專利名稱：：一種用于腫瘤化學治療中的新型增敏和增效物質的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明屬于藥物學領域，更具體地，本發(fā)明涉及一種對于腫瘤化學治療有用的新型增敏和增效物質及其用途。
背景技術：
：多藥抗藥性(multidrugresistance,MDR)是指癌細胞接觸一種來源于天然的抗腫瘤藥物并產生抗藥性的同時，對結構和作用機理不同的多種來源于天然的抗腫瘤藥物產生交叉抗藥性。腫瘤病人在經(jīng)過化療后，往往會產生多藥抗藥性。多藥抗藥性是導致腫瘤化療失敗的主要原因，也是腫瘤化療急需解決的難題之一。多藥抗藥性的形成機理復雜。腫瘤細胞可通過不同途徑導致MDR的產生，同時，單個MDR細胞可同時存在多種抗藥性的機制。任何一種或多種機制聯(lián)合作用均可導致MDR的產生。MDR的逆轉劑與抗癌藥物合用，將會大幅度地提高化療藥物對MDR腫瘤的療效。盡管許多化合物或藥物具有體外逆轉MDR的作用，但由于毒副作用很大，無臨床應用價值。可作為臨床應用的MDR逆轉劑的藥物至今尚未開發(fā)成功。一些對于MDR有逆轉效果的制劑的使用，盡管可以提高化療藥物的抗癌活性，但同時也增加了化療藥物的數(shù)量，加重了化療病人的負擔。反之，如果可找到在增加抗癌藥物療效的同時，又無毒副作用和抗藥性的物質，那么癌癥患者的生活質量將很大程度地得到改善。因此，尋找低毒、不易產生MDR的物質或有效的MDR逆轉物質是腫瘤化療治療領域急需解決的難題。
發(fā)明內容本發(fā)明的目的在于提供一種短葉老鸛草素作為抗腫瘤藥物的增敏劑或逆轉劑的用途。本發(fā)明的另一目的在于提供一種含有短葉老鸛草素和抗腫瘤藥物的藥物組合物。在本發(fā)明的第一方面，提供一種短葉老鸛草素(Brevilin，6-0-amgeloylenolin)的用途，用于制備抗腫瘤藥物的增敏劑或逆轉劑。在另一優(yōu)選例中，所述的抗腫瘤藥物選自阿霉素；長春新堿；紫杉醇；順鉑；放線菌素；博來霉素；白消安；卡培他濱；卡鉑；卡莫司??；苯丁酸氮芥；環(huán)磷酰胺；阿糖胞苷；柔紅霉素；表阿霉素；依托泊甙；足葉乙甙；鬼臼乙叉甙；氟阿糖腺苷酸；5-氟尿嘧啶；吉西他濱；赫賽汀；羥基脲；伊達比星；異環(huán)磷酰胺；依立替康；洛莫司?。画h(huán)己亞硝脲；美法侖；左旋苯丙氨酸氮芥；巰基嘌呤；氨甲蝶呤；絲裂霉素；米托蒽醌；二羥基蒽酮；奧沙利鉑；丙卡巴肼；甲芐肼；美羅華；類固醇；鏈佐星；鏈脲霉素；紫杉醇，泰索帝；硫鳥嘌呤；噻替哌；硫替哌；三胺硫磷；雷替曲塞；拓撲替康；曲奧舒凡；尿嘧啶；長春堿；長春花堿；長春地辛；長春瑞賓；格列衛(wèi)；羥基喜樹堿；或它們的混合物。在另一優(yōu)選例中，所述的抗腫瘤藥物選自長春新堿；阿霉素；順鉑；5-氟尿嘧啶；絲裂霉素；羥基喜樹堿；或它們的混合物。在另一優(yōu)選例中，所述的腫瘤選自鼻咽癌；食管癌；胃癌；肝癌；乳腺癌；結腸癌；前列腺癌；肺癌；宮頸癌；白血?。豢谇话?；唾液腺腫瘤；鼻腔與鼻旁竇惡性腫瘤；喉癌；耳部腫瘤；眼部腫瘤；甲狀腺腫瘤；縱隔腫瘤；胸壁；胸膜腫瘤；小腸腫瘤；膽道腫瘤；胰腺與壺腹周圍腫瘤；腸系膜與腹膜后腫瘤；腎臟腫瘤；腎上腺腫瘤；膀胱腫瘤；前列腺癌；睪丸腫瘤；陰莖癌；子宮內膜癌；卵巢惡性腫瘤；惡性滋養(yǎng)細胞腫瘤；外陰癌與陰道癌；惡性淋巴瘤；多發(fā)性骨髓瘤；軟組織腫瘤；骨腫瘤；皮膚及附件腫瘤；惡性黑色素瘤；或神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤。在另一優(yōu)選例中，所述的增敏劑或逆轉劑用于提高抗腫瘤藥物在腫瘤細胞內的累積量。在本發(fā)明的第二方面，提供一種抗腫瘤的藥物組合物，含有(a)有效量的短葉老鸛草素，和(b)有效量的抗腫瘤藥物；其中，所述抗腫瘤藥物選自阿霉素；長春新堿；紫杉醇；順鉑；放線菌素；博來霉素；白消安；卡培他濱；卡鉑；卡莫司??；苯丁酸氮芥；環(huán)磷酰胺；阿糖胞苷；柔紅霉素；表阿霉素；依托泊甙；足葉乙甙；鬼臼乙叉甙；氟阿糖腺苷酸；氟尿嘧啶；吉西他濱；赫賽??