例如羧甲基纖維素構(gòu)成。葡聚糖的組由通過(guò)酸進(jìn)行官能化的葡聚糖例如羧甲基葡聚糖構(gòu)成。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述多糖選自乙酰透明質(zhì)酸、藻酸鹽、殼聚糖。這些不同的多糖可以如下來(lái)表示<formula>formulaseeoriginaldocumentpage9</formula>聚半乳糖醛酸<formula>formulaseeoriginaldocumentpage9</formula>殼聚糖<formula>formulaseeoriginaldocumentpage10</formula>藻酸鹽。所述多糖可以具有10至10000的平均聚合度。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述多糖具有10至1000的平均聚合度。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述多糖具有10至500的平均聚合度。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明還涉及兩親性聚合物-BMP復(fù)合物，其特征在于，所述疏水基團(tuán)Hy選自天然來(lái)源的疏水氨基酸或者其醇、酯、脫羧基或酰胺衍生物，所述天然來(lái)源的疏水氨基酸選自色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸或異亮氨酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明還涉及兩親性聚合物-BMP復(fù)合物，其特征在于，所述疏水基團(tuán)Hy是色氨酸或者色氨酸的酯或酰胺衍生物。在色氨酸的衍生物中，可提及色氨醇(tryptophanol)、色氨酰胺(tryptophanamide)、2_吲哚乙胺。在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的兩親性聚合物-BMP復(fù)合物是可逆的。所使用的聚合物按照本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù)來(lái)合成，或者從制造商例如Sigma-Aidrich、N0FCorp.或CarboMerInc.購(gòu)買(mǎi)。所述BMP選自重組人BMP，其按照本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù)獲得，或者從制造商例如ResearchDiagnosticInc.(USA)公司購(gòu)買(mǎi)。BMP是非常疏水的生長(zhǎng)因子。在生理pH下，該蛋白質(zhì)的疏水性導(dǎo)致聚集，然后導(dǎo)致沉淀。根據(jù)本發(fā)明的兩親性聚合物-BMP復(fù)合物使得能夠在物理上穩(wěn)定在處于生理pH的溶液中的該蛋白質(zhì)?！拔锢砘蚧瘜W(xué)降解”是指任何物理范疇的事件，例如聚集，或者化學(xué)范疇的事件，例如蛋白水解，其導(dǎo)致該蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性降低。平行地，“蛋白質(zhì)的物理或化學(xué)穩(wěn)定化”是指保持該蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性的動(dòng)作。復(fù)合物的穩(wěn)定性通過(guò)測(cè)量BMP的穩(wěn)定性來(lái)進(jìn)行監(jiān)測(cè)。因此，可以尤其是通過(guò)進(jìn)行下列測(cè)試來(lái)證明通過(guò)兩親性聚合物的該蛋白質(zhì)的穩(wěn)定化通過(guò)凝膠混合電泳來(lái)揭示兩親性聚合物-BMP復(fù)合物的測(cè)試，在37°C和中性pH下進(jìn)行的在兩親性聚合物-BMP復(fù)合物中在細(xì)胞存在下BMP的熱穩(wěn)定性的測(cè)試，在生理PH下在所述復(fù)合物中BMP的物理穩(wěn)定化的測(cè)試。