專利名稱:鑒定特異應(yīng)答番木鱉堿和prop苦味配體的新的苦味受體t2r76的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本申請(qǐng)一般涉及77i 76多肽,其構(gòu)成T2R家族中新的人苦味受體, 還涉及該多肽介導(dǎo)的苦味味覺(jué)。更具體地,本發(fā)明提供了編碼"; 76 多肽的分離的核酸、作為苦味受體發(fā)揮功能的分離的和功能性7^ % 多肽、"; 7^多肽重組表達(dá)的異源性表達(dá)系統(tǒng)、鑒定rM7(f介導(dǎo)的味 覺(jué)的調(diào)節(jié)劑,尤其味苦或者阻斷苦味的化合物的方法,及其用途。甚 至更具體地,本發(fā)明涉及發(fā)現(xiàn)7^ 7f多肽特異應(yīng)答苦味配體,包括番 木鳘堿和丙基硫尿嘧啶(PROP)。
相關(guān)技術(shù)描述
人類可以識(shí)別的基本味道形式之一是苦味。認(rèn)為苦味化合物通過(guò) 與細(xì)胞表面受體相互作用而產(chǎn)生苦味。所述受體的活化氣動(dòng)細(xì)胞內(nèi)信 號(hào)級(jí)聯(lián),其以神經(jīng)遞質(zhì)釋放結(jié)束。然后來(lái)自腦神經(jīng)神經(jīng)節(jié)的傳入神經(jīng) 纖維釋放信號(hào)到皮質(zhì)味覺(jué)中樞,在這里信號(hào)被加工為味覺(jué)。這些受體 屬于7次跨膜結(jié)構(gòu)域受體家族,所述受體與細(xì)胞內(nèi)G蛋白相互作用, 也稱作G蛋白偶聯(lián)的受體(GPCRs)。見(jiàn)Lindemann (2001) Nature 413(6852): 219-25。
在人類和嚙齒動(dòng)物中已經(jīng)鑒定了稱作T2R的新的GPCR家族(Adler等人,2000; Chandrashekar等人,2000; Matsunami, 2000; PCT國(guó) 際乂/^布號(hào)WO 01/18050和WO 01/77676)。 一些證據(jù)提示T2R可以介導(dǎo) 苦味化合物的味覺(jué)。首先,T2R基因在舌和腭上皮的一部分味覺(jué)感受 器細(xì)胞中特異表達(dá)。其次,T2R與小鼠和人類中苦味味覺(jué)有關(guān)的基因 座遺傳連鎖(Conneally等人,1976; Capeless等人,1992; Reed等 人,1999; Adler等人,2000)。第三,體外研究已經(jīng)表明T2R可以激 活味轉(zhuǎn)導(dǎo)素,其是在味覺(jué)細(xì)胞中特異表達(dá)并且與苦味刺激轉(zhuǎn)導(dǎo)連接的 G蛋白(Wong等人,1996),并且應(yīng)答苦味化合物的應(yīng)用,選擇性發(fā)生 T2R對(duì)味轉(zhuǎn)導(dǎo)素的活化(Chandrashekar等人,2000)?;谶@些數(shù)據(jù), 提出mT2R和hT2R受體家族分別介導(dǎo)小鼠和人類中的苦味應(yīng)答。
苦味通常是食品、飲料、口腔洗滌劑、牙骨、化妝品和藥物中不 希望的。通過(guò)加入甜味化合物,如糖,可以掩蔽苦味;然而,增甜劑 的加入可以不希望地改變食品風(fēng)味和增加熱量攝入。對(duì)于藥物的情況, 已經(jīng)開(kāi)發(fā)了復(fù)雜和昂責(zé)的配制方法(例如,包衣和膠嚢劑)來(lái)減小口 服時(shí)的苦味。還沒(méi)有描述通過(guò)味覺(jué)感受器的抑制直接阻斷苦味的方法。
最近,已經(jīng)鑒定了一些人T2R為某些苦味配體的受體 (Chandrashekar等人(Id.) 2000; Buf e等人(Id) 2002; Kim等人, Science 299, 2003; Pronin等人,Chemical Senses 29, 2004; Behrens等人,BBRC 319, 2004; Kuhn等人,J. Neuroscience 24, 2004; Bufe等人Current Biology 15, 2005)。還提出每種hT2R能夠結(jié)合 多種配體。該假說(shuō)是基于人可以識(shí)別幾百種結(jié)構(gòu)上不同的化合物為苦 味的這一事實(shí)。hT2R的序列公開(kāi)在Zuker等人的公布的PCT申請(qǐng)WO 01/18050 A2 (2001)和WO 01/77676 A2 (2001)中,將它們都完整引 入本文作為參考,以及公開(kāi)在涉及上文鑒定的h7^ "的較早的專利申 請(qǐng)中。
研究T2R功能的困難之一是這些受體不容易在培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì) 胞系中表達(dá)。為了提高T2R表達(dá),可以將來(lái)自良好表達(dá)的GPCR的N-末端序列如視紫紅質(zhì)連接到特定的T2R序列(見(jiàn)Chandrashekar等人, (Id.) 2000)。由于可利用的抗體,該N-末端標(biāo)記也允許容易地監(jiān)視蛋白質(zhì)表達(dá)。而視紫紅質(zhì)標(biāo)記的摻入提高了哺乳動(dòng)物細(xì)胞系中一些
T2R的表達(dá),它們的一些仍然沒(méi)有足夠表達(dá)以用于功能研究。在不同 的方法中,mT2R5在Sf9昆蟲(chóng)細(xì)胞中成功地表達(dá)并且用于使用生物化 學(xué)GTP結(jié)合測(cè)定法的功能研究中(Chandrashekar等人,(Id.) 2000)。
在本受讓人Senomyx Inc.的以前的專利申請(qǐng)美國(guó)序列號(hào) 10/191,058 (完整引入本文作為參考)中,申請(qǐng)人發(fā)現(xiàn)特異結(jié)合三種 不同的人T2R的苦味配體。此外,申請(qǐng)人最近提交了臨時(shí)專利申請(qǐng) 60/00000,其公開(kāi)了特異結(jié)合幾種其他的人T2R的苦味配體。
從而,本領(lǐng)域需要鑒定和功能上表征苦味受體作為開(kāi)發(fā)苦味味覺(jué) 抑制劑的靶標(biāo)。為了滿足該需要,本發(fā)明提供了新的rW76核酸和多 肽。本發(fā)明還提供了鑒定和使用77/ 76的調(diào)節(jié)劑用于改變苦味味覺(jué), 尤其苦味配體如番木鱉堿(Brucine) 、 PROP和其他化合物介導(dǎo)的苦 味味覺(jué)的方法,所述化合物如調(diào)節(jié)77i 76介導(dǎo)的味覺(jué)的結(jié)構(gòu)上相關(guān)的 化合物。
發(fā)明概述
本發(fā)明提供了分離的r^ 7^核酸和其編碼的r^ 7^多肽和相關(guān)的
發(fā)現(xiàn),即"A7^多肽特異應(yīng)答PR0P (丙基硫尿嘧啶)和番木豎堿。所 述多肽和核酸可以用于本文公開(kāi)的檢測(cè)方法和測(cè)定法,優(yōu)選高通量基 于細(xì)胞的測(cè)定法,其用于鑒定阻斷或者抑制"A76介導(dǎo)的苦味,例如, 番木鳘堿、PROP或者其他苦味配體引起的苦味的化合物。
根據(jù)本發(fā)明,7^ 7f核酸可以包含(a)編碼SEQ ID N0:2的多 肽的分離的核酸分子;(b) SEQ IDNO: 1的分離的核酸分子;或者(c) 與SEQ ID N0:1 "實(shí)質(zhì)上相似"(如下文定義)的分離的核酸分子。
TR76核酸可以包含(a)編碼SEQ ID NO: 2的多肽的分離的核酸 分子;(b) SEQ ID NO: 1的分離的核酸分子;(c)與SEQ ID NO: 1 的核酸分子在洗滌嚴(yán)格條件下雜交并且編碼77y 76多肽的分離的核酸 分子,所述洗滌嚴(yán)格條件通過(guò)具有小于約200 mM鹽濃度的洗滌溶液和 大于約45。C的洗滌溫度代表;或者(d)分離的核酸分子,其由于遺傳密碼簡(jiǎn)并性而在核酸序列上與上面(a)、 (b)和(c)之一的分離的核酸 分子相差至少一個(gè)功能上等同的密碼子,并且編碼上面(a)、 (b)和(c) 之一的分離的核酸分子編碼的777 76多肽,并且編碼的多肽保留SEQ ID NO: 2中所含的天然"i ^多肽的配體和/或功能性質(zhì),即特異應(yīng)答 番木鱉堿和/或PROP。優(yōu)選地,分離的7^ 76核酸包含(a)編碼SEQ ID N0:2的多肽的分離的核酸分子;(b) SEQ ID NO: 1的分離的核酸 分子。
分離的7^ 7f多肽可以包含(a) SEQ ID NO: 2的多肽;(b)與 SEQ ID NO: 2 "實(shí)質(zhì)上同一"(下文定義)的多肽;(c) SEQ ID NO: 1 的核酸分子編碼的多肽;或者(d)與SEQ ID NO: 1實(shí)質(zhì)上同一的核酸 分子編碼的多肽。
7"Z 7f多肽還可以包含分離的核酸分子編碼的多肽,所述核酸分 子選自(a)編碼SEQ ID N0:2的多肽的分離的核酸分子;(b ) SEQ ID N0:1的分離的核酸分子;(c )與SEQ ID NO: 1的核酸在高嚴(yán)格條 件下雜交并且編碼7^ 7f多肽的分離的核酸分子;和(d)分離的核酸 分子,其由于遺傳密碼簡(jiǎn)并性而在核酸序列上與上面(a)、 (b)和(c) 之一的分離的核酸分子相差至少一個(gè)功能上等同的密碼子,并且編碼 上面(a) 、 (b)和(c)之一的分離的核酸分子編碼的多肽。優(yōu)選地, 7^ 76多肽包含SEQ ID NO: 2或者與其具有至少90%序列同一性、更 優(yōu)選與其具有至少95 - 99 %序列同一性的多肽。
本發(fā)明還提供了檢測(cè)T^ 76核酸的方法,該方法包括(a)得到
具有核酸物質(zhì)的生物樣品;(b)將分離的ny 7^核酸分子在嚴(yán)格雜交
條件下與(a)的生物樣品雜交,從而在分離的7"^ 76核酸和生物樣品內(nèi) 的核酸之間形成雙鏈體結(jié)構(gòu);和(c)檢測(cè)(b)的雙鏈體結(jié)構(gòu),從而
檢測(cè)r^^核酸分子。
本發(fā)明還提供了特異識(shí)別7^ 7f多肽的抗體,和產(chǎn)生所述抗體的 方法。該方法的代表性實(shí)施方案包括(a)重組或者合成地產(chǎn)生r"7《 多肽;(b)形成(a)的多肽,其中它是有效的免疫原;(c)對(duì)動(dòng)物施 用(b)的制劑以在動(dòng)物中產(chǎn)生免疫應(yīng)答,包括產(chǎn)生抗體,其中抗體存在于動(dòng)物的血清中;和(d)從(c)的動(dòng)物收集血清,其包含特異識(shí)別") 7^ 多肽的抗體。所公開(kāi)的方法還包括制備單克隆抗體。
還提供了檢測(cè)77i 7f多肽水平的方法。在代表性實(shí)施方案中,該 方法包括(a)得到具有肽物質(zhì)的生物樣品;(b)通過(guò)與本發(fā)明抗體 的免疫化學(xué)反應(yīng)檢測(cè)(a)的生物樣品中的T^ 76多肽,從而測(cè)定樣品 中"/ 7f多肽的量。
還提供了用于7^ 7f多肽的重組表達(dá)的系統(tǒng)。重組表達(dá)系統(tǒng)可以 包含(a)本發(fā)明的rW7(5"多肽(例如,如SEQ ID N0: 2中給出的代 表性實(shí)施方案);和(b)表達(dá)7^v 7(f多肽的異源宿主細(xì)胞。優(yōu)選地, 宿主細(xì)胞將包含哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞,如HEK-293、 HEK-293T、 C0S、 CH0、 BHK或MDCK細(xì)胞。最優(yōu)選地,宿主細(xì)胞是表達(dá)G蛋白的HEK-293細(xì)胞, 所述G蛋白功能上偶聯(lián)7^ 7f,例如,泛主G蛋白,如Galphal5或 Galphal6、味轉(zhuǎn)導(dǎo)素、轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白或者其嵌合體。此外,重組表達(dá)系統(tǒng) 可以包含編碼不同于rM7f的T2R多肽的核酸序列。具體地,重組表 達(dá)系統(tǒng)可以包括2003年5月6日公布的Zuker等人的美國(guó)專利號(hào) 6, 558, 910、 2002年7月18日/〉布的Adler, John Elliot的美國(guó)/> 布的申請(qǐng)20020094551 、和2003年1月30日公布的Zuker等人的美 國(guó)公布的申請(qǐng)20030022278中公開(kāi)的任一種T2R核酸序列,將這些申 請(qǐng)都完整引入本文作為參考。應(yīng)該注意到,T2R多肽的另一名稱是SF 或者GR多肽,如引入本文作為參考的Zuker申請(qǐng)中公開(kāi)。主題h7^ M 可以與一種或多種其他T2R多肽一起表達(dá)以產(chǎn)生功能的異聚體味覺(jué)受 體。其他的T2R多肽可以是另一種人T2R或者其他物種如大鼠或小鼠 的T2R。宿主細(xì)胞可以包含任何合適的細(xì)胞。優(yōu)選的宿主細(xì)胞包含哺 乳動(dòng)物細(xì)胞,更優(yōu)選人細(xì)胞。如所指出的,宿主細(xì)胞優(yōu)選還包含能夠 偶聯(lián)到rM7(f多肽的G蛋白a亞基,例如,泛主G蛋白,如Gal5、
味轉(zhuǎn)導(dǎo)素或轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白。
使用所公開(kāi)的系統(tǒng)重組表達(dá)"y 7/f多肽,本發(fā)明還提供了鑒定 多肽的調(diào)節(jié)劑的方法。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中,該方法包 括(a)提供重組表達(dá)系統(tǒng),從而在異源宿主細(xì)胞中表達(dá)7^ 76多肽;(b)對(duì)(a)的系統(tǒng)提供受試物質(zhì);(c)在受試物質(zhì)存在下和任選在 已知特異活化7^ ^的配體,例如,PROP或者番木蹩堿的存在下,測(cè) 定7^i 7《功能的水平或者質(zhì)量;(d)比較在受試物質(zhì)和任選另一種已 知的7^ 7f配體存在下7^ 76功能的水平或者質(zhì)量與7^ 76功能的對(duì) 照水平或者質(zhì)量;和(e)通過(guò)在受試物質(zhì)和任選另一種已知的"/ 7f 特異配體存在下,測(cè)定7^ ^功能的水平或者質(zhì)量與7^ 76功能的對(duì) 照水平或者質(zhì)量相比為顯著改變的,將受試物質(zhì)鑒定為7^ 7f調(diào)節(jié)劑。 該測(cè)定法可以包括測(cè)定在受試物質(zhì)存在下的GTPyS結(jié)合與不存在該 受試物質(zhì)時(shí)的結(jié)合相比的量。優(yōu)選地,在基于細(xì)胞的測(cè)定中鑒定"A7f 調(diào)節(jié)劑,所述測(cè)定監(jiān)視在受試化合物,和任選已知的77) 7f配體如PROP 或者番木鱉堿存在或不存在下,細(xì)胞內(nèi)鈣的改變。
在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中,鑒定"y 7f多肽的調(diào)節(jié)劑的方法包 括(a)在一種或多種受試物質(zhì)和任選地已知的"; 76配體如PROP 或者番木鱉堿的存在下,單獨(dú)表達(dá)7^ ^多肽或者表達(dá)所述多肽或多 肽組合或者與一種或多種其他T2R多肽組合表達(dá);(b)測(cè)定受試物質(zhì) 對(duì)分離的7^ 7f多肽或者含有7^ 76的多肽組合的結(jié)合或者它對(duì)已知 的7^ 76配體的結(jié)合的影響;和(c)選擇表現(xiàn)出特異結(jié)合7"^ 76多肽 或者調(diào)節(jié)、優(yōu)選抑制已知的T^ 76配體,例如PROP或者番木鱉堿的特 異結(jié)合的候選物質(zhì)。
還提供了通過(guò)所公開(kāi)的方法鑒定的7^ "多肽的調(diào)節(jié)劑,包括激 動(dòng)劑和抑制劑。調(diào)節(jié)劑可以包括蛋白質(zhì)、肽、抗體、核酸、小分子, 或者其組合,其調(diào)節(jié)77i 7f,例如抑制或者阻斷苦味配體與77/ 76多 肽的特異活化和/或結(jié)合,例如,番木鱉堿或者PROP,或者特異結(jié)合 77i 7(f多肽的結(jié)構(gòu)上相關(guān)的化合物。優(yōu)選地,在人味覺(jué)測(cè)試中證實(shí)了
此類7^ 76調(diào)節(jié)劑調(diào)節(jié)r^ 7^介導(dǎo)的苦味味覺(jué)。
本發(fā)明還提供了使用用本文描述的測(cè)定系統(tǒng)鑒定的調(diào)節(jié)劑 調(diào)節(jié)受試者中苦味味覺(jué)的方法。優(yōu)選地,所述受試者是哺乳動(dòng)物受試 者,更優(yōu)選地人受試者。還優(yōu)選地,在受試者中改變的苦味味覺(jué)包含 T^" 76介導(dǎo)的功能和其他T2R介導(dǎo)的潛在的苦味。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中,調(diào)節(jié)受試者中苦味味覺(jué)的方法包括 (a )制備包含根據(jù)所公開(kāi)的方法鑒定的T^ 7f調(diào)節(jié)劑的組合物;和(b ) 施用、優(yōu)選通過(guò)才聶入對(duì)受試者施用含有有效劑量的本發(fā)明的"W7d"調(diào) 節(jié)劑的食品、飲料或者藥物,從而改變受試者中的苦味味覺(jué)。
例如,本發(fā)明提供了通過(guò)對(duì)受試者共同施用ri^7(f抑制劑和苦味 化合物,減小苦味化合物的苦味味覺(jué)的方法。本發(fā)明還提供了通過(guò)共 同施用7^ 7(f激動(dòng)劑和化合物增強(qiáng)所述化合物的苦味味覺(jué)的方法。共 同施用可以包括施用包含與待調(diào)節(jié)其p木道的化合物混合的T^ 7^抑制 劑的組合物。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中,組合物可以包含食品、飲 料、口腔洗滌劑、潔牙劑、化妝品或者藥物。
本發(fā)明還提供了通過(guò)共同施用r"76激動(dòng)劑和待調(diào)節(jié)其味道的化 合物,增強(qiáng)該化合物的苦味味覺(jué)的方法。7^76激動(dòng)劑和所述化合物 可以混合為單一組合物。
因此,本發(fā)明的一個(gè)目的是提供新的r"7f核酸和多肽、檢測(cè) 77i 76核酸的方法、用于表達(dá)77) ;^多肽的異源性表達(dá)系統(tǒng)、使用異 源T^ 7f表達(dá)系統(tǒng)的方法和測(cè)定法,和調(diào)節(jié)和檢測(cè)77^7^多肽或者 7^ 7f調(diào)節(jié)化合物的方法。通過(guò)本發(fā)明完全或者部分實(shí)現(xiàn)了該目的。
本發(fā)明的一個(gè)目的已經(jīng)在上面陳述,研究本發(fā)明下面的描述和非 限制性實(shí)施例后,本發(fā)明的其他目的和優(yōu)點(diǎn)將是本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而
易見(jiàn)的。
圖1和2簡(jiǎn)述
圖1含有番木鳘堿和PROP的結(jié)構(gòu)。
圖2含有來(lái)自基于細(xì)胞的測(cè)定法的數(shù)據(jù),其揭示W(wǎng)i 7(f特異響應(yīng) 番木鱉堿和PR0P。
序列表中序列簡(jiǎn)述
SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO: 2分別含有根據(jù)本發(fā)明的人7^ 76核 苷酸和氨基酸序列。發(fā)明詳述 I.定義
盡管認(rèn)為下面的術(shù)語(yǔ)將是本領(lǐng)域技術(shù)人員完全理解的,但是給出 下面的定義以促進(jìn)本發(fā)明的解釋。
術(shù)語(yǔ)"一個(gè)"和"這個(gè)"根據(jù)常規(guī)指一個(gè)或多個(gè)。
如本文使用的術(shù)語(yǔ)"約"當(dāng)涉及可測(cè)量的值如序列同一性百分?jǐn)?shù) (例如,當(dāng)如下文所述的比較核苷酸和氨基酸序列時(shí))、核苷酸或者
蛋白質(zhì)長(zhǎng)度、結(jié)合的量等等時(shí),意在包括與指定量的±20%或±10%, 更優(yōu)選±5%,甚至更優(yōu)選±1%,還更優(yōu)選±0. 1%的差異,因?yàn)榇祟惒?異對(duì)于進(jìn)行所公開(kāi)的方法或者實(shí)施本發(fā)明是合適的。
n. "i ;^核酸和多肽
本發(fā)明提供了新的7^ 76核酸和新的77i 76多肽,包括功能T7i ^ 多肽。本發(fā)明的代表性T7i 7^核酸如SEQ ID NO: 1給出,其編碼如SEQ ID N0:2給出的7^ 7f多肽。
術(shù)語(yǔ)"7^ 7<T和包括"7^ 7(T的術(shù)語(yǔ)(例如,h7^ 7。一般指分 離的T^ 7^核酸、77/ 7d"核酸編碼的分離的多肽和其活性。7^ 76核酸 和多肽可以來(lái)自任何生物。術(shù)語(yǔ)"77; 7f和包括"7^ 7f,的術(shù)語(yǔ)還 指包含被苦味化合物如PROP、番木鱉堿等等活化的受體的多肽,還指 編碼所述多肽的核酸。7^ 76受體可以包含其他T2R多肽,即,它可
以是異聚體或者同聚體受體。
如核酸或多肽背景中使用的術(shù)語(yǔ)"分離的"指該核酸或者多肽與 其天然環(huán)境分離存在并且不是自然的產(chǎn)物。分離的核酸或者多肽可以 以純化形式存在或者可以存在于非天然環(huán)境中,如轉(zhuǎn)基因宿主細(xì)胞中。
如下文進(jìn)一步公開(kāi)的,本發(fā)明還提供了 7^ 7f多肽的功能表達(dá)的 系統(tǒng)。該系統(tǒng)利用包括SEQ ID NO: 1的重組7^ 76核酸,其可以與另 一 T2R核酸和合適的G蛋白結(jié)合表達(dá)。II. A. 77及7f核酸
術(shù)語(yǔ)"核酸分子"和"核酸"各自指單鏈、雙鏈或者三鏈形式的 脫氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸和其多聚體。除非特別限定,該術(shù)語(yǔ) 包括含有天然核苷酸的已知的類似物的核酸,其具有與參照的天然核 酸相似的性質(zhì)。術(shù)語(yǔ)"核酸分子"或"核酸"還可以用于代替"基因"、 "cDNA,, 、 "mRNA"或者"cRNA"。核酸可以被合成,或者可以來(lái)自 任何生物來(lái)源,包括任何生物。用于克隆全長(zhǎng)"i 7fcDNA的代表性方 法在實(shí)施例1中描述。
