專利名稱：肌肉損傷抑制組合物的制作方法
的組合物，更詳細(xì)的是，涉及以醋酸菌或食醋的脂溶性有機(jī)溶劑提取 物作為有效成分的肌肉損傷抑制組合物。而且，本發(fā)明還涉及以醋酸
菌的堿性穩(wěn)定脂質(zhì)，堿性穩(wěn)定脂質(zhì)中的N-?；淝拾贝?(N-acylsphinganine)， 二氫鞘氨醇，氨基脂質(zhì)或薛類化合物作為有效 成分的肌肉損傷抑制組合物。
背景技術(shù)：
家務(wù)勞動(dòng)，園藝勞動(dòng)，上班目的的步行等日常生活的活動(dòng)，閑暇 時(shí)進(jìn)行的趣味和休閑活動(dòng)等所有身體活動(dòng)在維持健康上是有用的，人 們認(rèn)為尤其是體育活動(dòng)等運(yùn)動(dòng)對(duì)健康維持提高更為有益，不僅對(duì)比賽 者，而且也普及到一般人。
但是，也存在如果進(jìn)行過(guò)度的體育活動(dòng)等運(yùn)動(dòng)而損傷肌肉的情況， 有時(shí)也發(fā)生反效果的情況。
已知這種肌肉損傷由運(yùn)動(dòng)超負(fù)荷而引起， 一旦一部分肌肉中發(fā)生 損傷，損傷的肌肉的細(xì)胞分泌細(xì)胞素和趨化因子(Chemokine)，促進(jìn)中 性白血球和巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)。因此，人們認(rèn)為由于中性白血球增加而 生成的活性氧種類，以及由中性白血球釋放的髓過(guò)氧化物酶(以下也稱 為MPO)的作用生成的次氯酸等，對(duì)周邊肌肉造成損傷等擴(kuò)大作用導(dǎo)致 了伴隨炎癥的癥狀的發(fā)生。這可以通過(guò)研究MPO活性，了解運(yùn)動(dòng)超負(fù)荷 而導(dǎo)致的肌肉損傷程度。
此外，通過(guò)研究細(xì)胞素的其中一種白細(xì)胞介素-6(以下也稱為 IL-6)，趨化因子一種的與中性白血球的游走相關(guān)的中性白血球趨化性 因子-1 (以下也稱為CXCL-1)等的分泌量和基因表達(dá)量，也可以了解肌肉的損失程度。
對(duì)于這種伴隨肌肉損傷的炎癥，已知有保泰松(phenylbutazone)， 水楊酸衍生物，茚甲新(indomethacin)，苯乙酸等非類固醇類消炎物 質(zhì)等。
但是，這種非類固醇類消炎物質(zhì)的作用盡管有助于從炎癥發(fā)生的 恢復(fù)治療，但并不具有抑制防止肌肉損傷的作用。
而且，該非類固醇類消炎物質(zhì)會(huì)導(dǎo)致肌粘膜的損傷和胃潰瘍等對(duì) 消化器官的副作用。
因此，為了抑制這些副作用，人們還提出了在該非類固醇類消炎 物質(zhì)中混合磷脂的組合物(例如，參照專利文獻(xiàn)l),但未必能夠滿足。
為了期待更有效的作用，需要具有防止肌肉損傷的功能且副作用 盡量少的安全性高的物質(zhì)，例如通過(guò)維生素E消除由于運(yùn)動(dòng)超負(fù)荷而 形成的活性氧種類可以抑制肌肉損傷的擴(kuò)大作用(例如，參照非專利文 獻(xiàn)l)。
而且，人們還提出了番茄紅素(lycopene)等也抑制肌肉蛋白質(zhì) 分解，具有筋肉損傷預(yù)防作用(例如，參照非專利文獻(xiàn)2)。
但是，盡管這些物質(zhì)安全性更高，但也無(wú)法充分滿足抑制預(yù)防肌 肉損傷的作用。
因此，需要開(kāi)發(fā)安全性高，效果更強(qiáng)的肌肉損傷抑制組合物。 專利文獻(xiàn)l:特開(kāi)昭55-89225號(hào)公報(bào) 專利文獻(xiàn)2:特開(kāi)2004-59518號(hào)公報(bào)
非專利文獻(xiàn)l:東北J. Exp.Med. (Tohoku J.Exp.Med.)， 198巻， p47-53, 2002年

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明要解決的問(wèn)題
本發(fā)明的目的在于解決上述問(wèn)題，提供安全性高且肌肉損傷抑制 效果更強(qiáng)的肌肉損傷抑制組合物。 用于解決問(wèn)題的手段鑒于上述問(wèn)題，本發(fā)明人著眼于一直作為釀造制醋菌等使用的認(rèn) 識(shí)到高安全性的醋酸菌。此外，已知醋酸菌自古以來(lái)就與人們的飲食
生活深深相關(guān)，在食醋制造之外，例如歐洲的傳統(tǒng)食品里海酸奶 (Caspian sea yogurt)中也含醋酸菌，也有長(zhǎng)期的食用歷史。
而且，由于醋酸菌在食醋發(fā)酵工序中的發(fā)酵終止后，經(jīng)過(guò)過(guò)濾， 再被廢棄，因此可以便宜地獲得。
此外，本發(fā)明人著眼于通過(guò)醋酸菌發(fā)酵而制造的食醋，食醋是自 古以來(lái)備受青睞的酸味調(diào)味料，現(xiàn)有米醋，谷物醋，黑醋，糙米醋， 蘋果醋和葡萄醋等水果醋，醇醋等。
本發(fā)明人進(jìn)行了積極的研究，其結(jié)果是在用脂溶性有機(jī)溶劑從上 述醋酸菌或食醋中提取獲得的脂溶性有機(jī)溶劑提取物中發(fā)現(xiàn)了肌肉損 傷抑制作用，從而完成了本發(fā)明。
此外，本發(fā)明人在醋酸菌的脂溶性有機(jī)溶劑提取物中所含的堿性 穩(wěn)定脂質(zhì)中，構(gòu)成堿性穩(wěn)定脂質(zhì)的N-?；淝拾贝?，二氫鞘氨醇， 氨基脂質(zhì)(或稱"氨基脂類")，萜類化合物(terpenoid compounds) 等中也發(fā)現(xiàn)了肌肉損傷抑制作用，從而完成了本發(fā)明。
即，權(quán)利要求l中涉及的本發(fā)明提供肌肉損傷抑制組合物，其特 征在于含有醋酸菌的脂溶性有機(jī)溶劑提取物作為有效成分。
而且，權(quán)利要求2中涉及的本發(fā)明提供權(quán)利要求l所述的肌肉損傷 抑制組合物，其特征在于所述脂溶性有機(jī)溶劑為乙酸乙酯。
此外，權(quán)利要求3中涉及的本發(fā)明提供權(quán)利要求1所述的肌肉損傷 抑制組合物，其特征在于所述脂溶性有機(jī)溶劑提取物是堿性穩(wěn)定脂質(zhì)。
