專利名稱：：一種蜂毒素脂質體制劑及其制備方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及藥物制劑領域，具體涉及一種蜂毒素的脂質體制劑，本發(fā)明還公開了這種蜂毒素脂質體制劑的制備方法。
背景技術：
：蜂毒(beevenom)是工蜂毒腺分泌出來的一種具有芳香氣味的透明毒液，它是一種成分復雜的混合物，主要含有蛋白質多肽類、酶類、生物胺類和其它物質，其中肽類、酶類和非肽類構成蜂毒的主要活性成分。肽類包括蜂毒素、阿帕敏反應的主要物質。酶類主要包括多達55種以上的酶類物質，其中磷脂酶A2是受蜂蟄之后產生過敏反應的主要物質。非肽類包括組胺、各種生物胺類物質，與受蜂蟄之后產生疼痛有關。蜂毒中研究較多的是蜂毒溶血肽，又稱蜂毒素，占蜂毒干重的50%，是蜂毒的主要組成成分及活性成分。蜂毒素是由26個氨基酸組成的小分子肽，其相對分子量為2849，氨基酸的排列順序為甘-異亮-甘-丙-纈-亮-賴-纈-亮-蘇-蘇-甘-亮-脯-丙-亮-異亮-絲-色-異亮-賴-精-賴-精-谷-谷，強堿性，溶于水，其二級結構為a-螺旋結構。詳見(王關林，邢卓.蜂毒肽的研究及展望，遼寧師范大學學報(自然科學版)，2005，28(1):87)蜂毒肽通過多途徑影響細胞的信號蜂毒傳導系統，并可誘發(fā)神經酰胺合成及細胞凋亡，具有抗菌、抗病毒、消炎等功效。最近研究表明其具有抗癌和抗HIV的作用。近20年來，先后發(fā)現其對多種腫瘤具有強烈的殺滅作用，這引起人們的高度關注。有研究報道，其抗腫瘤作用優(yōu)于去甲斑蝥素、大蒜素、華蟾素、絲裂霉素、長春新堿等常用抗癌藥物，是一個十分具有應用前景的抗腫瘤天然藥物。詳見(顧桂秋，錢鶴聲.蜂毒肽生物學活性和藥理作用的研究進展，中國蜂業(yè)，2006，57(8):33)(王碩豐，楊本明，李立標等.蜂毒素的藥理作用研究及展望，天津藥學，2003，15(4):53)在我國，有關蜂毒醫(yī)療應用已有數千年的歷史，近年關于蜂毒肽基礎研究也十分活躍。但至今國內仍無蜂毒素相關制劑上市。曾有人研究注射用蜂毒凍干粉但因其對血管的刺激性未能應用于臨床。蜂毒素自身的溶血作用和血管內皮細胞壞死等毒副作用極大的限制了其臨床應用。脂質體是解決上述問題首選的一類藥物傳遞系統，因其可將蛋白多肽類藥物包封在內，減緩藥物的釋放，從而避免由于溶液劑中全部劑量的藥物快速和血管內皮細胞的接觸產生的刺激性問題。但在實驗過程中發(fā)現蜂毒素普通脂質體仍不能完全消除蜂毒素的血管刺激性。
發(fā)明內容本發(fā)明公開了一種臨床適用的蜂毒素脂質體及其注射用凍千粉針，該蜂毒素脂質體凍干粉針在加入注射用生理鹽水后能重新分散，本發(fā)明的蜂毒素脂質體不僅可延緩脂質體中的藥物釋放，延長其在血液中的循環(huán)時間，提高藥物的生物利用度，同時可顯著性地降低藥物自身的毒副作用，提高病人的順應性。本發(fā)明的蜂毒素脂質體制劑，含下列組分及重量比蜂毒素1磷脂540膽固醇1.310泊洛沙姆10140。本發(fā)明的蜂毒素脂質體制劑，各組分優(yōu)選的重量比為蜂毒素1磷脂1020膽固醇1.75泊洛沙姆40100。本發(fā)明中，蜂毒素與磷脂、膽固醇、泊洛沙姆(poloxamer)的的配比直接影響到脂質體的質量。所述磷脂優(yōu)選大豆磷脂。