術(shù)語(yǔ)"T2R"或者"SF"指編碼味覺(jué)細(xì)胞特異性G蛋白偶聯(lián)的受體 家族成員的核酸。這些核酸和它們編碼的多肽在文獻(xiàn)中備選地稱作 "T2R,, 、 "SF" 、 "GR,,,或者G蛋白光學(xué)味覺(jué)感受器的TAS2R家族。 該GPCR家族包括味覺(jué)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的組分。已經(jīng)知道該味覺(jué)感受器家族的 其他人和嚙齒動(dòng)物成員涉及苦味的檢測(cè)并且特異應(yīng)答不同的苦味配 體。苦味感受器的T2R或者SF家族的成員公開(kāi)在美國(guó)專利6, "8, 910、 公布的美國(guó)專利申請(qǐng)20030022278 (Zuker等人,2003年1月20日公 布);和公布的美國(guó)專利申請(qǐng)20020094502 (Adler, Jon El 1 iot, 2002 年7月18日公布)中。此類T2R的實(shí)例包括Gro1 (SF01); GR02 (SF02); GR02 (SF03); GR04 (SF04); GR05 (SF05); GR06 (SF06); GR07 (SF07); GR08 (SF08); GR09 (SF09); GR10 (SF10); GR11(SF11); GR12 (SF12); GR13 (SF13); GR14 (SF14); GR15 (SF15); GR16 (SF16); GR17 (SF17); GR18 (SF18); GR19 (SF19); GR20 (SF20); GR21 (SF21); GR22 (SF23); GR24 (SF24); T2R51; T2R55; T2R33; T2R59; T2R61; T2R63; T2R64; T2R65; T2R75; GR25 (SF25); GR26 (SF26); GR27 (SF27); GR28 (SF28); GR29 (SF29); GR30 (SF30); GR31 (SF31); GR32鵬2); GR(SF ); GR 33 (SF33); GR 34(SF24); GR35 (SF35); GR36鵬6); GR37 (SF37); GR38鵬8); GR39鵬9); GR40 (SF40); GR41 (SF41); GR42 (SF42); GR43 (SF43); GR44 (SF44); GR45 (SF45); GR46 (SF46); GR47 (SF47); GR48 (SF48); GR49 (SF49); GR50 (SF50)。
這些T2R、 SF、 TAS2R等等或者如它們的別稱GR可以來(lái)自不同的物種,包括人、小鼠和大鼠,并且優(yōu)選是人的。還包括與如上文定義 的這些序列的任一種"實(shí)質(zhì)上同一"或者與這些序列具有特定的序列
同一性或者與特異雜交的T2R。
術(shù)語(yǔ)"r^7(T和包括"7^ 7f的術(shù)語(yǔ)(例如h"i 7《在本文中 用于指編碼7^ 7f多肽的核酸。從而,術(shù)語(yǔ)""/ 7(T指本發(fā)明的分離 的核酸,其包含
(a) 包含SEQ ID NO: 1的核苷酸序列的核苷酸序列;或者
(b) 與SEQ ID N0:1實(shí)質(zhì)上同一的核苷酸序列。 如本文使用的術(shù)語(yǔ)"實(shí)質(zhì)上同一"描述核苷酸序列之間的相似性
程度,指兩個(gè)或多個(gè)序列當(dāng)比較或者比對(duì)以得到最大對(duì)應(yīng)性時(shí),具有 至少約60%、優(yōu)選至少約70%、更優(yōu)選至少約80%、更優(yōu)選約90% 到約99%,更優(yōu)選約95%、 96%、 97%、 98%或約99%,最優(yōu)選約99% 核苷酸同一性,如使用下面的序列比較算法之一或者通過(guò)視覺(jué)檢查測(cè) 量。優(yōu)選地,實(shí)質(zhì)同一性存在于至少約100個(gè)殘基的核苷酸序列中, 更優(yōu)選存在于至少約150個(gè)殘基的核苷酸序列中,最優(yōu)選存在于包含 全長(zhǎng)編碼序列的核苷酸序列中。
術(shù)語(yǔ)"全長(zhǎng)"在本文中用于指編碼如下文進(jìn)一步描述的功能性 77j 7i5"多肽的完整可讀框。確定兩個(gè)多肽之間的百分比同一性的方法 在標(biāo)題為"核苷酸和氨基酸序列比較"的下文中定義。
一方面,實(shí)質(zhì)上同一的序列可以是多態(tài)性序列。術(shù)語(yǔ)"多態(tài)性" 指在群體中發(fā)生兩個(gè)或多個(gè)遺傳上確定的備選序列或者等位基因。等 位基因差異可以小至一個(gè)堿基對(duì)。
另一方面,實(shí)質(zhì)上相同的序列可以包含誘變的序列,包括包含沉默 突變的序列.突變可以包含一個(gè)或多個(gè)殘基改變、殘基缺失、或者額外 殘基的插入,其優(yōu)選不影響77A76配體結(jié)合,例如,PROP或者番木鱉堿。
兩種核苷酸序列實(shí)質(zhì)上同一的另一種表示是這兩個(gè)分子在嚴(yán)格條 件下特異雜交或者實(shí)質(zhì)上相互雜交。在核酸雜交上下文中,可以將被 比較的兩個(gè)核酸序列稱作"探針"和"耙標(biāo)"。"探針"是參考核酸分子,"靶標(biāo)"是測(cè)試核酸分子,通常在核酸分子的異質(zhì)性群體內(nèi)被 發(fā)現(xiàn)。"靶序列"與"測(cè)試序列"同義。
用于雜交研究或者測(cè)定法的優(yōu)選的核苷酸序列包括與本發(fā)明的核
酸分子的至少約H到40個(gè)核苷酸的序列互補(bǔ)或者模擬該序列的探針 序列。優(yōu)選地,探針包含14到20個(gè)核苷酸,或者需要時(shí)甚至更長(zhǎng), 如30、 40、 50、 60、 100、 200、 300或500個(gè)核苷酸或者長(zhǎng)達(dá)SEQ ID N0:1的完整序列。通過(guò)例如,片段的化學(xué)合成,通過(guò)應(yīng)用核酸擴(kuò)增技 術(shù),或者通過(guò)向用于重組生產(chǎn)的重組載體中導(dǎo)入所選的序列,可以容 易地制備此類片段。
短語(yǔ)"特異雜交,,指當(dāng)特定的核苷酸序列存在于復(fù)雜的核酸混合 物(例如,總細(xì)胞DNA或者RNA)中時(shí),分子在嚴(yán)格條件下僅僅與該 核苷酸序列結(jié)合、形成雙鏈體或者雜交。
短語(yǔ)"實(shí)質(zhì)上雜交"指探針核酸分子和靶標(biāo)核酸分子之間的互補(bǔ) 性雜交并且包括微小的錯(cuò)配,其可以通過(guò)降低雜交介質(zhì)的嚴(yán)格性實(shí)現(xiàn) 所希望的雜交來(lái)適應(yīng)。
在核酸雜交實(shí)驗(yàn)如DNA印跡和RM印跡分析的背景中,"嚴(yán)格雜 交條件"和"嚴(yán)格雜交洗滌條件"是序列和環(huán)境依賴性的。較長(zhǎng)的序 列在較高溫度下特異雜交。關(guān)于核酸雜交的詳細(xì)教導(dǎo)見(jiàn)Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes, 第一部分第二 章,Elsevier, New York, New York。通常,選擇高嚴(yán)格雜交和洗滌 條件為比在確定的離子強(qiáng)度和pH下特定序列的熱解鏈溫度(Tin)低約 50°C。通常,在"嚴(yán)格條件"下,探針將與它的靶序列,但不與其他 序列特異雜交。
Tm是50 %的耙序列與完全匹配的探針雜交的溫度(在確定的離子 強(qiáng)度和PH下)。選擇非常嚴(yán)格條件為等于具體探針的Tm。具有大于 約100個(gè)互補(bǔ)殘基的互補(bǔ)核酸的DNA或者RNA印跡分析的嚴(yán)格雜交條 件的實(shí)例是在50%曱酰胺與lmg肝素中42X:下過(guò)夜雜交。高嚴(yán)格洗滌 條件的實(shí)例是在0. lxSSC中65'C下15分鐘。嚴(yán)格洗滌條件的實(shí)例是OJXSSC緩沖液中65"C下15分鐘。SSC緩沖液的描述見(jiàn)Sambrook等 人編著 (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York。 通常,高嚴(yán)格洗滌之前是用于除去背景探針信號(hào)的低嚴(yán)格洗滌。大于 約100個(gè)核苷酸的雙鏈體的介質(zhì)嚴(yán)格性洗滌條件的實(shí)例是lxSSC中 45。C下15分鐘。大于約100個(gè)核苷酸的雙鏈體的低嚴(yán)格性實(shí)例是4x 到6xSSC中40。C下15分鐘。對(duì)于短探針(例如,約10到50個(gè)核苷 酸),嚴(yán)格條件通常涉及低于約1 M Na+離子,通常約0. 01到1 M Na+ 離子強(qiáng)度(或者其他鹽)的鹽濃度,pH 7.0-8.3,并且溫度通常為至 少約30。C。加入去穩(wěn)定劑如甲酰胺也可以實(shí)現(xiàn)嚴(yán)格條件。通常,在具 體雜交測(cè)定中,比為不相關(guān)探針觀察到的高2倍(或者更高)的信噪 比表明特異雜交的檢測(cè)。
下面是可以用于鑒定與本發(fā)明的參考核苷酸序列實(shí)質(zhì)上同一的核 苷酸序列的雜交和洗滌條件的實(shí)例探針核苷酸序列優(yōu)選與靶核苷酸 序列在7%十二烷基硫酸鈉(SDS) ,0. 5M NaP04, 1 mM EDTA中50°C 下雜交,接著在2X SSC, 0. 1 % SDS中50'C下洗滌;更優(yōu)選地,探針 和靶序列在7%十二烷基硫酸鈉(SDS) ,0. 5M NaP04, 1 mM EDTA中 50。C下雜交,接著在IX SSC, 0.1 % SDS中50"C下洗滌;更優(yōu)選地, 探針和靶序列在7%十二烷基硫酸鈉(SDS) ,0.5M NaP04, 1 mM EDTA 中50。C下雜交,接著在0. 5X SSC, 0. 1 % SDS中50'C下洗滌;更優(yōu)選 地,探針和耙序列在7 %十二烷基硫酸鈉(SDS ) , 0. 5M NaPO" 1 mM EDTA 中50X:下雜交,接著在0. IX SSC, 0. 1 °/。 SDS中50TC下洗滌;更優(yōu)選 地,探針和靶序列在7 %十二烷基硫酸鈉(SDS ), 0. 5M NaP04, 1 mM EDTA 中50。C下雜交,接著在0. IX SSC, 0. 1 °/。 SDS中65。C下洗滌。
兩個(gè)核酸序列實(shí)質(zhì)上同一的另一指示是這些核酸編碼的蛋白質(zhì)是 實(shí)質(zhì)上同一的,共有總的三維結(jié)構(gòu),或者是生物學(xué)上的功能等同物。
這些術(shù)語(yǔ)在標(biāo)題為"rM;^多肽"的下文中進(jìn)一步定義。如果對(duì)應(yīng)的 蛋白質(zhì)是實(shí)質(zhì)上同一的,那么在嚴(yán)格條件下不相互雜交的核酸分子仍 然是實(shí)質(zhì)上同一的。這可以例如當(dāng)兩個(gè)核苷酸序列包舍如遺傳密碼允許的保守替代的變體時(shí)發(fā)生。
術(shù)語(yǔ)"保守替代的變體,,指具有簡(jiǎn)并密碼子替代的核酸序列,其 中一個(gè)或多個(gè)所選的(或全部)密碼子的第三位用混合堿基和/或脫氧
次黃苷殘基替代。見(jiàn)Batzer等人(1991) Nucleic Acids Res 19: 5081; Ohtsuka等人(1985) J Biol Chem 260: 2605-2608;和Rossolini等 人(1994) Mol Cell Probes 8:91-98。
術(shù)語(yǔ)"TiT還包括包含T2R核酸、優(yōu)選"W7f的子序列和延長(zhǎng)序 列的核酸,包括T2R核酸的互補(bǔ)核酸、T2R RM分子、和T2R RNA的 互補(bǔ)核酸(cRNA)。
術(shù)語(yǔ)"子序列"指包含較長(zhǎng)的核酸序列的部分的核酸序列。示例 性子序列是如上文描述的探針或者引物。本文使用的術(shù)語(yǔ)"引物"指 包含所選核酸分子的約8個(gè)或更多脫氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸, 優(yōu)選10-20個(gè)核苷酸,更優(yōu)選20 - 30個(gè)核苷酸的連續(xù)序列。本發(fā)明 的引物包括足夠長(zhǎng)度和合適序列的寡核苷酸,以便啟動(dòng)本發(fā)明的核酸 分子的聚合。
術(shù)語(yǔ)"延長(zhǎng)的序列"指摻入核酸中的核苷酸(或者其他類似分子) 的加入。例如,聚合酶(例如,DNA聚合酶)可以在核酸分子的3,末 端加入序列。此外,核苷酸序列可以與其他DNA序列,如啟動(dòng)子、啟 動(dòng)子區(qū)、增強(qiáng)子、多聚腺苷酸化信號(hào)、內(nèi)含子序列、額外的限制酶位 點(diǎn)、多克隆位點(diǎn)和其他編碼區(qū)段組合。
如本文所用的術(shù)語(yǔ)"互補(bǔ)序列"表示包含反平行的核苷酸序列的 核苷酸序列,所述反平行的核苷酸序列當(dāng)在堿基對(duì)之間形成氫鍵時(shí)能 夠相互配對(duì)。如本文使用的術(shù)語(yǔ)"互補(bǔ)序列"指核苷酸序列,其如通 過(guò)下文給出的相同核苷酸比較方法可以評(píng)估的為實(shí)質(zhì)上互補(bǔ)的,或者 定義為在如本文所述的那些相對(duì)嚴(yán)格條件下與所討論的核酸片段雜 交?;パa(bǔ)核酸片段的具體實(shí)例是反義寡核苷酸。
本發(fā)明還提供了包含所公開(kāi)的77A7(f核酸和重組7^ 7f核酸的嵌 合基因。從而,還包括構(gòu)建體和載體,其包含7^ 76核酸,任選與其 他T2R核酸組合表達(dá)。任何DNA區(qū)段。基因包 括序列,包括但不限于編碼序列、啟動(dòng)子區(qū)、順式調(diào)節(jié)序列、非表達(dá) 的DNA區(qū)段,其是調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的特定識(shí)別序列,促進(jìn)基因表達(dá)的非表 達(dá)的DNA區(qū)段、設(shè)計(jì)成具有希望的參數(shù)的DNA區(qū)段,或者其組合。通 過(guò)多種方法可以得到基因,所述方法包括從生物樣品克隆、基于已知 的或者預(yù)測(cè)的序列信息合成,和現(xiàn)有序列的重組衍生。
如本文所用的術(shù)語(yǔ)"嵌合基因"指有效連接T2R序列的啟動(dòng)子區(qū), 所述T2R序列為例如T2RcDNA、編碼反義RNA分子的T2R核酸、編碼 具有三級(jí)結(jié)構(gòu)(例如,發(fā)夾結(jié)構(gòu))的MA分子的T2R核酸或者編碼雙 鏈RNA分子的T2R核酸。術(shù)語(yǔ)"嵌合基因"還指有效連接異源序列的 T2R啟動(dòng)子區(qū)。本發(fā)明的嵌合基因的制備在實(shí)施例2中描述。優(yōu)選地, T2R是"腐。
如本文使用的術(shù)語(yǔ)"有效連接"指啟動(dòng)子區(qū)和核苷酸序列之間的 功能組合,使得該核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄受到啟動(dòng)子區(qū)的控制和調(diào)節(jié)。將 啟動(dòng)子區(qū)有效連接到核苷酸序列的技術(shù)是本領(lǐng)域已知的。
術(shù)語(yǔ)"重組的" 一般指可以在非天然環(huán)境中復(fù)制的分離的核酸。 從而,重組核酸可以包含不可復(fù)制的核酸與額外的核酸,如載體核酸 的組合,所述額外的核酸使得所述不可復(fù)制的核酸在宿主細(xì)胞中復(fù)制。
術(shù)語(yǔ)"載體"在本文中用于指核酸分子,其具有使得它可以在宿 主細(xì)胞中復(fù)制的核苷酸序列。載體還可以包括核苷酸序列以允許載體 內(nèi)的核苷酸序列的連接,其中此類核苷酸序列也在宿主細(xì)胞中復(fù)制。 代表性載體包括質(zhì)粒、黏粒和病毒載體。載體還可以介導(dǎo)7^ 76多肽 的重組產(chǎn)生,如下文中進(jìn)一步描述。
如本文使用的術(shù)語(yǔ)"構(gòu)建體"描述包含表達(dá)構(gòu)建體的一類構(gòu)建體, 指還包含可操作地插入到載體中的核苷酸序列的載體,從而所述核苷 酸序列被重組表達(dá)。
術(shù)語(yǔ)"重組表達(dá)"或者"重組產(chǎn)生"在可以互換使用, 一般指重 組核酸所編碼的多肽借以產(chǎn)生的方法。
從而,優(yōu)選地,重組T2R、核酸,即"y 76核酸包含異源核酸。術(shù)語(yǔ)"異源核酸"指序列,其來(lái)自目的宿主細(xì)胞外來(lái)的來(lái)源,或者如 果來(lái)自相同來(lái)源,那么與其指出形式相比被修飾。宿主細(xì)胞中的異源
順式調(diào)節(jié)序列分離修飾的核酸。異源核酸還包括天然核苷酸序列的非 天然存在的多個(gè)拷貝。異源核酸還可以包括摻入到宿主細(xì)胞核酸中某 個(gè)位置的核酸,其中在該位置上通常沒(méi)有發(fā)現(xiàn)此類核酸。
可以克隆、合成、改變、誘變或者其組合得到本發(fā)明的核酸。用
于分離核酸的標(biāo)準(zhǔn)的重組DM和分子克隆技術(shù)是本領(lǐng)域中已知的。用 于產(chǎn)生堿基改變、缺失或者小插入的位點(diǎn)特異誘變是本領(lǐng)域已知的。 見(jiàn)例如,Sambrook等人 (eds.) (1989) Molecular Cloning Laboratory Manual . Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York; Silhavy等人 (1984) Experiments with Gene Fusions. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York; Glover & Hames (1995) DNA Cloning: A Practical Approach. 2nd ed. IRL Press at Oxford University Press, Oxford/New York; Ausubel (ed.) (1995) Short Protocols in Molecular Biology, 3rd ed. Wiley, New York。
III.B. r^7^多肽
本發(fā)明提供了新的T7i 7f多肽,其代表性實(shí)施方案以SEQ IDNOs: 2 給出。優(yōu)選地,本發(fā)明的分離的7^ 7f多肽包含重組表達(dá)的T7i 76多 肽。還優(yōu)選地,分離的7^ 7f多肽包含功能T^ 7^多肽。這些"y 76 多肽可以與一種或多種其他T2R多肽組合表達(dá)。
從而,用于本發(fā)明方法中的新的r^ 76多肽包含(a) SEQ ID N0: 2 的多肽;(b)與SEQ ID NO: 2實(shí)質(zhì)上相同的多肽;(c) SEQ ID NO: 1 的核酸分子編碼的多肽;或者(d)與SEQ ID NO: 1實(shí)質(zhì)上相同的核酸 分子編碼的多肽。7^ 76多肽還可以包含(a)編碼SEQ ID NO: 2的 多肽的分離的核酸分子;(b) SEQ IDNO: 1的分離的核酸分子;(c)分 離的核酸分子,其在小于約200 mM鹽濃度的洗涂溶液和大于約45'C的洗滌溫度代表的洗滌嚴(yán)格條件下與77i 76核酸序列雜交,并且其編 碼77v 7^多肽;和(d)分離的核酸分子,其由于遺傳密碼簡(jiǎn)并性而在 核酸序列上與上面(a)、 (b)和(c)之一的分離的核酸分子相差至少一個(gè) 功能上等同的密碼子,并且編碼上面(a)、 (b)和(c)之一的分離的核酸 分子所編碼的7^ 76多肽。
如本文使用的術(shù)語(yǔ)"實(shí)質(zhì)上同一的"描述T2R和與其實(shí)質(zhì)上同一 的蛋白質(zhì)之間的相似性水平,指與其至少75%同一的蛋白質(zhì)。例如, 對(duì)于不可復(fù)制的核酸和與該7^ 7d"蛋白質(zhì)實(shí)質(zhì)上同一的蛋白質(zhì)的情 況,這指當(dāng)在7^ 76蛋白質(zhì)的全長(zhǎng)上比較時(shí),與SEQ ID N0:2至少約 75%同一的序列。優(yōu)選地,與7^ 7f蛋白質(zhì)實(shí)質(zhì)上同一的蛋白質(zhì)包含 當(dāng)在7^ 76多肽的全長(zhǎng)上比較時(shí),與SEQ ID NO: 2至少約75°/。到約85 %同一,更優(yōu)選與SEQ IDN0: 2至少約85%到約95%同一,甚至更優(yōu) 選與SEQ ID N0:2至少約90%到約95%同一,更優(yōu)選與SEQ ID NO: 2 至少約95%到約99%同一,即,與SEQ ID NO: 2 86、 97、 98或99%
同一的氨基酸序列。
術(shù)語(yǔ)"全長(zhǎng)"指功能性7"^ 7(f多肽,如下文進(jìn)一步描述。用于確 定兩個(gè)多肽之間百分比同一性的方法也在標(biāo)題為"核苷酸和氨基酸序 列比較"的下文中定義。
術(shù)語(yǔ)"實(shí)質(zhì)上同一的"當(dāng)用于描述多肽時(shí),還包括共有保守的三 維結(jié)構(gòu)的兩種或多種多肽??梢杂糜?jì)算方法比較結(jié)構(gòu)表示,并且可以
產(chǎn)生結(jié)構(gòu)模型并容易地調(diào)節(jié)以鑒定重要的活性位點(diǎn)或者配體結(jié)合位點(diǎn) 周圍的相似性。見(jiàn)Saqi等人(1999) Bioinformatics 15: 521-522; Barton (1998) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 54: 1139-1146; Henikoff等人(2000) Electrophoresis 21: 1700-1706;和Huang等 人(2000) Pac Syrap Bio函put: 230-241。
