專利名稱：：組蛋白去乙?；敢种苿┰谥委焺用}粥樣硬化中的用途的制作方法組蛋白去乙?；敢种苿┰谥委焺用}粥樣硬化中的用途發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及組蛋白去乙酰化酶抑制劑類化合物曲古抑菌素A(TrichostatinA，TSA)和辛二酰苯胺異羥將酸(Suberoylani1idehydroxamicacid，SAHA)用于制備通過增強膽固醇逆轉(zhuǎn)運才幾制治療和/或預(yù)防動脈粥樣硬化藥物的用途，其中所述通過增強膽固醇逆轉(zhuǎn)運機制治療和/或預(yù)防動脈粥樣硬化的藥物包括上調(diào)高密度脂蛋白受體CLA-1/SR-BI表達活性的藥物和上調(diào)ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運子ABCA1表達活性的藥物。
背景技術(shù)：
：心血管疾病已經(jīng)成為當今世界危及人類生命的常見疾病，而動脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)是其主要病理基礎(chǔ)。流行病學(xué)和臨床研究表明，膽固醇在血漿中的濃度及在體內(nèi)的代謝與動脈粥樣硬化的發(fā)生與發(fā)展密切相關(guān)，血漿中低密度脂蛋白(lowdensitylipoprotein,LDL)膽固醇(LDL-C)水平與動脈粥樣硬化的發(fā)病率呈正相關(guān)，而高密度脂蛋白(highdensitylipoprotein,HDL)膽固醇(HDL-C)水平則與動脈粥樣硬化的發(fā)病率呈負相關(guān)[1-3]。目前臨床上成功應(yīng)用的他汀類藥物主要是通過抑制膽固醇的生物合成和增強外周細胞對膽固醇攝取的LDL受體調(diào)節(jié)通路來實現(xiàn)抗動脈粥樣硬化作用的，但也僅可降低20%~40%的心血管事件[4]，因此亟需研發(fā)具有新作用機制的新型抗動脈粥樣硬化藥物。近年來研究表明，高密度脂蛋白的抗動脈粥樣硬化作用主要基于肌參與的膽固醇逆轉(zhuǎn)運(reversecholesteroltransport,RCT)過程。膽固醇逆轉(zhuǎn)運是指新生的圓盤狀HDL攝取外周細胞(包括動脈壁細胞)中過剩的膽固醇，在血漿中經(jīng)卵磷脂膽固醇酰基轉(zhuǎn)移酶(lecithincholesterolacyltransferase,LCAT)酯^f匕后，游離膽固醇轉(zhuǎn)變成膽固醇酯并向HDL的內(nèi)核轉(zhuǎn)移，最終形成球狀的成熟HDL，將膽固醇轉(zhuǎn)運至肝臟，通過生成膽汁酸排出體外的過程。膽固醇逆轉(zhuǎn)運主要有4個步驟(1)膽固醇從外周組織細胞中流出；(2)HDL中膽固醇的酯化；(3)HDL膽固醇酯的轉(zhuǎn)運；(4)HDL膽固醇酯的清除。實驗證明，膽固醇逆轉(zhuǎn)運的增強有可能使動脈粥樣硬化損傷發(fā)生逆轉(zhuǎn)甚至消退。這其中涉及多種受體、酶和脂質(zhì)的相互作用，B族I型清道夫受體(scavengerreceptorclassBtypeI，SR-BI)和ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運子Al(ATPbindingcassettetransporterAl，ABCA1)是膽固醇逆轉(zhuǎn)運初始和終末步驟的主要參與者。直到上世紀末，SR-BI才被確定為體內(nèi)功能性的HDL受體[5]。人類SR-BI(hSR-BI)是作為CD36膜蛋白超家族以及溶酶體整合膜蛋白相關(guān)蛋白被獨立發(fā)現(xiàn)的，所以又稱為CLA-1(CD36andLIMPIIAnalogous-1)。研究表明，SR-BI參與外周組織中膽固醇的流出和肝臟中膽固醇的選擇性攝取。膽固醇選擇性攝取是指肝細胞攝取HDL中膽固醇酯，而不攝取HDL的蛋白成份，這一途徑是通過SR-BI介導(dǎo)的，通過選擇性的攝取，可將HDL膽固醇轉(zhuǎn)運到肝臟。外周細胞中的膽固醇在漿膜雙層上的分布是不對稱的，膽固醇外流是膽固醇以游離的形式進行轉(zhuǎn)移，膽固醇的外流可通過彌散或受體介導(dǎo)的方式進行。在受體介導(dǎo)的膽固醇外流過程中，HDL與細胞上的高密度脂蛋白受體SR-BI結(jié)合，激活蛋白激酶C介導(dǎo)的信號系統(tǒng)從而誘導(dǎo)膽固醇的外流，膽固醇從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)移到細胞表面。SR-BI/CLA-1在膽固醇/膽固醇酯的流出和流入(攝取)過程中都起著關(guān)鍵作用，被認為是發(fā)現(xiàn)新型心血管藥物的潛在靼標[6]。膽固醇逆轉(zhuǎn)運的增強將有利于動脈粥樣硬化病灶積蓄的膽固醇減少和病變的逆轉(zhuǎn)，因此可以通過升高SR-BI的表達來加速膽固醇逆轉(zhuǎn)運，促進機體特別是動脈壁脂紋病灶中多余膽固醇的清除。SR-BI的表達調(diào)控是種屬和細胞類型依賴性的，在不同的組織和細胞中，多種轉(zhuǎn)錄因子互相配合，形成一個復(fù)雜的調(diào)控體系，具體調(diào)控機制仍有待進一步深入研究。過氧化物酶體增殖激活受體(peroxisomeproliferators-activatedreceptors,PPARs)是一類能被內(nèi)源性脂肪酸以及外源性過氧化物酶體增殖劑(peroxisomeproliferators，PP)激活的甾體激素受體超家族成員，它作為脂質(zhì)和脂蛋白代謝的調(diào)節(jié)物，可以調(diào)控血漿膽固醇及甘油三酯的水平、促進脂肪細胞分化、影響巨噬細胞內(nèi)膽固醇內(nèi)穩(wěn)態(tài)、穩(wěn)定AS斑塊、抑制血小板聚集從而影響AS的發(fā)生和發(fā)展。研究表明，將無PPARy的骨髓移植到低密度脂蛋白受體缺失的小鼠中會導(dǎo)致其動脈粥樣硬化病變的顯著增加。Malerod等的研究結(jié)果表明在肝細胞中PPARy與類視黃酸X受體(retinoidXreceptor,RXR)形成異源二聚體后通過作用于SR-BI基因上游啟動子區(qū)的PPRE元件而誘導(dǎo)SR-BI的表達[7]。另外，固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白(sterolregulatoryelementbindingproteins,SREBP)在SR-BI的調(diào)控過程中也發(fā)揮著重要的作用。SREBP是重要的核轉(zhuǎn)錄因子之一，是一類固定于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和核膜上的膜連接蛋白，具有"堿性螺旋-環(huán)-螺旋-亮氨酸拉鏈"(basicHelix-Loop-Helix-UucineZipper,跳H-Zip)結(jié)構(gòu)，屬于亂H-Zip超家族的一員。它能與脂氧合酶(lipoxygenase,LOX)等基因的啟動子/增強子的固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合，激活靶基因轉(zhuǎn)錄，特異性調(diào)控膽固醇和脂肪酸代謝，而膽固醇調(diào)節(jié)肝臟SR-BI表達主要通過SREBP在轉(zhuǎn)錄水平進行調(diào)控[8]。與其它一些膽固醇敏感基因相似，SREBP通過結(jié)合到SR-BI啟動子的固醇調(diào)節(jié)元件(SRE)來促進轉(zhuǎn)錄，介導(dǎo)膽固醇對SR-BI的調(diào)控作用。通過藥物篩選獲得的HDL受體表達上調(diào)劑可以通過增加CLA-1的轉(zhuǎn)錄水平而增加CLA-1的表達，從而增強膽固醇的逆轉(zhuǎn)運過程，使泡沫細胞中過量的膽固醇外流，并通過逆轉(zhuǎn)運機制轉(zhuǎn)運到肝臟細胞及類固醇激素合成組織被利用和代謝，有可能使動脈血管壁業(yè)已形成的由大量膽固醇及膽固醇酯蓄積而成的脂質(zhì)斑塊逐漸消退，從而起到預(yù)防和/或治療動脈粥樣硬化及冠心病的作用。ABCAl是ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運子(ATP-bindingcassettetransporter)超家族成員之一，它們以ATP為能源轉(zhuǎn)運各種底物，如離子、脂類和6膽固醇及磷脂轉(zhuǎn)運中發(fā)揮重要作用。ABCA1的主要功能是參與膽固醇逆轉(zhuǎn)運，ABCAl可將細胞內(nèi)的膽固醇和磷脂轉(zhuǎn)運至HDL前體載脂蛋白A-I(apolipoproteinA-1，apoA-I)，而這是膽固醇逆轉(zhuǎn)運的第一個限速環(huán)節(jié)，因此ABCAl在脂質(zhì)代謝和AS的發(fā)生及發(fā)展中具有重要影響。臨床研究證實ABCAl基因突變可導(dǎo)致丹吉爾(Tangier)病和家族性低a脂蛋白血癥(FHA)，兩種疾病均表現(xiàn)為低高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)血癥和早發(fā)冠心病。