專利名稱：一種小干擾rna在制備治療大腸癌的藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，尤其涉及一種治療腫瘤的藥物，特別是一種小干擾RNA在制備治療大腸癌的藥物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：
隨著人們生活水平的提高和飲食結(jié)構(gòu)的變化，大腸癌在我國的發(fā)病率呈增高趨勢，因此，探索有效的大腸癌防治策略是關(guān)乎國民健康的重要課題。但由于大腸癌發(fā)生發(fā)展的機制尚不明確，故缺乏有效的防治靶點及手段。尤其是中晚期大腸癌，其治療手段只能以化療為主，療效以及患者預(yù)后均較差。
哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)介導(dǎo)的信號通路是與細(xì)胞增殖和凋亡最密切相關(guān)的通路之一，因其處于生長調(diào)節(jié)的中心環(huán)節(jié)而倍受關(guān)注。新近研究表明，肺癌、腎癌、乳腺癌和白血病等多種腫瘤均存在mTOR信號通路的過度激活；在肝癌、胰腺癌等消化系腫瘤中亦存在mTOR的高表達和持續(xù)活化；I期和II期臨床研究顯示，雷帕霉素的衍生物如CCI-779(Temsirolimus)、RAD001(Everolimus)以及AP23573等對晚期腎細(xì)胞癌及乳腺癌具有一定的抑制作用。但是目前關(guān)于mTOR信號通路與大腸癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系尚無文獻報道，抑制mTOR信號通路是否可以防治大腸癌尚不知曉。
近十年來生物學(xué)最重要的進展莫過于RNA干擾(RNAi)現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)。已有研究表明，應(yīng)用RNAi技術(shù)能夠在哺乳動物中滅活或降低特異性基因的表達，產(chǎn)生類似基因敲除的效應(yīng)。作為HIV相關(guān)淋巴瘤、AMD(age relatedmacular degeneration)等人類疾病的可能治療手段，RNAi相關(guān)研究已進入I期和II期臨床試驗。這無疑也為實體腫瘤的治療開辟了新途徑。目前，腫瘤治療領(lǐng)域的RNAi研究蓬勃開展，其中為數(shù)甚眾者將與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的各級分子作為靜默靶點的候選。
哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)基因，GeneID 2475，NM_004958，定位于染色體1p36.2，編碼蛋白質(zhì)分子量為289kDa，為不典型的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，屬于PIKK家族(PtdIns3K-related kinase family)。
RNA干擾技術(shù)(RNAi)是把與內(nèi)源mRNA編碼區(qū)同源的小片段外源雙鏈RNA導(dǎo)入細(xì)胞中，導(dǎo)致特定基因沉默的一種技術(shù)。siRNA是RNAi的關(guān)鍵效應(yīng)分子，是長度為21-23nt的雙鏈RNA。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種小干擾RNA在制備治療大腸癌的藥物中的應(yīng)用，所述的這種小干擾RNA要解決現(xiàn)有技術(shù)中采用化療來治療中晚期大腸癌，其療效以及患者預(yù)后均較差的技術(shù)問題。
本發(fā)明提供了一種小干擾RNA在制備治療大腸癌的藥物中的應(yīng)用，所述的小干擾RNA正義鏈的5’→3’方向的核苷酸序列如SEQ ID NO1所示，所述的小干擾RNA反義鏈的5’→3’方向的核苷酸序列如SEQ IDNO2所示。
本發(fā)明還提供了一種小干擾RNA在制備治療大腸癌的藥物中的應(yīng)用，所述的小干擾RNA的正義鏈5’→3’方向的核苷酸序列如SEQ IDNO3所示，所述的小干擾RNA的反義鏈5’→3’方向的核苷酸序列如SEQ ID NO4所示。
本發(fā)明還提供了一種小干擾RNA在制備治療大腸癌的藥物中的應(yīng)用，所述的小干擾RNA的正義鏈5’→3’方向的核苷酸序列如SEQ IDNO5所示，所述的小干擾RNA的反義鏈5’→3’方向的核苷酸序列如SEQ ID NO6所示。
本發(fā)明還提供了一種小干擾RNA在制備治療大腸癌的藥物中的應(yīng)用，所述的小干擾RNA的正義鏈5’→3’方向的核苷酸序列如SEQ ID NO7所示，所述的小干擾RNA的反義鏈5’→3’方向的核苷酸序列如SEQ IDNO8所示。
本發(fā)明使用了針對mTOR基因的4對siRNA片段，由美國Dharmacon公司合成(Pre-designed RNAi Reagents，Dharmacon，USA)，堿基序列及分子量如下表所示。經(jīng)實驗證實均為有效序列，均可抑制mTOR基因及蛋白表達，其中以siRNA3的作用最為顯著。
mTOR siRNA1-4寡核苷酸序列及分子量