實(shí)質(zhì)上同一的蛋白質(zhì)還包括包含與SEQ ID NO: 2的氨基酸功能上 等同的氨基酸的蛋白質(zhì)。在氨基酸上下文中,術(shù)語(yǔ)"功能上等同的" 是本領(lǐng)域中已知的并且基于氨基酸側(cè)鏈取代基的相對(duì)相似性。見(jiàn) Henikoff & Henikoff (2000) Adv Protein Chem 54:73-97??紤]的相關(guān)因素包括側(cè)鏈?zhǔn)杷浴⒂H水性、電荷和大小。例如,精氨酸、賴
氨酸和組氨酸都是陽(yáng)性電荷的殘基;丙氨酸、甘氨酸和絲氨酸都是相 似大?。徊⑶冶奖彼?、色氨酸和酪氨酸都具有通常相似的形狀。通 過(guò)如下文中進(jìn)一步描述的該分析,精氨酸、賴氨酸和組氨酸;丙氨酸、 甘氨酸和絲氨酸;和苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸都在本文中定義為生 物學(xué)上的功能等同物。
在進(jìn)行生物學(xué)上功能等同的氨基酸替代時(shí),可以考慮氨基酸的親 水指數(shù)。每個(gè)氨基酸已經(jīng)基于它們的疏水性和電荷特征指定親水指數(shù), 這些是異亮氨酸(+4. 5);纈氨酸(+4. 2);亮氨酸(+3. 8);苯丙氨酸 (+ 2. 8);半胱氨酸(+ 2. 5);曱硫氨酸(+1. 9);丙氨酸(+ 1. 8);甘氨酸 (0. 4 );蘇氨酸(-0. 7);絲氨酸(-0. 8);色氨酸(-0. 9);酪氨酸(-l. 3); 脯氨酸(-1. 6);組氨酸(-3. 2);谷氨酸(-3. 5);谷氨酰胺(-3. 5);天冬 氨酸(-3. 5);天冬酰胺(-3. 5);賴氨酸(-3. 9)和精氨酸(4. 5)。
親水氨基酸指數(shù)在賦予蛋白質(zhì)的相互作用生物學(xué)功能中的重要性 是本領(lǐng)域中公知的(Kyte等人,1982)。已知某些氨基酸可以替代具有
相似親水指數(shù)或者得分的其他氨基酸并且仍然保留相似的生物活性。 在基于親水指數(shù)做出改變中,優(yōu)選替代親水指數(shù)在最初值的±2以內(nèi) 的氨基酸,尤其優(yōu)選在最初值±1以內(nèi)的那些氨基酸,更尤其優(yōu)選在 最初值± 0. 5以內(nèi)的那些氨基酸。
本領(lǐng)域中還理解可以基于親水性有效做出相似氨基酸的替代。美 國(guó)專利號(hào)4, 554, 101描述蛋白質(zhì)的最大的局部平均疏水性(如受到它
的相鄰氨基酸的親水性控制)與它們的免疫原性和抗原性相關(guān),例如, 與該蛋白質(zhì)的生物學(xué)性質(zhì)相關(guān)??梢岳斫獍被峥梢蕴娲哂邢嗨频?親水性值的另一氨基酸并且仍然得到生物學(xué)上等同的蛋白質(zhì)。
如美國(guó)專利號(hào)4, 554, 101中詳述的,已經(jīng)將下面的親水性值指定 給氨基酸殘基精氨酸(+3. 0);賴氨酸(+3. 0);天冬氨酸(+3. 0 ± 1);谷 氨酸(+3. 0 ± 1);絲氨酸(+0. 3);天冬酰胺(+0. 2);谷氨酰胺(+0. 2);甘 氨酸(0);蘇氨酸(-O. 4);脯氨酸(-0. 5 ± 1);丙氨酸(-O. 5);組氨酸 (一O. 5);半胱氨酸(-1. 0);甲硫氨酸(-1, 3);纈氨酸(-1. 5);亮氨酸(-1.8);異亮氨酸(-1.8);色氨酸(-2. 3);苯丙氨酸(-2. 5);色氨酸 (-3. 4)。
在基于相似的親水性值做出改變時(shí),優(yōu)選親水性值在最初值的± 2 以內(nèi)的氨基酸,尤其優(yōu)選親水性值在最初值的±1以內(nèi)的氨基酸,甚 至更優(yōu)選親水性值在最初值的± 0. 5以內(nèi)的氨基酸。
術(shù)語(yǔ)"實(shí)質(zhì)上同一的"還包括T2R多肽的生物學(xué)功能等同物的多 肽,例如7^ 7f多肽。術(shù)語(yǔ)"功能的"包括7^ 7(f多肽的活性,例如, 激活細(xì)胞內(nèi)信號(hào)途徑(例如,與味轉(zhuǎn)導(dǎo)素偶聯(lián))和介導(dǎo)味覺(jué)。優(yōu)選地, 此類激活表明了與同源T2R多肽,例如體內(nèi)77i 7《多肽實(shí)質(zhì)上相似的 強(qiáng)度和動(dòng)力學(xué)。在下文描述了評(píng)估ri^7f活性的代表性方法。
本發(fā)明還提供了 r"M多肽的功能片段。此類功能部分不必包含 天然r^7f基因產(chǎn)物的全部或者基本上全部的氨基酸序列。
本發(fā)明還包括功能多肽序列,其序列比天然T2R多肽,例如,r^7f 多肽的更長(zhǎng)。例如,可以向T2R多肽,例如,7^ 76多肽的N末端或 者C-末端加入一個(gè)或多個(gè)氨基酸。此類額外的氨基酸可以用于多種應(yīng) 用,包括但不限于,純化應(yīng)用。制備延長(zhǎng)的蛋白質(zhì)的方法是本領(lǐng)域已 知的。
II. C.核苷酸和氨基酸序列比較
在兩個(gè)或多個(gè)核苷酸或者多肽序列背景中,術(shù)語(yǔ)"同一的"或者 "百分比同一性,,指兩個(gè)或多個(gè)序列或者子序列,其當(dāng)比較和比對(duì)以 得到最大對(duì)應(yīng)性時(shí),是相同的或者具有特定百分比的相同氨基酸殘基 或者核苷酸,如使用本文公開(kāi)的序列比較算法之一或者通過(guò)視覺(jué)檢查測(cè)量。
關(guān)于核苷酸或者多肽序列的術(shù)語(yǔ)"實(shí)質(zhì)上同一的"指特定序列與 天然存在的序列相差一個(gè)或多個(gè)缺失、替代,或者添加,其凈效果是 保留T2R核酸或者多肽,例如7^7 7f核酸或者"v 76多肽的生物功能。
為了比較兩個(gè)或多個(gè)序列,通常一個(gè)序列作為參考序列, 一個(gè)或 多個(gè)測(cè)試序列與其相比較。當(dāng)使用序列比較算法時(shí),而測(cè)試和參考序列進(jìn)入計(jì)算機(jī)程序,如果必要,指定子序列坐標(biāo),并選擇序列算法程 序參數(shù)。然后序列比較算法基于所選的程序參數(shù),計(jì)算指定的測(cè)試序 列相對(duì)于參考序列的百分比序列同一性。
例如,通過(guò)Smith & Water, (1981) Adv Appl Math 2: 482-489 的局部同源性算法,通過(guò)Needleman & Wunsch (1970) J Mol Biol 48: 443-453的同源性比對(duì)算法,通過(guò)Pearson & Lipman (1988) Proc Natl Acad Sci USA 85: 2444-2448的相似性算法搜索,通過(guò)這些算范 的計(jì)算機(jī)化實(shí)現(xiàn)(Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, Madison, Wisconsin中的GAP、 BESTFIT、 FASTA和 TFASTA),或者通過(guò)視覺(jué)檢查,可以進(jìn)行用于比較的序列的最佳比對(duì)。 一般見(jiàn)Ausubel (ed.) (1995) Short Protocols in Molecular Biology 3rd ed. Wiley, New York。
用于確定百分比序列同一性和序列相似性的優(yōu)選的算法是BLAST 算法,其在Altschul等人(1990) J Mol Biol 215: 403-410中描述。 用于進(jìn)行BLAST分析的軟件可以通過(guò)National Center for Biotechnology Information (http: //www, ncbi. nlm. nih. gov/)公開(kāi) 得到。該算法涉及首先通過(guò)鑒定查詢序列中長(zhǎng)為W的短字鑒定高得分 序列對(duì)(HSP),其當(dāng)與數(shù)據(jù)庫(kù)序列中相同長(zhǎng)度的字比較時(shí)匹配或者滿 足某個(gè)正值閾值得分T。將T稱作臨近字得分閾值。這些最初的臨近 字命中(word hit)作為起始搜索以發(fā)現(xiàn)含有它們的更長(zhǎng)HSP的種子。 然后字命中沿著每條序列在兩個(gè)方向上延伸,只要可以增加累積比對(duì)
得分。對(duì)于核苷酸序列,使用參數(shù)M (—對(duì)匹配殘基的獎(jiǎng)賞得分;總 是>0)和N(錯(cuò)配殘基的罰分;總是〈0)計(jì)算累積得分。對(duì)于氨基酸序 列,用得分矩陣計(jì)算累積得分。當(dāng)累積比對(duì)得分從實(shí)現(xiàn)的它的最大值 下降量X,由于一個(gè)或多個(gè)負(fù)得分殘基比對(duì)的積累使得累積得分達(dá)到0 或者以下,或者達(dá)到任一序列的末端時(shí),字命中在每個(gè)方向上的延伸 停止。BLAST算法參數(shù)W、 T和X決定比對(duì)的靈敏性和速度。BLASTN 程序(用于核苷酸序列)使用字長(zhǎng)W=ll、期望值E-IO、截?cái)?00, M=5、 4和兩條鏈的比較作為默認(rèn)值。對(duì)于氨基酸序列,BLASTP程序使用字長(zhǎng)(W) 3、期望(E) 10和BLOSUM62得分矩陣作為默認(rèn)值。 見(jiàn) Henikoff & Henikoff (11992) Proc Natl Acad Sci USA 89: 10915-10919。
除了計(jì)算百分比序列同一性外,BLAST算法還進(jìn)行兩個(gè)序列之間 相似性的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。見(jiàn)例如,Karlin & Altschul (1993) Proc Natl Acad Sci U S A 90:5873-5877。 BLAST算法提供的相似性的一種測(cè)量 是最小總和概率(P(N)),其提供了兩個(gè)核苷酸或者氨基酸序列之間將 偶然發(fā)生匹配的概率。例如,如果測(cè)試核酸序列與參考核酸序列的比 較中的最小總和概率小于約0. 1,更優(yōu)選小于約O. 01,最優(yōu)選小于約 0. 001,那么認(rèn)為測(cè)試核酸序列與參考序列相似。
III檢測(cè)7^ 7《核酸的方法
在本發(fā)明的另一方面,提供了檢測(cè)編碼7^ 7f多肽的核酸分子的 方法。此類方法可以用于檢測(cè)7^ 7f基因變體或者改變的基因表達(dá)。 例如,r^ 76序列或者表達(dá)改變的檢測(cè)可以用于診斷味覺(jué)中7^ 7d"相 關(guān)差異。優(yōu)選地,用于該方法的核酸包含SEQ ID NO:l的序列。
通過(guò)本發(fā)明的方法檢測(cè)的序列可以通過(guò)本領(lǐng)域公知的任何措施, 使用通常用于檢測(cè)特定MA序列的任一方法檢測(cè)、亞克隆、測(cè)序和進(jìn) 一步評(píng)估。從而,本發(fā)明的核酸可以用于克隆包含所公開(kāi)的序列的基 因和基因組DNA。備選地,本發(fā)明的核酸可以用于克隆相關(guān)序列的基 因和基因組DNA。使用本文公開(kāi)的核酸序列,此類方法是本領(lǐng)域技術(shù) 人員已知的。見(jiàn)例如,Sambrook等編著(1989) Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York。代表性方法也在實(shí)施例1 - 4中公開(kāi)。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中,通過(guò)例如使用RT-PCR測(cè)定法測(cè)量 7^ 7<5"核酸分子的水平。見(jiàn)Chiang (1998) J Chromatogr A 806:209-218,和其中引用的參考文獻(xiàn)。
在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中,基于本發(fā)明的核酸分子的遺傳測(cè)定 法可以用于篩選遺傳變體,例如,通過(guò)等位基因特異性寡核苷酸(ASO)探針?lè)治?Conner等人,1983)、寡核苷酸連接測(cè)定法(OLA )(Nickerson 等人,1990)、單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)分析(Orita等人,1989) 、 SSCP/ 異源雙鏈體分析、酶錯(cuò)配切割、擴(kuò)增的外顯子的直接序列分析(KesU1 a 等人,1998; Yuan等人,1999)、等位基因特異性雜交(Stoneking等 人,1991)、和擴(kuò)增的舍有特定突變的基因組DNA的限制性分析。也可 以用自動(dòng)化方法大規(guī)模表征單核苷酸多態(tài)性(Wang等人,1998;. Brookes, 1999)。優(yōu)選的檢測(cè)方法是非電泳的,包括例如,TAQMAN TM 等位基因辨別測(cè)定法、PCR-0LA、分子信標(biāo)、持鎖探針和熒光。見(jiàn) Landegren等人(1998) Genome Res 8:769-776和其中引用的參考文 獻(xiàn)。
IV.用于重組表達(dá)n76多肽的系統(tǒng)
本發(fā)明還提供了用于表達(dá)本發(fā)明的重組"/ 76多肽的系統(tǒng)。該 CT76多肽可以與一種或多種其他T2R —起表達(dá),所述其他T2R可以 是人或非人T2R。此類系統(tǒng)可以用于7^ 7f多肽的隨后純化和/或表征。 例如,純化的7^ M多肽可以用作產(chǎn)生7^ 76抗體的免疫原,如下文 進(jìn)一步描述。
用于重組表達(dá)n/ 7f多肽的系統(tǒng)還可以用于鑒定rw;^多肽的調(diào)
節(jié)劑。備選地,當(dāng)測(cè)定其他測(cè)試多肽的激活時(shí),所公開(kāi)的T^ 7^多肽 可以用作對(duì)照多肽。此類測(cè)試多肽可以包括涉及味覺(jué)的其他T2R,例 如,Adler等人(2000) Cel 1 100: 693-702和Matsunami等人(2000) Nature 601-603中公開(kāi)的那些多肽的任一種。
術(shù)語(yǔ)"表達(dá)系統(tǒng)"指宿主細(xì)胞,其包含異源核酸和該異源核酸編 碼的多肽。例如,異源性表達(dá)系統(tǒng)可以包含用包含重組7^ "核酸的 構(gòu)建體轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞、用r^76cRM轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞,或者通過(guò)向 宿主細(xì)胞基因組中導(dǎo)入異源核酸產(chǎn)生的細(xì)胞系。如所提到的,這些表 達(dá)系統(tǒng)可以包括其他T2R核酸。
用于重組表達(dá)7^ 76多肽的系統(tǒng)可以包含(a)重組表達(dá)的 多肽;和(b)包含重組表達(dá)的T^ 7f多肽的宿主細(xì)胞。例如,可以在 體外轉(zhuǎn)錄7Z 7(5"cRNA然后導(dǎo)入宿主細(xì)胞中,從而表達(dá)"y 7f多肽。該系統(tǒng)可以還包含一種或多種額外的T2R多肽,以便產(chǎn)生包含7"W7f和 另 一種T2R多肽的異聚體T2R受體。
用于重組表達(dá)"y 76多肽的系統(tǒng)可以還包含(a)包含有效連接 到異源啟動(dòng)子的編碼T^ 7f多肽的載體和核酸分子的構(gòu)建體;和(b) 包含(a)的構(gòu)建體的宿主細(xì)胞,其中該宿主細(xì)胞表達(dá)h7^ 7f多肽。 該系統(tǒng)可以還包含編碼一種或多種額外T2R多肽的構(gòu)建體。此外,單 個(gè)構(gòu)建體自身可以編碼7^ 7f多肽和一種或多種額外的T2R多肽。
使用技術(shù)人員已知的多種標(biāo)準(zhǔn)技術(shù),可以純化和表征分離的多肽 和重組產(chǎn)生的多肽。見(jiàn)例如,Schr6der & Liibke (1965) The Peptides. Academic Press, New York; Schneider & Eberle (1993) Peptides, 1992: Proceedings of the Twenty—Second European Peptide Symposium, September 13-19, 1992, Interlaken, Switzerland. Bscom, Leiden; Bodanszky (1993) Principles of Peptide Synthesis 2nd rev. ed. Springer-Verlag, Berlin/ New York; Ausubel (ed.) (1995) Short Protocols in Molecular Biology , 3rd ed. Wiley, New York。
優(yōu)選地,重組表達(dá)的T^ 76多肽包含功能味道感受器,更優(yōu)選地 苦味感受器。從而,重組表達(dá)的r"7f多肽優(yōu)選應(yīng)答苦味化合物顯示 出活性。還優(yōu)選地,重組的T^ 7^多肽顯示出類似于天然7^ 7f多肽 的激活應(yīng)答。在下文中描述了用于測(cè)定T^W7^功能的代表性方法。
IV. A.表達(dá)構(gòu)建體
用于表達(dá)7^ 7f多肽的構(gòu)建體包括載體和77i 76核苷酸序列,其 中7^ 7f核苷酸序列有效連接到啟動(dòng)子序列。用于重組7^ 7f表達(dá)的 構(gòu)建體還可以包含轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)和核苷酸序列的正確翻譯所需的序 列。表達(dá)構(gòu)建體的制備,包括翻譯和終止信號(hào)序列的加入,是本領(lǐng)域 技術(shù)人員已知的。
使用組成型啟動(dòng)子或者誘導(dǎo)型啟動(dòng)子,可以指導(dǎo)T2R多肽,例如 77/ 76多肽的重組產(chǎn)生??梢愿鶕?jù)本發(fā)明使用的代表性啟動(dòng)子包括猿猴病毒40早期啟動(dòng)子、來(lái)自逆轉(zhuǎn)錄病毒的長(zhǎng)末端重復(fù)啟動(dòng)子、熱休克 啟動(dòng)子和金屬硫蛋白。
可以用于表達(dá)7"Z 7f多肽的合適的栽體包括但不限于病毒,如痘 苗病毒或者腺病毒、桿狀病毒載體、酵母載體、噬菌體載體(例如, 入噬菌體)、質(zhì)粒和勦粒DNA載體、轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化載體和其衍生 物。
使用與所用的栽體相容的轉(zhuǎn)染方法向宿主細(xì)胞中導(dǎo)入構(gòu)建體。標(biāo) 準(zhǔn)轉(zhuǎn)染方法包括電穿孔、DEAE-葡聚糖轉(zhuǎn)染、磷酸鈣沉淀、脂質(zhì)體介 導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、使用逆轉(zhuǎn)錄病毒感染、微粒介導(dǎo)的基 因轉(zhuǎn)移、高速基因轉(zhuǎn)移和其組合。
IV. B.宿主細(xì)胞
如本文所用的術(shù)語(yǔ)"宿主細(xì)胞"指可以導(dǎo)入異源核酸分子的細(xì)胞。 可以使用任何合適的宿主細(xì)胞,包括但不限于,真核宿主,如哺乳動(dòng) 物細(xì)胞(例如,HEK-293細(xì)胞、CHO細(xì)胞、BHK細(xì)胞、MDCK細(xì)胞、HeLa 細(xì)胞、CV-1細(xì)胞、COS細(xì)胞)、兩棲類動(dòng)物細(xì)胞(例如,爪蟾卵母細(xì) 胞)、昆蟲(chóng)細(xì)胞(例如,Sf9細(xì)胞)、酵母細(xì)胞以及原核宿主,如大 腸桿菌(E. coli)和枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)。優(yōu)選的 宿主細(xì)胞實(shí)質(zhì)上缺少rM76多肽并且將優(yōu)選包含人或者其他哺乳動(dòng)物 細(xì)胞。
可以選擇調(diào)節(jié)重組序列的表達(dá)或者以所希望的特定方式修飾和加 工基因產(chǎn)物的宿主細(xì)胞林系。例如,不同的宿主細(xì)胞對(duì)于翻譯和翻譯 后加工和修飾(例如,蛋白質(zhì)的糖基化、磷酸化)具有特征性和特定 機(jī)制??梢赃x擇合適的細(xì)胞系或者宿主系統(tǒng)來(lái)確保表達(dá)的外源蛋白質(zhì) 的所希望的修飾和加工。例如,細(xì)菌系統(tǒng)中的表達(dá)可以用于產(chǎn)生非糖 基化的核心蛋白產(chǎn)物,并且酵母中的表達(dá)將產(chǎn)生糖基化的產(chǎn)物。
本發(fā)明還包含7^ 76多肽在穩(wěn)定細(xì)胞系中的重組表達(dá)。異源構(gòu)建 體轉(zhuǎn)化到宿主細(xì)胞后,產(chǎn)生穩(wěn)定細(xì)胞系的方法是本領(lǐng)域公知的。見(jiàn)例 如,Joyner (1993) Gene Tarneting: A Practical Approach. OxfordUniversity Press, Oxford/New York。從而,將轉(zhuǎn)化的細(xì)胞、組織 或者非人生物理解為不僅包括轉(zhuǎn)化過(guò)程的終產(chǎn)物,還包括其轉(zhuǎn)基因后 代或者繁殖的形式。
本發(fā)明還包括表達(dá)如本文公開(kāi)的重組ni 76多肽的細(xì)胞的冷藏。 從而,可以將瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞和表達(dá)7"7^的穩(wěn)定細(xì)胞系的細(xì)胞冷凍 并保持備用??梢匀菀椎剡\(yùn)輸冷凍的細(xì)胞以在遠(yuǎn)距離的地點(diǎn)使用。
冷藏培養(yǎng)基通常由基本培養(yǎng)基、冷藏劑和蛋白質(zhì)來(lái)源組成。冷藏 劑和蛋白質(zhì)保護(hù)細(xì)胞免于凍融過(guò)程的脅迫。對(duì)于含有血清的培養(yǎng)基, 將典型的冷藏培養(yǎng)基制備為含有10%甘油的完全培養(yǎng)基;含有10% DMS0(二甲亞砜)的完全培養(yǎng)基,或者具有50%新鮮培養(yǎng)基與10%甘 油或者10%DMSO的5. 0%細(xì)胞條件培養(yǎng)基。對(duì)于無(wú)血清的培養(yǎng)基,典 型的冷藏制劑包括50%無(wú)血清的細(xì)胞條件培養(yǎng)基與含有7. 5% DMS0的 50%新鮮的無(wú)血清培養(yǎng)基;或者含有7.5% DMS0和10%細(xì)胞培養(yǎng)級(jí) DMSO的新鮮的無(wú)血清培養(yǎng)基。優(yōu)選地,將包含約106到約10'個(gè)細(xì)胞/ml 的細(xì)胞懸浮液與冷藏培養(yǎng)基混合。
