專利名稱：朝藿定c對(duì)照品的制備方法及其產(chǎn)品的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種朝藿定C對(duì)照品的制備方法及其產(chǎn)品，屬于藥材中指標(biāo)成分的提取技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
淫羊藿為常用中藥，具有補(bǔ)腎陽、強(qiáng)筋骨、祛風(fēng)濕之功效，主要用于陽痿遺精，筋骨痿軟，風(fēng)濕痹痛，麻木拘攣，更年期高血壓等癥。淫羊藿所含總黃酮類成分為有效部位之一，包括淫羊藿苷等至少六種以上的黃酮類成分，朝藿定C(epimedin C)是其中的一種。經(jīng)研究得知淫羊藿的有效部位(總黃酮)中朝藿定C的含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他黃酮類成分。而目前，藥典要求的淫羊藿藥材的指標(biāo)性成分僅為淫羊藿苷。對(duì)一種藥材進(jìn)行多種指標(biāo)物的測(cè)定，可以更全面地反映藥材的內(nèi)在質(zhì)量，對(duì)質(zhì)量控制有著重要意義。
因此，申請(qǐng)人經(jīng)過大量的試驗(yàn)研究，于2006年4月6日向國家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局遞交了名稱為“仙靈骨葆制劑中淫羊藿苷及朝藿定C的含量測(cè)定方法”的專利申請(qǐng)，申請(qǐng)?zhí)枮?006102003226。該專利申請(qǐng)彌補(bǔ)了現(xiàn)有質(zhì)量檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)的不足，使淫羊藿藥材的質(zhì)量檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)更加完善。但在申請(qǐng)?zhí)枮?006102003226的專利申請(qǐng)中，用高效液相色譜法測(cè)定朝藿定C的含量是以朝藿定C為對(duì)照品進(jìn)行測(cè)定。而目前在國內(nèi)尚未有可提供朝藿定C對(duì)照品的單位和機(jī)構(gòu)，也未見有關(guān)朝藿定C對(duì)照品的制備方法的相關(guān)報(bào)道。于是，申請(qǐng)人在研究朝藿定C的含量測(cè)定方法的過程中，同時(shí)對(duì)朝藿定C對(duì)照品的制備進(jìn)行了相關(guān)研究。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種朝藿定C對(duì)照品的制備方法及其產(chǎn)品。本發(fā)明通過對(duì)淫羊藿藥材的提取工藝進(jìn)行全面考察，確定了朝藿定C的最佳提取工藝，并成功地對(duì)朝藿定C進(jìn)行了分離和純化，所制得的化合物經(jīng)過嚴(yán)密的光譜鑒定可確認(rèn)為朝藿定C。
本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的朝藿定C對(duì)照品的制備方法為(1)提取取淫羊藿藥材，切成斷，加10-40倍量45-90％的乙醇回流2-5次，每次0.5-2h，合并所有的提取液，回收乙醇，并濃縮成60℃時(shí)相對(duì)密度為1.13-1.20；濃縮液加蒸餾水適量放置，棄沉淀，取上清液，再濃縮得浸膏；依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯萃取至近無色，再用正丁醇反復(fù)萃取至近無色，回收正丁醇至干，即得含朝藿定C粗浸膏；(2)分離用甲醇溶解含朝藿定C粗浸膏，薄層色譜用硅膠拌樣，硅膠柱色譜分離，以氯仿∶甲醇＝100∶17、100∶20、100∶22進(jìn)行梯度洗脫，以硅膠預(yù)制板跟蹤檢識(shí)，收集硅膠預(yù)制薄層層析TLC板上比移值Rf小于淫羊藿苷的斑點(diǎn)流份，回收溶劑后，即得朝藿定C粗品；粗品用甲醇溶解，柱色譜用聚酰胺拌樣，聚酰胺柱色譜分離，以乙酸乙酯∶甲醇∶水＝8∶1∶0、8∶1∶0.2進(jìn)行梯度洗脫，以聚酰胺薄膜跟蹤檢識(shí)，收集聚酰胺薄膜薄層層析TLC上比移值Rf大于淫羊藿苷的斑點(diǎn)流份，回收溶劑后，即得朝藿定C對(duì)照品。
