專利名稱：：山蠟梅有效部位群的制備方法及其制劑的制法與用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種中藥有效部位藥物，特別涉及山蠟梅有效部位群的制備方法，及有效部位群中可檢測有效成分含量均達(dá)到50%以上；另涉及該有效部位群制備的藥物可在防治呼吸系統(tǒng)疾病、抗感冒、抗菌、消炎、抗病毒和抗真菌等藥物中應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：感冒是全球發(fā)病率最普遍的疾病，分為流行性感冒和普通感冒兩種，流感很容易引起病毒變異，并可能導(dǎo)致病毒性肺炎、病毒性心肌炎等疾病；感冒引起的癥狀主要是發(fā)熱、發(fā)冷、流涕、咳嗽。據(jù)統(tǒng)計(jì)，目前在中國常見病癥的自我診療比例中最高的是感冒，占常見病癥的89.6%。75%的人一年之中都得患一次感冒，也就是說，一年之中，約有十億人次感冒。我國傳統(tǒng)中藥在治療感冒方面有獨(dú)特的療效，并且隨著醫(yī)源性、藥源性疾病日益增加，化學(xué)藥品的毒副作用問題亦越來越受到重視，人們開始把眼光轉(zhuǎn)向更為自然的傳統(tǒng)醫(yī)藥領(lǐng)域，回歸自然成為世界性潮流。中藥感冒藥市場空間不段擴(kuò)大，但目前臨床使用的中藥感冒藥均存在制備工藝落后，服用劑量大，質(zhì)量難以控制的問題，缺乏市場競爭力。因此開發(fā)具有先進(jìn)制備工藝、質(zhì)量可控、有效成分明確、服用量小、安全有效的新藥成為中藥感冒藥的發(fā)展趨勢。山蠟梅為蠟梅科Calycanthaceae植物山蠟梅Chimo腦thusnitensOliv的葉，《中國藥典》(1977年版)有記載，主產(chǎn)于安徽、江西等地。山蠟梅性涼、味辛微苦，具有解表祛風(fēng)、清熱解毒之功效，對(duì)于防治感冒、流行性感冒有良好的療效。目前，山蠟梅化學(xué)成分研究以揮發(fā)油為主，對(duì)非揮發(fā)性成分研究較少。其揮發(fā)性組分主要是烯烴類、醇類物質(zhì)，含有l(wèi)，8桉葉素(1，8-cinceo1)、芳樟醇(linalool)，a-雜烯(a-pinene)，樟腦(camphor)，莰烯(c卿hene)，龍腦(borneol)等。開花期揮發(fā)油含量為l.62%-2.90%,營養(yǎng)期l.82%-2.46%，其中54-58%為桉葉素。截至目前共報(bào)道的山蠟梅非揮發(fā)性成分有黃酮、總酚、甾體、生物堿、香豆素等成分；其中總黃酮含量為0.87%-1.27%，主要是槲皮素(quercetin)和山柰酚(kae即ferol)及其與葡萄糖、鼠李糖形成的甙；生物堿含量為O.1%,主要是蠟梅堿(Calycanthine)和異山蠟梅堿?！督魇∷幤窐?biāo)準(zhǔn)》982年記載了山蠟梅制劑"山蠟梅片"和"山蠟梅沖劑"，作為防治感冒和流行性感冒在臨床上應(yīng)用。徐文躍等報(bào)道了以蠟梅葉為主的蠟梅止咳露，對(duì)外感風(fēng)熱型咳嗽、久咳及慢性支氣管炎76例療效觀察表明總有效率為90.8%，明顯優(yōu)于用川貝枇杷露治療的對(duì)照組(44.6%，P〈001)。李萍等人通過體內(nèi)抗菌試驗(yàn)，和體外抗菌試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)山蠟梅葉對(duì)金黃色葡萄球菌和多種細(xì)菌均有抑制作用，同時(shí)還證明有抗炎解熱，免疫增強(qiáng)的作用。何明等研究了通過體內(nèi)外抑菌實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)蠟梅感冒茶能抑制金葡菌的感染，減少小鼠致死率；顯著地對(duì)抗醋酸所致小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性增高和蛋清所致大鼠腳腫；同時(shí)還能對(duì)抗干酵母所致的大鼠發(fā)熱。刁軍成研究表明山蠟梅水浸液或揮發(fā)油均有直接抑制或殺滅流感A3或副流感1病毒的作用。以上研究表明山蠟梅揮發(fā)油及提取浸膏具有抑菌、抗炎、解熱、鎮(zhèn)咳、抗流感病毒和免疫增強(qiáng)等作用，但具體哪些成分或哪些部位起上述藥理作用尚不是很清楚，因此有必要深入研究山蠟梅有效成分和有效部位，從而指導(dǎo)開發(fā)療效更為顯著的新制劑。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供山蠟梅有效部位群的制備方法及其制劑的制法與用途。山蠟梅有效部位群的制備方法，該方法依次包括下列步驟步驟(1)山蠟梅葉分揀、干燥，加水浸泡30min-lh，水蒸氣蒸餾提取揮發(fā)油，收集揮發(fā)油，用無水硫酸鈉干燥，作為揮發(fā)油有效部位；步驟(2)蒸餾后的水溶液另器保存；藥渣加溶劑提取，過濾，收集提取液，與蒸餾后的水溶液合并，減壓濃縮，濃縮液上大孔樹脂層析柱吸附，用2-6倍柱體積水洗脫，水洗液棄掉，繼續(xù)用2-6倍柱體積的10%-30%的乙醇洗脫，洗液棄掉，繼續(xù)用2-6倍柱體積的30%-90%的乙醇洗脫，洗脫液收集，減壓濃縮，冷卻后用醇溶解，靜置，過濾，得濾液，減壓回收乙醇，干燥即得非揮發(fā)性有效部位；步驟(3)將揮發(fā)油有效部位和非揮發(fā)性有效部位按山蠟梅藥材實(shí)際生藥提取量1.0-2.6:0.5-3.5重量配比入藥，即為山蠟梅有效部位群。