專利名稱：用于治療性干預(yù)的y4選擇性受體激動劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及相對于Y1和Y2受體而言，作為Y4選擇性激動劑的肽或肽化合物，和它們在治療對Y4受體激活起反應(yīng)的疾病中的應(yīng)用，例如治療肥胖和超重，以及認為這些情況是影響因素的疾病，腹瀉和腸分泌過多(intestinalhypersecretion)。
背景技術(shù)：
PP-折疊肽家族-NPY(神經(jīng)肽Y)(人序列-SEQ ID.No1)、PYY(肽YY)(人序列-SEQ ID.No2)和PP(胰腺多肽)(人序列-SEQ ID.No3)是天然分泌的同源性，36個氨基酸，C-末端酰胺化的肽，這些肽的特征為有共同的三維結(jié)構(gòu)-PP-折疊，該結(jié)構(gòu)即使在稀釋的水溶液中也出人意料地穩(wěn)定并且對這些肽的受體識別很重要。
首先，通過下調(diào)分辨率至0.98的X-射線晶體圖分析和該肽獲得名稱的獨特結(jié)構(gòu)詳細鑒定了禽類PP的X-射線結(jié)構(gòu)特征(Blundell等，1981 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 784175-79；Glover等，1984，Eur.J.Biochem.142379-85)。然后，特別通過NMR圖譜分析分析了該家族其它成員的PP-折疊結(jié)構(gòu)。X-射線和NMR分析顯然要在高度濃縮的或固體條件下進行；然而，詳細的圓二色性分析提示NPY和PP即使在水溶液中仍采取PP-折疊結(jié)構(gòu)，這對此種小肽是罕見的(Fuhlendorff等，1990 J.Biol.Chem.26511706-12)。重要的是，對這些肽以及它們的片段和類似物的蛋白酶水解穩(wěn)定性分析表明，例如全長PP1-36即使為稀釋的水溶液也保持折疊構(gòu)型從而保護其免遭某些酶的降解，所述酶能容易且快速地降解因少許取代而不能采取PP-折疊結(jié)構(gòu)的類似物(Schwartz等，1990 Annals NY Acad.Sci.61135-47)。
NPY、PYY和PP共有的PP-折疊結(jié)構(gòu)由以下部分組成1)N-末端聚脯氨酸樣螺旋(對應(yīng)于含Pro2、Pro5和Pro8的殘基1-8)，其后是2)I型β-轉(zhuǎn)角區(qū)(對應(yīng)于殘基9-12)，然后是3)與聚脯氨酸螺旋反平行的具有152°角度的兩親性α-螺旋(殘基13-30)，和4)C-末端六肽(殘基31-36)。與3個疏水性脯氨酸殘基緊密相互交叉的兩親性α-螺旋側(cè)鏈之間的疏水相互作用穩(wěn)定了此折疊結(jié)構(gòu)(Schwartz等，1990)。除了受體識別C-末端六肽中的關(guān)鍵殘基外，穩(wěn)定PP-折疊結(jié)構(gòu)的核心疏水殘基在PP-折疊肽家族中也是保守的。

圖1A描述了NPY、PYY和PP中保守的NPY序列和殘基，以黑底白字表示。圖1A也說明了上述PP-折疊結(jié)構(gòu)的元件。對受體識別重要的C-末端六肽是非結(jié)構(gòu)性的(unstructured)，但PP折疊提供了將C-末端六肽提供給受體的穩(wěn)定支架(見圖1B描述)，就變化程度而言，這些受體也依賴于或不依賴于這些肽的N-末端部分。NMR圖譜分析證明，例如NPY的遠處C-末端和N-末端部分頗可移動，這意味著PP-折疊經(jīng)常處于游離末端被“拉開”的危險中。
NPY是在中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)各部分中具有多種作用的分布極廣的神經(jīng)肽，通過人體中許多不同的受體亞型，Y1、Y2、Y4和Y5起作用。主要的NPY受體是Y1受體和Y2受體，Y1受體一般是傳輸NPY神經(jīng)元“沖動”的突觸后受體，Y2受體一般是突觸前抑制性受體。該情況也見于下丘腦，下丘腦中也表達黑皮素受體拮抗劑/反向激動劑AgRP(野灰相關(guān)肽)的NPY神經(jīng)元在弓形核的刺激(傳入)支中起基礎(chǔ)“傳感”神經(jīng)元作用。因此，在該控制食欲和能量消耗的“傳感核”中，NPY/AgRP神經(jīng)元與抑制性POMC/CART神經(jīng)元一起監(jiān)控機體的激素和營養(yǎng)狀態(tài)，因為這些神經(jīng)元是長期調(diào)節(jié)劑如瘦蛋白和胰島素，和短期調(diào)節(jié)劑如生長素釋放肽和PYY(見下文)的靶點。刺激性NPY/AgRP神經(jīng)元也凸入例如下丘腦的室旁核中，認為該處其突觸后靶受體是Y1和Y5受體。就增進食物攝入而言，NPY是已知最強效化合物，因為嚙齒類動物經(jīng)腦室內(nèi)(ICV)注射NPY后將不斷進食直至飽撐。NPY/AgRP神經(jīng)元的AgRP作用主要是作為4型黑皮素受體(MC-4)的拮抗劑，能阻斷POMC衍生肽(主要是aMSH)對該受體的作用。由于MC4受體信號起到進食抑制劑作用，AgRP的作用與NPY的一樣是一種進食刺激信號(即，對抑制作用的抑制)。在NPY/AGRP神經(jīng)元上發(fā)現(xiàn)了抑制性突觸前Y2受體，該受體是局部釋放的NPY以及腸激素PYY(另一種PP-折疊肽)的靶點。
PYY在進食期間從小腸末端和結(jié)腸部位的腸道-內(nèi)分泌細胞釋放(與食物中的卡路里含量成比例)，作用于胃腸道外周(神經(jīng))功能和中樞(神經(jīng))，是一種飽食信號。就外周(神經(jīng))而言，認為PYY的功能是上部胃腸道運動性、胃酸和胰腺外分泌的抑制劑(回腸中斷(illeal break))。就中樞(神經(jīng))而言，認為PYY主要作用于弓形核NPY/AgRP神經(jīng)元的突觸前抑制性Y2受體，認為其可通過血液接近該受體(Batterham等，2002 Nature 418650-4)。該肽以PYY1-36釋放，但是其一部分(約50％)以PYY3-36在血中循環(huán)，PYY3-36是二肽基肽酶-IV的降解產(chǎn)物，該酶切除此肽的N-末端二肽，前提是如所有三種PP-折疊肽-PP、PYY和NPY那樣，在二位發(fā)現(xiàn)Pro或Ala(Eberlein等，1989 Peptides 10797-803)。因此，血循環(huán)中的PYY是作用于Y1和Y2受體的PYY1-36和對Y1、Y4和Y5受體的親和力低于Y2受體的PYY3-36的混合物。
PP是一種胰島內(nèi)分泌細胞釋放的激素，幾乎完全受特別是食物攝入引起的迷走神經(jīng)膽堿能刺激的控制(Schwartz 1983 Gastroenterology 851411-25)。PP對胃腸道有各種作用，但是無一在分離的細胞和器官中未觀察到，并且似乎均依賴于完整的迷走神經(jīng)供應(yīng)(supply)(Schwartz 1983 Gastroenterology 851411-25)。鑒于此，稱為Y4受體的PP受體位于腦干中，在迷走神經(jīng)運動神經(jīng)元(vagal motorneurones)(其激活導致PP的外周作用)和單生核束(NTS)(其激活導致PP作為飽食激素的作用)中有強烈表達(Whitecomb等，1990 Am.J.Physiol.259G687-91，Larsen & Kristensen 1997 Brain Res.Mol.Brain Res 481-6)。應(yīng)理解，由于在血腦屏障的感覺性外周(神經(jīng))區(qū)域各種激素對該區(qū)域是“可滲入的”，血液中的PP可進入大腦的該區(qū)域。近年來，有爭論說PP對食物攝入的部分作用是通過對神經(jīng)元，特別是弓形核中的POMC/CRAT神經(jīng)元起作用而介導的(Batterham等，“Coimbra國際NPY研討會2004摘要3.3”(2004 Abstract 3.3 International NPY Symposiumin Coimbra)，葡萄牙)。PP通過Y4受體起作用，與PYY和NPY對Y4受體的親和力為納摩爾(nanomolar)級，PP對該受體的親和力為亞納摩爾(subnanomolar)級(Michel等，1998 Pharmacol.Rev.50143-150)。PP對Y5受體也具有相應(yīng)的親和力，但由于無法接近CNS中專門表達該受體的細胞和(該受體)對PP的親和力較低，PP的生理學重要性不可能與循環(huán)PP有相關(guān)。
PP-折疊肽受體熟知人體中有四種類型以相似親和力識別NPY1-36和PYY1-36的PP-折疊肽受體Y1、Y2、Y4和Y5。曾提出過對NPY的親和力超過PYY的Y3受體類型，但現(xiàn)在不接受其為真正的受體亞型(Michel等，1998 Pharmacol.Rev.50143-150)。Y6受體亞型已得到克隆，然而它在人體內(nèi)表達為缺乏TM-VII以及受體尾部的截短形式，因此看來至少其本身不能形成功能性受體分子。
Y1受體-親和力研究提示Y1能同樣良好地結(jié)合NPY和PYY，但基本上不結(jié)合PP。對Y1的親和力取決于PP-折疊分子(NPY/PYY)的兩末端序列(例如，殘基Try1和Pro2是必須的)和此肽兩末端能否以正確方式呈遞。在含幾個必需殘基側(cè)鏈的C-末端，Y1受體(像Y5和Y4受體而不是Y2受體那樣)可耐受34位(通常是Gln)的某些取代，例如Pro(Fuhlendorff等，1990J.Biol.Chem.26511706-12；Schwartz等，1990 Annals NY Acad.Sci.6135-47)。關(guān)于Y1和Y2受體必須的某些結(jié)構(gòu)-功能研究已見報道(Beck-Sickinger等，1994 Eur.J.Biochem.225947-58；Beck-Sickinger和Jung，1995 Biopolymers 37123-42；Sll等，2001 Eur.J.Biochem.2682828-37)。
Y2受體-親和力研究提示Y2受體能同樣良好地結(jié)合NPY和PYY，但基本上不結(jié)合PP。該受體特別需要PP-折疊肽(NPY/PYY)的C-末端。因此，長的C-末端片段(下至例如NPY13-36(整個α螺旋加上C-末端六肽))識別親和力較高，即該全長肽的親和力的10倍之內(nèi)(Sheikh等，1989 FEBS Lett.245209-14；Sheikh等，1989 J.Biol.Chem.2646648-54)。所以，各種不能結(jié)合Y1受體的N-末端缺失(片段)在一定程度上仍能結(jié)合Y2受體。然而，即使較長的C-末端片段的親和力與NPY/PYY相比降低了約10倍。NPY和PYY的34位Gln殘基對Y2受體的配體識別極其重要(Schwartz等，1990 Annas NY Acad.Sci.61135-47)。
Y4受體-親和力研究提示對應(yīng)于血漿中發(fā)現(xiàn)的濃度，Y4以亞納摩爾親和力結(jié)合PP，而以低得多的親和力結(jié)合NPY和PYY。這種研究提示Y4受體高度依賴于PP-折疊肽的C-末端，較短的N-末端缺失將損傷對配體的親和力。關(guān)于Y4受體的幾項結(jié)構(gòu)活性研究已見報道(Gehlert等，1996 Mol.Pharmacol.50112-18；Walker等，1997 Peptides 18609-12)。
Y5受體-親和力研究提示Y5能同樣良好地結(jié)合NPY和PYY，也以較低的親和力結(jié)合PP，然而親和力低于該激素的正常血循環(huán)水平。Y5受體也能良好地識別PYY3-36，然而該受體在CNS中也有很大程度的表達，當將PYY3-36施用于外周(神經(jīng))中時，不易接近CNS中的此受體。
根據(jù)這些肽中的某些在動物模型和人體中所顯示的作用和肥胖人的PYY和PP基礎(chǔ)水平低以及對這些肽的進食反應(yīng)較低，已提出PP-折疊肽及其類似物可用于治療肥胖和相關(guān)疾病，包括例如普-韋綜合征(Holst JJ等，1983 Int.J.Obes.7529-38；Batterham等，1990 Nature)。從17世紀中葉已知PP可以影響嚙齒類動物中的食物攝入。在1993年，有報道說給普-韋綜合征的病態(tài)肥胖患者輸注PP降低了食物攝入(Berntson等，1993 Peptide 14497-503)。近來，PP的該作用通過在正常人對象中輸注PP而得到證實，在24小時期間觀察到持久的食欲抑制和食物攝入降低(Batterham等，2003 Clin.Endocrinol.Metab.883989-92)。
然而，天然PP-折疊肽用作生物藥物不是最佳，例如，它們對各種肽酶，如DPP-IV的降解敏感。因此，天然肽的蛋白質(zhì)穩(wěn)定性未經(jīng)優(yōu)化，因為它們作為神經(jīng)肽或神經(jīng)激素的作用時間通常較短。
因此，為治療對Y受體調(diào)節(jié)起反應(yīng)的疾病，例如肥胖和腸分泌過多，需要采用PP-折疊肽或PP-折疊肽模擬物，這些肽或模擬物對選作靶點的Y4受體具有特異性并穩(wěn)定地保留了對受體結(jié)合重要的PP-折疊結(jié)構(gòu)元件。特別是更需要采用對Y4受體的選擇性超過Y1和Y2受體的這類藥物。由于對Y1受體的激動作用可能導致有害的心血管和腎臟副作用，例如血管收縮和尿鈉排泄。此外，激活Y2受體也可導致副作用。雖然還不清楚真正有效的血管生產(chǎn)Y受體情況是什么，Y2激動劑，例如NPY3-36明顯可在例如局部缺血后肢模型中誘導血管再生，即，當以高劑量持續(xù)接觸給藥時，例如從引入的藥丸中釋放(Zukowska Z等，Trends Cardiovasc Med.2003，1386-92)。Y2受體敲除動物中NPY的血管生成應(yīng)答降低；然而，事實上對該廣譜Y2受體激動劑NPY的應(yīng)答未消除，Y2和Y5受體在局部缺血血管中得到上調(diào)(Lee等，J.Clin.Invest.2003，1111853-62)。但是，PP-折疊肽或PP-折疊肽模擬物可通過激活Y2受體在例如糖尿病患者中造成副作用，例如加重視網(wǎng)膜病變，并且可能有助于某些腫瘤生長相關(guān)的新血管生成。因此，使用對Y4受體有效且選擇性超過Y1和Y2受體的激動劑在治療對Y4受體激活敏感的疾病和病癥中特別有用。
