專利名稱：戊型肝炎口服疫苗及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，是一種預(yù)防戊型肝炎的口服疫苗及其制備方法。
背景技術(shù)：
戊型肝炎病毒(HEV)是單鏈、線性、正股的RNA病毒，引起以黃疸為主的急性肝炎，簡(jiǎn)稱戊肝。主要經(jīng)腸道傳播，占經(jīng)腸道傳播的非甲、非乙型肝炎的大部分。中國(guó)是戊肝高發(fā)區(qū)之一，曾發(fā)生11次該病的爆發(fā)或流行。1986年至1988年新疆曾發(fā)生迄今為止最大的戊肝暴發(fā)性流行，共計(jì)119280人發(fā)病，死亡707例，感染孕婦平均病死率13.46％，晚期妊娠病死率高達(dá)20.96％，流行原因主要是污染的水和食物。據(jù)衛(wèi)生部發(fā)布的傳染病疫情公示，我國(guó)戊肝發(fā)病數(shù)呈現(xiàn)連續(xù)快速增長(zhǎng)的態(tài)勢(shì)，已經(jīng)被列為因戊肝發(fā)病和死亡而引起的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)最為嚴(yán)重的國(guó)家之一，構(gòu)成了嚴(yán)重的公共問(wèn)題。由于人群對(duì)戊肝普遍易感，研究和開(kāi)發(fā)預(yù)防性疫苗具有重要的理論意義和現(xiàn)實(shí)意義，世界衛(wèi)生組織已經(jīng)將戊型肝炎疫苗推薦為21世紀(jì)最優(yōu)先發(fā)展的疫苗之一。
對(duì)戊肝的預(yù)防，疫苗的應(yīng)用是根本手段。HEV由于細(xì)胞培養(yǎng)非常困難，因此近年來(lái)研究較多的是重組蛋白疫苗。現(xiàn)有的HEV重組蛋白疫苗的研究大多經(jīng)注射途徑免疫，通常不能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生腸胃道局部粘膜免疫反應(yīng)，而局部粘膜免疫反應(yīng)在阻斷類似戊型肝炎等的胃腸道傳染病的發(fā)病中具有重要作用?？诜顾杌屹|(zhì)炎疫苗在計(jì)劃免疫中已使用多年就是一個(gè)例子，與注射接種的滅活脊髓灰質(zhì)炎疫苗相比，口服脊髓灰質(zhì)炎疫苗的優(yōu)勢(shì)不僅在于能夠在病毒侵入和增殖的局部腸粘膜誘導(dǎo)產(chǎn)生分泌型IgA抗體，有效阻止病毒的傳播，而且價(jià)廉、服用方便，提高了疫苗覆蓋率，為全球根除脊髓灰質(zhì)炎提供了強(qiáng)有力的手段。
現(xiàn)有的戊型肝炎口服疫苗大都是以重組蛋白直接口服免疫，一方面蛋白在消化道易被降解免疫效果持續(xù)時(shí)間短，需要反復(fù)接種，有時(shí)還需要添加佐劑，而且有時(shí)還會(huì)引起免疫耐受；另一方面采用口服途徑免疫時(shí)需要的重組蛋白疫苗劑量大，而基因工程重組蛋白的制備和純化過(guò)程復(fù)雜、操作繁瑣，大劑量蛋白的使用將使疫苗的成本大大提高，導(dǎo)致疫苗價(jià)格升高，影響疫苗的普及。
活載體疫苗是將編碼病原微生物特異性抗原的DNA片段插入減毒的活細(xì)菌或病毒載體基因組的某些部位，使之高效表達(dá)，從而誘生強(qiáng)有力的抗體和細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，使機(jī)體獲得對(duì)插入基因相關(guān)疾病的抵抗力。減毒沙門菌是最早用作活疫苗載體的病原菌之一，在承載異源抗原方面具有很確定的作用。該菌具有泛嗜性，有廣泛的宿主譜，能在細(xì)胞內(nèi)生存與繁殖并表達(dá)所載目的抗原，還可以提供Toll樣受體的配體以及“危險(xiǎn)信號(hào)”誘導(dǎo)抗原提呈細(xì)胞的激活與成熟，通過(guò)粘膜免疫后可以誘導(dǎo)產(chǎn)生廣泛而持續(xù)的局部免疫和全身免疫。然而，迄今為止，以減毒沙門菌做載體制備戊型肝炎口服疫苗在國(guó)內(nèi)外尚未有報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種安全、高效、低成本、方便易行的戊型肝炎口服疫苗及其制備方法。
本發(fā)明所述的一種用于預(yù)防戊型肝炎的戊型肝炎服口服疫苗，含有2-6×109CFU活菌和輔料，該活菌是將編碼戊型肝炎病毒中和抗原表位的基因片段與質(zhì)粒pYA3341進(jìn)行重組，再將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化減毒鼠傷寒沙門菌(attenuatedSalmonella enterica serotype Typhimurium)。所表達(dá)的戊型肝炎病毒重組蛋白的氨基末端位于其開(kāi)放閱讀框架2編碼衣殼蛋白的380位至480位氨基酸之間，其羧基末端位于580位至650位氨基酸之間或由此蛋白片段產(chǎn)生的衍生物，優(yōu)選片段是戊型肝炎病毒第4基因型毒株開(kāi)放讀碼框架2中編碼中和抗原表位的位于第453位至631位氨基酸序列的基因片段。
本發(fā)明所述戊型肝炎服口服疫苗的制備方法方法將編碼戊型肝炎病毒中和抗原表位的優(yōu)選基因片段與質(zhì)粒pYA3341進(jìn)行重組，再將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化減毒鼠傷寒沙門菌(attenuated Salmonella enterica serotype Typhimurium)，上述優(yōu)選基因片段的核苷酸序列為GTTATCCAGGACTATGATAATCAACATGAGCAAGACCGCCCTACCCCCTCCCCTGCTCCTTCTCGCCCTTTTTCTGTGCTTCGTGCTAATGATGTGCTTTGGCTC
TCTCTCACCGCCGCCGAGTATGATCAGACTACCTACGGCTCTTCTACTAACCCTATGTATGTTTCTGATACTGTAACGTTTGTCAATGTGGCCACTGGCGCCCAGGGGGTTTCGCGCTCTCTGGACTGGTCTAAGGTTACCCTTGATGGGCGTCCACTAACTACTATCCAGCAGTATTCCAAGACTTTCTATGTTCTGCCTCTTCGTGGTAAGCTTTCTTTTTGGGAGGCTGGTACTACTAAAGCCGGCTACCCATACAATTATAATACTACTGCTAGTGATCAGATCCTGATTGAGAATGCAGCTGGCCATCGGGTTTGTATTTCTACTTATACTACTAATTTGGGCTCCGGGCCTGTTTCTATCTCTGCTGTCGGTGTCCTCGCACCCCATTCTGCATTGGCCGTTTTGGAGGACACTGTTGATTACCCT。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)1)本發(fā)明的重組疫苗是以口服途徑接種。比起注射途徑來(lái)，一方面口服粘膜免疫廉價(jià)、方便，毋需專門醫(yī)護(hù)人員，適用于大群體免疫，且可避免因注射接種而感染血源傳播疾病；另一方面，HEV是經(jīng)過(guò)糞口傳播，通常情況下，注射免疫很少能在粘膜位點(diǎn)誘導(dǎo)特異性免疫反應(yīng)，而粘膜免疫具有泛化性，一處粘膜免疫可在多處粘膜產(chǎn)生免疫作用，形成抗感染的首道防線，能夠阻止病原微生物從多處粘膜的入侵，并刺激機(jī)體產(chǎn)生持續(xù)的免疫保護(hù)反應(yīng)。