；羥基脲；伊達比星；異環(huán)磷酰胺；依立替康；洛莫司??；環(huán)己亞硝脲；美法侖；左旋苯丙氨酸氮芥；巰基嘌呤；氨甲蝶呤；絲裂霉素；米托蒽醌；二羥基蒽酮；奧沙利鉑；丙卡巴肼；甲芐肼；美羅華；類固醇；鏈佐星；鏈脲霉素；紫杉醇，泰索帝；硫鳥嘌呤；噻替哌；硫替哌；三胺硫磷；雷替曲塞；拓撲替康；曲奧舒凡；尿嘧啶；長春堿；長春花堿；長春地辛；長春瑞賓；格列衛(wèi)；羥基喜樹堿；或它們的混合物。在另一優(yōu)選例中，短葉老鸛草素與抗腫瘤藥物的重量比為1:(0.1-10000)。在另一優(yōu)選例中，短葉老鸛草素與抗腫瘤藥物的重量比為l:(1-1000);更優(yōu)選的重量比為l:(1-200)。在另一優(yōu)選例中，所述的藥物組合物中還含有(c)藥學上可接受的載體。在另一優(yōu)選例中，所述的腫瘤選自鼻咽癌；食管癌；胃癌；肝癌；乳腺癌；結腸癌；前列腺癌；肺癌；宮頸癌；白血病；口腔癌；唾液腺腫瘤；鼻腔與鼻旁竇惡性腫瘤；喉癌；耳部腫瘤；眼部腫瘤；甲狀腺腫瘤；縱隔腫瘤；胸壁；胸膜腫瘤；小腸腫瘤；膽道腫瘤；胰腺與壺腹周圍腫瘤；腸系膜與腹膜后腫瘤；腎臟腫瘤；腎上腺腫瘤；膀胱腫瘤；前列腺癌；睪丸腫瘤；陰莖癌；子宮內膜癌；卵巢惡性腫瘤；惡性滋養(yǎng)細胞腫瘤；外陰癌與陰道癌；惡性淋巴瘤；多發(fā)性骨髓瘤；軟組織腫瘤；骨腫瘤；皮膚及附件腫瘤；惡性黑色素瘤；或神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤。。在另一優(yōu)選例中，所述組合物的劑型選自注射劑、注射用無菌粉末、片劑。在本發(fā)明的第三方面，提供一種體外(優(yōu)選非治療性地)抑制腫瘤細胞的方法，所述方法包括給予腫瘤細胞有效量的有效量的短葉老鸛草素和有效量的抗腫瘤藥物；其中所述抗腫瘤藥物選自阿霉素；長春新堿；紫杉醇；順鉑；放線菌素；博來霉素；白消安；卡培他濱；卡鉑；卡莫司??；苯丁酸氮芥；環(huán)磷酰胺；阿糖胞苷；柔紅霉素；表阿霉素；依托泊甙；足葉乙甙；鬼臼乙叉甙；氟阿糖腺苷酸；氟尿嘧啶；吉西他濱；赫賽?。涣u基脲；伊達比星；異環(huán)磷酰胺；依立替康；洛莫司??；環(huán)己亞硝脲；美法侖；左旋苯丙氨酸氮芥；巰基嘌呤；氨甲蝶呤；絲裂霉素；米托蒽醌；二羥基蒽酮；奧沙利鉑；丙卡巴肼；甲芐肼；美羅華；類固醇；鏈佐星；鏈脲霉素；紫杉醇，泰索帝；硫鳥嘌呤；噻替哌；硫替哌；三胺硫磷；雷替曲塞；拓撲替康；曲奧舒凡；尿嘧啶；長春堿；長春花堿；長春地辛；長春瑞賓；格列衛(wèi)；羥基喜樹堿；或它們的混合物。本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內容，對本領域的技術人員而言是顯而易見的。圖1顯示了不同濃度短葉老鸛草素對HCT-8和HCT-8/VCR細胞存活率的影響。圖2顯示了短葉老鸛草素對耐藥細胞內長春新堿累積的影響。圖3顯示了短葉老鸛草素對結腸癌細胞內阿霉素和羅丹明123累積的影響。具體實施例方式針對目前現(xiàn)有技術中缺乏安全可靠且無毒無害的提高化療藥物作用的制劑的現(xiàn)狀，本發(fā)明人經(jīng)過長期的研究和試驗，首次揭示一種對化學治療藥物具有增敏作用和增效作用的物質一一短葉老鸛草素。所述的短葉老鸛草素可有效逆轉腫瘤對腫瘤藥物的多藥耐藥性，提高化療藥物的作用，并且對哺乳動物沒有毒性和副作用。在此基礎上完成了本發(fā)明。短葉老鸛草素短葉老鸛草素是一種倍半萜內脂類化合物。在過去研究中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)短葉老鸛草素具有抗炎、抗原生蟲、抗腫瘤的作用。短葉老鸛草素的結構式如式(I)所示。在本發(fā)明中，所述的"短葉老鸛草素"可以是純凈形式存在的式(I)所示的化合物，或純度大于85%的式(1)所示的化合物；也可以是含有0.001-90wt%，更佳地含有l(wèi)-85wty。的短葉老鸛草素的短葉老鸛草素的提取物。該術語還包括短葉老鸛草素的濃度大于O.001wt。/。的混合物。