在小瓶或者其他適于冷藏的容器,如NUNC⑥CRYOTUBESTM (可從 Applied Scientific of South San Francisco, California得到) 中組合細(xì)胞與冷藏培養(yǎng)基。可以將細(xì)胞等分到多孔板,如設(shè)計(jì)用于高 通量測(cè)定法的96孔板的孔中,并以平板接種的形式冷凍。
優(yōu)選以約-l'C/分鐘的速度將細(xì)胞從室溫冷卻到保藏溫度??梢钥?制冷卻溫度,例如,通過(guò)將含有細(xì)胞的小瓶置于具有約1升液體容量 的絕緣的充水貯器中,并將這種立方體置于-70匸的機(jī)械冷凍機(jī)中。 備選地,可以如下以約-lt:/分鐘控制細(xì)胞冷卻速度將小瓶浸入一 定體積的液體冷凍劑,如脂肪族醇中,液體冷凍劑的體積為待冷凍的 細(xì)胞培養(yǎng)物總體積的15倍以上,并將浸入的培養(yǎng)瓶置于常規(guī)冷凍機(jī)中 低于約-70。C的溫度下。也可以利用用于冷凍細(xì)胞的商業(yè)裝置,如 Planer Mini-Freezer R202/200R (Planer Products Ltd. of Great Britain) 和BF-5 Biological Freezer (Union Carbide Corporation of Danbury, Connecticut, United States of America)。優(yōu)選地,將冷凍的細(xì)胞在或者低于約-70X:到約-80'C ,更優(yōu)選在或者低于約 -130匸保藏。
為了得到最可能的細(xì)胞存活,必須盡可能快地解凍細(xì)胞。 一旦從 冷藏取出了含有冷凍的細(xì)胞的小瓶或者其他貯器,那么應(yīng)該將它直接
置于37。C水浴中并溫和搖動(dòng)直到它完全解凍。如果細(xì)胞對(duì)于冷藏劑尤 其敏感,那么在進(jìn)一步生長(zhǎng)前,可以將細(xì)胞離心以除去冷藏劑。
用于制備和處理冷凍細(xì)胞的額外方法可以見(jiàn)Freshney (1987) Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique. 2nd ed. A. R. Liss, New York和美國(guó)專利號(hào)6, 176, 089; 6,140,123; 5, 629,145和4, 455,842;等等。
V.轉(zhuǎn)基因動(dòng)物
本發(fā)明還提供了轉(zhuǎn)基因動(dòng)物,其包含7^ M基因表達(dá)的破壞和任 選另一種T2R破壞子。改變的基因表達(dá)可以包括表達(dá)改變水平的r"7f 基因或者r^7^基因的突變變體。本發(fā)明還提供了編碼7^ 7f的核酸, 其可以用于制備用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的構(gòu)建體。還提供了用于制備靶 定77W76基因座的構(gòu)建體的基因組定位數(shù)據(jù)。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中,轉(zhuǎn)基因動(dòng)物可以包括具有小鼠 76基因座的定向修飾的小鼠并且可以還包括在所有體細(xì)胞中具有 r^7f基因的完整或者部分功能失活的小鼠品系。
在備選實(shí)施方案中,使用通用的或者組織特異性啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的反
義或者核糖體r"7^構(gòu)建體制備本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物,以降低體細(xì)胞
中7^ 7f基因表達(dá)水平,從而實(shí)現(xiàn)"下調(diào)(knock-down)"表型。本 發(fā)明還提供了產(chǎn)生具有7^ 76的條件或者可誘導(dǎo)的失活的鼠品系。此 類鼠品系還可以包括額外合成或者天然存在的突變,例如,任何其他 T2R基因中的突變。
本發(fā)明還提供了在7^ 7《基因中具有特定"上調(diào)(Knock-in)" 修飾的小鼠品系,例如,以產(chǎn)生過(guò)表達(dá)或者顯性失活表型。從而,"敲 入,,修飾包括表達(dá)野生型和突變形式的編碼7^ %多肽的核酸。用于制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的技術(shù)是本領(lǐng)域已知的。示例性技術(shù)在美國(guó)
專利號(hào)5, 489, 742(轉(zhuǎn)基因大鼠);美國(guó)專利號(hào)4, 736, 866, 5, 550, 316, 5, 614, 396, 5, 625,125和5, 648,061 (轉(zhuǎn)基因小鼠);美國(guó)專利號(hào) 5, 573, 933 (轉(zhuǎn)基因豬);5,162,215 (轉(zhuǎn)基因鳥(niǎo)種類)和美國(guó)專利號(hào) 5,741, 957 (轉(zhuǎn)基因牛種類)中描述,將它們的內(nèi)容都完整引入本文作 為參考。
例如,本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物可以包含具有小鼠7^ 7f的定向修飾 的小鼠。使用位點(diǎn)特異性重組的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)用鼠胚胎干細(xì)胞可以產(chǎn)生在 所有體細(xì)胞中具有7^ 76基因的完全或部分功能失活的小鼠品系。見(jiàn) Capecchi (1989) Science 244: 1288-1292; Thomas & Capecchi (1990) Nature 346: 847-850;和Delpire等人(1999) Nat Genet 22: 192195。
VI."豬抗體
在本發(fā)明的另一方面,提供了產(chǎn)生特異結(jié)合"i 76多肽的抗體的 方法。根據(jù)該方法,配制全長(zhǎng)重組77i 76多肽使得它可以用作有效免 疫原,并用于免疫動(dòng)物以便在動(dòng)物中產(chǎn)生免疫應(yīng)答。免疫應(yīng)答的特征 是產(chǎn)生抗體,其可以從動(dòng)物的血清中收集。本發(fā)明還提供了通過(guò)使用 本文公開(kāi)的新的7^ 7f多肽,包括SEQ ID NO: 2的方法產(chǎn)生的抗體。
術(shù)語(yǔ)"抗體"指免疫球蛋白蛋白質(zhì),或者其功能部分,包括多克 隆抗體、單克隆抗體、嵌合抗體、雜合抗體、單鏈抗體、誘變的抗體、 人源化抗體和包含抗原結(jié)合部位的抗體片段(例如,F(xiàn)ab和Fv抗體片 段)。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中,"i 7f抗體包含單克隆抗體。從 而,本發(fā)明還可以包括抗體和產(chǎn)生如本文所述的單克隆抗體的細(xì)胞系。
術(shù)語(yǔ)"特異結(jié)合"當(dāng)用于描述抗體與7^ 7f多肽的結(jié)合時(shí),指結(jié) 合到其他多肽的異質(zhì)性混合物中的7^ 7f多肽。
如用于描述抗體與對(duì)照多肽或樣品的結(jié)合時(shí),短語(yǔ)"實(shí)質(zhì)上缺少 結(jié)合"或者"實(shí)質(zhì)上無(wú)結(jié)合"指結(jié)合水平,其包括非特異或者背景結(jié) 合,但是不包括特異結(jié)合。
制備和表征抗體的技術(shù)是本領(lǐng)域已知的。見(jiàn)例如,Harlow & Lane(1988) Antibodies: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York和美國(guó)專利號(hào) 4, 196, 265; 4, 946, 778; 5, 091, 513; 5, 132, 405; 5, 260, 203; 5, 677, 427; 5,892,019; 5, 985, 279;和6, 054561。
如本文所公開(kāi)的制備的7^ 7f抗體可以用于本領(lǐng)域中已知的涉及 77V 7f多肽的定位和活性的方法中,例如,用于克隆編碼7^ 76多肽 的核酸、77> 76多肽的免疫純化、成像生物樣品中的7^ 76多肽,和 測(cè)量合適的生物樣品中7^ 76多肽的水平。為了進(jìn)行此類方法,本發(fā) 明的抗體可以還包含可檢測(cè)的標(biāo)記,包括但不限于,放射性標(biāo)記、焚 光標(biāo)記、表位標(biāo)記和可以在體內(nèi)檢測(cè)的標(biāo)記。選擇適于具體檢測(cè)技術(shù) 的標(biāo)記的方法,和將可檢測(cè)的標(biāo)記綴合或結(jié)合抗體的方法是本領(lǐng)域技 術(shù)人員已知的。
VIII. 7^ 76調(diào)節(jié)劑
本發(fā)明還公開(kāi)了鑒定7^ 7(f活性的調(diào)節(jié)劑的測(cè)定法。測(cè)定法可以 使用如上文公開(kāi)的用于表達(dá)7^ 76多肽的系統(tǒng),或者這種系統(tǒng)中產(chǎn)生 的分離的r^7^多肽,其中此類n/ 多肽可以與其他T2R多肽一起表 達(dá)。本發(fā)明還提供了使用所公開(kāi)的方法鑒定的7^ "活性的調(diào)節(jié)劑。
術(shù)語(yǔ)"調(diào)節(jié)"指7^ 7f的任何或者所有化學(xué)和生物學(xué)活性或性質(zhì) 的升高、降低或者其他改變。從而,鑒定調(diào)節(jié)劑的方法涉及測(cè)定"^7f
功能的水平或質(zhì)量。
鑒定7^ 7f功能的調(diào)節(jié)劑的方法可以包括(a)提供重組表達(dá)系 統(tǒng),從而7^ 7《多肽在宿主細(xì)胞中表達(dá),和其中7^ 〃多肽包含7^ " 多肽;(b)為(a)的系統(tǒng)提供受試物質(zhì);(c)在受試物質(zhì)存在下,測(cè) 定r^ ^功能的水平或質(zhì)量;(d)比較存在受試物質(zhì)下7^ 76功能的 水平或質(zhì)量與7^ 7f功能的對(duì)照水平或質(zhì)量;和(e)通過(guò)在受試物質(zhì) 存在下測(cè)定7^ 76功能的水平或質(zhì)量與7^ 76功能的對(duì)照水平或質(zhì)量 相比顯著改變,鑒定受試物質(zhì)為T^ 7(f調(diào)節(jié)劑。在一些實(shí)施方案中, 將在受試物質(zhì)和已知的7^ 7f配體(如在上文實(shí)例中所示的PR0P或者番木鱉堿)存在下測(cè)定"AM功能或結(jié)合,以便檢測(cè)受試物質(zhì)對(duì)7^ 76 配體與7^ 7f的結(jié)合或活化的影響。在一些實(shí)施方案中,還可以提供 表達(dá)系統(tǒng)用于riV 7f與至少一種其他T2R共同表達(dá)。
7^i 7<f活性的對(duì)照水平或質(zhì)量指僅僅野生型77) M活性的水平或 質(zhì)量或者存在已知的77i 7f活化劑如PROP或者番木鱉堿時(shí)野生型 7^ 7f活性的水平或質(zhì)量。優(yōu)選地,用于重組表達(dá)"及7f多肽的系統(tǒng) 將表達(dá)具有SEQ ID N0:2的多肽或者與實(shí)質(zhì)上相同的7"W7^多肽,其
具有基本上相同的配體結(jié)合和/或功能性質(zhì)。當(dāng)評(píng)估受試物質(zhì)的調(diào)節(jié)能 力時(shí),T7/ 7f活性的對(duì)照水平或者質(zhì)量包含不存在受試物質(zhì)時(shí)活性的
水平或者質(zhì)量。
如本文所用的術(shù)語(yǔ)"顯著改變"指T2R多肽,例如") M多肽的 改變的水平或活性,并且指可測(cè)量的質(zhì)量的定量改變,其大于測(cè)量技 術(shù)中固有的誤差界限,優(yōu)選相對(duì)于對(duì)照測(cè)量增加或者減少約2倍或者 更高,更優(yōu)選增加或者減少約5倍或者更高,最優(yōu)選增加或者減少約 IO倍或者更高。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中,測(cè)定7^ "功能包括測(cè)定77) ^基 因表達(dá)水平。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中,測(cè)定Hi ^功能包括測(cè)定重組表 達(dá)的7^ 76多肽的結(jié)合活性。例如,r^7^活性可以包括調(diào)節(jié)劑與7^ 7(f 多肽結(jié)合的量或強(qiáng)度。
在本發(fā)明的再一個(gè)實(shí)施方案中,測(cè)定T^ "功能可以包括測(cè)定 7^ 76多肽的活性構(gòu)象。
在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中,測(cè)定T^ 7f功能包括測(cè)定響應(yīng)配體 或者調(diào)節(jié)劑對(duì)7^ 76多肽的結(jié)合,細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳遞事件的活化。例如, G蛋白交換活性的配體介導(dǎo)的刺激可以通過(guò)測(cè)量["S]GTPYS與 多肽的結(jié)合的量來(lái)測(cè)定,如下文和實(shí)施例3中所述。
在另一優(yōu)選實(shí)施方案中,在基于細(xì)胞的測(cè)定法中鑒定7^ 7(f調(diào)節(jié) 化合物,該測(cè)定法通過(guò)成像方法使用鈣敏感的熒光測(cè)定染料,在受試 化合物存在和不存在下檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)鈣的改變(見(jiàn)下文實(shí)施例4)。通過(guò)所公開(kāi)的方法鑒定的調(diào)節(jié)劑可以包括激動(dòng)劑和拮抗劑。如本
文使用的術(shù)語(yǔ)"激動(dòng)劑"指活化、協(xié)同或者加強(qiáng)T^ 7f多肽的生物活 性的物質(zhì),如PROP或者番木豎堿或者另一苦味化合物。如本文所用的 術(shù)語(yǔ)"拮抗劑"指例如,通過(guò)抑制苦味配體如番木鳘堿、PR0P或者其 他7i^7f結(jié)合的苦味配體對(duì)"i776的結(jié)合或者活化,阻斷或者減弱 77i 76多肽的生物活性的物質(zhì)。調(diào)節(jié)劑可以還包含特異結(jié)合f"7(f多 肽的配體或者物質(zhì)??梢栽隗w外或體內(nèi)進(jìn)行用于測(cè)定"/ 76調(diào)節(jié)劑的 活性和結(jié)合測(cè)定法。優(yōu)選地,將使用如本文所述的基于細(xì)胞的測(cè)定法 檢測(cè)調(diào)節(jié)劑。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中,此類測(cè)定法可以用于鑒定"i 76調(diào) 節(jié)劑,該調(diào)節(jié)劑可以被開(kāi)發(fā)為添加劑以改變經(jīng)口使用的組合物的味道, 所述組合物包括但不限于,食品、飲料、口洗凈劑、潔牙劑、化妝品 和藥物,如標(biāo)題為"應(yīng)用,,的下文中所述。例如,"i 7f的抑制劑或 阻斷劑可以用于減輕苦味。
在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中,此類測(cè)定法可用于鑒定7^ 7f調(diào)節(jié) 劑,該調(diào)節(jié)劑可以被開(kāi)發(fā)為添加劑以改變化合物的味道,所述化合物 可能但是不希望經(jīng)口使用,例如,家庭清潔劑、毒藥等等。從而, 激動(dòng)劑可以用于引入或者增加組合物的苦味從而阻礙它的經(jīng)口使用。
在本發(fā)明的再一個(gè)實(shí)施方案中,為了預(yù)篩生物活性劑的目的,可 以進(jìn)行使用重組7^ 7f多肽的測(cè)定法,其中所述活性劑和T^ "之間 的相互作用是不希望的。例如,可以對(duì)預(yù)期施用于受試者的藥物測(cè)試 可以導(dǎo)致不希望的苦味的T^ 7(f調(diào)節(jié)活性。
在本發(fā)明的再一個(gè)實(shí)施方案中,本文公開(kāi)的測(cè)定法可以用于表征 突變的7Z 7f多肽,例如與苦味味覺(jué)的不同關(guān)聯(lián)的突變多肽。突變 7^ 76多肽的重組表達(dá)將允許進(jìn)一步分析疾病相關(guān)的T^ 7f多肽。
根據(jù)本發(fā)明,還提供了依賴于本文公開(kāi)的方法的快速和高通量篩 選方法。該篩選方法包括分別將7^ 76多肽與多種受試物質(zhì)接觸。在 此類篩選方法中,所述多種目標(biāo)物質(zhì)優(yōu)選包含約i,oooo種以上的樣 品,優(yōu)選包含約100000種以上的樣品,并且更優(yōu)選包含1, 000, 000種以上的樣 品o
本發(fā)明的體內(nèi)和細(xì)胞測(cè)定法可以包含可溶測(cè)定法,或者可以還包 含用于固定測(cè)定法的一種或多種組分的固相基質(zhì)。例如,r^ 7^多肽,
或者表達(dá)77及76多肽的細(xì)胞,和任選地另一種"/ 多肽可以通過(guò)共價(jià) 或者非共價(jià)鍵直接結(jié)合到固態(tài)組分。此外,任選地,結(jié)合可以包括接
頭分子或者標(biāo)記,其介導(dǎo)r"76多肽與基質(zhì)的間接結(jié)合或者提供細(xì)胞 表面上受體的檢測(cè)或表達(dá)。
代表性接頭包括已知的結(jié)合對(duì)(例如,生物素和抗生素蛋白)、 識(shí)別已知的抗原的抗體、合成聚合物(例如,聚氨基甲酸酯、聚酯、 聚碳酸酯、聚脲、聚酰胺、聚乙烯亞胺、聚亞芳基硫化物、聚硅氧烷、 聚酰亞胺和聚縮醛)、肽、醚。接頭可以任選包含柔性接頭,例如,
聚(乙二醇)接頭(可以從Shearwater Polymers, Inc. of Huntsvi 1 le, Alabama, United States of America得到)。4壬選地,接頭可以還 包含酰胺、巰基或者雜功能結(jié)合位點(diǎn)。
可以使用多種當(dāng)前的方法將接頭固定到固相基質(zhì),所述方法包括 基質(zhì)的衍生從而它與接頭反應(yīng),或者使用熱或者紫外線交聯(lián)的非化學(xué) 方法。代表性方案可以見(jiàn)例如Merrifield (1963) J Am Chem Soc 85: 2149-2154 (描述例如肽的固相合成);Geysen等人(11987) J Immun Meth 102: 259-274 (描述4十上的固相合成組分);Frank & Boring (1988) Tetrahedron 44: 60316040 (描述在纖維素盤(pán)上合成 多種肽序列);Fodor等人(1991) Science 251: 767-777;和Kozal 等人(1996) Nat Med 2 (7): "753759 (描述固定到固相基質(zhì)的生物聚 合物陣列),Merrifield (1963) J Am Chem Soc 85:2149-2154 (描 述例如肽的固相合成);Geysen等人 (1987) J Immun Meth 102: 259-274 (描述在針上合成固相組分);Frank & Doring (1988) Tetrahedron 44:60316040 (描述在纖維素盤(pán)上合成多種肽序列); Fodor等人(1991) Science 251: 767-777;和Kozal等人(1996) Nat Med 2 (7) :753759 (描述固定到固相基質(zhì)的生物聚合物陣列),等等)。VII. A.受試物質(zhì)
使用本發(fā)明的方法測(cè)定的潛在的調(diào)節(jié)劑包括候選物質(zhì)。如本文所 用的術(shù)語(yǔ)"候選物質(zhì)"和"受試物質(zhì)"可互換使用,并且每種指懷疑 與7^ 76多肽相互作用的物質(zhì),包括任何合成的、重組的或者天然產(chǎn) 物或者組合物。使用本文公開(kāi)的方法,可以對(duì)懷疑與多肽相互作用的 受試物質(zhì)評(píng)估這種相互作用。
代表性受試物質(zhì)包括但不限于肽、寡聚體、核酸(例如,適配體)、 小分子(例如,化合物)、抗體或者其片段、核酸-蛋白質(zhì)融合物,任 何其他親和劑,和其組合。受試物質(zhì)可以額外包含糖類、維生素或者 其衍生物、激素、神經(jīng)遞質(zhì)、病毒或者其受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域、ops或者 視紫紅質(zhì)、芳香劑、信息素、毒素、生長(zhǎng)因子、血小板激活因子、神 經(jīng)活性肽,或者神經(jīng)激素。優(yōu)選地,候選物質(zhì)引起苦味味覺(jué)。待測(cè)試 的物質(zhì)可以是純化的分子、同質(zhì)樣品,或者分子或化合物的混合物。
如本文使用的術(shù)語(yǔ)"小分子"指分子量小于約l,OOO道爾頓,更 優(yōu)選小于約750道爾頓,更優(yōu)選小于約600道爾頓,更優(yōu)選小于約500 道爾頓的化合物,例如,有機(jī)化合物。小分子還優(yōu)選具有在約-4到約 +14范圍內(nèi),優(yōu)選約-2到約+7. 5范圍內(nèi)的計(jì)算的對(duì)數(shù)辛醇-水分系數(shù)。
這些小分子可以包含在不同或者結(jié)構(gòu)上相似的化合物的化合物文庫(kù) 中,例如組合化學(xué)合成的文庫(kù)中。優(yōu)選地,這些化合物將包括天然存 在的苦味化合物,例如,來(lái)自植物提取物等等的苦味化合物。
受試物質(zhì)可以以文庫(kù)得到或者制備。如本文使用的術(shù)語(yǔ)"文庫(kù)" 指分子集合。文庫(kù)可以含有一些或者大數(shù)目的不同的分子,從約10 種分子到幾十億種分子或者更多。分子可以包含天然存在的分子、重 組分子、或者合成的分子??梢酝瑫r(shí)測(cè)定文庫(kù)中多種受試物質(zhì)。任選 地,可以將來(lái)自不同文庫(kù)的受試物質(zhì)合并用于同時(shí)評(píng)估。
