專利名稱：提高雙色雙光子熒光成像層析深度的方法和裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明與生物醫(yī)學(xué)有關(guān)，涉及雙光子熒光成像，特別是一種提高雙色雙光子熒 光成像層析深度的方法和裝置，以適用于醫(yī)學(xué)中對生物組織內(nèi)部的檢測。
背景技術(shù)：
隨著生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的快速發(fā)展，人們對顯微成像技術(shù)提出了越來越高的要求，不 僅需要對物體表面形貌和光學(xué)特性進(jìn)行分析，而且更需要對它內(nèi)部的構(gòu)造進(jìn)行三維 觀察與處理，這就需要提高成像深度。近年來，雙光子激發(fā)熒光成像引起了人們廣泛的興趣(Denk W, Strickler丄 Webb W. ， Science, Vol. 248， 73 76, 1997)。雙光子激發(fā)(以下簡稱為TPE)是 一種三階非線性過程，這種非線性的特點(diǎn)，使得雙光子激發(fā)需要更高的激發(fā)功率， 并且熒光信號的強(qiáng)度與激發(fā)光強(qiáng)度的平方成正比，從而能夠?qū)㈦p光子熒光的產(chǎn)生局 域在焦點(diǎn)區(qū)域。因此雙光子成像具有天然的對三維樣品層析成像的能力。據(jù)報(bào)道， 利用鎖摸摻鈦藍(lán)寶石振蕩器作為激發(fā)光源能實(shí)現(xiàn)的最大層析深度為600 um (參見 KleinfeldD.， MitraP. P. ， Helmchen F. ， Denk W. ， Proc. Natl. Acad. Sci. Vol. 95， 15741, 1998)。 2003年，Denk等人使用摻鈦藍(lán)寶石的再生放大器作為雙光子熒光激 發(fā)的光源，對小鼠大腦的在體層析深度達(dá)到lOOOum，即1mm (Theer P. ， Hasan M. T.， DenkW. ， Opt. Lett. ， Vol. 28， 1022 1024， 2003)。進(jìn)一歩提高層析深度將對生 物醫(yī)學(xué)研究有非常大的意義。在高散射介質(zhì)中，激發(fā)光的強(qiáng)度隨著深度的增加呈指 數(shù)衰減，為了在更深處維持同樣的信號強(qiáng)度，激發(fā)光強(qiáng)度需隨深度指數(shù)增加。但隨 著激發(fā)光能量的提高，焦點(diǎn)之外區(qū)域的熒光發(fā)射也大大增強(qiáng)，這就不可避免地引起 了背景信號的增強(qiáng)，因此導(dǎo)致成像對比度的降低，從根本上限制了層析深度的提高。雙光子激發(fā)時(shí)，兩束光的波長不一定必須相等，兩束不同波長光激發(fā)的雙光子 過程稱為雙色雙光子激發(fā)(以下簡稱為TCTPE).雙色雙光子激發(fā)與雙光子激發(fā)具有 相同的物理機(jī)制，兩個(gè)激發(fā)波長需要滿足+1/入2，其中、為單光子 激發(fā)波長，、和入2為兩個(gè)激發(fā)波長。TCTPE熒光信號的強(qiáng)度/『oc AW )/2(/l2)。TCTPE與TPE的最大區(qū)別是其在成像中的光學(xué)特性不同，TCTPE的兩束激發(fā)光具有不 同的波長，屬于非相干激發(fā)，而TPE是相干激發(fā)過程。對于TCTPE ，只有兩束光交 迭區(qū)域才能激發(fā)熒光，兩束光非相干疊加，旁瓣要小的多，因此相對于TPE的信噪 比更高。