此外，權(quán)利要求4中涉及的本發(fā)明提供權(quán)利要求3所述的肌肉損傷 抑制組合物，其特征在于所述堿性穩(wěn)定脂質(zhì)為N-?；淝拾贝?。
此外，權(quán)利要求5涉及的本發(fā)明提供權(quán)利要求3所述的肌肉損傷抑 制組合物，其特征在于所述堿性穩(wěn)定脂質(zhì)為二氫鞘氨醇。
此外，權(quán)利要求6涉及的本發(fā)明提供權(quán)利要求3所述的肌肉損傷抑 制組合物，其特征在于所述堿性穩(wěn)定脂質(zhì)為氨基脂質(zhì)。
此外，權(quán)利要求7涉及的本發(fā)明提供權(quán)利要求3所述的肌肉損傷抑制組合物，其特征在于所述堿性穩(wěn)定脂質(zhì)為薛類化合物。
此外，權(quán)利要求8涉及的本發(fā)明提供肌肉損傷抑制組合物，其特 征在于含有食醋的脂溶性有機(jī)溶劑提取物作為有效成分。
此夕卜，權(quán)利要求9涉及的本發(fā)明提供權(quán)利要求8所述的肌肉損傷抑 制組合物，其特征在于所述脂溶性有機(jī)溶劑為乙酸乙酯。
發(fā)明的效果
本發(fā)明的醋酸菌或食醋的脂溶性有機(jī)溶劑提取物通過(guò)經(jīng)口攝取 可以發(fā)揮強(qiáng)肌肉損傷抑制作用。此外，本發(fā)明的醋酸菌的脂溶性有機(jī) 溶劑提取物中所含的堿性穩(wěn)定脂質(zhì)，以及構(gòu)成堿性穩(wěn)定脂質(zhì)的N-?；?二氫鞘氨醇，二氫鞘氨醇，氨基脂質(zhì)，碎類化合物通過(guò)經(jīng)口攝取，也 可以發(fā)揮強(qiáng)肌肉損傷抑制作用。
因此，本發(fā)明可以提供安全性高而且肌肉損傷抑制效果強(qiáng)的肌肉 損傷抑制組合物，通過(guò)經(jīng)口攝取作為食品等形式的本發(fā)明中涉及的肌 肉損傷抑制組合物，可以期待能夠預(yù)防體育活動(dòng)和激烈運(yùn)動(dòng)中肌肉損 傷和伴隨日常生活中的身體活動(dòng)的輕度的肌肉損傷。


圖l:是表示本發(fā)明的輕度運(yùn)動(dòng)量下的心臟，比目魚肌，腓腸肌
(gastrocnemius muscle)的MP0活性的圖。
圖2:是表示本發(fā)明的大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)量下的心臟的MPO活性的圖。
圖3:是表示本發(fā)明的醋酸菌脂溶性提取物，醋酸菌堿性穩(wěn)定脂質(zhì)的肌
肉損傷抑制效果的圖。
圖4:是表示本發(fā)明的N-?；淝拾贝迹淝拾贝?，氨基脂質(zhì)和辟 類化合物肌肉損傷抑制效果的圖。
具體實(shí)施例方式
以下，對(duì)本發(fā)明進(jìn)^f亍詳細(xì)的說(shuō)明。
作為本發(fā)明中使用的醋酸菌，沒(méi)有特別限制，例如，可以例舉屬 于葡糖酸醋桿菌屬(Gluconacetobacter)，葡糖桿菌屬(Gluconobacter)， 醋桿菌屬(Acetobacter) ， Asaia屬或Acidomonas 屬等的醋酸菌。
更詳細(xì)的是，首先，作為葡糖酸醋桿菌屬的醋酸菌，可以例舉漢 氏葡糖酸醋桿菌(Gluconacetobacter hansenii)，重氮營(yíng)養(yǎng)葡糖酸醋 軒菌(Gluconacetobacter diazotrophicus) ， Gluconacetobacter intermedius ， Gluconacetobacter sacchari , 木糖葡糖酸醋桿菌 (Gluconacetobacter xylinus), 歐洲 葡糖酸醋桿菌 (Gluconacetobacter europaeus), 月l從葡萄酸醋桿菌 (Gluconacetobacter oboediens)等。
接著，作為葡糖桿菌屬(Gluconobacter)的醋酸菌，可以例舉弗 氏葡萄桿菌(Gluconobacter frateurii)， 蠟狀葡糖桿菌 (Gluconobacter cerinus)等。
此外，作為醋桿菌屬(Acetobacter)的醋酸菌，可以例舉 Acetobacter tropicalis, Acetobacter indones iens is ， Acetobacter syzygii， Acetobacter cibinongensis, Acetobacter orientalis， 巴氏醋桿菌 (Acetobacter pasteurianus) ， Acetobacter orleanensis, Acetobacter lovaniensis， 醋化醋桿菌(Acetobacter aceti), 果實(shí)醋桿菌(Acetobacter pomorum)等。
j);匕夕卜，作為Asaia屬的醋酸菌,可k乂命J舉Asaia bogorensis， Asaia siamensis等。
而且,作為Acidomonas屬的醋酸菌，可以例舉Acidomonas methanol ica等。
此外，作為醋酸菌，除上述外，還可以適當(dāng)使用可以在食醋制造 或酸奶等發(fā)酵食品中使用的醋酸菌，從自然界分離的并且已經(jīng)在微生 物保藏機(jī)構(gòu)中保藏的可以發(fā)放的保藏菌林等。
而且，由于醋酸菌可以在醋酸發(fā)酵中^f吏用而且在椰杲(Natade coco)，里海酸奶，紅茶菌等中有食用歷史，因此認(rèn)為其安全性高，尤 其是，由于在食醋發(fā)酵工序中在發(fā)酵后通過(guò)過(guò)濾而被分離，再被廢棄， 因此還可以大量便宜地獲得。
7此外，本發(fā)明中可使用的食醋沒(méi)有特別限制，可以例舉例如米醋， 谷物醋，黑醋，糙米醋，蘋果醋和葡萄醋等水果醋，醇醋等，其中的 谷物醋由于以小麥，玉米，米等谷物作為原料來(lái)制造，被廣泛食用， 比較^f更宜，因而優(yōu)選。
本發(fā)明中，如權(quán)利要求1或8中所述，使用含有用脂溶性有機(jī)溶劑 從上述的醋酸菌或食醋中提取的有效成分的提取物構(gòu)成肌肉損傷抑制 組合物，此外，如權(quán)利要求3-7所述，使用從脂溶性有機(jī)溶劑提取物中 提取的堿性穩(wěn)定脂質(zhì)，或該堿性穩(wěn)定脂質(zhì)中的N-酰基二氫鞘氨醇，二 氫鞘氨醇，氨基脂質(zhì)，辟類化合物等構(gòu)成肌肉損傷抑制組合物，但也 可以例如含有這些成分作為有效成分，也可以使用經(jīng)破碎處理的醋酸菌等。
