專利名稱：：甲胎蛋白的組合物和用于治療癌癥的細(xì)胞程序死亡的誘導(dǎo)劑的制作方法甲胎蛋白的組合物和用于治療癌癥的細(xì)胞程序死亡的誘導(dǎo)劑本申請(qǐng)要求序列號(hào)11/274,906的美國(guó)申請(qǐng)的優(yōu)先權(quán)，其內(nèi)容以其整體引入本文作為參考。就繊本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，尤其是腫瘤學(xué)。本發(fā)明提供了用于治療、預(yù)防和抑制哺乳動(dòng)物中惡性細(xì)胞增殖的包含結(jié)合于細(xì)胞程序死亡誘導(dǎo)劑的AFP的新的組合物和方法。本發(fā)明也提供了禾傭丁醇提取從來(lái)源于早期胚胎發(fā)生過程提取的血液和羊水中獲得的豬甲胎蛋白(alpha-fetoprotein)的方法。
背景技術(shù)：
：甲胎蛋白(AFP)是胎兒中主要的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，充當(dāng)穿梭運(yùn)輸工具，并且具有的半衰期為3—5天(Mizejewski,GJ.,祀'AFPandCongenitalDisorders",pp.5-34,AcademicPress,Orlando,1985;Abelev，GI，Alpha-fetoprotein:25yearsofstudy,TumorBiology,10:63—74;1989)。AFP的表達(dá)在發(fā)育過程中被緊密調(diào)節(jié)以至于AFP表達(dá)的可檢測(cè)水平在很大程度上依賴于發(fā)育階段。研究己經(jīng)證實(shí)AFP在個(gè)體發(fā)育生長(zhǎng)和腫瘤進(jìn)展期間中都充當(dāng)生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑。由于AFP表達(dá)發(fā)生在發(fā)育和腫瘤形成過程中，AFP被稱為癌胚胎抗原。AFP是屬于類白蛋白基因超家族的糖蛋白，白蛋白也是該,族的一員。AFP的分子量根據(jù)來(lái)源，發(fā)育階段和用于其純化的方法可以在64000到72000道爾頓內(nèi)變化。相關(guān)的碳水化合物百分比又隨來(lái)源和發(fā)育階段在3%至5%間變化。AFP似乎以兩禾中基本分子形式存在1)非結(jié)合形式，和2)其中AFP纟給于不同配體(如脂肪酸，雌激素類，植物類固醇)的結(jié)合形式。但是，不同形式的AFP已經(jīng)被鑒定。結(jié)合型AFP的不同構(gòu)象(全型)依賴于結(jié)合配體(們)的性質(zhì)和濃度而存在。人AFP(HAFP)的分子變體己經(jīng)被鑒定出來(lái)，其中變異歸因于碳水化合物微不均一性(即不同的碳水化合物部分結(jié)合在HAFP上的糖化作用位點(diǎn))和由于等電點(diǎn)的差異(Keel,B.A.等，CRCPress;vol2，24-31,1989;Mizejewski，G丄，Exp.Biol.Med.226(5):377408,2001;Morinaga，T.等^Proc.Natl.AcadSci.USA，80(15):4604-8,簡(jiǎn)；Parker，M.H.等，PurificationandcharacterizationofarecombinantversionofhumanAFPexpressedinthemilkoftransgenicgoats，ProteinExpressionandPurification,38:177-183,2004)。HAFP的基因變體已經(jīng)被檢測(cè)到，其歸因于HAFPmRNA在發(fā)育階段的特異性表達(dá)。MizejewskiGJ.等(TumourBiol.7(l):19-36，1986)將AFP的周期生理學(xué)描述為"發(fā)育時(shí)鐘"。作者指出了AFP的結(jié)構(gòu)和功能在發(fā)育過程中的自始至終的變化，其中該蛋白在胎兒發(fā)育過程中以波動(dòng)的水平表達(dá)，且表達(dá)水平在出生后下降到可以忽略的水平，其正常,AifiL清濃度低于50ng/mL(RuoslahtiandSeppala，Int.J.Cancer8:374-378,1971)。但是，AFP的血漿水平在患有不同癌癥的個(gè)體可以高一千倍(Ruoslahti禾卩SeppaKAdv.CancerRes.29:275-310，1979)。而且，很多癌癥在它們的細(xì)胞表面表達(dá)高水平的AFP受體(參見Unel，J.等，在'BiologicalActivitiesofAFP",CRCPress,1987，BocaRaton，F(xiàn)lorida,vol.2，pp.104-117;Moro凡，在"BiologicalActivitiesofAFP",CRCPress,1987,BocaRaton,Florid^vol.2,pp.120-127中)。因此，對(duì)于人M說，AFP不僅可以作為胚胎發(fā)生過程中胎兒缺陷標(biāo)志，還可以充當(dāng)腫瘤標(biāo)志?，F(xiàn)有技術(shù)中己知的各種化學(xué)制劑，如垸基化劑，抗代謝藥，生物堿類，抗生素，激素和免疫調(diào)節(jié)劑已經(jīng)被用于治療癌癥。但是，這些制劑沒有特異性地耙向腫瘤細(xì)胞，并導(dǎo)致了正常、非腫瘤細(xì)胞也對(duì)抗癌劑敏感的"旁觀者效應(yīng)"。相比于正常細(xì)胞上受體可忽略的表達(dá)，惡性細(xì)胞表面上的HAFP受體(HAFPR)的過量表達(dá)促進(jìn)了使用HAFP作為抗癌藥物的載體/輸送器(Severin，S.E.等3iochem.Mol.Biol.Int.37(2):385-92,1995;SeverinS.E等,Dokl.AkadNauk366(4):561-4，1999)3^寺異性地耙向癌細(xì)胞的研究。經(jīng)證實(shí)HAFP肖,將抗癌藥物軛合物靶向腫瘤細(xì)胞(Moskaleva等，CellBiolInt.21(12):793-799，1997;Sotnichenko等，F(xiàn)EBSLetters450:49—51，1999;US.專利號(hào)6，630,445toMurgita)。由于特異靶向腫瘤細(xì)胞，高特異性的HAFP對(duì)負(fù)荷AFP受體的癌細(xì)胞提供了增強(qiáng)藥效的功能。而且，由于周圍的正常細(xì)胞被赦免，這種iii^活性藥物的方式對(duì)患者更安全。已經(jīng)報(bào)道了HAFP與很多的抗癌藥物結(jié)合，這些藥物包括多柔比星，道諾霉素，加利車霉素，羧基磷,安，博萊霉素，苯丁酸氮芥，順鉑，甲氨蝶呤和洋紅霉素(Moskaleva等，CellBiol.Int21(12):793-799,1997;Lutsenko等,TumorBiology21(6):367—374,2000)。在這些例子中，活性藥物ilii化學(xué)接合方法與HAFP結(jié)合，致使HAFP共價(jià)結(jié)^"抗癌藥齊U。AFP-藥物軛^t)使結(jié)合組分不損失它們的生物活性和藥物革E向輸送的最佳AFP:藥物的摩爾比例被發(fā)現(xiàn)是1:2(Feldman，N.B.等^iochemistiy65:1140-1145，2000)。AFP和二-惡英的非共價(jià)結(jié)合也能超'j相同的摩爾比例l:2(Sotnichenko等)1^85Letters450:49-51，1999)。Herve等(在"Biologicalactivitiesofalpha-fetoprotein，，,FloridaCongresses,edMizejewski,G丄，CRCPress,Inc.,BocaRaton,Vol.1，1987)證實(shí)了大鼠AFP上的華法林和苯基保^r公的結(jié)合位點(diǎn)與在白蛋白上發(fā)現(xiàn)的那些相似。而且，他們證實(shí)了這些藥齊膽雌、麟類，月旨肪酸，pyirazolic化，和prcprionic藥物那樣與APF結(jié)合于同樣的大疏水口袋。如Mizejewski綜述的(Mizejewski,GJ.,在"AFPandcongenitaldisorders",edG丄Mizejewski,AcademicPress,Inc.,1985),脂肪酸能夠結(jié)合于人AFP和嚙齒動(dòng)物AFP，而植物維，類被表明只能結(jié)^T嚙齒動(dòng)物AFP，這顯示AFP結(jié)合能力存在種間差異。在AFP簡(jiǎn)物革巴向輸送實(shí)驗(yàn)中4OT的AFP的主要5le源是從女性胎盤后血清中提取的人AFP(Moskaleva等,CellBiolInt.21(12):793-799，1997)或者AI臺(tái)兒物質(zhì)(wwwalfetin.m)。人胎兒物質(zhì)由于來(lái)源有限(從杯孕最高達(dá)12周的流產(chǎn)物質(zhì)中提取)和此外費(fèi)用較高而難于獲得。在俄羅斯，人胎兒AFP作為免疫調(diào)節(jié)注射藥物以"Alfetinum"的名稱被注冊(cè)(1安瓿包含0.075mg純度為95%的AFP)。這樣，在向癌細(xì)胞輸送細(xì)胞毒性劑中有用的，備源會(huì)是有益的。據(jù)報(bào)道，以不同作用方式的抗癌劑激發(fā)了化學(xué)敏感細(xì)胞中的細(xì)胞程序死亡(Fisher，Cell78:539-542，1994)。線粒體功能的變化，例如線粒體膜M性和/，透性轉(zhuǎn)換孔復(fù)合體改變，在抗癌劑誘導(dǎo)的包括細(xì)胞死亡在內(nèi)的細(xì)胞禾i^死亡性細(xì)胞死亡中起重要作用(Kroemer等，ImmunolToday18:44-51,1997;Susin等,JExp.Med,186:5-37,1997;Marchetti等，丄Exp.Med.184:1155-1160，1996;Zamzani等，J.Exp.Med.l83:1533-1544，1996;Decaudin等,CanRes57:62-67，1997)。很多常規(guī)的化學(xué)治療劑M誘導(dǎo)內(nèi)源的效應(yīng)物，如參與細(xì)胞程序死亡生理控制的p53，以一種間接方式弓胞線粒體透化作用。但是，在很多不同的人類癌癥中p53的頻繁突變^^癥抵抗常規(guī)的化學(xué)治療劑。直接作用于線粒體的細(xì)胞毒性劑的發(fā)現(xiàn)，如氯尼達(dá)明，亞砷酸鹽，樺木酸和CD437給由于內(nèi)源的細(xì)胞程序死亡誘導(dǎo)旁路破壞，如那些涉及p53的內(nèi)源的細(xì)Mi序死亡誘導(dǎo)旁路破壞而致的常規(guī)藥物失效的情況提供了可選擇的治療策略(Costantini等綜述，J.Nad.CancerInstitute92:1042-1053，2000)。耙向線粒體和誘導(dǎo)細(xì),fi^胞禾ii^死亡的細(xì)胞毒性劑，如樺木酸已經(jīng)被描述(FuldaS.等，J.Biol.Chem.18;273(51):33942-8，1998;Pezzuto等，U.S.專利申請(qǐng)公開號(hào)20030186945)。Costantini等綜述了通過線粒體膜衝歪性的改變和/或通透性轉(zhuǎn)換孔復(fù)合體(PTPC)的變化導(dǎo)致的線粒體破壞來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞程序死亡的機(jī)制，并歹i」舉了靶向線粒體誘導(dǎo)細(xì)胞程序死亡的細(xì)胞毒性劑(J.Natl.CancerInst.92(13):1042-53,2000)。由于很多不同類型的癌癥抵抗化學(xué)治療，并且據(jù)稱它們表現(xiàn)多藥耐藥性(MDR)的這一事實(shí)，使用單一HAFP/抗癌劑軛合物(即，HAFP-雌激素阿毒素軛合物)被認(rèn)為是治療惡性腫瘤的限制性因素(LehnertM.，Eur.J.Cancer,32A:912-920，1996;Germ咖UA,,Eur.丄Cancer,32A:927-944,1996)。并且，很多的抗癌劑^il51耙向DNA并因此在很大程度上，完整的p53信號(hào)旁路而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡的烷基化劑和抗生素類(Bykov,VJ.等，Nat.Med.8(3):282-8，2002)。假如大劃中瘤缺乏功能性p53，那么這些治療經(jīng)常是無(wú)效的。因此需要一個(gè)改善的機(jī)制，它能夠?qū)⒓?xì)胞毒性劑輸送到癌細(xì)胞，并且容易衍生獲得和廉價(jià)生產(chǎn)，同時(shí)能夠用非侵入性手段輸送并有效和特異地殺死癌細(xì)胞。本發(fā)明能提供一個(gè)或多個(gè)前述優(yōu)點(diǎn)或其他在閱讀本申請(qǐng)后對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說變得明顯的優(yōu)點(diǎn)。