本發(fā)明所涉及的比例均為重量比。當膽固醇和泊洛沙姆取一個固定值，磷脂取不同的重量時，蜂毒素脂質體的平均粒徑和包封率也不同。結果見表l。表1.藥物和磷脂的比例對脂質體粒徑和包封率的影響(11=3)藥物磷脂平均粒徑/nm包封率/%1:3432.3±27.857.8±6.61:5214.1±23.779.0±3.71:10162.6±1.793.4±1.21:15154.9±10.893.2±2.81:20140.0±8.393.6±1.51:30152.7±0.670±2.91:40170.9±4.082.2±2.81:50210.U7.980.2±3.7從表可以看出，當蜂毒素和磷脂重量比小于1:5時，粒徑較大，包封率過低；當蜂毒素和磷脂重量比大于1:40時，盡管包封率和粒徑適宜，但脂質體溶液粘稠，且放置越久越粘稠；當蜂毒素和磷脂重量比在l:540范圍內，包封率較高，粒徑符合要求；當蜂毒素和磷脂重量比在1:1020范圍內，包封率高于90%，粒徑符合要求，因此本發(fā)明中藥物/磷脂的比例優(yōu)選為1:1020。當磷脂和泊洛沙姆取一個固定值，膽固醇取不同的重量時，蜂毒素脂質體的平均粒徑和包封率也不同。結果見表2。表2.藥物和膽固醇的比例對脂質體粒徑和包封率的影響(r^3)<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>從表中可以看出，藥物和膽固醇的重量比例在1:020范圍內，當藥物和膽固醇的重量比小于1:10時，粒徑過大，包封率較低；當藥物和膽固醇的重量比大于1:1.3時，包封率較低，且放置片刻即絮凝，當藥物和膽固醇的重量比例在l:1.310范圍內，包封率和粒徑均較好，且比例在l:1.75范圍內包封率和粒徑最佳，因此本發(fā)明中藥物/膽固醇的比例優(yōu)選在1:1.75。試驗發(fā)現當在蜂毒素脂質體中加入泊洛沙姆后，蜂毒素脂質體對血管無刺激作用。一、血管刺激性實驗實驗材料受試制劑為蜂毒素溶液組、蜂毒素脂質體A組(不含泊洛沙姆)、蜂毒素脂質體B組(2°/。泊洛沙姆修飾,相當于藥物泊洛沙姆的比例為l:40)、蜂毒素脂質體C組(5%泊洛沙姆修飾，相當于藥物泊洛沙姆為1:100)。其中蜂毒素溶液為蜂毒素在生理鹽水中溶解而制成。對照制劑為注射用生理鹽水。動物選用大白兔，體重2.0kg2.5kg,雌雄兼用，正常飼養(yǎng)3d后供試。實驗方法取家兔15只，隨機分成5組，每組3只，兔右耳耳緣靜脈滴注濃度為0.05mg/ml的上述各組蜂毒素制劑(采用生理鹽水稀釋)，滴速為lmL/min，給藥體積為10mL/kg;左耳耳緣靜脈滴注等量生理鹽水為對照，隔天給藥一次，連續(xù)給藥3次。每次注射后觀察靜脈滴注局部有無異常變化。末次給藥后48h后，處死動物，并將每只動物左、右耳靜脈滴注部位取組織標本，立即浸泡在10%福爾馬林液中固定48h后，石蠟切片，HE染色，光鏡下進行耳靜脈滴注處向心側不同部位(近段、中段、遠段)進行組織學檢查，觀察有無組織變形或壞死等顯著性刺激反應，并將給藥側與空白對照側進行比較。實驗結果自身陰性對照組(生理鹽水組)鏡下見注射點近端靜脈縱斷面血管腔內充滿紅細胞，血管內皮扁平，內膜面光滑，內皮完整，無損傷表現，無血栓形成；中段檢材可見靜脈內皮完整，腔內充滿紅色血槳；遠段切片見靜脈內皮細胞完整，腔內有少量紅細胞。