而且，醋酸菌的破碎處理可以按照常規(guī)方法，例如，用超聲波式 破碎才幾，法式?jīng)_床(French press)等高壓式石皮碎機(jī)來(lái)實(shí)施。
本發(fā)明中使用的脂溶性有機(jī)溶劑被定義為例如乙酸乙酯，苯酚， 正丁醇等疏水性有機(jī)溶劑，或者組合了這些疏水性有機(jī)溶劑和丙酮， 乙醇，甲醇，丙醇，異丙醇，丁醇等親水性有機(jī)溶劑的混合溶劑或者 含有這些物質(zhì)的水溶液。其中，如權(quán)利要求2或9所述，優(yōu)選極性呈中 性的乙酸乙酯、或其混合溶劑。
而且，醋酸菌或食醋來(lái)源的脂溶性有機(jī)溶劑提取物的制備可以用 上述脂溶性有機(jī)溶劑直接提取，特別優(yōu)選的是，在制備來(lái)自于醋酸菌 的脂溶性有機(jī)溶劑提取物時(shí)，在用脂溶性有機(jī)溶劑提取之前增加一個(gè) 預(yù)先通過(guò)用丙酮等親水性有機(jī)溶劑處理醋酸菌懸浮液而除去逐漸析出 的物質(zhì)的工序。
醋酸菌來(lái)源的堿性穩(wěn)定脂質(zhì)可以通過(guò)以下方式制備使用乙醇， 丙酮，己烷，氯仿，甲醇，乙酸乙酯等的1種或2種以上構(gòu)成的有機(jī)溶 劑，從醋酸菌中提取脂類，對(duì)提取的脂質(zhì)成分，實(shí)施弱堿性分離處理 除去磷脂。如果考慮食品用途中的安全性，理想的是低極性溶劑，作 為提取溶劑合適的是己烷或丙酮等。
這樣獲得的醋酸菌的堿性穩(wěn)定脂質(zhì)中包括作為含有成分的N-?；淝拾贝迹淝拾贝?，氨基脂質(zhì)，碎類化合物，脂肪酸等。這 些化合物一般作為醋酸菌的菌體來(lái)源的膜脂質(zhì)，包含于屬于醋桿菌屬， 葡糖桿菌屬，葡糖酸醋桿菌屬等中的醋酸菌中，該化合物的詳細(xì)情況 如下。
即，作為N-?；淝拾贝?，包括N-2'-羥棕櫚酰-二氫鞘氨醇， 0-1-葡糖苷酸基-N-2'-羥棕櫚酰-二氫鞘氨醇，N-順式-vaccenoyl-二 氫鞘氨醇，0-1-葡糖苷酸基-N-棕櫚酰-二氳鞘氨醇等。
此外，作為氨基脂質(zhì)，包括例如鳥氨酰?；撬嶂|(zhì)3-(棕櫚酰)-羥棕櫚酰-鳥氨酰-?；撬?，鳥氨酸脂質(zhì)3-(棕櫚酰)-羥棕櫚酰-鳥氨酸， 溶血(lyso)-鳥氨酸脂質(zhì)3-輕棕櫚酰-鳥氨酸等。
此外，作為碎類化合物(藿烷類hopanoids)化合物，包括例如 四羥基細(xì)菌藿烷(Tetrahydroxybacteriohopane) (C35-辟烯醇)，高 泛烷-22-醇，hop-22 (29)-烯等。
而且，作為脂肪酸，包括例如順式-ll-十八碳烯酸等。
N-酰基二氫鞘氨醇是指包含于堿性穩(wěn)定脂質(zhì)中的二氫鞘氨醇脂 質(zhì)的一部分，是在鞘氨醇(sphingoid)堿基二氫鞘氨醇上結(jié)合了脂肪酸 的總稱為神經(jīng)酰胺的化合物， 一般用以下化學(xué)式(l)表示。而且，式(l) 中-CO-R表示?；?。式(l)中，已知構(gòu)成?；闹舅崾橇u基脂肪酸或 普通脂肪酸，飽和烴或不飽和烴，直鏈狀或分支狀的，碳原子數(shù)為2-30 以下的脂肪酸。
而且，作為醋酸菌來(lái)源的N-?；淝拾贝迹_認(rèn)的是構(gòu)成?；?的作為脂肪酸的肉豆蔻酸，軟脂酸，硬脂酸，棕櫚油酸，油酸，11-十八碳烯酸，亞油酸，2-羥基肉豆蔻酸，2-羥基軟脂酸等，尤其是N-2'-羥基棕櫚酰-二氫鞘氨醇，N-棕櫚酰-二氫鞘氨醇，N-順式-vaccenoyl-二氫鞘氨醇占其組成比的多數(shù)(例如，參照《巖手大學(xué)大學(xué)院連合農(nóng)學(xué)研究科博士論文》，后藤英嗣著，p. 11-41，2001年)。
以上化合物根據(jù)醋酸菌的種類而其含量比不同，在醋酸菌所屬的 革蘭氏陰性菌中只作為膜脂質(zhì)的主要構(gòu)成成分存在，不作為革蘭氏陽(yáng) 性菌和真核生物等其它生物的脂質(zhì)成分存在，或者為極微量的化合物 類。
從醋酸菌或食醋中用有機(jī)溶劑提取肌肉損傷抑制物質(zhì)制造肌肉 損傷抑制組合物可以按照常規(guī)方法。例如，對(duì)醋酸菌適當(dāng)超聲波石皮碎 后，用有機(jī)溶劑溶液提取肌肉損傷抑制物質(zhì)后再濃縮。
食醋，同樣也用有機(jī)溶劑溶液提取肌肉損傷抑制物質(zhì)后再濃縮。 還可以將這些濃縮物直接作為肌肉損傷抑制組合物使用。而且，通過(guò) 液相層析和逆流分布法等分離純化肌肉損傷抑制物質(zhì)，并且收集這些 物質(zhì)，將其作為肌肉損傷抑制物質(zhì)使用。
此外，聯(lián)合使用例如維生素E，輔酶Q10等抗氧化物質(zhì)，氨基酸， 大豆蛋白，乳蛋白等也可以形成本發(fā)明的肌肉損傷抑制組合物。
而且，本發(fā)明的肌肉損傷抑制組合物的形態(tài)，可以作為溶解于水、 或醇，含水醇等中的溶液的形態(tài)，以及通過(guò)對(duì)其進(jìn)行干燥獲得的粉末 的形態(tài)，或者通過(guò)將其成形獲得的片劑的形態(tài)等來(lái)使用。此外，運(yùn)動(dòng) 輔助食品，飲料食品，藥品等的形態(tài)沒(méi)有特別限制。
作為飲料食品的形態(tài)，具體可以例舉混合于以西紅柿，胡蘿卜等 作為原料的蔬菜汁，蘋果，菠蘿，葡萄柚，橙子，桃等為原料的果汁， 或者蔬菜汁和果汁的混合品，醇飲料，牛奶，酸奶等乳制品，運(yùn)動(dòng)飲 料，咖啡，紅茶，綠茶，烏龍茶等茶制品，或者黑醋，谷物醋，米醋， 糙米醋，黑醋，醇醋，蘋果醋和葡萄醋等以水果作為原料的水果醋， 含有蔬菜作為原料的野菜醋等的食醋制品，糖果，口香糖，果凍，冰 淇淋，小甜餅等點(diǎn)心；主食面包，米飯，面等主食等中。
通過(guò)在上述形態(tài)中混合本發(fā)明的肌肉損傷抑制組合物，含有其它 天然物來(lái)源的健康功能成分，可以預(yù)期累加效應(yīng)乃至協(xié)同效應(yīng)。
