專利名稱：腎茶抗泌尿系統(tǒng)結(jié)石提取物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及中草藥的提取物與應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及腎茶抗泌尿系統(tǒng)結(jié)石提取物及其制備方法。
背景技術(shù)：
腎結(jié)石、膀胱結(jié)石、尿路結(jié)石等是泌尿系統(tǒng)的常見病，文獻(xiàn)報(bào)道歐洲為5％～9％，加拿大為12％，美國為13％左右，我國發(fā)病率9％～15％左右，廣東地區(qū)泌尿結(jié)石的發(fā)病率高達(dá)20％。發(fā)病隨年齡增加，危險(xiǎn)性也增大。氣候較熱的地區(qū)、嗜食動(dòng)物蛋白人群，尤其是男性30～50歲的青、中年，發(fā)病率較高，男女之比為2～3∶1。近年的流行病學(xué)調(diào)查，其發(fā)病率呈上升趨勢，尤其中青年增加更明顯，嚴(yán)重影響了人們的健康。
目前泌尿系結(jié)石，尤其是腎結(jié)石治療主要運(yùn)用體外沖擊波碎石術(shù)(ESWL)和腔內(nèi)泌尿外科手術(shù)，常引起腎臟的損傷和嚴(yán)重的并發(fā)癥，可使腎組織退行性病變，產(chǎn)生腎小球玻璃樣變和纖維化，間質(zhì)充血，炎癥細(xì)胞浸潤，且ESWL及手術(shù)治療都難以根治腎結(jié)石，其術(shù)后復(fù)發(fā)率高約78％～80％。如何采用藥物無創(chuàng)排除結(jié)石、并防止結(jié)石的形成和復(fù)發(fā)，是近代醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的重點(diǎn)研究課題。而我國的傳統(tǒng)中醫(yī)藥資源為泌尿系藥物排石、預(yù)防結(jié)石形成和復(fù)發(fā)開辟了廣闊的前景。
腎茶為唇形科腎茶屬Clerodendranthus植物腎茶C.spicatus(Thunb.)C.Y.Wu ex H.W.Li，又名貓須草。為多年生草本；莖直立，高0.5～1m，四棱形；葉對生，菱狀卵形或卵狀披針形，長3～10cm，寬1.5cm～5cm，葉緣具粗大牙齒，兩面被毛，具腺點(diǎn)，葉柄長達(dá)1.2cm；輪傘花序4～8朵排成頂生總狀花序，花唇形，花冠淡紫或白色，雄蕊4枚，2長2短，花絲超出花冠2～4cm；小堅(jiān)果卵形，具皺紋；花果期5～10月。氣淡，味微甘，稍苦。腎荼喜歡溫暖濕潤的氣候，原產(chǎn)地年平均氣溫19.6～23.8℃，年降雨量1157.6～2103mm，生長適宜溫度為26～30℃。
腎茶全世界約有五種，廣泛分布于印度東部、泰國、印度尼西亞與澳大利亞等地。在印尼民間腎茶作為一種治療糖尿病、高血壓、風(fēng)濕病、扁桃體炎、月經(jīng)不調(diào)等的有效藥物；在越南腎茶地上部分被用于治療泌尿系結(jié)石、浮腫、急性發(fā)熱、流感、肝炎和黃疸等；在緬甸腎茶被認(rèn)為是一種抗糖尿病藥，干葉的水煎劑用于治療尿道和腎臟疾??；在日本沖繩，腎茶被稱作爪哇茶可促進(jìn)身體解毒。我國僅有一種即腎茶[C.spicatus(Thunb).C.Y.Wu ex H.W.Li]，主產(chǎn)于廣西、廣東、云南、福建、臺(tái)灣等地。我國民間使用腎茶歷史悠久，在西雙版納，傣醫(yī)藥名稱“雅娜妙”。全草入藥，認(rèn)為有利尿、抗菌、消炎、溶石、排石等作用，常用于急、慢性腎炎、膀胱炎、尿路結(jié)石、咽炎及風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。從臨床文獻(xiàn)和民間用藥跟蹤調(diào)查，腎茶能預(yù)防和降低腎結(jié)石復(fù)發(fā)，促進(jìn)尿路結(jié)石排出，改善病人的生活質(zhì)量。
目前已從腎茶的地上部分提取出14個(gè)黃酮類化合物，12個(gè)黃酮苷元，2個(gè)為黃酮醇苷。8個(gè)酚酸類成分，即咖啡酸、咖啡酸的二聚體迷迭香酸、咖啡酸與酒石酸的縮合物caffeoyl tartrate及dicaffeoyl tartrate和四個(gè)咖啡酸四聚物。此外還有澤蘭黃素、琥珀酸、苯甲酸、乳酸、胡蘿卜苷、熊果酸、葡萄糖、戊糖、油脂、酒石酸、檸檬烯、龍腦、麝香草酚、消旋肌醇和一個(gè)香豆素等成分。
腎茶一直以來作為民間用藥，用途廣泛，其利尿、排石方面有顯著的功效，受到人們的廣泛關(guān)注，醫(yī)藥界也對其進(jìn)行了一定的研究。泰國的Premgamone等對腎茶進(jìn)行了長達(dá)18個(gè)月的臨床研究表明腎茶治療腎結(jié)石的效果優(yōu)于枸櫞酸鉀鈉。黃榮桂等臨床研究證明腎茶對泌尿系感染、治療尿路結(jié)石有較好療效。近年來國內(nèi)外對腎茶的化學(xué)成分及其生物活性的研究主要集中在抗腫瘤、抗菌消炎、利尿和補(bǔ)腎的作用表面上，而對其在泌尿系的利尿、排石、消炎等具體作用上究竟是什么活性化學(xué)成分起主導(dǎo)作用、其作用的機(jī)理是什么等了解甚少。為了加深腎茶在排泌尿系結(jié)石方面的開發(fā)應(yīng)用，我們對腎茶與抗泌尿系結(jié)石有關(guān)的3種提取物的作用、作用機(jī)理作了深入的研究。

發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的，是針對目前腎茶在抗泌尿系結(jié)石利用上存在不明其有效主導(dǎo)成份是什么及其作用機(jī)理的缺陷，在探明腎茶提取物中與泌尿系的結(jié)石、尿少、尿路感染和結(jié)石對臟器的損傷等癥狀有關(guān)物質(zhì)的作用效果及其機(jī)理基礎(chǔ)上，提出3種分別對泌尿系的抗結(jié)石、排石、利尿、消炎、抗氧化損傷等有效，可直接、復(fù)合或作為中間產(chǎn)品可進(jìn)一步開發(fā)成藥用產(chǎn)品的腎茶活性提取物；本發(fā)明的另一目的是提出這3種腎茶活性提取物的具體制備方法。
本發(fā)明目的通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)(一)腎茶提取物A組分，可按以下方法制得(1)將腎茶[C.spicatus(Thunb.)C.Y.Wu ex H.W.Li]干品粉碎后與甲醇按克重量∶毫升體積為1∶4～10的比例，浸泡3次，每次10天，合并、濃縮浸提液得浸膏混合物；(2)先將水與甲醇按1∶5～12體積比混配成溶解液，再將步驟(1)浸膏混合物與溶解液按克重量∶毫升體積為1∶1比例混合、攪拌至充分溶解；(3)將步驟(2)浸膏溶解液先用石油醚萃取4次，充分去除樹脂、葉綠素等低極性的雜質(zhì)成分后，再用乙酸乙酯萃取4次，合并、濃縮萃取物；(4)將步驟(3)萃取物進(jìn)行硅膠柱層析、梯度洗脫、收集并濃縮得黑褐色粘稠狀的腎茶提取物A組分。