代表性文庫(kù)包括但不限于,肽文庫(kù)(美國(guó)專利號(hào)6,l56,511、 6,107, 059、 5, 922, 545和5, 223, 409)、寡聚體文庫(kù)(美國(guó)專利號(hào) 5, 650, 489和5, 858, 670)、適配體文庫(kù)(美國(guó)專利號(hào)6, 180, 348和 5, 756, 291)、小分子文庫(kù)(美國(guó)專利號(hào)6,168,912和5, 738, 996)、抗體或抗體片段文庫(kù)(美國(guó)專利號(hào)6, 174, 708、 6, 057, 098、 5, 922, 254、 5,840, 479、 5, 780, 225、 5, 702, 892和5, 667988)、核酸-蛋白質(zhì)融合 體文庫(kù)(美國(guó)專利號(hào)6, 214, 553),和可以潛在結(jié)合"i 7f多肽的任何 其他親和劑的文庫(kù)(例如,美國(guó)專利號(hào)5, 948, 635 、 5, 747, 334和 5,498, 538)。
文庫(kù)可以包含分子的隨機(jī)集合。備選地,文庫(kù)可以包含對(duì)特定序 列、結(jié)構(gòu)或者構(gòu)象具有偏倚的分子集合。見(jiàn)例如,美國(guó)專利號(hào) 5, 264, 563和5, 824, 483。制備含有多種類型分子的不同群體的文庫(kù)的 方法是本領(lǐng)域已知的,例如如上面的美國(guó)專利中所述。還可以通過(guò)商 業(yè)途徑得到多種文庫(kù)。
VII. B結(jié)合測(cè)定法
在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中,用于鑒定7^ 7《調(diào)節(jié)劑的方法包括 測(cè)定受試物質(zhì)與r"7f多肽或者包含rM76多肽和一種或多種其他 T2R多肽的異聚體受體的特異結(jié)合。術(shù)語(yǔ)"結(jié)合"指兩個(gè)分子之間的 親和性。優(yōu)選地,特異結(jié)合還包括相互作用的質(zhì)量或狀態(tài),從而一種 蛋白質(zhì)或化合物對(duì)另 一種蛋白質(zhì)的活性是抑制性的(對(duì)于抑制劑或者 拮抗劑的情況)或者增強(qiáng)的(對(duì)于活化劑或者激動(dòng)劑的情況)。
短語(yǔ)"特異(或者選擇性)結(jié)合"當(dāng)指候選調(diào)節(jié)劑的結(jié)合能力時(shí), 指結(jié)合反應(yīng),其決定在蛋白質(zhì)和其他生物物質(zhì)的異質(zhì)性群體中所述蛋 白質(zhì)的存在。如果結(jié)合親和力為約1 x 1(J4NT到約1 x 1(TM4或者更高, 那么可以認(rèn)為調(diào)節(jié)劑與7"7^多肽的結(jié)合是特異的。短語(yǔ)"特異結(jié)合"
還指可飽和的結(jié)合。為了闡明受試物質(zhì)與r^;^多肽的可飽和的結(jié)合,
可以如Mak等人(1989) J Biol Chem 264: 21613-21618所述的進(jìn)行 Scatchard分析。
短語(yǔ)"基本上缺少結(jié)合"或者"基本上無(wú)結(jié)合"如本文用于描述 調(diào)節(jié)劑與對(duì)照多肽或者樣品的結(jié)合,指結(jié)合的水平,其包括非特異或
者背景結(jié)合,但是不包括特異結(jié)合。
可以用幾種技術(shù)檢測(cè)7^ 7^多肽和受試物質(zhì)之間的相互作用,而不用使用已知的竟?fàn)幷{(diào)節(jié)劑。代表性方法包括,但不限于,熒光相關(guān)
光語(yǔ)法、表面增強(qiáng)的激光解吸/電離飛行時(shí)間光諳法,和Biacore技術(shù), 每種技術(shù)都在下文中描述。這些方法容易自動(dòng)化、高通量篩選。
熒光相關(guān)光語(yǔ)法(FCS )測(cè)量小樣品體積內(nèi)熒光分析的平均擴(kuò)散速 率(Tallgren, 1980)。樣品大小可以低至103個(gè)熒光分子并且樣品體 積低至單個(gè)細(xì)菌的細(xì)胞質(zhì)。擴(kuò)散速率是分子質(zhì)量的函數(shù)并且隨著質(zhì)量 增加而降低。因此,F(xiàn)CS可以通過(guò)測(cè)量結(jié)合時(shí)分子質(zhì)量的改變并因此 測(cè)量擴(kuò)散速率的改變而應(yīng)用于多肽-配體相互作用分析。在典型的實(shí)驗(yàn) 中,待分析的靶標(biāo)(例如,"i 7f多肽)表達(dá)為重組多肽,其具有插 入在N-末端或者C-末端的序列標(biāo)記,如多聚組氨酸序列。表達(dá)在宿主 細(xì)胞如大腸桿菌、酵母、爪蟾卵母細(xì)胞或者哺乳動(dòng)物細(xì)胞中介導(dǎo)。使 用層析方法純化多肽。例如,多聚組氨酸標(biāo)記可以用于結(jié)合表達(dá)的多 肽到金屬螯合物柱如螯合在亞氨基二乙酸瓊脂糖上的Ni2+。然后將多 肽用熒光標(biāo)記如羧基四甲基羅丹明或者B0DIPYTM試劑(可以從 Molecular Probes of Eugene, Oregon獲得)標(biāo)記。然后多肽在溶液 中暴露于潛在配體,并且使用可以從Carl Zeiss, Inc. (Thornwood, New York)得到的儀器通過(guò)FCS測(cè)定它的擴(kuò)散速率。通過(guò)多肽的擴(kuò)散速 率的改變測(cè)定配體結(jié)合。
Hutchens & Yip (1993) Rapid Commun Mass Spectrom 7: 576-580 開(kāi)發(fā)了表面增強(qiáng)的激光解吸/電離(SELDI)。當(dāng)偶聯(lián)到飛行時(shí)間質(zhì)譜 儀(TOF)時(shí),SELDI提供了快速分子芯片上保留的分析的技術(shù)。通過(guò) 在芯片上共價(jià)結(jié)合目標(biāo)蛋白或者其部分并通過(guò)質(zhì)譜法分析結(jié)合該蛋白 質(zhì)的小分子,可以將SELDI應(yīng)用于配體-蛋白質(zhì)相互作用分析 (Worrall等人,1998)。在典型的實(shí)驗(yàn)中,重組表達(dá)并純化目標(biāo)多肽 (例如,"i 7f多肽)。目標(biāo)多肽通過(guò)利用多聚組氨酸標(biāo)記或者通過(guò) 其他相互作用如離子交換或者疏水相互作用結(jié)合到SELDI芯片。這樣 制備的芯片通過(guò)例如能夠以順序方式移取配體的遞送系統(tǒng)(自動(dòng)采樣 器)暴露于潛在的配體。然后用增加嚴(yán)格性的溶液洗滌芯片,例如, 用含有增加離子強(qiáng)度的緩沖液進(jìn)行一系列洗滌。每次洗滌后,通過(guò)將芯片進(jìn)行SELDI-T0F分析結(jié)合的物質(zhì)。特異結(jié)合目標(biāo)多肽的配體可通 過(guò)需要洗脫它們的洗滌的嚴(yán)格性鑒定。
Biacore依靠配體與固定在目標(biāo)多肽(例如,7^ 76多肽)結(jié)合時(shí), 表面層折射率的改變。在該系統(tǒng)中,將小配體集合順序注射到2-5 微升小室中,其中目標(biāo)多肽被固定在小室中。通過(guò)表面等離子體共振 (SPR)通過(guò)記錄來(lái)自表面的激光折射檢測(cè)結(jié)合。通常,表面層上質(zhì)量
允許將一種方法應(yīng)用于任一種蛋白質(zhì)(Liedberg等人,1983)。在典型 的實(shí)驗(yàn)中,將目標(biāo)蛋白重組表達(dá),純化,并結(jié)合到Biacore芯片。通 過(guò)利用多聚組氨酸標(biāo)簽或者通過(guò)其他相互作用如離子交換'或者疏水 相互作用可以促進(jìn)結(jié)合。從而制備的芯片通過(guò)整合到Biacore 0Jppsala, Sweden)銷售的儀器中的遞送系統(tǒng)(自動(dòng)采樣器)以順序方 式移取配體而暴露于一種或多種潛在的配體。記錄芯片上的SPR信號(hào) 并且折射率的改變表明固定的靶標(biāo)和配體之間的相互作用。結(jié)合速率 和解離速率的信號(hào)動(dòng)力學(xué)的分析允許區(qū)分非特異的和特異的相互作 用。也見(jiàn)Homola等人(1999) Sensors and Actuators 54: 3-15和其 中的參考文獻(xiàn)。
VII. C.構(gòu)象測(cè)定法
本發(fā)明還提供了鑒定7^ 7f調(diào)節(jié)劑的方法,該方法依賴于單獨(dú)表 達(dá)或者與另一種T2R多肽結(jié)合表達(dá)的"j 7^多肽與r^76調(diào)節(jié)劑結(jié)合 或者其他相互作用時(shí)的構(gòu)象改變。
對(duì)大分子溶液應(yīng)用圓二色性揭示這些大分子的構(gòu)象狀態(tài)。該技術(shù) 可以區(qū)分隨機(jī)巻曲、oc螺旋和P鏈構(gòu)象狀態(tài)。
為了鑒定r"76多肽的調(diào)節(jié)劑,可以使用重組表達(dá)的T^ ^多肽 進(jìn)行圓二色性分析。例如,通過(guò)離子交換和大小排阻層析純化77i 7f 多肽并將其與受試物質(zhì)混合。將混合物進(jìn)行圓二色性。在受試物質(zhì)存 在下77> 76多肽的構(gòu)象與不存在受試物質(zhì)時(shí)7^ 7f多肽的構(gòu)象相比。 受試物質(zhì)存在下riW7f多肽的構(gòu)象狀態(tài)的改變從而可以用于鑒定7^ 76調(diào)節(jié)劑。代表性方法描述于美國(guó)專利號(hào)5, 776, 859和5, 780, 242 中。7^ 7f多肽可以包含在包含另一T2R多肽的異聚體受體中。
VII. D.受體活化測(cè)定法
在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中,用于鑒定7^ 7f調(diào)節(jié)劑的方法使用 功能性77i 7f多肽。本文公開(kāi)的新的r^7f多肽包括SEQ ID NO: 2。 用于測(cè)定7^ 7f功能的代表性方法包括測(cè)定細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳遞事件的配 體介導(dǎo)的活化,如下文所述。
受試物質(zhì)對(duì)7^ 76功能的影響可以包括測(cè)定"i 76活性引起的任 何生理學(xué)改變,包括但不限于"i 7《多肽的磷酸化、對(duì)7^ 76多肽的 G蛋白結(jié)合、表達(dá)7^ 76多肽的細(xì)胞中的離子流、基因轉(zhuǎn)錄的改變、 細(xì)胞代謝(例如,細(xì)胞生長(zhǎng))的改變、細(xì)胞內(nèi)第二信使(例如,Ca2+、 IP3、 cGMP、 cAMP)的改變、和遞質(zhì)或激素釋放的改變。GPCR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo) 和用于測(cè)定該轉(zhuǎn)導(dǎo)的方法在Methods in Enzymology巻237和238 (1994)中描述。也見(jiàn)Berridge & Irvine (1984) Nature 312: 315—321; Bourne等人(1991) Nature 10: 349: 117-27; Bourne等人(1990) Nature 348:125-32; Fel ley-Bosco等人(1994) Am J Resp Cell and Mol Biol 11:159-164; Mistili & Spector (1997) Nat Biotech 15: 961-964;Offe簡(jiǎn)nns&Simon(1995)JBiol Chem 270: 15175-15180; Pitcher等人(1998) Annu Rev Biochem 67: 653-92; 和美國(guó)專利號(hào)4,115, 538; 5, 436, 128; 6, 004, 808; 6,403, 305,和 6, 255, 059中描述。
在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中,測(cè)定"^7f功能包括測(cè)定單獨(dú)或者 與另一T2R多肽結(jié)合重組表達(dá)的") 7^多肽與味轉(zhuǎn)導(dǎo)素或者泛主G蛋 白如Gq或者轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白或者其嵌合體的偶聯(lián)。從而,7^ 76活性的代表 性水平可以包括如實(shí)施例3所述的gdp交換味轉(zhuǎn)導(dǎo)素上的gtp y s的量 或者如實(shí)施例4所述的細(xì)胞內(nèi)鈣的改變。7^ 76活性的代表性質(zhì)量可 以包括例如G蛋白亞基的選擇性活化。
根據(jù)該方法,可以以用于進(jìn)行7^ 7f功能測(cè)定的試劑盒的形式提供表達(dá)7^ 7f的細(xì)胞。從而,可以如上文所述冷凍細(xì)胞并冷凍時(shí)運(yùn)輸 到別人用于進(jìn)行測(cè)定法。例如,在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中,提供了 用于檢測(cè)7^7《調(diào)節(jié)劑的測(cè)試試劑盒,該試劑盒包含(a)用編碼全 長(zhǎng)"W7f多肽的DNA轉(zhuǎn)染的冷凍的細(xì)胞;和(b)用于培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng) 基。
優(yōu)選地,用于此類測(cè)定法的細(xì)胞包括基本上沒(méi)有天然77i 7f或者 基本上類似于7M;^的多肽的細(xì)胞。優(yōu)選的細(xì)胞包括真核細(xì)胞,例如, HEK-293細(xì)胞。
如本文用于描述宿主細(xì)胞或?qū)φ占?xì)胞的術(shù)語(yǔ)"基本上沒(méi)有"指具 有天然T^ 7f的水平、基本上類似于7^ 7f的多肽的水平或者其活性 的水平的質(zhì)量,包括背景水平。術(shù)語(yǔ)"背景水平,,包括表達(dá)或活性的 非特異測(cè)量,其通常在沒(méi)有77i 7f和沒(méi)有與rM7f多肽基本上相似的 多肽的細(xì)胞中檢測(cè)到。
用于本發(fā)明測(cè)定法的細(xì)胞優(yōu)選包含功能G蛋白,其能夠?qū)/ 7f 受體偶聯(lián)到細(xì)胞內(nèi)信號(hào)途徑。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中,功能G蛋 白可以包含顯示出泛主偶聯(lián)的G蛋白,如Gocl5和Gotl6或者另一種 G蛋白,如轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白或者味轉(zhuǎn)導(dǎo)素或者如實(shí)施例4中公開(kāi)的其嵌合體 (G16gust44)。見(jiàn)Wilkie等人(1991) Proc Nad Acad Sci USA 88: 10049-10053和美國(guó)專利號(hào)6, 004, 808。
還優(yōu)選地,使用表達(dá)重組T^ 7^的細(xì)胞的所有測(cè)定法還利用對(duì)照 細(xì)胞,該對(duì)照細(xì)胞基本上沒(méi)有天然T^ 7^和與7^i 76多肽基本上相似 的多肽。當(dāng)使用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞時(shí),對(duì)照細(xì)胞可以包括例如,未轉(zhuǎn)染 的宿主細(xì)胞。當(dāng)使用表達(dá)"i 7(f多肽的穩(wěn)定細(xì)胞系時(shí),對(duì)照細(xì)胞可以 包括例如,用于得到表達(dá)7^ 7f的細(xì)胞系的親本細(xì)胞系。
利用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的7^ 7(f活性測(cè)定法優(yōu)選包括區(qū)分轉(zhuǎn)染的細(xì) 胞和未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的標(biāo)記。術(shù)語(yǔ)"標(biāo)記,,指可以用于區(qū)分重組表達(dá) 77W76的細(xì)胞與不重組表達(dá)76多肽的細(xì)胞的任何可檢測(cè)的分子。 優(yōu)選地,標(biāo)記由用于T^ 7(f表達(dá)的構(gòu)建體編碼或者與之結(jié)合,從而細(xì) 胞用編碼7^ %的核酸分子和標(biāo)記同時(shí)轉(zhuǎn)染。用作標(biāo)記的代表性可檢測(cè)的分析包括但不限于,異質(zhì)性核酸、轉(zhuǎn)染的構(gòu)建體編碼的多肽(例 如,酶或者熒光多肽)、結(jié)合蛋白和抗原。例如,標(biāo)記可以包含
rhodopson才示i己,其可以免疫檢觀'J, 3口實(shí)施例2中戶斤述。
可用作標(biāo)記的酶的實(shí)例包括磷酸酶(如酸性或堿性磷酸酶)、& -半乳糖苷酶、脲酶、葡萄糖氧化酶、碳酸酐酶、乙酰膽堿酯酶、葡 萄糖淀粉酶、馬來(lái)酸脫氫酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、p-葡糖苷酶、 蛋白酶、丙酮酸脫羧酶、酯酶、螢光素酶、醇脫氬酶、或者過(guò)氧化物 酶(如辣根過(guò)氧化物酶)。
可以基于酶的活性檢測(cè)包含酶的標(biāo)記。從而,加入底物以催化可 以檢測(cè)終產(chǎn)物的反應(yīng),例如,使用分光光度計(jì)、光度計(jì)或者熒光計(jì)檢 測(cè)。用于上述酶的反應(yīng)并且產(chǎn)生可檢測(cè)的反應(yīng)產(chǎn)物的底物是本領(lǐng)域技 術(shù)人員已知的。
優(yōu)選的標(biāo)記包含不存在加入的底物時(shí)可以被檢測(cè)的編碼多肽。可 以直接檢測(cè)的代表性多肽包括GFP和EGFP。已經(jīng)開(kāi)發(fā)可常規(guī)研究設(shè)備 來(lái)進(jìn)行熒光,例如GFP或者EGFP熒光的高通量檢測(cè),包括來(lái)自GSI Lumonics (Watertown, Massachusetts, United States of America), Amersharn Pharmacia Biotech/Molecular Dynamics (Sunnyvale, California, United States of America), Applied Precision Inc. (Issauah, Washington, United States of America)和 Genomic Solutions Inc. (Ann Arbor, Michigan, United States of America) 的儀器。多數(shù)商業(yè)系統(tǒng)使用某種形式的掃描技術(shù)與光電倍增管檢測(cè)。
VII. E.理性*沒(méi)計(jì)
天然7^ 7(f多肽結(jié)構(gòu)的知識(shí)提供了推理性設(shè)計(jì)調(diào)節(jié)劑和診斷試劑 的方法。簡(jiǎn)言之,通過(guò)X射線晶體學(xué)和/或通過(guò)計(jì)算機(jī)算法產(chǎn)生三維表 示可以測(cè)定777 7f多肽的結(jié)構(gòu)。見(jiàn)Saqi等人(1999) Bioinformatics 15:521-522; Huang等人(2000) Pac Symp Biocomput: 230—241;和 PCT國(guó)際公布號(hào)W0 99/26966。備選地,通過(guò)同源性建??梢缘玫?^ " 多肽結(jié)構(gòu)的工作模型(Maalouf等人,1998)。計(jì)算機(jī)模型還可以預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與多種底物分子的結(jié)合,可以合成所述分子并使用上文描
述的測(cè)定法測(cè)試。額外的化合物設(shè)計(jì)技術(shù)在美國(guó)專利號(hào)5, 834, 228和 5, 872, 011中描述。
通常,T^i 7f多肽是膜蛋白,并且可以使用去污劑或者其他合適 的兩親性分子以可溶形式純化。得到的"i 76多肽的純度和濃度足夠 用于結(jié)晶。純化的rz 7(f多肽優(yōu)選在還原或非還原聚丙烯酰胺凝膠電 泳(PAGE)下電泳為一條帶。經(jīng)純化的7^ 76多肽可以在至少一種下 面的不同條件下結(jié)晶pH、緩沖液類型、緩沖液濃度、鹽類型、多聚 體類型、多聚體濃度、和其他沉淀配體、和純化的T^ 7《的濃度。用 于產(chǎn)生結(jié)晶多肽的方法是本領(lǐng)域已知的并且可以有理由適于如本文公 開(kāi)的測(cè)定7^ 76多肽。見(jiàn)例如,Deisenhofer等人(1984) J Mol Biol 180: 385-398; Weiss等人(1990) FEBS Lett 267:268-272;或者商 業(yè)試劑盒,如CRYSTAL SCREENTM試劑盒(可以從Hampton Research of Riverside, California, United States of America得到)中提供 的方法。
可以對(duì)結(jié)晶的T^ 7f多肽測(cè)試功能活性并且不同大小和形狀的晶 體可以進(jìn)一步測(cè)試在X射線衍射中的適合性。通常,較大的晶體提供 比較小的晶體更好的晶體學(xué),并且較厚的晶體提供比較薄的晶體更好 的晶體學(xué)。優(yōu)選地,r"M晶體范圍為0.1-1.5 mm。這些晶體衍射X 射線到至少10A分辨率,如1.5-10.0 A或者其中任一范圍的值,如 1.5、 1.6、 1.7、 1.8、 1.9、 2.0、 2.1、 2.2、 2.3、 2.4、 2.5、 2.6、 2.7、 2.8、 2.9、 3.0、 3.1、 3.2、 3.3、 3.4、 3. 5或者3, 3. 5A對(duì)于 最高分辨率是優(yōu)選的。
VIII.檢測(cè)7^ 76多肽的方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明還提供了檢測(cè)"y M多肽的方法。所公開(kāi)的方法可以用于
