專利名稱：用于分化干細(xì)胞的方法及其在牙病治療中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于產(chǎn)生分化的哺乳動物細(xì)胞的新概念和方法，所述 分化的哺乳動物細(xì)胞可被植入以修復(fù)牙周炎和其他牙病，其中這些細(xì)
胞具有與分化的牙周韌帶干細(xì)胞(例如，PDLC)或牙周韌帶細(xì)胞(PDL) 相同的特征和行為。PDL將根部牙骨質(zhì)與牙槽骨相連接，并且對于牙 周傷口愈合是重要的。
背景技術(shù)：
骨髓被認(rèn)為是"干細(xì)胞儲備"的主庫(predominant pool)，其 不僅包含造血干細(xì)胞(HSC)而且還包含內(nèi)皮和間充質(zhì)干細(xì)胞(ESC， MSC )。本發(fā)明包括的一個目標(biāo)領(lǐng)域是獲得待分化成合適的自體細(xì)胞和 /或合適的同種異體細(xì)胞的合適細(xì)胞材料，所述細(xì)胞已轉(zhuǎn)化成能夠被移 植入受者中而不被排斥或引起移植物抗宿主反應(yīng)的細(xì)胞類型。
例如可以想象的是，除了別的可通過例如轉(zhuǎn)分化(例如通過共培 養(yǎng)，例如將細(xì)胞與牙周韌帶組織或來源于牙周韌帶組織的因子共培養(yǎng)) 而轉(zhuǎn)化的細(xì)胞類型外，尤其是任何間充質(zhì)成骨細(xì)胞或者甚至成骨細(xì)胞 或成纖維細(xì)胞鐠系的前體細(xì)胞和祖細(xì)胞可用于產(chǎn)生PDL細(xì)胞。
先前已公開了造血細(xì)胞的方法、組合物和用途。造血細(xì)胞是當(dāng)與 成骨細(xì)胞共培養(yǎng)時可分化成成熟血細(xì)胞的細(xì)胞。特別地，通過將細(xì)胞 與成骨細(xì)胞共培養(yǎng)來繁殖造血細(xì)胞并保持其未成熟形態(tài)的方法公開于 美國專利#5733541。
成骨細(xì)胞提供了繁殖造血細(xì)胞并保持其未成熟形態(tài)的細(xì)胞因子和 /或^:環(huán)境。造血細(xì)胞可用于治疔某些血液相關(guān)病癥和可用于治療需要造血細(xì)胞的患者。
本發(fā)明的一個目的實際上不是保持造血細(xì)胞的未成熟形態(tài)，而是 例如通過暴露于或與牙周韌帶組織或來自牙周韌帶組織的因子共培養(yǎng) 來轉(zhuǎn)分化間充質(zhì)干細(xì)胞(例如來自胯帶或臍帶血的間充質(zhì)干細(xì)胞)、 成骨細(xì)胞和相似鐠系的細(xì)胞，以獲得具有例如下列特征的間充質(zhì)干細(xì)
胞顯示出骨橋蛋白和骨鈣蛋白的表達(dá)增加，同時顯示出骨唾液蛋白 (BSP)的表達(dá)減少，從而導(dǎo)致與PDL細(xì)胞類似或相似的細(xì)胞群。這在
非常罕見的。
^雜4脊扭勿應(yīng)時^射
在將單種多能成體祖細(xì)胞注射入早期胚泡后，發(fā)現(xiàn)所述細(xì)胞貢獻(xiàn) 了來自所有3個胚層的大部分體細(xì)胞類型。此外，骨髄來源的造血前 體細(xì)胞似乎存在于非造血組織中，例如由McKinney-Freeman等人 (McKinney-Freeman SL， Jackson, KA,等人，PNAS USA (2002) 99: 1341 )描述的肌肉組織。
已在基質(zhì)層(stromal layer)內(nèi)觀察到成骨細(xì)胞樣細(xì)胞，所述細(xì) 胞與基質(zhì)細(xì)胞系共有幾種表型特征(Benayahu D等人，Calcif Tissue Int. (1992)， 51: 195-201; Benayahu D等人，Calcif Tissue Int. (1991)， 49:202-207; Mathieu E等人，Calcif Tissue Int. (1992)， 50: 362-371 )。例如，鼠類骨髓基質(zhì)細(xì)胞系BMS2共有許多成骨細(xì)胞標(biāo) 記物，包括高堿性磷酸酶、膠原(I )和骨橋蛋白，以及骨唾液蛋白(BSP) 的增加，這不是牙周韌帶干細(xì)胞或牙周韌帶細(xì)胞的特征。此外，在也 顯示出骨唾液蛋白(也稱為骨唾液蛋白II pr (BSP))的表達(dá)增加的 BMS2細(xì)胞(一種鼠類基質(zhì)細(xì)胞系)中也檢測到骨鈣蛋白(一種成骨細(xì) 胞特異性蛋白)的mRNA ( Dorheim MA等人，J Cell Physiol. (1993) 154: 317-328 );根據(jù)Dorheim等人，甚至前脂肪細(xì)胞和脂肪細(xì) 胞可展示出這些成骨細(xì)胞特征。
在使用幾種基質(zhì)細(xì)胞系的系列實驗中，Benayhu等人發(fā)現(xiàn)，被檢 查的所有細(xì)胞類型(MBA-1:成纖維細(xì)胞，MBA-2內(nèi)皮樣細(xì)胞，MBA-1'3纖維內(nèi)皮細(xì)胞(fibroendothelial ) , 13F1. 1克隆的前脂肪細(xì)胞， MBA-15成骨細(xì)胞)具有一些成骨細(xì)胞特征，但在表達(dá)的程度上不同 (Benayahu D等人，Calcif Tissue Int. (1992)， 51: 195-201; Benayahu D等人，Calcif Tissue Int. (1991)， 49:202-207 )。已 發(fā)現(xiàn)，重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2在W-20-17鼠類基質(zhì)細(xì)胞系中誘導(dǎo)成 骨細(xì)胞分化；異位骨髄移植實驗清楚地證明，新形成的骨髄基質(zhì)和骨 來源于供體，而血細(xì)胞是宿主來源的(Reddi AH， Coll Relat Res. (1981)1:209-226; Kataoka H， Urist MR, Clin Orthop Relat Res. (1993)， 286: 262-270 )。
骨祖細(xì)胞來源于骨髄這樣的觀察結(jié)果為造血祖細(xì)胞和成骨細(xì)胞之 間的功能關(guān)聯(lián)提供了進(jìn)一步的證據(jù)。幾位研究者已說明，原代和轉(zhuǎn)化 的骨髓基質(zhì)細(xì)胞可以獲得成骨細(xì)胞表型，因為在將這些細(xì)胞植入擴散 盒后在體內(nèi)觀察到骨形成(Grigoriadis等人J Cell Biol. (1988) 106: 2139-51 )。非粘著低密度骨髓細(xì)胞在無血清條件中的體外溫育也 可發(fā)育成成骨細(xì)胞樣細(xì)胞，這些細(xì)胞可礦化它們的細(xì)胞外基質(zhì)(Long 等人，1990;和Campbell等人，1987 )。