腎茶提取物A組分，經(jīng)過鑒定分析為脂溶性的黃酮甙元類化合物。
腎茶提取物A組分，具有明顯改善結(jié)石癥狀，減少腎臟組織中鈣和草酸的含量，減輕腎臟組織病變程度，減少結(jié)石量；增加腎結(jié)石者的尿量，尤其在0～4h時(shí)的作用點(diǎn)尿量增加較顯著；增加膀胱平滑肌收縮幅度，加快節(jié)律，松馳輸尿管、尿道平滑肌，有助于對泌尿系結(jié)石的排出；消炎；在一定程度上降低腎結(jié)石腎組織LPO含量，改善對腎組織的損傷等作用，可直接、復(fù)合或作為中間體進(jìn)一步分離提取出藥用有效活性成份，用于泌尿系抗結(jié)石、排石、利尿和消炎等的藥物。
所述腎茶提取物A組分的制備方法，按以下步驟進(jìn)行(1)將腎茶[C.spicatus(Thunb.)C.Y.Wu ex H.W.Li]干品粉碎后與甲醇按克重量∶毫升體積為1∶4～10的比例，浸泡3次，每次10天，合并、濃縮浸提液得浸膏混合物；(2)先將水與甲醇按1∶5～12體積比混配成溶解液，再將步驟(1)浸膏混合物與溶解液按克重量∶毫升體積為1∶1比例混合、攪拌至充分溶解；(3)將步驟(2)浸膏溶解液先用石油醚萃取4次，充分去除樹脂、葉綠素等低極性的雜質(zhì)成分后，再用乙酸乙酯萃取4次，合并、濃縮萃取物；(4)將步驟(3)萃取物進(jìn)行硅膠柱層析、梯度洗脫、收集并濃縮得腎茶提取物A組分產(chǎn)品。
(二)腎茶提取物B組分，可按以下方法制得(1)將腎茶[C.spicatus(Thunb.)C.Y.Wu ex H.W.Li]干品粉碎后與甲醇按克重量∶毫升體積為1∶4～10的比例，共浸泡3次，每次10天，合并、濃縮浸提液得浸膏混合物；(2)先將水與甲醇按1∶5～12體積比混配成溶解液，再將步驟(1)浸膏混合物與溶解液按克重量∶毫升體積為1∶1比例混合、攪拌至充分溶解；(3)將步驟(2)浸膏溶解液先用石油醚和乙酸乙酯分別萃取3-5次，充分去除樹脂、葉綠素等低極性的雜質(zhì)和脂溶性成分后，再用正丁醇萃取4次，合并、濃縮萃取物；(4)將步驟(3)萃取物進(jìn)行硅膠柱層析、梯度洗脫、收集并濃縮得淺褐色粘稠狀的腎茶提取物B組分。
腎茶提取物B組分，經(jīng)過鑒定分析為脂溶性的黃酮醇甙類化合物。
腎茶提取物B組分，具有明顯改善結(jié)石癥狀，減少腎臟組織中鈣和草酸的含量，減輕腎臟組織病變程度，減少結(jié)石量；增加腎結(jié)石者的尿量；增加膀胱平滑肌收縮幅度，加快節(jié)律，松馳輸尿管、尿道平滑肌，有助于對泌尿系結(jié)石的排出；消炎；在一定程度上降低腎結(jié)石腎組織LPO含量，改善對腎組織的損傷等作用，可直接、復(fù)合或作為中間體進(jìn)一步分離出提取藥用有效活性成份，用于泌尿系抗結(jié)石、排石、利尿、消炎等的藥物。
所述腎茶提取物B組分的制備方法，按以下步驟進(jìn)行(1)將腎茶[C.spicatus(Thunb.)C.Y.Wu ex H.W.Li]干品粉碎后與甲醇按克重量∶毫升體積為1∶4～10的比例，共浸泡3次，每次10天，合并、濃縮浸提液得浸膏混合物；(2)先將水與甲醇按1∶5～12體積比混配成溶解液，再將步驟(1)浸膏混合物與溶解液按克重量∶毫升體積為1∶1比例混合、攪拌至充分溶解；(3)將步驟(2)浸膏溶解液先用石油醚和乙酸乙酯分別萃取3-5次，充分去除樹脂、葉綠素等低極性的雜質(zhì)和脂溶性成分后，再用正丁醇萃取4次，合并、濃縮萃取物；(4)將步驟(3)萃取物進(jìn)行硅膠柱層析、梯度洗脫、收集并濃縮得腎茶提取物B組分產(chǎn)品。
(三)腎茶提取物C組分，可按以下方法制備獲得(1)將腎茶[C.spicatus(Thunb.)C.Y.Wu ex H.W.Li]干品粉碎后與甲醇按克重量∶毫升體積為1∶4～10的比例，浸泡2-3周后，濾去甲醇溶液至充分揮發(fā)干燥，備用；
(2)將步驟(1)處理后腎茶，用水浸沒后煮3-4次，每次4小時(shí)，合并水煮液、濃縮；(3)將步驟(2)濃縮液，分別用濃度為65％、75％、85％、95％的乙醇進(jìn)行分級沉降，收集后得黑色粘稠狀的腎茶提取物C組分。
腎茶提取物C組分，經(jīng)過鑒定分析為多糖類化合物。
腎茶提取物C組分，具有明顯改善結(jié)石癥狀，減少腎臟組織中鈣和草酸的含量，減輕腎臟組織病變程度，減少結(jié)石量；可延長利尿的時(shí)間，明顯增加腎結(jié)石者的尿量；增加膀胱平滑肌收縮幅度，加快節(jié)律，松馳輸尿管、尿道平滑肌，有助于對泌尿系結(jié)石的排出；明顯降低腎結(jié)石腎組織LPO含量，改善對腎組織的損傷等作用，可直接、復(fù)合或作為中間體進(jìn)一步分離提取出藥用有效活性成份，用于泌尿系抗結(jié)石、排石、利尿、抗腎結(jié)石損傷等的藥物。
所述腎茶提取物C組分的制備方法，按以下步驟進(jìn)行(1)將腎茶[C.spicatus(Thunb.)C.Y.Wu ex H.W.Li]干品粉碎后與甲醇按克重量∶毫升體積為1∶4～10的比例，浸泡2-3周后，濾去甲醇溶液至充分揮發(fā)干燥，備用；(2)將步驟(1)處理后腎茶，用水浸沒后煮3-4次，每次4小時(shí)，合并水煮液、濃縮；(3)將步驟(2)濃縮液，分別用濃度為65％、75％、85％、95％的乙醇進(jìn)行分級沉降，收集后得腎茶提取物C組分產(chǎn)品。