山蠟梅中提取有效部位群的方法，步驟(1)中加水量為生藥材的6-30倍，提取時(shí)間為1-6小時(shí)。山蠟梅有效部位群的制備方法，步驟(2)中藥渣加溶劑為水或10%-95%的乙醇，提取次數(shù)為l-4次，每次提取時(shí)間為30min-2h。山蠟梅有效部位群的制備方法，歩驟(2)中減壓濃縮溫度為40'C-75'C。山蠟梅有效部位群的制備方法，步驟(2)中用醇溶解工序是指加入乙醇至含醇量40%_95%進(jìn)行溶解。山蠟梅有效部位群的制備方法，步驟(2)用醇溶解工序中靜置時(shí)間為6-48小時(shí)。本發(fā)明利用現(xiàn)代藥效篩選技術(shù)、提取純化技術(shù)、制劑技術(shù)以及質(zhì)量控制技術(shù)對(duì)山蠟梅制劑進(jìn)行深度開發(fā)，目的得到有效成分明確，藥理作用明顯，性能穩(wěn)定，毒性小，質(zhì)量可控，安全可靠的有效部位群及其制劑。本發(fā)明對(duì)山蠟梅制劑進(jìn)行深度開發(fā)，富含活性成分，并且服用量小，有利于藥品運(yùn)輸、儲(chǔ)存與患者服用。具體實(shí)施例方式實(shí)施例l-l:山蠟梅有效部位群的制備方法，該方法依次包括下列步驟步驟(1)山蠟梅葉分揀、干燥，加水浸泡30分種，水蒸氣蒸餾提取揮發(fā)油，收集揮發(fā)油，用無水硫酸鈉干燥，作為揮發(fā)油有效部位；步驟(2)蒸餾后的水溶液另器保存;藥渣加溶劑提取，過濾，收集提取液，與蒸餾后的水溶液合并，減壓濃縮，濃縮液上大孔樹脂層析柱吸附，用2倍柱體積水洗脫，水洗液棄掉，繼續(xù)用2倍柱體積的10%的乙醇洗脫，洗液棄掉，繼續(xù)用2倍柱體積的30%的乙醇洗脫，洗脫液收集，減壓濃縮，冷卻后用醇溶解，靜置，過濾，得濾液，減壓回收乙醇，干燥即得非揮發(fā)性有效部位；步驟(3)將揮發(fā)油有效部位和非揮發(fā)性有效部位按山蠟梅藥材實(shí)際生藥提取量1.0:3.5重量配比入藥，即為山蠟梅有效部位群。實(shí)施例1-2:山蠟梅有效部位群的制備方法，該方法依次包括下列歩驟步驟(1)山蠟梅葉分揀、干燥，加水浸泡60分種，水蒸氣蒸餾提取揮發(fā)油，收集揮發(fā)油，用無水硫酸鈉干燥，作為揮發(fā)油有效部位；步驟(2)蒸餾后的水溶液另器保存；藥渣加溶劑提取，過濾，收集提取液，與蒸餾后的水溶液合并，減壓濃縮，濃縮液上大孔樹脂層析柱吸附，用6倍柱體積水洗脫，水洗液棄掉，繼續(xù)用6倍柱體積的30%的乙醇洗脫，洗液棄掉，繼續(xù)用6倍柱體積的90%的乙醇洗脫，洗脫液收集，減壓濃縮，冷卻后用醇溶解，靜置，過濾，得濾液，減壓回收乙醇，干燥即得非揮發(fā)性有效部位；歩驟(3)將揮發(fā)油有效部位和非揮發(fā)性有效部位按山蠟梅藥材實(shí)際生藥提取量2.6:0.5重量配比入藥，即為山蠟梅有效部位群。實(shí)施例1-3:山蠟梅有效部位群的制備方法，該方法依次包括下列步驟步驟(1)山蠟梅葉分揀、干燥，加水浸泡45分種，水蒸氣蒸餾提取揮發(fā)油，收集揮發(fā)油，用無水硫酸鈉干燥，作為揮發(fā)油有效部位；步驟(2)蒸餾后的水溶液另器保存;藥渣加溶劑提取，過濾，收集提取液，與蒸餾后的水溶液合并，減壓濃縮，濃縮液上大孔樹脂層析柱吸附，用3倍柱體積水洗脫，水洗液棄掉，繼續(xù)用3倍柱體積的60%的乙醇洗脫，洗液棄掉，繼續(xù)用3倍柱體積的60%的乙醇洗脫，洗脫液收集，減壓濃縮，冷卻后用醇溶解，靜置，過濾，得濾液，減壓回收乙醇，干燥即得非揮發(fā)性有效部位；步驟(3)將揮發(fā)油有效部位和非揮發(fā)性有效部位按山蠟梅藥材實(shí)際生藥提取量1.6:1.5重量配比入藥，即為山蠟梅有效部位群。實(shí)施例2-1:山蠟梅有效部位群的制備方法，.步驟(1)中加水量為生藥材的6倍，提取時(shí)間為l小時(shí)。步驟(2)中藥渣加溶劑為水或10%的乙醇，提取次數(shù)為1次，提取時(shí)間為30分鐘。步驟(2)中減壓濃縮溫度為4(TC。步驟(2)中用醇溶解工序是指加入乙醇至含醇量40%進(jìn)行溶解。步驟(2)用醇溶解工序中靜置時(shí)間為6小時(shí)。步驟(2)用醇溶解工序中靜置溫度為O'C。其余同實(shí)施例1-1。實(shí)施例2-2:山蠟梅有效部位群的制備方法，步驟(1)中加水量為生藥材的30倍，提取時(shí)間為6小時(shí)。步驟(2)中藥渣加溶劑為水或95%的乙醇，提取次數(shù)為4次，提取時(shí)間為120分鐘。步驟(2)中減壓濃縮溫度為75°C。步驟(2)中用醇溶解工序是指加入乙醇至含醇量95%進(jìn)行溶解。步驟(2)用醇溶解工序中靜置時(shí)間為48小時(shí)。步驟(2)用醇溶解工序中靜置溫度為25'C。其余同實(shí)施例l-2。