專利名稱：抗菌蛋白β－1－3,1－4－葡聚糖內(nèi)切酶和裂解酶L27及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及抗菌蛋白β-1-3，1-4-葡聚糖內(nèi)切酶和裂解酶L27及其用途，尤其是利用這兩種酶及其編碼基因、以及含有這兩個(gè)酶切割功能域的縮微融合肽段的重組基因、重組肽的用途。這些用途包括作為藥物組分、農(nóng)藥組分、消毒劑組分、牙膏組分、飼料制備酶制劑組分等。
背景技術(shù)：
隨著抗生素的廣泛使用，病原菌耐藥性成為了影響公共健康的重要問題。對(duì)微生物細(xì)胞壁有水解功能的酶能夠溶解微生物細(xì)胞壁而使其死亡，而復(fù)合酶克服了一種抗生素只能預(yù)防一種病原菌或一種血清型病原菌的不足，具有更廣譜更高效的抗菌活性，同時(shí)也不存在藥物殘留和耐藥性的問題。
β-1-3，1-4-endoglucanase(lichenases，EC 3.2.1.73)能分解含有β-糖苷鍵鏈成的葡萄糖聚合物，使其降解為低分子量片段，在食品、釀造、飼料和日化等工業(yè)方面應(yīng)用。葡聚糖酶在抗真菌中也有重要作用，可降解病原菌細(xì)胞壁的主要成分——葡聚糖，導(dǎo)致病原菌細(xì)胞破裂，生長(zhǎng)受阻，不能繼續(xù)侵染和為害農(nóng)作物。
lytic enzyme L27是一種細(xì)胞裂解酶，屬于Subtilase family，在芽孢桿菌屬中報(bào)道很少。Kim S.Y.等對(duì)lytic enzyme L27抗菌譜的研究顯示其對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌有抗菌活性，但對(duì)革蘭氏陰性菌和真菌沒有抗菌活性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供，1.一種重組表達(dá)β-1-3，1-4-葡聚糖內(nèi)切酶和裂解酶L27的工程菌；2.獲得大量純化的β-1-3，1-4-葡聚糖內(nèi)切酶和裂解酶L27；3.利用含有β-1-3，1-4-葡聚糖內(nèi)切酶和裂解酶L27的工程菌及其重組產(chǎn)物作為藥物或者消毒劑；4.獲得含有β-1-3，1-4-葡聚糖內(nèi)切酶和裂解酶L27切割功能域的縮微融合肽段。
本發(fā)明的技術(shù)方案如下采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的技術(shù)，從芽孢桿菌基因組擴(kuò)增β-1-3，1-4-葡聚糖內(nèi)切酶和裂解酶L27基因，或者進(jìn)行縮微化，構(gòu)建融合基因，在大腸桿菌等適宜的宿主表達(dá)，純化表達(dá)產(chǎn)物，并檢測(cè)效果。
實(shí)現(xiàn)上述目的的基本技術(shù)路線為
總體技術(shù)方案是克隆包括提取芽孢桿菌基因組，利用合適的載體和限制性內(nèi)切酶片段，構(gòu)建轉(zhuǎn)化載體，將基因組DNA克隆到合適的大腸桿菌宿主細(xì)胞。
1.基因模板提取將待克隆菌株在LB培養(yǎng)基或YE培養(yǎng)基等能夠生長(zhǎng)的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)到合適的菌體濃度，按照本領(lǐng)域一般技術(shù)人員熟悉的步驟、試劑和方法提取菌體DNA。
2.工程菌的構(gòu)建按照本領(lǐng)域一般技術(shù)人員熟悉的步驟、試劑和方法，將基因組DNA克隆到適當(dāng)?shù)妮d體，轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗骶?，通過一定的選擇標(biāo)記，收集獲得的工程菌。