本說明書中所用的一些共同術(shù)語親和力肽與特異性受體的親和力以例如IC50值或Kj或Kd值給出，在具體的非限制性例子中，這些值可用試驗，例如競爭性結(jié)合試驗測定。IC50值對應(yīng)于取代所用的與給定受體相關(guān)的放射性配體50％的肽濃度，其用量遠低于該放射性配體的Kd。
食欲對食物的自然欲望或渴求。食欲增加通常導致進食行為的增加。
食欲抑制劑能降低對食物需求的化合物。
結(jié)合兩種分子之間的特異性相互作用，可使得該兩種分子相互作用。與受體的結(jié)合可以是特異性和選擇性的，所以與另一種分子相比，可優(yōu)先結(jié)合某種分子?？赏ㄟ^解離常數(shù)(Kd)鑒定特異性結(jié)合。其值取決于對測試化合物的選擇性。例如，通常認為Kd小于10nM的化合物是優(yōu)秀的候選藥物。然而，親和力較低但對具體受體具有選擇性的化合物也可以是良好的候選藥物。
體重指數(shù)(BMI)一種衡量體重的數(shù)學式，有時也稱為Quetelet指數(shù)。通過體重(以千克計)除以身高2(以米計)來計算BMI。目前，所接受的男性和女性的“正?！睒藴蕿锽MI約20kg/m2。在一個實施方案中，超過25kg/m2的BMI可用于鑒定肥胖對象。I級肥胖對應(yīng)的BMI是25kg/m2。II級肥胖對應(yīng)的BMI是30-40kg/m2；III級肥胖對應(yīng)的BMI是40kg/m2以上(Jequier 1987 Ain.J Clin.Nutr.451035-47)。按照身高、身體構(gòu)成、骨架結(jié)構(gòu)和性別，不同人種和個體的理想體重有所不同。
熱量攝入或卡路里攝入個體所消耗的卡路里(能量)數(shù)量。在本文中該術(shù)語等同于“能量攝入”。
美容治療該術(shù)語表示不是為醫(yī)學目的，而是為改善對象的幸福程度，例如與對象外貌有關(guān)的治療。該術(shù)語包括治療想要降低體重，但不一定是超重或肥胖的對象。
食物攝入個體消耗的食物量。食物攝入可通過體積或重量來衡測。包括I)食物攝入是個體消耗的食物總量，和ii)食物攝入指個體的蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物、膽固醇、維生素、礦物質(zhì)或其它食物成分的攝入量。因此，本文使用的術(shù)語食物攝入類似于術(shù)語“能量攝入”。
每日正常飲食給定人種的個體平均食物攝入。每日正常飲食可以卡路里攝入、蛋白質(zhì)攝入、碳水化合物攝入和/或脂肪攝入表達。人的每日正常飲食一般含有約2,000、約2,400或約2,800到明顯更多的卡路里。此外，人的每日正常飲食一般含有約12g-45g蛋白質(zhì)、約120g-610g碳水化合物和約11g-90g脂肪。低卡路里飲食的卡路里攝入不超過個人的正?？防飻z入的約85％、優(yōu)選不超過約70％。在動物中，卡路里和營養(yǎng)需求隨動物的種類和體積而不同。例如，在貓中，每kg的總卡路里攝入以及蛋白質(zhì)、碳水化合物和脂肪的分布百分比隨貓的年齡和生殖狀態(tài)而不同。
肥胖過多的身體脂肪使人們處于健康危險之中的狀況(參見Barlow和Dietz，Pediatrics 102E29，1998；國家衛(wèi)生研究院，國家心臟、肺和血液研究所(NHLBI)，Obes.Res.6(增刊2)59 S209S，1998)。過多的身體脂肪是能量攝入和能量消耗失衡的結(jié)果。在一個實施方案中，用體重指數(shù)(BMI)評估肥胖。在一個實施方案中，BMI為約22kg/m2(即，高于正常值約10％)-約30kg/m2，特別是約25.0kg/m2-30kg/m2認為是超重，BMI為30kg/m2或更高是肥胖。
超重體重超過其理想體重的個體。超重的個體可以是肥胖，但不一定是肥胖。在一個實施方案中，超重的個體是需要降低他們體重的任何個體。在另一實施方案中，認為超重個體是BMI約為22kg/m2(即，高于正常值約10％)-約30kg/m2，特別是從約25.0kg/m2-30kg/m2的個體。應(yīng)注意BMI略微高于正常值的個體(例如約22kg/m2-25kg/m2)經(jīng)常想減輕體重，雖然僅是為美容目的。
效力化合物的體外效力定義為EC50值，即在給定受體相關(guān)的信號轉(zhuǎn)導試驗中測定的導致最大可達到作用的50％的濃度。
對象對象可以是任何對象，包括人和獸醫(yī)哺乳動物對象。因此，所述對象可以是人或者可以是非人靈長類，農(nóng)業(yè)動物，例如豬、牛、綿羊和家禽，運動動物(sport animal)或?qū)櫸铮绻?、貓、馬、倉鼠和嚙齒類動物。
治療有效量足以預(yù)防、治療或緩解特定病癥或疾病和/或緩解特定病癥或疾病的特定體征或癥狀的劑量。該術(shù)語包括足夠的或能預(yù)防疾病發(fā)展，或?qū)е录膊∷ネ?，或能減輕疾病的體征或癥狀，或能實現(xiàn)所需結(jié)果的劑量。在涉及美容治療或超重或肥胖治療的實施方案中，受體激動劑的治療有效量是足以抑制或停止體重的增加，或足以降低食欲的量，或足以減少能量或食物攝入或增加能量消耗的量。術(shù)語“美容有效量”指足以治療對象以實現(xiàn)所需效果的劑量。
發(fā)明詳述在最廣義方面，本發(fā)明提供了除PP以外的Y4受體激動劑在制備治療了對Y4受體激活起反應(yīng)的疾病的組合物中的應(yīng)用，該激動劑對Y4受體的選擇性超過Y1和Y2受體，(a)所述激動劑是PP-折疊肽或PP-折疊肽模擬物，其具有(i)以-X-Thr-Arg-X3-Arg-Tyr-C(＝O)NR1R2表示的C-末端Y4受體識別氨基酸序列，其中R1和R1獨立為氫或C1-C6烷基，X是Val、Ile、Leu或Ala，X3是除Gln以外的殘基，或其保守性取代變體，其中Thr被His或Asn取代和/或Tyr被Trp或Phe取代；和/或Arg被Lys取代，和(ii)以H2N-X1-Pro-X2-(Glu或Asp)-表示的N-末端Y受體識別氨基酸序列，其中X1不存在或是任何氨基酸殘基，X2是Leu、Ile或Ser或它們的保守性取代變體，或(b)所述激動劑含有如以上(i)所定義的C-末端Y4受體識別序列，所述序列與毗鄰所述六肽序列的N-末端處具有至少一個α螺旋轉(zhuǎn)角的兩親性氨基酸序列結(jié)構(gòu)域融合，所述轉(zhuǎn)角因分子內(nèi)共價鍵而束縛于螺旋構(gòu)型中，和任選的始于以上(ii)所定義的Y4受體識別氨基酸序列的N-末端序列；或(c)所述激動劑含有兩條共價連接的C-末端Y4受體識別氨基酸序列，其中每條含有以上(i)所定義序列的最后4個殘基。
發(fā)明相關(guān)的特定術(shù)語本發(fā)明所考慮的激動劑是對Y4受體的選擇性超過Y1和Y2受體的激動劑。在本文中，當激動劑用本文所述親和力試驗測定時，對Y4的IC50值比對Y1和Y2受體的至少低10倍，則符合該條件?？傮w上，就效力而言，本發(fā)明的激動劑用本文所述效力試驗測定時，對Y4的EC50值比對Y1和Y2受體的至少低10倍。許多本發(fā)明優(yōu)選的激動劑對Y4受體的親和力和效力比對Y1和Y2受體的至少高100倍。一些本發(fā)明優(yōu)選的激動劑對Y4受體的親和力和效力比對Y1和Y2受體的至少高1000倍。
出于本說明書的目的，PP-折疊肽是具有3-D結(jié)構(gòu)的分子，當用X-射線晶體圖測定禽類PP的原始3-D結(jié)構(gòu)(Blundell等，1981 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 784175-79；Glover等，1984，Eur.J Biochem.142379-85)作圖時，該結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)域相當于(和基本上這樣排列的)所述NPY、PYY和/或PP的N-末端聚脯氨酸樣螺旋、I型β轉(zhuǎn)角區(qū)域、兩親性α-螺旋和C-末端六肽結(jié)構(gòu)域(圖1)。因此，本文所用的PP-折疊肽不同結(jié)構(gòu)域的描述可參見禽類PP的原始X-射線結(jié)構(gòu)(Blundell等，1981 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 784175-79；Glover等，1984，Eur.J.Biochem.142379-85；Schwartz等，1990)。
出于本說明書的目的，PP-折疊肽模擬物是具有3-D結(jié)構(gòu)的分子，當對禽類PP的原始3-D結(jié)構(gòu)作圖時，該結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)域相當于(和基本上這樣排列的)所述PP兩親性α-螺旋最后一個轉(zhuǎn)角和C-末端六肽結(jié)構(gòu)域。當如上述作圖時，PP-折疊肽模擬物的結(jié)構(gòu)域也相當于兩親性α螺旋的一個或多個其余的轉(zhuǎn)角(remaining turn)、N-末端聚脯氨酸樣螺旋和I型β轉(zhuǎn)角區(qū)域。肽模擬物無需完全由經(jīng)典肽鍵相連的α氨基酸序列構(gòu)成。這種序列中的一個或多個鍵可被肽模擬物鍵，例如反酰胺(reverseamide)和還原的肽鍵替代，因而可將該肽模擬物視為擬肽序列。這類鍵替代能賦予該分子抵抗內(nèi)肽酶的降解和改善其藥代動力學特性。
可根據(jù)原子坐標通過構(gòu)建比較分子模型，或利用一種或多種計算機程序來比較以上“PP-折疊肽”和“PP-折疊肽模擬物”定義的3-D結(jié)構(gòu)，所述原子坐標可通過例如X-射線衍射方法測定，所述計算機程序可購得以便從其分子結(jié)構(gòu)式目測其預(yù)期的3-D結(jié)構(gòu)，例如Schrdinger Inc(1500 S.W.，F(xiàn)irst Avenue，Suite 1180，Portland，OR 97201)的“Maestro Modelling Environment”；Accelrys Inc.(SanDiego)的“InsightII Modeling Environment”，Release 4.0；和Tripos Inc.(1699South Hanley Rd.，St.Louis，Missouri，63144，USA)的“SYBYL7.0”。應(yīng)注意本發(fā)明的PP-折疊肽或PP-折疊肽模擬物的3-D結(jié)構(gòu)與天然的NPY、POY或PP無需和一般不具有精確的對應(yīng)關(guān)系。PP-折疊肽或PP-折疊肽模擬物的表觀3-D結(jié)構(gòu)視用于研究該結(jié)構(gòu)的實驗條件而不同，特別是較小的肽在某些條件下可呈現(xiàn)或多或少的非折疊結(jié)構(gòu)。然而，以下條件是充分的PP-折疊肽或PP-折疊肽模擬物應(yīng)具有對應(yīng)于上述那些PP-折疊結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)域，具有使之采取類似于天然肽總體形狀的結(jié)構(gòu)元件，其中C-末端序列和N-末端序列(如果存在的話)是正常取向。
本發(fā)明考慮的激動劑具有C-末端Y4受體識別序列。該序列是位于該激動劑C-末端的通常約5-7個殘基長的序列，特別是六肽序列，當存在于PP-折疊肽或PP-折疊肽模擬物中時，它能結(jié)合Y4受體和單獨通過該結(jié)合作用而激活該受體，或者作為該結(jié)合作用和存在于激動劑中的N-末端Y4受體序列的Y4受體結(jié)合的結(jié)果(而激活該受體)。N-末端Y4受體識別序列是位于激動劑的N-末端，通常約3-5個殘基長的序列，特別是4個殘基的序列，當存在于PP-折疊肽或PP-折疊肽模擬物中時，該序列結(jié)合Y4受體并通過該結(jié)合作用聯(lián)合與存在于激動劑中的N-末端Y4受體序列的Y4受體結(jié)合而激活該受體。典型的C-末端和N-末端Y4受體識別序列在天然PP肽中發(fā)現(xiàn)，但是從本文將明白，這些典型的序列可經(jīng)修飾以保留Y4識別(能力)但降低Y1和Y2識別(能力)。如果在本文所述的親和力和/或效力試驗中所述PP-折疊肽或PP-折疊肽模擬物與Y4受體相互作用，存在于任何具體激動劑中的C-末端序列是Y4受體識別序列，當該識別序列被刪除，C-末端序列雖存在但不能(相互作用)(或程度不明顯)。
在本說明書中，諸如“對應(yīng)于NPY的Ser3的殘基”術(shù)語指該激動劑的3-D結(jié)構(gòu)對NPY的3-D結(jié)構(gòu)作圖時，圖中最接近NPY的Ser3的氨基酸殘基。類似地，諸如“在對應(yīng)于PP的Pro34位”的術(shù)語指該激動劑的3-D結(jié)構(gòu)對PP的3-D結(jié)構(gòu)作圖時，該激動劑在圖中最接近PP的Pro34的氨基酸殘基位置。由于其天然肽中可能發(fā)生例如缺失，特定肽中具體殘基的實際編號可能與此不同。
總體上，本發(fā)明考慮的PP-折疊或PP-折疊模擬物激動劑通常具有肽骨架或部分是肽的骨架，至少具有C-末端氨基酸序列和經(jīng)常具有N-末端氨基酸序列，雖然骨架的其余部分可以是非肽接頭基團，例如直鏈或支鏈亞烷基鏈。存在于該激動劑的肽(peptidic)部分，特別是與Y4受體相互作用的C-和N-末端序列中的氨基酸通常是天然產(chǎn)生的，但也可存在保留了PP-折疊但不阻止Y4受體結(jié)合的非天然α氨基酸。