上述文獻(xiàn)基本上將成骨細(xì)胞描述為通過產(chǎn)生可能在造血譜系的特 定刺激方面有所幫助的細(xì)胞因子和其他因子來刺激細(xì)胞的來源。
然而，本發(fā)明的范圍是形成主要可用于修復(fù)牙疾病(例如牙周炎) 的細(xì)胞類型，例如PDL細(xì)胞或具有PDL特征的細(xì)胞，所述細(xì)胞可以為 同種異體來源的、成熟或未成熟的，但優(yōu)選在譜系中不比臍帶或臍帶 血的水平更低。事實上涉及可以例如通過共培養(yǎng)人牙周韌帶干細(xì)胞和 來源于臍帶或來源于骨髓的干細(xì)胞的組合來轉(zhuǎn)分化的任何間充質(zhì)細(xì) 胞。備選地，可從來自臼齒或來自智牙的牙周韌帶中分離和培養(yǎng)用于 用作PDL或PDLC這一目的的任何間充質(zhì)細(xì)胞或干細(xì)胞。
發(fā)明概述
在一個方面，本發(fā)明提供了一種方法，所述方法用于繁殖直接從牙齒收獲的PDL細(xì)胞以例如用于自體使用，或理想地繁殖間充質(zhì)細(xì)胞， 所述間充質(zhì)細(xì)胞當(dāng)植入口腔，更特別地植入牙周區(qū)域和更加特別地植 入牙齒區(qū)域以固定和/或修復(fù)牙齒以及牙齒的牙周區(qū)域時不被排斥，尤
PDL或PDLC的細(xì)胞。該方法可通過下列方式來起始將來源于牙周韌
共培養(yǎng):并i從某i蛋:質(zhì)的表達(dá)的觀:泉上看，導(dǎo)致產(chǎn)生具有與蛋白
質(zhì)的表達(dá)相關(guān)的能力的間充質(zhì)細(xì)胞，例如至少HLA-DR陽性(HLA-DR+)、 CD-34陰性(CD—34-) 、 Lin陽性(Lin + ) 、 Thy-l P日性(Thy-l+)、 Stro-l陽性(Stro-l +) 、 CD13陽性、CD44陽性、CD90陽性、CD73 陽性和還可能CD146/MUC 18陽性(CD146/MUC 18 +)的細(xì)胞。這些干
充質(zhì)干細(xì)胞或祖細(xì)胞而對于受者具有較弱的免疫原性。
本發(fā)明的公開內(nèi)容
本發(fā)明涉及用于獲得具有PDL細(xì)胞的特征的哺乳動物間充質(zhì)細(xì)胞 系的新概念和方法。獲得的細(xì)胞是并且將持續(xù)是HLA-DR陽性 (HLA-DR+) 、 CD-34陰小生(CD-34-) 、 Lin—1陽'l"生(Lin-l +) 、 Thy-l 陽性(Thy-l+) 、 STR0-1陽性(STRO-l+) 、 CD13陽性、CD44陽性、 C謂陽性、CD73陽性和還可能CD146/MUC 18陽性(CD146/MUC 18 +) 的。這些細(xì)胞優(yōu)選是牙周韌帶細(xì)胞，或者未成熟的牙周韌帶干細(xì)胞類 型或優(yōu)選人牙周韌帶干細(xì)胞(hPDLC )類型，或者來自臍帶血或優(yōu)選來 自人臍帶血的未成熟基質(zhì)或間充質(zhì)細(xì)胞，所述細(xì)胞僻如通過共培養(yǎng)， 例如與牙周韌帶組織或來自牙周韌帶組織的因子一起共培養(yǎng)而獲得。
細(xì)胞也可以具有生骨性細(xì)胞來源，其當(dāng)暴露于或在牙周韌帶組織或來 自該組織的因子中培養(yǎng)時，顯示出PDL細(xì)胞的特征。在理論上，牙周 韌帶細(xì)胞和/或牙周韌帶干細(xì)胞的特征在于骨鈣蛋白和骨橋蛋白的表 達(dá)，和最可能在于骨唾液蛋白的表達(dá)減少或甚至缺乏表達(dá)，而這種表達(dá)在成骨細(xì)胞培養(yǎng)物和成軟骨細(xì)胞培養(yǎng)物中通常觀察到。
具有PDL特征的細(xì)胞適合用于修復(fù)或治療牙病癥，特別是牙周炎。 為了獲得可預(yù)測的牙周再生，PDL細(xì)胞的選擇性粘著和增殖是必 需的。這些類型的細(xì)胞可修復(fù)受損的牙周韌帶(例如，牙周炎和相似 的病癥)以及同時例如產(chǎn)生將纖維組織與骨連接起來的牙骨質(zhì)，并且 可以能夠治療牙周缺損，從而重建由于牙周炎而處于喪失危險中的牙 齒粘著。
根據(jù)本發(fā)明，這些PDL細(xì)胞(其中首先是特化的細(xì)胞)是可用于 上述修復(fù)(例如牙周炎等的修復(fù))的細(xì)胞培養(yǎng)物的起始材料。當(dāng)然， 如果這些細(xì)胞是自體的，則是優(yōu)選的，這意味著其是在將牙齒撥出的 同時從牙齒例如智齒收獲的，因而可在撥出之時立即收獲細(xì)胞，或者 可將拔出的牙齒在運輸培養(yǎng)液中在例如24小時內(nèi)送至實驗室，然后可 收獲PDL細(xì)胞，并且立即進(jìn)行培養(yǎng)或在液氮罐中深度冷凍以待以后使 用。
其他細(xì)胞也可能用于相同的目的，例如從患者的頜骨或其他骨結(jié) 構(gòu)收獲的自體或同種異體的成骨細(xì)胞。這些間充質(zhì)前體細(xì)胞或祖細(xì)胞， 也可用于修復(fù)牙周炎等的目的?？蓙碓从谠醋阅殠Щ蚰殠а亩嗄荛g 充質(zhì)干細(xì)胞的另外一組細(xì)胞也可以作為自體細(xì)胞(取自貯存的臍帶血， 并后來在生命中用于修復(fù)在出生時提供了他/她的臍帶血的患者的牙 周炎)而得到?；蛘?，來自其他個體的臍帶的這些多能間充質(zhì)干細(xì)胞 可能在具有免疫原性方面顯示出較低的傾向，從而可用作"供體"細(xì) 胞以修復(fù)牙周炎等，當(dāng)使用此類細(xì)胞時，它們已經(jīng)歷共培養(yǎng)過程，其 中將細(xì)胞暴露于或與一種或多種牙周韌帶組織、來源于牙周韌帶組織 的牙周韌帶蛋白質(zhì)或因子一起共培養(yǎng)以獲得PDL特征。
將適合用作PDL細(xì)胞或PDLC的細(xì)胞與其他哺乳動物間充質(zhì)前體細(xì) 胞(例如，任何哺乳動物間充質(zhì)干細(xì)胞例如成體間充質(zhì)前體細(xì)胞)共 培養(yǎng)，在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。根據(jù)本發(fā)明，也可能將PDL細(xì)胞例如與 多能間充質(zhì)千細(xì)胞(例如來源于臍帶或臍帶血的此類千細(xì)胞)共培養(yǎng)， 這樣，可獲得適合用于修復(fù)牙周炎等的經(jīng)共培養(yǎng)的細(xì)胞。為了獲得牙周韌帶干細(xì)胞群，可將間充質(zhì)干細(xì)胞與牙周韌帶組織、 來自牙周韌帶組織的牙周韌帶蛋白質(zhì)或因子在牙周細(xì)胞含量存在或不 存在的情況下共培養(yǎng)，或者更確切地說可以通過首先在經(jīng)收獲以待加 入至培養(yǎng)基中的牙周韌帶組織中消除存在的活細(xì)胞，在所述培養(yǎng)基中