實驗表明ABCAl基因的過度表達可促進膽固醇和磷脂的外流，增加血漿膽固醇、膽固醇酯、HDL-C等的濃度[10]。膽固醇從組織的清除是預(yù)防動脈粥樣硬化的關(guān)鍵步驟，從外周流向肝臟的膽固醇逆轉(zhuǎn)運過程，會使泡沫細胞中過量的膽固醇外流并被肝臟細胞利用，有利于清除多余膽固醇，從而防止動脈粥樣硬化的發(fā)生。ABCAl促進細胞內(nèi)膽固醇流出而參與膽固醇的逆轉(zhuǎn)運過程，從而清除外周組織細胞過量的膽固醇。轉(zhuǎn)基因?qū)嶒炞C實，ABCAl的過度表達促進膽固醇從巨噬細胞流出，并抑制動脈粥樣硬化斑塊的形成。因此，ABCAl具有抗早期動脈粥樣硬化的功能，已經(jīng)成為治療動脈粥樣硬化心血管疾病的新乾點，能提高ABCAl基因表達的化合物很有可能成為有效治療動脈粥樣硬化的新藥。近來的研究表明，PPAR對巨噬細胞的分化沒有影響，但對巨噬細胞的膽固醇內(nèi)穩(wěn)態(tài)卻起著重要作用，如PPARy和PPAR5在高密度脂蛋白介導(dǎo)的巨噬細胞膽固醇流出中就起著重要的作用。肝X受體(LXR)是PPAR的靶基因，在巨噬細胞中PPARy能夠通過激活LXR的轉(zhuǎn)錄而誘導(dǎo)ABCAl的表達[11-13]，提示在膽固醇轉(zhuǎn)運的細胞水平調(diào)節(jié)中存在著PPARy-LXRa-ABCAl的途徑。迄今為止，臨床上使用的抗動脈粥樣硬化藥物，主要是通過抑制膽固醇合成來增強LDLR表達的以他汀類為主要代表的藥物，增加肝外脂蛋白酶活性的以吉非貝齊等為代表的藥物，以及影響膽固醇吸收的藥物如考來烯胺，其中尤其以增強LDLR的表達、降低血液中LDL-C水平的抗動脈粥樣硬化藥物占優(yōu)勢。LDLR調(diào)節(jié)的膽固醇正向轉(zhuǎn)運的機制最先被揭示，而與膽固醇逆轉(zhuǎn)運過程相關(guān)的機制只是近年來才被陸續(xù)研究揭示，仍有許多調(diào)節(jié)機制有待進一步闡明。曲古抑菌素A(TrichostatinA，TSA)屬于組蛋白去乙?；敢种苿?HistoneDeacetylaseinhibitors,HDACi)類化合物。組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶(histoneacetyltransferase，HAT)和組蛋白去乙?；?histonedeacetylase，HDAC)通過對組蛋白N端氨基酸殘基進行乙酰化或去乙?；{(diào)節(jié)組蛋白的乙?；?，調(diào)控基因表達。目前常見的組蛋白去乙酰化酶抑制劑以含有羥肟酸結(jié)構(gòu)的化合物為主，以曲古抑菌素A(TSA,式1)及辛二酰苯胺異羥肟酸(SAHA，式2)為代表；另外，還有環(huán)肽類、丙烯酸類及苯曱酰胺類等化合物也具有組蛋白去乙?；敢种苿┑幕钚訹14]。曲古抑菌素A最早是在抗真菌模型上篩選得到，從吸7K鏈霉菌(i7rep&邁/ces/j^rosco;/ci^)中分離純化得到的抗生素[15]。后證實曲古抑菌素A為組蛋白去乙?；傅奶禺愋砸种苿16]。曲古抑菌素A等組蛋白去乙?；敢种苿┈F(xiàn)在主要作為抗癌藥物研究較多，辛二酰苯胺異羥將酸已進入I/II期臨床實驗。組蛋白去乙?；敢种苿┩ㄟ^結(jié)合在組蛋白去乙?；阜肿拥拇呋行?，可逆或不可逆地抑制組蛋白去乙酰化酶活性，阻斷由于組蛋白去乙?；腹δ芪蓙y而導(dǎo)致的相關(guān)基因表達紊亂。發(fā)明人借助高密度脂蛋白受體表達上調(diào)劑篩選模型(中國專利申請?zhí)?00410029902,4,2004年3月26曰申請，2005年9月28曰公開)，經(jīng)過大量實驗，篩選到高密度脂蛋白受體表達上調(diào)劑一一曲古抑菌素A。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)另一個組蛋白去乙?；敢种苿┬炼１桨樊惲u將酸(SAHA)也具有類似的SR-BI/CLA-1上調(diào)活性。通過在分子水平上的研究，證實曲古抑菌素A具有較強的高密度脂蛋白受體表達的上調(diào)作用、ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運子尤其是ABCA1表達的上調(diào)作用以及增強肝細胞對膽固醇的選擇性攝取和巨噬細胞對膽固醇的攝取及外流能力，實現(xiàn)通過增強膽固醇逆轉(zhuǎn)運而顯示其抗動脈粥樣硬化作用。具體的，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)曲古抑菌素A通過提高膽固醇逆轉(zhuǎn)運初始和終末步驟的主要參與者清道夫受體BI和ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運子ABCA1的表達水平來促進膽固醇的逆向轉(zhuǎn)運，進而實現(xiàn)其抗動脈粥樣硬化作用。在本發(fā)明中，所述高密度脂蛋白受體表達的上調(diào)作用是指能在細胞體系中與空白對照相比使細胞中SR-BI/CLA-1的表達水平上調(diào)到200%以上，包括利用上述高密度脂蛋白受體表達上調(diào)劑篩選模型[17]測定的熒光強度增加到200%以上。在本發(fā)明中，所述ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運子ABCA1表達的上調(diào)作用是指在細胞體系中與空白對照相比使細胞中ABCAl的表達水平上調(diào)到200Q/fl以上，包括利用本發(fā)明實施例中詳述的ABCA1表達上調(diào)劑篩選模型[18]測定的熒光強度增加到200%以上。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明一方面涉及組蛋白去乙?；敢种苿╊惢衔锴乓志谹(TSA)和辛二酰苯胺異羥肟酸(SAHA)用于制備通過增強膽固醇逆轉(zhuǎn)運機制預(yù)防和/或治療動脈粥樣硬化的藥物的用途，其中所述通過膽固醇逆轉(zhuǎn)運機制實現(xiàn)預(yù)防和/或治療動脈粥樣硬化的藥物包括具有上調(diào)高密度脂蛋白受體SR-BI/CLA-1表達活性作用的藥物和上調(diào)ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運子ABCA1表達活性的作用的藥物。利用人高密度脂蛋白受體表達上調(diào)劑篩選模型U7]對中國藥用微生物菌種保藏管理中心微生物次級代謝產(chǎn)物庫(發(fā)酵液或粗提物)進行了大規(guī)模篩選，得到陽性菌株04-9179，經(jīng)鑒定為吸水鏈霉菌(57re/^<M7/ces力/^Tosco/7/ci/s)，對其進4亍大量發(fā)酵，采用大孑L樹月旨吸附、碳十八烷基鍵合硅膠(OctaDecyltrichloroSilane，ODS)反相層析等技術(shù)從發(fā)酵上清液中提取到3種純化合物(分別命名為9179A、9179B和9179C)，其中9179A在高密度脂蛋白受體表達上調(diào)劑篩選模型中表現(xiàn)出良好的上調(diào)活性。對其進行了ESI-MS的測定；并分別以CD30D3和CD3COCD3為溶劑，進行了^-NMIU13C-NMR、HSQC、HMBC和'H」HC0SY的測定及相應(yīng)的波傳解析，鑒定該化合物為7-(4-(二曱氨基)苯基)-N-羥基-4，6-二甲基-7-氧-2，4-庚二烯酰胺，即曲古抑菌素A(TSA，式l)。利用HPLC對化合物9179A與曲古抑菌素A標準品進行了比較，9179A的保留時間(7.899min)與曲古抑菌素A標準品的保留時間(7.918min)及UV圖譜基本一致，且混和進樣時9179A與曲古抑菌素A標準品色鐠峰疊加，確證9179A為已知化合物曲古抑菌素A(附圖1)。利用高密度脂蛋白受體表達上調(diào)劑篩選模型[17]對9179A與曲古抑菌素A標準品的量效關(guān)系進行了測定，其量效關(guān)系曲線基本一致，EC5。分別為0.37jliM和0.38jaM(附圖2)。此結(jié)果表明9179A與已知化合物曲古抑菌素A(TSA)的生物學(xué)活性一致。式l<formula>formulaseeoriginaldocumentpage10</formula>借助于人高密度脂蛋白受體表達上調(diào)劑篩選模型，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)7-(4-(二甲氨基)苯基)-N-羥基-4，6-二曱基-7-氧-2，4-庚二烯酰胺，即曲古抑菌素A(式l)顯示出對高密度脂蛋白表達較強的上調(diào)活性，且作用呈劑量依賴關(guān)系(附圖2)。曲古抑菌素A(TSA)是一種已知的組蛋白去乙?；?HDAC)抑制劑[14]。選擇另2個已知的組蛋白去乙酰化酶抑制劑，辛二酰苯胺異羥將酸(SAHA，式2)和丁酸鈉(Sodiumbutyrate,NaBu),利用高密度脂蛋白受體上調(diào)劑篩選模型考察它們對CLA-1啟動子的上調(diào)作用。