兔耳緣靜脈滴注蜂毒素溶液，肉眼觀察可見家兔耳緣靜脈血管顏色發(fā)紫，表明蜂毒素有強烈的血管刺激性。兔耳緣靜脈滴注蜂毒素脂質體A組，血管刺激性有所降低，但鏡檢仍發(fā)現有炎癥等血管刺激性表現。兔耳緣靜脈滴注蜂毒素脂質體B、C組后24hr，肉眼未見兔耳緣靜脈有明顯異常。經兔耳緣靜脈組織切片觀察，鏡下見注射點近端靜脈管壁內皮細胞完整無損，有的管腔內見有紅細胞；中段可見血管內皮完整，未見損傷及血栓形成；注射點遠端可見血管內皮細胞完整，管腔內有紅細胞及白細胞，管腔無損傷，未見血栓形成。結果表明，兔耳緣靜脈內皮細胞完整，內膜無損傷及血栓形成，管壁亦無炎癥反應。上述試驗結果表明采用蜂毒素溶液有強烈的血管刺激性，將蜂毒素包封于脂質體后，血管刺激性雖有所降低，但仍然不能消失；而經泊洛沙姆修飾的蜂毒素脂質體對家兔無血管刺激性反應。體內動力學試驗研究顯示，加入泊洛沙姆的蜂毒素脂質體顯著延長蜂毒素在體內的作用時間。二、以大鼠體內藥動學實驗研究實驗方法取雄性SD大鼠18只，禁食不禁水16h后，隨機分為3組，以0.42mg/ml劑量股靜脈注射，分別給予蜂毒素溶液(記為MLT-I)、蜂毒素脂質體2%188MLT-LIPO(即2%泊洛沙姆修飾，相當于藥物泊洛沙姆為1:40)、蜂毒素脂質體5%188MLT-LIPO(即5%泊洛沙姆修飾,相當于藥物泊洛沙姆為l:100)。給藥前和給藥后在設定時間點于大鼠眼眶后靜脈叢取血約300nL，置于離心管中，以8000rpm離心5min，分離血清。取血清lOOpL，采用間接ELISA法測定藥物濃度，繪制血藥濃度經時曲線，利用kinetica4.4程序計算藥動學參數。實驗結果血藥濃度經時曲線如圖l所示。由圖1可見，溶液組在大鼠血清中150min藥物濃度已基本接近檢測下限，而2%188MLT-LIPO組在大鼠血清中360min仍可檢測到微量藥物；5%188MLT-LIPO組在大鼠血清中480min仍可檢測到微量藥物。說明本發(fā)明的蜂毒素脂質體，其在大鼠體內釋放明顯變慢。藥動學數據擬合結果見表3。表3大鼠靜注0.42mg'kg—1蜂毒素后藥代動力學參數(n=6)<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>大鼠體內藥代動力學數據表明，與溶液劑相比，靜注2%及5%poloxamer修飾的蜂毒素脂質體后，血藥濃度均能夠維持更穩(wěn)定的水平，分別給藥6h及8h后，血中仍保持一定的濃度，平均滯留時間(MRT)分別增加了1.49倍及2.43倍，血藥濃度曲線下面積(AUC)是溶液劑的2.06倍及2.75倍?？梢钥闯?，本發(fā)明的蜂毒素脂質體，可延長在大鼠體內的滯留時間，提高生物利用度。另夕卜，對比2。/。188MLT-LIPO及5。/。188MLT-LIPO的藥動學數據，可以看出，隨著泊洛沙姆188用量的增加(從2%增加到5%)，其消除相半衰期T^,p增大27.83%;平均滯留時間MRT延長37.7%;體內清除率CI降低25.5%;AUC增加33.6%,表明隨著脂質體修飾劑泊洛沙姆用量的增加，其聚氧乙烯親水長鏈對脂質體的保護作用增加，進一步避免了體內血漿蛋白的調理作用，增加了生物利用度。初步研究表明，其長循環(huán)作用與所用共聚物的用量呈一定正相關。