更佳的提取過程為取淫羊藿藥材，切成斷，加20倍量70％乙醇回流3次，每次1h，合并三次的提取液，回收乙醇，并濃縮成60℃時(shí)相對(duì)密度為1.15；濃縮液加蒸餾水適量放置，棄沉淀，取上清液，再濃縮得浸膏；依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯萃取至近無色，再用正丁醇反復(fù)萃取至近無色，回收正丁醇至干，即得含朝藿定C粗浸膏。
其中硅膠薄層層析TLC的展開系統(tǒng)為氯仿∶甲醇＝100∶20。
聚酰胺薄膜薄層層析TLC的展開系統(tǒng)為乙酸乙酯∶乙醇∶水＝8∶1∶1。
按照上述朝藿定C對(duì)照品的制備方法制備得到的朝藿定C對(duì)照品，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式為 為了驗(yàn)證本發(fā)明方法的可靠性和準(zhǔn)確性，申請(qǐng)人對(duì)所制得的產(chǎn)品進(jìn)行了結(jié)構(gòu)鑒定和確認(rèn)，具體如下1、結(jié)構(gòu)鑒定所得產(chǎn)品為淺黃色結(jié)晶性粉末，鹽酸-鎂粉反應(yīng)、Molish反應(yīng)陽性，硅膠板上水解檢出葡萄糖和鼠李糖。分子式C39H50O19(MS+13C NMR)，不飽和度Ω＝15，結(jié)合氫(碳)譜、IR、UV數(shù)據(jù)，判斷為黃酮類化合物的三糖苷。
13C NMR數(shù)據(jù)δ178.2及1H NMR數(shù)據(jù)δ12.61表明該黃酮類化合物C-5上有一羥基。1H NMR數(shù)據(jù)顯示1上共有五個(gè)芳?xì)滟|(zhì)子，其中的一個(gè)質(zhì)子信號(hào)為單峰[6.63(1H，s，6-H)]，另外的四個(gè)質(zhì)子信號(hào)呈典型的B環(huán)4’-氧取代系統(tǒng)[7.90(2H，d，J＝8.8Hz，2’，6’-H)，7.13(2H，d，J＝8.8Hz，3’，5’-H)]，表明1為8位有取代的莰菲醇型黃酮類化合物。同時(shí)，氫(碳)譜顯示該化合物上有一個(gè)甲氧基信號(hào)[δH 3.84(3H，s)；δC 55.5]，經(jīng)與已知化合物的碳譜數(shù)據(jù)比較，確定該化合物4’位為甲氧基取代。另外，13C NMR數(shù)據(jù)δ17.6(q)，21.4(t)，25.5(q)，122.1(d)，131.1(s)，及1H NMR數(shù)據(jù)δ1.59(3H，s)，1.67(3H，s)，5.16(1H，t，J＝5.2Hz)表明1上有一個(gè)異戊烯基，且其C-7、C-9碳譜數(shù)據(jù)向高場(chǎng)位移，說明此異戊烯基位于8位，因此1的苷元為anhydroicartin。RDA裂解后形成的碎片峰(m/z 368，353，313，165[A1-C4H7]+和135[B2]+)進(jìn)一步支持這一結(jié)論。
13C NMR在95-106ppm之間有3個(gè)糖端基碳的共振信號(hào)δc101.6、100.7、100.5ppm；以及15個(gè)糖碳信號(hào)。經(jīng)與糖的標(biāo)準(zhǔn)碳譜數(shù)據(jù)比較，可以確定這三個(gè)糖分別為鼠李糖、鼠李糖和葡萄糖。經(jīng)與已知化合物數(shù)據(jù)比較，1H NMR、13C NMR、MS、UV、IR數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)資料中有關(guān)朝藿定C的報(bào)道一致，故可鑒定此種化合物為朝藿定C。