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的短葉老鸛草素可提取自任何含有短葉老鸛草素的植物中，所述的植物包括但不限于鵝不食草、橄欖樹(特別是存在于其莖中)。鵝不食草(Centipedaminima(L.)A.Br.etAscher.)系菊科(Compositae)石胡荽屬植物，生長于海拔300-1900米的陰濕處?？蓪⒍倘~老鸛草素的植物提取物直接給藥；或者可將短葉老鸛草素的植物提取物進行提純和加工，制成純凈形式的短葉老鸛草素、或各種形式的短葉老鸛草素的制劑后，用于給藥。此外，所述的短葉老鸛草素也可通過化學合成、半合成、生物轉化的方式獲得。在本發(fā)明中，還包括短葉老鸛草素的藥學上可接受的鹽或酯，只要所述的葉老鸛草素的鹽或酯也具有提高腫瘤細胞對化學治療藥物敏感性的作用。所述的"藥學上可接受的鹽或酯"包括短葉老鸛草素與無機酸或有機酸反應生成的鹽或酯。所述的無機酸或有機酸例如如下(但不限于)氫氯酸、氫溴酸、硫酸、檸檬酸、酒石酸、磷酸、乳酸、丙酮酸、乙酸、琥珀酸、草酸、富馬酸、馬來酸、草酰乙酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、或羥乙磺酸。所述的"藥學上可接受的鹽"還包括短葉老鸛草素與堿金屬或堿土金屬所形成的鹽。所述的堿金屬或堿土金屬例如如下鈉、鉀、鈣或鎂。其它"藥學上可接受的鹽"還包括以常規(guī)的"前體藥物"形式存在的鹽(當以這種形式給藥時，在體內可轉化成活性部分)。用途本發(fā)明提供了短葉老鸛草素、其藥學上可接受的鹽的用途，用于制備抗腫瘤藥物的增敏劑或逆轉劑。為了論證短葉老鸛草素的上述用途，本發(fā)明人隨機選擇了結腸癌細胞株(HCT-8)的耐長春新堿亞系HCT-8/VCR為多藥耐藥模型，測試了短葉老鸛草素對于傳統(tǒng)抗腫瘤用化療藥物的抗腫瘤敏感性影響。結果發(fā)現(xiàn)，短葉老鸛草素可顯著提高多藥抗藥性細胞株對抗腫瘤用化療藥物的敏感性，即可以逆轉腫瘤細胞的多藥抗藥性。進一步的試驗還證明，短葉老鸛草素可顯著地提高腫瘤細胞內抗腫瘤藥物的累積，有效地阻止或延緩抗腫瘤藥物被排出細胞。體內試驗證明，短葉老鸛草素可顯著地增強抗腫瘤藥物的抑制腫瘤增殖作用，顯著降低腫瘤的重量。在本發(fā)明的優(yōu)選實施例中，采用了本領域人員常用的經(jīng)典腫瘤模型即結腸癌細胞HCT-8和HCT-8/VCR作為細胞模型驗證了短葉老鸛草素的增敏和增效作用；然而本領域人員應理解，由于腫瘤的發(fā)病機制和不同類型、不同組織的腫瘤細胞的共性，所述的短葉老鸛草素對于其它種類的腫瘤也是適用的。由于短葉老鸛草素對于多藥抗藥性的逆轉機制不是通過直接作用于某一抗腫瘤藥物來實現(xiàn)的，而是作用于腫瘤細胞，通過增加抗腫瘤藥物在腫瘤細胞內的積聚、阻止或延緩外排來實現(xiàn)的。因此，本發(fā)明對于所述的抗腫瘤藥物沒有特別的限制，可以是本領域常規(guī)用于腫瘤化學治療的任何抗腫瘤藥物。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的抗腫瘤藥物選自阿霉素；長春新堿；紫杉醇；順鉑；放線菌素；博來霉素；白消安；卡培他濱；卡鉑；卡莫司??；苯丁酸氮芥；環(huán)磷酰胺；阿糖胞苷；柔紅霉素；表阿霉素；依托泊甙；足葉乙甙；鬼臼乙叉甙；氟阿糖腺苷酸；5-氟尿嘧啶；吉西他濱；赫賽汀；羥基脲；伊達比星；異環(huán)磷酰胺；依立替康；洛莫司?。画h(huán)己亞硝脲；美法侖；左旋苯丙氨酸氮芥；巰基嘌呤；氨甲蝶呤；絲裂霉素；米托蔥醌；二羥基蒽酮；奧沙利鉑；丙卡巴肼；甲芐肼；美羅華；類固醇；鏈佐星；鏈脲霉素；紫杉醇，泰索帝；硫鳥嘌呤；噻替哌；硫替哌；三胺硫磷；雷替曲塞；拓撲替康；曲奧舒凡；尿嘧啶；長春堿；長春花堿；長春地辛；長春瑞賓；格列衛(wèi)；羥基喜樹堿；或它們的混合物。更優(yōu)選地，所述的抗腫瘤藥物選自長春新堿；阿霉素；順鉑；5-氟尿嘧咬；絲裂霉素；羥基喜樹堿；或它們的混合物。所述短葉老鸛草素適用于提高多種腫瘤對于抗腫瘤藥物的敏感性。