專利名稱：絳紅褐鏈霉菌sp3抗菌蛋白母液及其在制備誘導(dǎo)雜交竹抗病藥劑中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是絳紅褐鏈霉菌SP3抗菌蛋白母液及其在制備誘導(dǎo)雜交竹抗病藥劑中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
撐X綠雜交竹是南方重要的經(jīng)濟(jì)用材竹，也是四川等地引種發(fā)展的主要經(jīng)濟(jì)竹種之一。近年來(lái)，由絲孢綱真菌暗孢節(jié)菱孢菌[Arthrinium phaeospermum (Corda)M.B.Ellis]引起的雜交竹梢枯病導(dǎo)致?lián)蝀綠雜交竹大面積枯死，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，極大地威脅著長(zhǎng)江中上游地區(qū)退耕還林的進(jìn)程和生態(tài)屏障的建設(shè)。目前主要采用化學(xué)防治和營(yíng)林技術(shù)，而生物防治措施研究較少。化學(xué)防治雖是一種有效的防治手段，但存在病原菌抗藥性、環(huán)境與食品安全、藥害等許多實(shí)際問(wèn)題，一些化學(xué)殺菌劑在許多發(fā)達(dá)國(guó)家和地區(qū)已嚴(yán)格限制使用。而與環(huán)境友好的生物農(nóng)藥越來(lái)越受到人們的青睞，是未來(lái)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要組成部分。李姝江和憔天敏等從雜交竹健康植株分離到一株銅綠假單胞菌(Pseudomonas aerugin osa) ZB27,用其菌懸液和代謝產(chǎn)物處理對(duì)雜交竹梢枯病有較好的防治效果，但銅綠假單胞菌為條件致病菌，作為生防菌劑在田間使用受到限制，而本發(fā)明涉及的絳紅褐鏈霉菌SP3(本申請(qǐng)人已于2012年09月27日申請(qǐng)中國(guó)專利，申請(qǐng)?zhí)枮?01210367119.3，公開(kāi)號(hào)CN102864110A，發(fā)明名稱:絳紅褐鏈霉菌SP3菌株及其在紅豆杉土傳根病和紅豆杉促生上的應(yīng)用)對(duì)雜交竹生防效果較好，但用其代謝產(chǎn)物一純抗菌蛋白作為誘導(dǎo)因子，誘導(dǎo)植物抗性，提高雜交竹免疫性尚無(wú)人報(bào)道。誘導(dǎo)抗性，即利用生物或非生物因子激發(fā)植物的防衛(wèi)基因，使植物產(chǎn)生局部的或系統(tǒng)的抗病性而達(dá)到防病的效果，在植物病害防治中具有重要的意義。其中，關(guān)于化學(xué)誘導(dǎo)因子誘導(dǎo)抗性的研究國(guó)內(nèi)外報(bào)道很多。另外，利用生物因子誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗性的研究也較多，這些生物因子包括致病菌、弱毒小種、AM真菌、植物根圍促生細(xì)菌(PGPR)和放線菌等。隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)一些來(lái)源于微生物的誘導(dǎo)因子和微生物一樣可以誘導(dǎo)寄主植物產(chǎn)生防衛(wèi)反應(yīng)，尤其是誘導(dǎo)植保素的合成和積累。Thakkera等利用從Fusarium oxysporum f.sp cubense獲得的激發(fā)子處理香蕉根部，可引起香蕉葉片防御性相關(guān)酶的積累，能有效提高感病品種的抗性Jung等發(fā)現(xiàn)從芽孢桿菌菌株中純化獲得的細(xì)菌素(class lid)可誘導(dǎo)大豆PAL、APX> SOD和PPO等活性的增加；Mao等從Alternaria tenuissima的菌絲中純化得到耐熱酸性蛋白激發(fā)子PeaTl，能夠誘導(dǎo)煙草對(duì)TMV產(chǎn)生系統(tǒng)抗病性；李云鋒等利用從稻瘟病菌細(xì)胞壁中純化獲得的糖蛋白激發(fā)子CSB I (分子量為102 kDa)接種水稻，可引起葉片內(nèi)P0D、PAL、L0X活性、綠原酸和木質(zhì)素含量的顯著增加。蔣繼志等從31種微生物中篩選出了兩種放線菌源激發(fā)子，其中放線菌A 5295發(fā)酵液型激發(fā)子誘抗效果最高，達(dá)63.97%，并推測(cè)發(fā)酵液中有效誘抗物質(zhì)可能是蛋白質(zhì)類(lèi)、多糖類(lèi)等物質(zhì)