通過(guò)凝膠混合電泳來(lái)揭示兩親性聚合物-BMP復(fù)合物的測(cè)試基于在電場(chǎng)的影響下離子的移動(dòng)。陰離子復(fù)合物向陽(yáng)極遷移，而陽(yáng)離子復(fù)合物向陰極移動(dòng)。在遷移后，通過(guò)毛細(xì)管作用將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，并且通過(guò)該蛋白質(zhì)的特異性抗體(其被與過(guò)氧化物酶相偶聯(lián)的二抗所識(shí)別)來(lái)揭示。單獨(dú)的蛋白質(zhì)不遷移；與兩親性聚合物相復(fù)合的蛋白質(zhì)依照該復(fù)合物的總電荷而向陽(yáng)極或陰極遷移。在細(xì)胞存在下BMP的熱穩(wěn)定性的測(cè)試在37°C和中性pH下進(jìn)行，并且在于將BMP的溶液放置入包含成肌細(xì)胞C2C12的培養(yǎng)基中。在放置后(J2)和在5天的培養(yǎng)結(jié)束時(shí)(J7)通過(guò)ELISA測(cè)定法來(lái)測(cè)定BMP溶液的濃度。通過(guò)測(cè)定在成肌細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞的過(guò)程中在J2和J7之間所產(chǎn)生的堿性磷酸酶的活性來(lái)評(píng)價(jià)BMP的生物學(xué)活性。生理pH下BMP的物理穩(wěn)定化的測(cè)試基于通過(guò)將蛋白質(zhì)的初始緩沖液(通常在酸性pH下)與pH7.4的PBS溶液進(jìn)行交換來(lái)將蛋白質(zhì)溶液帶至生理pH。進(jìn)行三次交換，同時(shí)保持BMP在交換結(jié)束時(shí)處于恒定的濃度。在該過(guò)程結(jié)束時(shí)，通過(guò)在離心后進(jìn)行ELISA測(cè)定法來(lái)測(cè)定溶液中BMP的濃度。該測(cè)試還可以通過(guò)用固定在pH7.4的緩沖液稀釋濃縮的BMP-2溶液來(lái)進(jìn)行。通過(guò)在不存在任何能夠使該蛋白質(zhì)變性的有機(jī)溶劑的情況下，在生理pH下將BMP和兩親性聚合物制成水溶液來(lái)形成根據(jù)本發(fā)明的兩親性聚合物-BMP復(fù)合物。兩親性聚合物-BMP復(fù)合物的形成是自發(fā)的，并且不牽涉BMP和兩親性聚合物之間的共價(jià)鍵。這種締合通過(guò)弱鍵來(lái)進(jìn)行，所述弱鍵主要是疏水相互作用和離子相互作用。復(fù)合物的這種形成不需要任何有機(jī)溶劑。任選地，可以布置其他測(cè)試以完善根據(jù)本發(fā)明的兩親性聚合物-BMP復(fù)合物的證明?！MP的三級(jí)結(jié)構(gòu)的維持的測(cè)試，通過(guò)圓二色性來(lái)測(cè)定。在生理pH和脅迫下，在根據(jù)本發(fā)明的兩親性聚合物-BMP復(fù)合物中BMP的穩(wěn)定性的測(cè)試。所述脅迫可以是特定的攪拌方式、鹽的存在，等等。對(duì)于蛋白水解酶例如嗜熱菌蛋白酶的抗性的測(cè)試。通過(guò)本發(fā)明解決的問(wèn)題之一是增加了蛋白質(zhì)的穩(wěn)定化，并因此在體外和在體內(nèi)保持了生物學(xué)活性。該生物學(xué)活性可以通過(guò)能夠顯示BMP使成肌細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞的能力的各種測(cè)試來(lái)進(jìn)行評(píng)價(jià)。所述分化可以通過(guò)下列方式來(lái)測(cè)量測(cè)定在細(xì)胞培養(yǎng)物中所產(chǎn)生的堿性磷酸酶的活性，產(chǎn)生堿性磷酸酶的細(xì)胞的著色，在細(xì)胞培養(yǎng)物中所產(chǎn)生的骨鈣蛋白的RNA的RT-PCR。