3.功能基因的篩選 按照本領(lǐng)域一般技術(shù)人員熟悉的步驟、試劑、完全可以從商業(yè)途徑獲得的載體、限制性內(nèi)切酶和方法，將目標(biāo)基因克隆到載體，轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，篩選轉(zhuǎn)化子。
4.利用含有功能基因的重組菌，進(jìn)行功能應(yīng)用。
發(fā)明效果利用本技術(shù)方案涉及的方法，得到了1.一種重組表達(dá)芽孢桿菌β-1-3，1-4-葡聚糖內(nèi)切酶和裂解酶L27的工程菌；2.獲得大量純化的β-1-3，1-4-葡聚糖內(nèi)切酶和裂解酶L27；3.利用含有β-1-3，1-4-葡聚糖內(nèi)切酶和裂解酶L27的工程菌作為藥物組分；4.含有β-1-3，1-4-葡聚糖內(nèi)切酶和裂解酶L27的各種混合物在藥物、農(nóng)藥、牙膏和飼料制備中的應(yīng)用。


圖1.β-1-3，1-4-葡聚糖內(nèi)切酶基因的PCR產(chǎn)物。
圖2.lytic L27的PCR產(chǎn)物。marker DL2000 2.空質(zhì)粒對(duì)照 3.重組菌菌落PCR鑒定 4.Bacillus sp.基因組PCR圖3.重組蛋白β-1-3，1-4-endoglucanase親和層析純化圖。1.雜蛋白峰2.非特異吸收峰3.特異吸收峰(目的蛋白)圖4.重組蛋白Lytic enzyme L27親和層析純化圖。1.雜蛋白峰2.非特異吸收峰3.特異吸收峰(目的蛋白)圖5.重組蛋白β-1-3，1-4-endoglucanase SDS-PAGE。1.總蛋白2.親和層析后純化收集峰3.小分子量蛋白marker圖6.重組蛋白Lytic enzyme L27 SDS-PAGE。1.小分子量蛋白marker2.空質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌總蛋白3.重組菌總蛋白4-8.親和層析后純化收集峰圖7.牛奶平板檢測(cè)重組蛋白的蛋白酶活性?？召|(zhì)粒對(duì)照2.beta-1-3，1-4-endoglucanase重組蛋白3.lytic enzyme L27重組蛋白。
圖8.重組蛋白抑菌活性檢測(cè)。1.空質(zhì)粒2.重組蛋白beta-1-3，1-4-endoglueanase 3.重組蛋白lytic enzyme L27 5.重組蛋白beta-1-3，1-4-endoglucanase和lytic enzyme L27混合物(a)重組蛋白對(duì)白色假絲酵母抑菌活性。(b)重組蛋白對(duì)大腸桿菌抑菌活性。(c)重組蛋白對(duì)銅綠假單孢菌抑菌活性。
具體實(shí)施例方式
我們分離到一株高產(chǎn)蛋白酶的芽孢桿菌，通過16s rDNA鑒定其屬于Bacillus spp.。純化單一活性峰冷干產(chǎn)物，SDS-PAGE分離得到兩個(gè)條帶，經(jīng)肽指紋圖譜鑒定這兩種蛋白分別為β-1-3，1-4-endoglucanase和Lytic enzyme L27。抑菌實(shí)驗(yàn)證明蛋白樣品對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌、革蘭氏陰性菌和真菌有顯著的抑菌效果(另文發(fā)表)?？寺ˇ?1-3，1-4-endoglucanase和lytic enzyme L27的成熟蛋白，在大腸桿菌中表達(dá)，純化重組蛋白進(jìn)行活性鑒定。我們的結(jié)果顯示，兩種蛋白的協(xié)同作用有更強(qiáng)的抗菌作用。這些研究將為抗菌蛋白的理論研究和復(fù)合酶抗菌的進(jìn)一步應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。