本發(fā)明的有益效果是一、腎茶提取物A組分，通過動(dòng)物試驗(yàn)明確[1]在草酸鈣腎結(jié)石模型試驗(yàn)中，結(jié)石小鼠、大鼠在體重減輕，腎體比增加等的癥狀較對照得到明顯改善(見表1、表4、表5)；腎臟組織中鈣和草酸的含量較對照明顯減少(表2、表6)；腎結(jié)石小鼠、大鼠腎臟組織病變程度，腎組織草酸鈣結(jié)石評分較對照明顯減輕(表3、表7)；上述腎組織中草酸和鈣含量的測定與腎組織病理切片觀察的結(jié)果相一致，表明腎茶提取物A組分具有抗腎結(jié)石的作用。[2]在對鼠尿量試驗(yàn)中，腎茶A組分對正常小鼠在0～4h時(shí)的作用點(diǎn)尿量增加較顯著，具有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)；而對腎結(jié)石小鼠的尿量有增加，但與模型組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)(見表9)；此外，腎茶提取物A組分可明顯增加腎結(jié)石大鼠的尿量，與模型組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)(見表10)。[3]在對動(dòng)物泌尿系平滑肌的試驗(yàn)中，腎茶A組分對豚鼠、新西蘭兔膀胱平滑肌有增加收縮幅度，加快節(jié)律的作用；而對輸尿管、尿道平滑肌均有松馳作用(見圖1、圖2、圖3)，這有助于對泌尿系結(jié)石的排出。[4]在對小鼠二甲苯致耳炎的抗炎試驗(yàn)中，與對照組比較，腎茶A組分與消炎痛組一樣對耳炎腫脹度降低有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)(見表11)，具較好的消炎作用。[5]在對腎結(jié)石小鼠抗過氧化脂質(zhì)的試驗(yàn)中，小鼠形成腎結(jié)石后，腎組織LPO含量明顯上升，與對照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，腎茶A組分和排石顆粒組一樣可使腎結(jié)石小鼠的腎組織LPO含量下降，但與模型組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)(見表12)。因此，腎茶A組分可直接、復(fù)合或作為中間體進(jìn)一步分離提取出藥用有效活性成份，用于泌尿系抗結(jié)石、排石、利尿和消炎等的藥物。
二、腎茶提取物B組分，通過動(dòng)物試驗(yàn)明確[1]在草酸鈣腎結(jié)石模型試驗(yàn)中，結(jié)石小鼠、大鼠在體重減輕，腎體比增加等的癥狀較對照得到明顯改善(見表1、表4、表5)；腎臟組織中鈣和草酸的含量較對照明顯減少(表2、表6)；腎結(jié)石小鼠、大鼠腎臟組織病變程度，腎組織草酸鈣結(jié)石評分較對照明顯減輕(見表3、表7)；上述腎組織中草酸和鈣含量的測定與腎組織病理切片觀察的結(jié)果相一致，表明腎茶提取物B組分具抗腎結(jié)石作用。[2]在對鼠尿量試驗(yàn)中，小鼠形成腎結(jié)石后，尿量明顯下降，腎茶B組分可增加腎結(jié)石小鼠的尿量，但與模型組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)(見表9)；腎茶B組分可明顯增加腎結(jié)石大鼠的尿量，與模型組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)(見表10)。[3]在對動(dòng)物泌尿系平滑肌的試驗(yàn)中，腎茶B組分對豚鼠、新西蘭兔膀胱平滑肌有增加收縮幅度，加快節(jié)律的作用；對輸尿管、尿道平滑肌均有松馳作用(見圖1、圖2、圖3)，這有助于對泌尿系結(jié)石的排出。[4]在對小鼠二甲苯致耳炎的抗炎試驗(yàn)中，對照組小鼠二甲苯致炎后右耳明顯腫脹，而腎茶B組分與消炎痛組一樣對耳炎腫脹度降低有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)(見表11)，具較好的消炎作用。[5]在對腎結(jié)石小鼠抗過氧化脂質(zhì)的試驗(yàn)中，小鼠形成腎結(jié)石后，腎組織LPO含量明顯上升，與對照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；腎茶B組分與排石顆粒組一樣可使腎結(jié)石小鼠的腎組織LPO含量下降，但與模型組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)(見表12)。因此，腎茶B組分可直接、復(fù)合或作為中間體進(jìn)一步分離提取出藥用有效活性成份，用于泌尿系抗結(jié)石、排石、利尿、消炎等的藥物。
三、腎茶提取物C組分，通過動(dòng)物試驗(yàn)明確[1]在草酸鈣腎結(jié)石模型試驗(yàn)中，結(jié)石小鼠、大鼠在體重減輕，腎體比增加等的癥狀較對照得到明顯改善(見表1、表4、表5)；腎臟組織中鈣和草酸的含量較對照明顯減少(見表2、表6)；腎結(jié)石小鼠、大鼠腎臟組織病變程度，腎組織草酸鈣結(jié)石評分較對照明顯減輕(見表3、表7)；上述腎組織中草酸和鈣含量的測定與腎組織病理切片觀察的結(jié)果相一致，表明腎茶提取物C組分具抗腎結(jié)石作用。[2]在對鼠尿量試驗(yàn)中，小鼠形成腎結(jié)石后，尿量明顯下降，腎茶C組分可增加腎結(jié)石小鼠的尿量，但與模型組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)(見表9)；但腎茶C組分可明顯增加腎結(jié)石大鼠的尿量，其作用時(shí)間較長，可持續(xù)24小時(shí)有效(見表10)，具有較好的利尿作用。[3]在對動(dòng)物泌尿系平滑肌的試驗(yàn)中，腎茶C組分對豚鼠、新西蘭兔膀胱平滑肌均有增加收縮幅度，加快節(jié)律的作用；對輸尿管、尿道平滑肌均有松馳作用(見圖1、圖2、圖3)，這有助于對泌尿系結(jié)石的排出。[4]在對小鼠二甲苯致耳炎的抗炎試驗(yàn)中，對照組小鼠二甲苯致炎后右耳明顯腫脹，腎茶C組分小鼠的耳廓腫脹度有所下降，但不明顯，與對照組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)(見表11)。[5]在對腎結(jié)石小鼠抗過氧化脂質(zhì)的試驗(yàn)中，小鼠形成腎結(jié)石后，腎組織LPO含量明顯上升，與對照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，腎茶C組分與排石顆粒組一樣可使腎結(jié)石小鼠的腎組織LPO含量明顯下降，與模型組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)(見表12)，對腎結(jié)石抗過氧化脂質(zhì)具較好的作用。因此，腎茶C組分可直接、復(fù)合或作為中間體進(jìn)一步分離提取出藥用有效活性成份，用于泌尿系抗結(jié)石、排石、利尿、抗腎結(jié)石損傷等的藥物。
四、腎茶提取物A、B、C組分僅是單一提取物，可根據(jù)不同需求從中選擇單獨(dú)使用或以不同的組合入藥來治療和消除泌尿系的結(jié)石癥狀，如抗結(jié)石、排石、利尿、抗炎、抗損傷等。

圖1腎茶提取物A、B、C組分對豚鼠膀胱平滑肌的作用曲線圖；圖2腎茶提取物A、B、C組分對豚鼠輸尿管平滑肌的作用曲線圖；圖3腎茶提取物A、B、C組分對豚鼠尿道平滑肌的作用曲線圖。
