專(zhuān)利名稱(chēng)：養(yǎng)血清腦顆粒對(duì)腦神經(jīng)元損傷的治療作用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
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本發(fā)明涉及一種中藥制劑的新用途，特別涉及中藥養(yǎng)血清腦顆粒對(duì)腦神經(jīng)元 損傷的治療作用。
背景技術(shù)：
腦損傷是多種損傷機(jī)制造成的共同結(jié)果，其中腦缺血最常引起神經(jīng)細(xì)胞損 傷。溶栓治療和神經(jīng)保護(hù)是治療缺血性腦卒中的兩大干預(yù)策略。溶栓治療往往有 治療時(shí)間窗,且副作用較多。因此,神經(jīng)元保護(hù)并與其他治療方法聯(lián)合應(yīng)用表現(xiàn)出 更明顯的優(yōu)越性。
養(yǎng)血清腦顆粒是由當(dāng)歸、川穹、雞血藤、白芍、細(xì)辛等為主要成分組成的中 藥復(fù)方制劑，臨床應(yīng)用于與腦微循環(huán)障礙相關(guān)的頭痛、眩暈治療。但是，對(duì)大腦 中動(dòng)脈阻塞再灌注引起的大腦局部腦神經(jīng)細(xì)胞的損傷是否具有保護(hù)作用等尚不 清楚，為此，本研究用大腦中動(dòng)脈阻塞再灌注建立的大鼠局部腦神經(jīng)細(xì)胞模型，
觀察養(yǎng)血清腦顆粒對(duì)局部缺血再灌注后，大鼠腦神經(jīng)元損傷的保護(hù)作用，并通過(guò) 免疫組織化學(xué)方法研究養(yǎng)血清腦顆粒對(duì)調(diào)亡相關(guān)的腦神經(jīng)元P53、 PUMA、 Bcl-2、 Caspase-3表達(dá)的影響，探討起作用機(jī)制。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種養(yǎng)血清腦顆粒的新的治療用途，特別是用養(yǎng)血清腦顆粒治療 腦神經(jīng)元損傷。
養(yǎng)血清腦顆粒是一種己經(jīng)上市的中成藥物，其配方組成為當(dāng)歸、赤芍、川 芎、雞血藤、勾藤、夏枯草等臨床上用于治療頭痛、眩暈等癥。
本發(fā)明經(jīng)過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，養(yǎng)血清腦顆粒可以治療腦神經(jīng)元損傷因而擴(kuò)大了其應(yīng) 用范圍，為此，本發(fā)明的內(nèi)容主要包括，用養(yǎng)血清腦顆粒制備一種治療腦神經(jīng)元 損傷的藥物。
為證明本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)效果，現(xiàn)將有關(guān)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)整列如下 實(shí)驗(yàn)一、
本實(shí)驗(yàn)研究養(yǎng)血清腦顆粒后給藥大腦中動(dòng)脈缺血再灌注引起的大鼠腦局部神經(jīng) 細(xì)胞損傷的治療作用。動(dòng)物
SD大鼠，雄性，體重270 300 g，購(gòu)自北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部，合格證 號(hào)SYXK (京)2002-0002。在12小時(shí)切換燈源，溫度22。C,相對(duì)濕度40%的環(huán) 境下飼養(yǎng)，自由進(jìn)食飲水。 藥物