將會培養(yǎng)間充質(zhì)細(xì)胞以分化或轉(zhuǎn)分化成PDL細(xì)胞。預(yù)期培養(yǎng)可從將細(xì) 胞短時間暴露于牙周韌帶組織或蛋白質(zhì)，變化至將細(xì)胞培養(yǎng)物在至少 包含牙周韌帶組織、其牙周韌帶蛋白質(zhì)或因子的培養(yǎng)基中完全擴展并 持續(xù)數(shù)周直至獲得足夠量的細(xì)胞。這種細(xì)胞培養(yǎng)方法可用于來源于臍 帶和/或臍帶血的間充質(zhì)干細(xì)胞。因此，來自臍帶或來自臍帶血的間充 質(zhì)干細(xì)胞與牙周韌帶組織、來源于其的牙周韌帶蛋白質(zhì)和/或因子一起 可誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞以獲得牙周韌帶樣特征，從而可在用于修復(fù)和再 生牙周組織的臨床應(yīng)用中用作具有或不具有支架的細(xì)胞植入體。 -嘑#乙^#/《蘢{細(xì)應(yīng)
通過將這些細(xì)胞暴露于和/或與牙周韌帶組織或來源于牙周韌帶 的因子共培養(yǎng)可將PDL細(xì)胞以及任何上述組合的間充質(zhì)干細(xì)胞或前體 細(xì)胞分化成PDL或PDLC,所述牙周韌帶組織或來源于牙周韌帶的因子 可誘導(dǎo)前體細(xì)胞，或者阻止諸如PDL的細(xì)胞去分化。
因此，應(yīng)當(dāng)理解并且在本發(fā)明的范圍內(nèi)的是上述細(xì)胞類型在當(dāng) 暴露于牙周韌帶組織或來源于牙周韌帶的因子、與其共培養(yǎng)和/或由其 誘導(dǎo)時，可分化或轉(zhuǎn)分化成PDL或PDLC，或者如果它們一開始實際上 就是PDL時，這些細(xì)胞將不進(jìn)行去分化。當(dāng)在培養(yǎng)基中使用時，當(dāng)使 用該培養(yǎng)基共培養(yǎng)來自臍帶的間充質(zhì)干細(xì)胞時，相同的收獲的牙周韌 帶組織或來源于該組織的因子可導(dǎo)致產(chǎn)生PDL或具有與PDL相同能力 的細(xì)胞，從而使得能夠使用它們來治療牙周炎等。
通過使用上述方法，可使本發(fā)明者能夠培養(yǎng)成骨細(xì)胞或生骨性細(xì) 胞(osteogenic cells)的祖細(xì)胞(例如通過來自哺乳動物(例如來 自骨，尤其是從患者獲得的骨結(jié)構(gòu))的活檢組織的外植而獲得的)以 發(fā)展成PDL或具有PDL行為的細(xì)胞，以便后來在患者的生命中治療牙 周炎，這意味著當(dāng)人們無法獲得PDL的原代培養(yǎng)物時，可以以這種方式采用自體細(xì)胞植入方法。
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牙周韌帶組織、來源于牙周韌帶的牙周韌帶蛋白質(zhì)和/或因子的來 源可以是自體、同種異體或異種來源的(例如，撥出的或撕脫的豬牙 齒)。然而，預(yù)期來自牙周韌帶的細(xì)胞、牙周韌帶或因子的處理必須 在當(dāng)組織仍然具有活力并且沒有經(jīng)歷任何必需組分的分解時進(jìn)行收獲
和處理，所述必需組分是對于獲得和可能對于保持培養(yǎng)的細(xì)胞如PDL 或PDLC或者將其本身表現(xiàn)為PDL或PDLC的細(xì)胞所需要的。在"牙周 組織的收獲和保存"中描述了關(guān)于操作牙周組織的建議。
例如可從臼齒或從智齒收獲牙周韌帶，其在培養(yǎng)基中使用以在所 述培養(yǎng)的細(xì)胞中誘導(dǎo)"PDL效應(yīng)"。這樣，可將牙周韌帶與已整合入 在牙周韌帶中的PDL細(xì)胞一起收集，或者牙周韌帶組織被除盡了這些 細(xì)胞，并且由牙周韌帶組織組成，或甚至為來源于牙周韌帶組織的因 子，以便將來用于PDL細(xì)胞培養(yǎng)或用于嘗試將上述的其他間充質(zhì)細(xì)胞 轉(zhuǎn)分化成PDL。
根據(jù)本發(fā)明，所述"牙周韌帶組織"可定義為加入至PDL細(xì)胞培 養(yǎng)物或間充質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物(希望被用作PDL細(xì)胞)中的誘導(dǎo)性混合物。 可將其進(jìn)行深度冷凍(例如在液氮罐中)貯存，或進(jìn)行使用，在使用 時，可將其直接與合適的生長介質(zhì)(培養(yǎng)基)混合在一起，在所述生 長介質(zhì)中，培養(yǎng)細(xì)胞以防止PDL細(xì)胞去分化成其他非PDL細(xì)胞，以及 分化或轉(zhuǎn)分化其他所選擇的細(xì)胞從而變成PDL或PDLC或者與PDL或 PDLC相似。因此，包含牙周韌帶組織或來自牙周韌帶的因子的所述培 養(yǎng)基組合物可用作生長培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基可保持PDL細(xì)胞，從而避免 去分化或細(xì)胞"漂移(drifting)"。
如先前所描述的，也可收獲、表征和匯集該牙周韌帶組織(例如 被除盡了細(xì)胞)，以便與培養(yǎng)基一起用于培養(yǎng)間充質(zhì)細(xì)胞以誘導(dǎo)PDL 細(xì)胞特征，從而產(chǎn)生可表征為牙周韌帶細(xì)胞或所述類型的前體細(xì)胞的 所述細(xì)胞群。例如通過借助于牙周韌帶組織的誘導(dǎo)用途從間充質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行分化而獲得的PDL細(xì)胞特征可通過顯示出下列狀態(tài)來證明所述 PDL或PDL樣細(xì)胞將顯示出骨橋蛋白和骨鉀蛋白的表達(dá)增加以及骨唾 液蛋白(也稱為骨唾液蛋白II)的表達(dá)減少(減少的BSP表達(dá))。 f^iff織的僅^和保存
為了以對于誘導(dǎo)、轉(zhuǎn)分化或轉(zhuǎn)化間充質(zhì)細(xì)胞以產(chǎn)生牙周韌帶細(xì)胞 或行為與牙周韌帶細(xì)胞類似的細(xì)胞來說所需要的量使用牙周組織，可 能必需準(zhǔn)備后勤系統(tǒng)(logistic system)以使撥出的牙齒(例如，從 各種牙科診所收集的撥出的智齒)的細(xì)胞保持存活以及阻止來自撥出 的牙齒的牙周組織分解，這很可能意味著使撥出的牙齒保持存活并且 保持在無菌條件下以防止微生物污染(可以通過使用盡可能無菌的方 法和加入足夠量的在運輸介質(zhì)或用于貯存的培養(yǎng)基中存在的抗生素和 抗真菌劑來使微生物污染保持在最低限度)。Sigalas等人最近已測 試了使撕脫的牙齒的細(xì)胞保持存活的方法。已檢查了作為用于撕脫的 牙齒的可能貯存培養(yǎng)基的許多溶液。Sigalas等人最近報導(dǎo)，在室溫 下和在水上將人牙周韌帶(PDL)細(xì)胞暴露于培養(yǎng)基、牛奶、Hanks平 衡鹽溶液(HBSS) 、 SoftWear、 Opt i Free和Solo Care接觸鏡溶液、 Gatorade和自來水1小時。在暴露后即刻(0小時)以及在第24和第 48小時使用臺盼藍(lán)排除技術(shù)計數(shù)活細(xì)胞的數(shù)目，在處理后測試細(xì)胞的 增殖能力(Sigalas E， Regan JD等人Dent. Traumatol. (2004) 20:21-28 )。本研究顯示，發(fā)現(xiàn)Hanks平衡鹽溶液HBSS對于撕脫的牙 齒來說是最佳的貯存介質(zhì)。可以想象許多其他類型的培養(yǎng)基，其加入 或不加入從一始就存在和最可能包含血清蛋白的牙周韌帶組織?？蓪?牙齒、牙周韌帶相關(guān)細(xì)胞或牙周韌帶組織在液氮罐中深度冷凍。