但泊洛沙姆用量會對脂質體的平均粒徑和包封率有所影響。當磷脂和膽固醇取一個固定值，泊洛沙姆取不同的重量時，觀察蜂毒素脂質體的平均粒徑和包封率。結果見表4。表4泊洛沙姆對脂質體粒徑和包封率的影響結果(n-3)藥物泊洛沙姆平均粒徑/nm包封率/%<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>從表中可以看出，隨著泊洛沙姆用量的增加，脂質體粒徑逐漸增大，包封率逐漸下降，當泊洛沙姆的用量超過l:100后，脂質體的粒徑和包封率都有較大幅度的改變，且溶液粘稠度增加；當泊洛沙姆的用量達到l:200時，雖然脂質體的粒徑和包封率仍滿足要求，但溶液的粘稠度高，穩(wěn)定性差，在放置過程中，逐漸出現絮狀物，因此不宜選用過高濃度的泊落沙姆。雖然不含泊洛沙姆的脂質體的粒徑和包封率符合要求，但仍表現出血管刺激性，綜合上述實驗結果，本發(fā)明中藥物/泊洛沙姆的比例在l:10140范圍內，優(yōu)選在l:40100。本發(fā)明的蜂毒素脂質體還可添加凍干保護劑制備成凍干脂質體制劑。試驗發(fā)現不同的凍干保護劑對蜂毒素脂質體的質量影響也不同，先制備本發(fā)明的蜂毒素脂質體，然后在其中添加不同的凍干保護劑，冷凍干燥，結果見表5:表5凍干保護劑對脂質體包封率和粒徑的影響(n-3)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>從表5中可以看出，在各種常見的凍干保護劑中，蔗糖、乳糖、葡萄糖、海藻糖的效果較好，脂質體的各項指標滿足要求；而甘露醇、山梨醇作為凍干保護劑，雖然其外觀較佳，但包封率有較顯著降低，且其對脂質體粒徑的控制欠佳。因此作為蜂毒素脂質體的凍干保護劑優(yōu)選蔗糖、乳糖、葡萄糖、海藻糖中的一種或幾種。本發(fā)明的蜂毒素脂質體的制備方法包括將磷脂膽固醇溶于有機溶劑，減壓蒸發(fā)去除有機溶劑，加入載制劑量蜂毒素的水合介質水合形成混懸液，勻化，即得，所述有機溶劑選自氯仿、二氯甲烷、甲醇、乙醇、乙醚、丙酮中的一種或幾種。優(yōu)選氯仿、甲醇、二氯甲烷或乙醇。制備成凍干粉針劑時，將凍干保護劑溶解于脂質體混懸液中中，冷凍千燥即可。本發(fā)明的蜂毒素脂質體還可以用以下方法制備采用現有技術中的方法制備得到空白脂質體，將制劑量的蜂毒素與空白脂質體混合均勻，冷凍干燥制備得到凍干脂質體制劑。本發(fā)明的蜂毒素脂質體還可以采用以下方法制備采用現有技術中的方法制備得到空白脂質體，將制劑量的蜂毒素與空白脂質體混合均勻，經數次反復凍融后，冷凍干燥得到凍干脂質體制劑。本發(fā)明的蜂毒素脂質體的既可使脂質體達到高包封率，又有良好的穩(wěn)定性，包封率在80100%,粒徑為100600nm。在優(yōu)化處方范圍內本發(fā)明的蜂毒素脂質體包封率大于90%，粒徑在100250nm范圍內。本發(fā)明的優(yōu)點是，所提供的脂質體制備工藝易于工業(yè)化大生產，且不影響蜂毒素的原有生物活性，其凍干脂質體為白色細膩、疏松不塌陷粘連、穩(wěn)定性好、易于水化。本發(fā)明制備的蜂毒素脂質體可顯著延長藥物在大鼠體內的駐留時間，提高藥物的生物利用度，消除藥物的血管刺激性。