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足提供一種絳紅褐鏈霉菌SP3抗菌蛋白母液及其在制備誘導(dǎo)雜交竹抗病藥劑中的應(yīng)用。本發(fā)明涉及的絳紅褐鏈霉菌SP3菌株，本申請(qǐng)人已于2012年09月27日申請(qǐng)中國(guó)專利，申請(qǐng)?zhí)枮?01210367119.3，公開(kāi)號(hào)CN102864110A，發(fā)明名稱:絳紅褐鏈霉菌SP3菌株及其在紅豆杉土傳根病和紅豆杉促生上的應(yīng)用。本發(fā)明的技術(shù)方案如下:—種絳紅褐鏈霉菌SP3抗菌蛋白母液,按照以下方法制備:Al去菌發(fā)酵濾液的制備:從新鮮培養(yǎng)的斜面菌種制備絳紅褐鏈霉菌SP3孢子懸浮液，調(diào)整孢子濃度為108cfu/mL ;然后以1%的接種量接入滅菌的發(fā)酵培養(yǎng)基中，于25°C、140r/min振蕩培養(yǎng)4d，發(fā)酵液于8000r/min離心15min,取上清液用0.45 μ m孔徑的微孔濾膜過(guò)濾除菌,備用；A2采用硫酸銨沉淀法提取抗菌物質(zhì)，制備活性粗蛋白；利用55%飽和度的硫酸銨鹽析濃度對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行粗提取，得到的即為活性粗蛋白；A3純化抗菌蛋白，得到幾丁質(zhì)結(jié)合抗菌蛋白母液:A31 DE52離子交換層析；A32 Sephadex G-75 凝膠過(guò)濾層析；A33 Sephadex G-50 凝膠過(guò)濾層析；

所述的絳紅褐鏈霉菌SP3抗菌蛋白母液在制備誘導(dǎo)雜交竹抗病藥劑中的應(yīng)用，在雜交竹栽培區(qū)，發(fā)病前噴霧或灌根10-50倍(體積比)所述絳紅褐鏈霉菌SP3抗菌蛋白母液，噴霧每株200暈升；灌根每株100暈升。不論是噴霧或是浸根誘導(dǎo)，不同濃度抗菌蛋白處理的病情指數(shù)差異顯著，除200倍稀釋液處理與對(duì)照差異不顯著外，其余均顯著低于對(duì)照(P < 0.05)，其中以10倍稀釋液處理的病情指數(shù)最低，分別是23.95和20.89，20倍稀釋液次之。噴霧和浸根兩種誘導(dǎo)方法都以10倍抗菌蛋白稀釋液的誘抗效果最好，分別為56.22%和62.88% ;其次是50倍稀釋液的處理，分別為45.39%和51.18% ;再者，100倍稀釋液的誘抗效均在20%以上；200倍稀釋液誘導(dǎo)后挑戰(zhàn)接種發(fā)病最為嚴(yán)重，誘抗效果僅為0.10%和-2.77%。表明隨著抗菌蛋白處理濃度的升高，雜交竹的抗病能力也隨之增強(qiáng)。


圖1為粗蛋白經(jīng)DE52離子交換層析結(jié)果；圖2為峰5經(jīng)Sephadex G-75凝膠過(guò)濾層析結(jié)果；圖3為峰5-4反向HPLC純度檢測(cè)結(jié)果；圖4為峰5-4經(jīng)Sephadex G-50凝膠過(guò)濾層析結(jié)果。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。實(shí)施例1絳紅褐鏈霉菌SP3抗菌蛋白(幾丁質(zhì)結(jié)合抗菌蛋白母液)制備本發(fā)明涉及的絳紅褐鏈霉菌SP3菌株，本申請(qǐng)人已于2012年09月27日申請(qǐng)中國(guó)專利，申請(qǐng)?zhí)枮?01210367119.3，公開(kāi)號(hào)CN102864110A，發(fā)明名稱:絳紅褐鏈霉菌SP3菌株及其在紅豆杉土傳根病和紅豆杉促生上的應(yīng)用。1.去菌發(fā)酵濾液的制作從新鮮培養(yǎng)的斜面菌種制備絳紅褐鏈霉菌SP3孢子懸浮液，調(diào)整孢子濃度為108cfu/mL;然后以1%的接種量接入滅菌的發(fā)酵培養(yǎng)基(黃豆餅粉3g，葡萄糖5g，甘油5g，蛋白胨 5g，NaCl 2.5g, CaCO2 2g，蒸餾水 IOOOmL)中，于 25°C、140r/min 振蕩培養(yǎng) 4d，發(fā)酵液于8000r/min離心15min,取上清液用0.45 μ m孔徑的微孔濾膜過(guò)濾除菌,備用。2抗菌物質(zhì)提取方法篩選(I)甲醇、乙醇和丙酮提取取3份去菌發(fā)酵濾液，每份IOOmL,按照1:5 (v/v)的比例分別加入冷甲醇、乙醇和丙酮(_2(TC ),在_2(TC放置IOmin, 10 000r/min離心15min,使沉淀風(fēng)干,上清液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓蒸干，沉淀物和蒸干 物分別用0.05mol/L pH8.5 Tris-HCl緩沖液溶解并調(diào)整至5mL,測(cè)定其抑菌活性(采用杯碟法測(cè)定待測(cè)物質(zhì)的抑菌活性。