用于確定細(xì)胞未分化成PDL或PDL細(xì)胞已去分化或飄移的方法表 明骨唾液蛋白(也稱為骨唾液蛋白II或BSP)將增加，從而實際上證 明經(jīng)培養(yǎng)的細(xì)胞事實上是成骨細(xì)胞而肯定不是PDL細(xì)胞。實際上，當(dāng) 骨唾液蛋白II或BSP可以被鑒定(或顯示增加)時，可意識到該PDL 細(xì)胞培養(yǎng)物已變成了生骨性細(xì)胞(例如，成骨細(xì)胞和非PDL-或非PDLC-分化的間充質(zhì)細(xì)胞)(Fisher LW， McBride 0W，等人J. Biol.Chemistry (1990)， 265:2347-2351 )。由該基因編碼的BSP蛋白是 骨基質(zhì)的主要結(jié)構(gòu)蛋白。其在人骨中構(gòu)成了大約12%的非膠原性蛋白， 并由骨骼相關(guān)細(xì)胞類型(包括肥大軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞、骨細(xì)胞和破 骨細(xì)胞)合成。該蛋白質(zhì)通過其酸性氨基酸簇結(jié)合釣和羥磷灰石，并 且通過識別玻連蛋白受體的RGD序列來介導(dǎo)細(xì)胞附著。BSP基因也被 鑒定為基因ID: 3381，并且表達(dá)結(jié)合整聯(lián)蛋白的唾液蛋白(骨唾液蛋 白，也稱為骨唾液蛋白II，縮寫為IBSP)。我們先前通過Affymetrix Gene Chip分析已發(fā)現(xiàn)，在來自骨關(guān)節(jié)炎患者和非-O. A.患者的軟骨細(xì) 胞中也存在玻連蛋白受體的表達(dá)(自己的觀察)。然而，該表達(dá)至今 仍未在PDL或PDLC中測試到。
以下也在本領(lǐng)域的范圍內(nèi)被植入以用于牙周修復(fù)和/或牙修復(fù)的 細(xì)胞可以是自體間充質(zhì)干細(xì)胞、前體細(xì)胞或祖細(xì)胞(例如從牙周區(qū)域 或牙周韌帶中作為干細(xì)胞或前體細(xì)胞而收獲的)，或者甚至來源于頜 骨活檢組織的間充質(zhì)細(xì)胞在當(dāng)暴露于牙周韌帶組織時也可向PDL分 化。因此，在理論上和實際在實踐中，我們可使用外植體培養(yǎng)技術(shù)來 擴展間充質(zhì)細(xì)胞或者更確切地成骨細(xì)胞或其前體以產(chǎn)生PDL細(xì)胞。然 后，可將這些PDL細(xì)胞用于植入患者中，以修復(fù)牙周炎等。
可以期望這些細(xì)胞進(jìn)一步分化成哺乳動物間充質(zhì)細(xì)胞(這可能包 括在相當(dāng)復(fù)雜的過程中)，從而產(chǎn)生與哺乳動物間充質(zhì)細(xì)胞系相似的 細(xì)胞身份(cell identity )，這種身份可通過繼續(xù)地表現(xiàn)為至少HLA-DR 陽性(HLA-DR+) 、 CD-34陰性(CD-34-) 、 Lin-l陽性(Lin-l+)、 Thy-l陽性(Thy-l+)和Stro-l陽性(Stro-l+) 、 CD13陽性、CD44 陽性、CD90陽性、CD73陽性和可能地對于另一種蛋白質(zhì)CD146/MUC18 是陽性的，但對于CD31 (造血細(xì)胞標(biāo)記物)是陰性的來鑒定。
在本發(fā)明的范圍內(nèi)的是獲得一種或幾種哺乳動物細(xì)胞類型，所述 細(xì)胞類型可移植入哺乳動物(包括人)中而不引起移植的或植入的細(xì) 胞的排斥或者產(chǎn)生"移植物抗宿主"(GVH)排斥，既不發(fā)生細(xì)胞凋亡 也不誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，或當(dāng)被移植時，不會轉(zhuǎn)變成永生化細(xì)胞系。
當(dāng)使用胚胎間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行例如關(guān)節(jié)中的植入，以試圖發(fā)展用于軟骨或0. A.修復(fù)的方法時，此類使用胚胎間充質(zhì)干細(xì)胞的植入已顯 示，這些細(xì)胞可在實驗中在分化成混合的內(nèi)胚層-中胚層-外胚層細(xì)胞 期間保持轉(zhuǎn)化的功能，所述細(xì)胞在顯著量的SCID小鼠中具有表現(xiàn)為畸 胎瘤的永生化行為，其中所述胚胎干細(xì)胞實際上誘導(dǎo)了這些永生化的 畸胎瘤(Wakitani S， Takaoka K， Hat tori T， Miyazawa N， I籠aga T， Takeda S， Watanabe TK和Tanigami A， Rheumatology (2003)， 42: 162-165 )，這表明當(dāng)例如為了產(chǎn)生牙周韌帶細(xì)胞而使用成熟度更 低的細(xì)胞時，為了該目的可能更可取的是使用來自臍帶或來自臍帶血 的間充質(zhì)干細(xì)胞而不使用胚胎干細(xì)胞，因為此類轉(zhuǎn)分化可能實際上產(chǎn) 生腫瘤，例如畸胎瘤。
增加人臍帶血(UCB )在成體同種異體移植中的應(yīng)用的一個主要限 制因素是只可收集和輸注少量的祖細(xì)胞。UCB的離體擴展可能有助于 克服該限制。UCB細(xì)胞的培養(yǎng)是否也可導(dǎo)致污染性母細(xì)胞的共擴展， 從而改變導(dǎo)致細(xì)胞排斥出現(xiàn)率增加的移植物特征，這一點到目前為止 仍未明了 ，但當(dāng)使用來自臍帶血的間充質(zhì)干細(xì)胞時應(yīng)當(dāng)考慮這一點。
這可例如通過在包含干細(xì)胞因子(SCF) 、 flt-3L、 11-3、 IL-6、 EPO和G-CSF的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基中起始UCB單核細(xì)胞(MNC)的培養(yǎng)，通過 探測分離間充質(zhì)千細(xì)胞(例如UCB細(xì)胞)的方法來進(jìn)行研究。為了解 決污染性母細(xì)胞的問題，可同時進(jìn)行X和Y染色體的所謂分裂間期 FISH分析?？稍诘贠天和在培養(yǎng)期間的幾個時間點上就雌性(XX)細(xì) 胞來檢查雄性(XY)臍帶血樣品。