養(yǎng)血清腦顆粒主要組成為當(dāng)歸、川芎、白芍、鉤藤、雞血藤、夏枯草、珍珠母、 細(xì)辛等，天津天士力制藥股份有限公司生產(chǎn)，國(guó)藥準(zhǔn)字Z10960082，批號(hào)050608。 實(shí)驗(yàn)前用生理鹽水配制成0.08 g/ml 0.16 g/ml的溶液。 模型的建立
用20%烏拉坦肌肉注射麻醉大鼠(2.5 g/kg.bw)，在頸部正中切開(kāi)，逐層分離頸 部右側(cè)肌肉(胸骨舌骨肌，胸鎖乳突肌)，小心分離頸總動(dòng)脈及其分支，用微動(dòng) 脈夾夾閉經(jīng)總動(dòng)脈近心端，雙線結(jié)扎頸外動(dòng)脈，并于中間剪斷，于近心端游離斷 支系一活結(jié)，分離頸內(nèi)動(dòng)脈致翼腭動(dòng)脈(PtA)分支處，用微動(dòng)脈夾夾閉頸內(nèi)動(dòng) 脈，用顯微剪在結(jié)扎處和活結(jié)中間開(kāi)一小孔，將動(dòng)脈插線(3-0 prolene， Johnson&Johnson， USA)小心插入后將活結(jié)扎緊，去除頸內(nèi)動(dòng)脈微動(dòng)脈夾，將動(dòng) 脈插線插入1.8~2.2 cm，造成缺血，60 min后撤出動(dòng)脈插線扎緊活結(jié)，開(kāi)始再 灌注(I/R)。假手術(shù)組除了不插入動(dòng)脈插線，其他操作同缺血再灌注組。給藥組 在大腦中動(dòng)脈缺血再灌注3小時(shí)后開(kāi)始，灌胃給予養(yǎng)血清腦顆粒0.4g/kg或 0.8g/kg，每日一次，連續(xù)6曰。 氯化三苯四氮唑(TTC)染色
在缺血再灌注6日后，麻醉大鼠，剪下頭部置于腦定位儀沿視交叉往后平均切成 5片,用含2%TTC的磷酸鹽緩沖液在37'C染色30min，然后再用4%多聚甲醛固定并 拍照。用Image-Pro-Plus軟件測(cè)量梗死體積比(即梗死區(qū)體積占同側(cè)大腦半球的
百分比)。
光鏡腦組織切片制備及Nissl染色
在缺血再灌注6日后，麻醉大鼠，經(jīng)左心室插管灌注，用生理鹽水250ml (室溫) 快速灌注，再用4X多聚甲醛150ml (4'C)緩慢灌注，持續(xù)60min左右，迅速取 腦，在腦定位模具中沿視交叉冠狀位切取腦組織，將其置于4%多聚甲醛溶液中 后固定6 8h后入30X的蔗糖中，待腦組織沉底后冰凍切片，制成20Mm厚的切片，每隔5張切片取5張分別行常規(guī)Nissl染色，脫水封片后于光鏡下觀察。 免疫組織化學(xué)染色
切片入O. 01mol/L PBS搖洗3次后，入Triton X-100液30min (37°C)，入3% 過(guò)氧化氫20min (避光)，血清封閉lh (室溫)，分別滴加1: 100抗Ca印ase-3、 抗PUMA、抗P53、抗NF-icB抗體各50W于各組不同的切片上，置于室溫下lh, 入4'C冰箱過(guò)夜。第二天復(fù)溫lh后入滴加ABC試劑盒中B、 C液50ul于對(duì)應(yīng)的 切片上，室溫下各孵育lh，各步驟之間均入0. 01mol/L PBS搖洗3次，DAB顯色， 常規(guī)梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片，光鏡下觀察。每組各5張切片， 每張切片隨機(jī)取5個(gè)視野計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，并作統(tǒng)計(jì)分析。 結(jié)果
養(yǎng)血清腦顆粒對(duì)缺血再灌注后大鼠大腦梗死體積比的影響
圖1是TTC染色結(jié)果，白色區(qū)域代表缺血梗死區(qū)。假手術(shù)組未見(jiàn)梗死蒼白區(qū)，I/R 組腦切片中缺血側(cè)腦皮質(zhì)及皮質(zhì)下基底核都有明顯的白色梗死灶。養(yǎng)血清腦顆粒 預(yù)防給藥后梗死區(qū)域均有所減小。