發(fā)明內(nèi)容簡(jiǎn)要闡述，本發(fā)明提供了包含AFP的新組合物和用于預(yù)防、治療或抑制表達(dá)甲胎蛋白受體(AFPR)的惡性月中瘤的方法。本發(fā)明也提供了用于丁醇提取從早期胚胎發(fā)生過程中提取的血液和羊水中獲得的豬甲胎蛋白的方法。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種組合物，該組合物包含外源性的甲胎蛋白(AFP),和至少一種選自線粒體膜透化劑，線粒體孔開放誘導(dǎo)劑，離子載體，半胱天冬酶9激活劑，半胱天冬酶3激活劑和類維生素A類的細(xì)胞禾聘死亡誘導(dǎo)劑的非共價(jià)復(fù)合體，其中所述至少一種細(xì)胞程序死亡誘導(dǎo)劑可逆地結(jié)M外源性的AFP。在一個(gè)實(shí)施方式中，組^包含兩種旨辦可iM結(jié)^外源性的AFP的細(xì)胞fij^死亡誘導(dǎo)劑。在另一個(gè)實(shí)施方式中，組，包含的細(xì)胞禾，死亡誘導(dǎo)劑選自蒼術(shù)苷，樺木酸，毒胡蘿卜內(nèi)酯，魚藤酮，粉蝶霉素A，氯尼達(dá)明，CD437,三氧化二砷，A23187，離子霉素(Ionomicin)，維生素D2和D3，地塞米松和異維甲酸。本發(fā)明也提供了外源性的AFP在哺乳動(dòng)物中向癌細(xì)胞輸送至少一種選自線粒體膜透化劑，線粒體孔開放誘導(dǎo)劑，離子載體，半胱天冬酶9激活劑，半胱天冬酶3^T活劑和類維生素A類的細(xì)胞程序死亡誘導(dǎo)劑的用途，其中所述至少一種細(xì)胞程序死亡誘導(dǎo)劑可逆地結(jié)合于外源性的AFP，該癌癥具有至少一種AFP受體，且外源性的AFP牛寺異地結(jié)合于至少一種AFP受體。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種組合物在制備向哺乳動(dòng)物中在細(xì)胞表面具有至少一種AFP受體的癌細(xì)胞耙向輸送至少一種細(xì)胞禾MJ^死亡誘導(dǎo)劑的藥物中的用途，該組合物包含非共價(jià)的復(fù)合體，其成分為外源性的甲胎蛋白(AFP)，和至少一種選自線粒體膜透化劑，線粒體孔開放誘導(dǎo)劑，離子載體，半胱天冬酶9撒活劑，半胱天冬酶3撒活劑和類維生素A類的細(xì)胞f將死亡誘導(dǎo)劑，其中所述至少一種細(xì)胞禾i^死亡誘導(dǎo)劑可m結(jié)M外源性的AFP，且外源性的AFP特異地結(jié)合于至少一種AFP受體。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種組合物用于抑制哺乳動(dòng)物中癌細(xì)胞增殖的用途，該組合物包含非共價(jià)的復(fù)合體，其成分為夕卜源性的甲胎蛋白(AFP)，和至少一種選自線粒體膜透化劑，線粒體孔開放誘導(dǎo)劑，離子載體，半胱天冬酶9激活劑，半胱天冬酶3激活劑和類維生素A類的細(xì)胞程序死亡誘導(dǎo)劑，所述癌細(xì)胞在細(xì)胞表面具有至少一種AFP受體，其中所述至少一種細(xì)胞禾ii^死亡誘導(dǎo)劑可m結(jié)合于夕卜源性的AFP，且外源性的AFP特異地結(jié)合于細(xì)胞表面上的至少一種AFP受體。也是在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種組合物用于治療難治性的惡性腫瘤中多藥耐藥性的用途，該組合物包含非共價(jià)的復(fù)合體，其成分為夕卜源性的甲胎蛋白(AFP)，和至少一種選自線粒體膜透化劑，線粒體孔開放誘導(dǎo)劑，離子載體，半胱天冬酶9激活劑，半胱天冬酶3激活劑和類維生素A類的細(xì)胞程序死亡誘導(dǎo)劑，所述難治性的惡性腫瘤包含在細(xì)胞表面具有至少一種AFP受體的癌細(xì)胞，其中所述至少一種細(xì)胞程序死亡誘導(dǎo)劑可逆地結(jié)合于外源性的AFP，且外源性的AFP特異地結(jié)合于細(xì)胞表面上的至少一種AFP受體。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明也提供了一種在哺乳動(dòng)物中抑制癌細(xì)胞增殖的方法，所述癌細(xì)胞在細(xì)胞表面具有至少一種AFP受體，其中所述方B含向哺乳動(dòng)物給藥治療有效量的一種組合物，所述組，包含非共價(jià)復(fù)合體，其成分為夕卜源性的AFP，和至少一種選自線粒體膜透化劑，線粒體孔開放誘導(dǎo)劑，離子載體，半胱天冬酶9激活劑，半胱天冬酶3撒活齊訴口類維生素A類的細(xì)胞程序死亡誘導(dǎo)劑，其中所述至少一種細(xì)胞程序死亡誘導(dǎo)劑可逆地結(jié)合于外源性的AFP，且外源性的AFP特異地結(jié)合于細(xì)胞表面上的至少一種AFP受體。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種用于治療難治性的惡性腫瘤中多藥耐藥性的方法，所述的難治性的惡性腫瘤包含在細(xì)胞表面具有至少一種AFP受體的癌細(xì)胞，所述方法包含向哺乳動(dòng)物給藥治療有效量的一種組合物，所述組合t^含非共價(jià)復(fù)合體，其成分為夕卜源性的AFP,和至少一種選自線粒體膜透化劑，線粒體孔開放誘導(dǎo)劑，離子載體，半胱天冬酶9激活劑，半胱天冬酶3激活齊訴n類維生素A類的細(xì)胞禾聘死亡誘導(dǎo)劑，其中所述至少一種細(xì)胞程序死亡誘導(dǎo)劑可逆地結(jié)^f外源性的AFP，且夕卜源性的AFP特異地結(jié)合于細(xì)胞表面上的至少一種AFP受體。還是在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了使用丁S享從原料中提取豬AFP的方法，該方、法包含連續(xù)的步驟(a)從懷孕約3至約14周的豬胚胎收集血液和羊水；(b)使(a)中收集的血液和羊水分離為上清液和沉淀物；(c)收集(b)中獲得的上清液；(d)濃縮(c)中獲得的上清液以形成濃縮液；(e)加入丁醇到(d)中的濃縮液，直至溶液中丁醇的終濃度為約5%至約10%;(f)攪拌(e)中獲得的丁醇溶液；(g)使從(f)中獲得的丁醇溶液分離為上面的非7j^相和下面的7K相；和(h)收集從(g)中獲得的非水相以生^有非結(jié)合的豬AFP的終溶液。在某些特定實(shí)施方式中，上述組合物包含特定劑量的第一和第二細(xì)胞程序死亡誘導(dǎo)劑。在一個(gè)實(shí)施方式中，組合物中使用的外源性的AFP衍生于哺乳動(dòng)物源。在另一個(gè)實(shí)駄式中，AFP來(lái)源于豬源(PAFP)。在其它的實(shí)施方式中，AFP來(lái)源于靈長(zhǎng)類動(dòng)物，牛科動(dòng)物，馬科動(dòng)物，犬科動(dòng)物，貓科動(dòng)物，或羊源。AFP可以是從自然中分離的或其可以是重組形式的AFP。附圖的簡(jiǎn)要說明圖1接受化療劑的癌細(xì)胞內(nèi)半胱天冬酶介導(dǎo)的細(xì)胞程序死亡途徑的示意圖。圖2單獨(dú)的AFP^^液(泳遨'C")，結(jié)舒蒼術(shù)苷的AFP、鵬液(泳度'A")和標(biāo)準(zhǔn)分子量標(biāo)記物的凝膠電泳圖。放棄泳il"B"，以進(jìn)行另外的實(shí)驗(yàn)。圖3在鼠白血病模型中，用PAFP細(xì)胞程序死亡誘導(dǎo)劑組合物治療之后的數(shù)天里測(cè)量的作為時(shí)間函數(shù)的以cmH十測(cè)定的腫瘤體積。P-388白血病細(xì)胞被皮下注射到DBA2小鼠內(nèi)。接種后一天，動(dòng)物每天用以下之一治療l.制劑A(PAFP-蒼術(shù)苷(A));2.制劑T(PAFP-毒胡蘿卜內(nèi)酯(T));3.制劑S(脾提取物(S));4.制劑A+S;5.制劑T+S;6.對(duì)照油；或7對(duì)照水。圖4皮下注射P-388白血病細(xì)胞和隨后接種后一天每天用以下之一治療l.制劑A(PAFP-蒼術(shù)苷產(chǎn)品)；2.制劑T(PAFP-毒胡蘿卜內(nèi)酉旨產(chǎn)品)；3.制劑S(脾提取物)；4.制劑A+S;5.制劑T+S;6.對(duì)照油；或7對(duì)照水，之后DBAs小鼠的存活率。圖5向DBA2小鼠皮下注射P-388白血病細(xì)胞和隨后接種后一天開々滴天用以下之一治療l.對(duì)照(水)；2.對(duì)照(油)；3.PAFP-樺木酸；4PAFP-樺木酸加上另外的非結(jié)合的樺木酸，之后的數(shù)天里測(cè)量的作為時(shí)間函數(shù)的以cV計(jì)測(cè)量的腫瘤體積。圖6患有轉(zhuǎn)移結(jié)腸腺癌的癌癥患者P.在PAFP-蒼術(shù)苷口服膠囊治療8周前(左)和后(右)的CT掃描比較，顯示肝轉(zhuǎn)移得到消除。圖7患有轉(zhuǎn)移結(jié)腸腺癌的癌癥患者P.N.G在PAFP-蒼術(shù)苷口月瞰囊治療6周前(左)和后(右)的CT掃描比較，顯示肝轉(zhuǎn)移得到消除。發(fā)明詳述本發(fā)明涉及用于向癌細(xì)胞靶向輸送細(xì)胞程序死亡誘導(dǎo)劑的組合物。本發(fā)明的組合物包含外源性的AFP，其非共價(jià)地結(jié)合于通過直接影響線粒體功能、防止需要經(jīng)初始核信號(hào)引發(fā)細(xì)胞程序死亡響應(yīng)從而誘導(dǎo)細(xì)胞程序死亡的化合物。在一個(gè)實(shí)施方式中AFP的來(lái)源是豬，在另外一個(gè)實(shí)施方式中豬AFP是從杯孕3-14周之間的M臺(tái)和羊水中提取的。在本發(fā)明中有用的與AFP非共價(jià)結(jié)合的特異化合物包括蒼術(shù)苷，樺木酸，毒胡蘿卜內(nèi)酯，CD437,魚藤酮,粉蝶霉素A和氯尼達(dá)明。此處應(yīng)用的術(shù)語(yǔ)—^^^^;^亡遂導(dǎo)#嫂旨具有誘導(dǎo)細(xì)胞程序死亡性的細(xì)胞死亡能力的化學(xué)或天然化合物。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，細(xì)胞程序死亡誘導(dǎo)劑直接作用于線粒體。這樣的化合物可以通過影響線粒體膜ilit性，誘導(dǎo)線粒體孔開放中的任何一個(gè)，影響線粒體膜電位和影響執(zhí)行半胱天冬酶的激活，如半胱天冬酶3和9，進(jìn)而引起細(xì)胞程序死亡。在本發(fā)明的上下文中，細(xì)胞程序死亡誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)在細(xì)胞表面上表達(dá)AFP受體的耙癌細(xì)胞的細(xì)胞程序死亡。適于本發(fā)明使用的細(xì)胞程序死亡誘導(dǎo)劑的例子包括或衍生于，但不限于，線粒體膜M性誘導(dǎo)劑如蒼術(shù)苷，樺木酸，毒胡蘿卜內(nèi)酯，CD437,氯尼達(dá)明,三氧化二砷和魚藤酮；半胱天冬酶活化劑如Pac-l(Putt等，NatureChem.Biol.2:543-550，2006)，離，體如卡西霉素/A23187和纈氨霉素；和類維生素A類如異維甲酸和順式視黃酸；和公知的化療劑如i爐米松；抗生素如寡霉素B;磷酸羥氯喹；抗氧化劑如槲皮素，維生素A，維生素D2和D3,姜黃素，和辣椒辣素；和重金屬如鋅，鉛，銅，鎳，和鎘(http:〃www.sigmaaldrich.com/catalo^search/TablePage/9560323,http:〃www.biomo1.com/Online—Catalog/Online_Catalog/Products/36/categoryId=234，http:〃www.emdbiosciences.com/html/cbc/apoptosisjnducers.html,http:〃www.axxora.com/apoptosisjnducers—inhibitors/opfa.1014.2.1.0.html)。