在PDA平板中央接入直徑6mm供試真菌菌絲塊，用打孔器距中心3.0cm處無(wú)菌挖取4個(gè)孔洞。每孔加入100 μ L待測(cè)物質(zhì)，于25°C培養(yǎng)3-5d測(cè)量抑菌帶寬度，下文粗蛋白及抗菌蛋白活性測(cè)定均以雜交竹梢枯病菌為指示菌。以加滅菌后的Tris-HCl做對(duì)照，每處理均設(shè)3個(gè)重復(fù)。( 2 )硫酸銨沉淀法提取取去菌發(fā)酵濾液IOOmL,在0°C下加入硫酸銨使溶液相對(duì)飽和度為100%，4°C下過(guò)夜，10 000r/min離心15min,沉淀物再用0.05mol/L pH8.5 Tris-HCl緩沖液溶解后,4°C下用8-14kDa的透析袋透析脫鹽，聚乙二醇20 000包埋濃縮，調(diào)整至5mL。分別測(cè)定沉淀溶解液和上清液的抑菌活性(同上)。1-2倍體積低溫有機(jī)溶劑即可使多數(shù)蛋白質(zhì)溶解度降低并析出，飽和度為100%的硫酸銨也可將發(fā)酵濾液中的蛋白質(zhì)全部析出。絳紅褐鏈霉菌發(fā)酵濾液經(jīng)有機(jī)溶劑沉淀后的上清液仍有活性，可能是部分未沉淀的活性蛋白，也可能是其它小分子次生代謝物質(zhì)，后者可通過(guò)萃取進(jìn)行提取。試驗(yàn)結(jié)果表明:100%硫酸銨飽和度沉淀的抗菌物質(zhì)的抑菌活性最大，顯著高于有機(jī)溶劑沉淀，上清液無(wú)抑菌活性；甲醇和乙醇對(duì)抗菌物質(zhì)也有較好的沉淀效果，抑菌帶寬度分別是10.8mm和11.0mm,丙酮沉淀效果最差。上清液蒸干物則以丙酮抑菌活性最大(表I)。以上分析說(shuō)明發(fā)酵濾液中起主要抑菌作用的是蛋白質(zhì)類(lèi)物質(zhì)，并且以硫酸銨鹽析法的提取效果最佳。表I幾種抗菌物質(zhì)提取方法比較
權(quán)利要求
1.一種絳紅褐鏈霉菌SP3抗菌蛋白母液，其特征在于，按照以下方法制備: Al去菌發(fā)酵濾液的制備: 從新鮮培養(yǎng)的斜面菌種制備絳紅褐鏈霉菌SP3孢子懸浮液，調(diào)整孢子濃度為IO8Cfu/mL ;然后以1%的接種量接入滅菌的發(fā)酵培養(yǎng)基中，于25°C、140r/min振蕩培養(yǎng)4d，發(fā)酵液于8000r/min離心15min,取上清液用0.45 μ m孔徑的微孔濾膜過(guò)濾除菌,備用； A2采用硫酸銨沉淀法提取抗菌物質(zhì)，制備活性粗蛋白；利用55%飽和度的硫酸銨鹽析濃度對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行粗提取，得到的即為活性粗蛋白； A3純化抗菌蛋白，得到幾丁質(zhì)結(jié)合抗菌蛋白母液: A31 DE52離子交換層析； A32 Sephadex G- 75凝膠過(guò)濾層析； A33 Sephadex G-50凝膠過(guò)濾層析。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的絳紅褐鏈霉菌SP3抗菌蛋白母液在制備誘導(dǎo)雜交竹抗病藥劑中的應(yīng)用，其特征在于，在雜交竹栽培區(qū)，發(fā)病前噴霧或灌根10-50倍(體積比)所述絳紅褐鏈霉菌SP3抗菌蛋白母液，噴霧每株200毫升；灌根每株100毫升。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種絳紅褐鏈霉菌SP3抗菌蛋白母液，按照以下方法制備A1去菌發(fā)酵濾液的制備A2采用硫酸銨沉淀法提取抗菌物質(zhì)，制備活性粗蛋白；利用55%飽和度的硫酸銨鹽析濃度對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行粗提取，得到的即為活性粗蛋白；A3 純化抗菌蛋白，得到幾丁質(zhì)結(jié)合抗菌蛋白母液；在雜交竹栽培區(qū)，發(fā)病前噴霧或灌(根)10-50倍(體積比)上述抗菌蛋白，噴霧每株200毫升，防治效果為70-80%；灌根每株100毫升，防治效果為75-85%。
文檔編號(hào)C07K1/16GK103088094SQ201310033858
公開(kāi)日2013年5月8日 申請(qǐng)日期2013年1月29日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月29日
發(fā)明者朱天輝, 張麗娜, 李姝江, 韓珊, 譙天敏 申請(qǐng)人:四川農(nóng)業(yè)大學(xué)