2、結(jié)構(gòu)確認(rèn)(1)儀器與試劑紅外光譜儀(德國VECTOR22型)、核磁共振波譜儀(美國瓦里安公司Varian 400MHz超導(dǎo)核磁共振波譜儀)、電噴霧質(zhì)譜儀(GC-MS 5973型)、紫外可見分光光度儀(HP8453E)。薄層色譜用硅膠H(青島海洋化工有限公司)，硅膠預(yù)制板(青島海洋化工廠分廠)，聚酰胺(80～120mesh浙江省臺(tái)州市路橋四青生化材料廠)，溶劑為工業(yè)級(jí)重蒸使用。
(2)熔點(diǎn)按《中國藥典》2005年版一部附錄VII C項(xiàng)下的“熔點(diǎn)測(cè)定法”方法測(cè)定。取本發(fā)明產(chǎn)品適量，研細(xì)，于105℃干燥2小時(shí)，分取適量樣品，依法測(cè)定，測(cè)定結(jié)果為198～200℃。
(3)紫外按《中國藥典》2005年版一部附錄VA項(xiàng)下的“紫外可見分光光度法”測(cè)定。本發(fā)明產(chǎn)品UVλmaxMeOHnm為271，316，351。紫外光譜顯示有黃酮特征吸收λmaxMeOHnm351和271。
(4)紅外按《中國藥典》2005年版一部附錄VC項(xiàng)下的“紅外分光光度法”測(cè)定。IR(KBr)cm-13417(OH)，2925，1651(α，β-unsaturated C＝O)，1598，1511(C＝C)，1491，1440，1377，1343，1305，1260，1220，1181，1062，983，940，919，838，810。
(5)黃色粉末(乙酸乙酯甲醇)，mp198-200℃。HCl Mg反應(yīng)呈玫瑰紅顏色，Molish反應(yīng)出現(xiàn)棕色環(huán)(陽性)，F(xiàn)eCl3反應(yīng)陽性(墨綠色)。
ESI-MS m/z823.3[M+H]+，677.2[M-rha+H]+，531.1[M-2×rha+H]+。
EI-MS m/z368[M-glc-2×rha]+，353[M-glc-2×rha-CH3]+，313[M-glc-2×rha-C4H8]+，300，177，165，146，135，85，73，60。
1H-NMR(DMSO-d6)12.61(1H，s，5-OH)，7.90(2H，d，J＝8.8 Hz，H-2’，6’)，7.13(2H，d，J＝8.8Hz，H-3’，5’)，6.63(1H，s，H-6)，5.16(1H，t，J＝5.2Hz，H-12)，5.00(1H，d，J＝6.4Hz，Glc-H-1)，3.84(3H，s，OCH3)，1.67(3H，s，H-15)，1.59(3H，s，H-14)，1.10(3H，d，J＝6.0Hz，Rha’H-6)，0.80(3H，d，J＝4.8Hz，Rha-H-6)。
5.38(1H，d，J＝1.5Hz，Rha-H-1)，4.87(1H，d，J＝1.0Hz，Rha’-H-1)，13C-NMR(DMSO-d6)157.3(C-2，s)，134.6(C-3，s)，178.2(C-4，s)，159.1(C-5，s)，98.1(C-6，d)，160.6(C-7，s)，108.3(C-8，s)，153.0(C-9，s)，105.5(C-10，s)，21.4(C-11，t)，122.1(C-12，d)，131.1(C-13，s)，25.5(C-14，q)，17.6(C-15，q)，122.1(C-1’，s)，130.6(C-2’，d)，114.1(C-3’，d)，161.5(C-4’，s)，114.1(C-5’，d)，130.6(C-6’，d)，55.5(OCH3，q)，100.5(Glc-C-1，d)，73.3(Glc-C-2，d)，76.6(Glc-C-3，d)，68.8(Glc-C-4，d)，77.2(Glc-C-5，d)，60.6(Glc-C-6，t)，100.7(Rha-C-1，d)，75.5(Rha-C-2，d)，70.4(Rha-C-3，d)，71.9(Rha-C-4，d)，70.2(Rha-C-5，d)，17.6(Rha-C-6，q)，101.6(Rha’-C-1，d)，70.7(Rha’-C-2，d)，70.1(Rha’-C-3，d)，71.3(Rha’-C-4，d)，69.6(Rha’-C-5，d)，17.5(Rha’-C-6，q)。