siRNA3分子量為13,373(g/mole)，為凍干粉劑，保存于-20℃，用前以DEPC水溶解。正義鏈(Nucleotide-3-S)21個堿基是19個堿基的mTOR基因靶序列加上3’端2個堿基的懸頭UU，反義鏈(Nucleotide-3-A)21個堿基完全與mTOR基因靶序列互補。在體內(nèi)研究部分，上述序列由上海吉瑪公司(Shanghai GenePharma Co.，Ltd)進行2’甲氧修飾以增加穩(wěn)定性，并化學(xué)合成(在ISO9000質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)下生產(chǎn)；HPLC純化；全長雙鏈siRNA含量＞97％)。
siRNA轉(zhuǎn)染入細(xì)胞后，即啟動RNAi效應(yīng)階段。siRNA在細(xì)胞內(nèi)RNA解旋酶的作用下解鏈成正義鏈和反義鏈，繼之由反義siRNA再與體內(nèi)一些酶(包括內(nèi)切酶、外切酶、解旋酶等)結(jié)合形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物(RNA-induced silencing complex，RISC)。RISC與外源性基因表達的mRNA的同源區(qū)進行特異性結(jié)合，并在距離siRNA3’端12個堿基的位置切割mRNA。被切割后的斷裂mRNA隨即降解，從而誘發(fā)宿主細(xì)胞針對這些mRNA的降解反應(yīng)。siRNA不僅能引導(dǎo)RISC切割同源單鏈mRNA，而且可作為引物與靶RNA結(jié)合并在RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase，RdRP)作用下合成更多新的雙鏈RNA(double stranded RNA，dsRNA)，新合成的dsRNA再由胞質(zhì)中的核酸內(nèi)切酶(Dicer)切割產(chǎn)生大量的次級siRNA，從而使RNAi的作用進一步放大，最終將靶mRNA完全降解。
本發(fā)明和已有技術(shù)相比，其效果是積極和明顯的。本發(fā)明能夠抑制大腸癌細(xì)胞增殖活力，阻滯大腸癌細(xì)胞生長周期，誘導(dǎo)大腸癌細(xì)胞凋亡，下調(diào)大腸癌mTOR/p70s6K/4EBP1信號通路的活性，對裸鼠大腸癌移植瘤具有治療作用。



圖1顯示了應(yīng)用RNAi靜默mTOR基因及蛋白表達的圖，其中，圖1A是應(yīng)用脂質(zhì)體法瞬時轉(zhuǎn)染人大腸癌HCT116細(xì)胞系，轉(zhuǎn)染48h后應(yīng)用Taqmen Real-Time PCR檢測mTOR基因表達的圖，圖1B是應(yīng)用脂質(zhì)體法瞬時轉(zhuǎn)染人大腸癌HCT116細(xì)胞系，轉(zhuǎn)染48h后應(yīng)用Western blot技術(shù)檢測mTOR蛋白表達的圖，圖1C是以GAPDH蛋白條帶密度為標(biāo)準(zhǔn)，進行Pan-mTOR及P-mTOR蛋白密度半定量的圖。
圖2顯示了mTOR基因沉默抑制下游p70S6K及4EBP1蛋白磷酸化的圖；其中，圖2A是以mTOR siRNA3(100nM)及陰性對照siRNA(100nM)轉(zhuǎn)染HCT116細(xì)胞，48h后抽提細(xì)胞總蛋白，以Western blot檢測pan-p70s6K，pho-p70s6K(Thr389)，pan-4EBP1，pho-4EBP1(Thr37/46)，以GAPDH作為內(nèi)參照；圖2B是以相應(yīng)總蛋白(pan-)條帶密度為標(biāo)準(zhǔn)，進行pho-p70S6K及pho-4EBP1蛋白半定量。
圖3顯示了mTOR siRNA3轉(zhuǎn)染抑制HCT116細(xì)胞活力的圖。
圖4顯示了mTOR siRNA3轉(zhuǎn)染阻滯HCT116細(xì)胞周期的圖。
圖5顯示了mTOR siRNA3轉(zhuǎn)染誘導(dǎo)HCT116細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)檢測及定量的圖；其中，圖5A是吖啶橙染色(Acridine Orange Staining)的結(jié)果，顯示正常活細(xì)胞DNA呈綠色，RNA呈紅色，凋亡細(xì)胞呈現(xiàn)致密濃染的黃色增強熒光(箭頭所示)；圖5B是AnnexinV/PI雙染色的結(jié)果，顯示早期凋亡細(xì)胞呈現(xiàn)綠色熒光，晚期凋亡細(xì)胞膜呈綠色熒光，核呈紅色熒光；圖5C是流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果，早期凋亡細(xì)胞位于第4象限(右下)。
圖6顯示了mTOR siRNA3轉(zhuǎn)染誘導(dǎo)HCT116細(xì)胞PARP蛋白剪切體(89kDa)形成的圖。
圖7顯示了瘤內(nèi)注射mTOR siRNA3抑制裸鼠大腸癌移植瘤生長的圖；其中，圖7A是首次瘤內(nèi)注射當(dāng)天及注射后第10天各組荷瘤裸鼠圖片；圖7B是以游標(biāo)卡尺測算腫瘤體積，每5天一次，數(shù)據(jù)以

±SD表示(n＝6)。
圖8顯示了mTOR siRNA3轉(zhuǎn)染抑制裸鼠大腸癌移植瘤mTOR蛋白表達以及mTOR/p70S6K/4EBP1信號通路活性的圖，其中，圖8A是三組裸鼠大腸癌移植瘤(siRNA3組、陰性對照組、轉(zhuǎn)染試劑對照組)mTOR蛋白以及mTOR信號通路活性的Western blot檢測結(jié)果；圖8B是mTOR蛋白以及pho-p70S6K和pho-4EBP1的標(biāo)準(zhǔn)化半定量結(jié)果；圖8C是轉(zhuǎn)染試劑對照組(VC)mTOR信號通路活性的SABC法檢測結(jié)果；圖8D是siRNA3轉(zhuǎn)染組mTOR信號通路活性的SABC法檢測結(jié)果。