1材料和方法1.1材料1.1.1菌株和培養(yǎng)基Bacillus sp.由本實(shí)驗(yàn)室分離鑒定。質(zhì)粒pET32a(+)、大腸桿菌(Escherichia coli)DH5α和E.coli BL21(DE3)、白色假絲酵母、大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株、銅綠假單孢菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌為本實(shí)驗(yàn)室保存。藤黃微球菌(Micrococcus luteusCNCC(B)28001)由四川省抗生素研究所王明蓉研究員惠贈(zèng)。
LB培養(yǎng)基酵母膏5g，蛋白胨10g，NaCl 10g，定容至1000ml，固體培養(yǎng)基中添加2％瓊脂。。
1.1.2主要試劑限制性內(nèi)切酶EcoR I、HindIII和Xho I、T4 DNA連接酶購(gòu)自TaKaRa公司；PfuDNA聚合酶、dNTP和buffer、IPTG購(gòu)自merck；DNA膠回收試劑盒購(gòu)自Bioflux；Ni2+-Sepharose和_KTA prime蛋白純化系統(tǒng)購(gòu)自Amersham Biosciences；低分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)購(gòu)自上海生化所研究所。
1.2目的基因PCR擴(kuò)增和克隆根據(jù)GenBank中Bacillus licheniformis株β-1-3，1-4-endoglucanase和Bacillussubtilis株lytic enzyme L27的基因序列，自行設(shè)計(jì)一對(duì)擴(kuò)增該成熟蛋白基因的PCR引物(由Invitrogen公司合成)，β-1-3，1-4-endoglucanase引物序列為G15’-AGCGAATTCATGCAAACAGGTGG-3’；G25’-GGTGAGCTCTTTTTGAAAGCGCACC-3’(劃線序列分別為EcoRI和HindIII酶切位點(diǎn))。以Bacillus sp.基因組DNA為模板，以G1，G2為引物進(jìn)行PCR，反應(yīng)條件95℃ 5min；95℃ 45s，55℃ 1min，72℃ 2min，30個(gè)循環(huán)；72℃10min。純化后的PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒pET32a(+)以EcoRI和HindIII雙酶切后，切膠純化后，以T4 DNA連接酶連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)E.coli BL21(DE3)，經(jīng)菌體PCR篩選獲得原核表達(dá)重組質(zhì)粒pET32a-G。送Invitrogen公司測(cè)序。
根據(jù)GenBank中和Bacillus subtilis株lytic enzyme L27的基因序列，自行設(shè)計(jì)一對(duì)擴(kuò)增該成熟蛋白基因的PCR引物(由Invitrogen公司合成)，序列為L(zhǎng)15’-CCCAAGCTTATATTAAAGCCCCTGCTC-3’；L25’-TACCTCGAGTTATTGTGCAGCCGC-3’(劃線序列分別為HindIII和Xho I酶切位點(diǎn))。以Bacillus sp.基因組DNA為模板，以cf，cr為引物進(jìn)行PCR，反應(yīng)條件95℃ 5min；95℃ 45s，52.5℃ 1min，72℃ 2min，30個(gè)循環(huán)；72℃10min。純化后的PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒pET28a(+)以HindIII和Xho I雙酶切后，切膠純化后，以T4 DNA連接酶連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)E.coli BL21(DE3)，經(jīng)菌體PCR篩選獲得原核表達(dá)重組質(zhì)粒pET32a-L27。送Invitrogen公司測(cè)序。