酸水解，TLC檢查，糖部分為葡萄糖、鼠李糖和鼠李糖。1H-NMR，13C-NMR，MS，IR，UV數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)資料中有關(guān)朝藿定C的報(bào)道一致。故該化合物鑒定為朝藿定C。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)通過對(duì)淫羊藿藥材的提取工藝進(jìn)行研究考察，確定了朝藿定C的最佳提取工藝，并成功地對(duì)朝藿定C進(jìn)行了分離和純化；所得的化合物經(jīng)光譜鑒定可確認(rèn)為朝藿定C。朝藿定C對(duì)照品的制備為淫羊藿藥材中朝藿定C的含量測(cè)定提供了有效的對(duì)照品來源，從而為淫羊藿藥材進(jìn)行多種指標(biāo)物的測(cè)定，以更全面地反映其內(nèi)在質(zhì)量奠定了基礎(chǔ)。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明的實(shí)施例1(1)提取工藝取淫羊藿藥材，切成斷，加20倍70％乙醇回流3次，每次1h，合并三次的提取液，回收乙醇，并濃縮成60℃時(shí)相對(duì)密度為1.15。濃縮液加蒸餾水適量放置，棄沉淀，取上清液，再濃縮得浸膏。依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯萃取至近無色，再用正丁醇反復(fù)萃取至近無色，回收正丁醇至干，即得到含朝藿定C的粗浸膏。
(2)分離工藝
①硅膠柱色譜的分離將上述所得粗浸膏用甲醇溶解，薄層色譜用硅膠拌樣，硅膠柱色譜分離，以氯仿∶甲醇(100∶17，100∶20，100∶22)梯度洗脫，以硅膠預(yù)制板跟蹤檢識(shí)，展開系統(tǒng)為氯仿∶甲醇＝100∶20，收集硅膠預(yù)制板TLC上Rf值小于淫羊藿苷的斑點(diǎn)流份，回收溶劑后，即得朝藿定C粗品。
②聚酰胺柱色譜的分離朝藿定C粗品用甲醇溶解，柱色譜用聚酰胺拌樣，聚酰胺柱色譜分離，以乙酸乙酯∶甲醇∶水(8∶1∶0，8∶1∶0.2)梯度洗脫，以聚酰胺薄膜跟蹤檢識(shí)，展開系統(tǒng)為乙酸乙酯∶乙醇∶水＝8∶1∶1，收集聚酰胺薄膜TLC上Rf值大于淫羊藿苷的斑點(diǎn)流份，回收溶劑后，即得朝藿定C對(duì)照品。
本發(fā)明的實(shí)施例2提取工藝取淫羊藿藥材，切成斷，加10倍90％乙醇回流2次，每次2h，合并兩次的提取液，回收乙醇，并濃縮成60℃時(shí)相對(duì)密度為1.13。濃縮液加蒸餾水適量放置，棄沉淀，取上清液，再濃縮得浸膏。依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯萃取至近無色，再用正丁醇反復(fù)萃取至近無色，回收正丁醇至干，即得到含朝藿定C的粗浸膏。
朝藿定C粗浸膏的分離工藝同實(shí)施例1所述。
本發(fā)明的實(shí)施例3提取工藝取淫羊藿藥材，切成斷，加40倍45％乙醇回流5次，每次0.5h，合并五次的提取液，回收乙醇，并濃縮成60℃時(shí)相對(duì)密度為1.20。濃縮液加蒸餾水適量放置，棄沉淀，取上清液，再濃縮得浸膏。依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯萃取至近無色，再用正丁醇反復(fù)萃取至近無色，回收正丁醇至干，即得到含朝藿定C的粗浸膏。
朝藿定C粗浸膏的分離工藝同實(shí)施例1所述。
權(quán)利要求