圖9顯示了瘤內(nèi)注射mTOR siRNA3誘導(dǎo)裸鼠大腸癌移植瘤細(xì)胞凋亡的圖，其中，圖9A是SiRNA3作用組TUNEL法檢測結(jié)果；圖9B是陰性對照組(NC)及轉(zhuǎn)染試劑對照組(VC)的TUNEL法檢測結(jié)果；圖9C是各組凋亡細(xì)胞計數(shù)結(jié)果(％)，數(shù)據(jù)以

±SD表示。

具體實施例方式 實施例1體外研究 本實施例的實驗材料人大腸癌細(xì)胞系HCT116購自中科院細(xì)胞生化所、McCOY’S5A培養(yǎng)基購自美國Sigma公司；針對mTOR基因4個潛在靶位點的SiRNA片段及陰性對照由美國Dharmacon公司合成(Pre-designed RNAi Reagents，Dharmacon，USA)；轉(zhuǎn)染試劑DharmaFECTTM 4siRNA Transfection Reagent(T-2004-03)；5×SiRNA BufferDharmacon，USA；TRIzol ReagentInvitrogen；MTT，Triton X-100，碘化丙啶(PI)Sigma；RNase ARoche公司；試驗所用SiRNA、引物、探針序列見表1；試驗所用抗體見表2；化學(xué)發(fā)光檢測用試劑盒Super

West Femto Maximum SensitivitySubstrate(34095)；Super

West Pico Chemilu-minescent Substrate(34077)，均為Pierce公司產(chǎn)品；細(xì)胞培養(yǎng)耗材Greiner，Germany；Real-Time quantitative PCR試劑盒TOYOBO，Japan；PVDF膜Milipore，Bedford，MA；8％SDS PAGE、12％SDS PAGEPIERCE，USA；酶標(biāo)儀Microplate Reader，Model 550，Bio Rad，USA；流式細(xì)胞儀EPICS-XL，Beckman Coulter，Germany；熒光定量PCR儀FTC2000(Canada)；蛋白電泳系統(tǒng)Mini Protein II BIO-RAD，USA；超凈工作臺(YJ-875)蘇州凈化設(shè)備公司；二氧化碳培養(yǎng)箱Sheldon Manufacturing Inc，SHELLABMODEL2300；低溫超速離心機Eppendorf Centrifuge，5417R；紫外/可見分光光度計Ultraspec 2000型，Pharmacia Biotech公司。
1.體外mTOR siRNA瞬時轉(zhuǎn)染及mTOR基因沉默效果的測定 細(xì)胞培養(yǎng) HCT116細(xì)胞的培養(yǎng)基為McCOY’S 5A MEDIUM完全培養(yǎng)液(10％胎牛血清，100U/ml青/鏈霉素)，培養(yǎng)條件為95％空氣、5％CO2、95％濕度、37℃恒溫。
siRNA瞬時轉(zhuǎn)染 [1]分別設(shè)置空白對照組，轉(zhuǎn)染試劑對照組(Vehicle Control，VC)，陰性對照組(Negative Control)，mTOR siRNA干擾組。
[2]以0.125％胰蛋白酶消化HCT116細(xì)胞成單細(xì)胞懸液，接種于直徑6cm的細(xì)胞培養(yǎng)皿，培養(yǎng)20h，使細(xì)胞融合度達到50％。
[3]取20uM siRNA 80μl，加入720μl 1×siRNA Buffer，800μl無血清培養(yǎng)基，共1600μl，混勻。室溫放置5分鐘。
[4]以同上方法溶解陰性對照(NC)序列。
[5]取DharmaFECTTM 4 192μl(16×12)，加入4608μl(384×8)無血清培養(yǎng)基，共4800μl，混勻。室溫放置5分鐘。
[6]將DharmaFECTTM 4與siRNA等體積混合，室溫放置20分鐘。
[7]棄培養(yǎng)皿內(nèi)的液體，以PBS洗滌后加入3.2ml含血清的完全培養(yǎng)液，800μlDharmaFECTTM 4與siRNA的混合物，使siRNA終濃度為100nM。轉(zhuǎn)染試劑對照組只加DharmaFECTTM 4，終濃度與RNA干擾組相同(4μl/ml)。
[8]按常規(guī)條件繼續(xù)培養(yǎng)48h后檢測RNA及蛋白。
[9]試驗所用siRNA、引物、探針序列見表1 表1 siRNA寡核苷酸、Taqmen Real-Time PCR引物及探針序列

細(xì)胞RNA抽提 [1]六孔板每孔細(xì)胞中加入1ml Trizol，冰上放置5min，以1ml移液槍頭吹打。
[2]將各孔裂解液吸到1.5ml EP管中，加入氯仿0.2ml/管，用力振搖15s。15-30℃孵育2-3min，離心(4℃，12,000g，15min)。
[3]離心后液體分為三層，小心吸取上層無色液體移入一新的EP管中。
[4]加入等體積異丙醇，0.4-0.5ml，混勻，15-30℃孵育10-30min，離心(4℃，12,000g，10min)。
[5]去上清，加入75％乙醇1ml，漩渦振蕩30s，離心(4℃，7,500g，5min)。
[6]盡量除去上清，管內(nèi)沉淀在超凈臺中鼓風(fēng)靜置干燥3-5min。
[7]加入20μl DEPC水溶解，分裝5μl/管，-70℃冰箱保存。