當本發(fā)明考慮的激動劑具有C-或N-末端氨基酸序列時，可以酰胺化C-末端和/或可以?；疦-末端以賦予對羧肽酶和/或氨肽酶的抗性。事實上，天然NPY、PYY和PP肽的C-末端是酰胺化的，所以本發(fā)明激動劑的C-末端氨基酸也可酰胺化。
在本說明書中，提及氨基酸時可用其通用名或縮寫，例如纈氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)、異亮氨酸(Ile)、甲硫氨酸(Met)、苯丙氨酸(Phe)、天冬酰胺(Asn)、谷氨酸(Glu)、谷氨酰胺(Gln)、組氨酸(His)、賴氨酸(Lys)、精氨酸(Arg)、天冬氨酸(Asp)、甘氨酸(Gly)、丙氨酸(Ala)、絲氨酸(Ser)、蘇氨酸(Thr)、酪氨酸(Tyr)、色氨酸(Trp)、半胱氨酸(Cys)和脯氨酸(Pro)。當用通用名或縮寫提到氨基酸而未明確說明其立體異構(gòu)形式時，應(yīng)理解所述氨基酸是L-形。在提到D-形時會特別指明D-形氨基酸。有時，在本文想要這樣做時，特指L-形而非推斷。
本文所用的術(shù)語“保守取代”表示一個或多個氨基酸被另一個生物學類似的殘基取代。例子包括用性質(zhì)相似的氨基酸殘基，例如小氨基酸、酸性氨基酸、極性氨基酸、堿性氨基酸、疏水性氨基酸和芳香族氨基酸取代。適用于本發(fā)明的保守氨基酸取代的非限制性例子包括用下表中性質(zhì)相似的非天然α氨基酸的原來殘基進行類似取代。例如，在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，Met殘基可用正亮氨酸(Nle)取代，正亮氨酸是Met的生物等構(gòu)物但(與Met相反)不易氧化。用通常在哺乳動物內(nèi)源性肽和蛋白質(zhì)中未發(fā)現(xiàn)的殘基進行保守性取代的另一例子是用例如鳥氨酸、刀豆氨酸、氨基乙基半胱氨酸或其它堿性氨基酸保守性取代Arg或Lys。關(guān)于肽和蛋白質(zhì)中表型沉默取代的其它信息可參見，例如Bowie等，Science 247，1306-1310，1990。
除非本文另有指明，應(yīng)用于本文任何部分的術(shù)語“取代的”指用多達4個相容性取代基取代，其中每個獨立為，例如(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基、羥基、羥基(C1-C6)烷基、巰基、巰基(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷硫基、鹵素(包括氟、溴和氯)、三氟甲基、三氟甲氧基、硝基、腈基(-CN)、氧代、苯基、-COOH、-COORA、-CORA、-SO2RA、-CONH2、-SO2NH2、-CONHRA、-SO2NHRA、-CONRARB、-SO2NRARB、-NH2、-NHRA、-NRARB、-OCONH2、-OCONHRA、-OCONRARB、-NHCORA、-NHCOORA、-NRBCOORA、-NHSO2ORA、-NRBSO2OH、-NRBSO2ORA、-NHCONH2、-NRACONH2、-NHCONHRB、-NRACONHRB、-NHCONRARB或-NRACONRARB，其中RA和RB獨立為(C1-C6)烷基?！叭芜x的取代基”可以是任一上述取代基團。
除非本文另有規(guī)定，本文提及的NPY、PYY和PP肽和它們的序列涉及那些肽的人形式和它們的序列。然而，如本文所用的那些術(shù)語一樣，其它哺乳動物的NPY、PYY和PP?？蓸?gòu)成人NPY、PYY和PP的PP-折疊肽模擬物，或保守取代的人NPY、PYY或PP。
本發(fā)明考慮的激動劑在它們的C-末端Y4受體識別序列中對應(yīng)于PP的Pro34位具有除Gln以外的殘基，優(yōu)選除Asn以外的殘基。避免這些殘基確保對Y2受體的親和力降低。
此外，當N-末端Y受體識別氨基酸序列存在于本發(fā)明考慮的激動劑中時，其用H2N-X1-Pro-X2-(Glu或Asp)-表示，其中X1不存在或是任何氨基酸殘基，X2是Leu、Ile或Ser或它們的保守性取代物。這些要求有助于確保N-末端Y4識別序列的親和力以及獲得針對Y1和Y2受體的選擇性。
本發(fā)明所用的(a)型激動劑總體上，(a)型激動劑是PP、NPY或PYY的PP-折疊類似物，或PP、NPY或PYY的PP-折疊模擬物，其含有修飾以保留或賦予Y4受體效力，但大大降低了它們對Y1和Y2受體的效力。這種PP-折疊類似物和模擬物包括具有PP-折疊性質(zhì)的完全互補序列的肽(N-末端聚脯氨酸樣螺旋、β轉(zhuǎn)角、兩親性α螺旋和C-末端六肽)、部分骨架(例如β轉(zhuǎn)角殘基和毗鄰的殘基)用非肽間隔鏈替代的肽類似物，和擁有C-末端六肽和兩親α螺旋最后一個轉(zhuǎn)角但缺乏所有或部分聚脯氨酸樣螺旋和/或β轉(zhuǎn)角的截短的肽?？傮w上，(a)型激動劑是。這種PP-折疊類似物和模擬物包括具有PP-折疊性質(zhì)的全部補體的肽(N-末端聚脯氨酸樣螺旋、β轉(zhuǎn)角、兩親性α螺旋和C-末端六肽)、部分骨架(例如β轉(zhuǎn)角殘基和毗鄰的殘基)被非肽間隔鏈替代的肽類似物和擁有C-末端六肽和兩親α螺旋的最后一個轉(zhuǎn)角但缺乏所有或部分聚脯氨酸樣螺旋和/或β轉(zhuǎn)角的截短的肽。
本發(fā)明所用的(b)型激動劑總體上，(b)型激動劑可認為是(a)型PP-折疊肽類似物或PP-折疊模擬物，它們最小的PP-折疊特征結(jié)構(gòu)(C-末端六肽和α螺旋的最后一個轉(zhuǎn)角)通過特定的分子內(nèi)共價鍵連接而穩(wěn)定。
該型激動劑的特征在于分子內(nèi)連接鍵，這些鍵或在天然NPY、PYY或PP肽中無等價物，或?qū)?yīng)于或用共價鍵替代非共價相互作用，例如在禽類PP的X-射線結(jié)構(gòu)中觀察到[Cys2，DCys27]PYY(SEQ ID No4)中Cys2和D-Cys27之間的共價二硫鍵，模擬了Pro2和Tyr27的側(cè)鏈之間的非共價疏水相互作用。如上所述，這種鍵可用于穩(wěn)定PP-折疊結(jié)構(gòu)的基本元件，特別是可活動的C-末端Y4識別序列和α螺旋的最后一個轉(zhuǎn)角，和/或提供N-末端。在全長或接近全長的肽中，這種鍵可穩(wěn)定此類天然PP-折疊結(jié)構(gòu)。這有利于兩方面，首先，可穩(wěn)定兩親性α螺旋的C-末端部分從而可以最佳方式提供C-末端Y4識別氨基酸序列進而提高對Y4受體的效力；第二，通過穩(wěn)定整個PP-折疊結(jié)構(gòu)使這類肽不易受蛋白酶解降解，因為這種酶往往需要它們的靶序列為非折疊形式(Schwartz等，1990)。分子內(nèi)連接鍵也能使Y4-選擇性激動劑相對于天然肽的結(jié)構(gòu)有更多修飾，例如激動劑可缺乏天然肽中發(fā)現(xiàn)的一個或多個結(jié)構(gòu)域或部分結(jié)構(gòu)域。
一組類型(b)的激動劑具有PP-折疊結(jié)構(gòu)，此結(jié)構(gòu)中束縛螺旋轉(zhuǎn)角的分子內(nèi)連接鍵從兩親性結(jié)構(gòu)域的一個氨基酸殘基延伸至該激動劑的N-末端部分的連接點，該N-末端部分對應(yīng)于反平行延伸至兩親性結(jié)構(gòu)域的PP-折疊肽的聚脯氨酸結(jié)構(gòu)域。在上述情況中的束縛螺旋轉(zhuǎn)角的分子內(nèi)連接鍵，例如二硫鍵或內(nèi)酰胺鍵可從兩親性結(jié)構(gòu)域的一個氨基酸殘基延伸至4個N-末端殘基之一。
該類激動劑的特別優(yōu)選的亞組由PP-折疊肽構(gòu)成，所述肽含有從兩親性結(jié)構(gòu)域的一個氨基酸殘基延伸至聚脯氨酸結(jié)構(gòu)域的N-末端部分連接點的束縛螺旋轉(zhuǎn)角的分子內(nèi)連接鍵。這種鍵可在5位和20位或8位和16位，特別是2位和27位的殘基之間，例如27位的D-Cys和2位的Cys之間的二硫鍵。D-形Cys優(yōu)選位于27位，因為這將巰基側(cè)鏈最佳地定向為與2位引入的“正?！盠-形Cys形成二硫鍵從而使整個分子采取并模擬PP-折疊結(jié)構(gòu)。在另一組(b)型激動劑中，束縛螺旋轉(zhuǎn)角的分子內(nèi)連接鍵在α螺旋結(jié)構(gòu)域的最后一個螺旋轉(zhuǎn)角中的殘基之間伸，例如在螺旋轉(zhuǎn)角的Lys和Glu殘基之間，或在C-末端Y4識別氨基酸序列中的殘基和α螺旋結(jié)構(gòu)域的最后一個螺旋轉(zhuǎn)角中的殘基之間形成的內(nèi)酰胺鍵，例如[Iys28，Glu32]PYY25-36(SEQ ID No5)或[Glu28，Lys32]PYY25-36(SEQ ID No6)中的Lys和Glu之間的內(nèi)酰胺鍵。
本發(fā)明所用的(c)型激動劑本發(fā)明考慮的(c)型激動劑可以認為是存在于(a)和(b)型激動劑中的C-末端Y4受體識別序列的至少最后4個殘基的二聚體，例如末端六肽序列或最后5或4個殘基的二聚體。因此，雖然C-末端Y4受體識別氨基酸序列自身(例如六肽形式)對Y4受體的親和力相當?shù)?，?a)和(b)型激動劑中具有其它結(jié)構(gòu)元件以變?yōu)楦哂H和力和效力的配體，可能通過將兩條這樣的C-末端Y4受體識別氨基酸序列連接成二聚體來獲得有用的高親和力與效力。可以想像，這種構(gòu)建物出乎意料的高親和力的原因在于因為發(fā)現(xiàn)許多(如果不是全部)其它A型家族的7TM受體并且因為二聚體的功能是在細胞膜上起作用(Bouvier，2001，Nat Rev Neurosci.2274-86)。因此，雖然單獨的C-末端Y4受體識別氨基酸序列對Y4受體的親和力同樣相當?shù)?，這種序列的二聚體形式的促進劑結(jié)合可導致其它C-末端Y4受體識別氨基酸序列的“非常高的局部濃度”，從而導致二聚體配體對二聚體受體的高親和力。在參考文獻中，NPY C-末端部分的類似物的二聚構(gòu)建物已制備為Y1受體拮抗劑(Daniels等，1995Proc Natl Acad Sci USA.929067-71)。出乎意料的是，隨后這種構(gòu)建物顯示為Y4受體激動劑(Parker等，1998 Eur J Pharmacol.34997-105)。
(c)型激動劑的兩條序列可以通過例如位于兩條序列中每一條的C末端至少4個殘基處的至少一對殘基之間的交聯(lián)鍵而連接。例如，兩條共價相連的序列可含有以上定義的C-末端序列的最后5個或最后6個殘基。在一個實施方案中，交聯(lián)是通過兩條序列中每一條的C末端的至少4個(例如，5或6)殘基處的兩對殘基之間的一對交聯(lián)鍵而實現(xiàn)。交聯(lián)方法包括半胱氨酸之間的二硫鍵，或通過一條序列中2.3-丙酸殘基的3-氨基與另一序列中殘基側(cè)鏈的羧基之間的酰胺鍵，或通過雙氨基酸HOOCCH(NH2)(CH2)1-6CH(NH2)COOH形成的-(CH2)1-6-鍵，其末端在每條序列中形成殘基。
通過一根二硫鍵交聯(lián)的(c)型激動劑的例子是S-Cys-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-CONH2|S-Cys-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-CONH2(SEQ ID.No7)然而，二聚體的兩個C-末端Y4受體識別氨基酸序列不一定要相同。因此，通過一根二硫鍵交聯(lián)的(c)型激動劑的另一例子是S-Cys-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-CONH2|S-Cys-Thr-Arg-His-Arg-Tyr-CONH2(SEQ ID.No8)(c)型Y4激動劑雜二聚體的另一例子是S-Cys-[N-(N’-十六烷?；?-γ谷氨?；鵠-Lys-Thr-Arg-Leu-Arg-Tyr-CONH2|S-Cys-Leu-Thr-Arg-Leu-Arg-Tyr-CONH2(SEQ ID.No29)。
在該肽中，Lys殘基作為血清白蛋白結(jié)合基序的連接側(cè)(在該情況中)引入肽單元之一的“31”位。
C-末端Y4受體識別序列((a)、(b)和(c)型激動劑)就Y4選擇而言，本發(fā)明考慮的所有3種類型激動劑具有C-末端Y4受體識別氨基酸序列，該識別序列可由本文所述的親和力和效力試驗證實。一組優(yōu)選的以本發(fā)明的(a)、(b)或(c)型激動劑存在的C-末端Y4受體識別氨基酸序列以-X-Thr-Arg-X3-Arg-Tyr-C(＝O)NR1R2表示，其中X和X3如上定義，R1和R2各自是氫。也優(yōu)選殘基X3不是Asn，Lys、Arg、Asp或Glu優(yōu)選不是X3殘基。當前優(yōu)選X3是Pro，但X3也可以是His，或選自4-羥脯氨酸、氮雜環(huán)丁烷-2-羧酸、氮雜環(huán)丁烷-3-羧酸、氮雜脯氨酸(azaproline)和1-氨基環(huán)丁烷羧酸的非天然脯氨酸類似物。在激動劑的C-末端Y4受體識別氨基酸序列中，殘基X優(yōu)選Leu。
在本發(fā)明考慮的激動劑中，以上定義的6個殘基的C-末端Y4識別序列可以是以-XA-X-Thr-Arg-X3-Arg-Tyr-C(＝O)NR1R2表示的C-末端七肽的最終殘基，其中殘基XA是非堿性和非酸性，序列-X-Thr-Arg-X3-Arg-Tyr-C(＝O)NR1R2如上定義。在這種情況中，所述非堿性和非酸性氨基酸殘基XA可以是，例如Leu或Met。
此外，前段所述的C-末端七肽序列本身可以是以-XC-Tyr-XB-Asn-XA-X-Thr-Arg-X3-Arg-Tyr-C(＝O)NR1R2表示的C-末端十一肽的最終殘基，其中序列-XA-X-Thr-Arg-X3-Arg-Tyr-C(＝O)NR1R2如上段所述，其中XC是Arg或Lys，XB是Ile、Leu或Val。這種十一肽序列的例子包括-Arg-Tyr-Ile-Asn-(Leu或Met)-Leu-Thr-Arg-(Pro或His)-Arg-Tyr-C(＝O)NH2。