測(cè)定7^ 7f表達(dá)的改變的水平,其與味覺(jué)中r""相關(guān)的不同有關(guān)。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中,所述方法包括用特異識(shí)別T^ 7(f多 肽的抗體進(jìn)行免疫化學(xué)反應(yīng),其中根據(jù)本發(fā)明的方法制備抗體以產(chǎn)生這種抗體。從而,該方法包括(a)得到包含肽物質(zhì)的生物樣品;(b)
將該生物樣品與特異結(jié)合"y 7^多肽并且根據(jù)所公開(kāi)的方法產(chǎn)生的抗
體接觸,其中該抗體包含可檢測(cè)的標(biāo)記;和(c)檢測(cè)所述可檢測(cè)的標(biāo) 記,從而檢測(cè)樣品中的T^ 7^多肽。
用于檢測(cè)此類抗體-抗原綴合物或者復(fù)合體的技術(shù)是本領(lǐng)域已知 的并且包括但不限于離心、親和層析和其他免疫化學(xué)方法。見(jiàn)例如, Manson (1992) Immunochemical Protocols. Humana Press, Totowa, New Jersey,United States of America;Ishikawa (1999) Ultrasensitive and Rapid Enzyme Immunoassays . Elsevier, Amsterdam/New York, United States of America; Law (1996) Immunoassay:Practical Guide. Taylor & Francis, London/Bristol, Pennsylvania, United States of America: Chan (1996) Immunoassay Automation: An Updated Guide to Systems. Academic Press, San Diego; Uddell & Weeks (1995) Antibody Technology. Bios Scientific Publishers, Oxford, United Kingdom; Masseyeff等人 (1993) Methods of Immunological Analysis. VCH Verlagsgesellschaft/VCH Publishers, Weinheim, Federal Republic of Germany/New York, United States of America; Walker & Rapley (1993) Molecular and Antibody Probes in Diagnosis. Wiley, Chichester, New York; Wyckoff等人(1985) Diffraction Methods for Biological Macromolecules. Academic Press, Orlando, Florida, United States of America;和其中引用的參考文獻(xiàn)。
在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中,用顯示出對(duì)7^ "多肽特異結(jié)合的 調(diào)節(jié)劑檢測(cè)7^ 7(f多肽。類似于用抗體檢測(cè)r^ 7^多肽,該方法包括 (a)得到包含肽物質(zhì)的生物樣品;(b)將該生物樣品與T^ 7^多肽 的調(diào)節(jié)劑接觸,其中該調(diào)節(jié)劑包含可檢測(cè)的標(biāo)記;和(c)檢測(cè)所述可 檢測(cè)的標(biāo)記,從而檢測(cè)樣品中的r^ 7f多肽。可以使用任何合適的可 檢測(cè)標(biāo)記,例如,熒光團(tuán)或者表位標(biāo)記。IX.應(yīng)用
本發(fā)明提供了鑒定7^ 7f多肽的調(diào)節(jié)劑的方法。本發(fā)明的調(diào)節(jié)劑 可以用于改變苦味味覺(jué),例如,抑制或者增強(qiáng)苦味味覺(jué)。
IX. A.受試者
本文使用的術(shù)語(yǔ)"受試者,,包括任何脊推動(dòng)物物種,優(yōu)選溫血?jiǎng)?物脊稚動(dòng)物,如哺乳動(dòng)物和鳥(niǎo)類。更具體地,本發(fā)明的方法預(yù)期用于 治療哺乳動(dòng)物如人以及由于瀕危而重要的那些哺乳動(dòng)物(如西伯利亞 虎)或者對(duì)人具有經(jīng)濟(jì)重要性(在農(nóng)場(chǎng)飼養(yǎng)用于人類消費(fèi)的動(dòng)物)和/ 或社會(huì)重要性(作為寵物喂養(yǎng)或者在動(dòng)物園中的動(dòng)物)的哺乳動(dòng)物, 不同于人的肉食動(dòng)物(如貓和狗)、豬(豬、和野豬)、反芻動(dòng)物和 家畜(如牛、綿羊、長(zhǎng)頸鹿、鹿、山羊、野牛和駱駝)和馬中的腫瘤。 還預(yù)期治療鳥(niǎo)類,包括瀕?;蛟趧?dòng)物園中保持的那些烏類,以及家禽, 更具體地,馴養(yǎng)的家禽,如火雞、雞、鴨、鵝、幾內(nèi)亞雞,等等,因 為它們對(duì)于人也具有經(jīng)濟(jì)上的重要性。
IX. B.組合物
根據(jù)本發(fā)明的方法,被施用用來(lái)改變受試者中的味覺(jué)的組合物包
含有效量的T^ ;^調(diào)節(jié)劑。r^ 7《調(diào)節(jié)劑可以包含上文所述的任一種 類型的受試物質(zhì)。如本文公開(kāi)所鑒定的r^7《調(diào)節(jié)劑可以用于制備用 于經(jīng)口適用的組合物,包括但不限于,食品、飲料、口洗凈劑、潔牙
劑、化妝品和藥物,例如,下文所列的那些化合物的任一種。T7A7《
調(diào)節(jié)劑還可以用作添加劑以改變具有可能但是不希望的經(jīng)口使用的化 合物,如家用清潔劑、毒藥等等的味道。
具有不希望的或者苦味的代表性食品包括,但不限于,柑橘屬水 果,如葡萄柚、柑橘和檸檬;蔬菜,如番茄、玉桂子、芹菜、甜瓜、 胡蘿卜、馬鈴薯和蘆筍;調(diào)味或風(fēng)味材料,如香料、果醬、醬油和紅
辣椒;來(lái)自大豆的食品;乳狀食品,如奶酪、調(diào)味品、蛋黃醬和人造 黃油;加工的海產(chǎn)品,如魚(yú)肉、底棲魚(yú)肉和魚(yú)子;堅(jiān)果,如花生;發(fā)酵食品,如發(fā)酵的大豆;肉和加工的肉類;泡菜;面條;湯,包括粉 末湯;奶產(chǎn)品,如乳酪、面包和蛋糕;甜食,如糖果、口香糖和巧克 力;和為健康特別準(zhǔn)備的食品。
引起苦味的代表性化妝品(例如,皮膚洗劑、霜?jiǎng)?、面膜、唇骨?粉底、剃須制劑、剃須后洗劑、清潔泡沫劑和清洗凝膠劑)包括但不 限于這樣的組合物,其包括表面活性劑,如烷基硫酸鈉和單烷基磷酸 鈉;芳香劑,如薄荷醇、芳樟醇、苯乙醇、丙酸乙酯、香葉醇、醋酸 里哪酯和醋酸卡酯;抗微生物劑,如對(duì)羥基苯甲酸甲酯、對(duì)羥基苯甲 酸丙酯和對(duì)羥基苯曱酸丁酯;濕潤(rùn)劑,如乳酸和乳酸鈉;醇變性劑, 如蔗糖八醋酸酯和番木鱉堿;和收斂劑,如乳酸鋁。
具有苦味的代表性藥物包括對(duì)乙酰氨基酚、特非那定、愈創(chuàng)木酚 甘油醚、甲氧節(jié)氨嘧啶、潑尼松龍、布洛芬、強(qiáng)的松龍磷酸鈉、乙酰 甲膽堿、新斯的明、腎上腺素、沙丁胺醇、偽麻黃堿鹽酸鹽、苯海拉 明、馬來(lái)酸氯苯那敏、吩噻嗪、氯丙嗪、氯氮萆、阿米替林、巴比妥 類、二苯海因、咖啡因、嗎啡、哌替啶、可待因、止瀉寧、利多卡因、 水楊酸、磺胺類藥物、氯喹、維生素制劑、礦物質(zhì)和青霉素類。
調(diào)節(jié)劑還可以作為制備的食品、飲料、口腔洗劑、潔牙劑、化妝 品或者藥物的部分施用。為了制備施用于受試者的組合物,可以將 "y 76調(diào)節(jié)劑與將調(diào)節(jié)其味道的化合物混合物,所述調(diào)節(jié)劑的量包括 按重量計(jì)約0. 001 %到約10°/。,優(yōu)選按重量計(jì)約0. 01 °/。到約8%,更 優(yōu)選按重量計(jì)約0. 1 %到約5%,最優(yōu)選按重量計(jì)約0. 5 °/ 到約2%。
合適的制劑包括溶液劑、浸骨、酏劑、酒精劑、糖漿劑、混懸劑、 粉劑、粒劑、膠嚢劑、丸劑、片劑和氣霧劑。任選地,制劑可以包括 可藥用載體、懸浮劑、增溶劑、增稠劑、穩(wěn)定劑、防腐劑、香料、著 色劑、增甜劑、香料或其組合。77/ 76調(diào)節(jié)劑和組合物可以存在于單 位劑量或者多劑量密封容器,如安瓿和小瓶中。
IX. C.施用
可以直接施用7^ %調(diào)節(jié)劑以調(diào)節(jié)味覺(jué)。優(yōu)選地,經(jīng)口或者經(jīng)鼻施用本發(fā)明的調(diào)節(jié)劑。
根據(jù)本發(fā)明的方法,對(duì)受試者施用有效量的7^ 7f調(diào)節(jié)劑。術(shù)語(yǔ) "有效量,,指足以調(diào)節(jié)7^i 76活化和/或調(diào)節(jié)苦味味覺(jué)的組合物的量。
可以改變有效量以便施用有效實(shí)現(xiàn)希望的味覺(jué)量的r"7^調(diào)節(jié) 劑。所選的劑量水平將取決于多種因素,包括7^ 7f調(diào)節(jié)劑的活性、 劑型、與其他組合物(例如,食品、藥物等)的組合、預(yù)期的用途(例 如,作為食品添加劑、潔牙劑等等),和被治療的受試者的生理狀況 和以前的醫(yī)療史。
使用本領(lǐng)域已知的味覺(jué)的體內(nèi)測(cè)定法可以容易確定有效量或者劑 量。用于測(cè)定味覺(jué)的代表性方法在實(shí)施例4描述。
實(shí)施例
包括下面的實(shí)施例用于闡明本發(fā)明的方式。下面實(shí)施例的某些方
術(shù)和步驟描述。這些實(shí)施例闡明共同發(fā)明人的標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室實(shí)踐。按照 本公開(kāi)和本領(lǐng)域的一般技術(shù)水平,技術(shù)人員將明白下面的實(shí)施例僅僅 意在實(shí)例并且可以使用多種改變、修飾和更改而不背離本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1.人"y 7f的克隆
在人基因組序列數(shù)據(jù)庫(kù)中鑒定了編碼人苦味感受器的新的基因。 新的hT2R成員h7^ 7f位于人7號(hào)染色體。通過(guò)篩選加利福尼亞大學(xué) (University of California) (Santa Cruz, Cal ifornia)基因組 學(xué)網(wǎng)站確定"y 76 DNA序列的染色體位置。該分析表明7^ 7f位于7 號(hào)染色體的 144062692-144063648 區(qū)中。某些化合物如 phenylthiocarbarnate的苦p木已經(jīng)與5和7號(hào)染色體遺傳連鎖(Guo 等人(2001) Ann Hum Biol 28:111-42)。從而,預(yù)測(cè)rM7f涉及某 些苦味劑的結(jié)合和識(shí)別。
用以前描述的hT2R序列對(duì)DNA序列數(shù)據(jù)庫(kù)的重復(fù)序列搜索初步鑒 定了人77i 7么然后通過(guò)基因組DNA的PCR擴(kuò)增分離編碼h7^ 7f的全長(zhǎng)可讀框。hr^7f的氨基酸序列由對(duì)應(yīng)的可讀框的概念上的翻譯驅(qū)
動(dòng)。h7^ 7f核苷酸和氨基酸序列分別如SEQ ID N0:1和SEQ ID NO: 2 給出。
hr^ 76的無(wú)內(nèi)含子的可讀框編碼長(zhǎng)為318個(gè)氨基酸殘基的推定的 受體蛋白。使用BLASTP算法,h7^ 7(f蛋白質(zhì)序列與公共序列數(shù)據(jù)庫(kù) 中所有已知的蛋白質(zhì)的比較揭示它與哺乳動(dòng)物苦味感受器家族成員的 高同源性。
實(shí)施例2. rhod-h7^7f的構(gòu)建
用橋交疊PCR延伸技術(shù)產(chǎn)生rhod-hr"7f嵌合體,其含有牛視紫 紅質(zhì)的前38個(gè)氨基酸,其與如所述的人rM7(f編碼序列處于讀框內(nèi) Chandrashekar等人 (2000) Cell 100: 703-711 。然后將嵌合 rhod-h7^ ;^"基因克隆到pFastBac-l載體中,并使用Bac-to-Bac系 統(tǒng)(Invitrogen Corporation of Carlsbad, California, United States of America)產(chǎn)生含有視紫紅質(zhì)標(biāo)記的h7^ 76的桿狀病毒。使 用抗視紫紅質(zhì)標(biāo)記抗體(136-30)通過(guò)免疫印跡證實(shí)了 h7^ 7f的表達(dá)。 用編碼h"y 7f的桿狀病毒感染的Sf9細(xì)胞產(chǎn)生了預(yù)期分子量的蛋白質(zhì) (-35 kDa)。
實(shí)施例3. 7^ 76的體外G蛋白偶聯(lián)
如實(shí)施例2所示制備編碼rhod-h7^A7f的感染性桿粒。用重組桿 粒感染昆蟲(chóng)幼蟲(chóng)細(xì)胞60小時(shí)并如Ryba & Trindelli (1995) J Biol Chem 270:6757-6767所述的制備膜。通過(guò)用5M尿素處理除去外周蛋 白質(zhì)并將膜重懸浮在10 mM HEPES pH 7.5, 1 mM EDTA,和1 raM DTT 中。使用單克隆抗體B6-30通過(guò)蛋白質(zhì)印跡評(píng)估rhod-h7^ 7f的表達(dá)。
如Hoon等人(1995) Cell 96 629-636和Ryba & Trindelli (1995) J Biol Chem 270: 6757-6767所述的分離G蛋白。在10nM rhod-hr^7么 lOOjaM GDP和20juM 1 y 8存在下測(cè)量味轉(zhuǎn)導(dǎo)素上GDP與GTP y S 的受體催化的交換。如美國(guó)專利申請(qǐng)序列號(hào)60/372089所述的進(jìn)行泛主G蛋白(例如,Ga 15或轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白)上GDP- GTP y S交換。在約15-60 分鐘時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行的測(cè)量反映了 gtp y s結(jié)合的初始速率。
實(shí)施例4.檢測(cè)特異7^ 7f配體的鉀成像測(cè)定法 在該實(shí)施例中,我們表明主題人r^ 7f識(shí)別苦味配體番木豎堿和 丙基硫尿嗜啶(prop)(見(jiàn)圖1中的化合物結(jié)構(gòu))。番木鳘堿是來(lái)自馬 錢(Strchnos)種子的毒性苦味生物堿,苦味閾值為0.01 mM。 PROP 是苦味化合物,對(duì)于PROP嘗味者的苦味閾值為0.01 nM。
在檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)釣濃度的基于細(xì)胞的測(cè)定中測(cè)量番木鳘堿和PROP 對(duì)hr"76的活化?;旧?,將人胚腎細(xì)胞接種到48孔組織培養(yǎng)板。 24小時(shí)后,用含有h7^ ;^"核酸序列的質(zhì)粒和表達(dá)嵌合G蛋白的質(zhì)粒 (G16gust44)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞。再過(guò)24小時(shí)后,將細(xì)胞與鈞特異的熒光 染料(Fluo-4; Molecular Probes)溫育,該熒光染料提供了檢測(cè)細(xì)胞 內(nèi)鈣的改變的快速、簡(jiǎn)單和可靠的方法。T2R的活化引起信號(hào)級(jí)聯(lián), 其導(dǎo)致plc活化和隨后細(xì)胞內(nèi)鉤濃度升高。該釣濃度的升高改變了細(xì) 胞內(nèi)鈣的熒光性質(zhì)。使用熒光顯微術(shù)和特別設(shè)計(jì)的軟件(Imaging Workbench, Axon)監(jiān)視這些改變。使用該方法,表明PROP和番木鳘堿 都特異活化HEK-293細(xì)胞內(nèi)的7MM,導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鉀水平的升高。相 比,也表達(dá)"i 7f受體的對(duì)照細(xì)胞與一些其他苦味配體如L-色氨酸、 水楊苷和N-苯硫脲接觸不導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)釣水平的可檢測(cè)的升高(見(jiàn)圖2 中所含的成像數(shù)據(jù))。從而,已經(jīng)表明2種不同的苦味配體PR0P和番 木鱉堿、番木鱉堿相關(guān)的化合物特異活化7^ 7f,證明"i 7f是人味 覺(jué)感受器,其主動(dòng)參與苦味轉(zhuǎn)導(dǎo)。
實(shí)施例5.味覺(jué)研究
使用包含如本文公開(kāi)的鑒定的r^7^調(diào)節(jié)劑的組合物進(jìn)行味道接 受研究。還使用對(duì)照組合物,其缺少r"^調(diào)節(jié)劑,但是其他方面與 受試組合物基本上相似或相同。該研究使用雙向交叉設(shè)計(jì),所有受試 者都評(píng)估兩種組合物,所述組合物以一次或多次相同的量或劑量施用。在一個(gè)研究日評(píng)估受試和對(duì)照組合物。施用受試和對(duì)照組合物的順序 在受試者中隨機(jī)化。所有登記的受試者都完成了研究方案的所有方面。
使用順序味道得分(例如,l-非???,2 =苦,3=不同,4 =不那么 苦,5=根本不苦),受試者響應(yīng)每種受試和對(duì)照組合物。記錄不利事 件。通過(guò)測(cè)量與對(duì)照組合物比較時(shí)受試組合物味道的顯著不同,測(cè)定 7^ 7f調(diào)節(jié)劑的有效性。
實(shí)施例6. h77/ 7^對(duì)苦味化合物的應(yīng)答
用表達(dá)h7"7(f的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系(HEK293)以及表達(dá)不同的hT2R (hT2R64)的對(duì)照細(xì)胞系實(shí)現(xiàn)GTPyS結(jié)合測(cè)定法。這些細(xì)胞系接觸從 0. 5到2mM的不同濃度的苦味化合物,包括6 -正丙基硫尿嘧啶(PROP)、 蔗糖八醋酸酯、棉子糖十一醋酸酯(RUA)、甘氨酸銅、苦精(denatonium) 和奎寧。該測(cè)定的結(jié)果用于證實(shí)h7^ 7f是苦味受體,其被已知的苦味 刺激特異活化。在該GTPyS結(jié)合測(cè)定中,在特定濃度的已知的苦味化 合物存在或不存在下測(cè)定活性。
實(shí)施例7.高通量篩選測(cè)定法
使用gtp y s結(jié)合測(cè)定法,篩選了 15000種以上的化合物的文庫(kù)以 鑒定特異活化h"i 7f的其他化合物。將該測(cè)定中激活hT276的特異化 合物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較以便預(yù)測(cè)具有相似結(jié)構(gòu)的可能激活h7^ 76的化 合物。然后在相同的gtp y s結(jié)合測(cè)定中以不同濃度評(píng)估具有這些相似 結(jié)構(gòu)的化合物的文庫(kù)以鑒定活化h7^ 76的其他化合物。
實(shí)施例8.人p未道測(cè)試
在人味道測(cè)試中評(píng)估在GTP y s結(jié)合測(cè)定中激活h的化合物。 在知情同意的成年人中進(jìn)行這些人味道測(cè)試,對(duì)這些人口服使用將體 外激活h7^ 7f的濃度下的經(jīng)鑒定的化合物。在這些味道測(cè)試中,將鑒 定的化合物(激活hrM7"溶解在水中以實(shí)現(xiàn)在體外GTPyS結(jié)合測(cè) 定中激活h7^ 76的化合物濃度。在該味道測(cè)試中,由至少5人品嘗一系列含有苦味化合物的水溶
液(在優(yōu)選實(shí)例中,苦味化合物是r^ ^激動(dòng)劑)。每種人將苦味程 度以從o到ioo的標(biāo)記的標(biāo)尺排列(o為"幾乎檢測(cè)不到",ioo為"可
想象到的最強(qiáng)烈的")。接著,備人品嘗一系列含有苦味化合物和T^ 7^
抑制劑的水溶液并將每個(gè)樣品的苦味程度排列。通過(guò)苦味長(zhǎng)度的降低
測(cè)量7^ 7f抑制劑的有效性。作為比較的手段,還由每個(gè)受試者測(cè)試 和評(píng)估了已知的苦味化合物(硫酸套寧)。味道測(cè)試的結(jié)果以所有受
試者中的平均等級(jí)表示。 結(jié)論
這些測(cè)定法的結(jié)果表明鈣成像測(cè)定法可以用以鑒定特異結(jié)合本發(fā) 明的h77/ 7f多肽的苦味化合物并且證明hn/ 7^是人類中的苦味受體。
因此,該受體可以用于本發(fā)明的篩選測(cè)定法中鑒定調(diào)節(jié)、優(yōu)選抑制至
少與"i 7f受體多肽相關(guān)的苦味的化合物。在這方面,發(fā)現(xiàn)結(jié)合T^ 7f 的苦味化合物包括番木鳘堿,其是在馬錢屬種子中發(fā)現(xiàn)的天然存在的 毒性生物堿,在人類中的苦味閾值為0. OlmM,和PROP苦味化合物, 其對(duì)于PROP嘗味者的苦味閾值為0. OlmM。因此,如所預(yù)期的,"及76
力中起功能作用。
因此,使用本測(cè)定法鑒定的調(diào)節(jié)劑可以用于為食品和飲料提供苦 味。備選地,這些化合物可以用作測(cè)定法中的激動(dòng)劑用以鑒定苦味阻 斷劑和調(diào)節(jié)劑和其他苦味化合物。
參考文獻(xiàn)
下面所列的參考文獻(xiàn)以及本說(shuō)明書(shū)中引用的所有參考文獻(xiàn)都引入
本文作為參考,以至于它們補(bǔ)充、解釋本文中所用的方法、技術(shù)和/
或組合物提供背景或教導(dǎo)。
Adler E, Hoon MA, Mueller KL, Chandrashefcar J, Ryba NJ, Zuker CS (2000) A
novel family of邁ammalian taste receptors. CeW 100(6): 693-702.