[8]細(xì)胞總RNA的鑒定0.9-1.2％瓊脂糖電泳鑒定細(xì)胞總RNA，觀察出現(xiàn)條帶及各條帶亮度。紫外分光光度計分別測定RNA樣品在260nm和280nm處的光密度值(OD)，并計算RNA的含量和純度。
RT反應(yīng)體系(30μl) 2×RT buffer 15μl，隨機引物(100pmol/ul)1.5μl，逆轉(zhuǎn)錄酶1.5μl，RNA模板5μl，DEPC水7μl 反應(yīng)條件25℃，10min；40℃，60min；70℃，10min Taqmen Real-Time PCR反應(yīng)體系(50μl) 2×Hotstart Fluo-PCR mix 25μl，引物(25pmol/μl)0.8μl×2，探針(25pmol/μl)0.3μl，cDNA模板1μl，DEPC水22.1μl 反應(yīng)條件93℃，4min；93℃，20s；60℃，30s；40循環(huán) 細(xì)胞總蛋白的抽提 [1]配制細(xì)胞裂解緩沖液(RIPA緩沖液)150mM NaCl，1％NP-40，0.5％脫氧膽酸鈉，50mM Tris-HCl(PH8.0)。用前加入PMSF、蛋白酶抑制劑、磷酸化酶抑制劑。
[2]以RIPA裂解緩沖液懸浮凍存的細(xì)胞團，0.1ml/(1×106～1×107)細(xì)胞。
[3]渦旋30s，冰上靜置5min，重復(fù)3次。
[4]14,000rpm，4℃，離心10min，吸取上清。
[5]應(yīng)用考馬斯亮蘭法(Bradford法)蛋白定量試劑盒進行蛋白定量。
Western blot [1]配制HEPES電泳緩沖液HEPES 23.8g，Tris 12.1g，SDS 1.0g，加入去離子水溶解，定容至1000ml。
[2]配制Tris-甘氨酸電轉(zhuǎn)移緩沖液(PH8.3)Tris 3.03g，甘氨酸14.4g，甲醇200ml，加入去離子水溶解，定容至1000ml。
[3]配制封閉液小牛血清與TBS溶液(Tris 12.1g，NaCl 9g，去離子水定容至1000ml，調(diào)節(jié)pH至7.5)以1∶9比例配成含10％小牛血清的封閉液。
[4]將定量后的蛋白樣品與5×loading buffer混合，于100℃加熱變性3-5min，簡單離心后順序加入加樣孔中。以150V電壓電泳直至溴酚藍(lán)到達分離膠底部。
[5]取出凝膠，其中一塊用于考馬斯亮藍(lán)染色以觀察樣品的加樣量及電泳情況，另一塊用于轉(zhuǎn)膜，于甘氨酸電轉(zhuǎn)移緩沖液中平衡10-15min。剪裁大小與凝膠相同的6張濾紙和1張PVDF膜。PVDF膜浸以甲醇預(yù)處理15s，與濾紙共同浸泡于Tris-甘氨酸電轉(zhuǎn)移緩沖液。將凝膠的一面與濾膜相接觸，夾于6張濾紙之間，整齊疊放于電轉(zhuǎn)移裝置中，PVDF膜靠近陽極一側(cè)。加入Tris-甘氨酸電轉(zhuǎn)移緩沖液，于冰上以0.65mA/cm2的電流強度恒流電轉(zhuǎn)移2～3h。
[6]PVDF膜于封閉液中4℃過夜。棄去封閉液，TTBS(999mlTBS，Tween-201ml)振蕩洗膜5分鐘，與一抗室溫孵育2-3h。TTBS震蕩洗膜3次，每次15min。與辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗室溫孵育1-2h。TTBS震蕩洗膜3次，每次15min。
[7]以ECL試劑盒進行化學(xué)發(fā)光，暗室內(nèi)將A、B發(fā)光液等比例稀釋混合。膜用去離子水稍加漂洗，濾紙貼角吸干，反貼法覆于A、B混合液上，置于保鮮膜內(nèi)固定于片盒中，迅速蓋上膠片，關(guān)閉膠盒，根據(jù)所見熒光強度曝光。取出膠片立即完全浸入顯影液中1～2min，清水漂洗后放在定影液中至底片完全定影，清水沖凈晾干，標(biāo)定Marker，進行分析與掃描。
本實施例應(yīng)用脂質(zhì)體法瞬時轉(zhuǎn)染人大腸癌HCT116細(xì)胞系，轉(zhuǎn)染48h后應(yīng)用Taqmen Real-Time PCR(圖1A)及Western blot(圖1B)方法檢測mTOR基因及蛋白表達，(圖1C)以GAPDH蛋白條帶密度為標(biāo)準(zhǔn)，進行Pan-mTOR及P-mTOR蛋白條帶密度半定量。由圖1可知，mTOR基因的擴增標(biāo)準(zhǔn)曲線為[Y＝-3.4172X+46.4226](R＝0.99973)。針對4個mTOR基因靶位點的siRNA片段(siRNA1、2、3、4)均可顯著抑制mTOR基因及蛋白表達，以siRNA3的作用最為明顯。與轉(zhuǎn)染試劑對照組(VC)相比較，siRNA3作用組mTOR mRNA表達量減少82.65％，mTOR蛋白表達量減少90.10％，磷酸化mTOR蛋白(pho-mTOR)表達減少89.52％。據(jù)此，選擇siRNA3作為靶序列進行后續(xù)實驗。
2.mTOR基因沉默對mTOR下游p70S6K及4EBP1蛋白活性的影響 應(yīng)用Western blot方法檢測mTOR信號通路下游p70s6K及4EBP1蛋白活性的變化。具體操作步驟同前。
以mTOR siRNA3(100nM)及陰性對照siRNA(100nM)轉(zhuǎn)染HCT116細(xì)胞，48h后抽提細(xì)胞總蛋白，以Western blot檢測pan-p70S6K，pho-p70S6K(Thr389)，pan-4EBP1，pho-4EBP1(Thr37/46)，以GAPDH作為內(nèi)參照(圖2A)。以相應(yīng)總蛋白(pan-)條帶密度為標(biāo)準(zhǔn)，進行pho-p70S6K及pho-4EBP1蛋白半定量(圖2B)。圖2中所示數(shù)據(jù)代表三次實驗結(jié)果。