存在于本發(fā)明所考慮的激動劑中的C-末端十一肽的另一例子以-XC-Tyr-XB-Asn-XA-X-Thr-Arg-X3-Arg-Tyr-C(＝O)NR1R2表示，其中序列-XA-X-Thr-Arg-X3-Arg-Tyr-C(＝O)NR1R2如以上倒數(shù)第二段所述，XC是His、Asn或Gln，XB是Ile、Leu或Val。這種序列的例子是-His-Tyr-(Ile或Leu)-Asn-Leu-(Val/Ile)-Thr-Arg-(Pro或His)-Arg-Tyr-C(＝O)NH2。
在一組本發(fā)明考慮的(a)或(b)型PP-折疊模擬激動劑中，含有Y4受體識別氨基酸序列的C-末端序列可以在其N-末端與兩親性氨基酸序列結(jié)構(gòu)域融合，該結(jié)構(gòu)域含有毗鄰所述表位N-末端的至少一個α螺旋轉(zhuǎn)角和至少兩個氨基酸的N-末端序列，所述C-和N-末端氨基酸序列通過肽鍵與接頭基團相連，該基團可以是任選含有一個或多個雙鍵或三鍵的直鏈或支鏈亞烷基。例如，接頭基團可以分別與式NH2(CH2)nCO2H所示氨基酸的羧基和氨基形成肽鍵，其中n是2-12，特別是6、7、8、9或10。因此，激動劑可以是具有上述Cys-Cys鍵的NPY、PPY或PP的類似物，但對應(yīng)于天然肽的5-24的氨基酸殘基被具有6-10個碳原子，選自6-氨基己酸(ε-氨基己酸)、7-氨基庚酸、8-氨基辛酸、9-氨基壬酸和氨基癸酸的氨基羧酸替代。在特定的實施方案中，優(yōu)選8-氨基辛酸(本文有時縮寫為“Aoc”)。這種激動劑的例子是[Cys2，Aoc5-24，Dcys27]-PP(SEQ ID.No9)。
N-末端Y4受體識別序列((a)和(b)型激動劑)在本發(fā)明的(a)和(b)型激動劑的N-末端Y4受體識別氨基酸序列中，殘基X1優(yōu)選是Ala或不存在。此外，在激動劑的N-末端Y4受體識別氨基酸序列中，當前殘基X2優(yōu)選是Leu、Ile或Ser。
這種N-末端序列的特定例子是H2N-Ala-Pro-Leu-Glu-和H2N-Pro-Leu-Glu-。
本發(fā)明關(guān)注的(a)和(b)型Y4激動劑了在它們的N-末端?；再x予抗氨肽酶活性。例如可用具有2-24個碳原子的碳鏈進行?；?，具體的例子是N-末端?；?。
本發(fā)明所用的特定激動劑以下是本發(fā)明所用的激動劑的特定例子[Cys2，DCys27]-PP(SEQ ID.No4)[Lys28，Glu32]PP25-36(SEQ ID.No5)[Glu28，Lys32]PP25-36(SEQ ID.No6)[Cys2，Aoc5-24，Dcys27]-PP(SEQ ID.No9)PP2-36(SEQ ID.No10)[His34]-PP(SEQ ID.No11)[Alal，Pro34]-PYY(SEQ ID.No12)[Ala2，Pro34]-PYY(SEQ ID.No13)[Glu4，Pro34]-PYY(SEQ ID.No14)[Arg26，Pro34]-PYY(SEQ ID.No15)[Ile28，Pro34]-PYY(SEQ ID.No16)[Met30，Pro34]-PYY(SEQ ID.No17)[Ala1，Glu4，Pro34]-PYY(SEQ ID No25)[Nle17]PP(SEQ ID.No32)[Nle30]PP(SEQ ID. No33)[Nle17，Nle30]PP(SEQ ID.No34)[Nle17]PP2-36(SEQ ID.No37)[Nle30]PP2-36(SEQ ID.No38)[Nle17，His34]-PP(SEQ ID.No41)[Nle30，His34]-PP(SEQ ID.No42)[Nle17，Nle30，His34]-PP(SEQ ID.No43)[Ala30，Pro34]-PYY(SEQ ID.No46)[Leu34]-PP(SEQ ID.No51)[Ile34]-PP(SEQ ID.No52)[Phe34]-PP(SEQ ID.No53)[Lys13]PP2-36(SEQ ID No54)S-Cys-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-CONH2
|S-Cys-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-CONH2(SEQ ID.No7)S-Cys-Leu-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-CONH2|S-Cys-Leu-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-CONH2(SEQ ID.No18)S-Cys-Leu-Thr-Arg-His-Arg-Tyr-CONH2|S-Cys-Leu-Thr-Arg-His-Arg-Tyr-CONH2(SEQ ID.No19)S-Cys-Leu-Thr-Arg-Leu-Arg-Tyr-CONH2|S-Cys-Leu-Thr-Arg-Leu-Arg-Tyr-CONH2(SEQ ID.No49)S-Cys-Leu-Thr-Arg-Ile-Arg-Tyr-CONH2|S-Cys-Leu-Thr-Arg-Ile-Arg-Tyr-CONH2(SEQ ID.No50)N-乙?；?PP(SEQ ID.No30)N-(N’-十六烷酰基)-γ谷氨?；?PP(SEQ ID No31)[N-(N’-十六烷酰基)-γ谷氨?；?Lys13，Nle30]PP(SEQ ID No35)[N-(N’-十四烷?；?-γ谷氨?；?Lys13]PP2-36(SEQ ID No39)[N-(N’-十四烷?；?-γ谷氨?；?Lys13，His34]-PP(SEQ ID No44)[N-(N’-十四烷?；?-γ谷氨酰基-Lys13，Ala30，Pro34]-PYY(SEQ ID No47)[Cys2，N-(N’-十四烷?；?-γ谷氨?；?Lys13，DCys27]-PP(SEQ ID No48)[N-(8-(8-γ谷氨?；被?辛?；被?-辛?；?-[Lys13]PP2-36(SEQ ID No55)S-Cys-[N-(N’-十六烷酰基)-γ谷氨?；鵠-Lys-Thr-Arg-Leu-Arg-Tyr-CONH2|S-Cys-Leu-Thr-Arg-Leu-Arg-Tyr-CONH2(SEQ ID.No29)[N-{(Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Ala-Arg-Ala)3}-Lys13]PP(SEQ ID No36)[N-{(Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Ala-Arg-Ala)3}-Lys13]PP2-36(SEQ ID No40)[N-{(Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Ala-Arg-Ala)3}-Lys13，His34]PP(SEQ ID No45)和它們保守性取代的類似物。
本發(fā)明所用的特別優(yōu)選的Y4選擇性激動劑是PP2-36、[His34]-PP(SEQ ID.No10)或[Cys2，DCys27]-PP(SEQ ID.No4)和它們保守性取代的類似物。
本發(fā)明所用的合適激動劑到目前為止，本發(fā)明所用的基礎(chǔ)Y4-選擇性激動劑已得到總體描述并提供了這種激動劑的具體例子。然而，為改善它們的藥代動力學、藥效學和代謝性能，可對這種激動劑，包括特別鑒定的激動劑作出各種修飾。這種修飾可涉及將該激動劑與本身為肽或蛋白質(zhì)藥物領(lǐng)域已知的功能基團(也稱為基序)相連。無論(a)、(b)或(c)型，在本發(fā)明考慮的激動劑的情況中，有具體益處的三種特定修飾是與血清白蛋白結(jié)合基序或糖胺聚糖(GAG)相連，或PEG化。
雖然PP排除在本發(fā)明的用途之外，也可采用具有這種修飾的PP。
血清白蛋白結(jié)合基序血清白蛋白結(jié)合基序一般是親脂性基團，將其引入能延長給藥后(藥物)在體內(nèi)的駐留時間，或出于其它原因可用各種已知的方法將其與肽或蛋白質(zhì)分子偶聯(lián)，例如i)通過共價鍵，例如側(cè)鏈氨基酸殘上的功能基團，ii)通過插入該肽中的或適當衍生肽中的功能基團，iii)作為該肽的一種整合部分。例如，WO 96/29344(NovoNordisk A/S)、P.Kurtzhals等，1995 Biochemical J.312725-31和L.B.Knudsen等，2000 J.Med.Chem.431664-69描述了許多可用于本發(fā)明所考慮激動劑的合適親脂性修飾。
合適的親脂性基團包括任選取代的、飽和或不飽和的、直鏈或支鏈的10-24個碳原子的烴基團。這種基團可形成該激動劑骨架的側(cè)鏈或其一部分，例如通過醚、硫醚、氨基、酯或酰胺鍵與骨架中氨基酸殘基的側(cè)鏈相連，或與PP-折疊模擬激動劑骨架中的非肽接頭基團的骨架碳或骨架碳的支鏈相連。連接親脂性基團的化學方法不是關(guān)鍵性的，但包含親脂性基團的以下側(cè)鏈是可與該激動劑的骨架碳相連的例子，或是其合適的支鏈CH3(CH2)nCH(COOH)NH-CO(CH2)2CONH-，其中n是9-15的一個整數(shù)，CH3(CH2)rCO-NHCH(COOH)(CH2)2CONH-，其中r是9-15的一個整數(shù)，CH3(CH2)sCO-NHCH((CH2)2COOH)CONH-，其中s是9-15的一個整數(shù)，CH3(CH2)mCONH-，其中m是8-18的一個整數(shù)，-NHCOCH((CH2)2COOH)NH-CO(CH2)pCH3，其中p是10-16之間的一個整數(shù)，-NHCO(CH2)2CH(COOH)NH-CO(CH2)qCH3，其中q是10-16的一個整數(shù)，CH3(CH2)nCH(COOH)NHCO-，其中n是9-15的一個整數(shù)，CH3(CH2)pNHCO-，其中p是10-18的一個整數(shù)，-CONHCH(COOH)(CH2)4NH-CO(CH2)mCH3，其中m是8-18的一個整數(shù)，-CONHCH(COOH)(CH2)4NH-COCH((CH2)2COOH)NH-CO(CH2)pCH3，其中p是10-16的一個整數(shù)，-CONHCH(COOH)(CH2)4NH-CO(CH2)2CH(COOH)NH-CO(CH2)qCH3，其中q是10-16的一個整數(shù)，和部分或完全氫化的環(huán)戊菲(cyclopentanophenanthrene)骨架。
在一個化學合成方案中，含有親脂性基團的側(cè)鏈是?；嬖谟诩觿┕羌軞埢膫?cè)鏈中的氨基的C12、C14、C16或C18酰基，例如十四烷酰基。
如上所述，對用于提供血清結(jié)合特性提高的激動劑進行修飾是一種通用方案，特別適用于以上列出的特定激動劑。因此，經(jīng)合適修飾的激動劑包括[十四烷?；?Ala1]-PP(SEQ ID No20)或[十四烷?；?Ala1，His34]-PP(SEQ ID No21)或它們保守性取代的類似物。
GAG結(jié)合在上述親脂性血清結(jié)合基序例子中，可通過加入作為該激動劑骨架側(cè)鏈(或其一部分)的GAG結(jié)合基序來修飾本發(fā)明考慮的激動劑。已知可以該方式加入的GAG-結(jié)合基序包括氨基酸序列XBBXBX和/或XBBBXXBX，其中B是堿性氨基酸殘基，X是任何氨基酸殘基?？蓪⒍鄺l，例如3條這種序列以多聯(lián)體(直鏈)或枝狀體(支鏈)的方式加入。具體的多聯(lián)體GAG基序包括Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Ala-Arg-Ala-Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Ala-Arg-Ala，和Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Ala-Arg-Ala-Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Ala-Arg-Ala-Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Ala-Arg-Ala，二者可以通過，例如多聯(lián)體GAG-結(jié)合基序的C-末端與激動劑骨架氨基酸側(cè)鏈的氨基之間形成酰胺鍵相偶連，所述氨基例如有[Lys18，His34]PP(SEQ ID No22)或[Lys18]PP(SEQ ID No23)的ε氨基。
GAG基序可直接或經(jīng)接頭基團與激動劑的C-或N-末端(優(yōu)選)共價連接，而不是與激動劑相連或作為骨架殘基側(cè)鏈的一部分。GAG結(jié)合基序也可含有氨基酸序列XBBXBX和/或XBBBXXBX，其中B是堿性氨基酸殘基，X是任何氨基酸殘基，例如序列[XBBBXXBX]n，其中n是1-5，B是堿性氨基酸殘基，X是任何氨基酸殘基。當這些多聯(lián)體重復(fù)序列結(jié)合GAG時，它們傾向于形成α螺旋，因此當它們與C-末端六肽/最后的α螺旋轉(zhuǎn)角融合時，可穩(wěn)定該轉(zhuǎn)角從而以最佳方式提供Y2受體識別的組合結(jié)構(gòu)。該型激動劑的具體例子是[XBBBXXBX-XBBBXXBX]PP或[XBBBXXBX-XBBBXXBX-XBBBXXBX]PP，其中B是堿性氨基酸殘基，X是任何氨基酸殘基，具體是Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Ala-Arg-Ala-Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Ala-Arg-Ala-Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Ala-Arg-Ala-PP(SEQID No24)。
