專利名稱：：含納米羥基磷灰石/膠原微粒的骨修復材料及其制備方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及一種含納米羥基磷灰石/膠原微粒的可注射型骨修復材料及其制備方法。
背景技術：
：殼聚糖是一種天然生物多糖，來源廣泛，無細胞毒性、生物相容性好且沒有抗原性，可吸收，易于加工，在生物醫(yī)學領域已用于人工皮膚、可吸收縫線、止血海棉、防粘連劑及藥物緩釋膠囊等。根據殼聚糖溶液離子之間的相互作用力，2000年，chenite等人(AChenite，CChaput，DWang，etal.Novelinjectableneutralsolutionsofchitosanfrombiodegradablegelsinsitu.Biomaterials，2000，21:2155-2161)開發(fā)出溫敏性殼聚糖水凝膠。具體做法是殼聚糖水溶液中加入多元醇鹽如e—甘油磷酸鈉(GP)，在氫鍵、靜電相互作用和疏水相互作用的協(xié)同下，殼聚糖溶液在室溫條件下保持液態(tài)，而溫度升高到體溫時則轉變?yōu)橄履z(殼聚糖/GP)。這種凝膠復合物由于具有溫度敏感的特性，可以用作藥物及生長因子緩釋載體的研究，并在Long—Evans大鼠皮下成功構建可注射性的組織工程化軟骨。2005年，Hoemann等人(HoemarmCD，SunJ，BuschmannMD，etal.Tissueengineeringofcartilageusing肌injectableandadhesivechitosan-based-celldeliveryvehicle.OsteoarthritisCartilage,2005，13:318-329)改進了殼聚糖/GP體系，以殼聚糖、甘油磷酸鈉、葡糖胺為原料，通過調節(jié)溶液的溫度及pH值也制備出溫敏性殼聚糖水凝膠，并與經乙基纖維素混懸的原代小牛軟骨細胞一起注射到裸鼠背部皮下構建組織工程化軟骨，同時將沒有攜帶細胞的殼聚糖水凝膠直接注射到兔的關節(jié)缺損部位進行缺損修復的實驗，術后1周觀察發(fā)現(xiàn)，該材料的植入對軟骨缺損有一定的修復作用，但未做長時間作用效果的觀察。2006年，第三軍醫(yī)大學的王東武等人(王東武，楊柳，段小軍等.可注射溫固化支架復合異體軟骨細胞修復關節(jié)軟骨缺損的實驗研究.重慶醫(yī)學，2006;35(12):1082-1084)將殼聚糖/甘油磷酸鈉水凝膠與異體軟骨細胞復合后注射到兔關節(jié)軟骨缺損區(qū)進行了修復實驗，取得了較好的軟骨缺損修復效果。但單純的殼聚糖/甘油磷酸鈉水凝膠不具有骨缺損修復效果。本發(fā)明涉及一種用于骨修復的礦化多肽材料。其微結構為附著鈣磷鹽晶體的多肽纖維的三維網絡，其中的纖維由包裹著納米鈣磷鹽晶體的多肽組成。其中多肽的氨基酸序列具有重復的Gly-X-Y結構，其中Gly代表甘氨酸，X、Y分別為甘氨酸之外的任何一種氨基酸，其中納米鈣磷鹽晶體可以為羥基磷灰石、二水合磷酸氫鈣等。本發(fā)明的礦化多肽材料，成份和結構接近天然骨，其鈣磷鹽晶體為納米尺寸，具有良好的生物活性、生物相容性和生物降解性，可促進骨再生，并隨新骨的生成最終降解。解決了以往骨材料存在病毒隱患和免疫反應，在治療骨缺損和骨折等骨修復中可達到自體骨的效果，具有優(yōu)異的骨誘導性能(200610112992.2)。