圖1是大鼠靜脈注射蜂毒素后血藥濃度-時間圖圖2是本發(fā)明的蜂毒素脂質體粒徑分布圖圖3是本發(fā)明的蜂毒素脂質體透射電鏡照片具體實施例方式實施例1稱取L2g大豆磷脂(純度大于92%磷脂酰膽堿)、150mg膽固醇溶于50ml乙醇中，超聲，溶解；在50。C、400rpm磁力攪拌條件下，將上述溶液緩慢注入90ml等滲生理鹽水(含5%泊洛沙姆188，為重量百分比，下同)，二者混合繼續(xù)攪拌2h后至乙醇完全揮干，得到脂質體粗混懸液，高壓均質以減少粒徑(5000psi，3次)，即得。后將60mg蜂毒素溶于30ml等滲生理鹽水(含5%泊洛沙姆188)，再與上述溶液混合，并加入12g乳糖溶解于混合溶液中，無菌過濾后(膜濾器孔徑0.2pm)，將續(xù)濾液分散無分裝于西林瓶中，冷凍干燥即可。將凍干脂質體在4'C環(huán)境貯存3個月后，蜂毒素含量為96.8%，加入注射級生理鹽水重組得到的脂質體包封率為91.45%，粒徑為217nm，以5%葡萄糖溶液或0.9%生理鹽水稀釋8h后包封率基本保持不變。成品性狀本品為白色細膩、疏松不塌陷粘連的固態(tài)。復水分散性本品在注射用溶劑如生理鹽水中經輕微震蕩，10s內即可迅速形成均一穩(wěn)定的半透明白色混懸溶液。粒徑測定本品用生理鹽水作為稀釋溶劑，稀釋數倍后用PCS法測定粒徑(MalvernZetasizer3000HS)，粒徑分布圖見圖2所示，平均粒徑為201nm，多分散系數為0.178。形態(tài)學觀察本品用等滲生理鹽水作為稀釋溶劑，稀釋數十倍后在透射電鏡下觀察。如圖3所示，脂質體為規(guī)則的球體，外觀圓整度良好，指紋結構明顯，脂質雙分子膜規(guī)則均一。實施例2稱取lg大豆磷脂(純度大于93%)、200mg膽固醇溶解于二氯甲烷中，將該溶液置于磨口茄形瓶中，于25'C恒溫水浴上旋轉蒸發(fā)儀在100rpm條件下減壓蒸發(fā)除去有機溶劑，使磷脂、膽固醇在瓶底形成均勻膜，后置于真空干燥器中抽真空過夜，備用。另將100mg蜂毒素溶解于200ml等滲5%葡萄糖溶液(含2%泊洛沙姆188)中，將此溶液加入上述茄形瓶中，在37'C條件下轉動洗膜，直至形成乳白色脂質體懸液，高壓均化，減小粒徑(5000psi，3次)，即得。將20g海藻糖溶解于脂質體中，無菌過濾后(膜濾器孔徑0.2pm)，將續(xù)濾液分裝于西林瓶中，冷凍干燥即可。將冷凍干燥的脂質體于4t:環(huán)境下貯存3個月后，蜂毒素含量為97.1%，加入適量注射級等滲葡萄糖溶液后脂質體包封率為91.0%，粒徑為242nm，以5%葡萄糖溶液或0.9%生理鹽水稀釋8h后包封率基本保持不變。實施例3將實施例1中無菌過濾后的續(xù)濾液分裝于西林瓶后，經反復凍融(冷凍溫度為-50'C，冷凍時間為3h，溶融溫度為4'C，溶融時間為30min，反復凍融次數為2次)后，冷凍干燥得到凍干粉針劑。將冷凍干燥的脂質體于4'C環(huán)境下貯存3個月后，蜂毒素含量為95.9%，加入適量注射級等滲葡萄糖溶液后脂質體包封率為％.8%，粒徑為214nm，以5%葡萄糖溶液或0.9%生理鹽水稀釋8h后包封率基本保持不變。實施例4與實施例1基本相同，但有以下改變前期制備空白脂質體時，操作流程為稱取1.2g大豆磷脂(純度大于92%磷脂酰膽堿)、150mg膽固醇溶于適量乙醚中，將該溶液置于磨口茄形瓶中，超聲，溶解，后注入90ml等滲生理鹽水(含5%泊洛沙姆188)，水浴超聲60min，得到脂質體粗混懸液，高壓均質以減少粒徑(5000psi，3次)，即得空白脂質體懸液。