本發(fā)明考慮的Y4選擇性激動劑可用于需要延長接觸時間的適應(yīng)癥。就該具體適應(yīng)癥而言，激動劑優(yōu)選包含上述糖胺聚糖(GAG)結(jié)合基序。這種基序能確保該激動劑在胞外基質(zhì)中與GAG結(jié)合，從而確保Y2受體在該組織中的局部接觸時間延長。生長因子，趨化因子等可通過能與GAG的酸性糖相互作用的堿性氨基酸斑(patch)與GAG結(jié)合。生長因子上這些帶正電荷表位通常由堿性殘基的側(cè)鏈構(gòu)成，這些殘基不一定連續(xù)地位于序列中但往往通過二級結(jié)構(gòu)元件，例如a-螺旋或轉(zhuǎn)角或通過該蛋白質(zhì)的整個三維結(jié)構(gòu)存在于鄰近區(qū)域。某些上述GAG-結(jié)合性線形序列已有描述，例如XBBXBX和XBBBXXBX，其中B代表堿性殘基(Hileman等，Bioassays 1998，20156-67)。圓二色性顯示這些區(qū)段與GAG結(jié)合后形成α-螺旋。當存在例如三條這樣的序列(例如每條是ARRRAARA序列)時，如果使這種序列位于例如多聯(lián)體或枝狀體構(gòu)建物中，得到的24-單體肽，例如ARRRAARA-ARRRAARA-ARRRAARA可確保其在胞外基質(zhì)中的保留(時間)類似于高分子量聚賴氨酸，即在4小時輸注期間不會被洗掉(Sakharov等，F(xiàn)EBSLett 2003，276-10)。
因此天然構(gòu)建的生長因子和趨化因子有兩類結(jié)合基序一類受體的結(jié)合基序，通過它實現(xiàn)信號轉(zhuǎn)導，而一類GAG的結(jié)合基序，通過它實現(xiàn)結(jié)合與持久的局部活性。諸如PYY和NPY等肽是神經(jīng)肽和神經(jīng)激素，它們可從組織中相當快速地洗掉，這對持久的局部作用而言不是最佳的。使GAG-結(jié)合基序與本發(fā)明的Y4選擇性激動劑或已知的典型肽激動劑PYY3-36結(jié)合，構(gòu)建了一種具有PP-折疊肽部分的受體結(jié)合表位和GAG-結(jié)合基序的類似于生長因子和趨化因子的雙功能分子。
如上所述，在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，GAG-結(jié)合基序，例如安置上述的多聯(lián)體24-聚序列作為Y4-選擇性激動劑的N-末端延伸段。這種安置(方式)對N-末端截短的PP-折疊模擬激動劑特別有意義。雖然本文所述的激動劑是Y4選擇性的，但它們與天然PP相比，在一定程度上對Y4受體的親和力或效力降低。由于和GAG結(jié)合可形成能有助于穩(wěn)定螺旋部分從而有助于以正確方式提供遠端C-末端區(qū)段的α-螺旋，采用這種截短的PP-折疊模擬激動劑和多聯(lián)體GAG-結(jié)合基序有利于延長(接觸時間)。
就NPY肽及其類似物而言，引入PP-折疊肽的GAG結(jié)合基序(例如堿性多聯(lián)體或枝狀體構(gòu)建物)的另一合適位置是14位，就PYY和PP肽及它們的類似物而言是13位。然而，如上所述，可將含有GAG-結(jié)合基序的殘基引入激動劑中的任何位置，前提是這種引入與保留本發(fā)明考慮的(a)、(b)和(c)型激動劑中所需的PP-折疊結(jié)構(gòu)和C-末端Y2-識別序列所需的(結(jié)構(gòu))相一致。因此，可將GAG-結(jié)合基序作為類似物中的間隔構(gòu)建物部分安置，所述類似物的PP-折疊部分可用非肽間隔物替代。
PEG化在PEG化過程中，將一個或多個聚環(huán)氧烷基團共價偶聯(lián)于肽或蛋白質(zhì)藥物以提高給藥后在體內(nèi)的有效半衰期。該術(shù)語得自該方法所用的優(yōu)選聚環(huán)氧烷，即得自乙二醇-聚乙二醇或“PEG”。
合適的PEG基團可通過任何方便的化學方法與激動劑相連，例如通過激動劑的骨架氨基酸殘基。例如，就PEG樣的分子而言，常用的連接基團是賴氨酸的ε-氨基或N-末端氨基。其它連接基團包括游離羧基(例如，C-末端氨基酸殘基或天冬氨酸或谷氨酸殘基的羧基)、適當活化的羰基、巰基(例如，半胱氨酸的巰基)、芳香族氨基酸殘基(例如，Phe、Tyr、Trp)、羥基(例如，Ser、Thr或OH-Lys的羥基)、胍基(例如，Arg)、咪唑基(例如，His)和氧化的碳水化合物部分。
當激動劑PEG化后，它通常包含1-5個聚乙二醇(PEG)分子，例如1、2或3個PEG分子。每個PEG分子的分子量可以是約5kDa(千道爾頓)-100kDa，例如約10kDa-40kDa的分子量，如約12kDa或優(yōu)選不超過約20kDa。
合適的PEG分子可購自Shearwater Polymers，Inc.和Enzon，Inc.，并且可選自SS-PEG、NPC-PEG、醛-PEG、mPEG-SPA、mPEG-SCM、mPEG-BTC、SC-PEG、分枝mPEG(US 5,880,255)，或氧基羰基-氧基-N-二羧基酰亞胺-PEG(US 5,122,614)。
血清白蛋白、GAG和PEG無論對激動劑的修飾是與某基團連接以促進血清結(jié)合、GAG結(jié)合還是通過PEG化提高其穩(wěn)定性，血清白蛋白結(jié)合基序或GAG結(jié)合基序或PEG基團可以是激動劑碳骨架的側(cè)鏈或者可以形成激動劑碳骨架側(cè)鏈的一部分，所述骨架碳對應(yīng)于以下PYY或PP的任一位置1、3、4、6、7、10、11、12、13、15、16、17、18、19、21、22、23、25、26、28、29、30和32，或?qū)?yīng)于以下NPY的任一位置1、3、4、6、7、10、11、12、14、15、16、17、18、19、21、22、23、25、26、28、29、30和32。
特別是當激動劑是(b)型時，血清白蛋白結(jié)合基序或GAG結(jié)合基序或PEG基團也可以是或可形成碳骨架側(cè)鏈的一部分，對應(yīng)于以下PYY、NPY或PP的任一位置2、5、8、9、13、14、20和24。
與較大生物分子的偶聯(lián)如上所述，可在PP-折疊肽或PP-折疊肽模擬物的各種位置連接某些基序而不削弱它們對Y受體的高親和力(見實施例)。以類似方式，選擇性Y4受體激動劑可作為與例如白蛋白或另一種蛋白質(zhì)或運載體分子相連的融合蛋白使用，從而提供有益的藥代動力學或其它類型性能，例如減少腎排除。如同可采用多種蛋白質(zhì)或運載體那樣，本領(lǐng)域已知這種共價結(jié)合可采用多種化學修飾基團和接頭。特別優(yōu)選將選擇性Y4肽激動劑與白蛋白共價結(jié)合于PP-折疊結(jié)構(gòu)中，本文其它地方已指出的可用各種基序修飾的有關(guān)位置。這種融合蛋白可以通過各種半合成技術(shù)產(chǎn)生，其中肽可通過本文所述的肽合成技術(shù)制備，和通過重組技術(shù)制備生物分子。該融合蛋白也可整體作為表達的重組分子來制備，例如含有延伸序列Gly-Lys-Arg的前體分子，當該分子在真核細胞中表達為分泌型蛋白時將被生物合成酶切割，C-末端Y4受體識別序列的C末端Tyr殘基上的Gly轉(zhuǎn)變?yōu)轸弱０贰?br> 穩(wěn)定化如本文各處提及的那樣，可以各種方法穩(wěn)定本發(fā)明的許多選擇性Y4激動劑，例如通過N-末端?；蛲ㄟ^用非肽接頭替換激動劑部分骨架，或通過內(nèi)部環(huán)化交連來穩(wěn)定PP-折疊結(jié)構(gòu)。在大多數(shù)情況中，該穩(wěn)定作用有兩個目的，一是通過保留PP-折疊以最佳方式提供Y4受體的受體識別表位，另一是穩(wěn)定此肽以抵抗降解，即特別是蛋白酶解的降解。當也通過連接上述各種基序來修飾選擇性Y4激動劑以獲得延長的半衰期、緩釋和/或長時間組織接觸時，這點特別重要。如通常的和與選擇性Y4激動劑肽，例如PP-折疊穩(wěn)定化，環(huán)形[Cys，D-Cys27]PP及其各種類似物相關(guān)的具體例子所述，通常此肽激動劑主要通過腎臟相對快速地排出，因此蛋白質(zhì)穩(wěn)定性可能不重要，然而，當要求此肽以一種或多種方式在各種體液中延長存在數(shù)小時時，保持該肽的生物活性完整就特別重要，即其穩(wěn)定形式應(yīng)能耐受蛋白酶解攻擊。因此，在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，Y4選擇性激動劑均是結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的(通過結(jié)構(gòu)改變，一些在以下實施例中具體指出)，它們用各種基序修飾和/或與生物分子融合和/或以藥學方式制備以獲得緩釋等或延長的受體接觸(時間)。
螺旋誘導肽已提及本發(fā)明考慮該激動劑N-末端的?；勺鳛榉€(wěn)定該激動劑抵抗氨肽酶作用的一種方法。另一種穩(wěn)定性修飾包括將4-20個氨基酸殘基的穩(wěn)定性肽序列共價連接于N-和/或C-末端，優(yōu)選N-末端。此穩(wěn)定性肽中的氨基酸殘基選自Ala、Leu、Ser、Thr、Tyr、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、Arg、His、Met等。在一令人感興趣的實施方案中，N-末端肽連接包含4、5或6個Lys殘基，例如Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-PP或Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-[His34]PP。這些穩(wěn)定性肽可連接在PP-折疊肽激動劑的N-末端或者可將它們置于N-末端截短的PP-折疊模擬激動劑或N-末端縮短的PP-折疊模擬激動劑的N-末端，其中將間隔肽引入新的N-末端和穩(wěn)定性肽之間。由于Lys殘基鏈傾向于形成α螺旋結(jié)構(gòu)并在隨后的殘基中誘導這種結(jié)構(gòu)，如上所述這有益于由本發(fā)明選擇性Y2激動劑肽最后螺旋轉(zhuǎn)角和C-末端Y2受體識別氨基酸序列的受體呈遞，這種修飾特別令人感興趣。這種穩(wěn)定性肽延伸物的常規(guī)描述見納入本文作為參考的WO99/46283(Zealand Pharmaceuticals)。
本發(fā)明考慮的受體激動劑可通過熟知的方法制備，例如合成、半合成和/或重組方法。這些方法包括標準肽制備技術(shù)，例如溶液合成和固相合成。為獲得激動劑和它們的衍生物或修飾物，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本領(lǐng)域的教材和常規(guī)知識知曉如何操作。
下文結(jié)合分子藥理學特性以及肽化學和穩(wěn)定特性描述本發(fā)明特定的激動劑。
N-乙?；?PP(SEQ ID.No30)，N-(N’-十六烷?；?-γ谷氨酰基-PP(SEQ IDNo31)，[Nle17]PP(SEQ ID.No32)，[Nle30]PP(SEQ ID.No33).PP(SEQ ID.No34)，[N-(N’-十六烷?；?-γ谷氨?；?Lys13，Nle30]PP(SEQ ID No35)，[N-{(Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Ala-Arg-Ala)3}-Lys13]PP(SEQ ID No36)這些肽描述了內(nèi)源性Y4激動劑PP的有用的變體或類似物。N-乙酰基-PP和N-(N’-十四烷?；?-γ谷氨?；?PP是在α-氨基處修飾以提供抗氨肽酶的蛋白酶解降解保護的PP類似物。在N-(N’-十四烷?；?-γ谷氨酰基-PP情況中，(N’-十四烷酰基)-γ谷氨?；蛲瑫r構(gòu)成確保延長有效的T的血清白蛋白基序。[Nle17]PP、[Nle30]PP、[Nle17，Nle30]PP代表了其中PP2-36中的Met殘基被不可氧化的殘基(在該情況中是非天然的正亮氨酸(Nle)殘基)取代的類似物。由于Met和Nle之間的結(jié)構(gòu)高度相似，這種取代不改變Y4受體的高親和力和選擇性。[N-(N’-十四烷酰基)-γ谷氨?；?Lys13]-PP和[N-{(Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Ala-Arg-Ala)3}-Lys13]PP代表了PP類似物，其中為與血清白蛋白等結(jié)合從而延長有效的T，為與GAG結(jié)合從而(實現(xiàn))自注射位點的緩釋和/或因在組織中的存在時間延長而獲得持久的局部Y4受體接觸，這些類似物連接有基序，在兩種情況中，基序與引入17位的Lys殘基相連。由于Lys殘基(從而也包括各種基序)引入結(jié)構(gòu)中遠離肽被Y受體識別之處，這些修飾不影響基礎(chǔ)肽的高度Y4親和力和選擇性。如本文其它地方所述，另一種有用的取代可以是，例如PEG化。這些PP類似物是本發(fā)明所述許多不同組的對Y4具有超過對Y1和Y2的高度選擇性激動劑的一組成員(在該情況中，除了引入各種基序的連接位點之外的地方保留了基礎(chǔ)PP結(jié)構(gòu))，治療對Y4激動劑起反應(yīng)的疾病，例如肥胖癥、分泌性腹瀉、應(yīng)激性腸病等的化合物可從本發(fā)明中選擇。這些是新的化合物。