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的腫瘤是多藥抗藥性腫瘤。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的腫瘤包括(但不限于)鼻咽癌；食管癌；胃癌；肝癌；乳腺癌；結腸癌；前列腺癌；肺癌；宮頸癌；白血病；口腔癌；唾液腺腫瘤；鼻腔與鼻旁竇惡性腫瘤；喉癌；耳部腫瘤；眼部腫瘤；甲狀腺腫瘤；縱隔腫瘤；胸壁；胸膜腫瘤；小腸腫瘤；膽道腫瘤；胰腺與壺腹周圍腫瘤；腸系膜與腹膜后腫瘤；腎臟腫瘤；腎上腺腫瘤；膀胱腫瘤；前列腺癌；睪丸腫瘤；陰莖癌；子宮內膜癌；卵巢惡性腫瘤；惡性滋養(yǎng)細胞腫瘤；外陰癌與陰道癌；惡性淋巴瘤；多發(fā)性骨髓瘤；軟組織腫瘤；骨腫瘤；皮膚及附件腫瘤；惡性黑色素瘤；或神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤。組合物本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，含有(a)有效量的短葉老鸛草素，(b)有效量的抗腫瘤藥物；其中，所述抗腫瘤藥物選自阿霉素；長春新堿；紫杉醇；順鉑；放線菌素；博來霉素；白消安；卡培他濱；卡鉑；卡莫司汀；苯丁酸氮芥；環(huán)磷酰胺；阿糖胞苷；柔紅霉素；表阿霉素；依托泊甙；足葉乙甙；鬼臼乙叉甙；氟阿糖腺苷酸；氟尿嘧啶；吉西他濱；赫賽??；羥基脲；伊達比星；異環(huán)磷酰胺；依立替康；洛莫司?。画h(huán)己亞硝脲；美法侖；左旋苯丙氨酸氮芥；巰基嘌呤；氨甲蝶呤；絲裂霉素；米托蒽醌；二羥基蒽酮；奧沙利鉑；丙卡巴肼；甲芐肼；美羅華；類固醇；鏈佐星；鏈脲霉素；紫杉醇，泰索帝；硫鳥嘌呤；噻替哌；硫替哌；三胺硫磷；雷替曲塞；拓撲替康；曲奧舒凡；尿嘧啶；長春堿；長春花堿；長春地辛；長春瑞賓；格列衛(wèi)；羥基喜樹堿；或它們的混合物。更優(yōu)選的，所述的藥物組合物還含有藥學上可接受的載體或賦形劑。本發(fā)明中，"藥學上可接受的"成分是適用于人和/或動物而無過度不良副反應(如毒性、刺激和變態(tài)反應)即有合理的效益/風險比的物質。本發(fā)明中，"藥學上可接受的載體"是用于將本發(fā)明的藥物組合物傳送給動物或人的藥學上可接受的溶劑、懸浮劑或賦形劑。所述的載體可以是液體或固體。本發(fā)明所述的藥物組合物的劑型可以是多種多樣的，只要是能夠使活性成分有效地到達哺乳動物體內的劑型都是可以的。比如可選自注射劑、注射用無菌粉末、片劑。本發(fā)明的短葉老鸛草素或藥物組合物也可儲存在適宜于注射或滴注的消毒器具中。在所述藥物組合物中，所述的短葉老鸛草素與抗腫瘤藥物的比例可隨待治療的腫瘤的種類、抗藥性程度、或抗腫瘤藥物的種類而定；所述比例對于本領域人員而言是可以根據(jù)臨床狀況而確定的。通常，短葉老鸛草素與抗腫瘤藥物的比例(重量比)在l:(0.1-10000)范圍內；優(yōu)選的在l:(1-1000)范圍內；更優(yōu)選的在l:(1-200)范圍內；最優(yōu)選的在l:(1-50)范圍內。本發(fā)明的藥物組合物的有效劑量可隨給藥的模式和待治療的疾病的嚴重程度而變化。然而，通常當本發(fā)明的藥物組合物每天以約0.001-100mg/kg動物體重的劑量給予時，能得到令人滿意的效果，較佳地每天以l-3次分開的劑量給予，或以緩釋形式給藥?？烧{節(jié)劑量方案以提供最佳治療應答。例如，由治療狀況的迫切要求，可每天給予若干次分開的劑量，或將劑量按比例地增加或減少。所述化合物或其藥學上可接受的鹽及其組合物可通過口服以及靜脈內、肌內或皮下等途徑給藥。固態(tài)載體包括淀粉、乳糖、磷酸二鈣、微晶纖維素、蔗糖和白陶土，而液態(tài)載體包括無菌水、聚乙二醇、非離子型表面活性劑和食用油(如玉米油、花生油和芝麻油)，只要適合活性成分的特性和所需的特定給藥方式。在制備藥物組合物中通常使用的佐劑也可有利地被包括，例如調味劑、色素、防腐劑和抗氧化劑如維生素E、維生素C、BHT和BHA。