實驗結(jié)果表明3種組蛋白去乙?；敢种苿┣乓志谹、辛二酰苯胺異羥肟酸和丁酸鈉都具有類似的上調(diào)CLA-1啟動子轉(zhuǎn)錄活性的能力(附圖3)。因此抑制組蛋白去乙?；赡苁荂LA-1基因的啟動子活性上升的機制之一。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage10</formula>將曲古抑菌素A作用于人肝癌細胞HepG2后，實時定量RT-PCR結(jié)果顯示高密度脂蛋白受體CLA-1的RNA水平明顯上調(diào)(附圖4)，流式細胞技術(shù)結(jié)果顯示高密度脂蛋白受體CLA-1蛋白水平明顯上調(diào)(附圖5)。更進一步的，曲古抑菌素A能夠增加HepG2細胞對熒光標記的HDL(Dil-HDL)的選擇性攝取(附圖6)。以上結(jié)果表明曲古抑菌素A可以通過上調(diào)人高密度脂蛋白受體CLA-1在肝細胞上的轉(zhuǎn)錄活性和受體表達提高肝細胞對HDL-C的攝取，從而促進膽固醇逆轉(zhuǎn)運的終末步驟。曲古抑菌素A亦能上調(diào)小鼠巨噬細胞RAW264.7中SR-BI的表達。將曲古抑菌素A作用于小鼠巨噬細胞RAW264.7后，實時定量RT-PCR結(jié)果顯示高密度脂蛋白受體SR-BI的RNA水平明顯上調(diào)(附圖7)，Western印跡結(jié)果顯示高密度脂蛋白受體SR-BI蛋白水平明顯上調(diào)(附圖8)。更進一步的，曲古抑菌素A能夠增加RAW264.7細胞對焚光標記的HDL(Dil-HDL)的攝取(附圖9)以及促進HDL介導(dǎo)的放射性標記的膽固醇([3H]cholesterol)的外流(附圖10)。以上結(jié)果表明曲古抑菌素A可以通過上調(diào)高密度脂蛋白受體SR-BI在巨噬細胞上的轉(zhuǎn)錄活性和受體表達提高巨噬細胞對HDL-C的攝取及膽固醇的外流，從而促進膽固醇逆轉(zhuǎn)運的起始步驟。在對膽固醇逆轉(zhuǎn)運過程中另一個關(guān)鍵靶點ABCAl的相關(guān)研究中，將含有人ABCAl上游調(diào)控序列的報告基因載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染入人肝癌細胞HepG2，構(gòu)建成穩(wěn)定表達熒光素酶報告基因的細胞林ABCAl-LUCHepG2[18]，熒光素酶活性的測定結(jié)果表明曲古抑菌素A能夠上調(diào)ABCAl的表達(附圖11)。將曲古抑菌素A作用于小鼠巨噬細胞RAW264.7后，實時定量RT-PCR(附圖12)及WesternBlot結(jié)果(附圖13)顯示ABCAl表達水平明顯上調(diào)。以上結(jié)果表明曲古抑菌素A可以上調(diào)人ABCAl在巨噬細胞上的轉(zhuǎn)錄活性和蛋白水平，從而提高巨嗟細胞中脂質(zhì)的流出，促進膽固醇逆轉(zhuǎn)運的初始步驟。對曲古抑菌素A分子作用機制的進一步研究提示，曲古抑菌素A通過調(diào)控含有SRE/SP1等順式元件的啟動子區(qū)域發(fā)揮上調(diào)CLA-1/SR-BI轉(zhuǎn)錄的作用(附圖14)。申請人構(gòu)建了含有不同長度的CLA-1啟動子片段的重組質(zhì)粒，通過比較曲古抑菌素A處理前后不同質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染的HepG2細胞的熒光素酶活性改變，發(fā)現(xiàn)-419~-232bP區(qū)域?qū)η乓志谹的作用敏感，該區(qū)域含有順式元件SRE和SP1,分別由反式因子SREBP和SP1所調(diào)控。申請人以該區(qū)域片段為探針，提取HepG2細胞核蛋白進行電泳遷移率變動實驗(electrophoreticmobilityshiftassay,EMSA)檢測，發(fā)現(xiàn)隨著曲古抑菌素A濃度上升，遷移條帶的量增加，提示曲古抑菌素A可能通過上調(diào)可結(jié)合SRE/SP1元件的反式因子的表達或通過調(diào)控反式因子與順式元件的結(jié)合來影響CLA-1的轉(zhuǎn)錄。進一步的，通過與PPARY激動劑羅格列酮(rosiglitazone，ROS)聯(lián)合用藥(PPRE順式元件位于-1055~-419bp)，發(fā)現(xiàn)兩藥合用有一定的累加效應(yīng)，提示曲古抑菌素A與羅格列酮通過不同的作用機制調(diào)控CLA-1的表達。本發(fā)明另一方面，涉及通過上調(diào)高密度脂蛋白受體SR-BI/CLA-1的表達增強膽固醇逆轉(zhuǎn)運機制，用于預(yù)防和/或治療動脈粥樣硬化的藥物組合物，其含有治療有效量選自曲古抑菌素A和辛二酰苯胺異羥肝酸的活性成分以及任選的藥學(xué)可接受的載體。更具體而言，含有選自本發(fā)明所述曲古抑菌素A和辛二酰苯胺異幾將酸的藥物組合物，可制成適于通過任何合適的途徑治療施用的形式，包括口服、胃腸外(包括皮下、肌內(nèi)、靜脈內(nèi)和皮內(nèi))等途徑。一般而言，對于本發(fā)明所述曲古抑菌素A和辛二酰苯胺異羥肟酸合適劑量為，每天每千克受者體重約1mg到約100mg，優(yōu)選地每天每千克體重約1mg到約50mg，最優(yōu)選地每天每千克體重約1mg到約25mg。希望的劑量優(yōu)選地為整個一天中以適當間隔施用的2、3、4、5、6或更多的亞劑量。這些亞劑量可以以單位劑型施用，例如，每單位劑型含有約1rag到約100mg、優(yōu)選地約1nig到約25mg以上、最優(yōu)選地約5mg到約25mg以上的有效成份。應(yīng)當理解，本發(fā)明的化合物和組合物的適當劑量可能取決于疾病的類型、嚴重程度和階段，并且隨患者各不相同。確定最佳劑量一般12包括使治療優(yōu)點水平與本發(fā)明的治療的任何危險或有害副作用相平衡。含有本發(fā)明所述曲古抑菌素A和辛二酰苯胺異羥肟酸的藥物組合物包括適于口、腸胃外(包括皮下、肌內(nèi)、靜脈內(nèi)和皮內(nèi))施用的制劑。制劑可便利地作為單位劑型，并且可以通過藥學(xué)領(lǐng)域眾所周知的任何方法制備。這些方法包括使有效成份與組成一種或多種助劑的載體結(jié)合的步驟。通常，制劑的制備方法為，使有效成份與液體載體或磨碎的固體載體或此兩者均勻且緊密地結(jié)合，然后必要時使該產(chǎn)品成形。適用于口服的本發(fā)明的制劑可以是離散的單位，如膠嚢、扁嚢劑或片劑，每種含有預(yù)定量的有效成份；粉末或顆粒；在水或非水液體中的溶液或懸液；或是水包油型液體乳劑或油包水型液體乳劑。有效成份也可以是大丸劑、藥糖劑或糊劑。通過任選地與一種或多種助劑一起壓縮或模制可以制備片劑。壓縮片劑的制備方法可以是，在合適的機器中壓縮易流動形式如粉末或顆粒狀的有效成份，該有效成份任選地與粘合劑(例如，聚烯吡酮、明膠、羥丙曱基纖維素)、潤滑劑、惰性稀釋劑、防腐劑、崩解劑(例如，淀粉乙醇酸鈉、交聯(lián)的聚烯吡酮、交聯(lián)的羧甲基纖維素鈉)、表面活性劑或分散劑混合。模制片劑的制備方法可以是，在合適的機器中模制一種用惰性液體稀釋劑潤濕的粉狀化合物的混合物。片劑可任選地包被或劃痕，并且可以配制使其中的有效成份緩慢或可控制地釋放，例如，應(yīng)用不同比例的羥丙甲基纖維素來得到希望的釋放分布圖。片劑可任選地包有腸溶衣，使之在腸而不在胃的部分中釋放。適于胃腸外施用的制劑包括水及非水等滲無菌注射液，其中可含有抗氧化劑、緩沖液、抑菌劑和使制劑與受者血液等滲的溶質(zhì)；水及非水無菌懸液，其中可含有懸浮劑和增稠劑，以及用來將化合物導(dǎo)向血液成分或一個或多個器官的脂質(zhì)體或其它微粒系統(tǒng)。這些制劑可存在于單位劑量或多劑量密封容器如安瓿或小瓶中，并且可以在冷凍干燥(凍千)條件下貯存，只需在使用前加入無菌液體載體如注射用水。臨時注射液及懸液可由前述類型的無菌粉末、顆粒和片劑制備而成。優(yōu)選的單位劑量制劑含有如上所述的前體藥物成份的每日劑量或單位、每日亞劑量或其適當部分。圖1:HPLC分析9179A與曲古抑菌素A標準品(TSA)分別及混和進樣o圖2:曲古抑菌素A增加CLAP-LUCHepG2細胞熒光素酶活性的量效關(guān)系曲線。圖3:組蛋白去乙酰化酶抑制劑(曲古抑菌素A、辛二酰苯胺異羥將酸和丁酸鈉)上調(diào)CLA-1啟動子活性。圖4:曲古抑菌素A增加HepG2細胞中高密度脂蛋白受體的mRM水平。圖5:曲古抑菌素A增加HepG2細胞中高密度脂蛋白受體的蛋白水平。圖6:曲古抑菌素A增加HepG2細胞中對熒光標記的HDL(DiI-HDL)的攝取(采用流式細胞儀檢測)。圖7:曲古抑菌素A增加RAW264.7細胞中高密度脂蛋白受體的mRNA水平。圖8:曲古抑菌素A增加RAW264.7細胞中高密度脂蛋白受體的蛋白水平。圖9:曲古抑菌素A增加RAW264.7細胞對熒光標記的HDL(Dil-HDL)的攝取(采用流式細胞儀檢測)。圖10:曲古抑菌素A增加RAW264.7細胞對放射性標記的膽固醇([3H]cholesterol)的外流。圖11:曲古抑菌素A上調(diào)ABCAl表達的量效關(guān)系曲線。