獲謬P見勿應(yīng)的才法
將哺乳動物細(xì)胞，例如哺乳動物間充質(zhì)細(xì)胞、同種異體哺乳動物 間充質(zhì)細(xì)胞(包括UC或UCB細(xì)胞)、自體哺乳動物間充質(zhì)細(xì)胞、自體 哺乳動物成骨細(xì)胞或成骨細(xì)胞的前體/祖細(xì)胞與一種或多種牙周韌帶 組織、來源于牙周韌帶組織的牙周韌帶蛋白質(zhì)或因子一起培養(yǎng)。使用 經(jīng)綴合的抗CD13、 CD44、 CD90、 CD73和CD31的單克隆抗體通過流式 細(xì)胞術(shù)檢查和分析這些細(xì)胞。標(biāo)記物例如CD13、 CD44、 CD90、 CD73 全都被認(rèn)為是間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)記物，而CD31是造血細(xì)胞標(biāo)記物。hPDLC被證明對于所有4種干細(xì)胞標(biāo)記物都是陽性的，而對于CD31是陰性的。 如果使用牙周韌帶組織，首先要使用例如本說明書的實施例l或 6中所描述的合適的培養(yǎng)基來培養(yǎng)該組織。在整個培養(yǎng)期期間定期例 如每1至5天，例如每3至4天更換生長培養(yǎng)基。在一段時間(通常 8至11天)后，細(xì)胞(hPDLC)從牙周韌帶中遷移出來，并且在當(dāng)達(dá) 到足夠的匯合時，例如使用酶處理(如胰蛋白酶/EDTA處理)來收獲 細(xì)胞。
在37'C和5% C02下，在合適的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)哺乳動物細(xì)胞和hPDLC 細(xì)胞并飼以生長培養(yǎng)基(例如DMEM/F12，其包含16Y。FCS、抗壞血酸、 慶大霉素和兩性霉素)。在整個培養(yǎng)期期間每3至4天更換生長培養(yǎng)基。
在8至11天后，細(xì)胞(稱為hPDLC)通常開始從牙周韌帶的小碎 片中遷移出來。當(dāng)培養(yǎng)達(dá)到70-80%的匯合(大約3周)時，使用胰蛋 白酶/EDTA處理來脫離細(xì)胞，并將其用于下面描述的實驗。
備選地，可在合適的培養(yǎng)皿中在包含F(xiàn)CS和其他上述成分的上述 DMEM/F12中培養(yǎng)哺乳動物細(xì)胞，在整個細(xì)胞培養(yǎng)期期間每3至4天更 換培養(yǎng)基，在11天或更長的時間后，可將此類因子例如牙周韌帶蛋白 質(zhì)作為誘導(dǎo)劑加入細(xì)胞中，其中人們試圖將這些細(xì)胞轉(zhuǎn)分化成PDL。
i束
當(dāng)在移植或植入期間允許它們粘附時，培養(yǎng)在各種生物可降解的 支架上的骨細(xì)胞或生骨性細(xì)胞可在支架和細(xì)胞之間產(chǎn)生相互作用。這 尤其可以通過使用各種生物可降解的聚合物例如PLGA支架來實現(xiàn)。
將可預(yù)期，可測試幾種類型的支架，并且所述支架可以能夠成功 地用于牙周韌帶細(xì)胞和/或牙周韌帶干細(xì)胞或間充質(zhì)干細(xì)胞，其已被誘 導(dǎo)以用作牙周韌帶組織。
可將待植入的細(xì)胞與支架例如羥基磷灰石載體一起植入，所述支 架可以增強牙周韌帶和甚至牙骨質(zhì)，以及產(chǎn)生插入牙骨質(zhì)和骨中并同 時使牙齒保持在原位的纖維結(jié)構(gòu)(例如與沙比纖維(Sharpey，s fiber ) 相似的纖維結(jié)構(gòu))。
移控的減控入的敘敏^于浴^,^^的^途使用分化的或轉(zhuǎn)分化的細(xì)胞的一個目的是發(fā)展出可用于例如治療 被損壞的牙周組織(其尤其是由于"牙周炎"而引起的)的細(xì)胞或組 織材料。稱為牙周炎的口腔病癥通常作為例如在齦線中由微生物(例 如，細(xì)菌或真菌)感染引起的感染而開始，該感染被診斷為齦炎或急 性齦炎。這種類型的感染最初似乎是無害的，但在一段時間內(nèi)該感染 可導(dǎo)致對于口腔來說必需的組織，特別是將牙齒與牙槽骨結(jié)合(與牙骨 質(zhì)一起)的牙周韌帶的壞死。該壞死尤其是由于組織破壞酶
(tissue-destructive enzyme )(例如膠原酶)的合成增加以及由破 骨細(xì)胞導(dǎo)致的骨組織腐蝕的激活而引起的。這些方法能夠破壞那些通 常使牙齒錨定在上頜和下頜的骨中的組織結(jié)構(gòu)(參見圖1)。
這些方法可在很大程度上將牙周炎的治療改變成細(xì)胞植入修復(fù) (可能與支架一起)。
牙根精確地安裝在健康牙周組織中的骨結(jié)構(gòu)(牙槽骨)中的"口 袋，，中(參見圖1)。牙齒通過牙周韌帶保持在原位。
在牙周炎期間，實際上是牙周韌帶受影響并最終導(dǎo)致牙齒松動， 如圖2中所顯示的。
因此，細(xì)胞治療基于例如細(xì)胞(例如PDL和/PDLC)的離體細(xì)胞培 養(yǎng)，所述細(xì)胞可以以各種不同的方式例如如上所述通過暴露于或與牙 周韌帶或其衍生物共培養(yǎng)而獲得，或者通過將間充質(zhì)干細(xì)胞群(例如 祖細(xì)胞或前體細(xì)胞)與骨細(xì)胞合并來產(chǎn)生，并且可以是其他類型的間 充質(zhì)細(xì)胞如例如也可以與間充質(zhì)干細(xì)胞(例如來自間充質(zhì)多能干細(xì)胞 (例如來源于來自臍帶或來自臍帶血的細(xì)胞))相合并的PDL和/或 PDLC，所述間充質(zhì)細(xì)胞可以是具有較小的產(chǎn)生反應(yīng)例如細(xì)胞排斥的傾 向的同種異體細(xì)胞，或可以是自體來源的，從而不顯示排斥的跡象。 自體間充質(zhì)細(xì)胞可以是生骨性細(xì)胞來源的或甚至成纖維細(xì)胞來源的， 或者甚至為可從分化性間充質(zhì)細(xì)胞獲得的細(xì)胞類型中的任一類型。
也在本發(fā)明的范圍內(nèi)的是將待植入的細(xì)胞與合適的支架相組合, 從而可以塑造希望用于特&的應(yīng)用區(qū)域的產(chǎn)品的形狀并使之與所述區(qū) 域適配，以及甚至覆蓋移植的細(xì)胞以保持它們的功能，保護(hù)它們免受
15感染和甚至限制細(xì)胞生長入口腔內(nèi)的不希望的區(qū)域中。


圖1.位于其齒窩中的牙齒的圖。
圖2.牙周炎，牙齦的慢性感染，其特征在于牙齒和頜骨之間的 附著的喪失始于稱為齦炎的更溫和的形式(參見"1")。
圖3.顯示了 hPDLC的亞匯合培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞達(dá)到70%匯合時，用胰 蛋白酶處理它們。
