一種改良的乳清蛋白培養(yǎng)基及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于微生物領(lǐng)域，涉及一種改良的乳清蛋白培養(yǎng)基及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]基因工程菌是利用基因工程技術(shù)，將外源目的基因?qū)胨拗骷?xì)胞使其表達(dá)所需蛋白的重組菌。基因工程菌發(fā)酵是為了獲得大量的外源基因表達(dá)產(chǎn)物，與發(fā)酵生產(chǎn)工藝的控制有非常重要的關(guān)系。
[0003]重組干酪乳桿菌是一種活載體口服疫苗候選菌株，并兼有乳酸菌的益生功能，而且在體內(nèi)能夠發(fā)揮許多生理效應(yīng)。傳統(tǒng)的干酪乳桿菌放大培養(yǎng)用MRS培養(yǎng)基進(jìn)行，細(xì)菌數(shù)量和表達(dá)量較高，但MRS培養(yǎng)基的價格比較貴，成本較高，口感欠佳，所以人們將目光放在價格低廉，營養(yǎng)豐富，口感較好的乳清蛋白上。乳清蛋白是從巴氏殺菌的乳清中去除非蛋白并經(jīng)過過濾沉淀制成的。乳清蛋白口感好，營養(yǎng)豐富，易消化吸收。但是，使用單純的乳清蛋白對重組干酪乳桿菌進(jìn)行培養(yǎng)時發(fā)現(xiàn)，該菌在乳清蛋白粉中發(fā)酵細(xì)菌數(shù)量低且表達(dá)量較低，因此，如果能夠進(jìn)一步改進(jìn)乳清蛋白粉的配方，獲得價格低廉、高效的改良乳清蛋白粉，延長菌種的保存時間，為疫苗的工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)顯得尤為重要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種改良的乳清蛋白培養(yǎng)基，解決目前所用的MRS培養(yǎng)基的價格比較貴，成本較高，口感欠佳，但單純用乳清蛋白粉作為培養(yǎng)基對重組干酪乳桿菌進(jìn)行培養(yǎng)，菌種的發(fā)酵細(xì)菌數(shù)量低和表達(dá)量較低的問題。
[0005]本發(fā)明的另一目的是提供上述改良的乳清蛋白培養(yǎng)基的用途。
[0006]本發(fā)明通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn):
[0007]一、一種改良的乳清蛋白培養(yǎng)基，其組分和重量百分比如下:
[0008]乳清蛋白4%，酵母粉1.5%，乳糖1%，磷酸鹽0.5%，余量為水。
[0009]進(jìn)一步的，所述的磷酸鹽包括Na2HPOjP NaH2PO4，其中，似2即04的重量百分比為0.188%，NaH2PO^重量百分比為 0.312%。
[0010]二、上述的改良的乳清蛋白培養(yǎng)基在培養(yǎng)重組干酪乳桿菌中的應(yīng)用。
[0011]采用上述技術(shù)方案的積極效果:本發(fā)明對培養(yǎng)重組干酪乳桿菌的乳清蛋白培養(yǎng)基進(jìn)行了進(jìn)一步優(yōu)化，可以更好的促進(jìn)菌種生長，提高活菌數(shù)，使重組干酪乳桿菌活菌數(shù)的平均實測值達(dá)到7.6X 109cfu/mL ;該培養(yǎng)基可以替代MRS培養(yǎng)基，降低生產(chǎn)成本，為進(jìn)一步制備預(yù)防仔豬腹瀉口服液疫苗奠定基礎(chǔ)。
【附圖說明】
[0012]圖1是重組質(zhì)粒PCR鑒定結(jié)果；
[0013]圖中，M.DL 2000marker ；1.陰性對照，2.TGEV-BC PCR 產(chǎn)物，1349bp ；
[0014]圖2是緩沖鹽對重組干酪乳桿菌生長影響結(jié)果圖；
[0015]圖3是緩沖鹽發(fā)酵前后的pH值變化圖；
[0016]圖4是胰蛋白胨對重組干酪乳桿菌生長影響結(jié)果圖；
[0017]圖5是酵母粉對重組干酪乳桿菌生長影響結(jié)果圖；
[0018]圖6是硝酸鈉對重組干酪乳桿菌生長影響結(jié)果圖；
[0019]圖7是硫酸銨對重組干酪乳桿菌生長影響結(jié)果圖；
[0020]圖8是不同碳源對重組干酪乳桿菌生長影響結(jié)果圖；
[0021]圖9是三種培養(yǎng)基對比結(jié)果圖；
[0022]圖中，I普通乳清蛋白培養(yǎng)基，2改良乳清蛋白培養(yǎng)基，3MRS培養(yǎng)基。
【具體實施方式】
[0023]本發(fā)明中生物材料的來源:
[0024]1、重組干酪乳桿菌:該菌種已經(jīng)公開在《豬傳染性胃腸炎病毒S截短蛋白在干酪乳桿菌表面展示表達(dá)的研宄》中，作者:田斌，中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報第35卷第11期，1008-0589 (2013) 11-0874-04，該作者為黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)學(xué)生，該菌種目前保存在黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院基因工程實驗室內(nèi)，并由本專利的申請人保證從本申請日起二十年內(nèi)向公眾發(fā)放該生物材料；
[0025]2、干酷乳桿菌 CICC6105 (Lactobacillus casei CICC 6106):購自中國工業(yè)微生物菌種保藏中心。
[0026]下面結(jié)合實施例和對比例對本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步的說明，但不應(yīng)理解為對本發(fā)明的限制:
[0027]實施例1
[0028]一種改良的乳清蛋白培養(yǎng)基，稱取乳清蛋白40g，酵母粉15g，乳糖10g，Na2HPO4L 88g，NaH2P043.12g，加入蒸餾水，配置終體積為IL的乳清蛋白培養(yǎng)基。
[0029]實施例2
[0030]一種改良的乳清蛋白培養(yǎng)基，稱取乳清蛋白80g，酵母粉30g，乳糖20g，Na2HP043.76g，NaH2P046.24g，加入蒸餾水，配置終體積為2L的乳清蛋白培養(yǎng)基。
[0031]實施例3
[0032]本實施例用于說明重組干酪乳桿菌的活化與鑒定。
[0033]挑取培養(yǎng)好的MRS瓊脂平板上的重組干酪乳桿菌單菌落，接入1mL MRS液體培養(yǎng)基中，37°C靜止培養(yǎng)16h，然后按重量百分比為2%的接種量接入10mL的MRS液體培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，37°C靜止培養(yǎng)16h，備用。
[0034]隨機(jī)挑取MRS培養(yǎng)基上生長的單菌落，接種于含氯霉素(34ug/mL)的MRS液體培養(yǎng)基中，37°C靜止培養(yǎng)過夜。按照Daniel J [94]等提供的方法提取質(zhì)粒，方法如下:
[0035](I)取過夜培養(yǎng)的菌液2mL于離心管中，12000r/min離心Imin收集菌體沉淀；
[0036](2)加入含有25%蔗糖和30mg/mL溶菌酶的溶液200uL重懸沉淀，混合均勻后，37°C 水浴 20min ；
[0037](3)向溶液中加入含3% SDS和0.2N的NaOH的裂解液400uL，迅速混合均勻，室溫放置7min ；
[0038](4)在向其中加入預(yù)冷的3M醋酸鈉300uL，4°C、12000r/min離心15min ；
[0039](5)將上清液移到一個新的離心管中，加入650uL的異丙醇后，4°C、12000r/min離心 15min ；
[0040](6)棄去上清，加入ImL 75%的乙醇洗滌沉淀，4°C、12000r/min離心5min，重復(fù)洗滌兩次；
[0041](7)傾倒上清，向其中加入30uL的含有Rnase酶的TE懸浮沉淀，_20°C保存?zhèn)溆谩?br>[0042]用提取好的質(zhì)粒作為PCR模板進(jìn)行PCR鑒定，通過設(shè)計的特異性引物(上游引物5 ’ -CGCGGATCCACTAATAGAACTATAGGCAAC-3，，下游引物 5 ’ -CGCGTCGACTTAAGCACATTGATCAGTGCAATTG-3’)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，同時設(shè)置干酪乳桿菌CICC6105空菌作為對照。用1%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定，結(jié)果如圖1所示，可見1349bp的特異性條帶，與預(yù)期DNA片段大小一致。
[0043]實施例4
[0044]本實施例說明緩沖鹽對活菌數(shù)的影響。
[0045]不同緩沖鹽對乳酸菌生長的影響:乳酸菌在生長過程中代謝糖類產(chǎn)生乳酸，使得培養(yǎng)液的PH值不斷降低，抑制乳酸菌的繁殖。因此在乳酸菌的發(fā)酵培養(yǎng)基中加入緩沖不同緩沖鹽對乳