圖12:曲古抑菌素A增加RAW264.7細胞中ABCA1的mRNA水平。圖13:曲古抑菌素A增加RAW264.7細胞中ABCA1的蛋白水平。圖14:曲古抑菌素A的調(diào)控機制研究。實施例實施例19179A的制備及結(jié)構(gòu)鑒定A)9179A的制備鏈霉菌04-9179來自中國藥用微生物菌種保藏管理中心，對其發(fā)酵液上清提取分離，其中組分A(9179A)在人高密度脂蛋白受體表達上調(diào)劑篩選模型中表現(xiàn)出良好的上調(diào)活性。菌種04-9179的發(fā)酵將保藏的04-9179菌種接種到Y(jié)M斜面，在28。C恒溫箱中培養(yǎng)一周后，復(fù)壯一次。將種子斜面挖塊，碾碎接種于100ml的9179發(fā)酵培養(yǎng)基，28°C振搖培養(yǎng)48h，5%(v/v)接種于100ml發(fā)酵培養(yǎng)基中，28°C,200rpm振搖培養(yǎng)48h，然后將發(fā)酵液10%(v/v)接種于1000ml發(fā)酵培養(yǎng)基中，28°C,200rpm振搖發(fā)酵96h后收獲。04-9179活性組分的提取分離(1)04-9179發(fā)酵液4000rpm離心20min，合并上清，揮干后用二曱亞砜(dimethylsulphoxide，DMSO)重新溶解，利用人高密度脂蛋白受體上調(diào)劑篩選模型進行活性測定，菌體用丙酮浸泡過夜，過濾后取樣，揮干并檢測活性。(2)活性上清液以10:1的比例進行X-5大孔吸附樹脂層析，每分鐘流速l/50柱體積，棄濾過液。(3)以2倍柱體積的20°/。丙酮洗脫，棄流出液。隨后，用2倍柱體積50%丙酮洗脫，收集流出液組分l(Fraction1)。最后以2倍柱體積80%丙酮洗脫，收集流出液組分2(Fraction2)。將收集的組分1、2分別置入高速真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，蒸干丙酮后冷凍干燥，-20^:保存。最后以100%丙酮洗脫處理樹脂柱，棄流出液。以上步驟流速均為每分鐘1/100柱體積。(4)以20。/。曱醇平衡ODS柱l-2個柱體積。(5)將組分1溶于50%甲醇，每克干品約用12-15ml溶劑，必要時超聲1-2min。溶液上ODS柱，分別以20%、50°/。、80%甲醇洗脫2個柱體積，HPLC檢測，通過人高密度脂蛋白受體上調(diào)劑篩選模型檢測活性，分別合并相應(yīng)的不同活性部分，得到活性組分B和C(FractionB和C),揮干，-2(TC保存。(6)將組分2溶于80%甲醇，每克干品約用12-15ml溶劑，必要時超聲1-2min。溶液上0DS柱，分別以30%、60%、85%甲醇洗脫2個柱體積，收集不同洗脫條件的流出液，HPLC檢測，模型測活，分別合并相應(yīng)的不同活性部分，得到活性組分A(FractionA)，揮干，-20°C保存。(7)用HPLC制備柱進一步分離活性組分A、B和C化合物9179A為白色粉末，都易溶于甲醇、丙酮和DMSO,難溶于水。其理化性質(zhì)見表l。表l:9179A的理化學(xué)性質(zhì)<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>B)化合物9179A的結(jié)構(gòu)解析對其進行了ESI-MS的測定；并分別以CD肌和CD3COCD3為溶劑，進行了)H-NMR、13C-NMR、HSQC、HMBC和屮-^COSY的測定及相應(yīng)的波譜解析，鑒定該化合物為7-(4-(二甲氨基)苯基)-N-羥基-4，6-二甲基-7-氧-2，4-庚二烯酰胺，即曲古抑菌素A。9179A的ESI-MS給出其分子量為302。碳譜中5131.9(C-2，6)和5111.9(C-3，5)處的兩個芳香碳信號明顯高于其它芳香碳，DEPT譜表明為CH,氫譜中對應(yīng)的57.80(H-2，6)和56.67(H-3，5)的兩組芳香氫積分面積均為2個氫，因此分子中存在1,4-對位取代的苯環(huán)結(jié)構(gòu)，H-2與H-3以及H-5與H-6均為鄰位耦合(J=9Hz)。氫鐠中53.00處的單峰積分面積為6個氫，很明顯為芳香環(huán)上的N(CH》2的信號。HMBC中可以觀察到氮上的甲基與苯環(huán)C-4(5155.5)和H-2、H-6與C-l，羰基(5201.5)的遠程耦合信號，因此苯環(huán)上1，4位分別為羰基和二甲氨基取代。力」HC0SY中可以觀察到H-8，和H-2，，H-2，和H-3，以及H-5，和H-6，的相關(guān)信號，H-5，(57.12，J-15.5)和H-6，(55.80,J-15.5)之間15.5Hz的耦合常數(shù)說明雙鍵為反式。HMBC中可以觀察到H-3，與C-5，，H-5，與C-3'，H-6，與C-4，的遠程耦合，因此兩個雙鍵相互共軛。HMBC中還可以找到H-2，和H-8，分別與C-l，羰基的遠程耦合，以及H-5，和H-6，與C-7，(5166.8)羥肟酸羰基的遠程耦合，因此兩個羰基基團分別連于側(cè)鏈的兩端。經(jīng)檢索化合物并與相關(guān)文獻比較，最終確定9179A的結(jié)構(gòu)式如圖9所示，其結(jié)構(gòu)為已知，與曲古抑菌素A(TSA)相同，化學(xué)名為7-(4-(二曱氨基)苯基)-N-羥基-4，6-二甲基-7-氧-2，4-庚二烯酰胺。9179A在CD30D和(CD3)2C0中的氫謙及與曲古抑菌素A的碳譜比較見表2。9179A在(CD》2CO中的氫語以及碳語與文獻報道的曲古抑菌素A在DMS0-d6的氫譜和碳譜數(shù)據(jù)基本一致，因此9179A被確定為是曲古抑菌素A，化學(xué)名為7-(4-(二甲氨基)苯基)-N-羥基-4，6-二曱基-7-氧-2，4-庚二烯酰胺。17表29179A和曲古抑菌素A的氫鐠和碳譜的化學(xué)位移和多重性比較<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>(a)500MHz，在CD3OD中；(b)125MHz，在CD3OD中;(c)15MHz,在CDC13+CD30D中。C)9179A與曲古抑菌素A標準品的HPLC比較為進一步確定9179A結(jié)構(gòu)與曲古抑菌素A的一致性，分別對曲古抑菌素A標準品、9179A及兩者混合樣品進^f亍HPLC分析。利用SHIMADZUVP-ODS分析柱(150x4.6mm，5jum)，甲醇/水/三氟醋酸(曱醇水TFA,50:50:0.1)洗脫，流速1ml/min，柱溫40。C，352認紫外下檢測。實驗結(jié)果見附圖1，9179A保留時間(7.899min)與曲古抑菌素A標準品保留時間(7.918min)及UV圖鐠基本一致，且混和進樣時9179A與曲古抑菌素A標準品色譜峰疊加，說明9179A確為已知化合物曲古抑菌素A(式1)。實施例2高密度脂蛋白受體表達上調(diào)劑篩選模型測定9179A和曲古抑菌素A標準品上調(diào)高密度脂蛋白受體表達活性A)重組表達質(zhì)粒pGL3-CLAP的構(gòu)建菌抹和細胞林Aco7/DH5a用于質(zhì)粒DNA的遺傳操作。人肝癌細胞抹HepG2(購自上海午立生物技術(shù)有限公司)用于人高密度脂蛋白受體表達上調(diào)劑篩選模型的構(gòu)建。質(zhì)粒pGEM-T(購自Promega公司)用于PCR產(chǎn)物的克隆。pGL3-Basic(購自Promega公司)為報告基因載體，含有無啟動子的螢火蟲(尸力o〃/7MArra/")熒光素酶編碼基因，用于人高密度脂蛋白受體調(diào)控序列的克隆。pGL3-contro1(購自Promega公司)含有SV40啟動子和增強子序列，用于熒光素酶表達的陽性對照。pRL-TK(購自Promega公司)包含編碼海腎(Wei727/are/7/丫or/z7")熒光素酶的cDNA，與實驗載體共轉(zhuǎn)染哺乳動物細胞，用于雙焚光素酶報告基因體系的內(nèi)對照。人高密度脂蛋白受體基因調(diào)控序列的獲得根據(jù)文獻報道的CLA-1基因序列，利用軟件PrimerPremier5.0設(shè)計PCR引物PI(5，-CCTCGAGTGGAGCCATTGTGTGCAAAG-3，)(SEQIDNO:2)和P2(5，-CAAGCTTCGGCGACAGAGACGACACAG_3，)(SEQIDNO:3)，用于擴增CLA-1基因上游-1055bp-62bp(以CLA-l基因起始密碼子ATG中的A為+l)長度為996bp的片段，其中PI引入了酶切位點，P2引入了#//7dIII酶切位點。以人肝癌細胞bel-7402總dna為模板設(shè)立25m1pcr反應(yīng)體系lxPCR緩沖液，0.5|amol/LPl引物和P2引物，2.5|amol/LdNTPs，0.5UTaqDNA聚合酶。反應(yīng)條件為94匸變性5min，94。C變性40s，54。C退火4Qs,72。C延伸1min20s(30個循環(huán))，72。C延伸10min。PCR擴增的目的片段用pGEM-T載體克隆后酶切鑒定并測定所得調(diào)控序列的序列，如seqidno:1所示。