作為本發(fā)明的肌肉損傷抑制組合物的醋酸菌脂溶性有機(jī)溶劑提 取物，醋酸菌堿性穩(wěn)定脂質(zhì)，N-?；淝拾贝?，二氫鞘氨醇，氨基
10脂質(zhì)或薛類化合物或食醋脂溶性有機(jī)溶劑提取物的施用量為成人每天
0. 001mg-100g，優(yōu)選O. lmg-10g。其中，按成人每天不到0. OOlmg的施 用量，無(wú)法充分抑制肌肉損傷。
本發(fā)明的肌肉損傷抑制組合物含有醋酸菌脂溶性有機(jī)溶劑提取 物，醋酸菌堿性穩(wěn)定脂質(zhì)，N-?；淝拾贝迹淝拾贝?，氨基脂 質(zhì)或薛類化合物或食醋脂溶性有機(jī)溶劑提取物作為有效成分，在與其 它的各種原料混合均勻后，還可以根據(jù)需要混合表面活化劑等，來(lái)謀 求穩(wěn)定化。
作為這些表面活性劑，可以使用山梨聚糖脂肪酸酯，甘油脂肪酸 酯，丙二醇脂肪酸酯，蔗糖脂肪酸酯和卵磷脂等。
本發(fā)明的肌肉損傷抑制組合物的適用部位只要是肌肉沒(méi)有特別 限定，可以例舉比目魚肌，腓腸肌等骨骼肌，平滑肌，呼吸肌，心肌 等，特別優(yōu)選的是骨骼肌的比目魚肌，腓腸肌和心肌。
本發(fā)明的肌肉損傷抑制組合物可以發(fā)揮效果的運(yùn)動(dòng)量沒(méi)有特別 限制，可以是人的最大攝取氧量(VO2max)80y。以下的運(yùn)動(dòng)量，但尤為優(yōu) 選40-60%的運(yùn)動(dòng)量。
對(duì)于本發(fā)明中肌肉損傷抑制效果，可以通過(guò)以下試驗(yàn)方法確認(rèn)。
即，使用通過(guò)踏車使大鼠行走運(yùn)動(dòng)的系統(tǒng)。踏車是人們?cè)谝员寂?和行走作為目的使用的跑步機(jī)，本發(fā)明中，是指大鼠專用的小型化機(jī) 械。這種踏車與以往通過(guò)強(qiáng)制游泳進(jìn)行的運(yùn)動(dòng)方法不同，可以對(duì)肌肉 進(jìn)行物理負(fù)荷，因此可以更嚴(yán)密地驗(yàn)證運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生的效果。
本發(fā)明中，作為運(yùn)動(dòng)時(shí)的肌肉損傷的指標(biāo)，在通過(guò)踏車使之行走 運(yùn)動(dòng)的系統(tǒng)中，使用存在于吞噬細(xì)胞之一的中性白血球的顆粒的MPO。 作為該理由，已知由于如果發(fā)生由于運(yùn)動(dòng)負(fù)荷造成的肌肉損傷，中性 白血球增加，中性白血球中的MPO釋放到細(xì)胞外，與生物體內(nèi)的過(guò)氧化 氬反應(yīng)，生成反應(yīng)性高的次氯酸，因而再對(duì)周邊組織引發(fā)傷害，通過(guò) 測(cè)定MPO活性可以了解由于運(yùn)動(dòng)負(fù)荷而造成的損傷程度。
此外，通過(guò)用肌管細(xì)胞的系統(tǒng)驗(yàn)證細(xì)胞水平的本發(fā)明的損傷抑制 效果。所謂肌管細(xì)胞，其在使成肌細(xì)胞分化誘導(dǎo)的細(xì)胞中呈肌肉纖維樣形態(tài)。而且，該方法比使用動(dòng)物的試驗(yàn)方法更為直接地驗(yàn)證對(duì)肌肉 損傷的效果。
在使用該肌管細(xì)胞的系統(tǒng)中，測(cè)定作為肌肉損傷指標(biāo)的作為 一 般
炎癥標(biāo)記物使用的細(xì)胞素IL-6，與中性白血球的游走相關(guān)的細(xì)中性白
血球cxcl-i。其原因已知是運(yùn)動(dòng)時(shí)肌肉損傷不僅是機(jī)械的肌肉損傷還 與該損傷誘發(fā)的炎癥反應(yīng)有很大關(guān)系，人們認(rèn)為損傷的肌肉細(xì)胞分泌 細(xì)胞素和趨化因子，促進(jìn)中性白血球和巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)。因此，測(cè)定
作為肌肉損傷的指標(biāo)的IL-6， CXCL-1。 實(shí)施例
接下來(lái)，通過(guò)實(shí)施例等更詳細(xì)地說(shuō)明本發(fā)明，本發(fā)明的范圍不受 這些實(shí)施例的任何限制。
制造例l (醋酸菌脂溶性有機(jī)溶劑提取物的大量制備) 作為醋酸菌林，使用木糖葡糖酸醋桿菌(Gluconacetobacter xylinus NBRC15237)林。該菌抹保藏于獨(dú)立行政法人制品評(píng)價(jià)技術(shù)基 礎(chǔ)機(jī)構(gòu)生物技術(shù)本部生物遺傳資源部門(千葉縣木更津市上總鐮足 2-5-8),是可以發(fā)放的醋酸菌。
首先，醋酸菌脂溶性有機(jī)溶劑提取物按以下方法制備。將1.8kg 醋酸菌干燥菌體懸浮于35升水，用法式?jīng)_床壓力式細(xì)胞破碎機(jī)，在 10000psi的破碎壓力破碎后，與丙酮混合。然后，為了除去由于混合 而產(chǎn)生的雜質(zhì)而進(jìn)行過(guò)濾。再次混合丙酮除去雜質(zhì)，重復(fù)兩次。對(duì)獲 得的過(guò)濾液進(jìn)行減壓濃縮，濃縮物加乙酸乙酯和水進(jìn)行混合后，進(jìn)行 分液，獲得有機(jī)層。再次在水層中加入乙酸乙酯，同樣分液回收有機(jī) 層。對(duì)有機(jī)層減壓濃縮，溶解于乙醇，再次減壓濃縮，獲得108g醋酸 菌脂溶性有機(jī)溶劑提取物。
制造例2 (食醋脂溶性有機(jī)溶劑提取物的大量制備) 在1000升谷物醋中混合1200升乙酸乙酯，靜置分液后，回收有機(jī) 層，進(jìn)行減壓濃縮。在達(dá)到15升左右的容量時(shí)投入等量乙醇，攪拌， 再進(jìn)行減壓濃縮，獲得了 2 34g食醋脂溶性有機(jī)溶劑提取物。制造例3 (醋酸菌堿性穩(wěn)定脂質(zhì)的制備)
與制造例l一樣，使用木糖葡糖酸醋桿菌(Giuconacetobacter xylinus NBRC15237)抹作為醋酸菌林。