由圖2可知，mTOR SiRNA3瞬時轉(zhuǎn)染可顯著降低mTOR下游p70s6K及4EBP1蛋白的磷酸化水平(pho-p70S6KSiRNA3/pho-p70S6KVC＝0.0729；pho-4EBP1SiRNA3/pho-4EBP1VC＝0.0521)，提示mTOR基因沉默可抑制下游p70S6K及4EBP1蛋白的磷酸化，即mTOR信號通路的活性被抑制。
3.MTT比色實驗檢測細(xì)胞活力變化 [1]細(xì)胞接種細(xì)胞培養(yǎng)至生長成單層，以0.125％胰蛋白酶消化，以含10％胎牛血清的McCOY’S 5A培養(yǎng)基調(diào)成單細(xì)胞懸液，濃度為2×104個/ml，按100μl/孔接種到96孔培養(yǎng)板中。
[2]轉(zhuǎn)染接種24小時后吸去培養(yǎng)液，加入200μl完全培養(yǎng)液，其中SiRNA濃度100nM，DharmaFECTTM 4濃度4μl/ml，溶劑對照組(Vehicle Control)只加入DharmaFECTTM4，空白對照組加入完全培養(yǎng)液。置于原條件分別繼續(xù)培養(yǎng)24h、48h、72h。每組設(shè)5個副孔。每組實驗重復(fù)三次。
[3]顯色每孔加入5mg/ml的MTT(methyl thiazolyl blue tetrazolium bromide，(3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl)-2，5-diphenytetra-zolium，Calbiochem，San Diego，CA，USA)溶液20μl，置于37℃繼續(xù)培養(yǎng)4h，小心吸去上清液，加入100ul/孔DMSO，避光室溫下?lián)u床振蕩30min。
[4]比色酶標(biāo)儀雙波長(570nm、630nm)測定各孔光吸收值并記錄結(jié)果。以

表示細(xì)胞活力。試驗重復(fù)三次，數(shù)據(jù)以

±SD顯示。與陰性對照組(NC)相比較，*P＜0.05，**P＜0.01。
由圖3可知，瞬時轉(zhuǎn)染mTOR siRNA3 48h即可顯著抑制HCT116細(xì)胞活力(81.99±1.1277vs.97.5±0.6186，P＜0.05)，至轉(zhuǎn)染后72h，其作用更為明顯(56.42±1.4226vs.85.83±3.635，P＜0.01)。
4.流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期 [1]對數(shù)生長期細(xì)胞以無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24h使之同步化。
[2]SiRNA瞬時轉(zhuǎn)染，終濃度為100nM。設(shè)陰性序列對照、空白對照。于完全培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)48h。
[3]以0.125％胰蛋白酶消化收集細(xì)胞，PBS洗滌，4℃無水乙醇固定后，制成約106個/ml的單細(xì)胞懸液。
[4]與含1％RNA酶的Tris-HCL緩沖液(pH7.4)共同孵育10min。
[5]以碘化丙啶(PI)染色后，進行流式細(xì)胞儀檢測。
[6]根據(jù)相對不同DNA含量的細(xì)胞分布圖，擬合各周期細(xì)胞的百分率。每組復(fù)測3個樣品，試驗重復(fù)三次。數(shù)據(jù)以

±SD顯示。與陰性對照組(Negative Control，NC)相比較，*P＜0.01。
由圖4可知，siRNA3轉(zhuǎn)染后48h，S期細(xì)胞數(shù)量顯著減少，G0/G1期細(xì)胞數(shù)量顯著增多，mTOR siRNA3可將HCT116細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期(78.667±0.2887vs.94.79±0.1，P＜0.01)。
5.mTOR基因沉默誘發(fā)細(xì)胞凋亡 以mTOR siRNA3(100nM)及陰性對照序列(100nM)轉(zhuǎn)染HCT116細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后48h進行吖啶橙染色，AnnexinV/PI雙染色，以流式細(xì)胞術(shù)進行凋亡細(xì)胞定量。
吖啶橙(Acridine Orange，AO)染色 1000rpm/min離心5分鐘收集細(xì)胞，以PBS懸浮細(xì)胞團。取95μl細(xì)胞懸液與5μl吖啶橙染色液(pH6.8)混勻，點于潔凈載玻片上，蓋玻片封固后立即鏡檢。正?；罴?xì)胞DNA呈綠色，RNA呈紅色，凋亡細(xì)胞呈現(xiàn)致密濃染的黃色增強熒光(圖5A箭頭所示)。
Annexin-V/PI雙染色 于4℃以1300rpm/min離心5分鐘收集細(xì)胞；1ml預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞；加入200μlBinding buffer懸浮細(xì)胞，加入10μl FITC-Annexin-V和5μl PI，避光室溫溫育15～30分鐘；取細(xì)胞沉淀涂片，蓋玻片封固，立即鏡檢?；蚣尤?00μl binding buffer，使終體積為500μl，進行流式細(xì)胞儀檢測。早期凋亡細(xì)胞呈現(xiàn)綠色熒光，晚期凋亡細(xì)胞膜呈綠色熒光，核呈紅色熒光(圖5B)。在流式細(xì)胞術(shù)檢測圖譜，早期凋亡細(xì)胞位于第4象限(右下)。凋亡細(xì)胞的比例(％)以