依據(jù)分子克隆中所述的方法[19]，將PCR產(chǎn)物與pGEM-T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5oc受體菌，用藍白斑法篩選轉(zhuǎn)化子。對轉(zhuǎn)化子進行快速質(zhì)粒提取后，用和A7/7dIII雙酶切鑒定，鑒定正確的轉(zhuǎn)化子命名為i".co//DH5a/pGEM-CLAP。重組質(zhì)粒pGL3-CLAP的構(gòu)建用J力ol和"'/din雙切重組質(zhì)粒pGEM-CLAP得到目的片段后，將目的片段與經(jīng)過相同雙酶切的pGL3-basic質(zhì)粒相連，從而將人SR-BI基因上游調(diào)控序列定向插入到pGL3-basic的熒光素酶基因上游，構(gòu)建成重組質(zhì)粒pGL3-CLAP。B)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞林CLAP-LUCHepG2的建立(1)細胞培養(yǎng)MEM-EBSS培養(yǎng)基(Hyclone公司)(含10。/。標準胎牛血清，Hyclone公司)用于肝癌細胞HepG2的培養(yǎng)。上述培養(yǎng)基補加600ug/ml的新霉素G418用于構(gòu)建的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞CLAP-LUCHepG2的培養(yǎng)。(2)轉(zhuǎn)染采用Lipofectamine2000(Invitrogen公司)介導(dǎo)的方法，將重組質(zhì)粒pGL3-CLAP和pcDNA3共轉(zhuǎn)染入HepG2細l包。經(jīng)700/ag/ml的新霉素G418處理14天后，帶有新霉素抗性的細胞克隆形成。對形成的細胞克隆進行一系列單克隆化操作，同時跟蹤其熒光素酶活性。將高表達熒光素酶活性且呈現(xiàn)正常細胞周期的穩(wěn)定細胞克隆命名為CLAP-LUCHepG2(G418維持濃度為600|ag/ml)。C)人高密度脂蛋白受體SR-BI上調(diào)劑的篩選(1)焚光素酶表達活性的測定細胞熒光素酶表達活性的測定釆用熒光檢測試劑盒LuciferaseAssaySystem(Promega公司)。用BMG公司的PolarstarGalaxy紫外-可見-熒光臺式培養(yǎng)板用分光光度計檢測熒光素酶活性。(2)篩選條件的優(yōu)化及最終確定將CLAP-LUCHepGZ細胞以一定密度接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，待細胞貼壁約6小時后，即長至90。/。滿時換為無血清的MEM-EBSS培養(yǎng)基(200ul/孔)，同時加入一定濃度的陰性對照(溶劑DMSO)、陽性對照(羅格列酮)和待測樣品。繼續(xù)于37。C，5%0)2條件下培養(yǎng)。18小時后用磷酸鹽緩沖液(phosphatebufferedsolution,PBS)(137raMNaCl，2.7mMKCl，4.3mMNa2HP04，1.4mMKH2P04，pH7.3)漂洗細月包一次，每孔加入預(yù)先稀釋好的lxCCLR(CellCultureLysisReagent)裂解液20Ml，37。C裂解細胞20min后，完全轉(zhuǎn)移細胞裂解液至不透明白板中的相應(yīng)各孔內(nèi)，并采用熒光檢測試劑盒LuciferaseAssaySystem測定細胞中熒光素酶的活性。通過對篩選過程中溶液DMSO的終濃度、樣品作用于細胞的時間以及每孔接種的細胞數(shù)等條件進行優(yōu)化，最終確定篩選條件如下每孔接種5xl(T個細胞，DMSO終濃度O.1%，樣品作用時間為18小時。待測樣品對焚光素酶表達活性改變率的計算用如下方程計算待測樣品對熒光素酶表達活性的改變率改變率(％)=A/Bx100其中，A為加入待測樣品后測定的熒光素酶表達活性(或相應(yīng)的熒光單位)，B為加入陰性對照樣品(溶劑DMSO)后測定的焚光素酶表達活性(或相應(yīng)的焚光單位)。D)9179A和曲古抑菌素A標準品增加CLAP-LUCHepG2細胞熒光素酶活性的量效關(guān)系曲線按照C)中所述的方法，將CLAP-LUCHepG2細胞以5xl(T個細胞/孔接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，待細胞貼壁約6小時后，分別換為含系列稀釋濃度的9179A和曲古抑菌素A標準品的無血清MEM-EBSS培養(yǎng)基(200jul/孔)。注意保持各濃度孔中DMSO的終濃度為0.1%，另設(shè)含終濃度0.r/。DMSO培養(yǎng)基的孔做空白對照。繼續(xù)于37。C，5%(^02條件下培養(yǎng)18小時后，按照上述處理方法測定細胞中熒光素酶的活性。9179A和曲古抑菌素A標準品在0.03-1.33uM濃度范圍內(nèi)能夠上調(diào)CLAP-LUCHepG2細胞焚光素酶的表達，在濃度為1.33pM時達到最高上調(diào)活性2000%(測定結(jié)果見附圖2)。E)組蛋白去乙?；敢种苿╊惢衔飳LA-1啟動子活性的影響檢測曲古抑菌素A、辛二酰苯胺異羥肝酸和丁酸鈉對CLAP-LUCHepG2細胞熒光素酶活性的影響。實驗結(jié)果見附圖3，曲古抑菌素A、辛二酰苯胺異羥將酸和丁酸鈉在一定濃度下均能夠上調(diào)CLAP-LUCHepG2細胞熒光素酶的表達。實施例3:曲古抑菌素A對肝癌細胞HepG2高密度脂蛋白受體CLA-1的影響A)HepG2細胞培養(yǎng)MEM-EBSS培養(yǎng)基(Hyclone公司)(含10。/。標準胎牛血清〈Hyclone公司>)用于肝癌細胞HepG2的培養(yǎng)。B)采用實時定量RT-PCR的方法研究曲古抑菌素A對CLA-1轉(zhuǎn)錄水平的影響(1)細胞總RNA的提取人肝癌細胞HepG2以5x105個接種60mm細胞培養(yǎng)板，37°C，5%C02條件下培養(yǎng)24小時后，用冰預(yù)冷的PBS漂洗細胞2次，分別加入含0.03、0.3、0.6jLiM(DMSO含量為0.1%)曲古抑菌素A的無血清MEM-EBSS培養(yǎng)基，同時對照板加入含0.1%DMSO的相應(yīng)培養(yǎng)基。"。C，5。/。C02條件下培養(yǎng)24小時后，用Trizol試劑(Invitrogen公司)進行細胞總RNA的提取(具體操作步驟按照試劑盒的說明書進行)。提取細胞總RNA后用瓊脂糖凝膠電泳檢測核糖體RNA(rRNA)的完整性并測定所提取RNA的濃度。(2)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)——cDNA的合成采用ThermoScriptRT—PCRSystem試劑盒(Invitrogen乂>司)進行，具體操作步驟按照試劑盒說明書所述。模板RNA各4jag分別與ThermoScript和引物RT01igo(dT)2?；旌希?5。C保溫60min進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后于85。C加熱5rain以終止反應(yīng)。所得cDM于-2(TC保存或繼續(xù)行以下的PCR反應(yīng)。(3)Real-timePCR檢觀"采用SYBRGreenPCRMasterMix和RT-PCR(ABI公司)將獲得的cDNA樣品分別配制Real-TimePCR反應(yīng)體系。體系配置如下2xpCRMasterMix緩沖液12.5u1;上、下游引物(2jiM)各2.5Ml;模板7.5總體積25u1。將溶液混合，5000rpm短暫離心。將PCR反應(yīng)液置于Real-timePCR儀上，按下列反應(yīng)條件進行PCR反應(yīng)。95°C,IO分鐘，1個循環(huán)；95°C，15秒，60°C，30秒，78°C，15秒(收集熒光)，40個循環(huán)；55°C，1分鐘，95°C，1分鐘，1個循環(huán)；55到95。C,每5秒升高1。C，81個循環(huán)檢測溶解曲線(MeltingCurve)。檢測目的基因及作為內(nèi)對照的持家基因磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)的引物各自的擴增曲線(將模板倍比稀釋后對閾值[Ct值〗進行線性擬合)，112均大于0.98;對引物進行溶解曲線檢測，結(jié)果均呈現(xiàn)單峰，且2%瓊脂糖凝膠電泳驗證擴增片段大小正確，說明無非特異擴增，符合釆用Real-timePCR實驗進行定量的要求。各樣品的目的基因和持家基因磷酸甘油醛脫氫酶(內(nèi)參)分別進行Rea卜timePCR反應(yīng)。各樣品的閾值由iQ5OpticalSystemversion1.1.1442.0軟件(Bio-Rad^S司)給出。每個樣品中目的基因的相對含量利用AACt法計算，計算公式為2(對照的ct值-藥物處理后的Ct值)紀基因相對含里=2(對照的ct值-藥物處理后的Q值)eMDH實驗結(jié)果見附圖4，曲古抑菌素A可劑量依賴性地上調(diào)HepG2細胞中CLA-1基因的mRNA水平，0.3pM及0.6pM曲古抑菌素A作用后，其上調(diào)率分別為47.6%和51.6%。