在典型的雙色雙光子方案中，兩種不同波長的光成一定的角度》入射，分 別用兩個(gè)物鏡將兩束光聚焦于樣品中的同一點(diǎn)激發(fā)熒光。兩束光在焦點(diǎn)前后在空間上是完全分開的，只在焦點(diǎn)區(qū)域重疊，因此只有焦點(diǎn)區(qū)域能夠激發(fā)雙色雙光子熒光， 背景噪聲非常小。在高散射介質(zhì)中，指數(shù)增加激發(fā)光強(qiáng)以維持更深處TCTPE熒光信 號時(shí)，不會引起背景信號的大量增加。因此，雙色雙光子比雙光子成像有較高的信噪比，層析深度更深。但該方案也有其不足之處(1) 由于使用兩個(gè)物鏡，調(diào)節(jié)較困難；(2) 物鏡之間成一定的角度，這縮短了物鏡的有效工作距離；(3) 不容易對活體組織進(jìn)行觀測。 如何尋找一種合適的方案來提高層析深度是目前光學(xué)顯微成像領(lǐng)域面臨的重要問題。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明要解決的技術(shù)問題在于克服上述現(xiàn)有對生物組織深度層析成像方面的不 足，提供一種一種提高層析深度的雙色雙光子熒光成像方法和裝置，該發(fā)明可提高 高散射介質(zhì)中三維成像的層析深度，有效地消除背景熒光，提高信噪比，而且操作 方便。本發(fā)明的技術(shù)解決方案如下一種提高雙色雙光子熒光成像層析深度的方法，其特點(diǎn)是采用外光束包含內(nèi)光 束且同軸的雙色光通過同一個(gè)聚焦物鏡聚焦到樣品中激發(fā)樣品熒光的方法，內(nèi)部光束為一圓形光束，波長為A，半徑為r,，外部光束為一圓環(huán)形光束，波長為義2，內(nèi) 徑為r"夕卜徑為r2。一種雙色雙光子熒光成像裝置，其特點(diǎn)在于該裝置包括照明部分、探測收集部 分和掃描部分照明部分包括第一光源，波長為A，沿該第一光源輸出光束方向依次是半波片、第一縮束系統(tǒng)、延時(shí)線和第一雙色鏡，該第一雙色鏡與所述的第一光源的光束成45。放置；第二光源，波長為義2，沿該第二光源輸出光束方向依次是第二縮束系統(tǒng)、濾波 光瞳和第二雙色鏡，所述的第二光源的光束經(jīng)所述的濾波光瞳后成為一圓環(huán)形光束，所述的第二雙色鏡與所述的圓環(huán)形光束成45。放置；所述的第一雙色鏡和所述的第二雙色鏡相互平行，經(jīng)所述的第一雙色鏡反射的半徑為r,圓形光束，通過所述的第二雙色鏡時(shí)，并與由所述的第二雙色鏡反射的內(nèi) 徑為n，外徑為r2的圓環(huán)形光束同軸，形成圓形光束在內(nèi)，圓環(huán)形光束在外，且同 軸的雙色光，該同軸的雙色光經(jīng)聚焦物鏡聚焦后照射樣品；探測收集部分由收集透鏡、光電倍增管、光子計(jì)數(shù)器和計(jì)算機(jī)組成，所述的收 集透鏡置于所述的第一雙色鏡的透射光方向，光電倍增管放置在收集透鏡的焦平面收集熒光信號由光子計(jì)數(shù)器獲得光子數(shù)信號后輸入計(jì)算機(jī)；掃描部分包括置放樣品的三維平移臺，所述的計(jì)算機(jī)驅(qū)動并控制所述的三維平 移臺的移動，以實(shí)現(xiàn)對樣品的不同位置的掃描探測。所述的第一光源輸出光為垂直偏振，波長為1200nm。 所述的第二光源輸出光為水平偏振，波長為800nm。所述的第一雙色鏡是對波長為1200nm的光束高反，波長為480-640ran的光束高 透的雙色鏡。所述的第二雙色鏡是對波長為800nm的光束高反，波長為1200nm的光束高透， 波長為480-640nm的光束高透的雙色鏡。 本發(fā)明的技術(shù)效果所述的同軸的雙色光束充滿聚焦物鏡的整個(gè)入射光瞳，可充分利用物鏡的數(shù)值 孔徑。