PP2-36(SEQ ID No10)該肽是(a)型，代表了含有其中1號殘基不存在的N-末端Y4受體識別氨基酸序列的PP類似物。與PP1-36相比，PP2-36是穩(wěn)定性改善的高度選擇性Y4受體激動劑。由于PP在2位具有Pro，其通常是DPP-IV降解的底物。因此，通過除去PP的第一個殘基，產(chǎn)生了未危及PP折疊結(jié)構(gòu)的肽，因為殘基1(Ala1)不與反平行的螺旋有任何相互作用(該作用由Pro2負責)并且因為PP2-36不再像野生肽是DPP-IV的底物。重要的是，與Y1受體依賴于1位中存在殘基相反，Y4受體不依賴于1位中存在殘基。因此，PP2-36既是更穩(wěn)定的肽，又是對Y1受體的選擇窗(selective window)提高的選擇性Y4受體激動劑。
受體識別情況-PP2-36以IC50＝0.64nM的親和力與Y4受體結(jié)合，該親和力類似于PP的親和力，IC50＝0.41。PP2-36對Y1和Y2受體的親和力＞1000nM(表1)。在實驗部分所述的轉(zhuǎn)染COS-7細胞中進行的磷酸肌醇酯轉(zhuǎn)化試驗中測定到PP2-36作為激動劑以0.64nM(EC50)的效力對Y4受體起作用，該效力非常類似于PP的效力(EC50＝0.85nM)(表2)。PP2-36和PP均是Y2受體的低親和力配體，即EC50值＞1000nM。然而，PP2-36對Y1受體的效力比PP的低3-4倍，EC50值是297對83nM(表2)。因此，如在體外功能試驗中所測定的，PP2-36是對Y1和Y2受體的選擇窗大于300倍的高度選擇性Y4激動劑。
蛋白質(zhì)穩(wěn)定性-與PP1-36相比，PP2-36的優(yōu)點在于它更穩(wěn)定，因此是更好的生物藥物，因為它不是DPP-IV的底物(由于在2位存在Pro殘基，PP是其底物)并且PP2-36中新穎的N-末端Pro殘基保護其免遭大多數(shù)其它氨肽酶降解。這些穩(wěn)定特性在通過各種方法，例如修飾肽或通過各種形式的藥學方法，例如緩釋制劑延長該肽在體液中的存在時間的場合特別有用。
急性食物攝入的體內(nèi)作用-禁食16小時后，通過皮下注射將鹽水或PY2-36以每只動物1或10μg的劑量給予各組小鼠(每組8只)。圖2顯示了小鼠在8小時期間累積的食物攝入量。選擇性Y4受體激動劑PP2-36在開始進食后的最初20分鐘將食物攝入抑制到接受鹽水的小鼠所攝入的約50％。當在整個第一小時測定時，也觀察到對食物攝入的50％抑制作用。1μg和10μg的PP2-36的作用相當類似。PP2-36的抑制作用維持于一次皮下注射后的整個8小時期間(圖2)。因此，如以前對PP所證實的，對Y4具有超過對Y1和Y2受體的高度選擇性PP2-36是小鼠食物攝入的有效抑制劑(Asakawa等，1999 Peptides 201445-48，Asakawa 2003 Gastroenterology 1241325-36)。已經(jīng)證實PP的這種作用也在正常的人對象(Batterham等，2003 Clin.Endocrinol.Metab.883989-92)和肥胖癥患者(Berntson等，1993 Peptides 14497-503)中觀察到。PP2-36(SEQ ID.No37)，[Nle30]PP2-36(SEQ ID.No38)，[N-(N’-十四烷酰基)-γ谷氨?；?Lys13]PP2-36(SEQ ID No39)，[N-{(Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Ala-Arg-Ala)3}-Lys13]PP2-36(SEQ ID No40)這些肽闡明了(a)型PP2-36的高選擇性Y4受體激動劑的一個例子的有用變體或類似物。[Nle17]PP2-36和[Nle30]PP2-36代表了PP2-36中的Met殘基被不可氧化的殘基(在該情況中是非天然的正亮氨酸(Nle)殘基)取代的類似物。由于Met和Nle之間的結(jié)構(gòu)高度相似，這種取代不改變Y4受體的高親和力與選擇性。[N-(N’-十四烷?；?-γ谷氨?；?Lys13]-PP2-36和[N-{(Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Ala-Arg-Ala)3}-Lys13]PP2-36代表了PP2-36的類似物，其中為與血清白蛋白等結(jié)合從而延長有效的T，和為與GAG結(jié)合從而(實現(xiàn))自注射位點的緩釋和/或因在組織中的存在時間延長而獲得持久的局部Y4受體接觸，這些類似物連接有基序，在兩種情況中，基序與引入17位的Lys殘基相連。由于Lys殘基(從而也包括各種基序)引入結(jié)構(gòu)中遠離肽被Y受體識別之處，這些修飾不影響基礎(chǔ)肽的高度Y4親和力和選擇性。如本文其它地方所述，另一種有用的取代可以是，例如PEG化。這些PP2-36類似物是本發(fā)明所述許多不同組的對Y4具有超過對Y1和Y2的高度選擇性激動劑的一組成員，治療對Y4激動劑起反應(yīng)的疾病，例如肥胖癥、分泌性腹瀉、應(yīng)激性腸病等的化合物可從本發(fā)明中選擇。這些均是新的化合物。-PP(SEQ ID No11)，[Leu34]-PP(SEQ ID.No51)，[Ile34]-PP(SEQ ID.No52)，[Phe34]-PP(SEQ ID.No53).
該肽代表了作為PP類似物的一組(a)型高選擇性Y4激動劑，其在C-末端Y4受體識別氨基酸序列中具有取代，在這些情況中，優(yōu)選在通常是Pro殘基的34位發(fā)生單獨取代。34位取代的PP類似物構(gòu)成了本發(fā)明所述許多不同組的對Y4具有超過對Y1和Y2的高度選擇性激動劑的一組，治療對Y4激動劑起反應(yīng)的疾病，例如肥胖癥、分泌性腹瀉、應(yīng)激性腸病等的化合物可從本發(fā)明中選擇。這些是新的化合物。
受體識別情況-如圖1所示，用例如[His34]PP的另一殘基取代天然的Pro34不損害對Y4受體的親和力，因為[His34]PP以類似于PP(IC50＝0.41nM)的高親和力(IC50＝0.48nM)與Y4受體結(jié)合。重要的是，[His34]PP對Y1和Y2受體的親和力不可測定(IC50＞1000nM)。因此，與Y1和Y2受體相反，這是高度選擇性Y4受體配體。在磷酸肌醇酯轉(zhuǎn)化試驗中檢測到作為Y4受體激動劑的[His34]-PP以極其類似于PP的效力(EC50＝0.64nM)的1.2nM(EC50)效力起作用(表2)。因為PP、[His34]-PP對Y2受體顯示低效力，即EC50值＞1000nM。然而，[His34]-PP對Y1受體的效力遠低于PP的，[His34]-PP的EC50值為＞1000nM而PP的為83nM(表2)。因此，如在體外功能試驗中所測定的，[His34]-PP是對Y1和Y2受體的選擇窗大于1000倍的高度選擇性Y4激動劑。
蛋白質(zhì)穩(wěn)定性-[His34]-PP具有類似于PP的蛋白質(zhì)穩(wěn)定性。-PP(SEQ ID.No41)，[Nle30，His34]-PP(SEQ ID.No42).-PP(SEQ ID.No43)，[N-(N’-十四烷酰基)-γ谷氨?；?Lys13，His34]-PP(SEQ ID No44)，[N-{(Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Ala-Arg-Ala)3}-Lys13，His34]PP(SEQ ID No45)這些肽闡明了(a)型的高選擇性Y4受體激動劑的一個例子的有用變體或類似物，其特征在于，在C-末端Y4受體識別氨基酸序列中具有取代，在這種情況中是34位，在這種具體的情況中是[His34]PP。[Nle17，His34]-PP、[Nle30，His34]-PP和[Nle17，Nle30，His34]-PP代表了[His34]PP中的一個或兩個Met殘基被不可氧化的殘基(在該情況中是非天然的正亮氨酸(Nle)殘基)取代的類似物。由于Met和Nle之間的結(jié)構(gòu)高度相似，這種取代不改變高度Y4受體親和力與選擇性。[N-(N’-十四烷?；?-γ谷氨酰基-Lys13，His34]-PP和[N-{(Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Ala-Arg-Ala)3}-Lys13，His34]PP代表了[His34]PP的類似物，其中連接有基序以便與血清白蛋白等結(jié)合從而延長有效的T，以及與GAG結(jié)合從而(實現(xiàn))自注射位點的緩釋和/或因在組織中的存在時間延長而獲得持久的局部Y4受體接觸，在兩種情況中，基序與引入17位的Lys殘基相連。由于Lys殘基(從而也包括各種基序)引入結(jié)構(gòu)中遠離肽被Y受體識別之處，這些修飾不影響基礎(chǔ)肽的高度Y4親和力和選擇性。如本文其它地方所述，另一種有用的取代可以是，例如PEG化。這些[His34]PP類似物是本發(fā)明所述許多不同組的對Y4具有超過對Y1和Y2的高度選擇性激動劑的一組成員，治療對Y4激動劑起反應(yīng)的疾病，例如肥胖癥、分泌性腹瀉、應(yīng)激性腸病等的化合物可從本發(fā)明中選擇。這些均是新的化合物。-PYY(SEQ ID No12)，[Ala2，Pro34]-PYY(SEQ ID No13)，[Glu4，Pro34]-PYY(SEQ ID No14)，[Ala1，Glu4，Pro34]-PYY(SEQ ID No25)這些肽是代表PYY類似物的(a)型選擇性Y4受體激動劑，其中C-末端Y4受體氨基酸序列通過Pro34取代引入PYY的C-末端并且通過N-末端Y4受體識別氨基酸序列中的取代，即Ala1取代Tyr，Ala2取代Pro或Glu4取代Lys增加了對Y1受體的選擇性。在[Ala1，Glu4，Pro34]-PYY的N-末端區(qū)段中進行兩種取代。[DesTyr1，Pro34]-PYY也是對Y1受體的選擇性增加的另一種肽。這些[Pro34]PYY類似物是本發(fā)明所述許多不同組的對Y4具有超過對Y1和Y2的高度選擇性激動劑的一組成員，治療對Y4激動劑起反應(yīng)的疾病，例如肥胖癥、分泌性腹瀉、應(yīng)激性腸病等的化合物可從本發(fā)明中選擇。這些肽均是新的化合物。
受體識別情況-例如，與Y2受體(IC50＞1000nM)和Y1受體(IC50＝176nM)相反，[Ala1，Pro34]-PYY以高親和力結(jié)合Y4受體(IC50＝4.4nM)(表1)。因此，PYY中的Ala1和Pro34取代增加了對Y4受體的親和力(從30到4.4nM)并降低了對Y1受體(從16到176nM)和Y2受體的親和力(從0.22nM到＞1000nM)。例如[Glu4，Pro34]-PYY的受體識別情況頗為相似，對Y4受體的親和力為2.4nM，對Y1受體的親和力為99nM(表1)。-PYY(SEQ ID No15)，[Ile28，Pro34]-PYY(SEQ ID No16)，[Met30，Pro34]-PYY(SEQ ID No17)
這些肽也是代表PYY類似物的(a)型選擇性Y4受體激動劑，其中C-末端Y4受體氨基酸序列通過Pro34取代引入PYY的C-末端并且通過PYY序列中的C-末端區(qū)段的單獨取代，即Arg26取代His，Ile28取代Leu或Met30取代Leu增加了對Y1受體的選擇性。這些[Pro34]PYY類似物是本發(fā)明所述許多不同組的對Y4具有超過對Y1和Y2的高度選擇性激動劑的一組成員，治療對Y4激動劑起反應(yīng)的疾病，例如肥胖癥、分泌性腹瀉、應(yīng)激性腸病等的化合物可從本發(fā)明中選擇。這些均是新的化合物。
受體識別情況-例如，與Y2受體(IC50＝177nM)和Y1受體(IC50＝15nM)相反，[Arg26，Pro34]-PYY以高親和力結(jié)合Y4受體(IC50＝0.43nM)(表1)。例如[Arg30，Pro34]-PYY的受體識別情況頗為相似，但對Y1受體具有更高的選擇窗，因為其對Y4受體的親和力為0.99nM，對Y1受體的為173nM，對Y2受體的為＞1000nM。第三實施例，[Met30，Pro34]PYY的相應(yīng)數(shù)據(jù)見表1。PP(SEQ ID No4)該肽代表了設(shè)計為具有受體選擇性和高度穩(wěn)定性的(b)型高度選擇性Y4激動劑。[Cys2，D-Cys27]PP代表了一組選擇性Y4激動劑，其中為穩(wěn)定其PP-折疊結(jié)構(gòu)，在該具體情況中，在全長PP分子的取代2位Pro的Cys和取代27位Tyr的D-Cys之間引入接頭，在該情況中是分子內(nèi)二硫鍵。[Cys2，D-Cys27]PP也受保護免遭DPP-IV降解，因為它在2位不再具有Pro。N-末端乙?；揎椧彩乖撾木哂谢钚?，這種修飾進一步防止該肽受氨肽酶降解。游離肽和例如乙?；问绞切碌幕衔?。
受體識別情況-[Cys2，D-Cys27]PP以一位納摩爾(single digit nanomolar)親和力與Y4受體結(jié)合，IC50＝8.2nM。它對Y4受體具有高度選擇性，因為[Cys2，D-Cys27]PP對Y1和Y2受體的親和力＞1000nM(表1)。在轉(zhuǎn)染的COS-7細胞中進行的磷酸肌醇酯轉(zhuǎn)化試驗中測定到[Cys2，D-Cys27]PP作為激動劑以4.6nM(EC50)的效力對Y4受體起作用，僅比PP的低7倍(EC50＝0.64nM)(表2)。[Cys2，D-Cys27]PP是Y2受體的低效力配體，即EC50值＞1000nM。重要的是，與PP相反，[Cys2，D-Cys27]PP對Y1受體的效力非常低，即PP的EC50值是83nM而[Cys2，D-Cys27]PP的不可測(表2)。因此，[Cys2，D-Cys27]PP是對Y1和Y2受體的選擇窗改善的高度選擇性Y4激動劑。
蛋白質(zhì)穩(wěn)定性-與PP相比，[Cys2，D-Cys27]PP的優(yōu)點在于它更穩(wěn)定，因此是更好的生物藥物，因為它不是DPP-IV的底物并且分子內(nèi)二硫鍵穩(wěn)定了其PP-折疊。這些穩(wěn)定特性在通過各種方法，例如修飾肽或通過各種形式的藥學方法，例如緩釋制劑延長該肽在體液中的存在時間的場合特別有用。-PP(SEQ ID No48).