首先，用以下方法制備醋酸菌來(lái)源的堿性穩(wěn)定脂質(zhì)。即，用氯仿 -甲醇系溶劑(氯仿甲醇水=1: 2: 0. 8)從該醋酸菌株的2000g干燥菌體 中提取，然后，進(jìn)行2層分離，作為脂質(zhì)粗級(jí)分回收下層。然后，用O. 4N NaOH對(duì)脂質(zhì)粗級(jí)分進(jìn)行弱堿性分解除去磷脂，按照Folch的組成(氯仿 曱醇水=8:4:3)進(jìn)行再提取，濃縮干燥，獲得醋酸菌來(lái)源的堿性穩(wěn)定 脂質(zhì)。
通過(guò)使用硅膠平板的薄層層析確認(rèn)獲得的醋酸菌來(lái)源的堿性穩(wěn) 定脂質(zhì)中所含的脂質(zhì)成分。作為該薄層層析中的展開(kāi)溶劑，涉及脂肪 酸，碎類化合物，N-?；淝拾贝际褂寐确录状?96:4，并且，涉 及二氫鞘氨醇和氨基脂質(zhì)的使用氯仿甲醇水=65: 16: 2。
作為對(duì)照，以從被確認(rèn)含有萜類化合物，N-?；淝拾贝迹?基脂質(zhì)等的醋酸菌提取的純化品(例如，參照前述的"帶大研報(bào)"，23 巻，p. 917-925 (1978年)，"巖手大學(xué)大學(xué)院連合農(nóng)學(xué)研究科博士論文"， 后藤英嗣著，P. 11-41 (2001年)和市售的二氫鞘氨醇(SIGMA社制))作為 指標(biāo)。薄層層析的結(jié)果發(fā)現(xiàn)在堿性穩(wěn)定脂質(zhì)中也存在作為對(duì)照的化合 物。
而且，通過(guò)高效液相色i普確認(rèn)堿性穩(wěn)定脂質(zhì)中的主要成分的含 量。在無(wú)水吡啶和氯化苯酰存在下于7 0 'C使堿性穩(wěn)定脂質(zhì)反應(yīng)10分鐘， 純化含有萜類化合物和神經(jīng)鞘脂類的苯酰衍生物。該苯酰衍生物提供 給高效液相色譜，檢測(cè)紫外吸光230nm的波長(zhǎng)。根據(jù)采用上述各化合物 的市售標(biāo)準(zhǔn)品或確認(rèn)了結(jié)構(gòu)的醋酸菌中提取的純化品的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì) 算堿性穩(wěn)定脂質(zhì)所含的含量。使用己烷異丙醇=100: l的溶劑作為高 效液相色i普的移動(dòng)相，流速為lml/分鐘。
這樣分析的醋酸菌來(lái)源的堿性穩(wěn)定脂質(zhì)中的主要成分示于下述表l。
而且，可以確認(rèn)氨基脂質(zhì)的存在(組合比未確認(rèn))，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)存在磷脂酰膽堿，磷脂酰絲氨酸，磷脂酰丙三醇等磷脂類。
表l
醋酸菌來(lái)源的堿性穩(wěn)定脂質(zhì)的主要成分組合比(重量/重量％)
辟類化合物11. 511
N-酰基二氫鞘氨醇5.446
二氫鞘氨醇3. 173
制造例4(萜類化合物，N-?；淝拾贝?，氨基脂質(zhì)，二氫鞘氨 醇的純化)
將10g上述堿性穩(wěn)定脂質(zhì)提供給用氯仿平衡化的硅膠柱，用按氯 仿醋酸-99: l的容量比混合的溶劑洗滌后，用氯仿甲醇==97: 3的溶劑 洗脫，對(duì)獲得的級(jí)分進(jìn)行干燥，獲得級(jí)分l。
然后，對(duì)通過(guò)用氯仿甲醇=96:4、 95: 5的溶劑洗脫獲得的級(jí)分進(jìn) 行干燥，獲得級(jí)分2。再用氯仿甲醇-92:8， 9:1的溶劑洗脫脂質(zhì)，對(duì) 獲得的級(jí)分進(jìn)行干燥，獲得級(jí)分3。再用氯仿甲醇-2:l的溶劑洗脫， 對(duì)獲得的級(jí)分進(jìn)行千燥，獲得級(jí)分4。
對(duì)獲得的級(jí)分l，通過(guò)采用硅膠板的薄層層析確認(rèn)構(gòu)成脂質(zhì)。作 為該薄層層析中展開(kāi)溶劑，采用氯仿甲醇-96:4。其結(jié)果是，級(jí)分l 的構(gòu)成脂質(zhì)是與實(shí)施例l中使用的確認(rèn)了N-?；淝拾贝嫉拇姿峋?中獲得的純化品同一移動(dòng)度的單一的點(diǎn)。此外，按照常規(guī)方法，用含 水甲醇性鹽酸分解級(jí)分l，通過(guò)薄層層析分離成鞘氨醇類堿基 (sphingoid base)和月旨肪酸，并進(jìn)4亍純4匕。
對(duì)于這些鞘氨醇類堿基和脂肪酸，按照常規(guī)方法，進(jìn)行三甲基甲 硅烷基化反應(yīng)，通過(guò)氣相色謙-質(zhì)謙分析進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)含有 作為N-?；淝拾贝嫉腘-2'-羥棕櫚酰-二氫鞘氨醇，N-棕櫚酰-二氬 鞘氨醇，N-順式-vaccenoyl -二氫鞘氨醇。
根據(jù)以上結(jié)果，確認(rèn)了級(jí)分l的通過(guò)薄層層析檢測(cè)到的單一的點(diǎn) 是N-?；迩拾贝肌?br> 此外，通過(guò)薄層層析確認(rèn)了級(jí)分2，級(jí)分3的構(gòu)成脂質(zhì)。作為薄層
14層析中的展開(kāi)溶劑，級(jí)分2使用氯仿甲醇=96:4的溶劑，級(jí)分3、級(jí)分 4使用氯仿甲醇水-65:16:2的溶劑。作為對(duì)照，使用確認(rèn)了制造例3 中使用的薛類化合物，氨基脂質(zhì)的結(jié)構(gòu)的從醋酸菌中獲得的純化品以 及市售的二氫鞘氨醇(SIGMA公司制)。
薄層層析的結(jié)果是，級(jí)分2的點(diǎn)與萜類化合物的對(duì)照一致，級(jí)分3 的點(diǎn)與氨基脂質(zhì)的對(duì)照一致，級(jí)分4的主要點(diǎn)與氨基脂質(zhì)的指標(biāo)一致。
根據(jù)以上結(jié)果，分別確認(rèn)了級(jí)分2中檢測(cè)到的薄層層析的點(diǎn)含有 萜類化合物，級(jí)分3中檢測(cè)到的薄層層析的點(diǎn)含有二氫鞘氨醇，級(jí)分4 中檢測(cè)到的薄層層析的點(diǎn)含有氨基脂質(zhì)。
實(shí)施例1 (輕度運(yùn)動(dòng)量下的肌肉損傷抑制效果)