圖2表示的是養(yǎng)血清腦顆粒對(duì)缺血再灌注后大鼠大腦梗死體積比的影響。與假手 術(shù)組相比，1/R組大鼠大腦梗死體積比明顯升高，養(yǎng)血清腦顆粒預(yù)給藥濃度依存 性降低了缺血再灌注后的大腦梗死體積比。 養(yǎng)血清腦顆粒對(duì)缺血再灌注后大鼠大腦Nissl染色的影響 圖3是Sham組，I/R組，CGO. 4+I/R組和CGO. 8+I/R組大鼠腦組織Nissl染色的 結(jié)果。Sham組鏡下可見(jiàn)正常大腦皮質(zhì)各層細(xì)胞排列整齊、規(guī)則，神經(jīng)元結(jié)構(gòu)完 整，神經(jīng)基質(zhì)無(wú)水腫?；咨窠?jīng)節(jié)區(qū)神經(jīng)元結(jié)構(gòu)也正常,神經(jīng)纖維無(wú)損壞；皮質(zhì) 神經(jīng)元胞體體積較大，胞漿淡染，內(nèi)含大而圓的泡狀核，胞核規(guī)整，核仁明顯， 染色質(zhì)分布均勻，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)尼氏體。1/R組低倍鏡下淡染區(qū)較大，半影區(qū)20 倍鏡下顯示尼氏小體減少，神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量減少。CG0.4+I/R組低倍鏡下淡染區(qū)較 1/R組減少，半影區(qū)20倍鏡下細(xì)胞排列紊亂、部分神經(jīng)細(xì)胞核固縮、尼氏小體 減少，可以觀察到正常神經(jīng)元。CGO. 8+I/R組低倍鏡下淡染區(qū)較I/R組明顯減少， 半影區(qū)20倍，雖然觀察到少量核濃縮的神經(jīng)元，但是大部分神經(jīng)元細(xì)胞大而圓， 尼氏體深染，形態(tài)與假手術(shù)組相似。
養(yǎng)血清腦顆粒對(duì)缺血再灌注后大鼠大腦Caspase-3表達(dá)的影響圖4是Sham組，I/R組，CGO. 4+I/R組和CGO. 8+I/R組大鼠腦組織Caspase-3 免疫組織化學(xué)染色的圖像。Sham組Caspase-3未見(jiàn)明顯表達(dá)。1/R組大鼠腦皮質(zhì) 可以觀察到大量的Caspase-3陽(yáng)性神經(jīng)元細(xì)胞。CGO. 4+I/R組大鼠腦皮質(zhì)內(nèi) Caspase-3陽(yáng)性神經(jīng)元細(xì)胞較I/R組明顯減少，CGO. 8+I/R組大鼠腦皮質(zhì)內(nèi) Caspase-3陽(yáng)性神經(jīng)元細(xì)胞更少。
養(yǎng)血清腦顆粒劑量依存性減少了缺血再灌注引起的大鼠腦Caspase-3陽(yáng)性神經(jīng) 元細(xì)胞數(shù)量(圖8)。
養(yǎng)血清腦顆粒對(duì)缺血再灌注后大鼠大腦PUMA表達(dá)的影響 圖5表示的是Sham組，I/R組，CGO. 4+I/R組和CGO. 8+I/R組大鼠腦組織PUMA 免疫組織化學(xué)染色的圖像。Sham組大鼠腦組織內(nèi)未見(jiàn)PUMA的明顯表達(dá)。I/R組 大鼠腦皮質(zhì)可以觀察到廣泛的PUMA陽(yáng)性區(qū)域，20倍鏡顯示PUMA在神經(jīng)元的胞 核胞漿均有表達(dá)，部分皺縮細(xì)胞則呈現(xiàn)均勻一致性表達(dá)。CGO. 4+I/R組和 CGO. 8+I/R組大鼠腦皮質(zhì)區(qū)PUMA陽(yáng)性細(xì)胞明顯減少。
養(yǎng)血清腦顆粒劑量依存性減少了缺血再灌注引起的大鼠腦PUMA陽(yáng)性神經(jīng)元細(xì)胞 數(shù)量(圖8)。