C)采用流式細胞儀檢測曲古抑菌素A對CLA-1蛋白水平的影響(1)HepG2細胞按5x105個/孔接種6孔板；(2)37°C，5。/。C02條件下培養(yǎng)24h后以PBS漂洗細胞2次，每孔加入一定濃度以相應(yīng)無血清培養(yǎng)基稀釋的待測化合物，同時做無化合物對照；(3)24h后以胰酶消化各孔細胞，用冷PBS漂洗細胞1次；(4)以4%(w/v)多聚甲醛(用PBS配制，6SX:水浴不斷攪拌至完全溶解，0.22pm濾膜過濾，4'C保存，2周內(nèi)有效)2ml，4。C固定細胞過夜或室溫固定40min;(5)固定結(jié)束后，1000rpra離心5min，棄多聚曱醛，并用PBS漂洗細胞1次；(6)用1ml含5%FBS的PBS重懸細胞，4C放置15min;(7)1mlPBS洗細胞1次，將細胞均分為兩份；(8)—抗醉育(1:50稀釋)相應(yīng)的對照管不加一抗稀釋液，只加入相同體積的PBS，混勻，4。Ci文置50min后，1mlPBS洗細胞2次；(9)二抗孵育(FITC標記，1:100-1:150稀釋)加入二抗稀釋液后將細胞混勻，4。C放置50min(此步開始盡量避光操作)后，1mlPBS漂洗細胞2次；(10)每管樣品加入0.5mlPBS重懸細胞，300目尼龍膜過濾，流式細胞儀檢測。實驗結(jié)果見附圖5,曲古抑菌素A可劑量依賴性地上調(diào)HepG2細胞中CLA-1蛋白水平，0.3jaM及O.6jiM9179A作用后，其上調(diào)率分別為48.0%和53.7%。D)采用流式細胞儀檢測曲古抑菌素A對細胞攝取DiI-HDL的影響人肝癌細胞HepG2以5x104個接種24孔細胞培養(yǎng)板，37°C，5%C02條件下培養(yǎng)24小時后，用冰預(yù)冷的PBS漂洗細胞2次，分別加入含0.03、0.3、0.6iaM(DMSO含量為0.1%)曲古抑菌素A的無血清MEM-EBSS培養(yǎng)基，同時對照孔加入含0.1%DMSO的相應(yīng)培養(yǎng)基。37。C，5%C02條件下培養(yǎng)24小時后，每孔加入2jag/mlDiI-HDL，37。C孵育4h。以冷PBS漂洗細胞1次，各孔分別加入1ml含有0.5%BSA和2raMEDTA的PBS，于4。C放置1h。輕輕吹打并分散細胞，細胞懸液于4°C，800xg，離心3min。收集細胞重懸于0.5mlPBS中，過300目尼龍網(wǎng)后上流式細胞儀檢測焚光值。實驗結(jié)果見附圖6,曲古抑菌素A對HepG2細胞攝取膽固醇的能力具有一定的上調(diào)作用，0.03mM、0.1juM和0.3jjM的曲古抑菌素A對HepG2細胞攝取DiI-HDL分別上調(diào)了50.5%、386.3%和70.9%。其中O.1juM的曲古抑菌素A對細胞攝取DiI-HDL的作用最強。0.6|iM曲古抑菌素A作用時對DiI-HDL的攝取有一定程度的下降，可能與在此濃度下曲古抑菌素A表現(xiàn)出一定的細胞毒作用有關(guān)。實施例4曲古抑菌素A對RAW264.7細胞中高密度脂蛋白受體SR-BI的影響A)RAW264.7細胞的培養(yǎng)DMEM-高糖培養(yǎng)基(Hyclone公司)(含10。/。標準胎牛血清〈Hyclone公司〉)用于小鼠巨噬細胞RAW264.7的培養(yǎng)。B)Real-1imePCR測定曲古抑菌素A對RAW264.7細胞SR-BImRNA水平的影響如實施例3中A)所述，實驗結(jié)果見附圖7，曲古抑菌素A可劑量依賴性地上調(diào)RAW264.7細胞中SR-BI基因mRNA水平，0.3及0.6jaM曲古抑菌素A作用后，其上調(diào)率分別為45.0%和64.8%。C)Westernblot方法測定曲古抑菌素A對RAW264.7細胞SR-BI蛋白水平的影響(1)蛋白樣品的制備小鼠巨噬細胞RAW264.7以7x1()5個/ml接種60mm細胞培養(yǎng)板，37°C，5%C02條件下培養(yǎng)24h后，用冰預(yù)冷的PBS漂洗細胞2次，加入含O.03、0.3、0.6ijM(DMSO含量為0.1%)曲古抑菌素A的無血清MEM-EBSS培養(yǎng)基，同時對照板加入含0.1%DMSO的相應(yīng)培養(yǎng)基。曲古抑菌素A作用24h后，以冰預(yù)冷的PBS漂洗細胞2次，各孔板分別加入200|i1的裂解液(50mMTris-HCL，pH7.4,150mMNaCl，1%NP40,0.1%SDS)，于水上裂解細胞20min。收集各組細胞裂解液，于4。C,10，000g離心5min。收集上清用BCA試劑盒(PIERCE公司)對蛋白進行定量。加入一定量的5x蛋白上樣緩沖液，于沸水浴中煮10min，冷卻后于-20'C保存?zhèn)溆没蜻M行隨后的蛋白電泳。(2)WesternBlot來自對照組和加藥組的各30mg蛋白提取物進行12。/。的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，具體膠的配制和電泳方法按照分子克隆[19]進行。電泳完成后進行隨后的轉(zhuǎn)膜反應(yīng)(0.45iamPVDF膜)，轉(zhuǎn)模完成后以含0.1%Tween20的PBS(PBST)配制的5%脫脂奶粉對膜進行室溫封閉1h。相對應(yīng)分子量的PVDF膜分別與各自的一抗孵育過夜。目的蛋白為小鼠抗人的CLA-1單克隆抗體(BD公司產(chǎn)品)，內(nèi)參為兔抗人的P-肌動蛋白((3-actin)的多克隆抗體(SantaCruz/^司產(chǎn)品)。二抗分別為辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠IgG和山羊抗兔IgG(SantaCruz公司產(chǎn)品)，室溫孵育1h。采用增強型發(fā)光檢測系統(tǒng)進行(SantaCruz公司產(chǎn)品)凝膠成像后并行各條帶的灰度掃描。用人的P-肌動蛋白作為內(nèi)對照來標準化CLA-1免疫反應(yīng)的條帶。實驗結(jié)果見附圖8，曲古抑菌素A可劑量依賴性地上調(diào)RAW264.7細胞中SR-BI蛋白質(zhì)水平，0.3pM及O.6曲古抑菌素A作用后，其上調(diào)率分別為133.6%和160.2%。D)采用流式細胞儀檢測曲古抑菌素A對RAW264.7細胞攝取Dil-HDL能力的影響方法見實施例3的C)，實驗結(jié)果見附圖9，曲古抑菌素A對RAW264.7細胞攝取膽固醇的能力具有一定的上調(diào)作用，其中0.1jaM、0.3luM和0.6iaM的曲古抑菌素A對HepG2細胞攝取Dil-HDL的量分別上調(diào)85.2%、189.9%和169.6%，呈一定的量效關(guān)系。E)利用放射性氚標記的膽固醇([3H]cholesterol)檢測曲古抑菌素A對RAW264.7細胞膽固醇外流能力的影響(1)液閃液的配制1000ml曱苯中溶解5gPPO(2，5-二硝基惡唑，5—Diphenyloxazole)和150mgPOPOP(1.4-雙-[2-(5-苯基惡喳)]-26苯，1,4-Bis-[5-phenyl-oxazoyl-2]-benzene);(2)RAW264.7細胞接種96孔板，待細胞匯合度至50%;(3)加入5jnCi/ml[1，2-3H〗膽固醇，37'C孵育24h;(4)用含1mg/ml牛血清白蛋白(BSA)的PBS洗細胞3次；(5)加入含lmg/mlBSA的培養(yǎng)基及不同劑量的曲古抑菌素A(0，0.03，0.3,0.6iaM)，37°C孵育18-24h;(6)用含1mg/mlBSA的PBS洗細胞3次；(7)加入100|ag/mlHDL(溶于含1mg/mlBSA的培養(yǎng)基)，37。C孵育24h;(8)收集培養(yǎng)基上清，10，000g離心5min;(9)細胞部分溶于己烷異丙醇=3:2的溶液中萃取過夜；(10)將收集的液體分別轉(zhuǎn)移至1.5cmxl.5cm的3M濾紙上(做好標記)，75'C烘干；(11)將紙片^L在液閃杯中，加入IOml液閃液，閃爍計數(shù)儀計數(shù)(BeckmanLS6000)。實驗結(jié)果見附圖10，曲古抑菌素A在0.6uM濃度能夠上調(diào)RAW264.7細胞膽固醇的外流。實施例5曲古抑菌素A增加RAW264.7細胞ABCA1的表達A)曲古抑菌素A增加ABCA1表達的量效關(guān)系曲線(1)重組表達質(zhì)粒pGL3-ABCAl的構(gòu)建菌林和細胞林Aco7/'DH5oc用于質(zhì)粒DNA的遺傳操作。人肝癌HepG2細胞林用于重組表達質(zhì)粒pGL3-ABCAl的瞬時轉(zhuǎn)染。質(zhì)粒pGEM-T(Promega公司)用于PCR產(chǎn)物的克隆。pGL3-Basic(Promega公司)為報告基因載體，含有無啟動子的螢火蟲(尸^〃/2^/^/%2//"熒光素酶編碼基因，用于ABCA1調(diào)控序列的克隆。pGL3-control(Promega公司)含有SV40啟動子和增強子序列，用于熒光素酶表達的陽性對照。ABCA1基因調(diào)控序列的獲得根據(jù)文獻報道的ABCA1基因序列，利用軟件PrimerPremier5.0設(shè)計PCR引物，用于擴增人ABCA1基因上游-819bp-+71bp(+1為ABCA1基因的轉(zhuǎn)錄起始位點)長度為890bp的片段。