具體實(shí)施方式通過以下實(shí)施例和試驗(yàn)例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明，但這并不是對本發(fā)明的具體限定。
與以下實(shí)施例有關(guān)的材料、設(shè)備等作說明如下腎茶[C.spicatus(Thunb.)C.Y.Wu ex H.W.Li]溶解液水與甲醇按1∶5～12體積混合而成石油醚批號(hào)20030610，浙江巨化集團(tuán)公司試劑廠生產(chǎn)乙酸乙酯批號(hào)20031009，浙江巨化集團(tuán)公司試劑廠生產(chǎn)正丁醇批號(hào)20021217，浙江巨化集團(tuán)公司試劑廠生產(chǎn)甲醇批號(hào)20021201，浙江巨化集團(tuán)公司試劑廠生產(chǎn)乙醇(95％)批號(hào)2003042012，安徽特酒總廠生產(chǎn)柱層析硅膠青島海洋化工廠生產(chǎn)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀R203B型，上海申生科技有限公司生產(chǎn)輔劑車前子、沉香、白芍、雞內(nèi)金均購自溫州中藥店，經(jīng)鑒定分別為Plantago asiatica L.(車前子)、Aquilaria sinensis(Lour.)Gilg(沉香)、Paeonialactiflora Pall.(白芍)、Gallus gallus domesticus Brisson(雞內(nèi)金)。
濃縮包括涉及的浸提液、萃取液和水煮液，均采用在40-60℃水溫控制下減壓使水分充分蒸餾進(jìn)行濃縮(特別說明除外)。
實(shí)施例1(腎茶提取物A組分的制備1)所述腎茶提取物A組分的制備，按以下步驟進(jìn)行(1)將腎茶[C.spicatus(Thunb.)C.Y.Wu ex H.W.Li]干品粉碎后與甲醇按重量(g)∶體積(ml)＝1∶4的比例，共浸泡3次，每次10天，合并浸提液在60℃水溫控制下減壓蒸餾濃縮后，得浸膏混合物；(2)將步驟(1)浸膏混合物與水-甲醇按1∶5體積混合的溶解液按重量(g)∶體積(ml)＝1∶1比例混合、攪拌至充分溶解；(3)將步驟(2)浸膏溶解液先用石油醚萃取4次，充分去除樹脂、葉綠素等低極性的雜質(zhì)成分，再用乙酸乙酯萃取4次，合并、濃縮萃取物；(4)將步驟(3)萃取物進(jìn)行硅膠柱層析、梯度洗脫、收集并在60℃水溫控制下減壓蒸餾濃縮后得黑褐色粘稠狀的腎茶提取物A組分。
實(shí)施例2(腎茶提取物A組分的制備2)本制備例中，所述腎茶干品粉碎后與甲醇按重量(g)∶體積(ml)＝1∶7的比例浸泡；合并浸提液在50℃水溫控制下減壓蒸餾濃縮；水-甲醇按1∶9體積混合成溶解液；層析、洗脫、收集液在50℃水溫控制下減壓蒸餾濃縮，其余制備步驟與工藝條件均同于實(shí)施例1。
實(shí)施例3(腎茶提取物A組分的制備3)本制備例中，所述腎茶干品粉碎后與甲醇按重量(g)∶體積(ml)＝1∶10的比例浸泡；合并浸提液在40℃水溫控制下減壓蒸餾濃縮；水-甲醇按1∶12體積混合成溶解液；層析、洗脫、收集液在40℃水溫控制下減壓蒸餾濃縮，其余制備步驟與工藝條件均同于實(shí)施例1。
實(shí)施例4(腎茶消石湯A)將車前子30克、沉香3克、白芍10克、雞內(nèi)金15克，加水1000ml浸泡半小時(shí)，煎煮15分鐘倒出煎劑，同法再煎煮1次，合并兩次煎劑，用無菌水補(bǔ)足至1200ml后，加入實(shí)施例1、2或3所制備的腎茶提取物A組分1克，攪拌至溶解后即成腎茶消石湯A。每日1劑，服藥后20分鐘進(jìn)行跳躍運(yùn)動(dòng)15分鐘，并盡量多飲水、多排尿，三個(gè)月為一療程，具抗結(jié)石、排石溶石、利尿、消炎止痛功效。
實(shí)施例5(腎茶提取物B組分的制備1)所述腎茶提取物B組分的制備，按以下步驟進(jìn)行(1)將腎茶[C.spicatus(Thunb.)C.Y.Wu ex H.W.Li]干品粉碎后與甲醇按重量(g)∶體積(ml)＝1∶10的比例，共浸泡3次，每次10天，合并浸提液在40℃水溫控制下減壓蒸餾濃縮后，得浸膏混合物；(2)將步驟(1)浸膏混合物與水-甲醇(按1∶5體積混合)的溶解液按重量(g)∶體積(ml)＝1∶1比例混合、攪拌至充分溶解；(3)將步驟(2)浸膏溶解液用石油醚和乙酸乙酯分別萃取3次，充分去除樹脂、葉綠素等低極性的雜質(zhì)和脂溶性成分，再用正丁醇充分萃取4次，合并濃縮萃取物；(4)將步驟(3)萃取物進(jìn)行硅膠柱層析、梯度洗脫、收集并在40℃水溫控制下減壓蒸餾濃縮后得淺褐色粘稠狀的腎茶提取物B組分。
實(shí)施例6(腎茶提取物B組分的制備2)本制備例中，所述腎茶干品粉碎后與甲醇按重量(g)∶體積(ml)＝1∶8的比例浸泡；合并浸提液在60℃水溫控制下減壓蒸餾濃縮；水-甲醇按1∶9體積混合成溶解液；石油醚萃取浸膏溶解液4次；乙酸乙酯萃取浸膏溶解液4次；層析、洗脫、收集液在50℃水溫控制下減壓蒸餾濃縮，其余制備步驟與工藝條件均同于實(shí)施例5。
實(shí)施例7(腎茶提取物B組分的制備3)本制備例中，所述腎茶干品粉碎后與甲醇按重量(g)∶體積(ml)＝1∶5的比例浸泡；合并浸提液在50℃水溫控制下減壓蒸餾濃縮；水-甲醇按1∶12體積混合成溶解液；石油醚萃取浸膏溶解液5次；乙酸乙酯萃取浸膏溶解液5次；層析、洗脫、收集液在60℃水溫控制下減壓蒸餾濃縮，其余制備步驟與工藝條件均同于實(shí)施例5。
實(shí)施例8(腎茶消石湯B)將車前子30克、沉香3克、白芍10克、雞內(nèi)金15克，加水1000ml浸泡半小時(shí)，煎煮15分鐘倒出煎劑，同法再煎煮1次，合并兩次煎劑，用無菌水補(bǔ)足至1200ml后，加入實(shí)施例5、6或7所制備的腎茶提取物B組分0.5克，攪拌至溶解后即成腎茶消石湯B。每日1劑，服藥后20分鐘進(jìn)行跳躍運(yùn)動(dòng)15分鐘，并盡量多飲水、多排尿，三個(gè)月為一療程，具抗結(jié)石、排石溶石、利尿、消炎止痛功效。
實(shí)施例9(腎茶提取物C組分的制備1)所述腎茶提取物C組分的制備，按以下步驟進(jìn)行(1)將腎茶[C.spicatus(Thunb.)C.Y.Wu ex H.W.Li]干品粉碎后與甲醇按重量(g)∶體積(ml)＝1∶5的比例，浸泡2-3周后，濾去甲醇溶液至充分揮發(fā)干燥，備用；(2)將步驟(1)處理后腎茶，用水浸沒后煮3次，每次4小時(shí)，合并水煮液，在50℃水溫控制下減壓蒸餾濃縮；(3)將步驟(2)濃縮液，分別用濃度為65％、75％、85％、95％的乙醇進(jìn)行分級沉降，收集后得黑色粘稠狀的腎茶提取物C組分。