使用Crl:CD(SD)大鼠，l周時(shí)間，10分鐘/天通過(guò)踏車施加運(yùn)動(dòng)負(fù) 荷(帶斜度6度，速度10m/分鐘)，進(jìn)行運(yùn)動(dòng)負(fù)荷后，進(jìn)行一周通過(guò)
經(jīng)口才聶取的試才羊施用。
飾食以固體飼料CRF-1 (0r ienta 1酵母工業(yè)社制)作為基本飼料， 試樣分為以下3組(n-8),即只施用基本飼料(非施用區(qū))，除基本飼料 外，按照最終達(dá)到500mg/kg大鼠體重強(qiáng)制施用制造例l中制備的醋酸菌 脂溶性有機(jī)溶劑提取物(醋酸菌提取物區(qū))，按照最終達(dá)到500mg/kg大 鼠體重強(qiáng)制施用制造例2中制備的食醋脂溶性有機(jī)溶劑提取物(食醋提 取物區(qū))。而且，在強(qiáng)制施用時(shí)，安裝了一次性大鼠用經(jīng)口管的聚丙烯 制一次性注射筒。
而且，在施用第7天進(jìn)行尸檢，測(cè)定心臟，比目魚肌，腓腸肌的 MPO活性。MPO活性的測(cè)定，使用髓過(guò)氧物酶測(cè)試盒(Cytostore/^司制) 進(jìn)行。
即，在約0. 5g各組織片中加入250nl溴化十六烷三甲胺 (Hexadecyltri—methylammounium bromide)溶液,用乳缽破碎，在 10000rpm離心后，回收上清。將回收的上清調(diào)整到組織蛋白質(zhì)濃度達(dá) 到20mg/ml，制成MPO活性測(cè)定用組織石皮碎液。而且，組織蛋白質(zhì)濃度 的測(cè)定采用Bio Rad DC-protein Assay (蛋白質(zhì)測(cè)試)(Bio-Rad Laboratories公司制)e然后，為了進(jìn)行反應(yīng)液的調(diào)整，在100ml的o-鄰聯(lián)茴香胺 (o-dianisidine dihydrochloride)/磷酸緩沖液中力口入0. 5加1的1%過(guò) 氧化氫，將其作為反應(yīng)液。在20ja 1的各組織的MP0活性測(cè)定用組織破 碎液中添加200 in l反應(yīng)液，使用吸光度計(jì)，測(cè)定當(dāng)時(shí)及l(fā)分鐘后的450nm 的吸光度。
而且，MPO活性lU定義為每lg組織蛋白質(zhì)反應(yīng)lM過(guò)氧化氫時(shí)，每 上升每l分鐘的吸光度(450nm)。
以上結(jié)果示于圖l。而且，對(duì)各器官的未施用區(qū)，醋酸菌提取物 區(qū)，食醋提取物區(qū)，分別進(jìn)行按照顯著水準(zhǔn)5。/。的t檢驗(yàn)，用※表示發(fā)現(xiàn) 有顯著差異的試驗(yàn)區(qū)。
圖l的結(jié)果，與未施用區(qū)相比，醋酸菌提取物區(qū)和食醋提取物區(qū) 中，心臟，比目魚肌，腓腸肌中MPO活性均顯著減少，可以確認(rèn)醋酸菌 脂溶性有機(jī)溶劑提取物和食醋脂溶性有機(jī)溶劑提取物均存在抑制肌肉 損傷。
實(shí)施例2 (大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)量下肌肉損傷抑制效果)
為了驗(yàn)證不同運(yùn)動(dòng)種類導(dǎo)致的效果的差異，l周時(shí)間，10分鐘/ 天，進(jìn)行踏車產(chǎn)生的運(yùn)動(dòng)負(fù)荷(帶斜度6度，速度10m/分鐘)后， 一邊通過(guò)強(qiáng)制經(jīng)口攝取施與飼料， 一邊進(jìn)行6天運(yùn)動(dòng)，在第7天通過(guò)踏 車進(jìn)行運(yùn)動(dòng)負(fù)荷(帶斜度IO度，速度20m/分鐘)。
何食以固體飼料CRF-1 (Oriental酵母工業(yè)社制)作為基本銅料， 試樣分為以下3組(n-8)，即只施用基本祠料(非施用區(qū))，除基本飼料 外，按照最終達(dá)到500mg/kg大鼠體重強(qiáng)制施用制造例l中制備的醋酸菌 脂溶性有機(jī)溶劑提取物(醋酸菌提取物區(qū))，按照最終達(dá)到500mg/kg大 鼠體重強(qiáng)制施用制造例2中制備的食醋脂溶性有機(jī)溶劑提取物(食醋提 取物區(qū))。而且，在施用第7天，運(yùn)動(dòng)終止2小時(shí)后進(jìn)行尸檢，測(cè)定心臟 的MPO。測(cè)定方法與實(shí)施例l一樣。
以上結(jié)果示于圖2。而且，對(duì)未施用區(qū)，醋酸菌提取物區(qū)，食醋 提取物區(qū)，分別進(jìn)行按照顯著水準(zhǔn)5M的t檢驗(yàn)，用※表示發(fā)現(xiàn)有顯著差 異的試驗(yàn)區(qū)。圖2的結(jié)果，與未施用區(qū)相比，醋酸菌提取物區(qū)和食醋提取物區(qū) 中，MPO活性均顯著減少，可以確認(rèn)醋酸菌脂溶性有機(jī)溶劑提取物和食 醋脂溶性有機(jī)溶劑提取物均抑制肌肉損傷。而且，還確認(rèn)了存在使運(yùn) 動(dòng)量增加的效果。
實(shí)施例3 (采用肌管的肌肉損傷抑制效果)
本評(píng)價(jià)系統(tǒng)中采用小鼠來(lái)源的C2C12成肌細(xì)胞。該細(xì)胞保存于理 化學(xué)研究所，是可以發(fā)放的細(xì)胞林。而且，通過(guò)分化誘導(dǎo)，由單核的 成肌細(xì)胞分化成多核的肌管細(xì)胞，形成肌纖維樣的形態(tài)。將該細(xì)胞接 種于涂覆了膠原I的35mm培養(yǎng)亞中，用DMEM(l 1965-092; GIBC0公司制) + 10。/。FBS(以下也稱為增殖培養(yǎng)基)，在37。C, 5%0)2的條件下培養(yǎng)直至 達(dá)到90%融合后，再用DMEM(11885-084; GIBCO公司制)+ 5。/。HS培養(yǎng)基 (以下也稱為分化培養(yǎng)基)，在37。C， 5%002的條件下培養(yǎng)72小時(shí)，使之 分化成肌管細(xì)胞。而且，在48小時(shí)后更換一次培養(yǎng)基。