1.一種朝藿定C對(duì)照品的制備方法，其特征在于(1)提取取淫羊藿藥材，切成斷，加10-40倍量45-90％的乙醇回流2-5次，每次0.5-2h，合并所有的提取液，回收乙醇，并濃縮成60℃時(shí)相對(duì)密度為1.13-1.20；濃縮液加蒸餾水適量放置，棄沉淀，取上清液，再濃縮得浸膏；依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯萃取至近無色，再用正丁醇反復(fù)萃取至近無色，回收正丁醇至干，即得含朝藿定C粗浸膏；(2)分離用甲醇溶解含朝藿定C粗浸膏，薄層色譜用硅膠拌樣，硅膠柱色譜分離，以氯仿∶甲醇＝100∶17、100∶20、100∶22進(jìn)行梯度洗脫，以硅膠預(yù)制板跟蹤檢識(shí)，收集硅膠預(yù)制薄層層析TLC板上比移值Rf小于淫羊藿苷的斑點(diǎn)流份，回收溶劑后，即得朝藿定C粗品；粗品用甲醇溶解，柱色譜用聚酰胺拌樣，聚酰胺柱色譜分離，以乙酸乙酯∶甲醇∶水＝8∶1∶0、8∶1∶0.2進(jìn)行梯度洗脫，以聚酰胺薄膜跟蹤檢識(shí)，收集聚酰胺薄膜薄層層析TLC上比移值Rf大于淫羊藿苷的斑點(diǎn)流份，回收溶劑后，即得朝藿定C對(duì)照品。
2.按照權(quán)利要求1所述朝藿定C對(duì)照品的制備方法，其特征在于所述的提取過程為取淫羊藿藥材，切成斷，加20倍量70％乙醇回流3次，每次1h，合并三次的提取液，回收乙醇，并濃縮成60℃時(shí)相對(duì)密度為1.15；濃縮液加蒸餾水適量放置，棄沉淀，取上清液，再濃縮得浸膏；依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯萃取至近無色，再用正丁醇反復(fù)萃取至近無色，回收正丁醇至干，即得含朝藿定C粗浸膏。
3.按照權(quán)利要求1所述朝藿定C對(duì)照品的制備方法，其特征在于硅膠薄層層析TLC的展開系統(tǒng)為氯仿∶甲醇＝100∶20。
4.按照權(quán)利要求1所述朝藿定C對(duì)照品的制備方法，其特征在于聚酰胺薄膜薄層層析TLC的展開系統(tǒng)為乙酸乙酯∶乙醇∶水＝8∶1∶1。
5.如權(quán)利要求1所述朝藿定C對(duì)照品的制備方法制備得到的朝藿定C對(duì)照品，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式為
全文摘要
本發(fā)明提供了一種朝藿定C對(duì)照品的制備方法及其產(chǎn)品，取淫羊藿藥材，用45－90％的乙醇回流提取，回收乙醇，濃縮成浸膏；依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇反復(fù)萃取至近無色，回收正丁醇至干，得粗浸膏；然后依次進(jìn)行硅膠柱色譜分離和聚酰胺柱色譜分離，即得朝藿定C對(duì)照品。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明確定了朝藿定C的最佳提取工藝，并成功地對(duì)朝藿定C進(jìn)行了分離和純化；所得的化合物經(jīng)光譜鑒定可確認(rèn)為朝藿定C。朝藿定C對(duì)照品的制備為淫羊藿藥材中朝藿定C的含量測(cè)定提供了有效的對(duì)照品來源，從而為淫羊藿藥材進(jìn)行多種指標(biāo)物的測(cè)定，以更全面地反映其內(nèi)在質(zhì)量奠定了基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)A61K36/296GK1970566SQ20061020122
公開日2007年5月30日 申請(qǐng)日期2006年12月6日 優(yōu)先權(quán)日2006年12月6日
發(fā)明者王曉春, 周寧, 馮澤熹, 楊昌生, 譚靜, 曾香蘭, 余勵(lì), 李梅, 龐媛媛, 周嵐, 童寅, 吳壽軍, 孟潔, 余東, 鄒良梅, 羅敏, 汪莎莎 申請(qǐng)人:貴州同濟(jì)堂制藥有限公司