焦點(diǎn)前后，兩束光是完全分開的，只在焦點(diǎn)處重合。只有當(dāng)兩束光在時(shí)間和 空間上重合時(shí)才有熒光的產(chǎn)生，因此該方案可以從很大程度上避免焦點(diǎn)之外的熒光 背景，提高信噪比，從而提高層析深度。本發(fā)明使用同一個(gè)物鏡聚焦，比現(xiàn)有的雙 色雙光子方案易于實(shí)現(xiàn)，而且本發(fā)明裝置操作方便，比較靈活，可以獨(dú)立控制兩束 光的波長、強(qiáng)度和偏振等。


圖1為本發(fā)明方法的原理示意圖；圖2為本發(fā)明雙色雙光子熒光成像裝置具體實(shí)施例的光路圖；其中l(wèi)為第一 (1200nm)光源，2為第二 (800nm)光源，3為物鏡，4為熒光 素標(biāo)記的樣品，5為半波片，6為縮束系統(tǒng)(縮束比為5: 3)， 7為延時(shí)線，8為濾 波光瞳(中心遮擋比為1: 2)， 9為第一雙色鏡(對1200nm高反，480_640nm高透)， IO為第二雙色鏡(對800nm高反，1200nm高透，480-640nm高透)，11為三維平移 臺，12為收集透鏡，13為光電倍增管，14為光子計(jì)數(shù)器，15為計(jì)算機(jī)。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合實(shí)施例和附圖對本發(fā)明作進(jìn)一歩說明，但不應(yīng)以此限制本發(fā)明的保護(hù) 范圍。先請參閱圖1，圖1為本發(fā)明方法的原理示意圖，本發(fā)明提高雙色雙光子熒光 成像層析深度的方法，關(guān)鍵是采用外光束包含內(nèi)光束且同軸的雙色光通過同一個(gè)聚 焦物鏡3聚焦到樣品4中激發(fā)樣品熒光的方法，內(nèi)部光束為一圓形光束，波長為A， 半徑為r,，外部光束為一圓環(huán)形光束，波長為義2，內(nèi)徑為r,，外徑為^。再請參閱圖2，圖2為本發(fā)明雙色雙光子熒光成像裝置具體實(shí)施例的光路圖， 由圖可見，本發(fā)明雙色雙光子熒光成像裝置，包括照明部分、探測收集部分和掃描 部分照明部分包括第一光源1，波長為^，沿該第一光源1輸出光束方向依次是半波片5、第一 縮束系統(tǒng)6、延時(shí)線7和第一雙色鏡9，該第一雙色鏡9與所述的第一光源1的光束 成45°放置；第二光源2，波長為義2 ，沿該第二光源2輸出光束方向依次是第二縮束系統(tǒng)6'、 濾波光瞳8和第二雙色鏡10，所述的第二光源2的光束經(jīng)所述的濾波光瞳8后成為 一圓環(huán)形光束，所述的第二雙色鏡10與所述的圓環(huán)形光束成45。放置；所述的第一雙色鏡9和所述的第二雙色鏡10相互平行，經(jīng)所述的第一雙色鏡9 反射后成為半徑為r,的圓形光束，通過所述的第二雙色鏡10時(shí)，并與由所述的第 二雙色鏡10反射的內(nèi)徑為r,，外徑為r2的圓環(huán)形光束同軸，形成圓形光束在內(nèi)圓 環(huán)形光束在外且同軸的雙色光，該同軸的雙色光經(jīng)聚焦物鏡3聚焦后照射樣品4;探測收集部分由收集透鏡12、光電倍增管13、光子計(jì)數(shù)器14和計(jì)算機(jī)15組成， 所述的收集透鏡12置于所述的第一雙色鏡9的透射光方向，光電倍增管13放置在 收集透鏡12的焦平面收集熒光信號由光子計(jì)數(shù)器14獲得光子數(shù)信號后輸入計(jì)算機(jī)15;掃描部分包括置放樣品4的三維平移臺11，所述的計(jì)算機(jī)15驅(qū)動并控制所述 的三維平移臺11的移動，以實(shí)現(xiàn)對樣品4的不同位置的掃描探測。 