適應于注射的藥物形式包括無菌水溶液或分散液和無菌粉(用于臨時制備無菌注射溶液或分散液)。在所有情況中，這些形式必須是無菌的且必須是流體以易于注射器排出流體。在制造和儲存條件下必須是穩(wěn)定的，且必須能防止微生物(如細菌和真菌)的污染影響。載體可以是溶劑或分散介質，其中含有如水、醇(如甘油、丙二醇和液態(tài)聚乙二醇)、它們的適當混合物和植物油。本發(fā)明的主要優(yōu)點在于(1)首次發(fā)現(xiàn)了短葉老鸛草素在提高腫瘤對抗腫瘤藥物敏感性方面的新用途，可有效逆轉腫瘤對腫瘤藥物的多藥耐藥性，提高化療藥物的作用，因而具有極好的藥用前景。(2)所述的短葉老鸛草素可以直接提取自植物中，在毒性低的同時，還具有來源豐富，價格低廉，制備工藝簡單的優(yōu)點。下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計算。實施例1短葉老鸛草素的制備短葉老鸛草素購自湖北省中藥資源與化學重點實驗室；此外，也可根據(jù)Taylor,R.S.等(1998)，Anti-bacterialconstituentsoftheNepalesemedicinalherb，Centipedaminima.Phytochemistry.47，631-634中提供的方法制備獲得。實施例2短葉老鸛草素對MDR細胞和藥物敏感性細胞的細胞毒性作用本實施例中，比較短葉老鸛草素對MDR細胞和藥物敏感性細胞的細胞毒性作用。MDR細胞HCT-8/VCR(購自中南大學湘雅中心實驗室，HTCC-90)和藥物敏感性細胞HCT-8(購自中南大學湘雅中心實驗室，HTCC-86)的細胞毒性作用。HCT-8/VCR和HCT-8是本發(fā)明人隨機選擇的兩種較具代表性的腫瘤細胞模型。將短葉老鸛草素用RPMI1640培養(yǎng)液稀釋成濃度適當濃度。采用噻唑藍(MTT)快速比色法測定短葉老鸛草素MDR細胞(HCT-8/VCR)和藥物敏感性細胞(HCT-8)的細胞毒性作用。將對數(shù)生長期細胞1(T細胞/ml接種于96孔培養(yǎng)板，每孔0.2ml,分別加入一定濃度的短葉老鸛草素，使短葉老鸛草素的終濃度為4uM、8uM、16"M、32uM、64uM，每濃度平行4孔，對照組加等量體積的培養(yǎng)液，置37'C，5%C02及飽和濕度的培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時，實驗終止時每孔加入5mg/mlMTT10u1，培養(yǎng)4小時后每孔加入0.04NDMS0(二甲基亞砜)150u1，振蕩10min，是MTT還原產物完全溶解，用ThermoMultiskanMk3型酶標儀，以550nm為實驗波長，630nm為參照波長測定其吸收度，計算腫瘤細胞的存活率和藥物對細胞的抑制率，并以藥物的不同濃度和細胞的存活率作圖，確定細胞的半數(shù)抑制濃度(ICs。)。結果顯示在HCT-8/VCR中IC5。=24.55uM，同時在IC9。=5.6uM;而在HCT-8細胞中短葉老鸛草素的IC5。=5.75iaM。以上結果說明，短葉老鸛草素具有良好的殺滅腫瘤細胞的作用，不論是對多藥抗藥性細胞還是藥物敏感細胞都可產生相似的抑制效果，而且這種抑制效果還具有劑量依賴性。實施例3短葉老鸛草素與傳統(tǒng)的腫瘤化療藥物耐藥倍數(shù)比較采用MTT法(具體實驗操作參照實施例2)考察五種臨床上較為常用的抗癌藥物長春新堿(VCR)、順鉑(DDP)、5氟尿嘧啶(5FU)、絲裂霉素(MMC)和羥基喜樹堿(HEPT)不同濃度一定作用時間下(24h)對HCT-8和HCT-8/VCR的細胞毒性，以藥物的不同濃度和細胞的存活率作圖，確定細胞的半數(shù)抑制濃度(IC5。)，計算耐藥倍數(shù)(ResistanceFactor,RF=IC50(HCT-8/VCR)/IC50(HCT-8))。并且，將短葉老鸛草素(Brevilin)相同作用時間下與這五種傳統(tǒng)的腫瘤化療藥物耐藥倍數(shù)進行比較。短葉老鸛草素與傳統(tǒng)的腫瘤化療藥物耐藥倍數(shù)比較結果如表1所示。