本發(fā)明還涉及治療組合物，其特征在于，所述治療組合物包含根據(jù)本發(fā)明的兩親性聚合物-BMP復(fù)合物?！爸委熃M合物”是指在人類(lèi)醫(yī)學(xué)或獸醫(yī)學(xué)中可用的組合物。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物是局部應(yīng)用的組合物，其可以以溶液、凝膠、霜?jiǎng)?、凍干物、粉劑或糊劑的形式存在。能夠與根據(jù)本發(fā)明的兩親性聚合物-BMP復(fù)合物一起進(jìn)行配制的賦形劑的種類(lèi)根據(jù)蓋侖氏醫(yī)學(xué)學(xué)者(galSniste)的常識(shí)依照該復(fù)合物的呈現(xiàn)形式來(lái)進(jìn)行選擇。因此，當(dāng)根據(jù)本發(fā)明的組合物以糊劑的形式存在時(shí)，該糊劑可以例如從諸如羧甲基纖維素(CMC)、磷酸三鈣和膠原的產(chǎn)品來(lái)獲得。為了調(diào)節(jié)該制劑的參數(shù)，在本發(fā)明中可以使用其他賦形劑，例如用于調(diào)節(jié)pH的緩沖液，使得能夠調(diào)節(jié)等滲性的試劑，防腐劑例如對(duì)羥基苯甲酸甲酯、對(duì)羥基苯甲酸丙酯、間甲酚或苯酚，或者抗氧化劑例如鹽酸L-賴(lài)氨酸。根據(jù)本發(fā)明，所述治療組合物的特征在于，所述治療組合物使得能夠施用大約1.5mg/ml的BMP。本發(fā)明還涉及根據(jù)本發(fā)明的兩親性聚合物-BMP復(fù)合物在制備用于在體內(nèi)誘導(dǎo)骨形成的治療組合物中的用途。本發(fā)明還涉及用于人或獸醫(yī)學(xué)使用的治療性治療方法，其特征在于，所述方法在于在治療部位處施用包含根據(jù)本發(fā)明的兩親性聚合物-BMP復(fù)合物的治療組合物。兩親性聚合物的合成實(shí)施例1通過(guò)色氨酸乙酯進(jìn)行修飾的羧甲基葡聚糖(PA1)從具有1.0的以“羧甲基/糖單元”表示的取代度和60kg/mol的平均摩爾質(zhì)量的羧甲基葡聚糖開(kāi)始來(lái)合成該兩親性聚合物。根據(jù)采用氯甲酸乙酯和N-甲基嗎啉的在有機(jī)溶劑中的常規(guī)偶聯(lián)方法，將色氨酸乙酯嫁接到該聚合物的酸上。在將反應(yīng)介質(zhì)在水中進(jìn)行稀釋并通過(guò)添加INNaOH將pH調(diào)節(jié)至7后，通過(guò)超濾來(lái)純化該聚合物。最終的聚合物的特征為X0.45的以“TrpOEt/糖單元”表示的取代度，其是在D2CVNaOD中通過(guò)1HNMR而測(cè)定的，X0.55的以“羧酸根(甲基羧酸根)/糖單元”表示的取代度，其是通過(guò)電勢(shì)分析法而測(cè)定的。實(shí)施例2通過(guò)色氨酸(鈉鹽)進(jìn)行修飾的羧甲基葡聚糖(PA2)通過(guò)PA1的堿性水解來(lái)獲得該兩親性聚合物。向兩親性聚合物1的水溶液(64ml，31mg/ml)中添加IN氫氧化鈉(3.79ml)以達(dá)到pH12.7。將所獲得的溶液在環(huán)境溫度下攪拌過(guò)夜。通過(guò)逆水(0.9%NaCl和H2O)進(jìn)行透析來(lái)純化該聚合物。最終的聚合物的特征為X0.45的以“TrpONa/糖單元”表示的取代度，其是在D2CVNaOD中通過(guò)1HNMR而測(cè)定的，X1.0的以“羧酸根(甲基羧酸根，色氨酸的羧酸根)/糖單元”表示的取代度，其是通過(guò)電勢(shì)分析法而測(cè)定的。實(shí)施例3通過(guò)苯丙氨酸乙酯進(jìn)行修飾的羧甲基葡聚糖(PA3)根據(jù)實(shí)施例1，從具有1.0的以“羧甲基/糖單元”表示的取代度和60kg/mol的平均摩爾質(zhì)量的羧甲基葡聚糖開(kāi)始來(lái)合成該兩親性聚合物。最終的聚合物的特征為X0.45的以“PheOEt/糖單元”表示的取代度，其是在D2CVNaOD中通過(guò)1HNMR而測(cè)定的，X0.55的以“羧酸根(甲基羧酸根)/糖單元”表示的取代度，其是通過(guò)電勢(shì)分析法而測(cè)定的。