圖4.在Beckman Coulter Epics XL流式細(xì)胞儀上分析樣品。通 過前向和側(cè)向散射門控從分析中排除死細(xì)胞和碎片。
圖5.使用特定的染色方案就堿性磷酸酶活性對細(xì)胞進(jìn)行染色和 研究，并且成骨分化顯示于該圖中。
在下列非限定性實施例中舉例說明本發(fā)明。
實施例1 hPDLC培養(yǎng)
將人笫三磨牙置于皮氏培養(yǎng)皿中，將2ml生長培養(yǎng)基(包含16% FCS、慶大霉素、抗壞血酸和兩性霉素的DMEM/F12)施加至所述磨牙。
用無菌解剖刀輕輕地從牙根表面分離出牙周韌帶，并將組織轉(zhuǎn)移 至新的皮氏培養(yǎng)皿中。
將2ml生長培養(yǎng)基施加至所述牙周韌帶組織，并用無菌解剖刀產(chǎn) 生小的外植體。
將來自牙周韌帶組織的外植體轉(zhuǎn)移至包含生長培養(yǎng)基的75 cm2培 養(yǎng)瓶中，并在37。C下在C02培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。分離在來自原代細(xì)胞 培養(yǎng)物的集落形成單位中的由外植體產(chǎn)生的細(xì)胞培養(yǎng)物。實施例2
表面標(biāo)記物的表達(dá)
使用經(jīng)綴合的抗CD13、 CD44、 CD90、 CD73和CD31單克隆抗體通 過流式細(xì)胞術(shù)來分析來自原代培養(yǎng)物(Ef。)(定義為還未傳代的主要 從外植體長出的細(xì)胞的初始CFU)的hPDLC。
CD13、 CD44、 CD90、 CD73全都被認(rèn)為是間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)記物，而 CD31是造血細(xì)胞標(biāo)記物。
hPDLC被證明對于所有4種干細(xì)胞標(biāo)記物都是陽性的，而對于CD31 是陰性的。
這表明，hPDLC群體由間充質(zhì)祖細(xì)胞組成。 實施例3
成骨分化(基因表達(dá))
將hPDLC接種在6孔板中，并通過將培養(yǎng)基從正常生長培養(yǎng)基改 變成成骨培養(yǎng)基(包含10%FCS、抗壞血酸、l(TM地塞米松、8mMp-磷酸甘油的DMEM/F12)而誘導(dǎo)其沿著成骨途徑分化。
作為對照，將hPDLC培養(yǎng)在包含10% FCS的正常生長培養(yǎng)基中。
在培養(yǎng)14天后，在PBS中洗滌hPDLC，并從經(jīng)誘導(dǎo)的培養(yǎng)物和對 照培養(yǎng)物中分離RNA。
通過使用RT-PCR，評估堿性磷酸酶(ALP) 、 I型膠原(Coll )和 骨鈣蛋白(OC)的表達(dá)。
實施例4
成骨分化(組織化學(xué)分析)
將hPDLC接種在6孔板中，并通過將培養(yǎng)基從正常生長培養(yǎng)基改變成成骨培養(yǎng)基(包含10% FCS、抗壞血酸、l(T M地塞米松、8 mM -磷酸甘油的DMEM/F12)而誘導(dǎo)其沿著成骨途徑分化。作為對照，將 hPDLC培養(yǎng)在包含10% FCS的正常生長培養(yǎng)基中。
在培養(yǎng)14天后，在PBS中洗滌hPDLC—次。然后，就ALP活性或
染色)。 '-、'。 、" '；
對于經(jīng)誘導(dǎo)的培養(yǎng)物，證明了 ALP活性增加和鈣沉積增加，這支 持了基因表達(dá)的結(jié)果。
所有三個標(biāo)記物在經(jīng)誘導(dǎo)的培養(yǎng)物中上調(diào)；這證明hPDLC能夠沿 著成骨途徑分化，表明該細(xì)胞群由未成熟間充質(zhì)干細(xì)胞組成。
實施例5 hPDLC的冷凍
用胰蛋白酶處理hPDLC，并通過70 iam無菌濾器進(jìn)行過濾，之后 進(jìn)行離心。將粒狀沉淀重懸浮于冷凍培養(yǎng)基(FCS + 10% DMSO)中， 然后將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至冷凍管。
開始進(jìn)行漸進(jìn)的冷凍過程，開始時于4'C進(jìn)行1小時，-20X:下進(jìn) 行4小時，-80C下過夜，最后進(jìn)入液體N2。
實施例6
在從3個個體撥出后立即收集正常人第三磨牙。輕輕地將牙周韌 帶從牙根表面分離，然后將它們切碎成小塊。然后將它們轉(zhuǎn)移至T-75 培養(yǎng)瓶內(nèi)，并用生長培養(yǎng)基(DMEM/F12,包含16% FCS、抗壞血酸、 慶大霉素和兩性霉素)在37t:和5%002下進(jìn)行培養(yǎng)。在整個培養(yǎng)過程 中每3至4天更換生長培養(yǎng)基。
在8至11天后，細(xì)胞(稱為hPDLC)開始從牙周韌帶的小碎片中 遷移出來。當(dāng)培養(yǎng)物達(dá)到70-80%匯合(大約3周)時，使用胰蛋白酶/EDTA處理來脫離細(xì)胞，并將其用于下面描述的實驗。 hPDLC的亞匯合培養(yǎng)顯示于圖3中。 流式細(xì)胞術(shù)分析
為了研究hPDLC的干細(xì)胞性質(zhì)進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析。
將hPDLC的單細(xì)胞懸浮液在室溫下與綴合有FITC的抗CD73、CD90 (已知為間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)記物)單克隆抗體一起溫育。在溫育后，在 Beckman Coulter Epics XL流式細(xì)胞儀上分析樣品。通過前向和側(cè)向 散射門控從分析中排除死細(xì)胞和碎片。
結(jié)果顯示于圖4中。
成骨分化
以0. 5xl(r個細(xì)胞/cW接種細(xì)胞，并在生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜。通 過將細(xì)胞從生長培養(yǎng)基轉(zhuǎn)換至骨誘導(dǎo)性培養(yǎng)基(OIM)(由DMBMF12 組成，其中含10。/。FBS、 85 ng/mL L-抗壞血酸2-磷酸、l(TM地塞米 松和8 mM (3-磷酸甘油)中來誘導(dǎo)成骨分化3周。在包含10% FBS的 SCM中培養(yǎng)無分化刺激物的對照培養(yǎng)物。每周更換培養(yǎng)基2次。
可通過VonKossa方法來檢測細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的鈣化，在所述 方法中，將磷酸鈣沉積物染成棕色至黑色。以0. Sxl(T個細(xì)胞/ci^的密 度將細(xì)胞接種在6孔板中，并在0IM中培養(yǎng)21天。此外，使用特定的 染色方案來研究堿性磷酸酶活性。