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>以上結果說明，HCT-8/VCR細胞具有非常明顯的抗藥性而HCT-8對藥物的反應卻很敏感。尤其是VCR和DDP的耐藥倍數(shù)為40.7和19.7倍。與之相比較的短葉老鸛草素的耐藥倍數(shù)只有4.3倍。但是，短葉老鸛草素的耐藥倍數(shù)略高于5FU、MIT和HEPT。說明短葉老鸛草素對癌細胞的抑制效果在敏感型菌株和抗藥型菌株都能收到比較好的效果。實施例4短葉老鸛草素對五種傳統(tǒng)腫瘤化療藥物的抗癌效果的影響將對數(shù)生長期HCT-8/VCR細胞104細胞/ml接種于96孔培養(yǎng)板，每孔0.2ml，先分別加入終濃度為1.4uM短葉老鸛草素和常用的化療藥物，每組平行4孑L，對照組加等量體積的培養(yǎng)液，置37'C，5%(]02及飽和濕度的培養(yǎng)箱培養(yǎng)培養(yǎng)24小時，實驗終止后加入5mg/mlMTT10u1，再培養(yǎng)4小時，培養(yǎng)結束后每孔加入O.04NDMSO(二甲基亞砜)，每孔150ul，振蕩10min，使MTT還原產物完全溶解，用ThermoMultiskanMk3型酶標儀，以550nm為實驗波長，630nm為參照波長測定其吸收度，求出半數(shù)抑制濃度(ICs。)，計算逆轉倍數(shù)(reversal<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>從圖ll可以看出經(jīng)過無細胞毒性的短葉老鸛草素(1.4WM)與五種傳統(tǒng)腫瘤化療藥物共同作用后，單獨使用VCR的ICs。值從250ug下降倒12.5ug;其它四種化療藥物的ICs。值也有不同程度的降低。逆轉倍數(shù)由20到2.2倍不等。而且這種增敏作用非常明顯而且不是經(jīng)過累加作用得到的。由此可以得出短葉老鸛草素具有提高多藥抗藥性細胞株對抗癌藥物敏感性的作用，即可以其它化療藥物的逆轉多藥抗藥性。實施例5短葉老鸛草素在體外對腫瘤細胞內抗腫瘤藥物累積的影響采用HPLC法測定HCT-8/VCR細胞內長春新堿的累積量。色譜條件為色譜柱采用EclipseC18(4.6mmX150mm,5um);流動相采用甲醇磷酸二氫鉀(0.06M)=55:45;流速lml/min;檢測波長297nm;進樣量20ul;柱溫20°C。對照樣品采用100ixg/ml長春新堿溶液，采用對半稀釋的方法分別稀釋為IO個濃度。其測定結果作為標準曲線的依據(jù)。將1X106HCT-8/VCR細胞培養(yǎng)于6cm培養(yǎng)皿中，加入長春新堿使其終濃度為10ug/ml，繼續(xù)培養(yǎng)24h。加入不同濃度的短葉老鸛草素并培養(yǎng)3小時。最后用PBS洗三次，收集細胞并超聲破碎。14000rpm離心10min，取上清真空干燥24h。加入PBS70ul，混勻后上機檢測細胞內長春新堿的累積量。結果見圖2，表明隨著短葉老鸛草素用量的升高，細胞內累積長春新堿的量也顯著上升，也即短葉老鸛草素可促進長春新堿在細胞內的累積量。實施例6短葉老鸛草素在體外對腫瘤細胞阿霉素和羅丹明123濃度測定將生長良好的耐藥(HCT-8/VCR細胞(圖中HCT-8/V))和敏感株細胞(HCT-8細胞)經(jīng)RPMI1640洗滌2次，將細胞終濃度調至1X104細胞/ml，加入不同濃度的短葉老鸛草素(O、0.35、0.7、1.4ixM)培養(yǎng)3天后加入50uM阿霉素(本身有熒光效應)和IOpMRhl23反應3小時，PBS洗三次，應用多功能酶標儀進行測定其熒光強度，阿霉素(ADR)檢測波長530nm，激發(fā)波長為485nrn;羅丹明123(Rhl23)檢測波長530nm，激發(fā)波長為550nm。維拉帕米(Verapamil，Ver)為陽性對照。結果見圖3，在不加入短葉老鸛草素時，HCT-8/VCR細胞中阿霉素和羅丹明123的積累量顯著低于HCT-8細胞，而加入老鸛草素后，HCT-8/VCR細胞內阿霉素和羅丹明積累量顯著升高。