實(shí)施例4通過(guò)酪氨酸甲酯進(jìn)行修飾的羧甲基葡聚糖(PA4)根據(jù)實(shí)施例1，從具有1.0的以“羧甲基/糖單元”表示的取代度和60kg/mol的平均摩爾質(zhì)量的羧甲基葡聚糖開(kāi)始來(lái)合成該兩親性聚合物。最終的聚合物的特征為X0.45的以“TyrOMe/糖單元”表示的取代度，其是在D2CVNaOD中通過(guò)1HNMR而測(cè)定的，X0.55的以“羧酸根(甲基羧酸根)/糖單元”表示的取代度，其是通過(guò)電勢(shì)分析法而測(cè)定的。實(shí)施例5通過(guò)色氨酸乙酯進(jìn)行修飾的葡聚糖琥珀酸(PA5)從根據(jù)(Sanchez-Chaves,Manuel等人，Polymer1998，39(13)，2751-2757)的文章獲得的具有1.0的以“琥珀酸/糖單元”表示的取代度和70kg/mol的平均摩爾質(zhì)量的葡聚糖琥珀酸開(kāi)始來(lái)合成該兩親性聚合物。根據(jù)采用氯甲酸乙酯和N-甲基嗎啉的在有機(jī)溶劑中的常規(guī)偶聯(lián)方法，將色氨酸乙酯嫁接到該聚合物的酸上。在將反應(yīng)介質(zhì)在水中進(jìn)行稀釋并通過(guò)添加INNaOH將pH調(diào)節(jié)至7后，通過(guò)超濾來(lái)純化該聚合物。最終的聚合物的特征為X0.45的以“TrpOEt/糖單元”表示的取代度，其是在D2CVNaOD中通過(guò)1HNMR而測(cè)定的，X0.55的以“羧酸根(琥珀酸的羧酸根)/糖單元”表示的取代度，其是通過(guò)電勢(shì)分析法而測(cè)定的。相反實(shí)施例1通過(guò)十二烷胺進(jìn)行修飾的羧甲基葡聚糖(PA6)根據(jù)實(shí)施例1，從具有1.0的以“羧甲基/糖單元”表示的取代度和60kg/mo1的平均摩爾質(zhì)量的羧甲基葡聚糖開(kāi)始來(lái)合成該兩親性聚合物。最終的聚合物的特征為X0.10的以“十二烷胺/糖單元”表示的取代度，其是在D2CVNaOD中通過(guò)1HNMR而測(cè)定的，X0.90的以“羧酸根(甲基羧酸根)/糖單元”表示的取代度，其是通過(guò)電勢(shì)分析法而測(cè)定的。相反實(shí)施例2通過(guò)芐胺進(jìn)行修飾的羧甲基葡聚糖(PA7)該兩親性聚合物在專(zhuān)利FR2794649A中作了描述，它的特征為X0.45的以“芐胺/糖單元”表示的取代度，X0.55的以“羧酸根(甲基羧酸根)/糖單元”表示的取代度。通過(guò)共電泳的BMP-2對(duì)兩親性聚合物的親和力BMP-2/兩親性聚合物復(fù)合物的制備向7μ1的緩沖至ρΗ7.4的100mg/mlPA溶液中添加5μ1在緩沖液H20/AcN/TFA(64.9/35/0.1%)中的0.28mg/mlBMP-2溶液。用0.9%NaCl溶液將該溶液補(bǔ)足至14μ1。該溶液具有0.lmg/ml的BMP-2的濃度和1/500的BMP-2/PA比例。將該溶液在環(huán)境溫度下溫和地?cái)嚢?0分鐘。BMP-2/兩親性聚合物復(fù)合物的證明將BMP-2/PA溶液在遷移緩沖液(pH7的tris-乙酸鹽溶液)中稀釋20倍。然后，向8μ17jC和7μ1上樣緩沖液(水中的甘油、tris-乙酸鹽和溴酚藍(lán))中添加2μ1經(jīng)稀釋的溶液。將包含IOngΒΜΡ-2和5μgPA的這17μ1置于0.8%瓊脂糖凝膠的孔中。合上電泳槽，并將電發(fā)生器調(diào)至30V。遷移持續(xù)1小時(shí)。在遷移后，在電場(chǎng)下將凝膠轉(zhuǎn)移至置于陽(yáng)極處的PVDF膜上(20分鐘，15V，Bio-Rad的Trans-BlotSD)。在環(huán)境溫度下用脫脂乳使該膜飽和1小時(shí)，接著與BMP-2的一抗一起進(jìn)行溫育(于4°C下過(guò)夜)，并最后與二抗即兔抗山羊-HRP—起進(jìn)行溫育(在環(huán)境溫度下1小時(shí))。通過(guò)HRP對(duì)于0pti-4CN的反應(yīng)來(lái)進(jìn)行揭示。