此處應(yīng)用的術(shù)語(yǔ)"可逆"是指能夠返回到最初的("非結(jié)合")條件，其中外源性的AFP，在向腫瘤細(xì)胞輸送第一個(gè)細(xì)胞，i^死亡誘導(dǎo)劑(即，蒼術(shù)苷，毒胡蘿卜內(nèi)酯，樺木酸，CD437，三氧化二砷，魚藤酮和氯尼達(dá)明)之后，以非結(jié)合形式被循環(huán)回到細(xì)胞外介質(zhì)，在那兒它能夠結(jié)合于它對(duì)其有固有結(jié)合親和力的另一化合物(即，蒼術(shù)苷，毒胡蘿卜內(nèi)酯，樺木酸，CD437，三氧化二脈魚藤酮和氯尼達(dá)明)。夕卜源性的AFP可以被循環(huán)至細(xì)胞外介質(zhì)多于一次。以前，很多體夕h開究證實(shí)了AFP肖灘通過AFP受體介導(dǎo)的胞吞作用向細(xì)胞運(yùn)送多不飽和脂肪酸(PUFAs)，且隨后不被糊針也循環(huán)至細(xì)胞外介質(zhì)(Tones等，Int.丄Cancer47:110—117，1991;Uriel等，在'Biologicalactivitiesofalpha—fetoprotein",FloridaCongresses,Mizejewski,GJ編輯，CRCPressInc.，BocaRaton,Vol.2，1987;和Laborda等，Int.丄Cancer40:314—318，1987)。這些研究表明被循環(huán)的AFP肖灘在返回細(xì)胞外空間時(shí)第二次結(jié)合于細(xì)B^M^死亡誘導(dǎo)劑。此處應(yīng)用的術(shù)語(yǔ)"治療有效量"是指本發(fā)明組，的量，當(dāng)對(duì)患者給藥時(shí)，能夠改善或減輕在此描述的癌癥(實(shí)體的或非實(shí)體的)癥狀。當(dāng)然，根據(jù)本發(fā)明給藥的組合物的特定齊懂由個(gè)例的具體清況決定，個(gè)例的具體清況包括，例如，給藥的組合物，給藥途徑，患者的狀態(tài)，和被治療的癌癥類型。適合用本發(fā)明進(jìn)行治療的癌癥是那些其中癌細(xì)胞表達(dá)AFPRs的癌癥。證實(shí)表達(dá)AFPR的癌癥的例子包括，但不限于，膀胱癌，乳腺癌，結(jié)腸和直腸癌，子宮內(nèi)膜癌，腎癌(腎細(xì)胞)，白血病，肝癌，肺癌，黑素瘤，非霍奇金氏淋巴瘤，卵巢癌，M癌，前列腺癌，艦癌(非黑素瘤)，睪丸癌和甲狀腺癌(Moro^Vidal,R.,CurexTechnologiesInc.,www.biocurex.com)。術(shù)語(yǔ)"患者"是指包括人在內(nèi)的所有哺乳動(dòng)物。患者的例子包括人，其它靈長(zhǎng)類，牛，狗，貓，山羊，綿羊，豬，馬和兔。本發(fā)明涉及外源性的甲胎蛋白(AFP)作為直接針對(duì)癌細(xì)胞造成癌細(xì)胞細(xì)胞禾號(hào)死亡的細(xì)胞禾歸死亡誘導(dǎo)齊啲載體或輸送戮transporter)的用途。US.專利號(hào)6,630,445和6，534，479敘述了重組人AFP結(jié)合細(xì)胞毒性劑的用途。先前，Nishi等(Ann.NewYorkAcad.Sci.259:109-118，1975)證實(shí)了哺乳動(dòng)物AFPs間關(guān)于免疫和抗原特性的種屬交叉相似性，增加了AFP備選哺乳動(dòng)物來(lái)源的可能性。豬和人AFP間的相似性表明豬AFP可以代替人AFP用于向癌細(xì)胞輸自胞禾1^死亡誘導(dǎo)劑(表l)。表人AFP(HAFP)，重組人AFP(rHAFP)和豬AFP(PAFP)性質(zhì)的比較性質(zhì)HAFPrHAFPPAFP%與白蛋白的氨404038基酸相似百分比%糖基化百分比34034糖基化糖類不同0未知微不均一性有無(wú)無(wú)來(lái)源的病原污染有無(wú)無(wú)可能性關(guān)于來(lái)源的有無(wú)無(wú)倫理問題月旨肪酸結(jié)合能力有未知有i5^K配體親和力有未知有抗癌癥活性(AFP介導(dǎo)的輸送與癌細(xì),合的有未知有細(xì)胞，M^死亡誘導(dǎo)劑)(NCBIBlast分析，http:〃www.ncbi.nlmnih.gov/blast/:Parker,M.H.等，ProteinExpressionandPurificatio1O8:177-183,2004)此處使用的術(shù)語(yǔ)"外源性的"是指源于患者或生物體之外。本發(fā)明涉及一種組合物，其包含夕卜源性的AFP和在體外可逆地結(jié)合于外源性的AFP以形成AFP-第一細(xì)胞fMJ^死亡誘導(dǎo)劑復(fù)合體的第一細(xì)胞fl^死亡誘導(dǎo)劑，還可以包括第二細(xì)胞禾i^死亡誘導(dǎo)劑，其中第一細(xì)胞程序死亡誘導(dǎo)劑和第二細(xì)胞程序死亡誘導(dǎo)劑是抗癌藥物(即蒼術(shù)苷，毒胡蘿卜內(nèi)酯，樺木酸，CD437，三氧化二砷和氯尼達(dá)明)，且其中第二細(xì)胞禾ii^死亡誘導(dǎo)齊脂,在體內(nèi)可iEt也結(jié)合于再循環(huán)的夕卜源性的AFP。第一細(xì)胞程序死亡誘導(dǎo)齊訴口第二細(xì)胞程序死亡誘導(dǎo)劑可以是相同的(即樺木酸)或它們可以是不同的(即樺木酸和CD437)。AFP上多個(gè)結(jié)合域的存在增加了一類以上細(xì)胞禾ii^死亡誘導(dǎo)齊職夠在體外同時(shí)結(jié)合于AFP的可能性(他ano，K.等，Biochem.J.，231:189-191,1985;Mizejewski,GJ.,Exp.Biol.Med.226(5):377-408，2001)。這是由于有些結(jié)合域與j^7K藥物相互作用，而其它結(jié)合域與親水的或兩性的藥物相互作用的事實(shí)。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式，癌癥患者將接受每日劑量的本發(fā)明的組，,其中根據(jù)患者及疾病的進(jìn)攻性每日總攝取AFP的量在0.07mg和].2mg之間。AFP的這個(gè)濃度是以通常發(fā)現(xiàn)的懷孕期間循環(huán)AFP的生理濃度為基礎(chǔ)的。對(duì)鼠相對(duì)物(counterparts)來(lái)說，根據(jù)'WaturalCompoundsinCancerTherapy"提供的準(zhǔn)貝'J(Boik丄，淑wra/Cowpowwiiy&G371cer77^卿.OregonMedicalPress，2001，pp.8-10)，可比擬的劑量在0.0014mg和0.024mg之間。本發(fā)明的組合物可以含有不同摩爾比的第一和第二細(xì)胞程序死亡誘導(dǎo)劑，如從等摩爾比例到對(duì)于AFP過多的第一細(xì)胞程序死亡誘導(dǎo)劑和從等摩爾比例到對(duì)于AFP過多的第二細(xì)胞程序死亡誘導(dǎo)劑。第一細(xì)胞程序死亡誘導(dǎo)劑和AFP在體外結(jié)合的條^H^于第一細(xì)胞程序死亡誘導(dǎo)劑的性質(zhì)(即，親水的或i^7K的)。典型地，AFP與第一細(xì)胞程序死亡誘導(dǎo)劑旨灘以AFP與第一細(xì)!SfM^死亡誘導(dǎo)劑從l:l到l:3的摩爾比混合。更典型地，AFP與第一細(xì)胞程序死亡誘導(dǎo)劑能夠以AFP與第一細(xì)胞禾i^死亡誘導(dǎo)劑從1:1到小于1:3的摩爾比混合。第一細(xì)胞程序死亡誘導(dǎo)劑可以包含一個(gè)或多個(gè)抗癌藥物。但是，如果j頓多個(gè)藥物，必須如上文提到的那樣確定^藥物結(jié)合于AFP上不同的結(jié)合域。所提取的物質(zhì)須經(jīng)透析過濾以清除非結(jié)合的小分子，而不干擾PAFP-細(xì)胞禾聘死亡誘導(dǎo)劑復(fù)合體。先前，Sotnichenko等(FEBSLetters450:49-51,1999)證實(shí)了人胎兒AFP以1:2的摩爾比與二喝與dioxin)形成復(fù)合體及該^^過濾有效清除非結(jié)合分子而不干擾AFP-二^英復(fù)合體。典型地，第二細(xì)胞程序死亡誘導(dǎo)劑的存在量比現(xiàn)有技術(shù)中描述的方法中應(yīng)用的量低至少10倍。例如，Pezzuto等(US.專利申請(qǐng)公開號(hào)20030186945)推薦樺木酸的劑量為3000|ig(日口服劑量為0.2mg到500mg)，而在本發(fā)明中，樺木酸(第二細(xì)胞程序死亡誘導(dǎo)劑)的劑量可以低至150嗎。在本發(fā)明中，0.6mg的PAFP與0.007mg的樺木酸復(fù)合。在另一個(gè)實(shí)驗(yàn)式中，制劑中包括0.15mg的非結(jié)合的樺木酸。在操作過程中，如以前描述的那些化學(xué)接合過程中的那些(GJ.Mizejewski，"Alpha-fetoprotein,，，inMonographsonEndocrinology,ed.UlrichWestphal，Steroid-proteininteractionsII，Springer-Verlag，Berlin,New-York^Tokyo,1986，pp.320-356;Nunez,E.A.等，ThephysiochemicalandbiologicalpropertiesofAFPdependonitsligandenvironment,,J.Nucl.Med.AlliedSci.,33:18-16,1989)，PAFP不穩(wěn)定且能夠聚集，沉淀或變得失活。本發(fā)明中在體外實(shí)現(xiàn)18-25。C下PAFP與第一細(xì)胞程序死亡誘導(dǎo)劑結(jié)合所需要的時(shí)間是10併巾，比現(xiàn)有技術(shù)中描述的非共價(jià)結(jié)合itl呈需要的時(shí)間顯著短，其中在18-25'C下的靜置時(shí)間10-12小時(shí)(參見，例如，Pak等的US.專利號(hào)6，878,688)。實(shí)現(xiàn)PAFP與第一細(xì)胞程序死亡誘導(dǎo)劑在體外結(jié)合的時(shí)間的縮短可能歸因于(I)使用本發(fā)明的超濾法和丁醇提取法獲得的濃縮液中存在的可用于結(jié)合的非結(jié)合PAFP的濃度更高，和(2)相比于其他方法獲得的如上文闡述的微不均一的HAFP(Wu，J.T.和Clayton,F.，'DetectionandisolationofvariousisoformsofhumanAFP",in"BiologicalactivitiesofAFP，，,CRCPress,1987，BocaRaton，F(xiàn)lorida,vol.2，pp.3-14;Mizejewski，G丄,Exp.Biol.Med，vol.226(5):377408，2001)，ilil本方法獲得的是PAFP的微均~ti(microhomogenicity)。典型地，第一細(xì)胞程序死亡誘導(dǎo)劑是一類抗癌藥，其以每日濃度不高于150昭存在。用于本發(fā)明的細(xì)鵬呈序死亡誘導(dǎo)齊i撒選自線粒體膜透化劑，線粒體孔開放誘導(dǎo)劑，半胱天冬酶9激活劑，半胱天冬酶3激活劑，離預(yù)體和類維生素A類。多藥耐藥性(MDR)經(jīng)常與癌細(xì)胞表面的gpl70泵的高表達(dá)水平相關(guān)(LehnertM.，EurJCancer32A:912-920，1996;GermannUA.,EurJCancer32A:927-944,1996;Thomas,H.，.等，CancerControl10(2):159-165，2003)。