1.3目的基因的表達(dá)和SDS-PAGE分析將原核表達(dá)重組克隆接種于10ml(含20μg/ml氨芐青霉素)的LB培養(yǎng)基中，37℃200rpm/min培養(yǎng)過夜。1％接種到50ml LB(含20μg/ml氨芐青霉素)中，37℃200rpm/min培養(yǎng)至OD6000.5～0.8，加IPTG至1mmol/L誘導(dǎo)表達(dá)，誘導(dǎo)4h。以同樣的方法誘導(dǎo)含空質(zhì)粒pET32a(+)的E.coli BL21(DE3)做對(duì)照。
誘導(dǎo)收獲的的菌液1ml，離心收集菌體。加入100μl2×SDS凝膠上樣緩沖液，振蕩混勻，沸水煮沸5min，12000rpm/min離心10min，取上清15μl進(jìn)行12％SDS-PAGE。
1.4重組蛋白的純化及濃度測(cè)定按上面的方法誘導(dǎo)500ml重組菌。菌液4℃離心30min。用20ml 1×Ni2+-SepharoseBinding buffer(20mmol/L NaH2PO4，500mmol/L NaCl，20mmol/L咪唑，pH7.4)重懸細(xì)胞。冰上超聲破碎菌體，4℃離心，棄沉淀，上清0.45μm的濾膜過濾，然后用Ni2+-Sepharose親合柱對(duì)蛋白進(jìn)行純化。10倍柱體積Binding buffer，10倍柱體積的Wash buffer(20mmol/LNaH2PO4，500mmol/LNaCl，80mmol/L咪唑，pH7.4)，10倍柱體積的Elutionbuffer(20mmol/LNaH2PO4，500mmol/LNaCl，500mmol/L咪唑，pH7.4)。收集洗脫峰，SDS-PAGE分析。洗脫的重組蛋白4℃透析過夜。蛋白濃度采用Bradford法進(jìn)行。
1.5重組蛋白活性測(cè)定1.5.1 CMC(羧甲基纖維素)法測(cè)定纖維素酶的活性取1支小試管(15mm×150mm)，加羧甲基纖維素鈉溶液2.0mL，于50℃水浴中預(yù)熱2～3min，加稀釋酶液0.5mL，保溫30min，取出加入3，5-二硝基水楊酸2.5mL，沸水浴煮沸5min，冷卻后用分光光度計(jì)530nm處比色測(cè)定OD值。另取小試管加羧甲基纖維素鈉2.0mL，先加入2.5mL 3，5-二硝基水楊酸，再加酶液0.5mL，其他操作同樣品測(cè)定作空白測(cè)定。CMC酶活力＝B×n/0.5mg/g·30′·50℃(B-從標(biāo)準(zhǔn)曲線中查得的凈葡萄糖毫克數(shù)(mg)；n-酶液稀釋倍數(shù)；0.5-測(cè)定時(shí)吸取稀釋酶液毫升數(shù)(mL))。[16]1.5.2蛋白酶活性測(cè)定方法1.5.2.1牛奶平板檢測(cè)蛋白酶活性。
1.5.2.2經(jīng)典蛋白酶活性檢測(cè)方法。以酪蛋白為底物，取5％酪蛋白1ml，加入3.9ml Tris-HCL(0.2mol/L，pH7.1)緩沖液，于37℃恒溫水浴中預(yù)熱5min，加入蛋白酶樣品0.1ml，37℃反應(yīng)20min。加50％三氯乙酸(TCA)終止反應(yīng)，離心(10000r/min，10min)取上清液，280nm下測(cè)OD值。以先加TCA再加酪蛋白為空白對(duì)照。在此條件下每分鐘增加0.001個(gè)OD值為一個(gè)酶活力單位(U)[13]。
1.5.3抑菌活性檢測(cè)方法檢測(cè)菌大腸桿菌，銅綠假單胞菌，金黃色葡萄球菌，藤黃微球菌，枯草芽孢桿菌，白色假絲酵母。
方法取菌液0.4ml，均勻涂布于平板固體培養(yǎng)基上，無(wú)菌操作將滅菌的濾紙片放置在培養(yǎng)基表面，輕輕加壓，使其與培養(yǎng)基接觸無(wú)間隙，樣品點(diǎn)樣量為20ul。在最適培養(yǎng)溫度下培養(yǎng)10h，觀察抑菌活性。