當(dāng)著色足夠時(shí)終止揭示，因?yàn)榉磻?yīng)產(chǎn)物吸收可見(jiàn)光。當(dāng)BMP-2與PA形成復(fù)合物時(shí)，在離上樣處0.7cm處以單個(gè)點(diǎn)的形式檢測(cè)到該復(fù)合物(向陽(yáng)極遷移)。當(dāng)BMP-2是單獨(dú)的或者不與PA形成復(fù)合物時(shí)，它在上樣的地方被檢測(cè)至IJ，因此沒(méi)有遷移。關(guān)于所述5種聚合物的結(jié)果概括在下表中。<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>生理PH下在兩親性聚合物存在下BMP-2的穩(wěn)定性BMP-2/兩親件聚合物復(fù)合物的制備從在緩沖液H20/AcN/TFA(64.9/35/0.)中的0.28mg/mlBMP-2溶液開(kāi)始，制備下列各種溶液1.通過(guò)在水中進(jìn)行稀釋而獲得的0.084mg/ml的BMP-2溶液，2.通過(guò)用14mg/ml的PA溶液稀釋BMP-2而獲得的0.084/9.8mg/ml的BMP-2/兩親性聚合物溶液。然后，將每種溶液用pH7.4和300m0sm的IOmMPBS溶液稀釋至1/10，隨后通過(guò)在Microcon組件(cellule)(YM10,IOkD,500μ1)上進(jìn)行離心而再濃縮。該操作重復(fù)兩次。在這三次洗滌后，離心每種溶液，并通過(guò)ELISA測(cè)定法來(lái)測(cè)定上清液中的ΒΜΡ-2的濃度。一部分的0.084mg/ml的BMP-2溶液不經(jīng)歷任何洗滌以便作為對(duì)照。另一部分的0.084mg/ml的BMP-2溶液經(jīng)歷三個(gè)循環(huán)的用ImMHCl溶液(pH3)進(jìn)行的洗滌。已知該緩沖液穩(wěn)定BMP-2，但是與藥學(xué)應(yīng)用是不相容的。沒(méi)有經(jīng)歷任何洗滌的BMP-2溶液的ELISA測(cè)定給出83.4μg/ml的BMP-2的濃度。該值相應(yīng)于100%的BMP-2。將通過(guò)在三次用PBS進(jìn)行的洗滌結(jié)束時(shí)其他溶液的ELISA所測(cè)定的濃度與未洗滌的BMP-2的該值相聯(lián)系。將所測(cè)得的BMP-2的百分比集中在下表中。<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>能夠與BMP-2形成復(fù)合物的PA致使BMP-2在生理pH下穩(wěn)定。在不存在PA時(shí)，在生理pH下BMP-2不再存在于溶液中。同樣地，在不與BMP-2形成復(fù)合物的PA存在下，該蛋白質(zhì)不再存在于溶液中。在37°C和生理pH下，在培養(yǎng)基中，在兩親性聚合物存在下BMP-2的穩(wěn)定性和生物學(xué)活性在J0，將C2C12細(xì)胞(小鼠的肌細(xì)胞)接種于包含具有10%FCS和1%TBA的DMEM的96孔培養(yǎng)板中(7000個(gè)細(xì)胞/孔)，然后置于培養(yǎng)箱中24小時(shí)。在J1，在細(xì)胞粘著后，將該培養(yǎng)基替換成具有2%FCS和1%TBA的DMEM，持續(xù)24小時(shí)。在J2，將該培養(yǎng)基替換成補(bǔ)充有單獨(dú)BMP-2溶液(0.3ug/ml)或BMP-2/PA1復(fù)合物溶液(0.3/150ug/ml,1/500的比例)的具有2%FCS和1%TBA的DMEM。通過(guò)在具有2%FCS和1%TBA的DMEM中分開(kāi)地稀釋BMP-2和PA來(lái)制備該復(fù)合物。在放置之前，讓蛋白質(zhì)/PA1混合物靜置1小時(shí)。在J7，即放置后5天，抽取上清液以便通過(guò)ELISA來(lái)測(cè)定殘留的BMP-2的量。<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>與細(xì)胞接觸5天后，留下少于5%的單獨(dú)BMP-2，而當(dāng)它與PA1復(fù)合時(shí)，留下多于40%的BMP-2。