但是，也已知MDR也發(fā)生在損傷的p53或細(xì)胞程序死亡抑制劑如Bcl-2表達(dá)上調(diào)的細(xì)胞內(nèi)(Jaattela，M.,Exp.CellRes.248:3043，1999)。很多化療劑具有p53活性上游耙點(diǎn)，如DN入RN入末端轉(zhuǎn)移酶和拓?fù)洚悩?gòu)酶。這些藥劑不會(huì)&i秀導(dǎo)具有損傷的p53或上調(diào)的Bcl-2的細(xì)胞中的細(xì)胞禾ii^死亡(Evan，GI.和Vousden，K.H.,Nature411:342-348,2001)(圖l)。Moskaleva等(CellBiol.Int.，21(12):793-799，1997)證實(shí)了AFP-藥物軛合物能有效，過度表達(dá)MDR(p-糖蛋白藥物流出泵)的多藥耐藥性的癌細(xì)胞，這表明AFP-藥物軛合物的受體介導(dǎo)胞吞作用征服了多藥耐藥性的癌癥。在本發(fā)明中，細(xì)胞程序死亡誘導(dǎo)齊啲選擇是基于它們?cè)趐53下游的線粒體水平誘導(dǎo)細(xì)胞程序死亡的肖g力。這些細(xì)SfilS^死亡誘導(dǎo)齊(誠(chéng)過它們對(duì)線粒體膜M性和線粒體孔轉(zhuǎn)換和/或半胱天冬酶激活的效應(yīng)，獸,在多藥耐藥性的癌細(xì)胞上引起細(xì)胞毒效應(yīng)(圖l)。雌地，本發(fā)明中4頓的細(xì)胞，歸死亡誘導(dǎo)劑衍生于自,(Pessayre等，"ApoptosisTriggedbyNaturalSubstances",in"ApoptosisandItsModulationbyDrugs",eds.R.GCameron,GFeuer，SpringerPress,2000，pp.86-108)。例如，樺木酸衍生于樺木腦一種大量存在于白樺樹外層樹皮的物質(zhì)(Betulaalba)。本發(fā)明中所用的典型細(xì)胞程序死亡誘導(dǎo)劑包括，但不限于，毒胡蘿卜內(nèi)酯，蒼術(shù)苷，樺木酸，CD437,三氧化二砷，魚藤酮，粉蝶霉素A和氯尼達(dá)明。適合于本發(fā)明使用的細(xì)胞程序死亡誘導(dǎo)劑的其它例子包括或衍生于，但不限于，itt米松，寡霉素B，磷^^氯喹，槲皮素，維生素A，維生素D2和D3,姜黃素，辣椒辣素，和重金屬如鋅，鉛，銅，鎳，鎘和化療劑。本發(fā)明中的組合物可以由任何目前已知的給藥方法輸送到癌細(xì)胞，包括但不限于口服劑量形式(即，膠囊，敏繊和片劑)，栓劑，P狄劑，滴鼻或滴眼齊廿，繃帶，嗅粉劑，注射劑，linaments和局部給藥劑型。在一個(gè)實(shí)式中，組合物被制備為軟用于口服劑量。在另一個(gè)實(shí)施方式中，組合物被制備為注射劑用于靜脈內(nèi)劑量。具體實(shí)施例方式實(shí)施例1PAFP的分離和純化PAFP是從豬胚胎的肝臟和血液，羊水，和胎盤中提取的。由于PAFP波動(dòng)的翻譯后性質(zhì)既肖鏃影響它的生物活性(如，受體結(jié)合)，也能影響它與細(xì)鵬呈序死亡誘導(dǎo)劑的結(jié)合能力，因而實(shí)施提取的胎兒階段是關(guān)鍵的。與從杯孕3到14周之間的胎兒物質(zhì)中提取的PAFP相比，從較早期懷孕(早于3周)，晚斯杯孕(超過14周)的胎兒物質(zhì)中提取的PAFP被不同iW基化(Ruoslahti，E.等，Int.J.Cancer,22:515-520,1978;Keel，B.A.等，in"BiologicalActivitiesofAlphal-Fetoprotein"，BocaRaton,Florida,CRCPressvol2，pp.24-31，1989;MizejewskiGJ.，Exp.Biol.Med226(5):377408,2001;Parker,M.H.等，ProteinExpressionandPurification,38:177-183，2004;Mizejewski,G丄，in"MonographsonEndocrinology"，ed.UlrichWes中hal,Steroid-proteininteractionsII，Springer-Verlag，Berlin,New-York,Tokyo,1986，pp.320-356)。已經(jīng)顯示糖基化的不同狀態(tài)影響HAFP的結(jié)合性質(zhì)，因此由于在胚胎發(fā)生過程中PAFP的糖基化發(fā)生變化和懷孕第14周后液體產(chǎn)量明顯減少，因ltb^M胎中提取液體的時(shí)間是關(guān)鍵的。理想的是，胚胎發(fā)生的第3周至瞎14周之間收集豬胎兒物質(zhì)并進(jìn)行提取過程。提取之后，為了允許自然沉淀作用發(fā)生，在4-l(TC下將血液和羊水(此后稱'原料")保持12到24小時(shí)。收集上清液并轉(zhuǎn)移至不同的容器,接著使用50kDa的膜Ma超濾'鵬3-5次。在超濾Mi^f呈中，'鵬不艦15。C。這個(gè)鵬步驟導(dǎo)致高產(chǎn)量的PAFP。然后加入丁醇使其終濃度為5%-10%之間；典型地，丁醇終濃度約為8%。攪拌原料和丁醇2併中，再孵育混合物一併中，使溶液能夠分離為上面的非水相和下面的水相。保留包含非結(jié)合PAFP的上面的非7K層并經(jīng)aiS析過濾，以從混合物中除去殘留的丁S享。所得的包含PAFP的溶液經(jīng)過體外與細(xì)胞程序死亡誘導(dǎo)齊i腐合，用于治療難治性癌癥。由于本發(fā)明的PAFP提取方法導(dǎo)致增加和更高度濃縮產(chǎn)量的非結(jié)合PAFP，因此它優(yōu)于AFP提取的傳統(tǒng)方法。非結(jié)合是指PAFP不結(jié)M內(nèi)源的結(jié)合配偶^(partnere)。由于非結(jié)合PAFP的濃度更高，可以預(yù)料結(jié)M感興趣的細(xì),序死亡誘導(dǎo)劑的更高濃度的PAFP是可以獲得的。對(duì)用上面詳述的方法提取的PAFP進(jìn)行聚丙烯翻安凝膠電泳(圖2)?？捡R斯，凝膠染色后兩個(gè)主要的蛋白條帶很明顯(圖2，泳道A和泳道C)。上面的條帶(約70kDa)對(duì)應(yīng)于PAFP,下面的條帶(約67kDa)對(duì)應(yīng)于白蛋白。實(shí)施例2PAFP具有與HAFP相比相似的結(jié)合性質(zhì)以前的研究沒有闡述PAFP是否具有與HAFP相比相似的生物學(xué)性質(zhì)。對(duì)上面詳述的方法提取的PAFP^ffi兩種不同的免疫一酶試劑盒進(jìn)行分析，以檢測(cè)上文詳述的方法獲得的提取物中PAFP的存在。比較PAFP樣品與自人血清和羊水中分離的AFP。最初地，對(duì)其中摻入了單克隆抗體的HAFP的樣品進(jìn)行膜EIA甲胎蛋白i式驗(yàn)(貨號(hào)糾10-1，1NDDiagnosticInc.，Vancouver,Canada)。與人AFP樣品相比，PAFP不能與EIA甲胎蛋白試驗(yàn)試劑盒發(fā)生反應(yīng)，這表明PAFP與人AFP在化學(xué)結(jié)構(gòu)上有潛在差別。然后，用向HAFP中摻入了多克隆抗體的第二種i微試劑盒(貨號(hào)T-8456,AFP-EIA-BEST-Strip，Vector-BEST，Novosibirsk，Russia)測(cè)定提取物中PAFP的存在。發(fā)生了表明PAFP與針對(duì)人AFP的抗體發(fā)生反應(yīng)的能力的陽(yáng)性反應(yīng)。免疫測(cè)定研究的結(jié)果表明PAFP肖灘被針對(duì)HAFP的抗體識(shí)別，表明PAFP在結(jié)構(gòu)上與HAFP相似。以前已經(jīng)證實(shí)HAFP本身能夠誘導(dǎo)細(xì)胞程序死亡。誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡顯現(xiàn)在高生理學(xué)劑量的AFP(〉250mg/mL)，而不顯現(xiàn)在低劑量(<200mg/mL)(Dudich等，Eur.J.Biochem.266:l-13,1999)。而且，研究已經(jīng)顯示HAFP能夠與不同的疏水和親水的化合物結(jié)合(Hirano，K.等，Biochem.J.231;189-191，1985)。但是，由于PAFP的氨基,列與HAFP相比存錢異(82n/。氨基酸相似性)(Kim等，AnimalGenetics,33:468485，2002)，PAFP是否育巨夠相似地誘導(dǎo)細(xì)胞程序死亡或其它下游生物學(xué)響應(yīng)，和PAFP是否能與HAFP相似地結(jié)合于不同的藥劑是未知的。在鼠癌癥模型中進(jìn)行的研究證實(shí)了PAFP向癌癥細(xì)胞輸送細(xì)胞程序死亡誘導(dǎo)劑(如蒼術(shù)苷，毒胡蘿卜內(nèi)酯和樺木酸)結(jié)果減少腫瘤負(fù)荷的能力(見實(shí)施例4和6)。因而這些結(jié)果在人類研究中被重復(fù)，其中結(jié)合于PAFP的細(xì)胞禾ii^死亡誘導(dǎo)劑被發(fā)現(xiàn)引起了抗腫瘤效應(yīng)(見實(shí)施例5，7和8)。這些資料一起表明PAFP肖嫩被人和鼠的AFP受體識(shí)別。實(shí)施例3aPAFP和細(xì)胞程序死亡誘導(dǎo)劑在體外的結(jié)合^J:面詳述的提取禾辨獲得的PAFP與細(xì)胞禾辦死亡誘導(dǎo)齊l腐合一倂中，并允許在10-15t:另夕卜孵育10辦中。雖然更長(zhǎng)的孵育期間是可接受的，考慮結(jié)^PAFP的藥劑的量，孵育時(shí)間的延長(zhǎng)不能提供明顯的益處。PAFP-細(xì)胞禾M^死亡誘導(dǎo)劑的混合物然后經(jīng)過使用50kDa自濾和透析過濾步驟以除去小^f和其它的雜質(zhì)，例如在收集原料期間先前提取步驟中用作生物緩沖液的鹽。透析過濾步驟進(jìn)一步幫助清除非結(jié)合的剩余細(xì)胞程序死亡誘導(dǎo)劑。滲余物包含以后步驟中有用的PAFP-細(xì)胞禾i^死亡誘導(dǎo)劑混，。4頓0.22Wt的膜進(jìn)行最后過濾步驟，以過濾消毒所得的溶液。白蛋白余留在混合物中但不干擾本發(fā)明組合物的功效。將所得的溶液瞬間凍于45'C直至其完全凍結(jié)。然后，PAFP-細(xì)胞程序死亡誘導(dǎo)劑組合物在冷凍干燥儀中進(jìn)行干燥直至該層完全干燥。冷凍干燥的PAFP-細(xì)胞程序死亡誘導(dǎo)劑組合物然后被粉碎為細(xì)微顆粒，并保證粉末溫度不超過35。C。得到80目或更小的粉末，目的是促進(jìn)組^1摻入不同的制劑送系統(tǒng)。粉末中PAFP的精確量能夠用HPLC或PAAG-電泳i^計(jì)算。實(shí)施例3b-PAFP-蒼術(shù)苷具有35g/L的總蛋白終濃度和大約21g/L的PAFP的一升PAFP^#^物(retentate)，與250mg溶于50mL水的蒼術(shù)苷(MW=803)結(jié)合，以達(dá)到PAFP:蒼術(shù)苷的摩爾比為1:1。溶液被允許在4-15"C混合10併中，然后用2-3體積的水進(jìn)行超濾和透析過濾。一升的終溶、M行冷凍干燥以產(chǎn)生PAFP-蒼術(shù)苷組合物。實(shí)施例3c-PAFP-毒胡蘿卜內(nèi)酯具有8g/L的總蛋白濃度和約1.7g/L的PAFP的半升PAFP滲余物，與10mg溶于10mL醇的毒胡蘿卜內(nèi)酯(MW=650)結(jié)合，以達(dá)到PAFP:毒胡蘿卜內(nèi)酯的摩爾比為1:1。溶液被允許在15-25"混合30併中，然后用2-5體積的水進(jìn)行超濾和透析過濾。二百毫升的終溶液進(jìn)行冷凍干燥以產(chǎn)生PAF卩-毒胡蘿卜內(nèi)酯組合物。實(shí)施例3d-PAFP-樺木酸具有20g/L的總蛋白濃度和約14g/L的PAFP的2升PAFP滲余物，與滴加的500mg溶于100mLDMSO的樺木酸(MW=456)結(jié)合，以達(dá)到PAFP:樺木酸的摩爾比為l:1。溶液被允許在25-37'C混合10射中，然后進(jìn)^it析過濾。一升的終溶、M行冷凍干燥以產(chǎn)生PAFP-樺木酸組合物。實(shí)施例4體內(nèi)鼠白血病模型PAFP+細(xì)胞禾聘死亡誘導(dǎo)齊贓月中瘤細(xì)胞接禾中24天后殺死小鼠中的腫瘤細(xì)胞。