將冷凍干燥的脂質體于4'C環(huán)境下貯存3個月后，蜂毒素含量為97.9%，加入適量注射級等滲生理鹽水溶液后脂質體包封率為90.8%，粒徑為192nm，以5%葡萄糖溶液或0.9%生理鹽水稀釋8h后包封率基本保持不變。實施例5考察蜂毒素對小鼠移植Heps瘤的抑制作用，對實施例1的產品進行體內抗腫瘤初步藥效學實驗研究。試驗材料受試制劑蜂毒素溶液組及實施例l產品。陽性藥注射用環(huán)磷酰胺(CTX)動物ICR小鼠，18-22g，雌雄各半瘤株Heps實驗方法取ICR小鼠60只，按移植性腫瘤研究法，接種Heps實體型瘤(在無菌操作下取瘤塊，稱重，用玻璃組織勻漿器研磨，磨勻后放人無菌容器內，加生理鹽水稀釋成1:3的細胞懸液，容器置冰塊上，用空針抽吸，每次抽吸前將細胞混勻，每只小鼠右前肢腋窩皮下接種0.21111)，接種后24小時稱鼠重，并隨機分為6組，空白對照組、CTX組(20mg/kg)分別為陰、陽性對照組，本發(fā)明的蜂毒素脂質體組(0.6、0.3、0.15mg/kg)組及蜂毒素溶液組(0.6mg/kg)。于接種24小時后尾靜脈注射給藥，每天一次，共給藥6次，于停藥后第2天處死荷瘤小鼠稱重，并分離瘤塊稱重，所得數據進行統計學處理(t檢驗)。實驗結果實驗研究結果表明，如表6所示，與空白對照組相比，溶液組(0.6mg/kg)、本發(fā)明脂質體組(0.6mg/kg、0.3mg/kg)、環(huán)磷酰胺(3mg/kg)組的抑瘤率分別為38.98%、46.49%，34.46%,54.33%，皆有顯著抑制Heps腫瘤生長的作用(PO.Ol)。與高濃度溶液組相比，本發(fā)明脂質體組(0.6mg/kg)的抑瘤率相比有較顯著增加，經t檢驗顯示出顯著性差異(P<0.05)。表6對小鼠移植瘤Heps的抑制作用(^±S")(n=10)<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>權利要求1、一種蜂毒素脂質體制劑，其特征是含下列組分及重量比蜂毒素1磷脂5～40膽固醇1.3～10泊洛沙姆10～140。2、權利要求1的蜂毒素脂質體制劑，其特征是各組分的重量比為蜂毒素1磷脂1020膽固醇1.75泊洛沙姆40100。3、權利要求1或2的蜂毒素脂質體制劑，其中磷脂是大豆磷脂。4、權利要求1或2的蜂毒素脂質體制劑，還含有凍干保護劑。5、權利要求4的蜂毒素脂質體制劑，其中凍干保護劑選自蔗糖、乳糖、葡萄糖、海藻糖中的一種或幾種。全文摘要本發(fā)明涉及藥物制劑領域，具體涉及一種蜂毒素的脂質體制劑，其特征是由蜂毒素1份、磷脂5～40份、膽固醇1.3～10份、泊洛沙姆10～140份組成，本發(fā)明還公開了這種蜂毒素脂質體制劑的制備方法。本發(fā)明的蜂毒素脂質體不僅可延緩脂質體中的藥物釋放，延長其在血液中的循環(huán)時間，提高藥物的生物利用度，同時可顯著性地降低藥物自身的毒副作用，提高病人的順應性。文檔編號A61K9/127GK101391098SQ20081023494公開日2009年3月25日申請日期2008年11月11日優(yōu)先權日2008年11月11日發(fā)明者勇楊,學柯,王長江,郭青龍,真陳申請人:中國藥科大學