在J7，在相同的實(shí)驗(yàn)中，將細(xì)胞用PBS洗滌2次，隨后用50u1裂解緩沖液進(jìn)行裂解并經(jīng)歷3個(gè)循環(huán)的冷凍(-80°C)/解凍(37°C)。在底物即磷酸對(duì)硝基苯酯(其在405nm處吸收)上，在裂解物中測(cè)量堿性磷酸酶的酶活性。將該活性歸并為通過(guò)microBCA測(cè)量的蛋白質(zhì)的量，并因此表示為nmolpnP/分鐘.Pg蛋白質(zhì)。<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>在存活條件下BMP-2通過(guò)復(fù)合物而被穩(wěn)定5天以上，而在這樣的持續(xù)時(shí)間內(nèi)它在單獨(dú)時(shí)則是不穩(wěn)定的。BMP-2的活性通過(guò)細(xì)胞分化的緩慢過(guò)程來(lái)顯現(xiàn)，BMP-2的復(fù)合物在體外比單獨(dú)BMP-2更具活性。聚合物保護(hù)了BMP-2免于酶促降解BMP-2/聚合物復(fù)合物的制備將19ill在TFA乙腈緩沖液中的0.315mg/mlBMP-2溶液混合入4.6yl的66mg/ml聚合物(PA2)溶液、50ii1的50mMTris(pH7.5)、60ii1的25iig/ml嗜熱菌蛋白酶和366.4ulH20中。制備相似但不含有聚合物的溶液作為對(duì)照。在這兩種溶液中，嗜熱菌蛋白酶為所述蛋白質(zhì)的25%(質(zhì)量/質(zhì)量)。消化的動(dòng)力學(xué)將包含嗜熱菌蛋白酶的單獨(dú)BMP-2溶液和復(fù)合物溶液在60°C下溫育6小時(shí)。在T=0,20分鐘、40分鐘、1小時(shí)、2小時(shí)和6小時(shí)處抽取20ill樣品。向每個(gè)樣品中立即添加5ill的250mM(即50mM的終濃度)EDTA以抑制酶促反應(yīng)。然后，將樣品于_20°C進(jìn)行冷凍。揭示借助于使用15%SDS-Page凝膠的Western印跡來(lái)進(jìn)行所述揭示。將7yl的每個(gè)樣品(含有65ng的BMP-2)混合入7u1的含有SDS的Laemli上樣緩沖液中。然后，將所述樣品在95°C下變性10分鐘，隨后置于15%SDS-Page凝膠上。作為對(duì)照，將相等量的BMP-2(65ng)和嗜熱菌蛋白酶(16.25ng)也置于凝膠上。合上電泳槽，并將電發(fā)生器調(diào)至125V。遷移持續(xù)1小時(shí)15分鐘。在遷移后，在100伏特下，在1小時(shí)期間，通過(guò)BioRad轉(zhuǎn)移系統(tǒng)將凝膠轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。然后，在環(huán)境溫度下用脫脂乳使該膜飽和1小時(shí)，接著與抗-BMP-2—抗一起進(jìn)行溫育(在4°C下過(guò)夜)，并最后與偶聯(lián)至HRP的二抗一起進(jìn)行溫育(在環(huán)境溫度下1小時(shí))。通過(guò)HRP對(duì)于0pti-4CN的反應(yīng)來(lái)進(jìn)行揭示。當(dāng)著色足夠時(shí)終止揭示，因?yàn)榉磻?yīng)產(chǎn)物吸收可見(jiàn)光。當(dāng)BMP-2是單獨(dú)的時(shí)，從20分鐘開(kāi)始觀察到出現(xiàn)了較低分子量的條帶，這說(shuō)明了嗜熱菌蛋白酶對(duì)于該蛋白質(zhì)的降解。在聚合物存在下，不存在該條帶，這表明該聚合物保護(hù)該蛋白質(zhì)免于降解。在已驗(yàn)證了該聚合物不抑制嗜熱菌蛋白酶的作用之后，可以得出結(jié)論所獲得的結(jié)果因此證明，聚合物PA2很好地保護(hù)BMP-2免于酶促降解。生理pH下在水中以復(fù)合物形式的BMP-2的增溶生理pH下BMP-2的溶解度BMP-2具有8.5的等電點(diǎn)，這意味著，在7.4的生理pH下，BMP-2接近其最小溶解度。