DBA2品種(strain)小鼠在身體側(cè)皮下接種20,000先前已被證明表達(dá)AFP受體的P-388鼠白血病細(xì)胞(Severin等，Dokl.AcadNauk，366(4):561-564，1999;Moro-Vidal，R.,CurexTechnologiesInc.,www.biocurex.com)。所有的動(dòng)物在接種后存活。10只小鼠各自接受下述的每日治療的一種1-制劑A(PAFP-蒼術(shù)苷組^tl)2-制劑T(PAFP-毒胡蘿卜內(nèi)酯組合物)3-制劑S(脾提取物)4-制劑A+S5-制劑T+S6-對(duì)照油7-對(duì)照水每組由10只小鼠組成的小組在第2天，即P—388細(xì)胞接種后的那天開始每天接受0.2mL口服齊懂的在油輸送媒介中的指示治療。動(dòng)物在接種后的第24天被評(píng)估腫瘤的生長(zhǎng)。表2中是對(duì)結(jié)果的總結(jié)。<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>皮下接種到小鼠體側(cè)并在接種后一天開始每日按指示治療的P-388淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞系的生長(zhǎng)在圖3中顯示。結(jié)果1.接種后第24天，與對(duì)照組6(油)相比，組l(PAFP-蒼術(shù)苷)和組2(PAFP-毒胡蘿卜內(nèi)酉旨)的動(dòng)物月中瘤的生長(zhǎng)分別被平均抑制79%和53%。在接種后第22天，與對(duì)照組7(水)相比，腫瘤的生長(zhǎng)分別被平均抑制85%和79%。2.當(dāng)每組10只動(dòng)物中有50%(例如5只動(dòng)物)存活時(shí)，測(cè)定存活率。與接受水作為對(duì)照(組7)(第21天)的動(dòng)物存活率相比，被施用PAFP-蒼術(shù)苷組合物的組1動(dòng)物(第30天)50%存活率增加1.4倍。被施用PAFP-毒胡蘿卜內(nèi)酯組合物的組2動(dòng)物(第27天)50%存活率比對(duì)照動(dòng)物增加1.28倍(圖4)。3.接種后第38天，每日接受PAFP-蒼術(shù)苷("制劑"A)治療的10只小鼠仍然有3只存活，被施用PAFP-毒胡蘿卜內(nèi)酯("制劑"T)的10只小鼠仍有l(wèi)只存活(圖4)。至i腐24^zK對(duì)照組的所有的小鼠死亡，而至嘴25天油對(duì)照組的^f有的小鼠死亡。4.接種后第38天仍然存活的每日接受"制劑A"治療的3只小鼠中的1只，觀察到了腫瘤消退(表3)。表3接種后天數(shù)13151720"2438月中瘤大小(cm3)00.050.050.050.030.01*ND*^>未確定^ffiAFP作為其共價(jià)結(jié)合于的抗生素埃斯波霉素Al的輸送運(yùn)載體，相似的腫瘤生長(zhǎng)消退被Severin等證實(shí)(Severin，S.E.等，Dokl.Akad.Nauk.366(4):5614,1999)。結(jié)論1."制劑A"稱'制劑T"分別包含PAFP-蒼術(shù)苷和PAFP-毒胡蘿卜內(nèi)酯，在所證實(shí)的濃度，抑制腫瘤生長(zhǎng)。2.施用結(jié)合于PAFP的細(xì)胞程序死亡誘導(dǎo)劑蒼術(shù)苷和毒胡蘿卜內(nèi)酯延長(zhǎng)了白血病小鼠模型中的存活。實(shí)施例5體內(nèi)數(shù)據(jù)一腫瘤PAFP—蒼術(shù)苷組合物殺死人中的腫瘤細(xì)胞8位被他們各自的醫(yī)生歸于癌癥進(jìn)展IV期的患者，1個(gè)月中每天以膠囊形式(2-6粒膠囊)施用口服劑量的PAFP—蒼術(shù)苷組合物。這些患者的進(jìn)展由他們各自的醫(yī)生另外追蹤4個(gè)月?；颊咦约簣?bào)告生活質(zhì)量提高。根據(jù)這些患者進(jìn)行的CT掃描，接受PAFP—蒼術(shù)苷治療的那些患者經(jīng)歷了原發(fā)腫瘤生長(zhǎng)率的下降，有些病例經(jīng)歷了原發(fā)腫瘤大小的減小和轉(zhuǎn)移程度的減小。最初人類研究的結(jié)論如下1.在治療過程中以日齊懂2"6粒膠囊口服攝取PAFP—蒼術(shù)苷產(chǎn)品(在淀粉和油運(yùn)載體內(nèi))發(fā)現(xiàn)是安全的，且副作用最小。2.原發(fā)和轉(zhuǎn)移腫瘤大小的減少和轉(zhuǎn)移部位疼痛的減輕證實(shí)了PAFP—蒼術(shù)苷產(chǎn)品特異的抗癌作用。3.在接受單獨(dú)或與其它藥物聯(lián)合施用PAFP—蒼術(shù)苷組合物的病人身上，觀察到了通過病人描述的體力活動(dòng)和總體健康狀況的改善而測(cè)量的生活質(zhì)量的明顯進(jìn)步。4.M^表明了被施用PAF—蒼術(shù)苷組合物的病人的齊懂^^響應(yīng)，是由觀察到的原發(fā)和轉(zhuǎn)糊中瘤團(tuán)塊的減小確定的。5.當(dāng)施用PAFP-蒼術(shù)苷的劑量增加時(shí)，只偶爾伴隨急性免疫反應(yīng)(#^顯增加，腫瘤/轉(zhuǎn)移部位局部痛)。6.響應(yīng)于PAFP—蒼術(shù)苷組合物的施用，IV期癌癥病人腫瘤負(fù)擔(dān)的下降表明該組合物是可口服生物利用的。實(shí)施例6體內(nèi)數(shù)據(jù)一白血病包含在體外可逆地與第一細(xì)胞程序死亡誘導(dǎo)劑和第二細(xì)胞程序死亡誘導(dǎo)劑結(jié)合的外源性的PAFP的組合物殺傷小鼠中的腫瘤細(xì)胞每日治療包括1一對(duì)照水2—對(duì)照油3—體外結(jié)合于第一細(xì)胞程序死亡誘導(dǎo)劑(樺木酸)的PAFP(PAFP-樺木酸組合物)4—體外結(jié)合于第一細(xì)lfil呈序死亡誘導(dǎo)劑(樺木酸)的PAFP(PAFP-樺木酸組合物)，結(jié)合額外的非結(jié)合的樺木酸小鼠在第1天被接種20，000P—388鼠白血病細(xì)胞，在第2天被施用每曰口服劑量的0,2mL水(1)或油(2)對(duì)照治療或0.2mL劑量的試驗(yàn)制劑3或4。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的齡治療組包括10只小鼠。圖5顯示了接受日口服齊懂的水(1),油(2)，PAFP-結(jié)合樺木酸(3)或PAFP-結(jié)合樺木酸并結(jié)合有額外的非結(jié)合樺木酸(4)中的一種的動(dòng)物中作為時(shí)間函數(shù)的P-388白血病細(xì)胞的生長(zhǎng)圖，其中后兩種串柳各自懸浮于0.2mL油中。組4治療是通過在DMSO中^l早過量的樺木酸如0.5mg/mL，然后將2mL(l略)此溶液加入到0.2mLPAFP-結(jié)合樺木酸制劑中來(lái)制備的。一旦PAFP-結(jié)合樺木酸被輸送到腫瘤細(xì)胞，基于證實(shí)1125標(biāo)記的AFP被腫瘤性淋巴細(xì)胞系吞噬和從該細(xì)胞實(shí)際Jl^被劂軍地釋放的體夕h5開究結(jié)果(Torres等，Int.J.Cancer47(1):110-117，1991)，可假設(shè)PAFP通皿《彌胞夕卜循環(huán)4鈔卜源性的PAFP能夠在腫瘤微環(huán)境中結(jié)合過量的樺木酸，隨后可輸送到腫瘤細(xì)胞。樺木酸(BA)己經(jīng)被應(yīng)用于治療惡性黑素瘤(U.S.專利申請(qǐng)公開號(hào)2003/0186945),但是，需要大劑量的BA(每天0.2mg-500mg)。PAFP與BA以摩爾比l:2混合，該組合吻在0.2ml的油作為載體中皿給人的量是0.6mg。關(guān)于重量比，樺木酸以日劑量0.008mg存在。當(dāng)與PAFP結(jié)合時(shí)，樺木酸被發(fā)現(xiàn)在微克濃頗人類有效。Boik(NaturalCompoundsinCancerTherapy,2001)提供了下面依據(jù)人劑量計(jì)算相對(duì)的(equivalent)鼠口服劑量的等式人劑量(克/kg)-小鼠劑量(mg/kg)/104。體重為75Kg的人和體重為0.02kg的小鼠給定0.0006g(人劑量)X104-小鼠劑量(mg/kg)=0.0624mg/kg。對(duì)于0.02kg的小鼠，劑量可以如此計(jì)算0.0624mg/kgX0.02kg=0.01248mg或12昭。依據(jù)人劑量計(jì)算鼠劑量的系數(shù)為60(Vg(人日劑量)/12嗎(鼠日劑量)=50。如果過量的第二細(xì)胞程序死亡誘導(dǎo)劑包括在該劑量?jī)?nèi)，該第二細(xì)胞程序死亡誘導(dǎo)劑以油懸浮形式稍后被加入到已經(jīng)制備的第一復(fù)合體的油懸浮液中(PAFP/第一細(xì)胞程序死亡誘導(dǎo)鄉(xiāng)中。例如，有IW性的鼠劑量包含與0.05mL油混合并與溶于油并形成0.2mL油終體積的0.15mg樺木酸結(jié)合的干形式的7叱的PAFP-樺木酸復(fù)合體。比較在缺乏過量的樺木酸下接受PAFP-結(jié)合的樺木酸的動(dòng)物(組3)中的腫瘤體積和存在過量樺木酸并接受PAF卩-結(jié)合的樺木酸的動(dòng)物(組4)中的腫瘤體積，表明后一種治療致働中瘤體積縮小。該結(jié)果表明PAFP-結(jié)合的樺木酸與過量的非結(jié)合的樺木酸B有更多的治療益處。該數(shù)據(jù)進(jìn)一步表明通過:l)向腫瘤細(xì)胞輸送與細(xì)胞程序死亡誘導(dǎo)劑結(jié)合的PAFP和2)接著輸送附加的旨灘在體內(nèi)結(jié)^fPAFP以改善治療效果的第二細(xì)胞程序死亡誘導(dǎo)劑，可以用結(jié)MPAFP的細(xì)胞程序死亡誘導(dǎo)劑治療其細(xì)胞表達(dá)AFP受體的惡性腫瘤。該結(jié)果證實(shí)了在PAFP-結(jié)合樺木酸制劑中包含過量的、未結(jié)合的樺木酸在陶氐腫瘤生長(zhǎng)上比斜蟲PAFP-結(jié)合樺木酸更有效。而且，該數(shù)據(jù)顯示了在本發(fā)明中f柳第二細(xì)胞，辨死亡誘導(dǎo)劑的治療優(yōu)勢(shì)。實(shí)施例7體內(nèi)數(shù)據(jù)一腫瘤包含在體外可逆地結(jié)合于第一化合物的外源性的PAFP和用于殺傷人類患者中的實(shí)體瘤類型癌癥的第二化合物的組合物?；加袑?shí)體瘤，有或沒有轉(zhuǎn)移灶的5位患者(4位女性和1位男性)中的初步結(jié)果患者弁l:女性，57歲，局限(bcalized)乳腺癌患者弁2:女性，63歲，乳腺癌，骨轉(zhuǎn)移患者弁3:女性，44歲，卵巢乳腺癌病人弁4:女性，60歲，乳腺癌，伴轉(zhuǎn)移至淋巴結(jié)病人井5:男性，58歲，睪丸癌。本研究的目的是評(píng)價(jià)患有實(shí)體類型癌癥的被劃分為不能手術(shù)的，抵抗現(xiàn)有治療的或手術(shù)后復(fù)發(fā)的患者中對(duì)PAFP—樺木酸組合物的響應(yīng)?；颊咭蝗嗽谠绯亢鸵蝗嗽谒胺謩e空腹每日服用1粒軟凝膠。每粒軟凝膠包含PAFP-樺木酸產(chǎn)品(即，體外可逆地結(jié)^T外源性的PAFP的樺木酸)和過量的樺木酸(即，附加的不結(jié)合于PAFP的樺木酸)。PAFP-樺木酸產(chǎn)品在每粒軟凝膠中以單個(gè)單位劑量的300pgPAFP和6jxg樺木酸的形式提供。過量的或附加的樺木酸以每粒軟凝膠150昭的形式出現(xiàn)。初步結(jié)果顯示5位患者中的4位證實(shí)了癌癥進(jìn)皿度下降和總體更好的生活質(zhì)量，這是根據(jù)病人關(guān)于自減輕，能量(energy)水平改善和食欲增加的報(bào)告確定的。患者沒有報(bào)告任何與使用軟凝膠治療相關(guān)的副作用。實(shí)施例8體內(nèi)數(shù)據(jù)一人類患者轉(zhuǎn)移腫瘤體積的減少本研究的目的是評(píng)價(jià)PAFP-蒼術(shù)苷復(fù)合體對(duì)治療實(shí)體瘤的治療益處。軟凝銜softgels灘施用于具轉(zhuǎn)移疾病的患者，每天一人在早晨和一人在睡前分別空腹口服2粒(caps)。評(píng)估了13位患者，12位患者被診斷為結(jié)腸癌，l位患者為乳腺癌。