1.6生物信息學(xué)分析使用Vector NT I Suite9對(duì)蛋白序列以及氨基酸組成進(jìn)行分析。使用在線軟件SignalP 3.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)對(duì)蛋白信號(hào)肽進(jìn)行預(yù)測(cè)。使用NCBI的RPS-BLAST對(duì)氨基酸一級(jí)結(jié)構(gòu)保守域進(jìn)行比對(duì)。使用PredictProtein蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)軟件進(jìn)行蛋白質(zhì)多重序列對(duì)比，預(yù)測(cè)二級(jí)結(jié)構(gòu)、殘基可溶性、跨膜螺旋位置、折疊拓?fù)漕愋汀?br> 2結(jié)果2.1 β-1-3，1-4-endoglucanase和Lytic enzyme L27基因的擴(kuò)增和克隆以Bacillus sp.基因組DNA為模板，以G1，G2為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖電泳分析，可見1條約800bp的DNA片斷，與預(yù)期DNA片斷大小一致。
純化的β-1-3，1-4-endoglucanase PCR產(chǎn)物與pET32a(+)連接，構(gòu)建的重組質(zhì)粒通過菌體PCR檢測(cè)(圖1)，再通過測(cè)序鑒定，該序列和GenBank中Bacillus subtilis的β-1-3，1-4-endoglucanase序列比對(duì)，有100％的同源性。
以Bacillus sp.基因組DNA為模板，以L1，L2為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖電泳分析，可見1條約800bp的DNA片斷，與預(yù)期DNA片斷大小一致。
1.純化的Lytic enzyme L27 PCR產(chǎn)物與pET32a(+)連接，構(gòu)建的重組質(zhì)粒通過菌體PCR檢測(cè)(圖2)，再通過測(cè)序鑒定，該序列和GenBank中Bacillus subtilis的lytic enzyme L27序列比對(duì)，有100％的同源性。
2.2重組β-1-3，1-4-endoglucanase和Lytic enzyme L27的異源表達(dá)與純化經(jīng)過IPTG誘導(dǎo)，重組β-1-3，1-4-endoglucanase和Lytic enzyme L27目的蛋白均主要以胞內(nèi)可溶形式表達(dá)。菌體超聲波破碎后上清中的可溶重組蛋白經(jīng)親和層析純化(圖3)，在考馬斯亮蘭染色的SDS-PAGE上純化可見單一條帶(圖4)。
2.3重組蛋白β-1-3，1-4-endoglucanase和Lytic enzyme L27蛋白酶活性的測(cè)定通過牛奶平板檢測(cè)蛋白酶活性，空質(zhì)粒樣品沒有明顯的透明圈，但是重組菌β-1-3，1-4-endoglucanase和Lytic enzyme L27樣品均可見明顯的透明圈(圖5)，說明重組蛋白β-1-3，1-4-endoglucanase和Lytic enzyme L27均有很強(qiáng)的蛋白酶活性。這個(gè)結(jié)果同時(shí)可以經(jīng)典蛋白酶活性檢測(cè)方法證明。(表1)兩種蛋白混合物的蛋白酶活性。
表1.蛋白酶活性測(cè)定結(jié)果


2.4纖維素酶活性測(cè)定結(jié)果通過纖維素酶活性測(cè)定結(jié)果可知，beta-1-3，1-4-endoglucanase重組蛋白有纖維素酶活性，lytic enzyme L27重組蛋白沒有纖維素酶活性。兩種蛋白質(zhì)混合物的纖維素酶活性。