2)與現(xiàn)有的研制中的戊型肝炎口服疫苗相比，本發(fā)明具有諸多優(yōu)點(diǎn)。直接口服重組蛋白，一方面蛋白在消化道易被降解免疫效果持續(xù)時(shí)間短，需要反復(fù)接種，有時(shí)還需要添加佐劑，而且有時(shí)還會(huì)引起免疫耐受；另一方面采用口服途徑免疫時(shí)需要的重組蛋白疫苗劑量大，而基因工程重組蛋白的制備和純化過(guò)程復(fù)雜、操作繁瑣，大劑量蛋白的使用將使疫苗的成本大大提高，導(dǎo)致疫苗價(jià)格升高，影響疫苗的普及。本發(fā)明的疫苗容易大量獲得，不需要佐劑，也不需要純化等繁瑣的操作，因而降低了成本，易推廣。


圖1為PCR擴(kuò)增產(chǎn)物、重組質(zhì)粒pYA3341及酶切鑒定圖1.DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；2.PCR陰性對(duì)照；3.PCR產(chǎn)物；4.質(zhì)粒pYA3341；5.pYA3341/NcoI-PstI雙酶切；6.pYA3341-179/NcoI-PstI雙酶切。
圖2為克隆測(cè)序報(bào)告(上游測(cè)序，引物3)圖。
圖3為克隆測(cè)序報(bào)告(下游測(cè)序，引物4)圖。
圖4為菌體蛋白SDS-PAGE電泳圖1.蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；2.χ4550(pYA3341-179)(克隆1)；3.χ4550(pYA3341-179)(克隆2)；4.χ4550(pYA3341)。
圖5為p179蛋白與4種不同基因型抗HEV單克隆抗體的Western-blot分析結(jié)果圖1.陰性對(duì)照；2.3G1(第I基因型)；3.E5E12(第II基因型)；4.4D3(第III基因型)；5.1G10(第IV基因型)。
圖6為p179蛋白與HE病人血清標(biāo)本的Western-blot分析結(jié)果圖1.陰性對(duì)照；2.戊型肝炎病人血清標(biāo)本。
圖7為血清抗HEV-IgG P/N比值圖。
圖8為糞便抗HEV-sIgA P/N比值圖。
圖9為不同劑量重組菌免疫小鼠血清抗HEV-IgG的P/N比值圖。
圖10為不同劑量重組菌免疫小鼠糞便抗HEV-sIgA的P/N比值圖。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明選用編碼HEV第4基因型毒株ORF2中的編碼HEV中和抗原表位的基因片段，位于453至631位共179個(gè)氨基酸，簡(jiǎn)稱p179。通過(guò)分子克隆的方法，將其插入質(zhì)粒pYA3341中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pYA3341-179，再將該重組質(zhì)?；瘜W(xué)轉(zhuǎn)化入E.coli χ6212，然后再抽取重組E.coli χ6212(pYA3341-179)中的重組質(zhì)粒，電轉(zhuǎn)化進(jìn)減毒鼠傷寒沙門菌(attenuated Salmonella enterica serotypeTyphimurium)疫苗株χ4550，獲得重組菌株χ4550(pYA3341-179)。應(yīng)用Western-blot對(duì)重組菌所表達(dá)的重組蛋白進(jìn)行免疫分析，其結(jié)果顯示該重組菌可表達(dá)目的蛋白，并且目的蛋白可以與病人血清和不同基因型HEV單克隆抗體發(fā)生免疫反應(yīng)；該重組菌株在體外營(yíng)養(yǎng)選擇壓力下可較穩(wěn)定地?cái)y帶重組質(zhì)粒傳代繁殖。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，該重組疫苗對(duì)小鼠沒(méi)有毒性，能夠誘導(dǎo)機(jī)體持續(xù)產(chǎn)生針對(duì)HEV的特異性粘膜免疫和體液免疫，抗體的體外中和試驗(yàn)為陽(yáng)性。表明減毒鼠傷寒沙門菌重組菌株χ4550(pYA3341-179)可作為預(yù)防HEV感染的候選疫苗?？诜庖咭欢ǚ秶鷥?nèi)不同劑量的該疫苗菌株，均能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生體液免疫和粘膜免疫，免疫反應(yīng)的強(qiáng)弱和接種劑量的高低相關(guān)，口服免疫小鼠的優(yōu)選劑量是109CFU。
實(shí)施例1
本實(shí)施描述了重組菌χ4550(pYA3341-179)的構(gòu)建方法(a)目的基因的獲得以HEV第4基因型中國(guó)株序列為模板，用引物1(5’-CCCCCCATGGTTATCCAGGACTATGATAATC-3’)和引物2(5’-CCCCTCGAGTCAAGGGTAATCAACAGTGTCCTCCA-3’)擴(kuò)增ORF2編碼多肽453-631(p179)的基因片段。PCR條件為94℃-45秒，52℃-45秒，72℃-50秒，35個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠回收純化，克隆入質(zhì)粒pET28(a)+中。以pET28(a)+為模板，用引物3(5’-GACCATGGCTACCCCCTCCCCTGTC-3’，含NcoI酶切位點(diǎn))和引物4(5’-GCCTGCAGCTAAGGATAATCAACAGTGTC-3’，含PstI酶切位點(diǎn)以及終止密碼子)擴(kuò)增目的片段。PCR條件為94℃-45秒，52℃-60秒，72℃-60秒，35個(gè)循環(huán)。
上述第453位至631位氨基酸序列(p179)，其所述的氨基酸序列如下VIQDYDNQHEQDRPTPSPAPSRPFSVLRANDVLWLSLTAAEYDQTTYGSSTNPMYVSDTVTFVNVATGAQGVSRSLDWSKVTLDGRPLTTIQQYSKTFYVLPLRGKLSFWEAGTTKAGYPYNYNTTASDQILIENAAGHRVCISTYTTNLGSGPVSISAVGVLAPHSALAVLEDTVDYP。