此外，采用如上類似的方法，本發(fā)明人還測定了短葉老鸛草素在體外對其它多種耐藥腫瘤細胞株(包括經(jīng)低劑量阿霉素長期誘導產生的耐阿霉素等化療藥的耐藥乳腺癌細胞系，經(jīng)低劑量長春新堿長期誘導產生的耐長春新堿等化療藥的細胞系等)中阿霉素和羅丹明123積累的影響，結果也發(fā)現(xiàn)耐藥腫瘤細胞內阿霉素和羅丹明123積累量顯著升高。實施例7短葉老鸛草素在體內對長春新堿的腫瘤增殖作用的影響將HCT-8/VCR細胞常規(guī)方法消化后收集到離心管中，然后用磷酸緩沖液(PBS)制成濃度為107ml的細胞懸液。按照每個注射點2X106細胞，總體積為0.2ml的方法皮下注射到裸小鼠的左右前肢的腋下。等到腫瘤直徑達到2.0cm左右時將腫瘤解剖下來，然后用磷酸緩沖液(PBS)小心勻槳制備成細胞懸液。再以細胞數(shù)量2X106，注射體積0.2ml的方法皮下注射到每只小鼠的右側前肢的腋下，總共40只。待小鼠體內腫瘤的直徑達到5X5mm左右時將所有小鼠隨機分為5組，每組8只，包括對照組、短葉老鸛草素單獨作用組、長春新堿單獨作用組、低劑量短葉老鸛草素+長春新堿組和高劑量短葉老鸛草素+長春新堿組。給藥方式為每天10:00腹腔注射短葉老鸛草素，以3.5mg/kg和7mg/kg劑量注射，共計9次，連續(xù)9天，即19天；禾卩/或每天14:00腹腔注射長春新堿，以2.5mg/kg劑量注射，共計9次，小鼠在接種腫瘤細胞后24天時處死，把腫瘤完整地解剖下來，然后立即稱量瘤的重量。實驗結果如表3。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>從表3中可以看出，短葉老鸛草素能夠顯著增強長春新堿的抑制腫瘤增殖作用，明顯增加了腫瘤對化療藥物長春新堿的敏感性。此外，單獨給予健康小鼠低劑量(每天2mg/kg)或高劑量(每天10mg/kg)的短葉老鸛草素，觀察其對于小鼠是否有毒副作用。結果發(fā)現(xiàn)，與沒有給予短葉老鸛草素的小鼠相比，低劑量或高劑量給藥小鼠的活動、食量等均沒有顯著的變化。因此可見，短葉老鸛草素對于動物沒有顯著的毒性，安全可靠。實施例7藥物組合物制備注射劑，注射劑的配方如表4和表5所示。根據(jù)常規(guī)的注射劑制備方法來制備即可。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>經(jīng)驗證，所述包含短葉老鸛草素和抗腫瘤藥物的組合物的抑癌效果明顯優(yōu)于單獨使用短葉老鸛草素或單獨使用該抗腫瘤藥物時的效果。在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內容之后，本領域技術人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。權利要求1.一種短葉老鸛草素的用途，其特征在于，用于制備抗腫瘤藥物的增敏劑或逆轉劑。2.如權利要求l所述用途，其特征在于，所述的抗腫瘤藥物選自阿霉素；長春新堿；紫杉醇；順鉑；放線菌素；博來霉素；白消安；卡培他濱；卡鉑；卡莫司??；苯丁酸氮芥；環(huán)磷酰胺；阿糖胞苷；柔紅霉素；表阿霉素；依托泊武；足葉乙甙；鬼臼乙叉武；氟阿糖腺苷酸；5-氟尿嘧啶；吉西他濱；赫賽?。涣u基脲；伊達比星；異環(huán)磷酰胺；依立替康；洛莫司??；環(huán)己亞硝脲；美法侖；左旋苯丙氨酸氮芥；巰基嘌呤；氨甲蝶呤；絲裂霉素；米托蒽醌；二羥基蒽酮；奧沙利鉑；丙卡巴肼；甲芐肼；美羅華；類固醇；鏈佐星；鏈脲霉素；紫杉醇，泰索帝；硫鳥嘌呤；噻替哌；硫替哌；三胺硫磷；雷替曲塞；拓撲替康；曲奧舒凡；尿嘧啶；長春堿；長春花堿；長春地辛；長春瑞賓；格列衛(wèi)；羥基喜樹堿；或它們的混合物。3.如權利要求l所述用途，其特征在于，所述的腫瘤選自鼻咽癌；食管癌；胃癌；肝癌；乳腺癌；結腸癌；前列腺癌；肺癌；宮頸癌；白血?。豢谇话?