但單純的礦化多肽材料呈微粒狀，不是一種可注射原位成型的骨修復材料，應用不方便。本發(fā)明涉及的礦化多肽材料由北京奧精醫(yī)藥科技有限公司提供，主要成分是納米羥基磷灰石/膠原，商品名稱nHAC。馮慶玲等公布了一種海藻酸鈣基可注射原位固化骨修復材料的制備方法。按質量比取去離子水加入磷酸鈉和海藻酸鈉粉末充分攪拌，得到海藻酸鈉溶液；往所述海藻酸鈉溶液中加入納米羥基磷灰石/膠原(nHAC)微粒，充分攪拌得到粘稠懸濁液；加入硫酸鈣微粒，充分攪拌后，即得到所述海藻酸鈣基可注射原位固化骨修復材料。所得液態(tài)可注射骨修復材料具有優(yōu)異的可注射性，2小時內即可原位固化，能夠顯著促進骨缺損的修復(200610144009.5)。本發(fā)明是一種殼聚糖基的可注射溶膠一凝膠骨修復材料，能夠在37攝氏度生理pH環(huán)境下自發(fā)轉變成凝膠，具有溫度和pH雙重敏感性，而海藻酸基的溶膠凝膠體系對溫度不敏感，如果不加入固化劑硫酸鈣微粒，不能在生理環(huán)境下自發(fā)轉變成凝膠，與之相比，本專利公開的方法能在10min內即形成凝膠，凝膠速度更快，使用起來更方便。
發(fā)明內容本發(fā)明的目的在于提供一種可注射型殼聚糖/GP/納米羥基磷灰石/膠原微粒(nHAC)骨修復材料及其制備方法。以納米羥基磷灰石/膠原微粒復合材料為基礎制備可注射型骨修復材料，既可以保持仿天然骨結構的特征，又賦予了材料新的可注射性能，適用于微創(chuàng)手術，具有更加廣闊的應用范圍。按此方法制備的水凝膠可在體內原位形成，其臨床應用方便。本發(fā)明的技術方案如下本發(fā)明提供一種骨修復材料，含納米羥基磷灰石/膠原微粒1-2重量份、殼聚糖1重量份和0—甘油磷酸鈉2-3重量份。例如可以是含納米羥基磷灰石/膠原微粒2重量份、殼聚糖1重量份和0—甘油磷酸鈉2.5重量份；含納米羥基磷灰石/膠原微粒1重量份、殼聚糖1重量份和P—甘油磷酸鈉3重量份；或含納米羥基磷灰石/膠原微粒1.5重量份、殼聚糖1重量份和6—甘油磷酸鈉2重量份。本發(fā)明還提供上述骨修復材料的制備方法，包括如下步驟1)將殼聚糖(脫乙酰度8099%)溶于鹽酸或醋酸中，攪拌溶解至澄清；2)將GP溶解于蒸餾水中，得到清亮均質的GP溶液；3)用堿性鹽溶液將殼聚糖溶液的pH值調到37之間；4)將GP溶液加入殼聚糖溶液中，使共混溶液的pH值位于6.57.4之間；5)將納米羥基磷灰石/膠原微粒(nHAC)加入上述溶液中，攪拌至充分混合。將共混溶液置于凝膠溫度中或注射入體內，即可原位形成凝膠。其中，所用堿性鹽為碳酸氫鈉，磷酸鈉或氫氧化鉀，堿性鹽用量須保證殼聚糖溶液的pH值調到37之間。本發(fā)明優(yōu)點在于采用殼聚糖，e-甘油磷酸鈉，納米羥基磷灰石/膠原微粒(nHAC)制備的溫度響應型可注射型殼聚糖/GP/納米羥基磷灰石/膠原微粒(nHAC)骨修復材料,通過調控與水分子間相互作用，實現(xiàn)溶膠一凝"交轉變的溫敏化。復合物體內凝膠化特性可調，能適應不同形狀骨缺損的修復。組分的優(yōu)化使其適于注射應用，按此方法制備的支架材料可通過注射在體內原位形成，不僅保留了殼聚糖/納米羥基磷灰石/膠原微粒(nHAC)的生物相容性，生物降解性，且其臨床應用方便。