成骨分化的結(jié)果顯示于圖5中。
基于上述發(fā)現(xiàn)我們得出結(jié)論培養(yǎng)在上述生長培養(yǎng)基中的hPDLC 能夠沿著成骨途徑分化。
此外，該細(xì)胞群展示出對于間充質(zhì)千細(xì)胞來說特征性的兩種表面 標(biāo)記物。本發(fā)明的特定實施方案
1. 用于繁殖哺乳動物間充質(zhì)細(xì)胞的方法，所述細(xì)胞已暴露于和/ 或與牙周韌帶組織、來源于牙周韌帶組織的牙周韌帶蛋白質(zhì)或因子共 培養(yǎng)，并被這些因子所誘導(dǎo)以
a. 獲得牙周特征，
b. 顯示出增加的骨橋蛋白和骨鈣蛋白以及減少的骨唾液蛋白(也 稱為骨唾液蛋白II或BSP),
c. 能夠被植入以修復(fù)和/或再生牙周組織，
d. 能夠修復(fù)病癥例如牙周炎，也稱為牙周病，
e. 被宿主接受而無顯著的免疫反應(yīng)或細(xì)胞排斥。
2. 用于繁殖同種異體哺乳動物間充質(zhì)細(xì)胞的方法，所述細(xì)胞來源 于臍帶和/或臍帶血，并且已暴露于或與牙周韌帶組織、來源于牙周韌 帶組織的牙周韌帶蛋白質(zhì)或因子共培養(yǎng)，并被這些因子所誘導(dǎo)以
a. 獲得牙周特征，
b. 顯示出增加的骨橋蛋白和骨鈣蛋白以及減少的骨唾液蛋白，
c. 能夠被植入以修復(fù)和/或再生牙周組織，
d. 能夠修復(fù)病癥例如牙周炎，也稱為牙周病，
e. 被宿主接受而無顯著的免疫反應(yīng)或細(xì)胞排斥。
3. 用于繁殖自體間充質(zhì)細(xì)胞的方法，所述細(xì)胞已暴露于或與牙周 韌帶組織、來源于牙周韌帶組織的牙周韌帶蛋白質(zhì)或因子共培養(yǎng)，并 被這些因子所誘導(dǎo)以
a. 獲得牙周特征，
b. 顯示出增加的骨橋蛋白和骨鈣蛋白以及減少的骨唾液蛋白，
c. 能夠被植入以修復(fù)和/或再生牙周組織，
d. 能夠修復(fù)病癥例如牙周炎，也稱為牙周病，
e. 被宿主接受而無顯著的免疫反應(yīng)或細(xì)胞排斥。
4. 用于繁殖自體成骨細(xì)胞或前體/祖細(xì)胞的方法，所述細(xì)胞已暴 露于或與牙周韌帶組織、來源于牙周韌帶組織的牙周韌帶蛋白質(zhì)或因子共培養(yǎng)，并被這些因子所誘導(dǎo)以
a. 獲得牙周特征，
b. 顯示出增加的骨橋蛋白和骨鉀蛋白以及減少的骨唾液蛋白，
c. 能夠被植入以修復(fù)和/或再生牙周組織，
d. 能夠修復(fù)病癥例如牙周炎，也稱為牙周病，
e. 被宿主接受而無顯著的免疫反應(yīng)或細(xì)胞排斥。
5. 用于繁殖第l至4項中所述的細(xì)胞的方法，所述細(xì)胞被直接向 下注射至剩余的牙周韌帶。
6. 用于繁殖自體間充質(zhì)細(xì)胞的方法，所迷細(xì)胞被直接原位注射入 牙周韌帶中，從而能夠原位轉(zhuǎn)分化。
7. 用于繁殖哺乳動物細(xì)胞并保持其未成熟形態(tài)的方法，所述未成 熟形態(tài)被定義為HLA-DR陽性(HLA-DR+) 、 Lin陽性(Lin + ) 、 Thy-l 陽性(Thy-l+) 、 Stro-l陽性(Stro-l +) 、 CD-13陽性、CD-44陽 性、CD-90陽性、CD-73陽性和可能地CD146/MUC 18陽性,應(yīng)當(dāng)是
a. 能夠與來自臍帶的哺乳動物間充質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng)，
b. 能夠與來自臍帶血的哺乳動物間充質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng)，
c. 能夠被植入以修復(fù)和/或再生牙周組織，
d. 能夠修復(fù)病癥例如牙周炎，也稱為牙周病，
e. 被宿主接受而無顯著的免疫反應(yīng)或細(xì)胞排斥。
8. 用于繁殖哺乳動物細(xì)胞并保持其未成熟形態(tài)的方法，所述未成 熟形態(tài)被定義為HLA-DR陽性(HLA-DR+) 、 CD-34陰性(CD-34 -)、 Lin陽性(Lin + ) 、 Thy-l陽性(Thy-l+) 、 Stro-l陽性(Stro-l +)、 CD-13陽性、CD-44陽性、CD-90陽性、CD-73陽性和可能地CD146/MUC 18 P曰性，應(yīng)當(dāng)是
a. 能夠與來自臍帶的哺乳動物間充質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng)，
b. 能夠與來自臍帶血的哺乳動物間充質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng)， C- 食巨 夠被植入以修復(fù)和/或再生牙周組織，
d. 能夠修復(fù)病癥例如牙周炎，也稱為牙周病，
e. 被宿主接受而無顯著的免疫反應(yīng)或細(xì)胞排斥。9. 能夠與來源于來自自體或同種異體供體的骨髓細(xì)胞或其集落 的哺乳動物細(xì)胞共培養(yǎng)，暴露于或與牙周韌帶組織、來源于牙周韌帶 組織的牙周韌帶蛋白質(zhì)或因子共培養(yǎng)，并被這些因子所誘導(dǎo)以
a. 獲得牙周特征，
b. 顯示出增加的骨橋蛋白和骨釣蛋白以及減少的骨唾液蛋白，
c. 能夠被植入以修復(fù)和/或再生牙周組織，
d. 能夠被植入以修復(fù)和/或再生牙周組織，
e. 能夠修復(fù)病癥例如牙周炎，也稱為牙周病，
f. 被宿主接受而無顯著的免疫反應(yīng)或細(xì)胞排斥。
10. 用于繁殖哺乳動物細(xì)胞并保持其未成熟形態(tài)的方法，所述未 成熟形態(tài)被定義為HLA-DR陽性(HLA-DR+)、 Lin P日性(Lin + )、 Thy-l 陽性(Thy-l+) 、 Stro-l陽性(Stro-l +) 、 CD-13陽性、CD-44陽 性、CD-90陽性、CD-73陽性和可能地CD146/MUC 18陽性，所述方法 包括鑒定哺乳動物牙周韌帶細(xì)胞的部分，可以是
a. 能夠與來自臍帶的哺乳動物間充質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng)，
b. 能夠與來自臍帶血的哺乳動物間充質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng)，
c. 能夠被植入以修復(fù)和/或再生牙周組織，
d. 能夠修復(fù)病癥例如牙周炎，也稱為牙周病，
e. 被宿主接受而無顯著的免疫反應(yīng)或細(xì)胞排斥。