±SD顯示，代表三次試驗結(jié)果。與陰性對照組(negative control，NC)比較，*P＜0.01(圖5C)。
多聚ADP-核糖聚合酶PARP的檢測 PARP(polyADP-ribose polymerase)是第一個被鑒定的在細(xì)胞凋亡中由Caspase-3和其他半胱氨酸蛋白酶降解、且最富特征性的蛋白酶解底物。PARP的蛋白酶解作為半胱氨酸蛋白酶激活的分子事件，被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡的一個早期分子標(biāo)志。將轉(zhuǎn)染后48h的HCT116細(xì)胞收集，并抽提細(xì)胞總蛋白，應(yīng)用Western blot方法檢測PARP蛋白剪切體(89kD)，具體操作步驟同前文，所用抗體如表2所示。PARP蛋白免疫印跡圖片及蛋白條帶密度半定量結(jié)果(89KDa/116KDa)如圖6所示。
由圖5可知，與VC及NC對照組相比較，轉(zhuǎn)染mTOR siRNA3 48h可誘導(dǎo)HCT116細(xì)胞發(fā)生顯著的凋亡的形態(tài)學(xué)改變(圖5A，B)；24h及48h的平均凋亡率分別為8.94％和36.5％，均顯著高于VC及NC對照組(P＜0.01，P＜0.01)(圖5C)。由圖6可知，在mTOR siRNA3作用48h及72h，PARP蛋白剪切體(89kD)的比例顯著增加，提示116kD的PARP被Caspase-3剪切生成89kD的片段，是細(xì)胞凋亡的重要特征。
表2實驗所用抗體及稀釋度

注CST，Cell Signaling Tech；WB，Western blot；IHC，Immunohistochemistry 實施例2體內(nèi)研究 本實施例的實驗材料 實驗動物BALB/c裸鼠，雄性，4周齡，近交系，購自中科院松江動物實驗基地(SCXK(滬)2003-0003)，飼養(yǎng)于上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院IVC動物實驗室(SYXK(滬)2003-0007)；SiRNA應(yīng)用表1所示siRNA3及陰性對照(NegativeControl)序列，由上海吉瑪公司(Shanghai GenePharma Co.，Ltd)進行甲氧修飾，并化學(xué)合成；轉(zhuǎn)染試劑in vivo-jetPEITM(201-50G，Polyplus Transfection，Illkirch，F(xiàn)rance)；試驗所用抗體見表2；TUNEL法細(xì)胞凋亡檢測試劑盒Roche，1684809a；50μl微量注射器上海天呈科技有限公司；游標(biāo)卡尺上海精密儀器儀表有限公司；超聲波細(xì)胞粉碎機(JY92-II)寧波新芝生物科技股份有限公司；石蠟切片機(RM21459)、包埋機(EG1140H)、自動染色機Leica公司。
1.mTOR siRNA3瞬時轉(zhuǎn)染抑制人大腸癌裸鼠移植瘤模型的生長 建立人大腸癌裸鼠移植瘤模型 復(fù)蘇人大腸癌細(xì)胞株HCT116，傳代培養(yǎng)至第三代，以0.125％胰蛋白酶消化細(xì)胞，離心收集，以PBS洗滌兩次，懸浮為單細(xì)胞懸液，密度為1.5×108個/ml。以微量注射器接種于裸鼠左側(cè)腋部皮下，100μl/只。接種后1w形成肉眼可見的癌結(jié)節(jié)。接種后第10天開始RNAi實驗。實驗動物分3組，每組6只，如下 [1]溶劑對照組(Vehicle control group，VC)瘤內(nèi)注射in vivo-jetPEI [2]陰性序列對照組(Negative control group，NC)瘤內(nèi)注射Negative Control siRNA [3]siRNA3干擾組(siRNA3 group)瘤內(nèi)注射mTOR siRNA3 siRNA瞬時轉(zhuǎn)染 [1]以5％GS分別溶解in vivo-jetPEI及SiRNA。
[2]將溶解后的in vivo-jetPEI加入SiRNA，in vivo-jetPEI與SiRNA的比例為1.6μl/10μg，總體積為30μl。渦旋混勻后室溫靜置15min。
[3]在層流超凈工作臺內(nèi)，以無菌微量注射器于腫瘤局部分3點注射，10μl/點。3組裸鼠分別瘤內(nèi)注射in vivo-jetPEI(1.6μl/30μl/只，VC組)、siRNANC(10μg/30μl/只，NC組)、mTOR siRNA3(10μg/30μl/只，RNAi組)。
[4]隔天重復(fù)上述操作一次，共轉(zhuǎn)染6次，末次轉(zhuǎn)染后第2天處死實驗動物。圖7A為首次瘤內(nèi)注射當(dāng)天及注射后第10天各組荷瘤裸鼠圖片。
腫瘤體積測算 應(yīng)用游標(biāo)卡尺于RNAi實驗的第1、5、10天測量腫瘤最大直徑(a)與最小直徑(b)，根據(jù)公式計算腫瘤體積。數(shù)據(jù)以

±SD表示(n＝6)。與VC組比較，*P＜0.05，**P＜0.01(圖7B)。
由圖7可知，mTOR siRNA3可顯著抑制裸鼠大腸癌移植瘤生長，siRNA3轉(zhuǎn)染組腫瘤的生長速度顯著低于轉(zhuǎn)染試劑對照組(VC)以及陰性序列對照組(NC)。轉(zhuǎn)染后第10天，siRNA3轉(zhuǎn)染組的腫瘤體積(746.99±171.525)顯著小于VC對照組(1333.765±220.427，P＜0.01)以及NC對照組(1489.37±449.684)(P＜0.01)，VC及NC對照組間無明顯差異。