殼聚糖是一種天然生物多糖，來源廣泛，無細胞毒性、生物相容性好且沒有抗原性，可吸收，易于加工。納米羥基磷灰石/膠原微粒(nHAC)以膠原分子為模板，調制鈣磷鹽沉積到有序排列的膠原纖維上，自組裝成具有天然骨分級結構的礦化多肽材料微粒(nHAC),目前這種材料已經由北京奧精醫(yī)藥科技有限公司商業(yè)生產，可由商業(yè)途徑購買得到。在殼聚糖溶液中加入納米羥基磷灰石/膠原微粒(nHAC)形成的溶膠凝膠體系，增強了其對骨組織的仿生程度，使此可注射支架材料更適合于骨重建，同時材料具有可注射性，操作方便。圖1:植入材料后X—ray觀察圖譜(a)術后；(b)植入凝膠A12周。圖2:植入凝膠A材料后的生理切片H&E染色圖(a)8周100倍；(b)12周25倍；(c)12周100倍。具體實施例方式下面通過實例進一步說明本發(fā)明的突出特點，僅在于說明本發(fā)明而決不限制本發(fā)明，亦即，本發(fā)明的突出特點和顯著進步，決不限于下述實例。本專利提到的納米羥基磷灰石/膠原微粒(nHAC)均購買自北京奧精醫(yī)藥科技有限公司，由北京奧精醫(yī)藥科技有限公司商業(yè)生產。實施例1:含納米羥基磷灰石/膠原微粒2重量份、殼聚糖1重量份和e—甘油磷酸鈉2.5重量份。將200mg殼聚糖(脫乙酰度99X)溶于9ml鹽酸(0.1M)中，攪拌溶解至澄清置于4攝氏度的水浴中；將GP500mg溶解于lml蒸餾水中，得到清亮均質的GP溶液(50%，w/v);用lM的碳酸氫鈉溶液將殼聚糖溶液的pH值調到4，將GP溶液小心滴入上述殼聚糖溶液中，調節(jié)pH值為7.15，將400mg納米羥基磷灰石/膠原微粒(nHAC)加入上述溶液中。將共混溶液注入15mmX5mmX5mm模具中，置于37度培養(yǎng)箱中，即可原位形成凝膠A。將200mg殼聚糖(脫乙酰度99X)溶于9ml鹽酸(0.1M)中，攪拌溶解至澄清置于4攝氏度的水浴中；將GP560mg溶解于lml蒸餾水中，得到清亮均質的GP溶液(56%，w/v);用lM的碳酸氫鈉溶液將殼聚糖溶液的pH值調到4，將GP溶液小心滴入上述殼聚糖溶液中，調節(jié)pH值為7.15，將溶液注入15mmX5mmX5mm模具中，置于37度培養(yǎng)箱中，即可原位形成不含納米羥基磷灰石/膠原微粒(nHAC)的凝膠B。將以上A、B兩種凝膠進行效果對比實驗，15mmX5咖X5mm的凝膠A和凝膠B進行實驗。新西蘭兔12只(體重2.5-3kg)隨機分為2組，3%戊巴比妥鈉肌注麻醉0.3mg/kg，常規(guī)脫毛、固定、消毒、鋪單，取右側前肢前外側切口，依次切開皮膚、皮下、深筋膜，沿肌間隙分離并顯露橈骨。于橈骨中上段1/3處用手持牙科打磨機截斷，造成15mm骨于骨膜節(jié)段性缺損，實驗組植入凝膠A，對照組植入凝膠B，逐層縫合不行固定，置于相同條件下飼養(yǎng)。分別于術后4、8、12周處死動物取材。觀察術后動物飲食、活動及傷口愈合情況。取材后觀察缺損部位的變化，脫鈣后縱向剖開觀察內部結構改變。術后4、8、12周在麻醉下拍攝前肢正位片，條件為55kv、50mA、0.2sec，觀察各組動物骨修復情況。組織切片及蘇木精一伊紅染色(服E)，觀察新骨的形成。觀察的結果發(fā)現(xiàn)所有動物傷口愈合良好，無一例感染或積液。