上述第453位至631位氨基酸序列(p179)，其所述的核苷酸序列如下GTTATCCAGGACTATGATAATCAACATGAGCAAGACCGCCCTACCCCCTCCCCTGCTCCTTCTCGCCCTTTTTCTGTGCTTCGTGCTAATGATGTGCTTTGGCTCTCTCTCACCGCCGCCGAGTATGATCAGACTACCTACGGCTCTTCTACTAACCCTATGTATGTTTCTGATACTGTAACGTTTGTCAATGTGGCCACTGGCGCCCAGGGGGTTTCGCGCTCTCTGGACTGGTCTAAGGTTACCCTTGATGGGCGTCCACTAACTACTATCCAGCAGTATTCCAAGACTTTCTATGTTCTGCCTCTTCGTGGTAAGCTTTCTTTTTGGGAGGCTGGTACTACTAAAGCCGGCTACCCATACAATTATAATACTACTGCTAGTGATCAGATCCTGATTGAGAATGCAGCTGGCCATCGGGTTTGTATTTCTACTTATACTACTAATTTGGGCTCCGGGCCTGTTTCTATCTCTGCTGTCGGTGTCCTCGCACCCCATTCTGCATTGGCCGTTTTGGAGGACACTGTTGATTACCCT。
(b)減毒鼠傷寒沙門菌χ4550的構(gòu)建方法本發(fā)明優(yōu)選的減毒鼠傷寒沙門菌χ4550的減毒方式是腺苷酸環(huán)化酶基因(cya)和環(huán)化Amp受體蛋白基因(crp)缺失突變，同時(shí)缺失了編碼天門冬氨酸基因形成營(yíng)養(yǎng)缺陷菌(asd-)，與含有野生型asd基因的質(zhì)粒pYA3341組成了平衡致死系統(tǒng)。這些都可以用已知技術(shù)來(lái)制備。這項(xiàng)技術(shù)在U.S.Pat.No.5468485、U.S.Pat.No.5672345和U.S.Pat.No.6872547中已被公開(kāi)。
(b-1)具有Δcrp-1和Δcya-1缺失突變的減毒鼠傷寒沙門桿菌的構(gòu)建采用類似于Curtiss、Kelly(1987)和Nakayama、Kelly、Curtiss(1988)所述經(jīng)典遺傳方法，將野生型鼠傷寒SR-11株從遺傳上加以改性，構(gòu)建Δcrp-1，Δcya-1減毒疫苗株。其構(gòu)建方法如下將Tn10(編碼四環(huán)素抗性)放在Δcrp-1或Δcya-1突變附近，通過(guò)P22HTint中介轉(zhuǎn)導(dǎo)將連接特性轉(zhuǎn)導(dǎo)入高毒性鼠傷寒沙門菌SR-11菌株并選擇四環(huán)素抗性和篩選麥芽糖負(fù)表型。將連接Δcrp-1的zhc-1431::Tn10和連接Δcya-1的zid-62::Tn10用于該目的，沒(méi)有一種插入獨(dú)自影響鼠傷寒沙門菌的毒性。在含Δcrp-1和zhc-1431::Tn10突變的鼠傷寒沙門菌菌株首先制得一高滴度噬菌體P22HTint溶菌產(chǎn)物。并在含Δcya-1的zid-62::Tn10突變的鼠傷寒沙門菌菌株中制成另一種溶菌產(chǎn)物以促進(jìn)具有連接轉(zhuǎn)座子的基因缺失的轉(zhuǎn)導(dǎo)。然后用得到的P22HTint溶菌產(chǎn)物將遺傳特性轉(zhuǎn)導(dǎo)入野生型受體菌株SR-11。
在Δcrp-1和zhc-1431::Tn10突變的鼠傷寒沙門菌中繁殖的P22HTint被使用于轉(zhuǎn)導(dǎo)毒性菌株為篩選出具有Mal-的四環(huán)素抗性。將噬菌體感染混合物在37℃保溫20分鐘，然后將100微升樣品涂布在MacConkey培養(yǎng)基上，該培養(yǎng)基還有1％麥芽糖(最終濃度)，添加12.5微克/毫升四環(huán)素。在37℃保溫約26小時(shí)后，收集四環(huán)素抗性Mal-轉(zhuǎn)導(dǎo)體，在同樣的培養(yǎng)基中純化。再在LB液體培養(yǎng)基中加12.5微克/毫升四環(huán)素培養(yǎng)獲得的這些細(xì)菌，用含明膠的緩沖鹽水(BSG)以1∶10稀釋培養(yǎng)物，取100微升涂布在含鐮孢菌酸(FA)的培養(yǎng)基的平板上，將該板在37℃下保溫約36小時(shí)。收集FA抗性的菌落至0.5毫升BSG中，在FA培養(yǎng)基中進(jìn)行純化。將已純化的FA抗性的菌落置LB液體培養(yǎng)基中，在37℃下培養(yǎng)至出現(xiàn)混濁，檢測(cè)Tn10的損失，完全LPS的存在和營(yíng)養(yǎng)缺陷。這些新的菌株具有基因型Δcrp-1Δzhc-1431::Tn10。
由于cya-和crp-突變體的表型是相同的，攜帶經(jīng)克隆的crp+基因并具有氨芐青霉素抗性的質(zhì)粒pSD110被暫時(shí)用于補(bǔ)充染色體中的Δcrp突變，當(dāng)通過(guò)轉(zhuǎn)導(dǎo)引入時(shí)，能鑒定Δcya突變。用含有pSD110質(zhì)粒的鼠傷寒沙門菌中培養(yǎng)的P22HTint轉(zhuǎn)導(dǎo)上述制備好的菌株(Δcrp-1 Δzhc-1431::Tn10)在LB液體培養(yǎng)基生長(zhǎng)的培養(yǎng)物。在含有1％麥芽糖和100微克/毫升氨芐青霉素的MacConkey瓊脂中進(jìn)行選擇。26小時(shí)后，收集氨芐青霉素抗性，Mal+菌落，在含有1％麥芽糖和100微克/毫升氨芐青霉素的MacConkey瓊脂中進(jìn)行純化。獲得pSD110+的菌株(Δcrp-1Δzhc-1431::Tn10)。在含有100微克/毫升氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)該菌株，用在含有Δcya-1和zid-62::Tn10突變的菌株中繁殖的P22HTint轉(zhuǎn)導(dǎo)菌株以引入連接的Δcya-1和zid-62::Tn10突變。將該轉(zhuǎn)導(dǎo)混合物涂布在含1％麥芽糖、100微克/毫升氨芐青霉素和12.5微克/毫升四環(huán)素的MacConkey瓊脂平板上，收集氨芐青霉素抗性、四環(huán)素抗性、Mal-的菌落，在含1％麥芽糖、100微克/毫升氨芐青霉素和12.5微克/毫升四環(huán)素的MacConkey瓊脂中純化。將已純化的菌落置LB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至出現(xiàn)混濁，檢測(cè)完全LPS的存在和營(yíng)養(yǎng)缺陷。得到的菌株具有基因型Δcrp-1 Δzhc-1431::Tn10 pSD110+Δcya-1 Δzid-62::Tn10。在LB液體培養(yǎng)基中加12.5微克/毫升四環(huán)素和100微克/毫升氨芐青霉素培養(yǎng)獲得的這些細(xì)菌，用BSG以1∶10稀釋培養(yǎng)物，取100微升涂布在含鐮孢菌酸的培養(yǎng)基的平板上，將該板在37℃下保溫約36小時(shí)。收集FA抗性的菌落在FA培養(yǎng)基中進(jìn)行純化。將已純化的FA抗性的菌落置LB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至出現(xiàn)混濁，檢測(cè)Tn10的損失，完全LPS的存在和營(yíng)養(yǎng)缺陷。在該工序中pSD110質(zhì)粒通常從該菌株中自然消失以導(dǎo)致氨芐青霉素敏感性。最后得到的菌株具有Δcya-1和Δcrp-1突變的基因型。