每位患者至少在一個(gè)部位出現(xiàn)轉(zhuǎn)移疾病。7位患者是女性，6位是男性，各自年齡在45到65歲之間。^i患者以每天2粒膠囊(每粒膠囊0.3mgPAFP+0.006mg蒼術(shù)苷)的齊U量被施用PAFP-結(jié)合細(xì)胞程序死亡誘導(dǎo)劑(名稱為CPA)4—8周。在治療前后分別進(jìn)^i十算機(jī)X線體層照相術(shù)(CT)(Siemens,16層)掃描。下面是本研究的結(jié)果?；贑T掃描數(shù)據(jù)，患者響應(yīng)被劃分為以下的一種完全沒有明顯的轉(zhuǎn)移部分至少一處轉(zhuǎn)移已消失或尺寸減小穩(wěn)定轉(zhuǎn)移生長(zhǎng)在世界衛(wèi)生組織關(guān)于穩(wěn)定的標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)(生長(zhǎng)小于25%)進(jìn)展轉(zhuǎn)移的尺寸的增長(zhǎng)(大于25%)或身體狀況更差中斷副反應(yīng)導(dǎo)致治療中斷。在表4中提供了對(duì)患者數(shù)據(jù)的總結(jié)。圖6和7中提供的治療前后對(duì)患者P.和P.N.G的CT掃描顯示他們都對(duì)該治療完全響應(yīng)。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>完整的患者資料如下患者P.性別男年齡56歲臨床診斷結(jié)腸癌(T2NOMO)腺癌(來(lái)自2005.01.21的B-12325648)以前的治療手術(shù)(腫瘤切除術(shù))一2005.01.15施用PAFP-蒼術(shù)苷組合物之前2006.05—進(jìn)展l處肝臟轉(zhuǎn)移(Mts)(13x15mm)(來(lái)自2006.05.15的CT)施用PAFP-蒼術(shù)苷組合物2006.05.05-2006.07.15治療結(jié)果劃干臟轉(zhuǎn)移(來(lái)自2006.08.02的CT)生活質(zhì)量(Kamofsky指數(shù))=80%副作用無(wú)結(jié)論完全反應(yīng)。轉(zhuǎn)移消失。對(duì)患者P.治療前(左)和治療后(右)進(jìn)行的CT掃描(圖6)比較顯示治療后轉(zhuǎn)移(箭頭)不再明顯?；颊逷.N.G性別男年齡62歲臨床診斷結(jié)腸癌(T2N0M0)。腺癌(來(lái)自2005.09.01的O-1045"48)以前的治療手術(shù)(腫瘤切除術(shù)，左)一2005.08施用PAFP-蒼術(shù)苷組合物之前2006.05—進(jìn)展l處肝臟轉(zhuǎn)移7xl0mm(來(lái)自2006.05.20的CT)生活質(zhì)量(Kamofsky指數(shù))=90%施用PAFP-蒼術(shù)苷組^J:2006.06.10-2006.07.22治療結(jié)果無(wú)肝臟轉(zhuǎn)移(來(lái)自2006.08.16的CT)生活質(zhì)量(Kamofsky指數(shù))=90%副作用無(wú)結(jié)論完全反應(yīng)。轉(zhuǎn)移(7xl0mm)消失。對(duì)于患者PN.G，治療前(左)和治療后(右)進(jìn)行的CT掃描(圖7)比較顯示治療后轉(zhuǎn)移(箭頭)不再明顯?；颊逜.N.A.性別女，年齡48歲臨床診斷結(jié)腸癌(T3aNlMl)，轉(zhuǎn)移1(肝臟)，腺癌(來(lái)自2005.09.25的B-1167-75)以前的治療非手術(shù)；化療(樂沙定，AIimta)，2005.10-2006.02;腫瘤生長(zhǎng)穩(wěn)定施用PAFP-蒼術(shù)苷組合物之前2006.05-進(jìn)展.肝臟轉(zhuǎn)移(左葉)25x27mm(來(lái)自2006.05.28的CT)生活質(zhì)量(Kamofsky指數(shù))=80%施用PAFP-蒼術(shù)苷組合物2006.06.10-2006.08.12治療結(jié)果肝臟轉(zhuǎn)移(左葉)16xllmm(來(lái)自2006.08.21的CT)生活質(zhì)量(Kamofsky指數(shù))=90%副作用無(wú)結(jié)論部分響應(yīng)轉(zhuǎn)移減小。CT掃描顯示接受每天兩次劑量的PAFP-蒼術(shù)苷組合物的患者的結(jié)腸癌肝臟轉(zhuǎn)移的大小減小73%(25x27=675，16x11=176,675—176=499，499/675=73.9%)?；颊逜.N.P.性別女，年齡63歲臨床診斷結(jié)腸Cr.(T3N0M0)，腺癌(來(lái)自2005.01.14的0-1117-29)以前的治療手術(shù)(結(jié)腸部分切除術(shù)，右)一2004.122005.08-迸展.化療一樂沙定，希羅達(dá)，5—FU;部分響應(yīng)施用PAFP-蒼術(shù)苷組合物之前2006.05—進(jìn)展，Retzidiv:3處肝臟轉(zhuǎn)移21x28腿，27x29腿，10xl2mm(來(lái)自2006.05.17的CT)生活質(zhì)量(Karnofsky指數(shù))=70-80%施用PAFP-蒼術(shù)苷組合物2006.06.05-2006.07.30治療結(jié)果2處肝臟轉(zhuǎn)移21x28mm，27x29腿(來(lái)自2006.08.08的CT)生活質(zhì)量(Karnofsky指數(shù))=90%副反應(yīng)無(wú)結(jié)論部分響應(yīng)一處(10"2mm)月干臟轉(zhuǎn)移消失。患者S.VA.性別女年齡45歲臨床診斷結(jié)腸癌(T2NlM0)。腺癌(來(lái)自2004.03.25的0-13542)以前的治療手術(shù)(結(jié)腸部分切除術(shù)，左)一2005.032006.05-對(duì)癥治療施用PAFP-蒼術(shù)苷組合物之前2006.04-進(jìn)展3處肝臟轉(zhuǎn)移45x65mm，26x42mm和7x9mm(來(lái)自2006.04.26的CT)生活質(zhì)量(Kamofsky指數(shù))=80%施用PAFP-蒼術(shù)苷組合物2006.06.29-2006.07.24治療結(jié)果2處肝臟轉(zhuǎn)移42x55mm和26x42mm(來(lái)自2006.08.03的CT)生活質(zhì)量(Kamofsky指數(shù))=90%副作用無(wú)結(jié)論部分響應(yīng)l處轉(zhuǎn)移被清除(7x9mm)，2處轉(zhuǎn)移穩(wěn)定?；颊遉.T.P.性別女年齡49歲臨床診斷乳腺Cr.(T3bNlM0)以前的治療手術(shù)(乳房切除術(shù))一2004.12;放療(淋巴結(jié)區(qū)域)；泰索帝治療；穩(wěn)定施用PAFP-蒼術(shù)苷組，之前2006.07—進(jìn)展l處肝臟轉(zhuǎn)移67x69mm(來(lái)自2006.07.18的CT)生活質(zhì)量(Kamofsky指數(shù))=90%施用PAFP-蒼術(shù)苷組合物2006.08.05-2006.09.02治療結(jié)果l處肝臟轉(zhuǎn)移68x66mm(來(lái)自2006.08.30的CT)生活質(zhì)量(Kamofsky指數(shù))=90%副作用無(wú)結(jié)論穩(wěn)定患者G..N.K.性別女年齡62歲臨床診斷結(jié)腸癌(T2NOM0)，腺癌(來(lái)自2005.06.14的O-1086-92)以前的治療手術(shù)(腫瘤切除術(shù)，右)一2005.06施用PAFP-蒼術(shù)苷組，之前2006.06—進(jìn)展2處肝臟轉(zhuǎn)移8x6mm和6x6mm(來(lái)自2006.06.10的CT)生活質(zhì)量(Kamofsky指數(shù))=90%施用PAFP-蒼術(shù)苷組合物2006.07.01-2006.09.02治療結(jié)果2處肝臟轉(zhuǎn)移8x6腿和6x6mm(來(lái)自2006.09.15的CT)生活質(zhì)量(Kamofsky指數(shù))=90%副作用無(wú)結(jié)論穩(wěn)定。患者P.A.G.性別男年齡65歲臨床診斷結(jié)腸Cr.(T2NOMO)。腺癌(來(lái)自2005.09.25的0-1256-65)以前的治療外禾樣術(shù)一2005.092005.12-進(jìn)展；肝臟轉(zhuǎn)移5個(gè)療程的化療5-FU。施用PAFP-蒼術(shù)苷組合物之前2006.06—進(jìn)展2處肝臟轉(zhuǎn)移32x24腿和32><26mm(來(lái)自2006.06.14的CT)生活質(zhì)量(Karnofsky指數(shù))=90%施用PAFP-蒼術(shù)苷組，2006.06.19-2006.08.13治療結(jié)果2處肝臟轉(zhuǎn)移32x24mm和32x26mm(來(lái)自2006.08.22的CT)生活質(zhì)量(Kamofsky指數(shù))=90%副作用無(wú)結(jié)論穩(wěn)定患者B丄.N.性別女年齡57歲臨床診斷結(jié)腸癌(T3bN0M0)，腺癌(來(lái)自2006.01.14的0-1245-61)以前的治療外科(腫瘤切除術(shù)，右)一2005.12施用PAFP-蒼術(shù)苷組合物之前2006.06—進(jìn)展肝臟轉(zhuǎn)移18xl2mm(來(lái)自2006.06.19的CT)生活質(zhì)量(Kamofsky指數(shù))=90%施用PAFP-蒼術(shù)苷組^h2006.07.02-2006.08.27治療結(jié)果月干臟轉(zhuǎn)移22xl8mm(來(lái)自2006.09.04的CT)生活質(zhì)量(Karnofsky指數(shù))=90%副作用無(wú)結(jié)論進(jìn)展。轉(zhuǎn)移增大艦25%。患者K.A.R.性別男年齡52歲臨床診斷結(jié)腸癌(T3bNlMl—Hep.)，腺癌(B—1189—96)以前的治療非外科。化療一樂沙定(2005.12-2006.02)。穩(wěn)定施用PAFP-蒼術(shù)苷組^t/之前2006.06-進(jìn)展l處肝臟轉(zhuǎn)移118x85mm(來(lái)自2006.06.19的CT)生活質(zhì)量(Kamofsky指數(shù))=60-70%施用PAFP-蒼術(shù)苷組，2006.06.26-2006.08.27治療結(jié)果l處肝臟轉(zhuǎn)移118x85mm(來(lái)自2006.06.19的CT)生活質(zhì)量(Kamofsky指數(shù))=40-50%晚間體溫上升，不能行走。副作用嘔吐，惡心結(jié)論臨腿展。轉(zhuǎn)移一非動(dòng)態(tài)的(穩(wěn)定)患者K.VI_.性別男年齡.*48歲臨床診斷結(jié)腸癌(T3bNlMl—Hep.)，腺癌(B—1245—50)以前的治療非外科?；熞粯飞扯?2005.10-11)。部分響應(yīng)施用PAFP-蒼術(shù)苷組合物之前2006.05—進(jìn)展l處肝臟轉(zhuǎn)移19x9mm(來(lái)自2006.05.16的CT)生活質(zhì)量(Kamofsky指數(shù))=90%施用PAFP-蒼術(shù)苷組合物2006.06.05-2006.07.30治療結(jié)果l姻干轉(zhuǎn)移28x32mm(來(lái)自2006.08.08的CT)生活質(zhì)量(Kamofsky指數(shù))=90%副作用無(wú)結(jié)論進(jìn)展?；颊遬.八，y.性別男年齡65歲臨床診斷結(jié)腸Cr.(T3aNOM0)。腺癌(來(lái)自2005.02.12的0-1212-34)。以前的治療手術(shù)(腫瘤切除術(shù))一2005.022005.10-進(jìn)展；月干臟轉(zhuǎn)移2005.10—11—化療(樂沙定)一部分響應(yīng)施用PAFP-蒼術(shù)苷組合物之前2006.06—進(jìn)展。2處肝臟轉(zhuǎn)移7x8mm和5x6證(來(lái)自2006.06.06的CT)生活質(zhì)量(Kamofsky指數(shù))=90%。