實(shí)施例10(腎茶提取物C組分的制備2)本制備例中，所述腎茶干品粉碎后與甲醇按重量(g)∶體積(ml)＝1∶8的比例浸泡；濾去甲醇溶液至充分揮發(fā)干燥后的腎茶，用水浸沒后煮4次；在60℃水溫控制下減壓蒸餾濃縮，其余制備步驟與工藝條件均同于實(shí)施例9。
實(shí)施例11(腎茶提取物C組分的制備3)本制備例中，所述腎茶干品粉碎后與甲醇按重量(g)∶體積(ml)＝1∶10的比例浸泡；濾去甲醇溶液至充分揮發(fā)干燥后的腎茶，用水浸沒后煮4次；在40℃水溫控制下減壓蒸餾濃縮，其余制備步驟與工藝條件均同于實(shí)施例9。
實(shí)施例12(腎茶消石湯C)將車前子30克、沉香3克、白芍10克、雞內(nèi)金15克，加水1000ml浸泡半小時(shí)，煎煮15分鐘倒出煎劑，同法再煎煮1次，合并兩次煎劑，用無菌水補(bǔ)足至1200ml后，加入實(shí)施例9、10或11所制備的腎茶提取物C組分6克，攪拌至溶解后即成腎茶消石湯C。每日1劑，服藥后20分鐘進(jìn)行跳躍運(yùn)動(dòng)15分鐘，并盡量多飲水、多排尿，三個(gè)月為一療程，具利尿通淋、消炎止痛、抗腎結(jié)石損傷功效。
與以下試驗(yàn)例有關(guān)的材料、設(shè)備等作說明如下1實(shí)驗(yàn)材料1.1動(dòng)物ICR小鼠，SD大鼠，由浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)碼SCXK(浙)2003-0001。新西蘭兔，DPH豚鼠，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)碼SCXK(浙)2003-0002。由浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。飼養(yǎng)條件室溫18℃～20℃，相對濕度40％～70％，喂以全價(jià)營養(yǎng)顆粒飼料，自由飲水。
1.2藥物腎茶提取物A組分(實(shí)施例1、2或3產(chǎn)品)稱取腎A適量，用1％羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)碾磨均勻配成所需濃度，備用。(小鼠使用濃度6.4mg/ml，灌胃體積0.5ml/20g，劑量為160mg/kg；大鼠使用濃度16mg/ml，灌胃體積1ml/100g，劑量為160mg/kg。下同。)腎茶提取物B組分(實(shí)施例5、6或7產(chǎn)品)稱取腎B適量，用蒸餾水碾磨均勻配成所需濃度，備用。
腎茶提取物C組分(實(shí)施例9、10或11產(chǎn)品)稱取腎C適量，用蒸餾水碾磨均勻配成所需濃度，備用。
吲哚美辛(消炎痛)原料藥，寧波制藥廠惠贈(zèng)，臨用以1％羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)碾磨均勻配成所需濃度，備用。
呋塞米片(速尿)20mg/片，批號(hào)0311131，江蘇林海藥業(yè)有限公司制造分公司，用1％羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)配成所需濃度，備用。
排石顆粒20g/袋，批號(hào)050109，南京同仁堂藥業(yè)有限責(zé)任公司，用蒸餾水碾磨均勻配成所需濃度，備用。
1.3試劑生理鹽水，批號(hào)20040115，浙江平湖莎普愛思制藥有限公司。
乙二醇，批號(hào)990332，余杭市城南化學(xué)試劑廠。
氯化銨，批號(hào)20030603，衢州巨化試劑有限公司。
鈣測定試驗(yàn)盒(甲基百里酚藍(lán)法)批號(hào)030927，寧波市慈城生化試劑廠。
臺(tái)氏液(自配)依次溶解8g NaCl、2ml10％KCl、2.6ml10％MgSO4·7H2O、1g NaHCO3于500ml蒸餾水中(試劑I)，1.8ml 1mol/L CaCl2單獨(dú)溶于200ml蒸餾水(試劑II)，緩慢將試劑II加入試劑I中，邊加邊攪拌，并定容至1000ml(試劑III)。1g葡萄糖于臨用時(shí)加入試劑III，即為臺(tái)氏液。
丙二醛MDA測定試劑盒，批號(hào)20040219，南京建成生物工程研究所。
其它試劑均為分析純。
1.4儀器721型分光光度計(jì)，上海第三分析儀器廠。
離心機(jī)，LXJ-II，上海醫(yī)用分析儀器廠。
電子分析天平，AEL-200，島津。
Medlab-U/4cs生物信號(hào)采集處理系統(tǒng)，南京美易科技有限公司。
SC-15數(shù)控超級恒溫槽，寧波天恒儀器廠。
Motic顯微圖像處理系統(tǒng)，麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司。
試驗(yàn)例1(腎臟中草酸和鈣含量的測定)按以下步驟進(jìn)行1)腎組織處理取供試動(dòng)物一側(cè)腎組織加1M HCl，用勻漿器制成組織勻漿，3000r/min離心10min，取上清液2ml用1M氫氧化鈉調(diào)pH至5.0，補(bǔ)充去離子水至5ml，搖勻；2)腎臟中草酸含量的測定(高錳酸鉀褪色法)取200μl步驟1)腎組織處理液，加500mM氯化鈣0.1ml混勻，加無水乙醇2ml充分混勻，4℃放置過夜，3000r/min離心10min，棄上清液后加0.02M乙酸一草酸鈣平衡液5ml充分混勻。3000r/min離心10min，棄上清。加去離子水5ml，充分混勻，3000r/min離心10min，棄上清。試管倒置于濾紙上瀝干水分，沉淀加1mol/L硫酸1ml及去離子水1ml充分混勻，溶解沉淀物。加高錳酸鉀應(yīng)用液3.0ml混勻，60℃水浴10min，3000r/min離心10min。取上清液525nm比色。同時(shí)做空白及標(biāo)準(zhǔn)測定管(標(biāo)準(zhǔn)管草酸1mM，1ml)。按下列公式計(jì)算測定管草酸濃度＝(空白管A-測定管A)/(空白管A-標(biāo)準(zhǔn)管A)×13)腎臟中鈣含量的測定(甲基百里酚藍(lán)法)另取腎處理液50μl，加3ml顯色劑，混勻，同時(shí)作空白及標(biāo)準(zhǔn)管(標(biāo)準(zhǔn)鈣2.5mM)，用610nm波長，空白管調(diào)零，讀取測定管和標(biāo)準(zhǔn)管分吸光度(A)，按下列公式計(jì)算測定管鈣濃度＝測定管A/標(biāo)準(zhǔn)管A×2.5試驗(yàn)例2(腎臟結(jié)石組織病理學(xué)觀察)供試動(dòng)物末次藥后水負(fù)荷法收集6h尿液。處死動(dòng)物，腎臟稱重后，取一側(cè)腎用10％甲醛固定，常規(guī)切片，HE染色后進(jìn)行腎臟結(jié)石組織病理學(xué)觀察。其中，組織病理學(xué)觀察腎臟結(jié)石評分標(biāo)準(zhǔn)為0分無結(jié)晶；1分局部或散在少到多量沙狀結(jié)晶；2分局部有單個(gè)細(xì)小結(jié)晶；3分局部有多量細(xì)小結(jié)晶或有1個(gè)大顆粒單晶；4分僅有3～4個(gè)大顆粒單晶散在或多量細(xì)小結(jié)晶；5分局部有3～4處多量大結(jié)石積集成堆；6分滿視野多量大結(jié)石積集成堆。