實(shí)施例2-3:山蠟梅有效部位群的制備方法，步驟(1)中加水量為生藥材的15倍，提取時(shí)間為3小時(shí)。步驟(2)中藥渣加溶劑為水或70%的乙醇，提取次數(shù)為2次，提取時(shí)間為100分鐘。步驟(2)中減壓濃縮溫度為65'C。步驟(2)中用醇溶解工序是指加入乙醇至含醇量80%進(jìn)行溶解。步驟(2)用醇溶解工序中靜置時(shí)間為24小時(shí)。步驟(2)用醇溶解工序中靜置溫度為15'C。其余同實(shí)施例1-3。實(shí)施例3-1:山蠟梅有效部位群的制備方法，步驟(2)所使用的干燥方法為噴霧干燥。其余同實(shí)施例1-1。實(shí)施例3-2:山蠟梅有效部位群的制備方法，步驟(2)所使用的干燥方法為減壓干燥。其余同實(shí)施例1-2。實(shí)施例3-3:山蠟梅有效部位群的制備方法，步驟(2)所使用的干燥方法為常壓干燥。其余同實(shí)施例l-3。試驗(yàn)例1經(jīng)氣相色譜法測定，本發(fā)明山蠟梅揮發(fā)油有效部位(試驗(yàn)例7-14制備)主要含有l(wèi)，8桉葉素(l,8-cinceol)、芳樟醇(linalool)，樟腦(camphor)和龍腦(borneol)等，其中1，8桉葉素(1,8-cinceol)、芳樟醇(linalool)含量總和為50%-88%。試驗(yàn)例2經(jīng)特征顯色反應(yīng)及薄層層析檢查，本發(fā)明山蠟梅非揮發(fā)性有效部位(試驗(yàn)例7-14制備)主要含有黃酮、酚類和甾體類成分。建立紫外-分光光度法測定本發(fā)明山蠟梅非揮發(fā)性有效部位(試驗(yàn)例7-14制備)中總黃酮、總酚和甾體類成分含量用硝酸鋁-亞硝酸鈉-氫氧化鈉顯色法，在500nm下測定紫外吸收值，用蘆丁作對(duì)照品，樣品不加顯色劑為空白。(測總黃酮)用十二烷基硫酸鈉-鐵氰化鉀-三氯化鐵顯色法，在764nm下測定紫外吸收值，用綠原酸或沒食子酸作對(duì)照品，樣品不加顯色劑為空白。(測總酚)用香草醛-冰乙酸-高氯酸顯色法，在445mn下測定紫外吸收值，用fi-谷甾醇作對(duì)照品，樣品不加顯色劑為空白。(測甾體類成分)結(jié)果總黃酮、總酚和甾體類成分含量總和為50%-90%。試驗(yàn)例3本發(fā)明山蠟梅有效部位群抗炎作用研究(對(duì)蛋清致大鼠足跖腫脹的影響)1.實(shí)驗(yàn)分組和實(shí)驗(yàn)步驟取大鼠64只，雌雄各半，180-220g，隨機(jī)分為8組，每組8只，分別為(1)模型對(duì)照組(2)陽性對(duì)照組(臨床用量1215-2430mg/d，本實(shí)驗(yàn)復(fù)方乙酰水楊酸片用量為364.5mg/kg體重[即乙酰水楊酸198mg/kg體重]，相當(dāng)于臨床用量的12倍)(3)樣品組(臨床用量30g/d,本實(shí)驗(yàn)用量6g/kg體重，相當(dāng)于臨床用量的12倍)ltt非揮發(fā)性有效部位組(試驗(yàn)例11制備)2ft揮發(fā)油組(試驗(yàn)例ll制備)3#揮發(fā)油+非揮發(fā)有效部位組(試驗(yàn)例ll制備)4#揮發(fā)油+非揮發(fā)有效部位組(試驗(yàn)例7制備)5ft揮發(fā)油+非揮發(fā)有效部位組(試驗(yàn)例8制備)6#揮發(fā)油+非揮發(fā)有效部位組(試驗(yàn)例9制備)用記號(hào)筆在大鼠右后肢踝關(guān)節(jié)周圍做一標(biāo)記，采用特定裝置測定每只大鼠右后肢正常足跖容積。測量正常足跖容積后，模型對(duì)照組大鼠灌予生理鹽水，其余給藥組大鼠按lml/100g體重灌胃給予相應(yīng)的藥物，l次/d,連續(xù)5d，第5d給藥后30min，2%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，分別在大鼠右后肢足跖皮下注射蛋清O.1mL/只致炎。隨后，每隔lh均按上法，各測一次足跖容積，連續(xù)6次，記錄結(jié)果，并分別按下式計(jì)算腫脹率(％)和抑制率(％)。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage10</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage10</formula>2.結(jié)果(見表l)表l山蠟梅有效部位對(duì)蛋清致大鼠足跖腫脹的影響(mean土sd，N=8)<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>與模型對(duì)照組比較，*尸<0.053.結(jié)論從表1中得知，水楊酸組在4h和6h、山蠟梅1#在4h、山蠟梅2#在lh、和山蠟梅3tt在3h、山蠟梅4tt在4h、山蠟梅5tt在4h和5h、山蠟梅6W在2h對(duì)大鼠足跖腫脹率與模型對(duì)照組相比差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明山蠟梅有效部位群具有顯著抗炎作用。試驗(yàn)例4本發(fā)明山蠟梅有效部位群體外抗真菌試驗(yàn)1.