該肽代表了一組(b)型高度選擇性Y4激動劑，其設(shè)計為具有受體選擇性和通過上述分子內(nèi)連接鍵而具有高度穩(wěn)定性，并且通過與結(jié)合基序相連而得到修飾，在該情況中例如將血清白蛋白結(jié)合基序與[Cys2，D-Cys27]PP中引入的Lys13殘基相連。因為連接位點的位置，它具有類似于[Cys2，D-Cys27]PP的結(jié)合Y受體的特性。-PP(SEQ ID No9)[Cys2，Aoc5-24，D-Cys27]PP是(b)型選擇性Y4激動劑，它代表了中心截短二硫鍵穩(wěn)定的PP肽模擬物，其對Y4受體具有選擇性，相比于PP的優(yōu)點在于更小(與36個殘基相比，只有16個殘基)且穩(wěn)定。[Cys2，Aoc5-24，DCys27]-PP是新的化合物。
受體識別情況-[Cys2，Aoc5-24，D-Cys27]PP以286 nM的親和力與Y4受體結(jié)合，對Y1和Y2受體的親和力不可測(表1)。PP25-36(SEQ ID No5)和[Glu28，Lys32]PP25-36(SEQ IDNo6)這些是(b)型選擇性Y4受體激動劑，代表了通過分子內(nèi)內(nèi)酰胺鍵穩(wěn)定的環(huán)形PP類似物。在這些情況中，PP的Ile28(在實際十二肽的4位)被Lys或Glu殘基取代，Thr32(在實際十二肽的8位)被Glu或Lys殘基取代，28位和32位的這些殘基側(cè)鏈的氨基和羧基通過內(nèi)酰胺化相連。這些肽的新的化合物。
S-Cys-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-CONH2|
S-Cys-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-CONH2(SEQ ID No7)S-Cys-Leu-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-CONH2|S-Cys-Leu-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-CONH2(SEQ ID No18)S-Cys-Leu-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-CONH2|S-Cys-Leu-Thr-Arg-His-Arg-Tyr-CONH2(SEQ ID No26)S-Cys-Leu-Thr-Arg-Leu-Arg-Tyr-CONH2|S-Cys-Leu-Thr-Arg-Leu-Arg-Tyr-CONH2(SEQ ID.No49)S-Cys-Leu-Thr-Arg-Ile-Arg-Tyr-CONH2|S-Cys-Leu-Thr-Arg-Ile-Arg-Tyr-CONH2(SEQ ID.No50)。
這些是(c)型選擇性Y4受體激動劑，代表了其中兩條C-末端Y4受體識別氨基酸序列相連(在這些情況中是通過兩個Cys殘基之間的二硫鍵)的二聚體構(gòu)建物。這些肽的優(yōu)點在于小但具有高效力，是選擇性Y4受體配體。這些是新的化合物。
受體識別情況-例如，[CTRPRY-酰胺]×2均-二聚體(SEQ ID No18)以29nM的親和力結(jié)合Y4受體，對Y1和Y2受體的親和力不可測(表1)，而較長的[CLTRPRY-酰胺]×2均-二聚體(SEQ ID No26)對Y4受體的親和力甚至更高(IC50＝1.3nM)并且對Y1和Y2受體的親和力仍不可測(表1)。因此，該(c)型化合物在高親和力的Y4結(jié)合與低親和力的Y1和Y2受體結(jié)合之間具有廣泛的選擇窗，即在本文給出的[CLTRPRY-酰胺]×2均-二聚體例子之間具有＞1000倍的差異。
S-Cys-[N-(N’-十六烷酰基)-γ谷氨?；鵠-Lys-Thr-Arg-Leu-Arg-Tyr-CONH2|S-Cys-Leu-Thr-Arg-Leu-Arg-Tyr-CONH2(SEQ ID.No29)該肽代表了一組(c)型選擇性Y4受體化合物，它是其中兩條C-末端Y4受體識別氨基酸序列相連(在這些情況中是通過兩個Cys殘基之間的二硫鍵)并且被結(jié)合基序(在該情況中是與取代“31”位Leu的Lys相連的血清白蛋白結(jié)合基序)修飾的二聚體構(gòu)建物。因此，盡管該基礎(chǔ)肽的體積小，該類型的Y4選擇性化合物在腎臟中不被快速洗出從而具有延長的T。結(jié)合基序的連接位點接近對Y4受體識別影響最小的二硫鍵處，該“31”位殘基缺失的以上較短的[CTRPRY-酰胺]×2的高親和力結(jié)合說明了該情況。
臨床適應(yīng)癥本發(fā)明考慮的Y4-特異性激動劑可用于治療對Y4受體激活起反應(yīng)的疾病。這種疾病包括顯示需要調(diào)節(jié)能量攝入或能量代謝或誘導血管生成的疾病。就這種用途而言，該激動劑可包含能賦予對肽酶的穩(wěn)定性、血清蛋白質(zhì)結(jié)合性能、PEG化或GAG-結(jié)合基序以延長血清和/或組織半衰期的修飾或基序。
顯示需要調(diào)節(jié)能量攝入或能量代謝的疾病或病癥包括肥胖和超重，與肥胖和超重認為是影響因素的疾病，例如食欲過勝、神經(jīng)性貪食、X綜合征(代謝綜合征)、糖尿病、2型糖尿病或非胰島素依賴型糖尿病(NIDDM)、高血糖、胰島素耐受、葡萄糖耐受不良、心血管疾病、高血壓、動脈粥樣硬化、冠狀動脈病、心肌梗塞、周圍血管病、中風、血栓栓塞性疾病、高膽固醇血癥、高脂血癥、膽囊疾病、骨關(guān)節(jié)炎、睡眠呼吸暫停、生殖性疾病如多囊性卵巢綜合征，或乳腺癌、前列腺癌或結(jié)腸癌。
Y4選擇性激動劑在治療腹瀉或腸造口術(shù)的過度分泌(hyper-secretion fromintestinal stomia)、治療惡心或嘔吐、或作為抗惡心或止吐藥或與易于導致惡心和/或嘔吐的藥物共同治療中也有價值。
1.肥胖和超重在17世紀已有暗示，PP可能涉及對食物攝入的控制。近來，嚙齒類動物研究積累的許多證據(jù)非常清楚地顯示事實上當PP外圍給藥時，其是強有力且有效的食欲減退肽(Askawa等，Peptides 1999，20；Gastroenterology 2003，1241325-36)。由于PP在Y4敲除動物中對食欲、食物攝入等無影響，PP非常可能通過Y4受體起到降低食欲和食物攝入的作用(Batterham等，“Coimbra國際NPY研討會2004摘要S3.3”(2004 abstract S3.3 from International NPY symposium in Coimbra)，葡萄牙)。PP在飲食誘導的肥胖動物中對食物攝入也有作用。PP受體尤其在血腦屏障無效的postreama區(qū)域的腦干中和迷走神經(jīng)運動神經(jīng)元上發(fā)現(xiàn)，循環(huán)激素例如PP可接近神經(jīng)元。因此，腦干中NTS的Y4受體很可能是PP起到抑制食欲和食物攝入的主要靶位。然而，近來的證據(jù)也指出PP也可能通過POMC上可能的弓形核，也可能是NPY/AgRP神經(jīng)元中的Y受體起作用(Batterham等，“Coimbra NPY大會摘要S3.3”(Coimbra NPY meeting abstract S3.3))。在肥胖對象，特別是患普-韋綜合征的對象中發(fā)現(xiàn)PP的水平低(Zipe等，J.C.E.M.1981，521264-6；Holst等，1983，INT.J.OBES.7529-38；Glaser等，Horm.Metab.1988，20288-92)，在神經(jīng)性厭食患者中發(fā)現(xiàn)PP水平高。重要的是，在人中輸注PP降低食欲和食物攝入達24小時(Batterham等，JCEM 2003，883989-92)。因此，循環(huán)(系統(tǒng))中PP回復(fù)正常水平后仍觀察到PP對食物攝入的作用。也熟知其它化合物，例如ICV注射AgRP對食欲有這種持久的作用。重要的是，輸注PP顯示在患普-韋綜合征的病態(tài)肥胖患者中降低食物攝入(Bemtson等，1993 Peptides 14497-503)。
因此，為調(diào)節(jié)能量攝入，本發(fā)明考慮的Y4選擇性激動劑適用于包括人的哺乳動物對象。所以，本發(fā)明涉及調(diào)節(jié)能量攝入、食物攝入、食欲和能量消耗的方法。本文公開了通過給予對象美容或治療有效量的這種激動劑來減少能量或食物攝入的方法。在一個實施方案中，給予該受體激動劑導致(攝入的)食物總量或總體積或卡路里含量減少。在另一實施方案中，(給予受體激動劑)可導致食物成分的攝入減少，例如脂質(zhì)、碳水化合物、膽固醇或蛋白質(zhì)的消化降低。在本文公開的任何方法中，可以給予本文詳述的優(yōu)選化合物。在其它實施方案中，本文公開了通過給予治療有效量的這種激動劑來降低食欲的方法。食欲可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法測定?？捎帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法測定食欲。
例如，可通過生理評估來評價食欲降低。在這種實施方案中，給予該受體激動劑可導致對饑餓的感知、過飽的感覺和/或飽帳感的變化。可用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法來評估饑餓。在一個實施方案中，用生理試驗評估饑餓，例如利用調(diào)查表來評估饑餓感和感官感知。
在另一實施方案中，本文公開了降低上胃腸(GI)道能動性，例如降低胃排空的方法。已知PP(原型Y4激動劑)可降低胃排空。該方法包括給予對象治療有效量的這種Y4選擇性激動劑，從而降低胃腸道能動性。降低胃排空的化合物也熟知在降低食物攝入中具有有益作用，因為對象感覺到過飽或飽脹感。
在其它實施方案中，本文公開了改變對象的能量代謝的方法。該方法包括給予對象治療有效量的這種激動劑而改變能量消耗。所有生理過程均消耗能量。機體可通過調(diào)節(jié)那些過程的效率或者改變正發(fā)生過程的數(shù)量和性質(zhì)來直接改變能量消耗率。例如，在消化期間，機體消耗能量便食物通過腸道移動并消化食物，在細胞中，細胞代謝效率的改變會產(chǎn)生或多或少的熱量。在其它實施方案中，本文公開了本申請所述弓形線路(arcuate circuitry)的所有調(diào)節(jié)方法，該方法協(xié)同改變了食物攝入并回應(yīng)性改變能量消耗。能量消耗是細胞代謝、蛋白質(zhì)合成、代謝速率和利用卡路里的結(jié)果。因此，在該實施方案中，外周給藥導致能量消耗增加和卡路里利用率降低。在一個實施方案中，給予對象治療有效量的本發(fā)明受體激動劑從而增加了能量消耗。
在治療應(yīng)用和美容應(yīng)用相關(guān)的幾個實施方案中，可用Y4選擇性激動劑控制體重和治療、減輕或預(yù)防肥胖，特別是以下一種或多種用途預(yù)防和減輕體重增加；誘導和促進體重降低；減輕體重指數(shù)所測定的肥胖癥。如上所述，本發(fā)明還涉及Y4選擇性激動劑在控制食欲、飽脹和饑餓中的應(yīng)用，特別是以下一種或多種應(yīng)用降低、壓制和抑制食欲；誘導、增加、提高或促進飽脹和飽脹感；降低、抑制和壓制饑餓和饑餓感。該內(nèi)容還涉及Y4選擇性激動劑的以下一種或多種應(yīng)用維持所需體重、所需體重指數(shù)、所需外貌和良好的健康狀況。
在另一方面，本發(fā)明涉及治療和/或預(yù)防能量代謝降低、進食障礙疾患(feedingdisorder)、食欲紊亂、超重、肥胖、食欲過勝、神經(jīng)性貪食、X綜合征(代謝綜合征)或與它們相關(guān)的并發(fā)癥或風險，包括糖尿病、2型糖尿病或非胰島素依賴型糖尿病(NIDDM)、高血糖、胰島素耐受、葡萄糖耐受不良、心血管疾病、高血壓、動脈粥樣硬化、充血性心力衰竭、中風、心肌梗塞、血栓栓塞性疾病、高膽固醇血癥、高脂血癥、膽囊疾病、骨關(guān)節(jié)炎、睡眠呼吸暫停、生殖性疾病如多囊性卵巢綜合征，乳腺癌、前列腺癌或結(jié)腸癌，該方法包括給予對象，例如包括人的哺乳動物有效劑量的一種或多種本文所述Y4選擇性激動劑。
2.腸分泌過多已知PP對小腸和大腸具有強烈的抗分泌作用，該作用顯示受位于上皮細胞中的Y4受體介導(Cox和Tough，2001 Br.J.Pharmacol.1351505-12)。外周給予PYY(另一種激活Y1和Y2受體的PP-折疊肽)在體內(nèi)顯示持久降低經(jīng)回腸造口術(shù)的人對象中各種腸內(nèi)多肽誘導的腸分泌(Playford等，1990 Lancet 3351555-57)。結(jié)論是，PYY可以是抗腹瀉的治療性藥物。然而，例如聯(lián)用Y1和Y2激動劑，NPY和PYY的利尿鈉和高血壓作用阻止了這種作用。這種副作用與本發(fā)明的選擇性Y4受體激動劑無關(guān)。因此，本發(fā)明的選擇性Y4激動劑特別可用于治療或保護以抵御胃腸道過度分泌，包括各種形式的腹瀉，而無論它們是否直接由過度分泌導致，因為抑制腸液過度分泌既消除了腹瀉的誘因又消除了癥狀。一種特別感興趣的適應(yīng)癥是在經(jīng)常喪失大量液體的經(jīng)回腸造口術(shù)的患者中觀察到的過度分泌。本發(fā)明的選擇性Y4激動劑特別可用于治療或保護以抵御小腸回腸造口術(shù)相關(guān)的過度分泌。