所述的第一光源1輸出光為垂直偏振，波長為1200nm。 所述的第二光源2輸出光為水平偏振，波長為800nm。所述的第一雙色鏡9是對波長為1200nm的光束高反，波長為480-640nm的光束 高透的雙色鏡。所述的第二雙色鏡10是對波長為800nm的光束高反，波長為1200nm的光束高 透，波長為480-640nm的光束高透的雙色鏡。本實(shí)施例中以800ran和1200nm兩束光 作為激發(fā)光源，如圖2所示，系統(tǒng)主要包括照明部分，掃描部分和探測收集部分。 1200nm光源1輸出光為垂直偏振，光斑半徑為2. 5mm，利用半波片5改變?yōu)樗狡?振，通過第一縮束系統(tǒng)6準(zhǔn)直縮束，使光斑半徑變?yōu)?. 5mm。第二光源2為800nm 光源，輸出光為水平偏振，半徑為5mm。經(jīng)第二縮束系統(tǒng)6'變?yōu)?mm。通過濾波光 瞳8將800皿光變?yōu)榄h(huán)形光束，其內(nèi)徑為1.5mm，外徑為3mm。調(diào)節(jié)第一雙色鏡9 和第二雙色鏡10的位置，使兩束光同軸互補(bǔ)，經(jīng)同一聚焦物鏡3聚焦入樣品4中， 所用聚焦物鏡3數(shù)值孔徑為0. 7，通光孔徑為6mm (直徑)，光束可以充滿整個(gè)通光 孔徑，有效利用其數(shù)值孔徑。調(diào)節(jié)延時(shí)線7使兩束光等光程，在焦點(diǎn)處激發(fā)雙色雙 光子熒光。探測收集部分主要包括收集透鏡12、光電倍增管13、光子計(jì)數(shù)器14和 計(jì)算機(jī)15?；竟ぷ鬟^程為兩束光經(jīng)縮束、濾波整形后，經(jīng)由第一雙色鏡9和第二雙色 鏡10變?yōu)橥S互補(bǔ)的兩束光，通過聚焦物鏡3聚焦到樣品4中，照明光所激發(fā)的熒光再次被聚焦物鏡3收集，經(jīng)由第二雙色鏡10和第一雙色鏡9、收集透鏡12，進(jìn)入 光電倍增管13。接著，在計(jì)算機(jī)的控制下，通過三維平移臺11掃描樣品的不同位 置，同時(shí)根據(jù)光子計(jì)數(shù)器14記錄的數(shù)據(jù)，計(jì)算機(jī)15可以重組出樣品的顯微圖象。 實(shí)施中，我們以光束行進(jìn)方向作為Z軸，以垂直光束行進(jìn)方向作為X-Y平面，將樣 品4的入射表面和聚焦物鏡3焦點(diǎn)之間的距離定義為層析深度d。改變深度d，依次 獲取生物樣品在不同d位置處的X-Y成像。實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明很大程度上避免焦點(diǎn)之外的熒光背景，提高了信噪比，從而 提高層析深度。本發(fā)明使用同一個(gè)物鏡聚焦，操作方便，比較靈活，可以獨(dú)立控制 兩束光的波長、強(qiáng)度和偏振等。
權(quán)利要求
1、一種提高雙色雙光子熒光成像層析深度的方法，其特征是采用外光束包含內(nèi)光束且同軸的雙色光通過同一個(gè)聚焦物鏡(3)聚焦到樣品(4)中激發(fā)樣品熒光的方法，內(nèi)部光束為一圓形光束，波長為λ1，半徑為r1，外部光束為一圓環(huán)形光束，波長為λ2，內(nèi)徑為r1，外徑為r2。