Altechul SF, Gish W, Miller W, Myers EW. & Lipman DJ (1990) Basic Local
Alignment Search Tool. 7 M)Z胸215:403-410.Ausubel F, ed (1995〉 Short Protocols in Molecular Biolog . 3rd ed. Wiley, New York.
Barton GJ (1998) Protein Sequence Alignment Techniques. A;to C77s《aW0gr
及oZ Cr,"ogr 54:1139-1146. Bateman A, Birney E, Durbin R, Eddy SR, Howe KL & Sonnham邁er EL (2000〉
The PFAM Protein Families Database. iVucteic <4cids ites 28:263-266. Batzer MA, Carlton JE & Deininger PL (1991〉 Enhanced Evolutionary PCR
Using Oligonucleotides with Inosine at the 3'- Terminus. Nucleic Acids
Res 19:5081.
Berridge & Irvine (1984) Inositol trisphosphate, a novel second messenger in
cellular signal transduction. iVa似re 312:315-321. Bodanszky M (1993) PrinciDles of Peptide Synthesis, 2nd rev. ed.
Springer-Verlag, Berlin / New York. Bourne HR, Sanders DA & McCormick F (1990〉 The GTPase superfa邁ily: a
conserved switch for diverse cell functions. iVaf"re 348:125-132, Bourne HR, Sanders DA & McCormick F (1991) iVaiwre The GTPase
superfa邁ily: conserved structure and molecular mechanism. 349:117-127. Brookes AJ (1999) The Essence of SNPb. Gene 234:177-186. Burge C & Karlin S (1997) Prediction of Complete Gene Structures in Human
Genomic DNA. t/M Z5ioZ 268:78-94. Burge CB & Karlin S (1998) Finding the Genes in Genomic DNA- Curr Qpin
說(shuō)ruc《壓oZ 8:346-354. Capecchi MR (1989a) Altering the Ge加邁e by Homologous Recombination.
Science 244:1288-1292. Capecchi MR (1989b) Altering the Genome by Homologous Recombination.'
Science 244:1288-1292. Chan DW (1996) Immu加assav Automation: An Updated Guide to Systems. Academic Press, San Diego, California, United States of America.Chandrashekar J, Mueller KL, Hoon MA Adler E, Feng L, Guo \y, Zuker CS, Ryba NJ (2000) T2Rs ftinction as bitter taste receptors. CeH 100(6): 703-711.
Chiang LW (1998〉 Detection of Gene Expression in Single Neurons by Patch-Clamp and Single-Cell Reverse Transcriptase Polymerase Chain R卿ticm. J CTiromoto^r A 806:209-218. Conner BJ, Reyes AA, Morin C, IteJmra T印litz RL & Wallace RB (1983〉 Detection of Sickle Cell Beta S-Globin Allele by Hybridization with Synthetic Oligonudeotides. Proc iVbW4cad Sc£ 80:278-282. Costanzi E, Beccari T, Stinchi S, Bibi L, Hopwood JJ & Orlacchio A (2000) Gene Encoding the Mouse Sulphamidase: cDNA Cloning, Structure, and Chromosomal Mapping. Afcwnm Ge/iome 11:436-439, Deisenhofer J, Epp 0, MiM K, Huber R & Michel H (1984) X-Ray Structure Analysis of a Membrane Protein Complex. Electron Density Map at 3 a Resolution and a Model of the Chromophores of the Photosynthetic Reaction Center fro邁Rhodopseudo咖na.B Viridis. JMoZ JBioi! 180:385-398. Felley-Bosco E, Ambs S, Lowenstein CJ, Keefer LK & Harris CC (1994) Constitutive expression of inducible nitric oxide synthase in human bronchial epithelial cells induces c-fos and stimulates the cGMP pathway. Ji esp Cell cmrf AfoZ 5ioZ ", 159-164. Fewell JG, MacLaughHn F, Mehta V, Gondo M, Nicol F, Wilson E & Smith LC (2001) Gene Therapy for the Treatment of Hemophilia B Using PINC Formulated Plasmid Delivered to Muscle with Electroporation. 3fo/ 7%gr 3:574-583.
Frank & Doring (1988〉 Simultaneous Multiple Peptide Synthesis Under.
Continuous Flow Conditions On Cellulose Paper Discs As Segmental Solid
Supports. Tetra/iedro/i 44:60316040. Freshney RI (1987) Culture of Ani邁al Gells: A Manual of Basic Technique, 2nd
ed. A.R. Liss, New York.Geysen服,Rodda SJ, Mason TJ, Tribbick G & Schoofs PG (1987) Strategies for epitope analysis using peptide synthesis, t/ J饑;n認(rèn)Afe /i J股259-274.Glover DM & Hames BD (1995〉 DNA Cloning: A Practical A睛oach. 2nd ed. IRL Press at Oxford University Press, Oxford / New York.Guo SW & Reed DR (2001) The genetics of phenylthiocarbamide perception. A/m ifum胸28:111-142.Harlow E & Lane D (1988) Antibodies: A Laboratory Manual. Cold SpringHarbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, United States ofAmsrica.Henikoff JG, Pietrokovski S, McCallum CM & Henikoff S (2000) Blocks-Based Methods for Detecting Protein Homology.五tecfro/)/ioresis 21:1700-1706.Henikoff S & Henikoff JG (1992〉 Amino Acid Substitution Matrices from Protein Blocks, i^oc M "/lead Sd, 89:10915-10919.Heniko任S & Henikoff JG (2000) Amino Acid Substitution Matrices. /Vo-efra C/ie/n 54:73-97.Homola J, Yee S & Gauglitz G (1999) Surface Plasmone Resonance Sensors:Review. Sensors and A;tuotors B 54:3-15, Hoon MA, Adler E, Lindemeier J, Battey <IF, Ryba NJP & Zuker CS (1995)"Functional expression of the taste specific G protein, alpha-gustducin."Ce 96629-636,Huang CC, Novak WR, Babbitt PC, Jewett Al, Ferrin TE & Klein TE (2000〉Integrated Tools for Structural and Sequence Alignment and Analysis.■Pac Symp Bioco邁put:230-241. Hutchens & Yip (1993) New Desorption Strategies for the Mass SpectrometricAnalysis of Macromoleculbs. Jfapid Communications《n Mczss Spectroscopy7:576-580.Ishikawa E (1999) Ultrasensitive and Rapid Enzyme Im邁u加assa . Elsevier, Amsterdam / New York.Jayaraman S, Teitler L, Skalski B & Verkman AS (1999) Long-Wavelength Iodide-Sensitive Fluorescent Indicators for Measurement of Functional CFTR Expression in Cells. Am J Physiol 277:C1008.1018.Joyner AL (1993〉 Gene Targeting: A Practical Approach. Oxford University Press, Oxford / New York,Karlin S & Altechul SF (1993) Applications and Statistics for Multiple High-Scoring Segments in Molecular Sequences. Piroc iVb" A:od Sci, 90:5873-5877.Kozal MJ, Shah N, Shen N, Yang R, Fucini R, Merigan TC, Richman DD, Morris D, Hubbell E, Chee M & Gingeras TR (1996) Extensive polymorphisms observed in HIV-1 clade B protease gene using high-density oligonucleotide arrays. iVcrf Afed 2(7):753-759.Kyte J & Doolittle RF (1982〉 A Simple Method for Displaying the Hydropathic Character of a Protein. J AfoZ BioZ 157:105-132.Landegren U, Nilsson M & Kwok PY (1998) Reading Bits of Genetic Information:Methods for Single-Nucleotide Polymorphism Analysis. Ge加/ree丑es 8:769-776. Law (1996) Immunoassay: A Practical Guide. Tavlor & Francis, Liondon/Bristolj Pennsylvania, United States of America.Lindemann B, (2001) Receptors and transduction in taste. Wat《t*re 413(6852): 219-225.Maalouf GJ, Xu W, Smith TF & Mohr SC (1998) Homology Model for the Ligand-Binding Domain of the Human Estrogen Receptor. J jBiomof Struct 15:841-851.Mak P, McDonnell DP, Wei辟l NL, Schrader WT & O'Malley BW (1989) Expression of Functional 'Chicken Oviduct Progesterone Receptors in Yeast (Sacc/ioromyces Cereuisiae). e/ J3ioZ C7ie饑264:21613-21618.Manson MM (1992〉 Immunochemical Protocols. Humana Press, Totowa, New Jersey, United States of America Masseyeff RF, Albert WHW & Staines N (1993) Methods of Immunological Analysis.VCH Verlagsgesellschaft; VCH Publishers, V^einheim (Federal Republic of Germany) / New York, New York (United States of America).Mateunami H, Mont呵yeur JP, Buck LB (2000) A family of candidate taste receptors in human and mouse. Atowe 404(6778〉 601-604.Merrifield (1963) J Am C/iem Soc 85:2149-2154.MistUi & Spector (1997) JVa 孜og 5:961-964.Needleman SB & Wunsch CD (1970) A General Method Applicable to the Search for Similarities in the Amino Acid Sequence of Two Proteins. J MoZ BioZ 48:443453.Nickerson DA, Kaiser R, Lappin S, Stewart J, Hood L & Landegren U (1990) Automated DNA Diagnostics Using an ELISA-Based Oligonucleotide Ligation Assay. iVoc iVa". Acad Sc£, C/fiA 87:8923-8927.Offermanns S & Simon MI (1995) G alpha 15 and G alpha 16 couple a wide variety of receptors to phospholipase C, J" J3ioZ C/ie;n 270:15175-15180.Ohtsuka E, Mateuki S, Ikehara M, Takahashi Y & Mateubara K (1985) An Alternative Approach to Deoxyoligonucleotides as Hybridization Probes by Insertion of Deoxyinosi加at A邁biguous Codon Positions, i/ BioZ C/ie/n 260:2605-2608.Orita M, Iwahana H, Kanazawa H, Hayashi K & Sekiya T (1989) Detection of Polymorphisms of Hu邁an DNA by Gel Electrophoresis as Single*Stran(i Conformation Polymorphisms. ^FVoc JVa" A:od Sci, t/SA 86:2766-2770.PCT International Publication No. WO 99/26966PCT International Publication No. WO 01/18050PCT International Publication No. WO 01/77676Pitcher A Freedman NJ & Lefkowitz RJ (1998) G protein-coupled receptor kinases,i2et/ Bioche邁67:653-92.Quandt K Freeh & Karas H, Wingender E & Werner T (1995) Matind and Matinspector: New Fast and Versatile Tools for Detection of Consensus Matches in Nucleotide Sequence Data. M*cfei'c 4cids ites 23:4878-4884.Roberts L (1991) GRAIL Seeks out Genes Buried in DNA Sequence. Scie騰 254:805.Rossolini GM, Cresti S, Ingianni A, Cattani P, Eiccio ML & Satta G (1994) Use of Deoxyi加sine-Containing Primers Vs Degenerate Primers for Polymerase Chain Reaction Based on Ambiguous Sequence Information. M Z CeH Pro&es 8:91-98.Ryba NJP & TrindelH R (1995) "A novel GTP-binding protein gamma-subunit G gamma 8, is expressed during neurogenesis in the olfactory and vomeronasal neuroepithelia." JBioZ CTiem 270:6757-6767Sambrook J, Sambrook EF & Maniatis F (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York) United States of America.Saqi MA, Wild DL & Hartshorn MJ (1999) Protein Analyst—a Distributed Object Environment for Protein Sequence and Structure Analysis. J5io"/brmafi'cs .15:521-522.Schneider CH & Eberle AN (1993) Peptides. 1992: Proceedings of the Twenty-Second European Peptide Symposium. September 13-19, 1992. Interlaken. Switzerland. Escom' Leiden.Schr6der E & Liibke K (1965) The PeDtides. Academic Press, New York.Silhavy TJ, Berman ML, Enquist LW & Cold Spring Harbor Laboratory, (1984) Experiments with Gene Fusions. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, United States of America.Smith TF & Waterman M (1981) Comparison of Bioseque加es. Adi> i4ppZ MafA 2:482-489.Stoneking M, Hedgecock D, Higuchi RG, Vigilant L &. Erlich HA (1991) Population Variation of Hu邁an mtDNA Control Region Sequences Detected by Enzy邁atic Amplification and Sequence.Spec迅c Oligonucleotide Probes. Am J i/wm Genet 48:370-382.Taylor G, Vimr E, Garman E & Laver G (1992) Purification, Crystallization and Preliminary Crystallographic Study of Neuraminidase from Vibrio CTwtenze and Sd;ncwdto 2>pWwmr/Uwi Lt2. J Mb! BioZ 226:1287-1290.Tijssen (1993) Laboratory Techniaues in Biochemistry and Molecular Bioloev-Hvbridization with Nucleic Acid Probes. Elsevier, New YorLuU.S. Patent No. 4,115,538U.S. Patent No. 4,196,265U.S. Patent No. 4,455,842U,S. Patent No. 4,554,101U.S. Patent No. 4,736,866U.S. Patent No. 4,946,778U.S. Patent No. 5,091,513U.S. Patent No. 5,132,405U,S. Patent No, 5,162,215U.S. Patent No. 5,223,409U.S. Patent No. 5,260,203U.S. Patent No. 5,264,563U.S. Patent No. 5,436,128 U.S. Patent No. 5,489,742 U.S. Patent No. 5,498,538 U.S. Patent No. 5,550,316 U.S. Patent No. 5,573,933 U.S. Patent No. 5,629,145 U.S. Patent No. 5,614,396 U.S. Patent No. 5,625,125 U,S. Patent No. 5,648,061 U.S. Patent No. 5,650,489 U.S. Patent No. 5,667,988 U.S. Patent No. 5,677,427 U.S. Patent No. 5,702,892U.S. Patent No. 5,741,957U.S. Patent No. 5,738,996U.S. Patent No, 5,747,334U.S. Patent No. 5,756,291U.S. Patent No. 5,776,859U.S. Patent No. 5,780,225U.S. Patent No. 5,780,242U.S. Patent No. 5,824,483U.S. Patent No. 5,834,228U.S. Patent No. 5,840,479 U.S. Patent No. 5,858,670 U.S. Patent No. 5,872,011 U.S. Patent No. 5,892,019 U.S. Patent No. 5,922,254 U.S. Patent No. 5,948,635 U,S. Patent No. 6,004,808 U.S. Patent No. 6,057,098 U.S. Patent No. 6,107,059 U.S. Patent No. 6,140,123 U.S. Patent No. 6,156,511 U.S. Patent No. 6,168,912 U.S. Patent No. 6,174,708 U.S. Patent No. 6,176,089 U.S. Patent No. 6,180,348 U.S. Patent No. 6,190,700 U.S. Patent No. 6,214,553 U.S. Patent No. 6,255,059 U.S. Patent No. 6,403,305Walker 'MR & Rapley R (1993) Molecular and Antibody Probes in Diagnosis. Wiley,Chich6st6r / New York,Wang DG, Fan JB, Siao CJ, Berao A, Young P, Sapolsky R, Ghandour G, Perkins N, Winchester E, Spencer J, Kruglyak L, Stein L, Hsie L, Topaloglou T, Hubbell E, Robinson E, Mittmann M, Morris MS, Shen N, Kilb證D, Rioux J, Nusbau邊C, Rozen S, Hudson TJ, Lander ES & et al. (1998) Large-Scale Identification, Mapping, and Genotyping of Single-Nucleotide Polymorphisms in the Human Genome. Scie/ice 280:1077-1082. Weiss MS, Wacker T, Weckesser J, Welte W & Schulz GE (1990) The Three-Dimensional Structure of Porin &om Rhodobacter Capsulatus at 3 a Resolution. F五BS ie 267:268-272. WilMe TM, Scherie PA, Strathmann MP, S印ak VZ & Simon MI (1991) Characterization of G-protein alpha subunits in the Gq class: expression in murine tissues and in stromal and hematopoietic cell lines. Proc iVa" Sci' 88:10049-10053. Wong GT, Gannon KS, Margolskee RF (1996) Transduction of bitter and sweettaste by gustducin. iVcrf訳381(6585): 796-800. Worrall TA Cotter RJ & Woods AS (1998) Purification of Contaminated Peptides and Proteins on Synthetic Membrane Surfaces for Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometiy. Ano2 C/iem 70:750-756, Wyckoff HW, Hire CHW & Tim站heff SN (1985) Diffraction Methods for Biological Macromolecules. Academic Press, Orlando, Florida, United States of America.Yuan B, Thomas JP, von Kodolitsch Y & Pyeritz RE (1999) Comparison of Heteroduplex Analysis, Direct Sequencing, and Enzyme Mismatch Cleavage for Detecting Mutations in a Large Gene, FBNl. i7u;n Mttot 14:440-446.將理解可以改變本發(fā)明的多個(gè)細(xì)節(jié)而不背離本發(fā)明的范圍。此外, 前面的描述僅僅用于闡明,并且不用于限制本發(fā)明,本發(fā)明由所附的 權(quán)利要求限定。