養(yǎng)血清腦顆粒對(duì)缺血再灌注后大鼠大腦P53表達(dá)的影響
圖6表示的是Sham組，I/R組，CGO. 4+I/R組和CGO. 8+I/R組大鼠腦組織P53 免疫組織化學(xué)染色的圖像。Sham組大鼠腦組織內(nèi)未見(jiàn)P53的明顯表達(dá)。I/R組大 鼠腦皮質(zhì)區(qū)可以觀察到廣泛的P53陽(yáng)性區(qū)域，20倍鏡可以觀察到較多的P53陽(yáng) 性神經(jīng)元。CGO. 4+I/R組和CGO. 8+I/R組大鼠腦皮質(zhì)P53陽(yáng)性細(xì)胞明顯減小。 養(yǎng)血清腦顆粒劑量依存性減少了缺血再灌注引起的大鼠腦P53陽(yáng)性神經(jīng)元細(xì)胞 數(shù)量(圖8)。
養(yǎng)血清腦顆粒對(duì)缺血再灌注后大鼠大腦NF- k B表達(dá)的影響
圖7表示的是Sham組，I/R組，CGO. 4+I/R組和CGO. 8+I/R組大鼠腦組織NF- k B 免疫組織化學(xué)染色的圖像。Sham組大鼠腦組織內(nèi)未見(jiàn)NF-KB的明顯表達(dá)。I/R 組大鼠腦皮質(zhì)區(qū)可以觀察到廣泛的NF-k B陽(yáng)性染色區(qū)域，20倍鏡可以觀察到較 多的NF- k B陽(yáng)性神經(jīng)元。CGO. 4+I/R組和CGO. 8+I/R組大鼠腦皮質(zhì)區(qū)NF- k B陽(yáng) 性神經(jīng)細(xì)胞明顯減小。
養(yǎng)血清腦顆粒劑量依存性減少了缺血再灌注引起的大鼠腦NF-k B陽(yáng)性神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)量(圖8)。 結(jié)論
大腦中動(dòng)脈缺血1小時(shí)再灌注6日可以引起同側(cè)腦梗死和神經(jīng)細(xì)胞損傷，引起神 經(jīng)細(xì)胞內(nèi)Caspase-3、 P53、 PUMA和NF-k B表達(dá)的增強(qiáng)。大腦中動(dòng)脈缺血再灌注 3小時(shí)后開(kāi)始，并每日一次，連續(xù)6日灌胃給予養(yǎng)血清腦顆?？梢詼p少大鼠腦梗 死區(qū)域和神經(jīng)元的損傷，該作用與其抑制Caspase-3、 P53、 PUMA和NF- k B的表 達(dá)相關(guān)。


圖1是TTC染色結(jié)果，白色區(qū)域代表缺血梗死區(qū)。假手術(shù)組未見(jiàn)梗死蒼白區(qū)，I/R 組腦切片中缺血側(cè)腦皮質(zhì)及皮質(zhì)下基底核都有明顯的白色梗死灶。養(yǎng)血清腦顆粒 預(yù)防給藥后梗死區(qū)域均有所減小。
圖2表示的是養(yǎng)血清腦顆粒對(duì)缺血再灌注后大鼠大腦梗死體積比的影響。與假手 術(shù)組相比，1/R組大鼠大腦梗死體積比明顯升高，養(yǎng)血清腦顆粒預(yù)給藥濃度依存 性降低了缺血再灌注后的大腦梗死體積比。
圖3是Sham組，I/R組，CGO. 4+I/R組和CGO. 8+I/R組大鼠腦組織Nissl染色的 結(jié)果。Sham組鏡下可見(jiàn)正常大腦皮質(zhì)各層細(xì)胞排列整齊、規(guī)則，神經(jīng)元結(jié)構(gòu)完 整，神經(jīng)基質(zhì)無(wú)水腫?；咨窠?jīng)節(jié)區(qū)神經(jīng)元結(jié)構(gòu)也正常,神經(jīng)纖維無(wú)損壞；皮質(zhì) 神經(jīng)元胞體體積較大，胞漿淡染，內(nèi)含大而圓的泡狀核，胞核規(guī)整，核仁明顯， 染色質(zhì)分布均勻，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)尼氏體。