方法(平皿法)(1)藥液稀釋取滅菌試管10支,依次編號(hào)，排列于試管架，按無菌操作第l管中加入供試液10ml，第2-10管中加無菌蒸餾水各5ml，從第一管中取5ml供試品至第二管，再從第二管取5ml至第三管……，按兩倍稀釋法依次稀釋，另做無菌蒸餾水作對(duì)照。(2)真菌的接種和培養(yǎng)取10個(gè)無菌平皿做好編號(hào)分別加入上述I-IO號(hào)試管內(nèi)已稀釋的藥物各lml至平皿，加入O.5ml試驗(yàn)菌，傾注10ml改良馬丁瓊脂(冷卻至40。C一45'C)，混勻，凝固，倒置，于培養(yǎng)箱25'C-28。C培養(yǎng)3—5d.同時(shí)制備陽性對(duì)照，供該藥對(duì)白色念珠菌的MIC。(3)測定37°C培養(yǎng)3—5d后觀察結(jié)果，《3個(gè)菌落的平板或無菌生長的平板最低藥物濃度即為受試藥對(duì)該菌株的最低抑菌的MIC。2.結(jié)果結(jié)果顯示山蠟梅有效部位對(duì)所試驗(yàn)的白色念球菌有不同程度的抑菌作用MIC，見表2。_表2山蠟梅有效部位抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>3#揮發(fā)油+非揮發(fā)有效部位組(試驗(yàn)例ll制備)0.0073g生藥/ml根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)評(píng)價(jià)其抑真菌活性強(qiáng)弱順序分別是5#〉4#〉3#〉6#〉1#〉2tt山蠟梅揮發(fā)油。本實(shí)驗(yàn)中山蠟梅提取物平均最低抑菌濃度MIC值范圍在0.0033-0.01g生藥/ml之間。根據(jù)相關(guān)報(bào)告，楮葉提取物總平均最低抑菌濃度MIC(g/mL)值范圍在0.0268-0.0667(g/mL)之間，而其治療淺部真菌病的療效與達(dá)克寧相當(dāng)，并且楮葉不同溶劑提取物體外抗淺部真菌試驗(yàn)顯示具有明顯的抗真菌作用，其提取物的最低抑菌濃度低于目前公認(rèn)的抗真菌中藥的最低抑菌濃度[2];根據(jù)我國科學(xué)家經(jīng)過幾十年的探索，抗真菌作用較強(qiáng)的中藥有丁香、肉桂、牡丹皮、土槿皮等，這些中草藥的乙醇提取物的MFC約為lg/ml，中草藥有效成分丁香酚、肉桂醛的MFC為0.250g/ml[3];屠鵬飛[4]測定龍血竭對(duì)多種真菌的MIC在0.0188-0.75g/ml，其作用耙位是真菌的細(xì)胞壁；何進(jìn)[5]測定了大蒜油的抗真菌活性(MIC為O.00625-0.05g/ml)。山蠟梅有效部位提取物抑菌濃度MIC值基本低于以上所提中藥提取物的MIC值，故可以說山蠟梅有效部位最低抑菌濃度低于目前公認(rèn)的抗真菌中藥的最低抑菌濃度，有開發(fā)價(jià)值。試驗(yàn)例5本發(fā)明山蠟梅有效部位群體外抑菌實(shí)驗(yàn)1.方法采用平皿法，對(duì)常見的5種菌株進(jìn)行最小抑菌濃度試驗(yàn)1.1藥液的配制及稀釋1#非揮發(fā)性有效部位組(試驗(yàn)例ll制備)2tt揮發(fā)油組(試驗(yàn)例ll制備)3#揮發(fā)油+非揮發(fā)有效部位組(試驗(yàn)例11制備)4tt揮發(fā)油+非揮發(fā)有效部位組(試驗(yàn)例7制備)5tt揮發(fā)油+非揮發(fā)有效部位組(試驗(yàn)例8制備)6tt揮發(fā)油+非揮發(fā)有效部位組(試驗(yàn)例9制備)4tt揮發(fā)油+非揮發(fā)有效部位組(試驗(yàn)例7制備)5tt揮發(fā)油+非揮發(fā)有效部位組(試驗(yàn)例8制備)6ft揮發(fā)油+非揮發(fā)有效部位組(試驗(yàn)例9制備)0.0033g生藥/ml0.0042g生藥/ml0.0085g生藥/ml0.00013g生藥/ml0.00015g生藥/ml0.0001313g生藥/ml7tt(酮康唑)8共(皮康王)(酮康唑含量)3.結(jié)論:首先山蠟酶各提取液用無菌蒸餾水按等倍稀釋的原則，依次配制10個(gè)濃度。1.2山蠟酶提取液對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌的抑制作用實(shí)驗(yàn)分為無菌蒸餾水組、陽性對(duì)照組、山蠟酶各濃度組。取10個(gè)無菌平皿做好編號(hào)后，分別加入上述不同濃度的藥液各lml至平皿中，加入已稀釋好的金黃色葡萄球菌或大腸埃希氏菌菌液，傾注10ml冷卻至4(TC左右的營養(yǎng)瓊脂，混勻，平皿倒置，于5^C(U咅養(yǎng)箱中，37'C培養(yǎng)18-24h。得出該藥對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的MIC(培養(yǎng)18-24h后觀察，《3個(gè)菌落的平板或無菌生長的平板的最低藥物濃度即為受試藥對(duì)該菌株的MIC)。1.3山蠟酶提取液對(duì)肺炎雙球菌、乙型溶血性鏈球菌的抑制作用實(shí)驗(yàn)分為無菌蒸餾水組、陽性對(duì)照組、山蠟梅各濃度組。