凝膠B植入組12周內骨缺損未修復，縱剖面可見材料形態(tài)較為完整，與骨折端分界清晰，組織切片可見大量纖維結締組織充填孔隙；而凝膠A植入4周雙側骨皮質達到連接，縱剖面見材料形態(tài)保持，12周后材料內部有較多的新骨形成，材料輪廓逐漸崩散，組織切片示植入4周后材料邊緣既有初步的骨連接,材料內部新生骨小梁隨著時間的推移而增加。圖1是植入凝膠A后12周愈合的x-ray結果。圖2是8周和12周的生理切片結果，(a)圖中我們看見新生的骨小梁進入材料中間，而多孔材料中細胞聚集，在骨小梁的表面有連續(xù)的成骨細胞，(b)圖是12周大體觀察可知骨組織已經基本代替了材料，髓腔已通，有更多的新生骨小梁對材料進行分割和取代。本實驗表明在殼聚糖溶液中加入納米羥基磷灰石/膠原微粒(nHAC)形成的溶膠凝膠體系，增強了其對骨組織的仿生程度，使此可注射支架材料更適合于骨重建，其骨缺損愈合效果得到了有力的證實。同時材料具有可注射性，操作方便。實施例2:含納米羥基磷灰石/膠原微粒1重量份、殼聚糖1重量份和0—甘油磷酸鈉3重量份。將200mg殼聚糖(脫乙酰度80%)溶于9ml鹽酸(0.1M)中，攪拌溶解至澄清置于4攝氏度的水浴中；將GP600mg溶解于lml蒸餾水中，得到清亮均質的GP溶液(56。％，w/v);用1M的K0H溶液將殼聚糖溶液的pH值調到5，將GP溶液小心滴入上述殼聚糖溶液中，調節(jié)pH值為7.2，將200mg納米羥基磷灰石/膠原微粒(nHAC)加入上述溶液中。將將溶液注入15腿X5ramX5mm模具中，置于37度培養(yǎng)箱中，5分鐘即可原位形成凝膠C。按照專利200610144009.5公布的一種海藻酸鈣基可注射原位固化骨修復材料的制備方法。按質量比取去離子水100g加入3g磷酸鈉和2g海藻酸鈉粉末充分攪拌，得到海藻酸鈉溶液；往所述海藻酸鈉溶液中加入2g納米羥基磷灰石/膠原(nHAC)微粒，充分攪拌得到粘稠懸濁液；加入4.4g硫酸鈣微粒，充分攪拌后，將溶液注入15腿X5mmX5咖模具中，置于37度培養(yǎng)箱中，0.5小時才可原位形成凝膠D。與之相比，本專利公開的方法能在10min內即形成凝膠，凝膠速度更快，使用起來更方便，也更安全。將以上C、D兩種凝膠進行效果對比實驗，15mmX5mmX5mm的凝膠C和凝膠D進行實驗。新西蘭兔12只(體重2.5-3kg)隨機分為2組，3%戊巴比妥鈉肌注麻醉0.3mg/kg，常規(guī)脫毛、固定、消毒、鋪單，取右側前肢前外側切口，依次切開皮膚、皮下、深筋膜，沿肌間隙分離并顯露橈骨。于撓骨中上段1/3處用手持牙科打磨機截斷，造成15mm骨于骨膜節(jié)段性缺損，實驗組植入凝膠A，對照組植入凝膠B，逐層縫合不行固定，置于相同條件下飼養(yǎng)。分別于術后4、8、12周處死動物取材。觀察術后動物飲食、活動及傷口愈合情況。取材后觀察缺損部位的變化，脫鈣后縱向剖開觀察內部結構改變。術后4、8、12周在麻醉下拍攝前肢正位片，條件為55kv、50mA、0.2sec，觀察各組動物骨修復情況。組織切片及蘇木精一伊紅染色(H&E)，觀察新骨的形成。觀察結果發(fā)現(xiàn)兩種凝膠均能達到骨缺損愈合效果，但凝膠C的骨修復速度大于凝膠D組，可能原因在于殼聚糖在體內的降解速度大于海藻酸，為骨組織的長入提供了生長的空間，從而加速了骨愈合。動物實驗結果表明本專利更有優(yōu)越性。