(b-2)具有ΔasdA1突變的鼠傷寒沙門菌菌株的構(gòu)建在無(wú)毒沙門菌屬菌株中的重組質(zhì)粒上穩(wěn)定的維持和高水平的表達(dá)克隆基因，取決于使用的平衡-致死寄主-載體系統(tǒng)，為此編碼天冬氨酸β-半醛脫氫酶的asd基因的染色體突變，被引入Δcya-1和Δcrp-1突變體中，以此強(qiáng)加上需二氨基庚二酸(DAP)這一必要條件，該酸是細(xì)菌細(xì)胞壁堅(jiān)硬層的主要成分，而且它不能在動(dòng)物體內(nèi)合成。染色體Δasd突變由具有野生型Δasd+基因的質(zhì)?？寺≥d體pYA3341加以補(bǔ)充，質(zhì)粒的喪生會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌在無(wú)DAP的條件下死亡及溶解。
構(gòu)建方法包括移動(dòng)ΔasdA1突變至Δcya-1Δcrp-1突變菌株，該步驟的完成通過(guò)放置轉(zhuǎn)座子Tn10靠近ΔasdA1突變，再通過(guò)P22HTint轉(zhuǎn)導(dǎo)作用，將連接特性轉(zhuǎn)導(dǎo)入Δcya-1Δcrp-1突變鼠傷寒沙門菌株，同時(shí)挑選四環(huán)素抗性和篩選二氨基庚二酸陰性表型。連接ΔasdA1的zhf-4::Tn10用于該目的。帶連接轉(zhuǎn)座子的基因缺失，按下述方法進(jìn)行首先在含ΔasdA1和zhf-4::Tn10突變的鼠傷寒沙門菌上制成高滴度的噬菌體P22HTint溶胞產(chǎn)物，所得到的P22HTint溶胞產(chǎn)物再用于感染和轉(zhuǎn)導(dǎo)遺傳特性至受體Δcya-1Δcrp-1突變鼠傷寒沙門菌株，其感染復(fù)制率為10。噬菌體細(xì)菌感染混合物于37℃下保溫20分鐘，然后取100微升樣品涂布于含50微克/毫升DAP的Penassay瓊脂上，并補(bǔ)充以12.5微克/毫升四環(huán)素，于37℃下保溫約26小時(shí)后，檢出轉(zhuǎn)導(dǎo)體并于相同培養(yǎng)基上純化。將得到的衍生物在含有12.5微克/毫升四環(huán)素和50微克/毫升DAP的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，該培養(yǎng)基用BSG以1∶10比例稀釋。取100微升樣品涂布于含F(xiàn)A和50微克/毫升DAP的培養(yǎng)基上，再將平板于37℃下保溫約36小時(shí)。FA抗性菌落取出放入0.5毫升BSG中，并于含F(xiàn)A和50微克/毫升DAP的培養(yǎng)基上純化。純化過(guò)的FA抗性菌落放入含50微克/毫升DAP的LB液體培養(yǎng)基中，于37℃下培養(yǎng)至溶液發(fā)生混濁，再檢驗(yàn)Tn10缺失，完全LPS和Vi抗原的存在以及在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基上半胱氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、蘇氨酸和DAP的營(yíng)養(yǎng)缺陷，得到的新菌株即為減毒鼠傷寒沙門菌χ4550，其基因型為ΔasdA1Δ[zhf-4::Tn10]Δcya-1Δcrp-1。
(c)重組質(zhì)粒的構(gòu)建本實(shí)施例中，瓊脂糖凝膠回收純化均是使用上海申能博彩生物科技有限公司的“3S Spin DNA Agarose Gel Purification Kit”產(chǎn)品，按照說(shuō)明書操作即可。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠回收純化，用PstI和NcoI雙酶切后再經(jīng)瓊脂糖凝膠回收純化。同時(shí)質(zhì)粒pYA3341用PstI和NcoI雙酶切后進(jìn)行瓊脂糖凝膠回收純化。然后，將酶切純化過(guò)的PCR片段和質(zhì)粒pYA3341按摩爾比3∶1混勻，在T4DNA連接酶作用下進(jìn)行連接，最后轉(zhuǎn)化E.coli χ6212篩選陽(yáng)性克隆。E.coli χ6212是asd基因突變的營(yíng)養(yǎng)缺陷型，具有奈啶酮酸(NA)抗性，只有轉(zhuǎn)化進(jìn)攜帶asd基因的pYA3341才能在不含二氨基庚二酸(DAP)的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，據(jù)此達(dá)到篩選目的。
轉(zhuǎn)化過(guò)程如下將連接反應(yīng)液5μl和50μl E.coli χ6212新鮮感受態(tài)細(xì)菌混勻，冰浴30min；42℃水浴100s，立即冰浴2min；加600μl LB，37℃ 1h后，取100μl涂布于含50μg/ml NA的LB固體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)過(guò)夜。篩選過(guò)程如下首先挑取平皿上若干個(gè)單克隆，首先用引物3和引物4進(jìn)行PCR篩選，PCR條件為94℃預(yù)變性3min，然后94℃變性1.5min，52℃退火2min，72℃延伸3min，
30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸7min。然后，篩出的PCR陽(yáng)性的克隆，抽取質(zhì)粒，并用PstI和NcoI雙酶切鑒定(見(jiàn)圖1)。最后，雙酶切鑒定陽(yáng)性的克隆進(jìn)行測(cè)序(見(jiàn)圖2及3)。測(cè)序完全正確的克隆即為含有重組質(zhì)粒pYA3341-179的E.colix6212，抽提質(zhì)粒即可獲得重組質(zhì)粒pYA3341-179。
(d)重組菌χ4550(pYA3341-179)的構(gòu)建減毒鼠傷寒沙門桿菌χ4550是asd基因突變的營(yíng)養(yǎng)缺陷型，都有奈啶酮酸(NA)抗性，只有轉(zhuǎn)化進(jìn)攜帶asd的pYA3341才能在不含二氨基庚二酸(DAP)的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。將用LB培養(yǎng)基(含NA，50ug/ml)培養(yǎng)的E.coli χ6212(pYA3341-179)陽(yáng)性重組子，用引物3和引物4進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物測(cè)序正確后以常規(guī)堿變性法提取經(jīng)E.coli χ6212修飾過(guò)的重組質(zhì)粒，再電轉(zhuǎn)化進(jìn)χ4550。電轉(zhuǎn)化條件為電容25μF/電壓2.5kV/電阻200Ω。將用LB培養(yǎng)的χ4550(pYA3341-179)陽(yáng)性重組子，進(jìn)行酶切鑒定，并用Western-blot鑒定p179蛋白的表達(dá)。鑒定陽(yáng)性的菌落即為所要構(gòu)建的戊肝疫苗候選菌株。