試驗(yàn)例3(腎茶提取物對小鼠草酸鈣腎結(jié)石模型的影響)取小鼠66只，隨機(jī)分為6組，每組11只，除對照組小鼠每日飲用正常水外，其它各組均飲用成石水(1％的乙二醇+1％氯化銨)，連續(xù)飲用6周，造成小鼠腎結(jié)石模型。造模同時(shí)各組按下述劑量給藥。①對照組，ig水；②模型組，ig水；③排石顆粒組，ig排石顆粒6g/kg；④腎茶A組，ig腎茶A溶液160mg/kg；⑤腎茶B組，ig腎茶B溶液160mg/kg；⑥腎茶C組，ig腎茶C溶液160mg/kg；每日給藥1次，給藥體積0.5ml/20g，連續(xù)6周。
末次藥后水負(fù)荷法收集6h尿液，處死動(dòng)物，腎臟稱重后，一側(cè)腎按試驗(yàn)例1方法測定腎組織內(nèi)草酸及鈣含量；另一側(cè)腎按試驗(yàn)例2方法進(jìn)行腎臟結(jié)石組織病理學(xué)觀察，結(jié)果如下(1)一般情況腎結(jié)石成分以草酸鈣和磷酸鈣結(jié)石為主，占全部尿路結(jié)石的80％～84％，其中草酸鈣結(jié)石占58.8％。乙二醇是草酸的前體，進(jìn)入體內(nèi)后轉(zhuǎn)化成羥乙酸，后者既可在羥乙酸氧化酶的作用下直接轉(zhuǎn)化為草酸，也可以通過乳酸脫氧酶的催化轉(zhuǎn)化成乙醛酸，乙醛酸又可以直接在酶或非酶促作用下轉(zhuǎn)化為草酸。因此，給動(dòng)物喂食乙二醇進(jìn)入體內(nèi)代謝后最終轉(zhuǎn)化為草酸，經(jīng)尿排出，增加尿中草酸的濃度，加服氯化銨，腎內(nèi)結(jié)石形成率極高。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在飲水中加入1％乙二醇+1％氯化銨，可以形成理想的腎結(jié)石模型以供實(shí)驗(yàn)研究。小鼠給予成石水4周后，精神萎靡，畏寒卷縮，體毛干枯，無光澤，毛色變黃，呈聳毛狀，體重減輕較明顯，腎體比明顯增加，6周內(nèi)部分動(dòng)物因腎臟嚴(yán)重病變而死亡。而排石顆粒組與腎茶給藥各組與模型組相比，癥狀有所改善。結(jié)果見表1。
表1 腎茶對腎結(jié)石小鼠體重和腎臟重量的影響(x±s)
注與對照組比較***P＜0.001(2)腎茶對腎結(jié)石小鼠腎臟鈣和草酸含量的影響小鼠飲用1％乙二醇和1％氯化胺后，草酸鈣結(jié)晶在腎內(nèi)大量聚積，實(shí)驗(yàn)顯示腎組織中鈣、草酸含量顯著增加。而腎A、B、C組的腎鈣、腎草酸含量明顯少于模型組，其中，腎A組的腎草酸含量與模型組比較有明顯的差異(P＜0.001)，甚至明顯優(yōu)于排石顆粒組。結(jié)果見表2。
表2 腎茶對腎結(jié)石小鼠腎臟鈣和草酸含量的影響(x±s)
注與對照組比較###P＜0.001；與模型組比較***P＜0.001，*P＜0.05(3)腎組織形態(tài)學(xué)和腎組織草酸鈣結(jié)晶觀察腎臟組織肉眼觀察，模型組動(dòng)物腎臟水腫，表面蒼白，質(zhì)地變硬，腎臟表面可見散在白色小點(diǎn)。而排石顆粒組與腎茶A、B、C各組癥狀較輕，表而紅潤，質(zhì)地正常。病理切片組織學(xué)觀察，模型組動(dòng)物腎臟病變程度較嚴(yán)重，腎皮質(zhì)部、髓部、腎盞、腎盂內(nèi)存在大量草酸鈣結(jié)石，嚴(yán)重者多量大結(jié)石積集成堆或滿視野多量大結(jié)石積集成堆。與模型組比較，排石顆粒組和腎茶A、B、C各組腎組織病變程度較輕，腎組織草酸鈣結(jié)石評分較低，表明有抗腎結(jié)石作用。結(jié)果見表3。
表3 腎茶對腎結(jié)石小鼠腎臟草酸鈣結(jié)石形成的影響(n＝11，x±s)
注與模型組比較***P＜0.001，**P＜0.01，*P＜0.05試驗(yàn)例4(腎茶提取物對大鼠草酸鈣腎結(jié)石模型的影響)取雄性大鼠30只，隨機(jī)分為6組，每組5只。除對照組大鼠每日飲用正常水外，其它各組均飲用成石水(1％乙二醇+1％氯化銨)，連續(xù)飲用10天，造成大鼠腎結(jié)石模型。造模同時(shí)各組按下述劑量給藥。①對照組，ig水；②模型組，ig水；③排石顆粒組，ig排石顆粒6g/kg；④腎茶A組，ig腎茶A溶液160mg/kg；⑤腎茶B組，ig腎茶B溶液160mg/kg；⑥腎茶C組ig腎茶C溶液160mg/kg；每日給藥1次，給藥體積1ml/100g，連續(xù)10天。于末次藥后，大鼠代謝籠法收集24h尿液，測尿液量及尿液pH后，處死動(dòng)物，取腎臟稱重，一側(cè)腎按試驗(yàn)例1方法測定腎組織內(nèi)草酸及鈣含量；另一側(cè)腎按試驗(yàn)例2方法進(jìn)行腎臟結(jié)石組織病理學(xué)觀察，結(jié)果如下(1)一般情況大鼠給予成石水5天后，開始出現(xiàn)精神萎靡，畏寒卷縮，體毛干枯，無光澤，毛色變黃，呈聳毛狀，個(gè)別動(dòng)物尚有脫毛發(fā)生，體重減輕較明顯，腎體比明顯增加。而排石顆粒組與腎茶A、B、C各組與模型組相比，癥狀有所改善。結(jié)果見表4、5。
表4 腎茶對腎結(jié)石大鼠體重的影響(x±s)
注與對照組比較###P＜0.001，#P＜0.05；與模型組比較***P＜0.001，**P＜0.01，*P＜0.05
表5 腎茶對腎結(jié)石大鼠腎體比的影響(x±s)
(2)腎茶對腎結(jié)石大鼠腎臟鈣和草酸含量的影響大鼠飲用乙二醇和氯化胺后，腎內(nèi)草酸鈣結(jié)晶大量聚積，顯示腎組織中鈣、草酸含量顯著增加。腎A、B、C組腎鈣、腎草酸含量明顯下降(大鼠比小鼠有更明顯的效果)，與模型組比較腎A、C組有顯著差異。結(jié)果見表6。
表6 腎茶對腎結(jié)石大鼠腎臟鈣和草酸含量的影響(x±s)