將制造例1中制造的醋酸菌脂溶性有機(jī)溶劑提取物，制造例3制造 的醋酸菌堿性穩(wěn)定脂質(zhì)，制造例4制造的辟類化合物，N-酰基二氫鞘氨 醇，氨基脂質(zhì)，二氫鞘氨醇分別溶解于DMSO中，按終濃度10jig/ml添 加到分化培養(yǎng)基中。考慮到DMSO對(duì)細(xì)胞的影響，將培養(yǎng)基添加后的DMSO 調(diào)整到終濃度5 jLi 1/ml。添加后，于37。C， 5%0)2存在下培養(yǎng)24小時(shí)。
添加各脂質(zhì)培養(yǎng)24小時(shí)的肌管細(xì)胞用PBS洗滌3次，用lmM H202+ 分化培養(yǎng)基于37'C, 5%0)2存在下培養(yǎng)2小時(shí)后廢棄培養(yǎng)基，回收肌管 細(xì)胞。而且，在不直接^f吏用回收的細(xì)胞時(shí)，用液氮瞬間冷凍，使用前 一直在-80'C冷凍庫(kù)中保存。
為了分析回收的細(xì)胞的IL-6和CXCL-l的基因表達(dá)，從細(xì)胞提取總 RNA，通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDM,通過(guò)定量PCR分析基因的表達(dá)。即， 用含有苯酚，異石危氰酸胍的Trizol溶液(invitrogen公司制)按照附帶 的操作規(guī)程提取并純化總RNA,用于逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。提取的總RNA基于吸 光度(260nm， 280nm)的測(cè)定結(jié)果測(cè)定RNA濃度。
逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中反應(yīng)液采用Taqman逆轉(zhuǎn)錄試劑，基于附帶的操作手 冊(cè)制備。而且，每個(gè)試樣的總RNA量約為200ng。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)在25。C (10
17分鐘)—48°C (30分鐘)—95°C (5分鐘)—4'C的條件下進(jìn)行PCR反應(yīng)，獲 得cDNA。
用獲得的cDNA進(jìn)行定量PCR。定量PClH吏用qPCRs叩er mix-UDG with ROX作為反應(yīng)試劑，IL-6用作引物使用Mm00446190 (AB公司制)， 用于CXCL-1用引物使用Mm00433859 (AB/^司制)，作為內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)使用的 丙三醇3磷酸脫氬酶(以下也稱為GAPDH)用作引物使用Mm99999915 (AB 公司制)，按照操作手冊(cè)制備PCR反應(yīng)液。定量PCR使用ABI prism7000, 在50。C2分鐘—95°C 10分鐘卄〈95。C 15秒—60°C l分鐘〉(40個(gè)循環(huán)) —4。C的反應(yīng)條件下進(jìn)行，用GAPDH的測(cè)定值作為100的相對(duì)值表示IL-6 和CXCL-l的各測(cè)定值。
結(jié)果示于圖3和圖4。而且，與過(guò)氧化氬處理比較，分別對(duì)醋酸菌 脂溶性提取物，醋酸菌堿性穩(wěn)定脂質(zhì)，N-?；淝拾贝迹迩拾?醇，氨基脂質(zhì)和碎類化合物處理區(qū)進(jìn)行按照顯著水準(zhǔn)5y。的t檢驗(yàn)，用※ 表示發(fā)現(xiàn)有顯著差異的試驗(yàn)區(qū)。
根據(jù)圖3的結(jié)果，在醋酸菌脂溶性提取物，醋酸菌堿性穩(wěn)定脂質(zhì) 中發(fā)現(xiàn)了 IL-6的基因表達(dá)抑制效果。
根據(jù)圖4的結(jié)果，在N-酰基二氫鞘氨醇，二氫鞘氨醇，氨基脂質(zhì) 和辟類化合物中發(fā)現(xiàn)了 IL-6， CXCL-1的各基因表達(dá)抑制效果。
根據(jù)以上結(jié)果，在本發(fā)明的醋酸菌脂溶性提取物，醋酸菌堿性穩(wěn) 定脂質(zhì)，鞘脂類，二氫鞘氨醇，氦基脂質(zhì)和辟類化合物中發(fā)現(xiàn)存在肌 肉損傷抑制效果。
實(shí)施例4(片劑的制造)
(1)醋酸菌脂溶性有機(jī)溶劑提取物
用高速離心機(jī)(8000rpm，20分鐘)對(duì)10千升的醋酸發(fā)酵液收集菌 體，獲得10kg的濕菌體。用蒸餾水洗滌所得到10kg濕菌體后，用大型 冷凍千燥機(jī)冷凍減壓干燥，獲得了l. 8kg的干燥菌體。
將獲得的干燥菌體lkg與10升丙酮一起裝入索氏抽提器(Soxhlet extractor), 20小時(shí)加熱環(huán)流。對(duì)獲得的提取液減壓干燥，添加10升 的乙酸乙酯和10升蒸餾水，分液之后，用轉(zhuǎn)缸式蒸發(fā)機(jī)蒸發(fā)有機(jī)層，
18在達(dá)到l升左右的容量時(shí)等量投入乙醇，攪拌，用轉(zhuǎn)缸式蒸發(fā)機(jī)蒸發(fā)干
燥后，獲得了淡黃褐色的醋酸菌脂溶性有機(jī)溶劑提取物約50g。加入獲 得的醋酸菌脂溶性有機(jī)溶劑提取物lg(O. 7重量％)，結(jié)晶纖維素 35g(26. 9重量％)，千燥玉米淀粉67g(51.5重量。/。)，乳糖22g(16. 9重量 %)，硬脂酸鈣2g(1. 5重量n/。)和作為結(jié)合劑的聚乙烯吡咯烷酮3g(2. 3重 量°/。)，混合粉末化后，填充于硬明膠膠嚢中。 (2)食醋脂溶性有機(jī)溶劑提取物
將5升食醋與6升乙酸乙酯混合，用轉(zhuǎn)缸式蒸發(fā)機(jī)蒸發(fā)有機(jī)層，在 達(dá)到約l升時(shí)加入等量乙醇，再用轉(zhuǎn)缸式蒸發(fā)機(jī)蒸發(fā)后，獲得了茶褐色 的食醋脂溶性有機(jī)溶劑提取物約1 g 。
加入獲得的食醋脂溶性有機(jī)溶劑提取物lg(O. 7重量％)，結(jié)晶纖維 素35g(26. 9重量％)，千燥玉米淀粉67g(51. 5重量％)，乳糖22g(16. 9重 量％),硬脂酸鈣2g(1. 5重量y。)和作為結(jié)合劑的聚乙烯吡咯烷酮3g(2. 3 重量％)，混合粉末化后，填充于硬明膠膠嚢中。
能夠有效經(jīng)口攝取。