PCR擴增的目的片段用pGEM-T載體克隆后酶切鑒定并測定所得的序列。依據(jù)分子克隆實驗指南中所述的方法[19]，將PCR產(chǎn)物與pGEM-T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a受體菌，用藍白斑法挑選轉(zhuǎn)化子。對轉(zhuǎn)化子進行快速質(zhì)粒提取后，用和"'"dill雙酶切鑒定，鑒定正確的轉(zhuǎn)化子命名為Aco//DH5a/pGEM-ABCAl。重組質(zhì)粒pGL3-ABCA1的構(gòu)建用J力ol和〃2'/2din雙切重組質(zhì)粒pGEM-ABCA1得到目的片段后，將目的片段與經(jīng)過相同雙酶切的pGL3-basic質(zhì)粒相連，從而將人ABCA1基因上游調(diào)控序列定向插入到pGL3-basic的熒光素酶基因上游，構(gòu)建成重組質(zhì)粒pGL3-ABCA1。(2)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞林ABCA1-LUCHepG2的建立細胞培養(yǎng)MEM-EBSS培養(yǎng)基(Hyclone公司)(含10%標準胎牛血清〈Hyclone公司〉)用于肝癌細胞HepG2的培養(yǎng)。上述培養(yǎng)基補加500yg/ml新霉素G418用于構(gòu)建的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞ABCA1-LUCHepG2的培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染采用Lipofectamine2000(Invitrogen公司)介導(dǎo)的方法，將重組質(zhì)粒pGL3-ABCA1和pcDNA3共轉(zhuǎn)染入HepG2細胞。經(jīng)600mg/mlG418處理14天后，帶有新霉素抗性的細胞克隆形成。對形成的細胞克隆進行一系列單克隆化操作，同時跟蹤其熒光素酶活性。將高表達熒光素酶活性且呈現(xiàn)正常細胞周期的穩(wěn)定細胞克隆命名為ABCA1-LUCHepG2(G418維持濃度為500|Jg/ml)。(3)量效關(guān)系曲線的測定將ABCA1-LUCHepG2細胞以3xl04個細胞/孔接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，過夜培養(yǎng)后(細胞貼壁》12h)，換為含系列稀釋濃度的待測樣品的無血清MEM-EBSS培養(yǎng)基(200jli1/孔)。注意保持各濃度孔中DMSO的終濃度為0.1%，另設(shè)含終濃度0.l仰MSO培養(yǎng)基的孔做空白對照。繼續(xù)于37。C，5%0)2條件下培養(yǎng)18小時后，按照實施例l中所述處理方法測定細胞熒光素酶的活性。待測樣品對熒光素酶表達活性改變率間接反應(yīng)了細胞中ABCA1表達的變化情況，用如下方程計算待測樣品對熒光素酶表達活性的改變率改變率(％)=A/Bx100其中，a為加入待測樣品后測定的熒光素酶表達活性(或相應(yīng)的熒光單位)，B為加入空白對照樣品(溶劑DMSO)后測定的熒光素酶表達活性(或相應(yīng)的熒光單位)。曲古抑菌素a在0.1-10mM濃度范圍內(nèi)能夠上調(diào)ABCA1-lucHepG2細胞熒光素酶的表達，在濃度為1.66uM時達到最高上調(diào)活性248.3%(測定結(jié)果見附圖11)。B)曲古抑菌素A對RAW264.7細胞ABCA1基因mRNA水平的影響Real-timeRT-PCR方法測定曲古抑菌素A對RAW264.7細胞ABCA1基因mRNA水平的影響，如實施例3中A)所述。實驗結(jié)果見附圖12，曲古抑菌素A可劑量依賴性上調(diào)RAW264.7細胞中ABCA1的mRNA水平，0.3jaM及0.6曲古抑菌素A作用后，其上調(diào)率分別為632.9%和750.4%。C)曲古抑菌素A對RAW264.7細胞ABCA1基因蛋白水平的影響Western印跡方法測定曲古抑菌素A對RAW264.7細胞SR-BI基因蛋白水平的影響，如實施例4中B)所述。實驗結(jié)果見附圖13，曲古抑菌素A對RAW264.7細胞中ABCA1的蛋白水平也有一定的上調(diào)作用，0.3及0.6曲古抑菌素A作用后，其上調(diào)率分別為47.6%和42.8%。實施例6曲古抑菌素A作用機制研究參照實施例2中方法，為進一步揭示曲古抑菌素A上調(diào)CLA-l基因啟動子活性的作用區(qū)域，除原有的pGL3-CLAP(-1055~-62bp)重組質(zhì)粒外，構(gòu)建了不同長度的CLA-l啟動子區(qū)域與熒光素酶報告基因相連的重組質(zhì)粒，包括pGL3-CLAPl(-1195—62bp)，pGL3-CLAP3(-419~-62bp),pGL3-CLAP4(-232~-62bp),pGL3-CLAP5(-182~-62bp)四個質(zhì)粒，并對轉(zhuǎn)染了不同質(zhì)粒的HepG2細胞中熒光素酶活性進行了比較，如附圖14A所示，CLAP1、CLAP、CLAP3重組質(zhì)粒表現(xiàn)出較高的轉(zhuǎn)錄活性，提示包含SRE/SP1元件的區(qū)域(-419--232bp)及包含PPRE元件的區(qū)域(-1055~-419bp)對CLA-l基因的轉(zhuǎn)錄活性影響較大。檢測曲古抑菌素A對轉(zhuǎn)染了不同重組質(zhì)粒的HepG2細胞中熒光素酶報告基因活性的影響，結(jié)果如附圖14B所示，曲古抑菌素A對含有SRE/SP1元件的區(qū)域(-419~-232bp)存在與否敏感，當該區(qū)域缺失時，對CLA-1上調(diào)的活性即失去，而其他區(qū)域?qū)η乓志谹的加入與否不敏感。說明曲古抑菌素A可能通過含有SRE/SP1元件的區(qū)域調(diào)控CLA-1的轉(zhuǎn)錄。用PCR方法擴增含有SRE/SP1元件的CLA-1啟動子區(qū)域(-419~-232bp)，以該片段為探針，利用電泳遷移率變動實驗(electrophoreticmobilityshiftassay,EMSA)的方法檢測不同濃度曲古抑菌素A處理HepG2細胞后，對HepG2細胞核蛋白提取物與該探針結(jié)合的影響，如附圖14C所示，不同濃度曲古抑菌素A使核蛋白結(jié)合探針片段的量逐漸上升，而加入過量的(IO倍)非標記的該探針片段后，結(jié)合條帶明顯減弱，說明該條帶是核蛋白與探針特異性結(jié)合形成。結(jié)果表明曲古抑菌素A可能直接或間接上調(diào)SREBP或SP1轉(zhuǎn)錄因子的表達或活性，通過結(jié)合含有SRE/SP1元件的區(qū)域(-419~-232bp)發(fā)揮上調(diào)CLA-1轉(zhuǎn)錄的作用。有文獻報道，在肝細胞中PPARy與類視黃醇X受體(RXR)形成異源二聚體后通過作用于SR-BI基因上游啟動子區(qū)的PPRE元件而誘導(dǎo)SR-BI的表達。本工作以上實驗結(jié)果也表明PPRE元件對CLA-1的啟動子活性非常重要(附圖14a)，因此利用已知的ppary特異性激動劑羅格列酮(Rosiglitazone，ROS)，檢測曲古抑菌素A、羅格列酮分別及聯(lián)合用藥后對CLA-1啟動子活性的影響，結(jié)果顯示二者聯(lián)合應(yīng)用具有累加效應(yīng)(如附圖14D所示)，也說明曲古抑菌素A和羅格列酮是通過不同的作用機制影響CLA-1的轉(zhuǎn)錄。30參考文獻TallAR.血漿高密度脂蛋白代謝和動脈粥樣硬化的關(guān)系(Plasmahighdensitylipoproteins.Metabolismandrelationshiptoatherogenesis.)《臨床研究雜志》(/.J/^eW.),1990,86(2):379-384。BarterPJandRyeKA.高密度月旨蛋白和冠心病(High-density1ipoproteinsandcoronaryheartdisease.)《心血管風(fēng)險雜志》(/.j/政)1994，1(3):217-221。KwiterovichP0,Jr.高密度脂蛋白膽固醇的抗動脈粥樣硬化作用(Theantiatherogenicroleofhigh-densitylipoproteincholesterol.)《美國心臟病學(xué)雜志》(J肌/.Carrf/o厶)1998，82(9A):13Q—21Q。ShahPK.通過降低低密度脂蛋白膽固醇治療血脂異常與動脈粥樣硬化的非他汀類藥物(Emergingnon-statinLDL-loweringtherapiesfordyslipidemiaandatherosclerosis.)《心血管醫(yī)學(xué)綜述》Wer.Cs/^/omsc.led.)2003,4(3):136-141。MalerodL，SporstolM，JuvetLK,肝細胞清道夫受體SR-BI可被過氧化物酶體增值激活受體Y及肝細胞核因子4a所激活。