這可以通過(guò)BMP-2的酸性溶液的中和實(shí)驗(yàn)而得到證明。在酸性緩沖液(Infuse緩沖液，pH4.5)中制備1.5mg/mL的BMP-2的澄清溶液。通過(guò)添加磷酸鹽緩沖液來(lái)中和該溶液，以達(dá)到7.4的pH(l.2mg/mL的BMP-2的終濃度)。在PH7.4下，BMP-2沉淀出來(lái)并且所形成的聚集體是可見(jiàn)的。該中和導(dǎo)致獲得懸浮液。牛理dH下BMP-2/PA2的溶解度在酸性緩沖液(Infuse緩沖液，pH4.5)中制備1.5mg/mL的BMP-2的澄清溶液。向該溶液中添加凍干的PA2以達(dá)到75mg/mL的PA2濃度。然后，通過(guò)添加磷酸鹽緩沖液來(lái)中和該BMP-2/PA2復(fù)合物溶液，以達(dá)到7.4的pH(l.2mg/mLBMP-2和60mg/mLPA2的終濃度)。在PH7.4下，BMP-2是完全溶解的，并且沒(méi)有見(jiàn)到任何聚集體。因此，大大地提高了在生理pH下以BMP-2/PA2復(fù)合物形式的BMP-2的溶解度。1權(quán)利要求在物理和化學(xué)上穩(wěn)定的、可溶于水的兩親性聚合物-BMP復(fù)合物，其特征在于■所述兩親性聚合物由通過(guò)疏水取代基和親水基團(tuán)進(jìn)行官能化的親水性多糖骨架構(gòu)成，根據(jù)下述通式I●R，R′，相同或不同，并且表示鍵或包含1至18個(gè)碳的鏈，所述鏈任選地是支化的和/或不飽和的，且包含一個(gè)或多個(gè)雜原子例如0、N或/和S，●F，F(xiàn)′，相同或不同，并且表示酯、硫酯、酰胺、碳酸酯、氨基甲酸酯、醚、硫醚或胺，●X表示親水基團(tuán)，其選自羧酸根、硫酸根、磺酸根、磷酸根、膦酸根，●Y表示親水基團(tuán)，其選自硫酸根、磺酸根、磷酸根、膦酸根，●Hy表示疏水基團(tuán)，其選自下列○線性或支化的C8-C30烷基，其任選地是不飽和的和/或包含一個(gè)或多個(gè)雜原子例如O、N或S，○線性或支化的C8-C18烷基芳基或芳基烷基，其任選地是不飽和的和/或任選地包含一個(gè)或多個(gè)雜原子例如O、N或S，○C8-C30多環(huán)，其任選地是不飽和的和/或任選地包含一個(gè)或多個(gè)雜原子例如O、N或S，○芐胺除外，●n和o為1至3，●h表示疏水基序相對(duì)于糖單元而言的摩爾份數(shù)，其為0.01至0.5，●x表示親水基團(tuán)相對(duì)于糖單元而言的摩爾份數(shù)，其為0至2.0，●y表示親水基團(tuán)相對(duì)于糖單元而言的摩爾份數(shù)，其為0至0.5，■所述BMP選自在治療上有活性的BMP(骨形態(tài)發(fā)生蛋白)，■聚合物/BMP的質(zhì)量比小于或等于700。FPA00001058579000011.tif2.根據(jù)權(quán)利要求1的復(fù)合物，其特征在于，所述多糖選自通式I的多糖，其中y=0。3.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的復(fù)合物，其特征在于，所述多糖選自通式I的多糖，其中X表示羧酸根。4.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的復(fù)合物，其特征在于，聚合物/BMP的質(zhì)量比小于或等于600。5.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)的復(fù)合物，其特征在于，聚合物/BMP的質(zhì)量比小于或等于500。6.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的復(fù)合物，其特征在于，所述BMP選自BMP-2(代勃特明-a)、BMP-4、BMP-7(依托特明_a)、BMP-14和GDF-5。7.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的復(fù)合物，其特征在于，所述聚合物選自其取代基以隨機(jī)方式分布的聚合物。8.