實施例3:含納米羥基磷灰石/膠原微粒1.5重量份、殼聚糖1重量份和0—甘油磷酸鈉2重量份。將200mg殼聚糖(脫乙酰度90%)溶于9ml鹽酸(0.1M)中，攪拌溶解至澄清置于4攝氏度的水浴中；將GP400mg溶解于lml蒸餾水中，得到清亮均質的GP溶液(50%，w/v);用1M的磷酸鈉溶液將殼聚糖溶液的pH值調到5，將GP溶液小心滴入上述殼聚糖溶液中，調節(jié)pH值為7.4，將300mg納米羥基磷灰石/膠原微粒(nHAC)加入上述溶液中。將共混溶液置于37度環(huán)境中，5rnin即可原位形成凝膠。實施例4:含納米羥基磷灰石/膠原微粒i重量份、殼聚糖2重量份和e—甘油磷酸鈉2.5重量份。將400mg殼聚糖(脫乙酰度60X)溶于9ml鹽酸(0.1M)中，攪拌溶解至澄清置于4攝氏度的水浴中；將GP500mg溶解于lml蒸餾水中，得到清亮均質的GP溶液(45%，w/v);用1M的磷酸鈉溶液將殼聚糖溶液的pH值調到5，將GP溶液小心滴入上述殼聚糖溶液中，調節(jié)pH值為7.4，將200mg納米羥基磷灰石/膠原微粒(nHAC)加入上述溶液中。將共混溶液置于37度環(huán)境中，不能原位形成凝膠。權利要求1.一種骨修復材料，含納米羥基磷灰石/膠原微粒1-2重量份、殼聚糖1重量份和β-甘油磷酸鈉2-3重量份。2.根據權利要求1所述的骨修復材料，其特征在于，所述骨修復材料含納米羥基磷灰石/膠原微粒2重量份、殼聚糖1重量份和e—甘油磷酸鈉2.5重量份。3.根據權利要求1所述的骨修復材料，其特征在于，所述骨修復材料含納米羥基磷灰石/膠原微粒1重量份、殼聚糖1重量份和0—甘油磷酸鈉3重量份。4.根據權利要求1所述的骨修復材料，其特征在于，所述骨修復材料含納米羥基磷灰石/膠原微粒1.5重量份、殼聚糖1重量份和^—甘油磷酸鈉2重量份。5.制備權利要求1-4任意一項所述骨修復材料的方法，包括如下步驟1)將脫乙酰度8099%的所述量殼聚糖溶于酸中，攪拌溶解至澄清；2)將所述量3—甘油磷酸鈉溶解于蒸餾水中，得到清亮均質的e_甘油磷酸鈉溶液；3)用堿性鹽溶液將步驟l)制備的溶液的pH值調至37;4)將步驟2)制備的e—甘油磷酸鈉溶液加入步驟3)制備的溶液中，調節(jié)pH值至6.57.4;5)將所述量納米羥基磷灰石/膠原微粒加入步驟4)制備的溶液中，充分混合。6.根據權利要求3所述方法，其特征在于，步驟l)中所述酸為鹽酸或醋酸。7.根據權利要求3所述方法，其特征在于，步驟3)中所述堿性鹽為碳酸氫鈉，磷酸鈉或氫氧化鉀。全文摘要本發(fā)明涉及一種含納米羥基磷灰石/膠原微粒的骨修復材料及其制備方法。本發(fā)明提供一種骨修復材料，含納米羥基磷灰石/膠原微粒1-2重量份、殼聚糖1重量份和β-甘油磷酸鈉2-3重量份。(此處補充給組分的重量配比)本發(fā)明還提供上述骨修復材料的制備方法。將上述骨修復材料置于37℃或注射入體內，即可原位形成凝膠。本發(fā)明提供的骨修復材料既可以保持仿天然骨結構的特征，又賦予了材料新的可注射性能，而且具有溫度敏感性，適用于微創(chuàng)手術，臨床應用方便。文檔編號A61L27/46GK101297980SQ20081011602公開日2008年11月5日申請日期2008年7月1日優(yōu)先權日2008年7月1日發(fā)明者馮慶玲,崔福齋,堃胡,智黃申請人:北京奧精醫(yī)藥科技有限公司