施用PAFP-蒼術(shù)苷組合物2006.06.05-2006.08.06。治療結(jié)果2處肝轉(zhuǎn)移12x9mm和6x8mm(來(lái)自2006.08.07的CT)生活質(zhì)量(Kamofsky指數(shù))=90%副作用無(wú)。結(jié)論進(jìn)展?；颊逺.D.P性別女年齡62歲臨床診斷結(jié)腸癌(T2NlM0)。腺癌(來(lái)自2004.09.29的0-1187—48)以前的治療外科(腫瘤切除術(shù),左)一2004.09施用PAFP-蒼術(shù)苷組^I之前2006.05—進(jìn)展:2處肝臟轉(zhuǎn)移:65x85mm和46x22腿,傾向融合(來(lái)自2006.05.14的CT)生活質(zhì)量(Kamofsky指數(shù))=90%施用PAFP-蒼術(shù)苷組合物2006.06治療結(jié)果未確定副作用嘔吐，惡心；止吐藥不能抑制結(jié)論治療由于副作用(嘔吐，惡心)中斷考慮到本研究中治療的是晚期癌癥，13位|用日劑量CAP的患者的結(jié)果表明有61%(8/13)例證了響應(yīng)。響應(yīng)是指治療后檢測(cè)不到轉(zhuǎn)移腫塊(15%，2/13),至少一處轉(zhuǎn)移腫塊被消除或尺寸減小(23%，3/13)或沒有觀察到轉(zhuǎn)移灶生長(zhǎng)的進(jìn)展(穩(wěn)定，23%，3/13)。4位患者經(jīng)歷了其疾病的進(jìn)展(31%),—位(8%)患者由于副作用(嘔吐，惡心)從研究中被排除。主要的研究人員不能確定副作用是否直接與治療相關(guān)，也暗示初始的肝臟轉(zhuǎn)移的大小(65x85mm和46><22mm,傾向于融合)可育旨會(huì)有影響。除了一個(gè)與攝取該產(chǎn)品不能直接相關(guān)的嘔吐病例之外，沒有嚴(yán)重副作用報(bào)告。分別使用樂沙定/AJimta，和樂沙忠希羅齒5—FU治療后，患者A.N.A.和A.N.P.具有多藥耐藥的轉(zhuǎn)移灶。PAFP-蒼術(shù)苷組合物治療后，這些患者證明了轉(zhuǎn)移腫瘤的尺寸減小。這些支持PAFP-蒼術(shù)苷復(fù)合體在體內(nèi)具有刻艮多藥耐藥性的能力。上述是本發(fā)明某些方面的具體實(shí)施例。很多其它實(shí)施方式，包括其修飾和變體，也是可能的，且在閱讀了本文描述的本發(fā)明后，這些對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說是顯而易見的。因此，所有合適的修飾，變體和等價(jià)物是可以采用的，而且這些修飾，變體和等價(jià)物將落入在此描述的本發(fā)明的范圍內(nèi)和所附的權(quán)利要求書的范圍之內(nèi)。參考文獻(xiàn)Abelev,G丄，Alpha-fetoprotein:25yearsofstudy.7V歸r腸/ogy,10:63-74;1989.Boik,John.,NaturalCompoundsinCancerTherapy,PromisingNontoxicAntitumorAgentsfromPlants&OtherAnimalSources,Minnesota:OregonMedicalPress,2001，Bykov，V.J.g/，，Restorationofthetumorsuppressorfunctiontomutantp53byalow-molecular-weightcompound.TVla/.AW/cme8(3):283-8，2002.CostantiniWa/.，Mitochondrionasanoveltargetofanticancerchemotherapy.歸.92(13):1042-53,2000.DecaudinD，GeleyS，HirschT，Bcl-2andBcl-XLantagonizethemitochondrialdysfunctionprecedingnuclearapoptosisinducedbychemotherapeuticagents.Cfl"cer/ey.1997;57:62-67.DudichWa/.，Alpha-fetoproteincausesapoptosisintumorcellsviaapathwayind鄰endentofCD95，TNFRlandTNRF^throughactivationofcaspase-3-likeproteases.￡wr.J.266:1-13,1999.Evan，G.I.andVousden,K'H.,Proliferation,cellcycleandapoptosisincancer,淑w"411:342-348，2001.Feldman,N.B,a/.,AntitumoractivityofAFPconjugatewithdoxorubicin/"v"roand/"v/vo.65:1140-1145，2000.Fisher,D.E.，Apoptosisincancertherapy:crossingthethreshold.Ce〃78:539-542，1994.Fulda，S.a/.，Activationofmitochondriaandreleaseofmitochondrialapoptogenicfactorsbybetulinicacid.5/o/,CAew,18:273(51):33942-8，1998.GermannUA,,P-glycoprotein-amediatorofmultidrugresistanceintumourcells.￡wrCa,!cer，32A:927-944，1996.Hirano，K.a/,，Drug-bindingpropertiesofhumanAFP.丄,231,189-191，1985.Ked，B.A.，Cho,S.，CharacterizationofhumanAFPchargemicroheterogeneitybychromatofocusing,MizejewskiGI，JacobsonHI,eds,,BiologicalActivitiesofAlphal-Fetoprotein.BocaRaton,Florida:CRCPress;vol2，24-31,1989.Kima/.，Mappingoftheporcinealpha-fetoprotein(AFP)genetoswinechromosome8.InternationalSocietyforAnimalGenetics,爿m'/wa/33:468-485,2002.Kroemer，G.，Zamz咖i,N,,Susin，S.A,，Mitochondrialcontrolofapoptosis./mmwwo/ro^iy18:44-51，1997,Laborda,J,，Naval,J"Allcmche,M.，Calvo,M'，Georgoulias,V.，Mishal，Z"Uriel,J.,SpecificuptakeofAFPbymalignanthumanlymphoidcells,/"AJ,Qmcer40:314-318,1987.LehnertM.,Clinicalmultidrugresistanceincancer:amultifactorialproblem.￡wr乂32A:912-920，1996.Lutsenkoa/.,AntitumorActivityofAlphaFetoproteinandEpidermalGrowthFactorConjugates/"v〃roand/wv/vo.『wmor5zo/ogy21(6):367-374，2000.Marchetti，P.，Castedo，M.，Susin，S，A.，Zamz咖i，N.，Hirsch,T,，Macho，A.,Haefftier,A.,Hirsch，F(xiàn),，Geuskens，M.，andKroemer，G.J.，￡平A/eJ.184，1155-1160，1996.Mizejewski，G.J.,Alpha-fetoprotein，MonographsonEndocrinology,UlrichWestpha，Steroid-proteininteractionsII,§pringer-Verlag,Berlin,New-York,Tokyo,1986，320-356.Mizejewski,G.J."/.，Studiesoftheintrinsicantiuterotropicactivityofmurinealpha-fetoprotein.r"加owr則.7(1):19-36，1986.Mizejewski，G,J.,Alpha-fetoproteinstructureandfunctionrelevancetoisoforms，epitopesandconformationalvariants.￡!x/.A/ec/.226(5):377-408，2001.Mizejewski，G.J.,NewinsightsintoAFPstructureandfunction:potentialbiomedicalapplications,Alpha-FetoproteinandCongenitalDisorders,ed.MizejewskiG丄,AcademicPress,lnc.，1985.MizejewskiGI，JacobsonHI,eds.，BiologicalActivitiesofAlpha1-Fetoprotein.BocaRaton,Florida:CRCPress;vol1，1987;vol2,1989-Morinaga，T，Sakai，M，Wegmann，TG，Tamaoki，丁.，Primarystructuresofhumanalpha-fetoproteinanditsmRNA./Voc，淑/.々"dt/S^，1983Aug;80(15):4604-8.Moro，R.，TheAFPreceptor-awidespreadoncofetalantigen,BiologicalActivitiesofAFP，CRCPress,BocaRaton，F(xiàn)lorid^vol.2，120-127,1987.Moro-Vidal，R.,TheAFPreceptor:awidespreadcancermarkerofclinicalpotential,CurextechnologiesInc.,www.biocurex.com,MoskalevaAlpha-fetoprotein-mediatedtargeting:anewstrategytoovercomemultidrugresistanceoftumourcellsv"ra.Ce//fi/o/./"t21(12):793-91997，1997.Murgila，R,A,，Recombinantalpha-fetoproteinhybridcytotoxinsfortreatinganddiagnosingcancers,U.S.PatentNo.6,534,479,March18，2003.Murgita，R.A.,Recombinantalpha-fetoproteinfortreatingcancers,U.S.PatentNo.6,630,445October7，2003.Nishi，S.，Watabe，H.,Hirai,H.，ImmunologicalandchemicalcorrelationbetweenAFPsfromhumanandseveralmammalianspecies.A^/lcarf.iSa'.，259:109-118，1975.Nunez，E.A.,Benassayag,C.，Ballette,G.,MartinM.E.，Vranckx,R.，Christeff,N.，Garreau,B.,ThephysiochemicalandbiologicalpropertiesofAFPdependonitsligandenvironment./M<c/.AfeJ.j/"et/5"c/.,33:18-16,1989.Pak，V.N.oi/,，Methodoftreatmentofmalignantneoplasmsandcomplexpreparationhavingantineoplasticactivityforuseinsuchtreatment,U.S.PatentNo.6,878,688,2005.Parker,M.H.eza/.,PurificationandcharacterizationofarecombinantversionofhumanAFPexpressedinthemilkoftransgenicgoats./VoWmfi^resw'o"P"r—"ow,38:177-183,2004.Pessayreetal,HepatocyteApoptosisTriggedbyNaturalSubstances,ApoptosisandItsModulationbyDrugs,eds.R.G.Cameron,G.Feuer，SpringerPress,86-108，2000.Pezzutoa/.