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的復(fù)合物，其特征在于，所述多糖選自乙酰透明質(zhì)酸、藻酸鹽、殼聚糖、聚半乳糖醛酸、硫酸軟骨素、葡聚糖、纖維素。9.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的復(fù)合物，其特征在于，纖維素的組由通過(guò)酸進(jìn)行官能化的纖維素例如羧甲基纖維素構(gòu)成。10.根據(jù)權(quán)利要求1至8中任一項(xiàng)的復(fù)合物，其特征在于，葡聚糖的組由通過(guò)酸進(jìn)行官能化的葡聚糖例如羧甲基葡聚糖構(gòu)成。11.根據(jù)權(quán)利要求1至8中任一項(xiàng)的復(fù)合物，其特征在于，所述多糖選自乙酰透明質(zhì)酸、藻酸鹽、殼聚糖。12.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的復(fù)合物，其特征在于，所述疏水基團(tuán)Hy選自天然來(lái)源的疏水氨基酸或者其醇、酯、脫羧基或酰胺衍生物，所述天然來(lái)源的疏水氨基酸選自色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸或異亮氨酸。13.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的復(fù)合物，其特征在于，所述疏水基團(tuán)Hy是色氨酸或者色氨酸的酯或酰胺衍生物。14.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的復(fù)合物，其特征在于，所述兩親性聚合物-BMP復(fù)合物的形成是可逆的。15.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的復(fù)合物，其特征在于，所述BMP在生理pH下是穩(wěn)定的。16.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的復(fù)合物，其特征在于，所述BMP在37°C和中性pH下具有生物學(xué)活性。17.制備根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的兩親性聚合物-BMP復(fù)合物的方法，其特征在于，在水性介質(zhì)中和在不存在能夠使該蛋白質(zhì)變性的有機(jī)溶劑的情況下制備所述聚合物/BMP復(fù)合物。18.治療組合物，其特征在于，所述治療組合物包含根據(jù)權(quán)利要求1至16中任一項(xiàng)的兩親性聚合物-BMP復(fù)合物。19.根據(jù)權(quán)利要求18的治療組合物，其特征在于，所述治療組合物使得能夠施用大約1.5mg/ml的BMP。20.根據(jù)權(quán)利要求1至16中任一項(xiàng)的兩親性聚合物-BMP復(fù)合物在制備用于在體內(nèi)誘導(dǎo)骨形成的治療組合物中的用途。全文摘要本發(fā)明涉及在物理和化學(xué)上穩(wěn)定的、可溶于水的兩親性聚合物-BMP復(fù)合物，其特征在于所述兩親性聚合物由通過(guò)疏水取代基和親水基團(tuán)進(jìn)行官能化的親水性多糖骨架構(gòu)成；所述BMP選自在治療上有活性的BMP(骨形態(tài)發(fā)生蛋白)；聚合物/BMP的質(zhì)量比小于或等于700。本發(fā)明還涉及在水性介質(zhì)中和在不存在能夠使該蛋白質(zhì)變性的有機(jī)溶劑的情況下制備所述兩親性聚合物-BMP復(fù)合物的方法。本發(fā)明還包括根據(jù)本發(fā)明的兩親性聚合物-BMP復(fù)合物的治療組合物。文檔編號(hào)A61K38/18GK101835493SQ200880107383公開(kāi)日2010年9月15日申請(qǐng)日期2008年7月25日優(yōu)先權(quán)日2007年7月27日發(fā)明者G·蘇拉,O·蘇拉,R·蘇拉申請(qǐng)人:阿道恰公司