2.mTOR基因沉默對腫瘤組織mTOR信號通路活性的影響 抽提腫瘤組織總蛋白 [1]觀察期結(jié)束后采用頸椎脫臼法處死并解剖實驗動物，獲得腫瘤組織，去除壞死組織，在液氮中將其碾碎成粉。
[2]將粉末轉(zhuǎn)移到冰上預(yù)冷的RIPA裂解緩沖液中，每300mg樣品加入1ml裂解液，勻漿器內(nèi)最大轉(zhuǎn)速勻漿30秒。
[3]將勻漿液置冰上，搖床上搖20min，150g離心5min，轉(zhuǎn)移上清到新的離心管。
[4]18,000rpm 4℃再次離心30min，取上清測定蛋白質(zhì)濃度。
Western blot 按照前文描述的Western blot步驟檢測腫瘤組織Pan-mTOR、Pan-p70s6K、Pho-p70s6K(Thr389)、Pan-4EBP1和Pho-4EBP1(Thr37/46)蛋白水平的變化，以GAPDH作為內(nèi)參照(圖8A)。所用抗體如表2所示。以GAPDH條帶密度為標(biāo)準(zhǔn)，進行Pan-mTOR標(biāo)準(zhǔn)化定量，以各自的總蛋白條帶密度為標(biāo)準(zhǔn)，進行Pho-p70s6K和Pho-4EBP1的標(biāo)準(zhǔn)化定量(圖8B)。與VC組比較，*P＜0.01。圖中所示數(shù)據(jù)代表三次實驗結(jié)果。
SABC法檢測腫瘤組織mTOR、p70s6K、4EBP1蛋白磷酸化水平 [1]至實驗觀察終點，以頸椎脫臼法處死實驗動物，解剖剝離腫瘤，以PBS緩沖液洗凈，去除壞死組織，以中性甲醛固定過夜 [2]按照常規(guī)方法取材、脫水、石蠟包埋，4μm連續(xù)切片，70℃烘烤2h [3]石蠟切片以二甲苯脫蠟，2次，10min/次。
[4]梯度酒精水化(100％，95％，75％，50％)，5min/次，蒸餾水漂洗5min。
[5]含0.1％Tween-20的0.01M PBS(pH7.4)漂洗2次，5min/次 [6]滴加過氧化氫甲醇液以消除內(nèi)源性過氧化物酶活性，室溫孵育20min [7]蒸餾水洗，PBS浸泡2次，5min/次 [8]0.01mol/L pH6.0檸檬酸緩沖液(CB)微波修復(fù)10min，冷卻至室溫，蒸餾水洗2次，PBS洗2次，3min/次 [9]滴加封閉用二抗宿主血清，室溫孵育20min [10]傾去血清，不洗，滴加一抗工作液，37℃溫箱孵育1h。
[11]PBS沖洗3次，5min/次 [12]滴加生物素標(biāo)記二抗，37℃溫箱孵育30min [13]PBS沖洗3次，5min/次 [14]滴加ABC復(fù)合物.37℃溫箱30min [15]PBS沖洗3次，5min/次 [16]滴加新鮮配制的BCIP/NBT液避光顯色5～30min，顯微鏡下觀察至出現(xiàn)陽性著色 [17]蒸餾水充分水洗終止染色 [18]核固紅復(fù)染胞核 [19]蒸餾水充分水洗 [20]梯度乙醇(50％，75％，95％，100％)脫水，5min/次 [21]二甲苯透明2次，10min/次 [22]晾干后中性樹膠封片 [23]應(yīng)用OLYMPUS 1X51倒置顯微鏡觀察并拍照。認(rèn)為細(xì)胞漿著色為陽性表達。(圖8C)VC組SABC法檢測結(jié)果，(圖8D)SiRNA3轉(zhuǎn)染組SABC法檢測結(jié)果。(a)Pho-mTOR(Ser2448)，(b)Pho-p70S6K1(Thr389)，(c)Pho-4EBP1(Thr37/46)。原始圖片放大倍數(shù)400×。
由圖8可知，與對照組相比，mTOR siRNA3轉(zhuǎn)染可顯著降低裸鼠大腸癌移植瘤組織中mTOR蛋白的表達量(mTORSiRNA3/mTORVC＝0.2301，P＜0.01)，以及p70s6K、4EBP1蛋白的磷酸化水平(Pho-p70s6KsiRNA3/Pho-p70s6KVC＝0.0845，P＜0.01；Pho-4EBP1siRNA3/Pho-4EBP1VC＝0.0602，P＜0.01)(圖8A，B)。SABC法檢測結(jié)果顯示，siRNA3轉(zhuǎn)染組腫瘤組織Pho-mTOR、Pho-p70s6K及Pho-4EBP1的表達量明顯低于VC對照組。各對照組間無明顯差異(圖8C，D)。提示mTOR siRNA3轉(zhuǎn)染可顯著抑制裸鼠大腸癌移植瘤組織中mTOR蛋白表達以及mTOR/p70s6K/4EBP1信號通路活性。
3.TUNEL法原位檢測細(xì)胞凋亡 [1]將石蠟組織切片置于染色缸中，二甲苯浸洗2次，每次5min [2]100％的乙醇浸洗2次，依次用95％、85％、70％和50％的乙醇各浸洗一次，每次3min，PBS浸洗5min [3]置于4％多聚甲醛溶液或含10％福爾馬林的PBS溶液(見備注1和2)中固定15min，PBS浸洗二次，每次5min [4]將載玻片取出置于一水平表面，用濾紙小心吸去載玻片上的多余液體，滴加100μL新配制的蛋白酶K工作溶液(見備注3)覆蓋在樣本區(qū)域上，室溫下放置10～30min，然后PBS浸洗5min [5]再置于4％多聚甲醛溶液或含10％福爾馬林的PBS溶液中固定5min，用PBS浸洗二次，每次5min [6]用濾紙小心吸去載玻片上的多余液體，滴加100μL的Equilibration Buffer于樣本區(qū)域上，室溫平衡5-10min [7]載玻片平衡時，將Biotin-11-dUTP置冰上解凍，同時配制TdT酶反應(yīng)液，于冰上保存待用 [8]用濾紙小心吸去樣本區(qū)域周圍的多余液體，滴加50μL的TdT酶反應(yīng)液于樣本區(qū)域上 [9]在反應(yīng)區(qū)域蓋上蓋玻片以確保反應(yīng)液分布均勻，于37℃、潮濕環(huán)境中反應(yīng)60-90min [10]去除蓋玻片，加入50μL 2×SSC溶液終止反應(yīng)，室溫放置15min，PBS浸洗三次，每次5min [11]用0.3％的H2O2浸洗3～5min，然后PBS浸洗三次，每次5min [12]滴加100μL稀釋的Streptavidin-AKP溶液于樣本區(qū)域上，室溫反應(yīng)3-5min [13]PBS浸洗三次，每次5min [14]于載玻片的樣本區(qū)域滴加100μL BCIP/NBT工作液(見備注10)，直到呈現(xiàn)淺藍(lán)色背景 [15]去離子水漂洗2次，用核固紅復(fù)染 [16]去離子水漂洗2～3次；依次用70％、90％、100％乙醇浸洗、每次3min，100％乙醇浸洗兩次 [17]二甲苯浸洗固定，樹脂封片，光學(xué)顯微鏡下進行觀察并拍照。藍(lán)色為凋亡細(xì)胞。
[18]每張切片取5個視野，應(yīng)用Image Pro Plus 5.0 software計算陽性細(xì)胞率，結(jié)果以

±SD表示。(圖9A)mTOR siRNA3作用組；(圖9B)VC及NC對照組；(圖9C)各組凋亡細(xì)胞計數(shù)結(jié)果(％)。原始圖片放大倍數(shù)400×。
由圖9可知，與對照組相比較，mTOR siRNA3轉(zhuǎn)染組細(xì)胞凋亡率顯著增高(23.7±7.496 vs.2.1±0.4，P＜0.01)。提示mTOR siRNA3轉(zhuǎn)染可誘導(dǎo)裸鼠大腸癌移植瘤組織發(fā)生顯著的凋亡。
序列表
<110>上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟醫(yī)院
房，靜遠(yuǎn)
張，燕捷
<120>一種小干擾RNA在制備治療大腸癌的藥物中的應(yīng)用
<160>8
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>21
<212>RNA
<213>人工序列
<400>1
gagaagaaau ggaagaaauu u21
<210>2
<211>21
<212>RNA
<213>人工序列
<400>2
auuucuucca uuucuucucu u21
<210>3
<211>21
<212>RNA
<213>人工序列
<400>3
ccaaagugcu gcaguacuau u21
<210>4
<211>21
<212>RNA
<213>人工序列
<400>4
uaguacugca gcacuuuggu u21
<210>5
<211>21
<212>RNA
<213>人工序列
<400>5
gagcaugccg ucaauaauau u21
<210>6
<211>21
<212>RNA
<213>人工序列
<400>6
uauuauugac ggcaugcucu u21
<210>7
<211>21
<212>RNA
<213>人工序列
<400>7
ggucugaacu gaaugaagau u21
<210>8
<211>21
<212>RNA
<213>人工序列
<400>8
ucuucauuca guucagaccu u2權(quán)利要求
1.一種小干擾RNA在制備治療大腸癌的藥物中的應(yīng)用，所述的小干擾RNA正義鏈的5’→3’方向的核苷酸序列如SEQ ID NO1所示，所述的小干擾RNA反義鏈的5’→3’方向的核苷酸序列如SEQ IDNO2所示。
2.一種小干擾RNA在制備治療大腸癌的藥物中的應(yīng)用，所述的小干擾RNA的正義鏈5’→3’方向的核苷酸序列如SEQ ID NO3所示，所述的小干擾RNA的反義鏈5’→3’方向的核苷酸序列如SEQ IDNO4所示。
3.一種小干擾RNA在制備治療大腸癌的藥物中的應(yīng)用，所述的小干擾RNA的正義鏈5’→3’方向的核苷酸序列如SEQ ID NO5所示，所述的小干擾RNA的反義鏈5’→3’方向的核苷酸序列如SEQ IDNO6所示。
4.一種小干擾RNA在制備治療大腸癌的藥物中的應(yīng)用，所述的小干擾RNA的正義鏈5’→3’方向的核苷酸序列如SEQ ID NO7所示，所述的小干擾RNA的反義鏈5’→3’方向的核苷酸序列如SEQ ID NO8所示。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種小干擾RNA在制備治療大腸癌的藥物中的應(yīng)用，這種小干擾RNA能夠抑制大腸癌細(xì)胞增殖活力，阻滯大腸癌細(xì)胞生長周期，誘導(dǎo)大腸癌細(xì)胞凋亡，下調(diào)大腸癌mTOR/p70S6K/4EBP1信號通路的活性，對裸鼠大腸癌移植瘤具有治療作用，解決了現(xiàn)有技術(shù)中采用化療來治療中晚期大腸癌，其療效以及患者預(yù)后均較差的技術(shù)問題。
文檔編號A61P35/00GK101606948SQ200810039008
公開日2009年12月23日 申請日期2008年6月16日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月16日
發(fā)明者房靜遠(yuǎn), 張燕捷 申請人:上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟醫(yī)院