取稀釋好的肺炎雙球菌或乙型溶血性鏈球菌或流感桿菌菌液lml分別加入盛有不同濃度藥液的已編號(hào)的1-IO號(hào)試管中，混勻，用燒紅并冷卻的接種環(huán)分別取l-10號(hào)試管中受試藥與試驗(yàn)菌的混合液一環(huán)，劃線接種于血平板和巧克力平板上，平板倒置，于5%0)2培養(yǎng)箱中，37'C培養(yǎng)18-24h。同時(shí)設(shè)置陽性對(duì)照組，得出該藥對(duì)溶血性鏈球菌、肺炎雙球菌的MIC(培養(yǎng)18-24h后觀察，《3個(gè)菌落的平板或無菌生長的平板的最低藥物濃度即為受試藥對(duì)該菌株的MIC)。1.4山蠟酶提取液對(duì)流感嗜血桿菌的的抑制作用實(shí)驗(yàn)分為無菌蒸餾水組、陽性對(duì)照組、山蠟梅各濃度組。取脫纖維羊血100ml平均分裝于裝有無菌玻璃珠的三角錐型瓶中，每瓶20ml，搖動(dòng)三角瓶10min左右，使形成的纖維蛋白塊會(huì)沉淀在玻璃珠上，以無菌操作每瓶加入180ml冷至45。C一5(TC的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，立即搖蕩以便血液和培養(yǎng)基充分混勻(45T:—5(rC加入血液是為了保存其中某些不耐熱的營養(yǎng)物質(zhì)和保存血細(xì)胞的完整，以便于觀察細(xì)菌的溶血作用，同時(shí)這個(gè)溫度下瓊脂不會(huì)凝固)45。C一5(TC水浴保溫，另取三瓶制好的血液瓊脂置于水浴80'C15分鐘使成巧克力色，為巧克力培養(yǎng)基。取10個(gè)無菌平皿做好編號(hào)分別加入上述1-10號(hào)試管內(nèi)已稀釋的藥物各lml至平皿，加入lml試驗(yàn)菌，傾注10ml以上做好的血瓊脂，搖勻，倒置，于二氧化碳培養(yǎng)箱36"土rC培養(yǎng)18h—24h.同時(shí)制備陽性對(duì)照，供該藥對(duì)溶血性鏈球菌、肺炎雙球菌的、流感嗜血桿菌的MIC。2.結(jié)果(見表3)表3山蠟梅有效部位對(duì)五種菌株的抑制作用<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>3.結(jié)論山蠟梅有效部位群具有良好的體外抑菌作用，其中綜合抑菌效果強(qiáng)弱順序?yàn)?#〉4#>3#〉2#〉6#〉1#。試驗(yàn)例6本發(fā)明山蠟梅有效部位群體內(nèi)抗病毒藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)1.受試藥物及實(shí)驗(yàn)用病毒(1)山蠟梅樣品組(1#-6#);(2)陽性對(duì)照藥利巴韋林片；(3)甲型流感病毒A/PR8/34(H1H1)。2.實(shí)驗(yàn)方法(1)甲型流感病毒經(jīng)雞胚增毒，經(jīng)血凝試驗(yàn)結(jié)果血凝滴度為640以上，可以用于體內(nèi)感染動(dòng)物。(2)經(jīng)測定病毒感染小鼠半數(shù)死亡(LD50)滴定，結(jié)果LD50為10-1.71。(3)山臘梅有效部位對(duì)甲型流感病毒A/PR8/34感染小鼠的保護(hù)作用取ICR小鼠144只，體重18-22g，雌雄各半，按以下辦法隨機(jī)分9組，每組16只。以上各組動(dòng)物均采用灌胃給藥，每日一次，連續(xù)給藥5天。于開始給藥次日，除正常對(duì)照組外的各組小鼠在淺麻醉下，以血凝滴度640以上的尿囊液給小鼠滴鼻感染病毒，每鼠50ul，觀察動(dòng)物感染發(fā)病情況及死亡數(shù)目，記錄14d內(nèi)死亡樹目，并比較存活天數(shù)，結(jié)果見表4。表4山蠟梅有效部位群體內(nèi)抗病毒實(shí)驗(yàn)結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>2.結(jié)論山蠟梅有效部位群可明顯延長甲型流感病毒小鼠存活天數(shù)。與病毒模型組比較有顯著性差異，療效與利巴韋林相當(dāng)，抗病毒強(qiáng)弱順序?yàn)?#〉4#〉3#〉1#〉6#〉2#。試驗(yàn)例7(1)山蠟梅葉分揀、干燥，稱取1000g，加30倍水浸泡30min，水蒸氣蒸餾提取揮發(fā)油1小時(shí)，收集揮發(fā)油，用無水硫酸鈉干燥，得揮發(fā)油有效部位10.lg，其中l(wèi)，8-桉葉素、芳樟醇兩者在有效部位中含量質(zhì)量分?jǐn)?shù)和為88.0%;(2)蒸餾后的水溶液另器保存；藥渣加水煎煮2次，提取時(shí)間為30min，過濾，濾液與蒸餾后的水溶液合并，4(TC-75'C減壓濃縮，濃縮液上大孔樹脂層析柱吸附，用3倍柱體積水洗脫，水洗液棄掉，繼續(xù)用2倍柱體積的10%乙醇洗脫，洗液棄掉，繼續(xù)用5倍柱體積的30%乙醇洗脫，洗脫液收集，40'C-75'C減壓濃縮，冷卻后加入乙醇至含醇量40%，進(jìn)行溶解，IO'C-2(TC靜置24小時(shí)，過濾，得濾液，4(TC-75。