注與對照組比較###P＜0.001；與模型組比較***P＜0.001，**P＜0.01，*P＜0.05(3)腎組織形態(tài)學(xué)檢查和腎組織草酸鈣結(jié)晶觀察腎臟組織肉眼觀察，模型組動(dòng)物腎臟水腫，表面蒼白，腎臟表面可見散在白色小點(diǎn)。而排石顆粒組與腎茶各組癥狀較輕，表面紅潤。腎臟組織病理學(xué)觀察，模型組動(dòng)物腎臟病變程度較嚴(yán)重，腎皮質(zhì)部、髓部、腎盞、腎盂內(nèi)存在大量草酸鈣結(jié)石，嚴(yán)重者多量大結(jié)石積集成堆或滿視野多量大結(jié)石積集成堆。與模型組比較，排石顆粒組和腎茶各組腎組織病變程度較輕，腎組織草酸鈣結(jié)石評分較低，表明有抗腎結(jié)石作用。結(jié)果見表7。
表7 腎茶對腎結(jié)石大鼠腎臟草酸鈣結(jié)石形成的影響(n＝5，x±s)
注與模型組比較***P＜0.001，**P＜0.01，*P＜0.05試驗(yàn)例5(腎茶提取物對小、大鼠尿量的影響)(1)腎茶提取物對正常小鼠利尿作用的影響取正常小鼠55只隨機(jī)分為5組，每組11只。①對照組，ig等體積水；②速尿組，ig 25mg/kg；③腎茶A組，ig 160mg/kg；④腎茶B組，ig 160mg/kg；⑤腎茶C組，ig 160mg/kg。各組連續(xù)灌胃給藥3次，第1天上、下午各1次(8:30AM，4:30PM)，次日上午1次。實(shí)驗(yàn)前禁食16h(前1天5:00PM～次日9:00AM)，腹腔注射0.9％氯化鈉溶液1ml/只給予水負(fù)荷，并擠壓小鼠下腹部，使膀胱排空。水負(fù)荷0.5小時(shí)后開始給藥，給藥完畢，立即將小鼠放入350ml的廣口瓶內(nèi)，瓶底放已稱重的棉球，每隔2h收集棉球稱重，以其重量差為小鼠排尿量，連續(xù)6h，比較組間差異，結(jié)果如下與對照組比較，小鼠給予速尿25mg/kg后小鼠排尿量增加，利尿作用強(qiáng)，作用時(shí)間長，差異非常顯著，具有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)；而小鼠給予腎茶A、B、C后，只有腎茶A的0～4h作用點(diǎn)尿量增加較顯著，具有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)；腎茶B、C作用不明顯。腎茶A、B、C各組比較，利尿作用A＞C＞B，但三組間比較無明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。結(jié)果見表8。
表8 腎茶提取物對正常小鼠的利尿作用(x±s)
注與對照組比較**P＜0.01；***P＜0.001(2)腎茶提取物對腎結(jié)石小鼠尿量的影響取小鼠66只，隨機(jī)分為6組，每組11只。除對照組小鼠每日飲用正常水外，其它各組均飲用成石水(1％的乙二胺+1％氯化銨)，連續(xù)飲用6周，造模同時(shí)各組按下述劑量給藥。①對照組，ig等體積水；②模型組，ig等體積水；③排石顆粒組，ig 600mg/kg；④腎茶A組，ig 160mg/kg；⑤腎茶B組，ig 160mg/kg；⑥腎茶C組，ig 160mg/kg，末次給藥以后進(jìn)行利尿?qū)嶒?yàn)，方法同上，結(jié)果如下表9 腎茶對腎結(jié)石小鼠尿量的影響(x±s)
注與對照組比較***P＜0.001
小鼠形成腎結(jié)石后，尿量明顯下降，與對照組比較有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)。腎茶各組分可增加腎結(jié)石小鼠的尿量，但與模型組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。結(jié)果見表9。
(3)腎茶提取物對腎結(jié)石大鼠尿量的影響取大鼠30只，隨機(jī)分為6組，每組5只。除對照組大鼠每日飲用正常水外，其它各組均飲用成石水(1％的乙二胺+1％氯化銨)，連續(xù)飲用10天造成腎結(jié)石模型。造模同時(shí)各組按下述劑量給藥，連續(xù)10天。①對照組，ig等體積水；②模型組，ig等體積水；③排石顆粒組，ig 600mg/kg；④腎茶A組，ig 160mg/kg；⑤腎茶B組，ig 160mg/kg；⑥腎茶C組，ig 160mg/kg，末次給藥以后進(jìn)行利尿?qū)嶒?yàn)，方法同上，結(jié)果如下腎茶提取物A、B、C可明顯增加腎結(jié)石大鼠的尿量，其中腎C作用時(shí)間較長，可持續(xù)24小時(shí)有效。結(jié)果見表10。
表10 腎茶對腎結(jié)石大鼠尿量的影響(x±s)
注與對照組比較#P＜0.05；與模型組比較**P＜0.01，*P＜0.05現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為腎結(jié)石病的病因，一方面是由于尿量減少、脫水或尿濃縮等原因引起尿液中的晶體物質(zhì)濃度增高，使尿液中晶體(如草酸鈣、磷酸鈣等物質(zhì))和膠體(如粘蛋白等物質(zhì))之間的平衡失調(diào)，導(dǎo)致尿中晶體物質(zhì)的析出，沉積而形成結(jié)石。因此尿量增加可以降低尿中晶體物質(zhì)的濃度，及時(shí)排出尿中晶體，預(yù)防尿中晶體物質(zhì)沉淀、附著，凝聚成腎結(jié)石，其作用可能是排石的機(jī)理之一。
試驗(yàn)例6(腎茶提取物對動(dòng)物泌尿系平滑肌的影響)實(shí)驗(yàn)使用豚鼠或新西蘭兔，雌雄不拘。處死后迅速取出膀胱、輸尿管、尿道置于37℃臺(tái)氏液中，去除表面的脂肪和其他結(jié)締組織。制成膀胱環(huán)和輸尿管、尿道條，用手術(shù)線結(jié)扎兩端，一端固定在標(biāo)本鉤上，另一端則與10g張力換能器相連，并置于含8ml臺(tái)氏液的麥?zhǔn)显〔壑校?7℃保溫，通氧。靜止張力0.5g，穩(wěn)定30min后通過Medlab-U/4cs生物信號(hào)采集處理系統(tǒng)記錄平滑肌的舒縮變化。待基線平穩(wěn)后，在浴槽中加入藥物(腎A/或腎B/或腎C)，觀察并記錄平滑肌反應(yīng)約5～10min，用預(yù)溫的臺(tái)氏液洗去藥物，連續(xù)3次，約穩(wěn)定15min待基線基本恢復(fù)后，再加藥物觀察。其它處理同上。記錄觀察腎A、腎B、腎C對豚鼠(新西蘭兔)膀胱、輸尿管、尿道平滑肌的影響。