1/R組低倍鏡下淡染區(qū)較大，半影區(qū)20 倍鏡下顯示尼氏小體減少，神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量減少。CG0.4+I/R組低倍鏡下淡染區(qū)較 1/R組減少，半影區(qū)20倍鏡下細(xì)胞排列紊亂、部分神經(jīng)細(xì)胞核固縮、尼氏小體 減少，可以觀察到正常神經(jīng)元。CGO. 8+I/R組低倍鏡下淡染區(qū)較I/R組明顯減少， 半影區(qū)20倍，雖然觀察到少量核濃縮的神經(jīng)元，但是大部分神經(jīng)元細(xì)胞大而圓， 尼氏體深染，形態(tài)與假手術(shù)組相似。
圖4是Sham組，I/R組，CGO. 4+I/R組和CGO. 8+I/R組大鼠腦組織Caspase-3 免疫組織化學(xué)染色的圖像。Sham組Caspase-3未見(jiàn)明顯表達(dá)。1/R組大鼠腦皮質(zhì) 可以觀察到大量的Caspase-3陽(yáng)性神經(jīng)元細(xì)胞。CGO. 4+I/R組大鼠腦皮質(zhì)內(nèi) Caspase-3陽(yáng)性神經(jīng)元細(xì)胞較I/R組明顯減少，CGO. 8+I/R組大鼠腦皮質(zhì)內(nèi) Caspase-3陽(yáng)性神經(jīng)元細(xì)胞更少。圖5表示的是Sham組，I/R組，CGO. 4+I/R組和CGO. 8+I/R組大鼠腦組織PUMA 免疫組織化學(xué)染色的圖像。Sham組大鼠腦組織內(nèi)未見(jiàn)PUMA的明顯表達(dá)。I/R組 大鼠腦皮質(zhì)可以觀察到廣泛的PUMA陽(yáng)性區(qū)域，20倍鏡顯示PUMA在神經(jīng)元的胞 核胞漿均有表達(dá)，部分皺縮細(xì)胞則呈現(xiàn)均勻一致性表達(dá)。CGO. 4+I/R組和 CGO. 8+I/R組大鼠腦皮質(zhì)區(qū)PUMA陽(yáng)性細(xì)胞明顯減少。
圖6表示的是Sham組，I/R組，CGO. 4+I/R組和CGO. 8+I/R組大鼠腦組織P53 免疫組織化學(xué)染色的圖像。Sham組大鼠腦組織內(nèi)未見(jiàn)P53的明顯表達(dá)。I/R組大 鼠腦皮質(zhì)區(qū)可以觀察到廣泛的P53陽(yáng)性區(qū)域，20倍鏡可以觀察到較多的P53陽(yáng) 性神經(jīng)元。CGO. 4+I/R組和CGO. 8+I/R組大鼠腦皮質(zhì)P53陽(yáng)性細(xì)胞明顯減小。 圖7表示的是Sham組，I/R組，CGO. 4+I/R組和CGO. 8+I/R組大鼠腦組織NF- k B 免疫組織化學(xué)染色的圖像。Sham組大鼠腦組織內(nèi)未見(jiàn)NF-!cB的明顯表達(dá)。I/R 組大鼠腦皮質(zhì)區(qū)可以觀察到廣泛的NF- k B陽(yáng)性染色區(qū)域，20倍鏡可以觀察到較 多的NF- k B陽(yáng)性神經(jīng)元。CGO. 4+I/R組和CGO. 8+I/R組大鼠腦皮質(zhì)區(qū)NF- k B陽(yáng) 性神經(jīng)細(xì)胞明顯減小。
圖8是養(yǎng)血清腦顆粒劑量依存性減少了缺血再灌注引起的大鼠腦NF- k B陽(yáng)性神
經(jīng)元細(xì)胞數(shù)量。
具體實(shí)施例方式
以下實(shí)施例用于進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明但不作為對(duì)本發(fā)明的限制。 實(shí)施例1