；唾液腺腫瘤；鼻腔與鼻旁竇惡性腫瘤；喉癌；耳部腫瘤；眼部腫瘤；甲狀腺腫瘤；縱隔腫瘤；胸壁；胸膜腫瘤；小腸腫瘤；膽道腫瘤；胰腺與壺腹周圍腫瘤；腸系膜與腹膜后腫瘤；腎臟腫瘤；腎上腺腫瘤；膀胱腫瘤；前列腺癌；睪丸腫瘤；陰莖癌；子宮內膜癌；卵巢惡性腫瘤；惡性滋養(yǎng)細胞腫瘤；外陰癌與陰道癌；惡性淋巴瘤；多發(fā)性骨髓瘤；軟組織腫瘤；骨腫瘤；皮膚及附件腫瘤；惡性黑色素瘤；或神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤。4.如權利要求l所述的用途，其特征在于，所述的增敏劑或逆轉劑用于提高抗腫瘤藥物在腫瘤細胞內的累積量。5.—種抗腫瘤的藥物組合物，其特征在于，含有:(a)有效量的短葉老鸛草素，和(b)有效量的抗腫瘤藥物；其中，所述抗腫瘤藥物選自阿霉素；長春新堿；紫杉醇；順鉑；放線菌素；博來霉素；白消安；卡培他濱；卡鉑；卡莫司??；苯丁酸氮芥；環(huán)磷酰胺;阿糖胞苷；柔紅霉素；表阿霉素；依托泊甙；足葉乙甙；鬼臼乙叉甙；氟阿糖腺苷酸；氟尿嘧啶；吉西他濱；赫賽汀；羥基脲；伊達比星；異環(huán)磷酰胺；依立替康；洛莫司??；環(huán)己亞硝脲；美法侖；左旋苯丙氨酸氮芥；巰基嘌呤；氨甲蝶呤；絲裂霉素；米托蒽醌；二羥基蒽酮；奧沙利鉑；丙卡巴肼；甲芐肼；美羅華；類固醇；鏈佐星；鏈脲霉素；紫杉醇，泰索帝；硫鳥嘌呤；噻替哌；硫替哌；三胺硫磷；雷替曲塞；拓撲替康；曲奧舒凡；尿嘧啶；長春堿；長春花堿；長春地辛；長春瑞賓；格列衛(wèi)；羥基喜樹堿；或它們的混合物。6.如權利要求5所述的藥物組合物，其特征在于，短葉老鸛草素與抗腫瘤藥物的重量比為1:(0.1-10000)。7.如權利要求5所述的藥物組合物，其特征在于，所述的藥物組合物中還含有(c)藥學上可接受的載體。8.如權利要求5所述的藥物組合物，其特征在于，所述的腫瘤選自鼻咽癌；食管癌；胃癌；肝癌；乳腺癌；結腸癌；前列腺癌；肺癌；宮頸癌；白血?。豢谇话?；唾液腺腫瘤；鼻腔與鼻旁竇惡性腫瘤；喉癌；耳部腫瘤；眼部腫瘤；甲狀腺腫瘤；縱隔腫瘤；胸壁；胸膜腫瘤；小腸腫瘤；膽道腫瘤；胰腺與壺腹周圍腫瘤；腸系膜與腹膜后腫瘤；腎臟腫瘤；腎上腺腫瘤；膀胱腫瘤；前列腺癌；睪丸腫瘤；陰莖癌；子宮內膜癌；卵巢惡性腫瘤；惡性滋養(yǎng)細胞腫瘤；外陰癌與陰道癌；惡性淋巴瘤；多發(fā)性骨髓瘤；軟組織腫瘤；骨腫瘤；皮膚及附件腫瘤；惡性黑色素瘤；或神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤。9.如權利要求5所述的藥物組合物，其特征在于，所述組合物的劑型選自注射劑、注射用無菌粉末、片劑。10.—種體外抑制腫瘤細胞的方法，其特征在于，所述方法包括給予腫瘤細胞有效量的有效量的短葉老鸛草素和有效量的抗腫瘤藥物；其中所述抗腫瘤藥物選自阿霉素；長春新堿；紫杉醇；順鉑；放線菌素；博來霉素；白消安；卡培他濱；卡鉑；卡莫司??；苯丁酸氮芥；環(huán)磷酰胺；阿糖胞苷；柔紅霉素；表阿霉素；依托泊甙；足葉乙甙；鬼臼乙叉甙；氟阿糖腺苷酸；氟尿嘧啶；吉西他濱；赫賽??；羥基脲；伊達比星；異環(huán)磷酰胺；依立替康；洛莫司??；環(huán)己亞硝脲；美法侖；左旋苯丙氨酸氮芥；巰基嘌呤；氨甲蝶呤；絲裂霉素；米托蒽醌；二羥基蒽酮；奧沙利鉑；丙卡巴肼；甲芐肼；美羅華；類固醇；鏈佐星；鏈脲霉素；紫杉醇，泰索帝；硫鳥嘌呤；噻替哌；硫替哌；三胺硫磷；雷替曲塞；拓撲替康；曲奧舒凡；尿嘧啶；長春堿；長春花堿；長春地辛；長春瑞賓；格列衛(wèi)；羥基喜樹堿；或它們的混合物。全文摘要本發(fā)明屬于藥物學領域，公開了短葉老鸛草素的新用途，用于制備抗腫瘤藥物的增敏劑或逆轉劑。本發(fā)明首次揭示短葉老鸛草素在提高腫瘤對抗腫瘤藥物敏感性方面的新用途，可有效逆轉腫瘤對腫瘤藥物的多藥耐藥性，并且所述的短葉老鸛草素毒性低、來源豐富，具有極好的藥用前景。文檔編號A61K9/20GK101433535SQ20071017048公開日2009年5月20日申請日期2007年11月16日優(yōu)先權日2007年11月16日發(fā)明者于有軍,劉建文,劉焱文,吳和珍,吳宏忠,孫麗娟,山冬梅,文徐,房一時,李長龍,楊艷芳,勁王,芳王,鄧皖利申請人:華東理工大學