，Methodofpreparinganduseofprodrugsorbetulinicacidderivatives,USPatentApplicationPublicationNo.2003/0186945.Puttfl/.，Smallmoleculeactivationofprocaspase-3tocaspase-3asapersonalizedanticancerstrategy.A^nwreCV;ew.5i.o/.，2:543-550,2006.Ruoslahti,E.,Seppala,M.,Studiesofcarcino-fetalproteins.III.Developmentofradio-immunoassayforalpha-fetoprotein.Demonstrationofalpha-fetoproteininserumofhealthyhumanadults./Ca"ce/"8:374-383，1971.Ruoslahti,E.，Engvall,E.，Pekkaa,M,Seppala,M.，DevelopmentalchangesincarbohydratemoietyofAFP./W.Ca"cer,22:515-520，1978.Severin,S.E.a/.,Alpha-fetoprotein-mediatedtargetingofanti-cancerdrugstotumorcells/"Wrra.5iocAew.A/o/.AW./"r.37(2):385-92，1995.Severin，S.E."a/"AntitumoractivityofacovalentconjugateoftheendieneantibioticesperamicinAlwithhumanalpha-fetoprotein，DoW.屈。c.MwA:，366(4):56卜4,1999.Sotnichenko,A.I.，Severin,S.E.，Posypanova，G.A.，F(xiàn)eldman,N.B.,Grigor,M丄，Severin,E.S.,Petrov,R.V.，Water-soluble2，3，7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxincomplexwithhumanAFP:properties,toxicityf'"v/vo，andanti-tumoractivity!wv/vo.FEBS丄"f.，450:49-51,1999.Susin，S.A.，Zamzami,N.，Castedo,M,，Hirsch,T,，Marchetti,P,,Macho，A.,Daugas，E.,Geuskens,M.，andKroemer，G.J,￡!xp.Aferf.，184，1331-1341，1996.Thomas,H.，'Coley，H.M，OvercomingMultidrugResistanceinCancer:AnUpdateontheClinicalStrategyofInhibitingP-Glycoprotein.G/;tcer"Co密o/，10(2):159-165，2003.Torres,J.M.，Geuskens，M.，Uriel,J.,Receptor-mediatedendocytosisandrecyclingofAFPinhumanB-lymphomaandT-leukemiacells,/wt47:110-117,1991.UrielWa/.，Biologicalactivitiesofalpha-fetoprotein，F(xiàn)loridaCongresses,ed.Mizejewski,G.J.,CRCPressInc.,BocaRaton，Vol,2，104-117,1987.Wu，J.T.，ClaytonF.,DetectionofvariousisoformsofhumanAFP,MizejewskiGI,JacobsonHI,eds.BiologicalActivitiesofAlpha1-Fetoprotein.BocaRaton,Florida:CRCPress;vol2，3-13,1987.Zamzani，N.，Susin，S.A.，Marchetti，P.，Mitochondrialcontrolofnuclearapoptosis.A/W"183:1533-1544，1996.權(quán)利要求1.一種組合物，其包含非共價(jià)復(fù)合體，其成分如下外源性的甲胎蛋白(AFP)；和至少一種細(xì)胞程序死亡誘導(dǎo)劑，其選自線粒體膜透化劑，線粒體孔開放誘導(dǎo)劑，離子載體，半胱天冬酶9激活劑，半胱天冬酶3激活劑和類維生素A類，其中所述至少一種細(xì)胞程序死亡誘導(dǎo)劑可逆地結(jié)合于外源性的AFP。2.根據(jù)權(quán)利要求1的組合物，其中存在兩種可逆地結(jié)合于外源AFP的細(xì)胞程序死亡誘導(dǎo)劑。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2中任意一項(xiàng)的組合物，其中細(xì)胞程序死亡誘導(dǎo)劑選自蒼術(shù)苷，樺木酸，毒胡蘿卜內(nèi)酯，繊酮，粉蝶霉素A，氯尼達(dá)明，CD437,三氧化二砷，A23187,離子霉素，維生素D2和D3，i媳斜公和異維甲酸。4.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任意一項(xiàng)的組合物，其中所述組合物的AFP特異地結(jié)合于在細(xì)胞表面具有至少一種AFP受體的細(xì)胞。5.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任意一項(xiàng)的組合物，其中所述AFP是豬AFP。6.根據(jù)權(quán)利要求5的組合物，其中豬AFP是從懷孕約3至約14周的豬胚胎提取的。7.根據(jù)權(quán)利要求1至6中任意一項(xiàng)的組合物，其中所述組合物呈用于口服的膠囊，軟凝膠或片劑形式，栓抓可注射劑，吸入齊膨式(formula)，滴鼻劑，滴眼劑，繃帶，linament或局部給藥制劑。8.夕卜源性的AFP用于在哺乳動(dòng)物中向在細(xì)胞表面具有至少一種AFP受體的癌細(xì)胞輸送至少一種細(xì)胞程序死亡誘導(dǎo)劑的用途，其中所述細(xì)胞程序死亡誘導(dǎo)劑選自線粒體膜透化劑，線粒體孔開放誘導(dǎo)劑，離子載體，半胱天冬酶9激活劑，半胱天冬酶3激活劑和類維生素A類，其中所腿少一種細(xì)胞程序死亡誘導(dǎo)劑可逆地結(jié)^P外源性的AFP,且外源性的AFP特異地結(jié)合于至少一種AFP受體。9.一種包含非共價(jià)復(fù)合體的組合物在制備用于向哺乳動(dòng)物中在細(xì)胞表面具有至少一種AFP受體的癌細(xì)胞靶向輸送至少一種細(xì)胞程序死亡誘導(dǎo)劑的藥物中的用途，其中非共價(jià)復(fù)合體的成分如下夕卜源性的甲胎蛋白(AFP);禾口至少一種細(xì)胞程序死亡誘導(dǎo)劑，其選自線粒體膜透化劑，線粒體孔開放誘導(dǎo)劑，離子載體，半胱天冬酶9'撒活劑，半胱天冬酶3激活齊lj和類維生素A類，其中所述至少一種細(xì)胞H^死亡誘導(dǎo)齊阿逆地結(jié)^F夕卜源性的ARP，_a^^外源性的AFP特異地結(jié)合于至少一種AFP受體。10.—種包含非共價(jià)復(fù)合體的組合物用于抑制哺乳動(dòng)物中癌細(xì)胞增殖的用途，其中所述非共價(jià)復(fù)合體的成分如下夕卜源性的甲胎蛋白(AFP);和至少一種細(xì)胞程序死亡誘導(dǎo)劑，其選自線粒體膜透化劑，線粒體孔開放誘導(dǎo)劑，離子載體，半胱天冬酶9激活劑，半胱天冬酶3激活齊訴嘍維生素A類，所述的癌細(xì)胞在細(xì)胞表面具有至少一種AFP受體，其中所述至少一種細(xì)胞禾，死亡誘導(dǎo)劑可逆地結(jié)合于外源性的AFP，且夕卜源性的AFP特異地結(jié)合于細(xì)胞表面上的至少一種AFP受體。11.一種包含非共價(jià)復(fù)合體的組合物用于治療難治性惡性腫瘤中多藥耐藥性的用途，其中所述非共價(jià)復(fù)合體的成分如下夕卜源性的甲胎蛋白(AFP);和至少一種細(xì)胞程序死亡誘導(dǎo)劑，其選自線粒體膜透化劑，線粒體L開放誘導(dǎo)劑，離子載體，半胱天冬酶9激活劑，半胱天冬酶3激活劑和類維生素A類，所^t治性惡性腫瘤包含在細(xì)胞表面具有至少一禾中AFP受體的癌細(xì)胞，其中所述至少一種細(xì)胞程序死亡誘導(dǎo)劑可逆地結(jié)合于外源性的AFP，且外源性的AFP特異地結(jié)合于細(xì)胞表面上的至少一種AFP受體。12.—種用于抑制哺乳動(dòng)物中癌細(xì)胞增殖的方法，所述癌細(xì)胞在細(xì)胞表面具有至少一種AFP受體，其中所述方法包含向哺乳動(dòng)物給藥治療有效量的組合物，該組，包含非共價(jià)復(fù)合體，其成分如下-夕卜源性的AFP;禾口至少一種細(xì)胞程序死亡誘導(dǎo)劑，其選自線粒體膜透化劑,'線粒體孔開放誘導(dǎo)劑，離子載體，半胱天冬酶9激活劑，半胱天冬酶3激活齊訴卩類維生素A類，其中所述至少一種細(xì)胞程序死亡誘導(dǎo)劑可逆地結(jié)#外源性的AFP,且外源性的AFP特異地結(jié)合于細(xì)胞表面上的至少一種AFP受體。13.—種用于治療難治性惡性腫瘤中多藥耐藥性的方法，所述難治性惡性腫瘤包含在細(xì)胞表面具有至少一種AFP受體的癌細(xì)胞，所述方法包含向哺乳動(dòng)物給藥治療有效量的組合物，該組合物包含非共價(jià)復(fù)合體，其成分如下夕卜源性的AFP;禾口至少一種細(xì)胞程序死亡誘導(dǎo)劑，其選自線粒體膜透化劑，線粒體孔開放誘導(dǎo)劑，離子載體，半胱天冬酶9、^T活劑，半胱天冬酶3^T活劑和類維生素A類,其中所述至少一種細(xì)胞禾M^死亡誘導(dǎo)劑可逆地結(jié)^T夕卜源性的AFP，且外源性的AFP特異地結(jié)合于細(xì)胞表面上的至少一種AFP受體。14.一種使用丁醇從原料中提取豬AFP的方法，所述方法包含連續(xù)的步驟:(a)從杯孕約3至約14周的豬胚胎收集血液和羊水；(b)分離(a)中收集的血液和羊水為上清液和沉淀；(c)收集從(b)中獲得的上清液；(d)濃縮從(C)中獲得的上清液以形成、^fl液；(e)加入丁醇到(d)中的濃縮液，1S溶液中的丁醇終濃度為約5%至約10%;(f)攪拌從(e)中獲得的丁醇溶液；(g)使從(f)中獲得的丁醇溶液分離為上面的非7ja目和下面的水相；和(h)收集從(g)中獲得的非水相以產(chǎn)生包含非結(jié)合的豬AFP的終溶液。全文摘要本發(fā)明涉及包含甲胎蛋白(AFP)的新的組合物和用于預(yù)防、治療或抑制表達(dá)甲胎蛋白受體(AFPR)的有或無(wú)多藥抗藥性的惡性腫瘤的方法。提供了包含外源性的AFP，和至少一種選自線粒體膜透化劑，線粒體孔開放誘導(dǎo)劑，離子載體，半胱天冬酶9激活劑，半胱天冬酶3激活劑和類維生素A類的細(xì)胞程序死亡誘導(dǎo)劑的非共價(jià)復(fù)合體的組合物，其中所述至少一種細(xì)胞程序死亡誘導(dǎo)劑可逆地結(jié)合于外源性的AFP。本發(fā)明也提供了用于丁醇提取從來(lái)源于早期胚胎發(fā)生過程中提取的血液和羊水中獲得的豬甲胎蛋白的方法。文檔編號(hào)A61K38/00GK101437531SQ200680051067公開日2009年5月20日申請(qǐng)日期2006年11月15日優(yōu)先權(quán)日2005年11月15日發(fā)明者V·帕克申請(qǐng)人:康斯塔布制藥公司