養(yǎng)血清腦顆粒，由如下重量份的原料藥制成當(dāng)歸250- 420份；川芎280-400 份；白芍200-380份；熟地黃200-400份；鉤藤580-750份；雞血藤550-780 份；夏枯草600-720份；決明子500-750份；珍珠母560-750份；延胡索200-420 份；細(xì)辛30-IOO份。顆粒的制備采用制劑學(xué)常規(guī)技術(shù)制備成lOOOg。
權(quán)利要求
1、養(yǎng)血清腦顆粒在制備一種治療腦神經(jīng)元損傷藥物的應(yīng)用。
2、 權(quán)利要求l的應(yīng)用，其特征在于，所述養(yǎng)血清腦顆粒是由當(dāng)歸250- 420份； 川芎280-400份；白芍200-380份；熟地黃200-400份；鉤藤580-750份； 雞血藤550-780份；夏枯草600-720份；決明子500-750份；珍珠母560-750 份；延胡索200-420份；細(xì)辛30-100份為主要成分制成的中藥復(fù)方制劑。
3、 權(quán)利要求l的應(yīng)用，其特征在于，所述應(yīng)用是養(yǎng)血清腦顆粒對(duì)大腦中動(dòng)脈缺 血再灌注引起的腦局部神經(jīng)細(xì)胞損傷的治療作用。
4、 權(quán)利要求l的應(yīng)用，其特征在于，所述應(yīng)用是養(yǎng)血清腦顆粒后給藥減少腦梗 死區(qū)域和神經(jīng)元的損傷，該作用與其抑制Caspase-3、 P53、 PUMA和NF-k B 的表達(dá)相關(guān)。
5、 權(quán)利要求l的應(yīng)用，其特征在于，所述應(yīng)用是養(yǎng)血清腦顆粒后給藥減少了缺 血再灌注引起的大鼠腦Caspase-3陽(yáng)性祌經(jīng)元細(xì)胞數(shù)量。
6、 權(quán)利要求l的應(yīng)用，其特征在于，所述應(yīng)用是養(yǎng)血清腦顆粒后給藥減少了缺 血再灌注引起的大鼠腦PUMA陽(yáng)性神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)量。
7、 權(quán)利要求l的應(yīng)用，其特征在于，所述應(yīng)用是養(yǎng)血清腦顆粒后給藥減少了缺 血再灌注引起的大鼠腦P53陽(yáng)性神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)量。
8、 權(quán)利要求l的應(yīng)用，其特征在于，所述應(yīng)用是養(yǎng)血清腦顆粒后給藥減少了缺 血再灌注引起的大鼠腦NF- k B陽(yáng)性神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)量。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種中藥制劑的新用途，特別涉及中藥養(yǎng)血清腦顆粒對(duì)腦神經(jīng)元損傷的治療作用，本發(fā)明實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，養(yǎng)血清腦顆粒對(duì)大腦中動(dòng)脈缺血再灌注引起的腦局部神經(jīng)細(xì)胞損傷有治療作用。
文檔編號(hào)A61P25/00GK101530500SQ20081005243
公開(kāi)日2009年9月16日 申請(qǐng)日期2008年3月13日 優(yōu)先權(quán)日2008年3月13日
發(fā)明者周長(zhǎng)滿, 安麗華, 昕 常, 芳 王, 琴 胡, 胡白和, 趙新榮, 陳春花, 韓晶巖 申請(qǐng)人:天津天士力制藥股份有限公司