2、 一種實(shí)施權(quán)利要求1所述的方法的雙色雙光子熒光成像裝置，其特征在于該 裝置包括照明部分、探測收集部分和掃描部分照明部分包括第一光源(1)，波長為A，沿該第一光源(1)輸出光束方向依次是半波片(5)、第一縮束系統(tǒng)(6)、延時(shí)線(7)和第一雙色鏡(9)，該第一雙色 鏡(9)與所述的第一光源(1)的光束成45。放置；第二光源(2)，波長為義2，沿 該第二光源(2)輸出光束方向依次是第一縮束系統(tǒng)(6')、濾波光瞳(8)和第二雙 色鏡(10),所述的第二光源(2)的光束經(jīng)所述的濾波光瞳(8)后成為一圓環(huán)形光 束，所述的第二雙色鏡(10)與所述的圓環(huán)形光束成45°放置；所述的第一雙色鏡 (9)和所述的第二雙色鏡(10)相互平行，經(jīng)所述的第一雙色鏡(9)反射的半徑為 r,圓形光束，通過所述的第二雙色鏡(10)時(shí)，并與由所述的第二雙色鏡(10)反 射的內(nèi)徑為r,，外徑為r2的圓環(huán)形光束同軸，形成圓形光束在內(nèi)，圓環(huán)形光束在外， 且同軸的雙色光，該同軸的雙色光經(jīng)聚焦物鏡(3)聚焦后照射樣品(4);探測收集部分由收集透鏡(12)、光電倍增管(13)、光子計(jì)數(shù)器(14)和計(jì)算 機(jī)(15)組成，所述的收集透鏡(12)置于所述的第一雙色鏡(9)的透射光方向， 光電倍增管(13)放置在收集透鏡(12)的焦平面收集熒光信號由光子計(jì)數(shù)器(14) 獲得光子數(shù)信號后輸入計(jì)算機(jī)(15);掃描部分包括置放樣品(4)的三維平移臺(11)，所述的計(jì)算機(jī)(15)驅(qū)動并 控制所述的三維平移臺(11)的移動，以實(shí)現(xiàn)對樣品(4)的不同位置的掃描探測。
3、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的雙色雙光子熒光成像裝置，其特征在于所述的第一光 源(1)輸出光為垂直偏振，波長為1200nm。
4、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的雙色雙光子熒光成像裝置，其特征在于所述的第二光 源(2)輸出光為水平偏振，波長為800nm。
5、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的雙色雙光子熒光成像裝置，其特征在于所述的第一雙 色鏡(9)是對波長為1200nm的光束高反，波長為480-640nm的光束高透的雙色鏡。
6、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的雙色雙光子熒光成像裝置，其特征在于所述的第二 雙色鏡(10)是對波長為S00nm的光束高反，波長為1200nm的光束高透，波長為 480-640nm的光束高透的雙色鏡。
全文摘要
一種提高雙色雙光子熒光成像層析深度的方法和裝置，采用外光束包含內(nèi)光束且同軸的雙色光通過同一個(gè)聚焦物鏡(3)聚焦到樣品(4)中激發(fā)樣品熒光的方法，利用兩種不同頻率的飛秒脈沖激光作為激發(fā)光源，一束橫截面為環(huán)形，一束橫截面為圓形，兩者同軸互補(bǔ)，這樣兩束光只在焦點(diǎn)區(qū)域重合，通過延時(shí)線調(diào)整兩束光在焦點(diǎn)處等光程激發(fā)雙光子熒光信號，從而有效消除焦點(diǎn)之外的背景信號，本發(fā)明裝置可有效地提高三維成像的層析深度，消除背景熒光，提高信噪比，而且操作方便。
文檔編號A61B5/00GK101248986SQ20081003596
公開日2008年8月27日 申請日期2008年4月11日 優(yōu)先權(quán)日2008年4月11日
發(fā)明者喬玲玲, 徐至展, 毛崢樂, 琛 王, 亞 程 申請人:中國科學(xué)院上海光學(xué)精密機(jī)械研究所