(e)重組菌χ4550(pYA3341-179)蛋白表達(dá)分析(如圖4-圖6所示)應(yīng)用重組候選疫苗菌χ4550(pYA3341-179)和含空質(zhì)粒菌χ4550(pYA3341)提取全菌體蛋白后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜并進(jìn)行Western-blot分析，結(jié)果顯示重組菌在20KD左右有一條新生的蛋白條帶，位置與p179預(yù)期分子量大小一致，而對(duì)照空載體菌在相對(duì)應(yīng)的位置無(wú)該條蛋白帶；結(jié)果還顯示重組菌所表達(dá)的重組p179蛋白能與I、II、III、IV型HEV單抗發(fā)生免疫印跡反應(yīng)，呈單一清晰條帶；同時(shí)候選疫苗菌表達(dá)的p179也可與戊型肝炎病人血清發(fā)生反應(yīng)，膜上出現(xiàn)多條條帶，但在相同的位置有一較強(qiáng)顯色條帶；而含空質(zhì)粒菌χ4550免疫印跡分析無(wú)陽(yáng)性免疫條帶出現(xiàn)?？傊?，候選疫苗菌所表達(dá)蛋白p179與各型抗HEV的單抗和病人血清標(biāo)本均有較好的免疫反應(yīng)性。
實(shí)施例2本實(shí)施描述了候選疫苗菌χ4550(pYA3341-179)的體外穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)挑取上述構(gòu)建好的候選疫苗菌χ4550(pYA3341-179)單菌落分別接種于含DAP(無(wú)選擇壓力)和不含DAP(有選擇壓力)的LB液體培養(yǎng)基(含NA，50ug/ml)中；次日，分別用不含DAP和含有DAP的LB培養(yǎng)基稀釋1000倍，再培養(yǎng)，重復(fù)10次。經(jīng)上述反復(fù)傳代后分別取少量菌液涂布于含DAP的LB平板培養(yǎng)過(guò)夜，24h后各挑取100個(gè)單菌落分別點(diǎn)種于不含DAP的LB平板，觀察其中菌落數(shù)量，同時(shí)在每個(gè)不含DAP的LB平皿中隨機(jī)各挑取20個(gè)菌落提取質(zhì)粒。
結(jié)果在有選擇壓力傳代的重組菌生長(zhǎng)于含DAP平皿上的100個(gè)菌落在不含DAP的平皿上生長(zhǎng)菌落數(shù)為95個(gè)，從中隨機(jī)挑取的20個(gè)菌落提取質(zhì)粒，顯示90％含有重組質(zhì)粒。在無(wú)選擇壓力傳代的重組菌長(zhǎng)于含DAP平皿上挑取的100個(gè)菌落在不含DAP的平皿上生長(zhǎng)菌落數(shù)為70個(gè)，僅占70％，從中隨機(jī)挑取20個(gè)菌落提取質(zhì)粒，顯示僅有8個(gè)含有重組質(zhì)粒，僅占40％。體外穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)顯示候選疫苗菌在有選擇壓力的情況下重組質(zhì)粒能夠保持較高的穩(wěn)定性。
實(shí)施例3本實(shí)施描述了候選疫苗菌χ4550(pYA3341-179)毒性實(shí)驗(yàn)挑取LB平板上單個(gè)菌落于LB液體培養(yǎng)基(含NA，50ug/ml)中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，加入滅菌的5M NaCl溶液，使菌液中NaCl終濃度為300mM，于37℃靜置保溫4-5h以增加沙門菌的侵襲力，同時(shí)按照平板計(jì)數(shù)法進(jìn)行細(xì)菌的計(jì)數(shù)。將重組菌以4000rpm轉(zhuǎn)速，4℃離心20分鐘收集菌體，然后PBS洗兩次，用PBS調(diào)節(jié)菌液濃度分別為4×1011/100μl和4×109CFU/100μl。取6周齡BALB/C小鼠18只，隨機(jī)分為3組，每組6只。灌胃前過(guò)夜禁食禁水，接種前半小時(shí)用10％碳酸氫鈉溶液100ul灌胃中和胃酸。取兩組小鼠口服上述兩種劑量的重組菌，另外一組口服PBS，觀察小鼠服菌后的反應(yīng)及成活率。
接種30天后，對(duì)照組和口服疫苗組小鼠全部存活。與PBS對(duì)照組相比，口服疫苗組活動(dòng)情況及體重改變均無(wú)明顯差異，表明上述候選疫苗株具有良好的安全性。
實(shí)施例4本實(shí)施描述了候選疫苗菌χ4550(pYA3341-179)的免疫原性研究(a)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組和免疫方案選用6-8周齡的雌性BALB/C小鼠(揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心提供)16只，隨機(jī)分為兩組①口服候選疫苗菌χ4550(pYA3341-p179)組，4×1011CFU/100μl，每小鼠口服100μl菌液；②口服χ4550(pYA3341)組，4×1011CFU/100μl，每小鼠口服100μl菌液；小鼠口服免疫前，需要過(guò)夜禁食禁水，在口服菌液前半小時(shí)先用10％碳酸氫鈉100μl灌胃中和胃酸。兩組都于0周、4周、8周按上述劑量各口服免疫一次。
(b)標(biāo)本采集小鼠眼眶后靜脈叢采集新鮮血液，隔周采集一次，分離收集血清，置-20℃?zhèn)溆?，用于檢測(cè)血清抗HEV-IgG；小鼠新鮮糞便，每周采集一次，用0.01mol/L PBS溶液配成10％的混懸液，用震蕩器使其充分混勻，離心取上清，置-20℃?zhèn)溆?，用于檢測(cè)糞便抗HEV-sIgA。
(c)檢測(cè)方法(c-1)用間接ELISA法分別檢測(cè)血清抗HEV-IgG和糞便抗HEV-sIgA。
根據(jù)HEV緬甸(Bur)株、墨西哥(Mex)株、美國(guó)(Us)株、中國(guó)(Chi)株、摩洛哥(Mor)株、巴基斯坦(Pak)株、新西蘭豬(Nz-s)病毒株結(jié)構(gòu)區(qū)基因序列，采用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增編碼HEV ORF2 452～617位氨基酸的基因片段，將此片段連接于PGEX-4T-2質(zhì)粒表達(dá)GST-p166融合蛋白，經(jīng)GST-Sepharose 4B(Pharmacia產(chǎn)品)親和層析純化得到7種重組抗原(分別簡(jiǎn)稱為p166Bur、p166Mex、p166Us、p166Chi、p166Mor、p166Pak、p166Nz-s)，將7種重組抗原等量混合(簡(jiǎn)稱p166 Mix)后作為包被抗原。