表2纖維素酶活性測(cè)定結(jié)果

1.5抑菌活性檢測(cè)使用革蘭氏陰性菌(大腸桿菌、銅綠假單孢菌)、革蘭氏陽(yáng)性菌(枯草芽孢桿菌、藤黃微球菌、金黃色葡萄球菌)、真菌(白色假絲酵母)進(jìn)行蛋白抑菌活性檢測(cè)(圖6)。結(jié)果顯示同種濃度下，重組beta-1-3，1-4-endoglucanase對(duì)真菌(白色假絲酵母)有抑菌效果，重組蛋白beta-1-3，1-4-endoglucanase和lyticenzyme L27混合物協(xié)同作用時(shí)對(duì)白色假絲酵母有抑菌效果，且有強(qiáng)烈增效作用。重組蛋白beta-1-3，1-4-endoglucanase和lytic enzyme L27的混合物對(duì)革蘭氏陰性菌(大腸桿菌、銅綠假單孢菌)有抑菌效果，但是同種濃度下，每個(gè)蛋白單獨(dú)作用抑菌效果不明顯。
權(quán)利要求
1.抗菌蛋白β-1-3，1-4-葡聚糖內(nèi)切酶和裂解酶L27的用途，其特征是含有表達(dá)抗菌蛋白β-1-3，1-4-葡聚糖內(nèi)切酶和裂解酶L27的重組工程菌、純化的重組酶以及利用純化的酶或工程菌進(jìn)行的應(yīng)用。
2.權(quán)利要求1所述的抗菌蛋白β-1-3，1-4-葡聚糖內(nèi)切酶和裂解酶L27的用途，其特征是利用β-1-3，1-4-葡聚糖內(nèi)切酶和裂解酶L27的協(xié)同作用，作為治療性藥用混合物的組分。
3.權(quán)利要求1所述的抗菌蛋白β-1-3，1-4-葡聚糖內(nèi)切酶和裂解酶L27的用途，其特征是利用β-1-3，1-4-葡聚糖內(nèi)切酶和裂解酶L27的協(xié)同作用，作為化妝品的組分。
4.權(quán)利要求1所述的抗菌蛋白β-1-3，1-4-葡聚糖內(nèi)切酶和裂解酶L27的用途，其特征是利用β-1-3，1-4-葡聚糖內(nèi)切酶和裂解酶L27的協(xié)同作用，作為牙膏等的組分。
5.權(quán)利要求1所述的抗菌蛋白β-1-3，1-4-葡聚糖內(nèi)切酶和裂解酶L27的用途，其特征是利用β-1-3，1-4-葡聚糖內(nèi)切酶和裂解酶L27的協(xié)同作用，作為動(dòng)物飼料制備的組分。
6.權(quán)利要求1所述的抗菌蛋白β-1-3，1-4-葡聚糖內(nèi)切酶和裂解酶L27的用途，其特征是利用β-1-3，1-4-葡聚糖內(nèi)切酶和裂解酶L27的協(xié)同作用，構(gòu)建融合表達(dá)的工程菌或者重組酶。
7.權(quán)利要求1所述的抗菌蛋白β-1-3，1-4-葡聚糖內(nèi)切酶和裂解酶L27的用途，其特征是利用β-1-3，1-4-葡聚糖內(nèi)切酶和裂解酶L27的協(xié)同作用，將負(fù)責(zé)切割的功能域進(jìn)行融合，仍然具有裂解活性的的縮微融合肽段及其用途。
8.權(quán)利要求1所述的抗菌蛋白β-1-3，1-4-葡聚糖內(nèi)切酶和裂解酶L27的用途，其特征是利用β-1-3，1-4-葡聚糖內(nèi)切酶和裂解酶L27的協(xié)同作用，作為農(nóng)藥的組分。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及抗菌蛋白β－1－3，1－4－葡聚糖內(nèi)切酶和裂解酶L27及其用途，尤其是利用這兩種酶及其編碼基因、以及含有這兩個(gè)酶切割功能域的縮微融合肽段的重組基因、重組肽的用途。這些用途包括作為藥物組分、農(nóng)藥組分、消毒劑組分、牙膏組分、飼料制備酶制劑組分等。
文檔編號(hào)A61K38/51GK1995337SQ20061009534
公開日2007年7月11日 申請(qǐng)日期2006年12月25日 優(yōu)先權(quán)日2006年12月25日
發(fā)明者謝建平, 劉玉嶺 申請(qǐng)人:西南大學(xué)