實(shí)施例5(果凍的制造) (l)醋酸菌破碎粉末
用高速離心機(jī)器(8000rpm， 20分鐘)對(duì)醋酸發(fā)酵液千升收集菌體， 獲得了濕菌體10kg。使獲得的濕菌體10kg分散于等量的蒸餾水。在通 過(guò)使分散的20kg的醋酸菌分散液3次通過(guò)高壓均化器(20000psi)實(shí)施 細(xì)胞破壞處理后，用大型冷凍干燥機(jī)冷凍減壓干燥，獲得了l. 5kg的干 燥菌體粉末。
均勻混合獲得的干燥菌體粉末8g (0. 8重量％)，砂糖250g (25重量 %),角叉茱膠1. 6g(0. 16重量％)， 刺槐豆膠(Locust bean gum)O. 8g(0. 08重量％)，黃原膠(xanthan gum) 0. 8g (0. 08重量％)，獲 得粉狀混合物。在鍋中計(jì)量300g的水，溶解黑糖30g(3. 0重量％)，再混 合還原糖漿(hydrogenated syrup) 150g(15重量W，加入先前獲得 的粉狀混合物， 一邊攪拌以使其不成塊狀， 一邊混合。將它們攪拌均勻，加入余下的水258. 8g，加溫。溶液溫度在85匸加熱10分鐘溶解后， 用流水冷卻，獲得了含醋酸菌體的果凍食品。 (2)食醋脂溶性有機(jī)溶劑提取物
將50升食醋與60升乙酸乙酯混合，用轉(zhuǎn)缸式蒸發(fā)機(jī)蒸發(fā)有機(jī)層， 在達(dá)到約10升時(shí)加入等量乙醇，再用轉(zhuǎn)缸式蒸發(fā)機(jī)蒸發(fā)后，獲得了茶 褐色的食醋脂溶性有機(jī)溶劑提取物約1 Og。
混合均勻獲得的食醋脂溶性有機(jī)溶劑提取物8g(0. 8重量％),砂糖 250g(25重量y。)，角叉菜膠l. 6g(0. 16重量％)，刺槐豆膠O. 8g (0. 08重 量％),黃原膠O. 8g (0. 08重量％)，獲得粉狀混合物。用鍋計(jì)量300g的水， 溶解黑砂糖30g(3. 0重量％)，再混合還原糖漿150g(15重量。/。)，加入先 前獲得的粉狀混合物， 一邊攪拌使得其不成塊狀， 一邊再混合。將它 們攪拌均勻，加入余下的水258. 8g，加溫。溶液溫度在85。C加熱10分 鐘溶解后，用流水冷卻，獲得了含食醋脂溶性有機(jī)溶劑提取物的果凍 食品。
可以期待上述(1)和(2)中制備的果凍食品作為肌肉損傷抑制組 合物，能夠有效經(jīng)口攝取。 實(shí)施例6(飲料的制造)
(1) 含醋酸菌體的食醋
用高速離心機(jī)器(8000rpm， 20分鐘)對(duì)醋酸發(fā)酵液10千升收集菌 體，獲得了濕菌體10kg。使獲得的濕菌體10kg分散于100L食醋中。使 分散的醋酸菌分散液3次通過(guò)高壓均化器(20000psi)，實(shí)施細(xì)胞破壞處 理。將該溶液分注于容積為500ml的瓶中，通過(guò)加溫至75。C進(jìn)行殺菌，
獲得了含醋酸菌體的食醋。
(2) 含高濃度的食醋脂溶性有機(jī)溶劑提取物的食醋 將500升食醋與600升乙酸乙酯混合，用轉(zhuǎn)缸式蒸發(fā)機(jī)蒸發(fā)有機(jī)
層，在達(dá)到50升左右時(shí)加入等量乙醇，再用轉(zhuǎn)缸式蒸發(fā)機(jī)蒸發(fā)后，獲 得了茶褐色的食醋脂溶性有機(jī)溶劑提取物(食醋脂溶性級(jí)分)約100g。 使獲得的食醋脂溶性級(jí)分100g分散于l升食醋。將該溶液分注于容積為 500ml的瓶中，通過(guò)加溫至75。C進(jìn)行殺菌，獲得了含高濃度的食醋脂溶性有機(jī)溶劑提取物的食醋。
可以期待，上述(1)和(2)制備的飲料作為肌肉損傷抑制組合物可以有效經(jīng)口攝取。
工業(yè)上利用的可能性
本發(fā)明可以廉價(jià)地提供對(duì)人體的安全性高而且具有肌肉損傷抑制效果的經(jīng)口物品。因此，通過(guò)作為食品等形式經(jīng)口攝取本發(fā)明涉及的肌肉損傷抑制組合物品，可以預(yù)期能夠預(yù)防體育活動(dòng)和激烈運(yùn)動(dòng)中肌肉損傷和伴隨日常生活中身體活動(dòng)的輕度的肌肉損傷的效果。
權(quán)利要求
1、肌肉損傷抑制組合物，其特征在于含有醋酸菌的脂溶性有機(jī)溶劑提取物作為有效成分。
2、 權(quán)利要求l所述的肌肉損傷抑制組合物，其特征在于所述脂溶性 有機(jī)溶劑是乙酸乙酯。
3、 權(quán)利要求l所述的肌肉損傷抑制組合物，其特征在于所述脂溶性 有機(jī)溶劑提取物是堿性穩(wěn)定脂質(zhì)。
4、 權(quán)利要求3所述的肌肉損傷抑制組合物，其特征在于所述堿性穩(wěn) 定脂質(zhì)為N-?；淝拾贝?。
5、 權(quán)利要求3所述的肌肉損傷抑制組合物，其特征在于所述堿性穩(wěn) 定脂質(zhì)是二氫鞘氨醇。
6、 權(quán)利要求3所述的肌肉損傷抑制組合物，其特征在于所述堿性穩(wěn)定脂質(zhì)是氨基脂質(zhì)。
7、 權(quán)利要求3所述的肌肉損傷抑制組合物，其特征在于所述堿性穩(wěn) 定脂質(zhì)是薛類化合物。
8、 肌肉損傷抑制組合物，其特征在于含有食醋的脂溶性有機(jī)溶劑 提取物作為有效成分。
9、 權(quán)利要求8所述的肌肉損傷抑制組合物，其特征在于所述脂溶性 有機(jī)溶劑是乙酸乙酯。
全文摘要
本發(fā)明的目的在于提供一種安全性高且肌肉損傷抑制效果更強(qiáng)的肌肉損傷抑制組合物。本發(fā)明提供一種肌肉損傷抑制組合物，其特征在于含有醋酸菌的脂溶性有機(jī)提取物，優(yōu)選醋酸菌的乙酸乙酯提取物，醋酸菌堿性穩(wěn)定脂質(zhì)，N-?；淝拾贝?，二氫鞘氨醇，氨基脂或萜類化合物。本發(fā)明還提供了一種肌肉損傷抑制組合物，其特征在于含有食醋的脂溶性有機(jī)溶劑提取物，優(yōu)選食醋的乙酸乙酯提取物作為有效成分。
文檔編號(hào)A61K31/164GK101583353SQ20078005002
公開(kāi)日2009年11月18日 申請(qǐng)日期2007年1月16日 優(yōu)先權(quán)日2007年1月16日
發(fā)明者杉山健一, 榊原玲奈 申請(qǐng)人:味滋康集團(tuán)有限公司