權(quán)利要求
1.分離的T2R76核酸分子,其包含(a)編碼SEQ ID NO2中所含的多肽的分離的核酸分子;(b)包含SEQ ID NO1的分離的核酸分子;或(c)分離的核酸分子,其編碼的多肽與SEQ ID NO1編碼的多肽有至少90%序列同一性并且特異應(yīng)答至少一種苦味配體,該苦味配體特異結(jié)合SEQ ID NO2中所含的多肽。
2. 分離的"i 7f核酸分子,其選自(a) 分離的核酸分子,其編碼含有SEQ IDN0:2中所含多肽的多肽;(b) 包含SEQ ID N0:1中所含核酸序列的分離的核酸分子;(c) 分離的核酸分子,其與SEQ ID NO: 1的核酸序列在洗滌嚴(yán)格條 件下雜交并且編碼7"7f多肽,所述洗滌嚴(yán)格條件通過(guò)具有小于約200 mM鹽濃度的洗滌溶液和大于約45'C的洗滌溫度代表,所述77i 76多肽 特異結(jié)合至少一種苦味配體,該苦味配體特異結(jié)合SEQ ID NO: 2中所含 的7^ 76多肽;(d) 分離的核酸分子,其由于遺傳密碼簡(jiǎn)并性而在核酸序列上與上 面(a)、 (b)和(c)之一的分離的核酸分子相差至少一個(gè)功能上等同的密 碼子,并且編碼上面(a)、 (b)和(c)之一的分離的核酸編碼的T^W7f多 肽。
3. 權(quán)利要求1的分離的7^ 7f核酸分子,其包含(a) 編碼SEQ ID NO: 2的多肽的分離的核酸分子;或(b) SEQ ID NO: 1的分離的核酸分子。
4. 檢測(cè)r^7《核酸分子的方法,該方法包括(a) 得到具有核酸物質(zhì)的生物樣品;(b) 將分離的"i 76核酸分子在嚴(yán)格雜交條件下與(a)的生物樣品 雜交,從而在分離的77i 7f核酸和生物樣品內(nèi)的核酸之間形成雙鏈體結(jié) 構(gòu)^和(c) 檢測(cè)(b)的雙鏈體結(jié)構(gòu),從而檢測(cè)生物樣品中的77及7《核酸分子。
5. 分離的r"7f多肽,其包含(a) SEQ ID NO: 2的多肽;(b) 與SEQ ID NO: 2實(shí)質(zhì)上同一的多肽;(c) SEQ ID NO: 1的核酸分子編碼的多肽;或(d) 與SEQ ID N0:1實(shí)質(zhì)上同一的核酸分子編碼的多肽。
6. 權(quán)利要求5的分離的7Z 7f多肽,其還包含選自如下的核酸分 子編碼的多肽(a) 分離的核酸分子,其編碼SEQ ID N0:2的多肽;(b) SEQ ID NO: l的分離的核酸分子;(c) 分離的核酸分子,其與7^ 7f核酸序列在洗滌嚴(yán)格條件下雜交 并且編碼T^ 76多肽,所迷洗滌嚴(yán)格條件通過(guò)具有小于約200 mM鹽濃 度的洗滌溶液和大于約45。C的洗滌溫度代表;(d) 分離的核酸分子,其由于遺傳密碼簡(jiǎn)并性而在核酸序列上與上 面(a) 、 (b)和(c)之一 的分離的核酸分子相差至少一個(gè)功能上等同的密 碼子,并且編碼上面(a)、 (b)和(c)之一的分離的核酸分子編碼的7^ 7f 多肽。
7. 權(quán)利要求5的分離的7^ 76多肽,其包含SEQ ID NO: 2。
8. 權(quán)利要求5的分離的")?多肽,其與至少一種其他T2R多肽相 關(guān)聯(lián)。
9. 權(quán)利要求8的分離的r"多肽,其中所述其他T2R多肽是另一 種人T2R。
10. 權(quán)利要求9的分離的"/ 多肽,其中所述其他人T2R選自人 T2R51、 T2R54、 T2R55、 T2461、 T2R63、 T2R64、 T2R65、 T2R67、 T2R71、 T2R75、 T2R59和T2R33。
11. 產(chǎn)生抗體的方法,該抗體特異識(shí)別權(quán)利要求1中所述的(a)、 (b)和(c)的分離的核酸序列編碼的7^ 76多肽。
12. 權(quán)利要求10的方法,其中所述分離的7^i 7d"多肽包含SEQ ID NO: 2。
13. 權(quán)利要求8的方法,其還包括制備單克隆抗體。
14. 權(quán)利要求11的方法產(chǎn)生的抗體。
15. 檢測(cè)r^7(f多肽水平的方法,該方法包括(a) 得到具有肽物質(zhì)的生物樣品;(b) 通過(guò)與權(quán)利要求14的抗體的免疫化學(xué)反應(yīng)檢測(cè)(a)的生物樣 品中的7^ 7f多肽,從而測(cè)定樣品中7^ 7f多肽的量。
16. "W7f多肽的異源表達(dá)系統(tǒng),其包括(a) 7^ 7f多肽,和(b) 表達(dá)r^7^多肽的異源宿主細(xì)胞。
17. 權(quán)利要求16的系統(tǒng),其中r^ M多肽包括(a) SEQ ID NO: 2的多肽;(b) 與SEQ ID NO: 2實(shí)質(zhì)上同一的多肽;(c) SEQ ID NO: 1的核酸分子編碼的多肽;或(d) 與SEQ ID N0:1實(shí)質(zhì)上同一的核酸分子編碼的多肽。
18. 權(quán)利要求17的系統(tǒng),其中rM7f多肽還包含選自下面的核酸 分子編碼的多肽(a) 分離的核酸分子,其編碼SEQ ID N0:2的多肽;(b) SEQ ID NO: l的分離的核酸分子;(c) 分離的核酸分子,其與U) 7(f核酸序列在洗滌嚴(yán)格條件下雜交 并且編碼r^7(f多肽,所述洗滌嚴(yán)格條件通過(guò)具有小于約200 mM鹽濃 度的洗滌溶液和大于約45。C的洗滌溫度代表;(d) 分離的核酸分子,其由于遺傳密碼簡(jiǎn)并性而在核酸序列上與上 面(a)、 (b)和(c)之一的分離的核酸分子相差至少一個(gè)功能上等同的密 碼子,并且編碼上面(a)、 (b)和(c)之一的分離的核酸分子編碼的f^7f 多肽。
19. 權(quán)利要求18的系統(tǒng),其中所述分離的r^7f多肽包含SEQ ID NO: 2。
20. 權(quán)利要求18的系統(tǒng),其還包含編碼另一 T2R的核酸。
21. 權(quán)利要求16的系統(tǒng),其中所述宿主細(xì)胞包括哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
22. 權(quán)利要求21的系統(tǒng),其中所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞包括人細(xì)胞。
23. 權(quán)利要求16的系統(tǒng),其中所述宿主細(xì)胞還包含能夠與7^ 76 多肽偶聯(lián)的G蛋白a亞基。
24. 權(quán)利要求23的系統(tǒng),其中所述G蛋白a亞基包含泛主G蛋白。
25. 權(quán)利要求24的系統(tǒng),其中所述泛主G蛋白包含Ga15。
26. 權(quán)利要求23的系統(tǒng),其中所述G蛋白包含轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白或者味轉(zhuǎn) 導(dǎo)素,或者嵌合G蛋白。
27. 鑒定7^ 76多肽調(diào)節(jié)劑的方法,該方法包括(a) 提供重組表達(dá)系統(tǒng),從而在異源宿主細(xì)胞中單獨(dú)或者與至少一 種其他T2R多肽相組合地表達(dá)rM7《多肽;(b) 對(duì)(a)的系統(tǒng)提供受試物質(zhì);(c) 在受試物質(zhì)存在下測(cè)定"i 7f功能的水平或者質(zhì)量;(d) 比較在受試物質(zhì)存在下的"A76功能的水平或者質(zhì)量與77i 7f 功能的對(duì)照水平或者質(zhì)量;和(e) 通過(guò)測(cè)定在受試物質(zhì)存在下的7^ 76功能的水平或者質(zhì)量與 7^ 7f功能的對(duì)照水平或者質(zhì)量相比為顯著改變的,將受試物質(zhì)鑒定為 "i 7f調(diào)節(jié)劑。
28. 權(quán)利要求27的方法,其中所述77i 7f多肽包括(a) SEQ ID NO: 2的多肽;(b) 與SEQ ID N0:2實(shí)質(zhì)上同一的多肽;(c) SEQ ID NO: 1的核酸分子編碼的多肽;或(d) 與SEQ ID N0:1實(shí)質(zhì)上同一的核酸分子編碼的多肽。
29. 權(quán)利要求28的方法,其中rM7f多肽還包含選自下面的核酸 分子編碼的多肽(a) 分離的核酸分子,其編碼SEQ ID N0:2的多肽;(b) SEQ ID NO: l的分離的核酸分子;(c) 分離的核酸分子,其與T^ 7^核酸序列在洗滌嚴(yán)格條件下雜交 并且編碼7^ M多肽,所述洗滌嚴(yán)格條件通過(guò)具有小于約200 mM鹽濃 度的洗滌溶液和大于約45'C的洗滌溫度代表;(d)分離的核酸分子,其由于遺傳密碼簡(jiǎn)并性而在核酸序列上與上 面(a) 、 (b)和(c)之一的分離的核酸分子相差至少一個(gè)功能上等同的密 碼子,并且編碼上面(a)、 (b)和(c)之一的分離的核酸編碼的77i 7f多 肽。
30. 權(quán)利要求29的方法,其中所述分離的7^ 7f多肽包含SEQ ID NO: 2。
31. 權(quán)利要求27的方法,其中所述宿主細(xì)胞包括哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
32. 權(quán)利要求31的方法,其中所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞包括人細(xì)胞。
33. 權(quán)利要求27的方法,其中所述宿主細(xì)胞還包含能夠與r"7f 多肽偶聯(lián)的G蛋白o(hù)t亞基。
34. 權(quán)利要求33的方法,其中所述G蛋白a亞基包含泛主G蛋白。
35. 權(quán)利要求34的方法,其中所述泛主G蛋白包含Ga15。
36. 權(quán)利要求33的方法,其中所述泛主G蛋白包含轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白、味 轉(zhuǎn)導(dǎo)素或者嵌合G蛋白。
37. 權(quán)利要求27的方法,其中所述測(cè)定包括測(cè)定GTPYS結(jié)合的量。
38. 權(quán)利要求27的方法鑒定的r^ 7f調(diào)節(jié)劑。
39. 權(quán)利要求38的7^ 76調(diào)節(jié)劑,其還包含選自蛋白質(zhì)、肽、抗 體、核酸和小分子的調(diào)節(jié)劑。
40. 調(diào)節(jié)受試者中苦味味覺(jué)的方法,該方法包括(a) 制備包含權(quán)利要求38的調(diào)節(jié)劑的組合物;(b) 對(duì)受試者施用有效劑量的所述組合物,從而改變受試者中的 苦味味覺(jué)。
41. 權(quán)利要求40的方法,其中所述組合物還包括食品、飲料、口 腔洗劑、潔牙劑、化妝品或者藥物。
42. 權(quán)利要求40的方法,其還包括共同施用包含調(diào)節(jié)劑的組合物 和選自食品、飲料、口腔洗劑、潔牙劑、化妝品和藥物的組合物。
43. 權(quán)利要求40的方法,其中所述受試者是哺乳動(dòng)物。
44. 權(quán)利要求43的方法,其中所述哺乳動(dòng)物是人。
45. 鑒定7^ 76多肽調(diào)節(jié)劑的方法,該方法包括(a) 將僅7^ 76多肽或者與至少一種其他T2R多肽相關(guān)聯(lián)地表達(dá)的 7^ 7f多肽接觸一種或多種受試物質(zhì);(b) 測(cè)定受試物質(zhì)與分離的7^ 7f多肽或者r"76多肽組合的結(jié)合;和(c) 選擇表現(xiàn)出對(duì)77i 76多肽特異結(jié)合的候選物質(zhì)。
46. 權(quán)利要求45的方法,其中所述r^76多肽包含(a) SEQ ID NO: 2的多肽;(b) 與SEQ ID NO: 2實(shí)質(zhì)上同一的多肽;(c) SEQ ID NO: 1的核酸分子編碼的多肽;或(d) 與SEQ ID NO: 1實(shí)質(zhì)上同一的核酸分子編碼的多肽。
47. 權(quán)利要求46的方法,其中r"7d"多肽還包含選自下面的核酸 分子編碼的多肽(a) 分離的核酸分子,其編碼SEQ ID N0:2的多肽;(b) SEQ ID NO: l的分離的核酸分子;(c) 分離的核酸分子,其與77i 7f核酸序列在洗滌嚴(yán)格條件下雜交 并且編碼7^ 7d"多肽,所述洗滌嚴(yán)格條件通過(guò)具有小于約200 mM鹽濃 度的洗滌溶液和大于約45'C的洗滌溫度代表;(d) 分離的核酸分子,其由于遺傳密碼簡(jiǎn)并性而在核酸序列上與上 面(a) 、 (b)和(c)之一 的分離的核酸分子相差至少一個(gè)功能上等同的密 碼子,并且編碼上面(a)、 (b)和(c)之一的分離的核酸分子編碼的"A7f 多肽。
48. 權(quán)利要求47的方法,其中所述分離的r"76多肽包含SEQ ID NO: 2。
49. 權(quán)利要求48的方法鑒定的T^ 7f調(diào)節(jié)劑。
50. 權(quán)利要求49的7^ 76調(diào)節(jié)劑,其還包含選自蛋白質(zhì)、肽、抗 體、核酸和小分子的調(diào)節(jié)劑。
51. 調(diào)節(jié)受試者中苦味味覺(jué)的方法,該方法包括(a) 制備包含權(quán)利要求49的調(diào)節(jié)劑的組合物;(b) 對(duì)受試者施用有效劑量的所述組合物,從而改變受試者中的苦味味覺(jué)。
52. 權(quán)利要求51的方法,其中所述組合物還包括食品、飲料、口 腔洗劑、潔牙劑、化妝品或者藥物。
53. 權(quán)利要求51的方法,其還包括共同施用包含調(diào)節(jié)劑的組合物 和選自食品、飲料、口腔洗劑、潔牙劑、化妝品和藥物的組合物。
54. 權(quán)利要求51的方法,其中所述7^ 7f調(diào)節(jié)劑選自蛋白質(zhì)、肽、 抗體、核酸和小分子。
55. 權(quán)利要求51的方法,其中所述受試者是哺乳動(dòng)物。
56. 權(quán)利要求55的方法,其中所述哺乳動(dòng)物是人。
57. 減輕苦味化合物的苦味味覺(jué)的方法,該方法包括對(duì)受試者共同 施用T^ 7d"抑制劑和所述苦味化合物。
58. 權(quán)利要求57的方法,其中所述共同施用包括施用包含與所述 苦味化合物混合的7^ 76抑制劑的組合物。
59. 權(quán)利要求57的方法,所述"W7f抑制劑還包含選自蛋白質(zhì)、 肽、抗體、核酸和小分子的調(diào)節(jié)劑。
60. 權(quán)利要求57的方法,其中所述苦味化合物包括食品、飲料、 口腔洗劑、潔牙劑、化妝品或者藥物。
61. 權(quán)利要求57的方法,其中所述受試者是哺乳動(dòng)物。
62. 權(quán)利要求61的方法,其中所述哺乳動(dòng)物是人。
63. 增強(qiáng)化合物的苦味味覺(jué)的方法,該方法包括對(duì)受試者共同施用 76激動(dòng)劑和所述化合物。
64. 權(quán)利要求63的方法,其中所述共同施用包括施用包含與所述 化合物混合的77i 76激動(dòng)劑的組合物。
65. 權(quán)利要求63的方法,其中所述"A7《激動(dòng)劑還包含選自蛋白 質(zhì)、肽、抗體、核酸和小分子的調(diào)節(jié)劑。
66. 權(quán)利要求63的方法,其中所述受試者是哺乳動(dòng)物。
67. 權(quán)利要求66的方法,其中所述哺乳動(dòng)物是人。
68. 鑒定調(diào)節(jié)7^ 7f味覺(jué)感受器的化合物的測(cè)定法,其包括(U測(cè)定化合物對(duì)權(quán)利要求5、 6或7的至少一種7^ 76多肽的由PROP或番木蹩堿誘導(dǎo)的活化的影響;(ii)測(cè)定所述化合物是否基于它對(duì)所述受體多肽被PROP或者番 木鱉堿活化的影響來(lái)調(diào)節(jié)hny 76多肽。
69. 權(quán)利要求68的測(cè)定法,其中所述h7^ 76多肽與SEQ ID NO: 2 中所含的多肽至少90%同一。
70. 權(quán)利要求69的測(cè)定法,其中所述"i 7f多肽與SEQ ID NO: 2 中所含的多肽有至少95%序列同一性。
71. 權(quán)利要求69的測(cè)定法,其中所述Wi 7f多肽與SEQ ID NO: 2 中所含的多肽有至少96%序列同一性。
72. 權(quán)利要求69的測(cè)定法,其中所述77i 7《多肽與SEQ ID NO: 2 中所含的多肽有至少97%序列同一性。
73. 權(quán)利要求69的測(cè)定法,其中所述77i 7f多肽與SEQ ID NO: 2 中所含的多肽有至少98%序列同一性。
74. 權(quán)利要求69的測(cè)定法,其中所述77W7f多肽與SEQ ID NO: 2 中所含的多肽有至少99%序列同一性。
75. 權(quán)利要求69的測(cè)定法,其中所述T^ 7f多肽具有SEQ IDNO: 2 中所含的序列。
76. 權(quán)利要求75的測(cè)定法,其中所述77^7^多肽與另一種多肽融合。
77. 權(quán)利要求76的測(cè)定法,其中所述多肽是視紫紅質(zhì)多肽。
78. 權(quán)利要求77的測(cè)定法,其中所述視紫紅質(zhì)是人、嚙齒動(dòng)物或 者牛視紫紅質(zhì)。
79. 權(quán)利要求76的測(cè)定法,其中所述融合的多肽是可檢測(cè)的多肽。
80. 權(quán)利要求79的測(cè)定法,其中所述多肽是綠色熒光多肽。
81. 權(quán)利要求69的測(cè)定法,其中所述7^ 76多肽在分離的細(xì)胞膜 上表達(dá)。
82. 權(quán)利要求69的測(cè)定法,其中所述7^ 7f多肽被完整細(xì)胞表達(dá)。
83. 權(quán)利要求82的測(cè)定法,其中所述細(xì)胞是真核細(xì)胞。
84. 權(quán)利要求83的測(cè)定法,其中所述細(xì)胞是哺乳動(dòng)物、兩棲動(dòng)物、昆蟲(chóng)或酵母細(xì)胞。
85. 權(quán)利要求84的測(cè)定法,其中所述細(xì)胞選自HEK293、 BHK、 COS、 HEK293T、 CHO和爪蟾細(xì)胞。
86. 權(quán)利要求69的測(cè)定法,
87. 權(quán)利要求69的測(cè)定法,
88. 權(quán)利要求69的測(cè)定法 的影響。
89. 權(quán)利要求88的測(cè)定法,
90. 權(quán)利要求69的測(cè)定法響。
91. 權(quán)利要求69的測(cè)定法-轉(zhuǎn)錄的影響。
92. 權(quán)利要求69的測(cè)定法,其對(duì)阻斷所述r^ 7f多肽與PROP或番 木豎堿相互作用的化合物加以選擇。
93. 權(quán)利要求69的測(cè)定法,其檢測(cè)所述化合物對(duì)cAMP、 cGMP或 IP3的影響。
94. 權(quán)利要求69的測(cè)定法,其使用鈣或者鈉特異性熒光染料檢測(cè) 鉤的改變。
95. 權(quán)利要求94的測(cè)定法,其中所述染料是Fluo-3、 Fluo-4或 Fura-2。
96. 權(quán)利要求69的測(cè)定法,其中所述7^ 76多肽包含在溶液中。
97. 權(quán)利要求69的測(cè)定法,其中所述r"76多肽附著到固相基質(zhì)。
98. 權(quán)利要求69的測(cè)定法,其是高通量篩選測(cè)定法。
99. 權(quán)利要求98的測(cè)定法,其篩選結(jié)構(gòu)上不同的化合物的文庫(kù)。
100. 權(quán)利要求98的測(cè)定法,其篩選結(jié)構(gòu)上相關(guān)的化合物的文庫(kù)。
101. 權(quán)利要求69的測(cè)定法,其中所述受體由HEK-293細(xì)胞表達(dá)。
102. 權(quán)利要求69的測(cè)定法,其中所述細(xì)胞表達(dá)與所述77i 7f多肽 功能性地偶聯(lián)的G蛋白。
103. 權(quán)利要求102的測(cè)定法,其中所述G蛋白是轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白、味轉(zhuǎn)其是熒光測(cè)定法。 其是結(jié)合測(cè)定法。 ,其檢測(cè)所述化合物對(duì)細(xì)胞內(nèi)離子濃度其中所述離子是鈉或鈣。 ,其檢測(cè)所述化合物對(duì)細(xì)胞膜電位的影,其檢測(cè)所述化合物對(duì)所述7^ 7(f多肽導(dǎo)素、Gotl5、 Gocl6或者其嵌合體。
104. 權(quán)利要求103的測(cè)定法,其中所述G蛋白是gust44Got16。
105. 權(quán)利要求69的測(cè)定法,其檢測(cè)所述化合物對(duì)分光特征、流體 力學(xué)特征或者溶解性的影響。
106. 權(quán)利要求69的測(cè)定法,其是熒光偏振測(cè)定法。
107,權(quán)利要求69的測(cè)定法,其檢測(cè)所述化合物對(duì)所述r^76多肽與 G蛋白的復(fù)合的影響。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了編碼T2R76多肽的分離的核酸、重組表達(dá)的T2R76多肽、用于T2R76多肽重組表達(dá)的異源性表達(dá)系統(tǒng)、使用該系統(tǒng)的測(cè)定方法,和通過(guò)施用T2R76調(diào)節(jié)劑改變味覺(jué)的方法。這些T2R76多肽可以單獨(dú)表達(dá)或者與另一T2R多肽、優(yōu)選不同的人T2R多肽共表達(dá)。這些T2R76多肽特異應(yīng)答苦味配體,包括番木鱉堿和丙基硫尿嘧啶(PROP),因此可以用于測(cè)定法中,該測(cè)定法鑒定調(diào)節(jié)、優(yōu)選阻斷苦味的化合物。
文檔編號(hào)A61K38/00GK101595118SQ200680023589
公開(kāi)日2009年12月2日 申請(qǐng)日期2006年7月17日 優(yōu)先權(quán)日2005年7月18日
發(fā)明者紅 徐, 李曉東 申請(qǐng)人:塞諾米克斯公司