具體步驟如下①用0.0lmol/L PBS稀釋后包被微孔板，100μl/孔，濃度為10μg/孔，4℃過(guò)夜。②1×PBST洗板3次，扣干。③用5％脫脂牛奶將血清標(biāo)本作1∶20稀釋，糞便標(biāo)本作1∶5稀釋，100μl/孔，37℃孵育40分鐘。④1×PBST洗板5次，扣干。⑤用20％甘油將HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG作1∶10000稀釋，HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgA作1∶1000稀釋，100μl/孔，37℃孵育40分鐘。⑥1×PBST洗板5次，扣干。⑦用底物A液和B液顯色10分鐘后，以2mol/L H2SO4終止顯色后，用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔A450值。
(c-2)用間接ELISA法分別檢測(cè)血清抗LPS-IgG和糞便抗LPS-sIgA抗原包被選用LPS，濃度為10μg/孔。將LPS抗原用0.1M碳酸鹽緩沖液(PH9.6)稀釋同時(shí)加入濃度為10mg/ml的牛血清白蛋白，包被微孔板，100μl/孔，放置4℃冰箱過(guò)夜。具體操作步驟同前。
(d)檢測(cè)結(jié)果(d-1)血清抗HEV-IgG(見(jiàn)圖7)口服χ4550(pYA3341)組小鼠血清始終未檢測(cè)到抗HEV-IgG，疫苗免疫組小鼠血清中抗HEV-IgG于2周開(kāi)始呈陽(yáng)性(P/N＞2.1)，之后逐漸上升，第10周達(dá)到高峰。表明小鼠口服候選疫苗菌χ4550(pYA3341-179)后可產(chǎn)生特異性抗HEV-IgG，刺激小鼠產(chǎn)生體液免疫。
(d-2)糞便抗HEV-sIgA(見(jiàn)圖8)口服χ4550(pYA3341)組小鼠糞便中始終未檢測(cè)到抗HEV-sIgA。疫苗免疫組小鼠糞便抗HEV-sIgA于首次免疫接種后一直保持較低水平，首次加強(qiáng)免疫后，抗HEV-sIgA水平即開(kāi)始緩慢上升，第9周達(dá)到高峰。糞便檢測(cè)的結(jié)果顯示候選疫苗菌χ4550(pYA3341-179)可以刺激小鼠產(chǎn)生特異性抗HEV-sIgA，誘導(dǎo)小鼠的粘膜免疫應(yīng)答。
(d-3)血清抗LPS-IgG口服疫苗組小鼠于接種后2周，其抗LPS-IgG水平即開(kāi)始升高，于第4周抗體的A450值達(dá)到最高峰，其后的首次加強(qiáng)免疫和二次加強(qiáng)免疫，抗LPS-IgG水平均未見(jiàn)明顯升高，仍維持在較高水平；抗LPS-IgG的A450值于第12周開(kāi)始下降。
(d-4)糞便抗LPS-sIgA口服疫苗組小鼠免疫后糞便抗LPS-IgA抗體水平于初次加強(qiáng)免疫后2周才逐漸升高，抗LPS-sIgA水平一直維持較低水平。
實(shí)施例5本實(shí)施描述了戊肝抗體體外中和實(shí)驗(yàn)。
采用基于PCR的體外中和實(shí)驗(yàn)方法，將1∶40稀釋的抗血清100ul與含100TCID50/100ul戊肝病毒懸液混合，37℃作用1小時(shí)后接種PLC/PRF/5細(xì)胞，37℃培養(yǎng)2小時(shí)后，Hank’s液洗滌細(xì)胞3次，使用Trizol法提取核酸，采用引物3(5’-CCGACA GAA TTG ATT TCG TCG GC-3’)、引物4(5’-GTT GTC TCG GCC AAT GGCGAG CC-3’)、引物5(5’-TCG GCG GCG GTG AGA GAG AGC CA-3’)、引物6(5’-CCG TAA GTG GAC TGG TCG TAC TC-3’)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄-巢式PCR檢測(cè)戊型肝炎病毒核酸，巢式PCR條件為第一輪94℃-45秒，50℃-45秒，72℃-50秒，35個(gè)循環(huán)，引物為引物3和引物6；第二輪94℃-45秒，52℃-45秒，72℃-50秒，30個(gè)循環(huán)，引物為引物4和引物5；PCR陰性判為中和試驗(yàn)陽(yáng)性，最后將能中和病毒的抗血清判為陽(yáng)性血清。
結(jié)果顯示空菌免疫小鼠血清均為陰性，口服疫苗組小鼠血清均為陽(yáng)性?？梢?jiàn)口服免疫χ4550(pYA3341-179)，小鼠體內(nèi)可以誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體。
實(shí)施例6本實(shí)施例描述了不同劑量χ4550(pYA3341-179)口服免疫小鼠后免疫效果的比較。
(a)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組和免疫方案選用6-8周齡的雌性BALB/C小鼠(揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心提供)32只，隨機(jī)分為五組①口服PBS組，每小鼠口服100μl②口服χ4550(pYA3341-p179)組，4×103CFU/100μl，每小鼠口服100μl菌液；③口服χ4550(pYA3341-p179)組，4×107CFU/100μl，每小鼠口服100μl菌液；④口服χ4550(pYA3341-p179)組，4×109CFU/100μl，每小鼠口服100μl菌液；⑤口服χ4550(pYA3341-p179)組，4×1011CFU/100μl，每小鼠口服100μl菌液。小鼠口服免疫前，需要過(guò)夜禁食禁水，在口服菌液前半小時(shí)先用10％碳酸氫鈉100μl灌胃中和胃酸。各組都于0周、4周、8周按上述劑量分別口服免疫一次。
(b)標(biāo)本采集小鼠眼眶后靜脈叢采集新鮮血液，隔周采集一次，分離收集血清，置-20℃?zhèn)溆?，檢測(cè)血清抗HEV-IgG；小鼠新鮮糞便，用0.01mol/L PBS溶液配成10％的混懸液，用震蕩器使其充分混勻，離心取上清，置-20℃?zhèn)溆茫瑱z測(cè)糞便抗HEV-sIgA。
(c)觀察指標(biāo)以及檢測(cè)方法(c-1)接種后，每天觀察以下指標(biāo)至少連續(xù)7天是否死亡、體重增減、毛順與否、活動(dòng)狀況、是否厭食、精神狀態(tài)、是否腹瀉等小鼠的一般狀況。
(c-2)用間接ELISA法分別檢測(cè)血清抗HEV-IgG和糞便抗HEV-sIgA。