結(jié)果如下腎茶A、B、C三個(gè)組分對豚鼠、新西蘭兔膀胱平滑肌均有增加收縮幅度，加快節(jié)律的作用。而三者對輸尿管、尿道平滑肌均有松馳作用，如說明書附1、圖2、圖3所示。腎茶可能通過擴(kuò)張輸尿管-收縮膀胱-擴(kuò)張尿道，從而使泌尿道通暢排出結(jié)石。
試驗(yàn)例7(腎茶提取物對小鼠抗炎作用二甲苯致耳炎的影響)取小鼠60只隨機(jī)分成5組，12只/組，，雌雄各半。①對照組，ig等體積水；②消炎痛組，ig 20mg/kg；③腎茶A組，ig 160mg/kg；④腎茶B組，ig 160mg/kg；⑤腎茶C組，ig 160mg/kg。連續(xù)給藥5天，于末次給藥后30min，用二甲苯涂擦小鼠右耳致炎，致炎后15min處死小鼠，剪下左右耳片，用9mm打孔器在相同部位打下圓耳片，計(jì)算左右耳片重量之差作為腫脹度。結(jié)果如下
對照組小鼠二甲苯致炎后右耳明顯腫脹，而各組小鼠的耳廓腫脹度均有下降。與對照組比較，消炎痛組、腎茶A和B組的腫脹度降低有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。但腎茶C組腫脹度降低不明顯，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。結(jié)果見表11。
表11 腎茶提取物對小鼠抗炎作用的影響(x±s)
注與對照組比較**P＜0.01，*P＜0.05試驗(yàn)例8(腎茶提取物對腎結(jié)石小鼠抗過氧化脂質(zhì)的影響)取小鼠60只，隨機(jī)分為6組，每組10只。除對照組小鼠每日飲用正常水外，其它各組均飲用成石水(1％乙二胺+1％氯化銨)，連續(xù)飲用6周，同時(shí)各組按下述劑量給藥。①對照組，ig等體積水；②模型組，ig等體積水；③排石顆粒組，ig 600mg/kg；④腎茶A組，ig 160mg/kg；⑤腎茶B組，ig160mg/kg；⑥腎茶C組，ig 160mg/kg，末次給藥以后，處死動(dòng)物，解剖小鼠，腎臟稱重，取一側(cè)腎臟加預(yù)冷的生理鹽水，用玻璃勻漿器研磨均勻，制成10％的勻漿，吸取勻漿0.1mL測LPO(過氧化脂質(zhì))含量(按丙二醛MDA測定試劑盒方法進(jìn)行)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以x±s表示。經(jīng)t檢驗(yàn)，P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果如下小鼠形成腎結(jié)石后，腎組織LPO含量明顯上升，與對照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。腎茶各組和排石顆?？墒鼓I結(jié)石小鼠的腎組織LPO含量下降，與模型組比較腎C組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，而其它組均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。結(jié)果見表12。
表12 腎茶提取物對腎結(jié)石小鼠LPO的影響(x±s)
注與對照組比較#P＜0.05；與模型組比較*P＜0.05正常人的腎小管上皮細(xì)胞可抵制晶體的粘附，尿液中也含有草酸鈣結(jié)晶生長和聚集的抑制物和促進(jìn)物。當(dāng)腎小管上皮細(xì)胞損傷時(shí)，晶體可粘附于腎盂內(nèi)壁、輸尿管內(nèi)壁等處粘膜，結(jié)石機(jī)械刺激可致組織的充血、水腫等炎癥反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)證明了腎茶提取物有抗炎作用，提示其可能通過抑制腎臟組織的損傷，減少晶體在腎上皮細(xì)胞的粘附機(jī)率，利于小結(jié)晶的排出，達(dá)到抑制腎結(jié)石的作用。
權(quán)利要求
1.腎茶提取物B組分，其特征在于可按以下方法制得(1)將腎茶[C.spicatus(Thunb.)C.Y.Wu ex H.W.Li]干品粉碎后與甲醇按克重量∶毫升體積為1∶4～10的比例，共浸泡3次，每次10天，合并、濃縮浸提液得浸膏混合物；(2)先將水與甲醇按1∶5～12體積比混配成溶解液，再將步驟(1)浸膏混合物與溶解液按克重量∶毫升體積為1∶1比例混合、攪拌至充分溶解；(3)將步驟(2)浸膏溶解液先用石油醚和乙酸乙酯分別萃取3-5次，充分去除樹脂、葉綠素低極性的雜質(zhì)和脂溶性成分后，再用正丁醇萃取4次，合并、濃縮萃取物；(4)將步驟(3)萃取物進(jìn)行硅膠柱層析、梯度洗脫、收集并濃縮得淺褐色粘稠狀的腎茶提取物B組分。
2.一種制備權(quán)利要求1所述腎茶提取物B組分的方法，其特征在于按以下步驟進(jìn)行(1)將腎茶[C.spicatus(Thunb.)C.Y.Wu ex H.W.Li]干品粉碎后與甲醇按克重量∶毫升體積為1∶4～10的比例，共浸泡3次，每次10天，合并、濃縮浸提液得浸膏混合物；(2)先將水與甲醇按1∶5～12體積比混配成溶解液，再將步驟(1)浸膏混合物與溶解液按克重量∶毫升體積為1∶1比例混合、攪拌至充分溶解；(3)將步驟(2)浸膏溶解液先用石油醚和乙酸乙酯分別萃取3-5次，充分去除樹脂、葉綠素低極性的雜質(zhì)和脂溶性成分后，再用正丁醇萃取4次，合并、濃縮萃取物；(4)將步驟(3)萃取物進(jìn)行硅膠柱層析、梯度洗脫、收集并濃縮得腎茶提取物B組分產(chǎn)品。
全文摘要
本發(fā)明公開了腎茶抗泌尿系統(tǒng)結(jié)石提取物及其制備方法，屬于中草藥的提取物與應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域。該方法包括(1)將腎茶與甲醇按重量體積1∶4～10的比例，浸泡、提取、濃縮得浸膏混合物；(2)將浸膏混合物與溶解液按重量體積1∶1比例混合、溶解；(3)將溶解液先用石油醚萃取，再用乙酸乙酯萃取、濃縮后得到萃取物；(4)將萃取物層析、洗脫、收集并濃縮得腎茶提取物A組分。屬脂溶性黃酮甙元類化合物，具明顯改善泌尿系結(jié)石癥狀、減少結(jié)石量、增加尿量、有助于結(jié)石排出及消炎等效果?？芍苯?、復(fù)合或進(jìn)一步分離提取，用于泌尿系抗結(jié)石、排石、利尿和消炎等的藥物。
文檔編號(hào)A61P13/00GK101066292SQ20071006918
公開日2007年11月7日 申請日期2007年6月5日 優(yōu)先權(quán)日2007年6月5日
發(fā)明者陶正明, 蔡華芳, 顧雪萍, 李林 申請人:浙江省亞熱帶作物研究所