C減壓回收乙醇，噴霧干燥即得非揮發(fā)性有效部位19.5g，其中總黃酮含量質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10.7%，酚類、甾體類成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)總和為80.2%，三者含量總和為90.9%。(3)將揮發(fā)油有效部位10.lg和非揮發(fā)性有效部位19.5g作為原料藥制成顆粒劑。其余按照實(shí)施例1-1提供的方法操作。試驗(yàn)例8(1)山蠟梅葉分揀、干燥，稱取1000g，加30倍水浸泡30min，水蒸氣蒸餾提取揮發(fā)油1小時(shí)，收集揮發(fā)油，用無水硫酸鈉干燥，得揮發(fā)油有效部位10.9g，其中l(wèi)，8-桉葉素、芳樟醇兩者在有效部位中含量質(zhì)量分?jǐn)?shù)和為88.2%;(2)蒸餾后的水溶液另器保存；藥渣加60%乙醇，回流提取2次，每次提取時(shí)間為lh，過濾，合并濾液，與蒸餾后的水溶液合并，4(TC-75'C減壓濃縮，濃縮液上己預(yù)處理好的大孔樹脂層析柱吸附，用4倍柱體積水洗脫，水洗液棄掉，繼續(xù)用4倍柱體積的30%的乙醇洗脫，洗液棄掉，繼續(xù)用5倍柱體積的70%的乙醇洗脫，洗脫液收集，40'C-65'C減壓濃縮，冷卻后加入乙醇至含醇量95%進(jìn)行醇沉，0-10。C靜置24小時(shí)，過濾，得濾液，4CTC-65i:減壓回收乙醇，噴霧干燥即得非揮發(fā)性有效部位5.2g，其中總黃酮含量質(zhì)量分?jǐn)?shù)為76.2%，酚類、甾體類成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)總和為13.3%，三者含量總和為89.5%。(3)將揮發(fā)油有效部位10.9g和非揮發(fā)性有效部位5.2g作為原料藥制成滴丸。其余按照實(shí)施例1-2提供的方法操作。試驗(yàn)例9(1)山蠟梅葉分揀、干燥，稱取1000g，加30倍水浸泡30min，水蒸氣蒸餾提取揮發(fā)油6小時(shí)，收集揮發(fā)油，用無水硫酸鈉干燥，得揮發(fā)油有效部位26.0g，其中l(wèi)，8-桉葉素、芳樟醇兩者在有效部位中含量質(zhì)量分?jǐn)?shù)和為52.8%;(2)蒸餾后的水溶液另器保存；藥渣加水煎煮2次，每次lh，過濾，合并濾液，與蒸餾后的水溶液合并，4(TC-75'C減壓濃縮，濃縮液上已預(yù)處理好的大孔樹脂層析柱吸附，用2倍柱體積水洗脫，水洗液棄掉，繼續(xù)用2倍柱體積的10%的乙醇洗脫，洗液棄掉，繼續(xù)用5倍柱體積的40%的乙醇洗脫，洗脫液收集，4(TC-65。C減壓濃縮，冷卻后加入乙醇至含醇量70%進(jìn)行醇沉，1CTC-25。C靜置24小時(shí)，過濾，得濾液，4(TC-65X:減壓回收乙醇，噴霧干燥即得非揮發(fā)性有效部位35.0g，其中總黃酮含量質(zhì)量分?jǐn)?shù)為21.6%，酚類、留體類成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)總和為30.3%，三者含量總和為51.9%。(3)將揮發(fā)油有效部位26.Og和非揮發(fā)性有效部位35.Og作為原料藥制成膠囊。其余按照實(shí)施例1-3提供的方法操作。試驗(yàn)例10(1)山蠟梅葉分揀、干燥，稱取1000g，加6倍水浸泡30min，水蒸氣蒸餾提取揮發(fā)油2小時(shí)，收集揮發(fā)油，用無水硫酸鈉干燥，得揮發(fā)油有效部位15.8g，其中l(wèi)，8-桉葉素、芳樟醇兩者在有效部位中含量質(zhì)量分?jǐn)?shù)和為82.6%;(2)蒸餾后的水溶液另器保存；藥渣加水煎煮2次，每次lh，過濾，合并濾液，與蒸餾后的水溶液合并，40°C-75'C減壓濃縮，濃縮液上已預(yù)處理好的大孔樹脂層析柱吸附，用3倍柱體積水洗脫，水洗液棄掉，繼續(xù)用2倍柱體積的10%的乙醇洗脫，洗液棄掉，繼續(xù)用5倍柱體積的30%的乙醇洗脫，洗脫液收集，4(TC-65。C減壓濃縮，冷卻后加入乙醇至含醇量50%進(jìn)行醇沉，O-l(TC靜置24小時(shí)，過濾，得濾液，40'C-65i:減壓回收乙醇，噴霧干燥即得非揮發(fā)性有效部位20.lg，其中總黃酮含量質(zhì)量分?jǐn)?shù)為13.8%，酚類、甾體類成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)總和為58.3%，三者含量總和為72.1%。(3)將揮發(fā)油有效部位20.8g和非揮發(fā)性有效部位20.1作為原料藥制成膠囊。其余按照實(shí)施例2-1提供的方法操作。試驗(yàn)例11(1)山蠟梅葉分揀、干燥，稱取1000g，加10倍水浸泡30min，水蒸氣蒸餾提取揮發(fā)油3小時(shí)，收集揮發(fā)油，用無水硫酸鈉干燥，得揮發(fā)油有效部位19.9g，其中l(wèi)，8-桉葉素、芳樟醇兩者在有效部位中含量質(zhì)量分?jǐn)?shù)和為79.8%;(2)蒸餾后的水溶液另器保存；藥渣加10%乙醇，回流提取2次，每次提取時(shí)間為lh，過濾，合并濾液，與蒸餾后的水溶液合并，4(TC-75'C減壓濃縮，濃縮液上已預(yù)處理好的大孔樹脂層析柱吸附，用3倍柱體積水洗脫，水洗液棄掉，繼續(xù)用3倍柱體積的20%的乙醇洗脫，洗液棄掉，繼續(xù)用3倍柱體積的50%的乙醇洗脫，洗脫液收集，4(TC-65。