根據(jù)HEV緬甸(Bur)株、墨西哥(Mex)株、美國(guó)(Us)株、中國(guó)(Chi)株、摩洛哥(Mor)株、巴基斯坦(Pak)株、新西蘭豬(Nz-s)病毒株結(jié)構(gòu)區(qū)基因序列，采用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增編碼HEV ORF2 452～617位氨基酸的基因片段，將此片段連接于PGEX-4T-2質(zhì)粒表達(dá)GST-p166融合蛋白，經(jīng)GST-Sepharose 4B(Pharmacia產(chǎn)品)親和層析純化得到7種重組抗原(分別簡(jiǎn)稱為p166Bur、p166Mex、p166Us、p166Chi、p166Mor、p166Pak、p166Nz-s)，將7種重組抗原等量混合(簡(jiǎn)稱p166Mix)后作為包被抗原。
具體步驟如下①用0.01mol/L PBS稀釋后包被微孔板，100μl/孔，濃度為10μg/孔，4℃過(guò)夜。②1×PBST洗板3次，扣干。③用5％脫脂牛奶將血清標(biāo)本作1∶20稀釋，糞便標(biāo)本作1∶5稀釋，100μl/孔，37℃孵育40分鐘。④1×PBST洗板5次，扣干。⑤用20％甘油將HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG作1∶10000稀釋，HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgA作1∶1000稀釋，100μl/孔，37℃孵育40分鐘。⑥1×PBST洗板5次，扣干。⑦用底物A液和B液顯色10分鐘后，以2mol/L H2SO4終止顯色后，用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔A450值。以P/N比值(待檢樣品OD450值/陰性樣品OD450)≥2.1判為陽(yáng)性。
(d)檢測(cè)結(jié)果(d-1)小鼠灌胃后，出現(xiàn)短暫呼吸加快，行動(dòng)遲緩，活動(dòng)減少。經(jīng)過(guò)大約半小時(shí)后，上述狀況好轉(zhuǎn)，2-3小時(shí)后完全好轉(zhuǎn)，但對(duì)照組和疫苗免疫組在免疫初2-3天均有豎毛現(xiàn)象。疫苗組以及PBS對(duì)照組在免疫期間未出現(xiàn)腹瀉，無(wú)小鼠死亡。免疫后小鼠體重有所降低，與免疫劑量沒(méi)有相關(guān)性，且與免疫前相比差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，在三次免疫完成后體重又開(kāi)始上升。表明灌胃對(duì)小鼠有一定的的傷害，小鼠對(duì)減毒鼠傷寒沙門桿菌耐受良好。
(d-2)血清抗HEV-IgG(見(jiàn)圖9)口服PBS對(duì)照組小鼠血清始終未檢測(cè)到抗HEV-IgG，而各疫苗免疫組小鼠抗HEV-IgG水平呈穩(wěn)定上升趨勢(shì)。如圖9所示，自第6周后，口服4×1011CFU和4×109CFU兩組小鼠一直保持高滴度抗HEV-IgG，兩者抗體水平差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)?？诜?×103CFU組小鼠的抗體水平也呈上升趨勢(shì)，但均低于同期高劑量組，與口服4×1011CFU和4×109CFU兩組相比，差別均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。首次免疫后66周各疫苗免疫組小鼠的血清抗HEV-IgG均呈陽(yáng)性，而以劑量高者P/N比值高。
(d-3)糞便抗HEV-sIgA(見(jiàn)圖10)口服PBS組小鼠糞便未檢測(cè)到抗HEV-sIgA，各疫苗免疫組小鼠糞便抗HEV-sIgA呈緩慢上升趨勢(shì)。其中口服4×1011CFU的抗HEV-sIgA于第4周開(kāi)始呈陽(yáng)性，而后快速上升，之后維持在較高水平，于第23周左右開(kāi)始出現(xiàn)下降趨勢(shì)，至66周抗體呈陰性。其它免疫組也有類似的規(guī)律，但是各組抗體水平隨著接種劑量的高低而有所增減，其中口服4×1011CFU與4×103CFU組之間的抗體水平差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
(d-4)綜合各方面因素，優(yōu)選劑量為口服4×109CFU。
實(shí)施例7
本實(shí)施例描述的是口服疫苗χ4550(pYA3341-179)的凍干方法。
(a)樣品準(zhǔn)備挑取χ4550(pYA3341-179)單克隆于LB液體培養(yǎng)基中，37℃同時(shí)以250rpm振蕩培養(yǎng)，直至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。4℃，5000rpm離心20分鐘收集菌體沉淀。
(b)添加凍干保護(hù)劑凍干將凍干保護(hù)劑和沉淀充分混勻，所加保護(hù)劑的量為發(fā)酵液的1/4-1/2，優(yōu)選1/3。預(yù)冷后，經(jīng)冷凍真空干燥制成產(chǎn)品，4℃保存。
所用凍干保護(hù)劑是由蔗糖3-20克，維生素C 0.5-2克，氨基酸混合物1-3克，水1000克組成。其中維生素C和氨基酸混合物采用過(guò)濾除菌，蔗糖高壓滅菌。
凍干粉做成后，用生理鹽水重懸疫苗凍干粉，并按1∶102，1∶101，1∶106，1∶108，1∶1010系列稀釋后在平板上進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，得到每克凍干粉含有的活菌數(shù)。
(c)灌制膠囊選用腸溶膠囊殼，每顆膠囊的成分為含有2-6×109CFU活菌的凍干粉、乳糖100-180mg、硬脂酸鎂3.6-4.4mg，利用全自動(dòng)膠囊灌裝封口機(jī)灌制成膠囊。
(d)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)(d-1)選用6-8周齡的雌性BALB/C小鼠(揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心提供)12只，隨機(jī)分為PBS對(duì)照組和疫苗組，每組6只?？诜斑^(guò)夜禁食禁水，接種前30分鐘用10％碳酸氫鈉溶液100μl灌胃中和胃酸。PBS對(duì)照組于0周、4周、8周分別口服100μL無(wú)菌PBS。將含有2-6×109CFU活菌的凍干粉(每顆膠囊的含量)用100μL無(wú)菌生理鹽水重懸，疫苗組小鼠分別于0周、4周、8周口服上述劑量。
(d-2)標(biāo)本采集小鼠眼眶后靜脈叢采集新鮮血液，隔周采集一次，分離收集血清，置-20℃?zhèn)溆?，檢測(cè)血清抗HEV-IgG；小鼠新鮮糞便，每周采集一次，用0.01mol/L PBS溶液配成10％的混懸液，用震蕩器使其充分混勻，離心取上清，置-20℃?zhèn)溆?，檢測(cè)糞便抗HEV-sIgA。
(d-3)檢測(cè)方法用間接ELISA法分別檢測(cè)血清抗HEV-IgG和糞便抗HEV-sIgA。