11. 所得到的如第1和2項中所述進(jìn)行處理的群體，被定義為 HLA-DR陽性(HLA-DR+) 、 Lin陽性(Lin + ) 、 Thy-l陽性(Thy-l+) 和Stro-l陽性(Stro-l +) 、 CD-13陽性、CD-44陽性、CD-90陽性、 CD-73陽性和可能地CD146/MUC 18陽性，應(yīng)當(dāng)可被移植入哺乳動物中
a. 進(jìn)入它們的口腔而不被排斥，
b. 進(jìn)入牙周區(qū)域而不被排斥，
c. 進(jìn)入牙缺損而不被排斥。
12. 所得到的如笫1和2項中所述進(jìn)行處理的群體，被定義為 HLA-DRP曰性(HLA-DR+) 、 Lin陽性(Lin + ) 、 Thy-l陽性(Thy-l+) 和Stro-l陽性(Stro-l +) 、 CD-13陽性、CD—44陽性、CD-90陽性、CD-73陽性和可能地CD146/MUC 18陽性，應(yīng)當(dāng)可被移植入哺乳動物中
a. 進(jìn)入它們的口腔而不被排斥，
b. 進(jìn)入牙周區(qū)域而不被排斥，
c. 進(jìn)入牙缺損而不被排斥。
13. 使用細(xì)胞和支架的組合來植入第l至ll項中所描述的細(xì)胞的 方法。
14. 用于繁殖哺乳動物自體牙周韌帶陽性細(xì)胞(干細(xì)胞)的方法， 所述細(xì)胞可纟皮移植
a. 進(jìn)入口腔而不被排斥，
b. 進(jìn)入牙周區(qū)域而不被排斥，
c. 進(jìn)入牙缺損而不被排斥。
15. 使用細(xì)胞和支架的組合來植入上述權(quán)利要求中所描述的細(xì)胞 的方法。
16. 來自自體、同種異體和/或異種來源的牙周韌帶或其提取物用 于使得細(xì)胞能夠分化的用途。
17. 來自自體、同種異體和/或異種來源的牙周韌帶或其提取物用 于使得細(xì)胞能夠分化成牙周細(xì)胞、牙周干細(xì)胞和/或表現(xiàn)出牙周行為的 細(xì)胞的用途。
權(quán)利要求
1.用于繁殖和/或分化哺乳動物細(xì)胞的方法，該方法包括將哺乳動物細(xì)胞暴露于或與一種或多種牙周韌帶組織、來源于牙周韌帶組織的牙周韌帶蛋白質(zhì)或因子共培養(yǎng)，從而獲得具有PDL特征并達(dá)到至少一種下列狀況的細(xì)胞i)顯示出通過Von Kossa方法所證明的牙周特征，在該方法中磷酸鈣沉積物被染成棕色至黑色，ii)顯示出增加的骨橋蛋白和骨鈣蛋白以及同時減少的骨唾液蛋白(骨唾液蛋白II或BSP)，iii)能夠被植入以修復(fù)和/或再生牙周組織，iv)能夠通過朝向牙齒的齦線的愈合來修復(fù)病癥例如牙周炎，也稱為牙周病或齒根骨膜炎，和v)被宿主接受而無顯著的免疫反應(yīng)或細(xì)胞排斥。
2. 權(quán)利要求1的方法，其中所述哺乳動物細(xì)胞在生長培養(yǎng)基中繁 殖，然后通過將生長培養(yǎng)基變換為分化培養(yǎng)基例如骨誘導(dǎo)性培養(yǎng)基而被 誘導(dǎo)分化，由此收獲具有獲得的PDL特征的細(xì)胞。
3. 權(quán)利要求1或2的方法，其中所述哺乳動物細(xì)胞是哺乳動物間充質(zhì)細(xì)胞、來源于臍帶和/或臍帶血的同種異體哺乳動物間充質(zhì)細(xì)胞、 自體哺乳動物間充質(zhì)細(xì)胞、自體哺乳動物成骨細(xì)胞或成骨細(xì)胞的前體細(xì)胞/祖細(xì)胞，其中這些細(xì)胞通過暴露于牙周韌帶蛋白將分化成PDL細(xì)胞。
4. 權(quán)利要求3的方法，其中進(jìn)行繁殖的哺乳動物間充質(zhì)細(xì)胞是自 體間充質(zhì)細(xì)胞，并且所獲得的細(xì)胞能夠原位轉(zhuǎn)分化成PDL細(xì)胞或顯示出 PDL特征的細(xì)胞。
5. 前述權(quán)利要求中任一項的方法，其中所獲得的具有PDL特征的 細(xì)胞是HLA-DR陽性的(HLA-DR+) 、 Lin陽性的(Lin + ) 、 Thy-l陽性 的(Thy-l+) 、 Stro-l陽性的(Stro-l +) 、 CD-13陽性的、CD-44陽 性的、CD-90陽性的、CD-73陽性的，和可能CD146/MUC 18陽性的，但 對于CD31是陰性的。
6. 前述權(quán)利要求中任一項的方法，其中所獲得的具有PDL特征的 細(xì)胞是CD-34陰性的。
7. 具有PDL特征并且通過權(quán)利要求1至6中任一項所描述的方法 可獲得的細(xì)胞群。
8. 用于治療牙周組織中的病癥的方法，所述方法包括將通過權(quán)利 要求1至3中任一項所定義的方法而獲得的細(xì)胞直接向下注射至牙周韌 帶，從而導(dǎo)致所述細(xì)胞與周圍牙根管的粘著。
9. 權(quán)利要求8的方法，其中細(xì)胞的植入采用細(xì)胞和支架的組合。
10. 主要由能夠誘導(dǎo)PDL細(xì)胞特征的牙周韌帶蛋白質(zhì)組成的組織 組合物，該組合物可通過下列方式而獲得在培養(yǎng)基中培養(yǎng)牙周韌帶外 植體以獲得細(xì)胞的遷移，并收獲這些細(xì)胞。
11. 在權(quán)利要求10中描述的細(xì)胞，所述細(xì)胞能夠與來源于來自自 體或同種異體供體的骨髓細(xì)胞或其集落的哺乳動物細(xì)胞共培養(yǎng)，暴露于 或與牙周韌帶組織、來源于牙周韌帶組織的牙周韌帶蛋白質(zhì)或因子共培 養(yǎng)，并通過這些因子進(jìn)行誘導(dǎo)以a. 獲得牙周特征，其顯示出增加的骨橋蛋白和骨鈣蛋白以及減少 的骨唾液蛋白，b. 能夠被植入以修復(fù)和/或再生牙周組織，c. 能夠被植入以修復(fù)和/或再生牙周組織，d. 能夠修復(fù)病癥，例如牙周炎，也稱為牙周病，e. 被宿主接受而無顯著的免疫反應(yīng)或細(xì)胞排斥。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于繁殖和/或分化哺乳動物細(xì)胞的方法，該方法包括將哺乳動物細(xì)胞暴露于或與一種或多種牙周韌帶組織、來源于牙周韌帶組織的牙周韌帶蛋白質(zhì)或因子共培養(yǎng)，從而獲得具有PDL特征并達(dá)到至少一種下列狀況的細(xì)胞i)顯示出通過Von Kossa方法所證明的牙周特征，在該方法中磷酸鈣沉積物被染成棕色至黑色，ii)顯示出增加的骨橋蛋白和骨鈣蛋白以及同時減少的骨唾液蛋白(骨唾液蛋白II或BSP)，iii)能夠被植入以修復(fù)和/或再生牙周組織，iv)能夠通過朝向牙齒的齦線的愈合來修復(fù)病癥例如牙周炎(也稱為牙周病)，和v)被宿主接受而無顯著的免疫反應(yīng)或細(xì)胞排斥。
文檔編號A61K6/00GK101316926SQ200680044909
公開日2008年12月3日 申請日期2006年9月28日 優(yōu)先權(quán)日2005年9月30日
發(fā)明者C·克勞森, K·R·派德森, K·歐瑟 申請人:復(fù)制基因股份公司