C減壓濃縮，冷卻后加入乙醇至含醇量60%進(jìn)行醇沉，0-10。C靜置12小時(shí)，過濾，得濾液，4(TC-65。C減壓回收乙醇，噴霧干燥即得非揮發(fā)性有效部位18.2g，其中總黃酮含量質(zhì)量分?jǐn)?shù)為42.6%，酚類、甾體類成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)總和為35.7%，三者含量總和為78.3%。(3)將揮發(fā)油有效部位19.9g和非揮發(fā)性有效部位18.2g作為原料藥制成片劑。其余按照實(shí)施例2-2提供的方法操作。試驗(yàn)例12(1)山蠟梅葉分揀、干燥，稱取1000g，加15倍水浸泡30min，水蒸氣蒸餾提取揮發(fā)油4小時(shí)，收集揮發(fā)油，用無水硫酸鈉干燥,得揮發(fā)油有效部位21.2g，其中l(wèi)，8-桉葉素、芳樟醇兩者在有效部位中含量質(zhì)量分?jǐn)?shù)和為76.5%;(2)蒸餾后的水溶液另器保存；藥渣加30%乙醇，回流提取3次，提取時(shí)間為30min，過濾，合并濾液，與蒸餾后的水溶液合并，40°C-75'C減壓濃縮，濃縮液上己預(yù)處理好的大孔樹脂層析柱吸附，用4倍柱體積水洗脫，水洗液棄掉，繼續(xù)用4倍柱體積的30%的乙醇洗脫，洗液棄掉，繼續(xù)用4倍柱體積的60%的乙醇洗脫，洗脫液收集，4(TC-75。C減壓濃縮，冷卻后加入乙醇至含醇量70%進(jìn)行醇沉，0-10'C靜置24小時(shí)，過濾，得濾液，40。C-75。C減壓回收乙醇，噴霧干燥即得非揮發(fā)性有效部位15.3g，其中總黃酮含量質(zhì)量分?jǐn)?shù)為51.6%，酚類、g體類成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)總和為23.7%，三者含量總和為75.3%。(3)將揮發(fā)油有效部位21.2g和非揮發(fā)性有效部位15.3g作為原料藥制成軟膠囊。其余按照實(shí)施例2-3提供的方法操作。試驗(yàn)例13(1)山蠟梅葉分揀、干燥，稱取1000g，加20倍水浸泡30min，水蒸氣蒸餾提取揮發(fā)油4小時(shí)，收集揮發(fā)油，用無水硫酸鈉干燥，得揮發(fā)油有效部位23.8g，其中l(wèi)，8-桉葉素、芳樟醇兩者在有效部位中含量質(zhì)量分?jǐn)?shù)和為79.3%;(2)蒸餾后的水溶液另器保存；藥渣加60%乙醇，回流提取2次，提取時(shí)間為lh，過濾，合并濾液，與蒸餾后的水溶液合并，4(TC-75'C減壓濃縮，濃縮液上已預(yù)處理好的大孔樹脂層析柱吸附，用5倍柱體積水洗脫，水洗液棄掉，繼續(xù)用5倍柱體積的30%的乙醇洗脫，洗液棄掉，繼續(xù)用5倍柱體積的70%的乙醇洗脫，洗脫液收集，40°C-75'C減壓濃縮，冷卻后加入乙醇至含醇量80%進(jìn)行醇沉，0-10'C靜置36小時(shí)，過濾，得濾液，40°C-75'C減壓回收乙醇，噴霧干燥即得非揮發(fā)性有效部位11.2g，其中總黃酮含量質(zhì)量分?jǐn)?shù)為56.8%，酚類、甾體類成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)總和為12.1%，三者含量總和為68.9%。(3)將揮發(fā)油有效部位23.8g和非揮發(fā)性有效部位11.2g作為原料藥制成復(fù)合膠囊。其余按照實(shí)施例2-1提供的方法操作。試驗(yàn)例14(1)山蠟梅葉分揀、干燥，稱取1000g，加30倍水浸泡30min，水蒸氣蒸餾提取揮發(fā)油5小時(shí)，收集揮發(fā)油，用無水硫酸鈉干燥，得揮發(fā)油有效部位24.3g，其中l(wèi)，8-桉葉素、芳樟醇兩者在有效部位中含量質(zhì)量分?jǐn)?shù)和為62.3%;(2)蒸餾后的水溶液另器保存；藥渣加95%的乙醇，提取3次，提取時(shí)間為lh，過濾，合并各次濾液，與蒸鎦水液合并，4(TC-75X:減壓濃縮，濃縮液上已預(yù)處理好的大孔樹脂層析柱吸附，用6倍柱體積水洗脫，水洗液棄掉，繼續(xù)用6倍柱體積的30%的乙醇洗脫，洗液棄掉，繼續(xù)用6倍柱體積的70%的乙醇洗脫，洗脫液收集，4(TC-75'C減壓濃縮，冷卻后加入乙醇至含醇量90%進(jìn)行醇沉，0-10'C靜置48小時(shí)，過濾，得濾液，40°C-75。C減壓回收乙醇，噴霧干燥即得非揮發(fā)性有效部位10.6g，其中總黃酮含量質(zhì)量分?jǐn)?shù)為58.7%，酚類、甾體類成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)總和為8.2%，三者含量總和為64.9%。(3)將揮發(fā)油有效部位24.3g和非揮發(fā)性有效部位10.6g作為原料藥制成分散片。