根據(jù)HEV緬甸(Bur)株、墨西哥(Mex)株、美國(guó)(Us)株、中國(guó)(Chi)株、摩洛哥(Mor)株、巴基斯坦(Pak)株、新西蘭豬(Nz-s)病毒株結(jié)構(gòu)區(qū)基因序列，采用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增編碼HEY ORF2 452～617位氨基酸的基因片段，將此片段連接于PGEX-4T-2質(zhì)粒表達(dá)GST-p166融合蛋白，經(jīng)GST-Sepharose 4B(Pharmacia產(chǎn)品)親和層析純化得到7種重組抗原(分別簡(jiǎn)稱為p166Bur、p166Mex、p166Us、p166Chi、p166Mor、p166Pak、p166Nz-s)，將7種重組抗原等量混合(簡(jiǎn)稱p166Mix)后作為包被抗原。
具體步驟如下①用0.01mol/L PBS稀釋后包被微孔板，100μl/孔，濃度為10μg/孔，4℃過(guò)夜。②1×PBST洗板3次，扣干。③用5％脫脂牛奶將血清標(biāo)本作1∶20稀釋，糞便標(biāo)本作1∶5稀釋，100μl/孔，37℃孵育40分鐘。④1×PBST洗板5次，扣干。⑤用20％甘油將HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG作1∶10000稀釋，HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgA作1∶1000稀釋，100μl/孔，37℃孵育40分鐘。⑥1×PBST洗板5次，扣干。⑦用底物A液和B液顯色10分鐘后，以2mol/L H2SO4終止顯色后，用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔A450值。以P/N比值(待檢樣品OD450值/陰性樣品OD450)≥2.1判為陽(yáng)性。
(d-4)檢測(cè)結(jié)果如表7-1和7-2所示，做成的膠囊制劑可以誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生高滴度血清抗HEV-IgG和糞便抗HEV-sIgA表7-1.血清抗HEV-IgG P/N比值

表7-2.糞便抗HEV-slgA P/N比值

HEV p179核苷酸序列g(shù)ttatccagg actatgataa tcaacatgag caagaccgcc ctaccccctc ccctgctcct60tctcgccctt tttctgtgct tcgtgctaat gatgtgcttt ggctctctct caccgccgcc120gagtatgatc agactaccta cggctcttct actaacccta tgtatgtttc tgatactgta180acgtttgtca atgtggccac tggcgeccag ggggtttcgc gctctctgga ctggtctaag240gttacccttg atgggcgtcc actaactact atccagcagt attccaagac tttctatgtt300ctgcctcttc gtggtaagct ttctttttgg gaggctggta ctactaaagc cggctaccca360tacaattata atactactgc tagtgatcag atcctgattg agaatgcagc tggccatcgg420gtttgtattt ctacttatac tactaatttg ggctccgggc ctgtttctat ctctgctgtc480ggtgtcctcg caccccattc tgcattggcc gttttggagg acactgttga ttaccct 53權(quán)利要求
1.一種用于預(yù)防戊型肝炎的戊型肝炎服口服疫苗，其特征在于含有2-6×109CFU活菌和輔料，該活菌是將編碼戊型肝炎病毒中和抗原表位的基因片段與質(zhì)粒pYA3341進(jìn)行重組，再將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化減毒鼠傷寒沙門菌(attenuatedSalmonella enterica serotype Typhimurium)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的預(yù)防戊型肝炎的戊型肝炎服口服疫苗，其特征在于所表達(dá)的戊型肝炎病毒重組蛋白的氨基末端位于其開(kāi)放閱讀框架2編碼衣殼蛋白的380位至480位氨基酸之間，其羧基末端位于580位至650位氨基酸之間或由此蛋白片段產(chǎn)生的衍生物，優(yōu)選片段是戊型肝炎病毒第4基因型毒株開(kāi)放讀碼框架2中編碼中和抗原表位的位于第453位至631位氨基酸序列的基因片段。
3.一種用于制備權(quán)利要求1所述戊型肝炎服口服疫苗的方法，其特征在于將編碼戊型肝炎病毒中和抗原表位的優(yōu)選基因片段與質(zhì)粒pYA3341進(jìn)行重組，再將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化減毒鼠傷寒沙門菌(attenuated Salmonella enterica serotypeTyphimurium)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于上述基因片段的核苷酸序列為GTTATCCAGGACTATGATAATCAACATGAGCAAGACCGCCCTACCCCCTCCCCTGCTCCTTCTCGCCCTTTTTCTGTGCTTCGTGCTAATGATGTGCTTTGGCTCTCTCTCACCGCCGCCGAGTATGATCAGACTACCTACGGCTCTTCTACTAACCCTATGTATGTTTCTGATACTGTAACGTTTGTCAATGTGGCCACTGGCGCCCAGGGGGTTTCGCGCTCTCTGGACTGGTCTAAGGTTACCCTTGATGGGCGTCCACTAACTACTATCCAGCAGTATTCCAAGACTTTCTATGTTCTGCCTCTTCGTGGTAAGCTTTCTTTTTGGGAGGCTGGTACTACTAAAGCCGGCTACCCATACAATTATAATACTACTGCTAGTGATCAGATCCTGATTGAGAATGCAGCTGGCCATCGGGTTTGTATTTCTACTTATACTACTAATTTGGGCTCCGGGCCTGTTTCTATCTCTGCTGTCGGTGTCCTCGCACCCCATTCTGCATTGGCCGTTTTGGAGGACACTGTTGATTACCCT。
全文摘要
一種用于預(yù)防戊型肝炎的戊型肝炎口服疫苗，其特征在于含有2－6×10
文檔編號(hào)A61P31/14GK1966077SQ20061004155
公開(kāi)日2007年5月23日 申請(qǐng)日期2006年9月15日 優(yōu)先權(quán)日2006年9月15日
發(fā)明者孟繼鴻, 程險(xiǎn)峰, 嚴(yán)亞慧, 戴星, 董晨 申請(qǐng)人:東南大學(xué)