(HepaticscavengerreceptorclassB，typeIisstimulatedbyperoxisomeproliferators—activatedreceptorgammaandhepatocytenuclearfactor4alpha.)《生物化學(xué)及生物物理學(xué)研究簡訊》(萬ioc力e瓜5io;/^./es.Co邁邁w.)2003，305(3):557—565。LopezDandMcLeanMP.固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-la可結(jié)合在大鼠高密度脂蛋白受體SR-BI基因啟動子順式元件上。(Sterolregulatoryelement-bindingprotein-labindstociselementsinthepromoteroftherathighdensitylipoproteinreceptorSR-BIgene.)《內(nèi)分泌學(xué)》(iW縱/z2o/柳.)1999,140(12):5669-5681。BungertS,MoldayLL，andMoldayRS.ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運子abcr及其相關(guān)abcl和abca的膜拓樸結(jié)構(gòu)鑒定的N連接的糖基化位點(MembranetopologyoftheATPbindingcassettetransporterABCRanditsrelationshiptoABC1andrelatedABCAtransporters:identificationofN-linkedglycosylationsites.)《生物化學(xué)雜志》(/."e邊.)2001，276(26):23539—23546。VaismanBL,LambertG，AmarM，etal.abcal過表達的轉(zhuǎn)基因小鼠導(dǎo)致高a脂蛋白血癥并增加膽汁中膽固醇的排泄。(ABCA1overexpressionleadstohyperalphalipoproteinemiaandincreasedbiliarycholesterolexcretionintransgenicmice.)《臨床研究雜志》(/.)2001,108(2):303-309。ChawlaA,BarakY，NagyL,a/.過氧化物酶體增值激活受體y依賴及非依賴在脂代謝及炎癥過程中對巨噬細胞基因表達的影響(PPAR-gammadependentandindependenteffectsonmacrophage-geneexpressioninlipidmetabolismandinflammation,)《自然-醫(yī)藥學(xué)》led.)2001,7(1):48-52。CostetP,LuoY,WangN,e/1a/.肝X受體/維曱酸X受體在固醇依賴下激活A(yù)BC1啟動子。(Sterol-dependenttransactivationoftheABC1promoterbytheliverXreceptor/retinoidXreceptor.)《生物化學(xué)雜志》(/.腸/.C力e邁.)2000，275(36):28240-28245。VenkateswaranA，LaffitteBA,JosephSB,a/.核氧化甾醇受體LXRa調(diào)控細胞內(nèi)膽固醇的流出(ControlofcellularcholesteroleffluxbythenuclearoxysterolreceptorLXRalpha.)《美國科學(xué)院P完報》(尸，.yVis〃.Jcad.i"c/.)"5".丄2000，97(22):12097-12102。KellyWKandMarksPA.藥物的啟示組蛋白去乙?；敢种苿┮恍虑c的抗腫瘤藥物辛二酰苯胺輕肝酸(Druginsight:Histonedeacetylaseinhibitors--developmentofthenewtargetedanticanceragentsuberoylani1idehydroxamicacid.)《自然-臨床實踐肺瘤學(xué)》"http://./Va".toco/.)2005，2(3):150-157。TsujiN，KobayashiM，NagashimaK，—個新的抗真菌抗生素，曲古才中菌素(Anewantifungalantibiotic,trichostatin.)《抗生素雜志、(東京)》(/./1/3"'W。L)1976，29(1):l-6。YoshidaM，KijimaM,AkitaM，eta人曲古抑菌素A在體內(nèi)、外實驗中均可有效、特異的抑制哺乳動物細胞組蛋白去乙?；?Potentandspecificinhibitionofmammalianhistonedeacetylasebothinvivoandinvitrobytrichosta"nA.)《生物化學(xué)雜志》(/.Wo/.C力弧)1990,265(28):17174-17179。YangY,ZhangZ,JiangW，a/.利用細胞為基礎(chǔ)的高通量篩選模型鑒定新的人高密度月旨蛋白受體上調(diào)劑(Identificationofnovelhumanhigh—densitylipoproteinreceptorUp-regulatorsusingacell-basedhigh—throughputscreeningassay.)《分子生物學(xué)篩選雜志》(/.5/o邁o/.Scree".)2007，12(2):211-219。GaoJ,XuY.N，YangY，a/.通過高通量篩選模型篩選合成的及天然產(chǎn)物化合物庫鑒定人ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運子Al的上調(diào)劑(Identificationofup-regulatorsofhumanATP-bindingcassettetransporterAlviahighthroughputscreeningofsyntheticandnaturalcompoundlibrary.)《分子生物學(xué)篩選雜志》(/.J/o卵7.iVr，.)2008,13(7):648-656。SambrookJandRussellDW(2001)分子克隆實驗指南(第三版)6V0/7/w^Za60r"or/鵬i7i/a/,3rdEd.)，ColdSpringHarborLaboratory,3權(quán)利要求1.組蛋白去乙?；敢种苿┰谥苽溆糜谕ㄟ^增強膽固醇逆轉(zhuǎn)運治療和/或預(yù)防動脈粥樣硬化的藥物的用途。2.權(quán)利要求l的用途，其中所述組蛋白去乙?；敢种苿槭?所示的曲古抑菌素A或式2所示的辛二酰苯胺異幾肟酸3.權(quán)利要求1所述的用途，其中組蛋白去乙?；敢种苿┡cPPARY激動劑聯(lián)合應(yīng)用。4.權(quán)利要求3所述的用途，其中PPARy激動劑是羅格列酮。5.權(quán)利要求l所述的用途，其中所述通過增強膽固醇逆轉(zhuǎn)運治療和/或預(yù)防動脈粥樣硬化的藥物為上調(diào)高密度脂蛋白受體SR-BI/CLA-1表達活性的藥物。6.權(quán)利要求l所述的用途，其中所述通過增強膽固醇逆轉(zhuǎn)運治療和/或預(yù)防動脈粥樣硬化的藥物為上調(diào)ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運子ABCA1表達活性的藥物。7.—種通過增強膽固醇逆轉(zhuǎn)運用于治療和/或預(yù)防動脈粥樣硬化的藥物組合物，其中含有治療有效量的曲古抑菌素A或辛二酰苯胺異羥將酸作為活性成分，以及任選的藥學(xué)可接受的載體。8.—種用于上調(diào)高密度脂蛋白受體SR-BI/CLA-1表達活性實現(xiàn)增強膽固醇逆轉(zhuǎn)運的藥物組合物，其中含有治療有效量的曲古抑菌素A或辛二酰苯胺異羥將酸作為活性成分，以及任選的藥學(xué)可接受的載體。9.一種用于上調(diào)ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運子ABCA1表達活性實現(xiàn)增強膽固醇逆轉(zhuǎn)運的藥物組合物，其中含有治療有效量的曲古抑菌素A或辛二酰苯胺異羥將酸作為活性成分，以及任選的藥學(xué)可接受的載體。全文摘要本發(fā)明涉及組蛋白去乙酰化酶抑制劑化合物在制備用于通過增強膽固醇逆轉(zhuǎn)運機制治療和/或預(yù)防動脈粥樣硬化的藥物的用途，其中所述組蛋白去乙?；敢种苿槭?所示的曲古抑菌素A或式2所示的辛二酰苯胺異羥肟酸。文檔編號A61P9/10GK101683329SQ20081022360公開日2010年3月31日申請日期2008年9月27日優(yōu)先權(quán)日2008年9月27日發(fā)明者司書毅,威姜,媛楊,斌洪,麗王,王麗非,磊高,羿鮑申請人:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所