其余按照實(shí)施例2-3提供的方法操作。權(quán)利要求1、山蠟梅有效部位群的制備方法，其特征在于該方法依次包括下列步驟步驟(1)山蠟梅葉分揀、干燥，加水浸泡30min-1h，水蒸氣蒸餾提取揮發(fā)油，收集揮發(fā)油，用無水硫酸鈉干燥，作為揮發(fā)油有效部位；步驟(2)蒸餾后的水溶液另器保存；藥渣加溶劑提取，過濾，收集提取液，與蒸餾后的水溶液合并，減壓濃縮，濃縮液上大孔樹脂層析柱吸附，用2-6倍柱體積水洗脫，水洗液棄掉，繼續(xù)用2-6倍柱體積的10％-30％的乙醇洗脫，洗液棄掉，繼續(xù)用2-6倍柱體積的30％-90％的乙醇洗脫，洗脫液收集，減壓濃縮，冷卻后用醇溶解，靜置，過濾，得濾液，減壓回收乙醇，干燥即得非揮發(fā)性有效部位；步驟(3)將揮發(fā)油有效部位和非揮發(fā)性有效部位按山蠟梅藥材實(shí)際生藥提取量1.0-2.6∶0.5-3.5重量配比入藥，即為山蠟梅有效部位群。2、根據(jù)權(quán)利要求l所述的山蠟梅有效部位群的制備方法，其特征是步驟(1)中加水量為生藥材的6-30倍，提取時(shí)間為1-6小時(shí)。3、根據(jù)權(quán)利要求l所述的山蠟梅有效部位群的制備方法，其特征是步驟(2)中藥渣加溶劑為水或10%-95%的乙醇，提取次數(shù)為1-4次，每次提取時(shí)間為30min-2h。4、根據(jù)權(quán)利要求l所述的山蠟梅有效部位群的制備方法，其特征是歩驟(2)中減壓濃縮溫度為40°C-75°C。5、根據(jù)權(quán)利要求l所述的山蠟梅有效部位群的制備方法，其特征是歩驟(2)中用醇溶解工序是指加入乙醇至含醇量40%-95%進(jìn)行溶解。6、根據(jù)權(quán)利要求l所述的山蠟梅有效部位群的制備方法，其特征是歩驟(2)用醇溶解工序中靜置時(shí)間為6-48小時(shí)。7、根據(jù)權(quán)利要求l所述的山蠟梅有效部位群的制備方法，其特征是歩驟(2)用醇溶解工序中靜置溫度為0-25°C。8、根據(jù)權(quán)利要求1所述的山蠟梅有效部位群的制備方法，其特征是所使用的干燥方法為噴霧干燥、減壓干燥(真空)或常壓干燥。9、根據(jù)權(quán)利要求1所述的山蠟梅有效部位群的制備方法，其特征是揮發(fā)油有效部位在山蠟梅干燥藥材中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)得率為1.0%-2.6%。10、根據(jù)權(quán)利要求1所述的山蠟梅有效部位群的制備方法，其特征是揮發(fā)油有效部位主要含有l(wèi)，8-桉葉素、芳樟醇，其兩者在有效部位中含量質(zhì)量分?jǐn)?shù)總和為50%-88%。11、根據(jù)權(quán)利要求1所述的山蠟梅有效部位群的制備方法，其特征是非揮發(fā)性有效部位在山蠟梅干燥藥材中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)得率為0.5%-3.5%。12、根據(jù)權(quán)利要求l所述的山蠟梅有效部位群的制備方法，其特征是非揮發(fā)性有效部位主要含有黃酮、酚類、甾體和三萜類成分，其中總黃酮、總酚和沿體類成分三者質(zhì)量分?jǐn)?shù)總和為50%-90%。13、根據(jù)權(quán)利要求l-12所述方法提取的山蠟梅有效部位群。14、一種含有權(quán)利要求13所述的有效部位群的制劑，其特征是有效部位群制備的制劑可為顆粒劑、軟膠囊、膠囊、滴丸、片劑、復(fù)合膠囊和分散片中的一種。15、根據(jù)權(quán)利要求13所述的有效部位群及其制劑在防治呼吸系統(tǒng)疾病、抗感冒、抗菌、抗炎、抗病毒、抗真菌等藥物中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明涉及山蠟梅有效部位群的制備方法及其制劑的制法與用途，本發(fā)明的山蠟梅有效部位群及其制劑在防治呼吸系統(tǒng)疾病、抗感冒、抗菌、抗炎、抗病毒和抗真菌等藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明將揮發(fā)油有效部位和非揮發(fā)性有效部位按山蠟梅藥材實(shí)際生藥提取量1.0-2.6∶0.5-3.5重量配比入藥，即為山蠟梅有效部位群。該山蠟梅有效部位群的制劑可為顆粒劑、軟膠囊、膠囊、滴丸、片劑、復(fù)合膠囊、分散片等。本發(fā)明對(duì)山蠟梅制劑進(jìn)行深度開發(fā)，富含活性成分，不僅有效成分明確，藥理作用明顯，藥效顯著提高，而且性能穩(wěn)定，質(zhì)量可控，安全可靠，并且服用量小，有利于藥品運(yùn)輸、儲(chǔ)存與患者服用。文檔編號(hào)A61P31/00GK101357146SQ20081010692公開日2009年2月4日申請(qǐng)日期2008年6月17日優(yōu)先權(quán)日2008年6月17日發(fā)明者張小娟,楊世林,洪漢斌,王躍生,羅曉健,范玫玫,勇黃申請(qǐng)人:江西天佑藥業(yè)有限公司;江西本草天工科技有限責(zé)任公司