3.嘔吐與惡心已有提示可作為控制食欲的藥物的許多肽和其它類型的化合物，例如PYY和CB1拮抗劑是會引起嘔吐的。例如，事實上在1989年在腸提取物中發(fā)現(xiàn)PYY(“第二次”)作為生物活性實體導致狗嘔吐(Harding和McDonald，1989 Peptides 1021-24)。結(jié)論是，PYY是鑒定到的最有效的循環(huán)催吐肽，該作用通過已知具有滲漏血腦屏障的postreama區(qū)域介導。也有報道說，當將PYY3-36外周給予人對象時可導致惡心(Nastech press release 29th of June 2004)。令人感興趣的是，注意到以相似劑量給藥的PP不導致這些狗嘔吐(Harding和McDonald，1989)。因此，通過也位于腦干的postreama區(qū)域的Y4受體起作用的PP不導致嘔吐。重要的是，可給予動物例如彌猴(cyno monkey)大劑量的組合Y2-Y4激動劑肽(對Y2受體具有與PYY相似的體外效力)，達到12-13.000nM的極高血漿水平而未觀察到任何動物嘔吐或胃腸道副作用的證據(jù)。由于當對Y2受體具有相似效力的PPY3-36以很低的劑量給予時在人和可能的動物中未導致嘔吐，這是出乎意料的。因此，組合的Y2-Y4選擇性激動劑未導致嘔吐的情況出乎意料地與選擇性Y2激動劑(PYY3-36化合物)一樣。明顯，Y4受體激活(可能在postreama區(qū)域)阻止了Y2激活的催吐作用(在該情況中是作用于Y2受體的同一化合物導致的作用)。因此，本發(fā)明的Y4選擇性化合物特別可用于治療或保護以抵御嘔吐與惡心。這可以是與例如另一種經(jīng)常導致嘔吐與惡心的食欲抑制藥物如Y2激動劑型、CB1拮抗劑/反向拮抗劑型或其它類型的食欲抑制藥物進行治療相關(guān)的嘔吐與惡心。應(yīng)該注意的是，Y4選擇性化合物的食欲抑制作用很可能同時是附加或者甚至是協(xié)同的。因此，共同給予本發(fā)明的Y4選擇性激動劑和另一種食欲抑制或其它類型的抗肥胖藥物可達到兩個目的1)獲得全部或部分的附加抗肥胖作用的有益作用，2)Y4選擇性化合物消除或降低其它抗肥胖藥物的催吐作用的有益作用。
本發(fā)明的Y4選擇性化合物和PP本身特別可用于治療或保護以抵御妊娠相關(guān)的嘔吐和惡心。就該具體適應(yīng)癥而言，重要的是Y4選擇性化合物是天然PP-折疊肽的相近類似物，通常期望它們具有可忽略的副作用。這些肽在胎盤中不穿過母體循環(huán)(系統(tǒng))進入胎兒循環(huán)(系統(tǒng))的事實尤其重要，因為這使得與胎兒的接觸時間最短從而使導致發(fā)育性副作用的風險很低。
本發(fā)明的Y4選擇性化合物和PP本身也可用于治療或保護以抵御酒精不耐受相關(guān)的嘔吐和惡心。
4.應(yīng)激性腸病Y4受體的天然配體，PP的分泌和功能與自發(fā)神經(jīng)系統(tǒng)的活性高度相關(guān)(Schwartz，1983，Gastroenterology 851411-25)。因此，例如PP血漿水平的起伏與胃腸道能動性和分泌的起伏以及激素/或神經(jīng)遞質(zhì)促胃動素的分泌極其相關(guān)。已知PP通過副交感神經(jīng)系統(tǒng)和中心迷走神經(jīng)控制中心，例如腦干中的迷走神經(jīng)運動神經(jīng)元起作用，從而控制傳出迷走神經(jīng)纖維到胃腸道的活性。由于據(jù)信應(yīng)激性腸病與特別是胃腸道能動性和導致疼痛等的功能失常和通過自發(fā)神經(jīng)系統(tǒng)控制該作用的功能失常相關(guān)，利用選擇性Y4激動劑治療應(yīng)激性腸病是本發(fā)明的優(yōu)選實施方案。
給予Y4激動劑治療或防止肥胖和相關(guān)疾病的其它評價在進食過程中，各種胃腸道激素和神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)以仔細協(xié)調(diào)、依次和重疊的方式激活。此外，食物成分在吸收后不僅直接影響胃腸道激素的分泌和各種傳入神經(jīng)元途徑的激活，也影響各種激素和CNS中心。因此，調(diào)節(jié)食物攝入和能量消耗是一高度復(fù)雜和多層面的過程。鑒于此，當某些激素，例如PP僅以導致例如進食期間達到的血漿水平的3-4倍的方式給藥時，事實上可基本影響該系統(tǒng)是出乎意料的。
如果這種化合物-Y4選擇性激動劑—在禁食期間以上述有效劑量給予，則其給藥明顯主要具有預(yù)期的作用。如果Y4激動劑在各種激素和神經(jīng)元系統(tǒng)因在胃腸道中存在食物成分或期望進食而激活的情況下給予，該作用未觀察到或較低。因此，在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，選擇性Y4激動劑在禁食狀態(tài)下以有效劑量通過皮下、鼻部或通過本文其它地方所述的其它方式給予。本文的術(shù)語“禁食的狀態(tài)”指對象在給予Y2受體激動劑前至少最近2小時內(nèi)未吃任何食物或飲水，例如給藥前至少最近3小時內(nèi)、至少最近4小時內(nèi)、至少最近5小時內(nèi)、至少最近6小時內(nèi)、至少最近7小時內(nèi)、至少最近8小時內(nèi)、至少最近9小時內(nèi)、至少最近10小時內(nèi)、至少最近11小時內(nèi)或至少最近12小時內(nèi)。
在種群的一個亞組中，Y4激動劑因遺傳變異，例如Y4基因中的多態(tài)性而可能不具有所期望的作用。這些受體中喪失功能的突變可能與肥胖相關(guān)。因此，在本發(fā)明一優(yōu)選實施方案中，為檢測這些基因中的多態(tài)性/突變和鑒定這種多態(tài)性，對待治療對象的Y4基因進行分析。根據(jù)這種分析可得到這些對象的最佳治療方案。例如，只有具有不影響Y4激動劑功能的正?；蛐突蚨鄳B(tài)性的對象應(yīng)該用這種激動劑治療。為確保藥物的最佳效果，另一種可能性是提高表達受損傷受體對象的Y4激動劑用量。在Y4受體功能受損導致對象肥胖的情況中，例如在雜合子患者(前提是至少保留了一些相關(guān)受體功能)中用替代療法形式的Y4激動劑(例如大劑量)治療可能有爭議。
在本發(fā)明的一個實施方案中，在長期治療開始前可進行給予Y4激動劑以確保這些化合物在待治療對象中具有所期望作用的急性測試。通過這些方法確保了只有對用Y4激動劑治療敏感的對象才可用這些化合物治療。
聯(lián)用Y4-選擇性激動劑和Y2-選擇性激動劑與其它藥物我們在同一天提交的待批國際專利申請公開了Y2-選擇性激動劑和它們在治療中的應(yīng)用。本申請的附錄簡明地總結(jié)了該申請的Y2激動劑所需的結(jié)構(gòu)特性，并且給出了Y2選擇性激動劑的具體例子。如下文簡單所述，本發(fā)明的Y4-激動劑可與Y2的特異性激動劑聯(lián)用來治療。
通過用兩種化合物(分別是選擇性Y4激動劑和選擇性Y2激動劑)聯(lián)合治療，可以用低于每種化合物各自單獨使用時的劑量而獲得最大的有益作用，。即可給予亞最高劑量的選擇性Y2化合物而確保只有最小的副作用(例如通過周圍心血管Y2受體產(chǎn)生最小副作用或產(chǎn)生嘔吐)，同時給予最高劑量或者甚至超高劑量的Y4激動劑而確保通過具有更廣泛治療窗(window)的Y4受體途徑在所有對象中產(chǎn)生極強作用。Y2受體途徑的伴隨(部分)刺激可確保對食欲調(diào)節(jié)和能量消耗的作用比Y4激動劑單獨刺激更有效。例如，Y2激動劑對胃排空的作用比Y4激動劑更明顯。并且，Y4受體的伴隨刺激可允許使用較低而更安全劑量的單用無效的Y2激動劑。
當單獨用兩種化合物獲得對Y4和Y2受體的聯(lián)合刺激時，可如上所述調(diào)整給藥方案。因此，在本發(fā)明的具體實施方案中，Y2激動劑和Y4激動劑聯(lián)合給藥時，Y2和Y4之間的劑量比為約0.1∶10-約10∶0.1，例如約0.1∶1-約1∶0.1、約0.2∶1-約1∶0.2、約0.3∶1-約1∶0.3、約0.4∶1-約1∶0.4或約0.5∶1-約1∶0.5，例如1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6等。如上所述，一個令人感興趣的實施方案是Y2和Y4激動劑聯(lián)用，其中調(diào)整Y2與Y4用量之間的平衡可獲得最大療效和最小的副作用(如果有的話)。因此，可以考慮在這種組合中Y2激動劑的濃度低于Y4激動劑的濃度。為此，上述濃度和比例分別為摩爾濃度和摩爾比。
因此，在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，選擇性Y4激動劑與選擇性Y2激動劑聯(lián)合給藥來治療肥胖癥。
這些化合物可通過相同或不同的給藥途徑給予。原則上，給藥途徑可以是任何途徑，如本文所述，胃腸外和局部途徑最令人感興趣。因此，在本發(fā)明的一個實施方案中，Y4和Y2激動劑均通過局部途徑給藥，例如鼻部給藥或皮下注射，在其它實施方案中，Y4激動劑經(jīng)鼻部給藥給予而Y2激動劑經(jīng)皮下注射給予，或反之亦然。其它合適的組合或給藥途徑也屬于本發(fā)明范圍內(nèi)。
用于聯(lián)合治療的Y4和Y2激動劑可以裝在同一藥物組合物中(例如，摻合在藥物組合物中)，或者可存在于不同藥物組合物中以同時、依次或分別給藥并裝有具體的使用說明書。因此，這種組合物可以試劑盒的形式提供，該試劑盒中在同一或分開的容器中裝有Y4激動劑和Y2激動劑，任選附有使用說明書。
本發(fā)明的Y4特定激動劑可與各種靶向食欲和能量消耗的其它藥物聯(lián)用來治療肥胖、糖尿病和相關(guān)疾病，包括但不限于胃腸道酯酶抑制劑、神經(jīng)遞質(zhì)再攝取抑制劑、大麻素受體拮抗劑和反向激動劑以及其它類型的神經(jīng)遞質(zhì)(包括但不限于5HT受體)和/或神經(jīng)激素(包括但不限于GLP-1、MC4、MC3受體激動劑或拮抗劑)。由于Y4選擇性激動劑靶向聯(lián)系胃腸道和CNS的穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)機理(即，飽脹感介導胰腺分泌的激素PP通常靶向Y4受體)，特別優(yōu)選聯(lián)用Y4選擇性激動劑和靶向食欲和能量消耗調(diào)節(jié)中樞快感機理(例如作為應(yīng)答系統(tǒng)(reward system)一部分的CB1受體)的藥物治療。因此，在治療肥胖癥和相關(guān)疾病中聯(lián)用Y4激動劑與CB1拮抗劑是本發(fā)明的一種優(yōu)選實施方案。
劑量本發(fā)明Y4受體激動劑的治療有效量取決于所用的具體激動劑、所治療對象的年齡、體重和狀況、所治療病癥或疾病的嚴重性和類型、給藥方式和所用組合物的強度。
例如，Y4受體激動劑的治療有效量可在約0.01μg/公斤體重-約1g/公斤體重范圍內(nèi)變動，例如約1μg-約5mg/公斤體重，或約5μg-約1mg/公斤體重。在另一實施方案中，給予對象0.5-135皮摩爾(pmol)/kg體重，或約72pmol/kg體重的受體激動劑。
在一具體的非限制性例子中，皮下注射給予約5-約50nmol，例如約2-約20nmol，或者皮下注射給予約1.0nmol。本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)所用具體特定化合物的效力、對象的年齡、體重、性別和生理情況不難確定精確的劑量。激動劑的劑量可以是治療有效劑量的PYY3-36的摩爾當量。
這些用量可分為一次或數(shù)次劑量，以每日、每兩日、每周、每兩周、每月或以任何其它適當?shù)念l率給藥。給藥一般是每日一次或每日兩次。
給藥方法本發(fā)明的Y4激動劑以及美容或藥物組合物可經(jīng)任何途徑給予，包括腸內(nèi)(例如，口服給藥)或胃腸外途徑。在一具體實施方案中，優(yōu)選胃腸外途徑，包括靜脈內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下、肌肉內(nèi)、胸骨內(nèi)注射和輸液，以及通過舌下、透皮、局部、經(jīng)粘膜(包括鼻部途徑)給藥，或者通過吸入，例如肺部吸入給藥。在具體實施方案中，優(yōu)選皮下和/或鼻部給藥途徑。
與腦室內(nèi)給藥的NPY和PYY一樣，當天然Y4選擇性肽PP中樞給藥時，可以誘導進食(可能是因為循環(huán)激素或外周給藥的肽化合物一般達不到的中樞受體激活)。因此，為避免增加進食，本發(fā)明的Y4選擇性激動劑優(yōu)選外周給藥。
這些受體激動劑可以分散在合適的運載體中給藥，或者它們可以合適的藥物或化妝品組合物形式給藥。這種組合物也屬于本發(fā)明的范圍內(nèi)。下文描述了合適的藥物組合物。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知這種組合物也適用于美容用途，或者知道通過利用合適的美容上可接受的賦形劑將這些組合物調(diào)整為化妝品組合物。
藥物組合物用于藥品或化妝品中的本發(fā)明受體激動劑(也稱為“化合物”)通常以藥物組合物形式存在，所述藥物組合物含有特定的化合物或其衍生物和一種或多種生理學或藥學上可接受的賦形劑。
這些化合物可通過任何常規(guī)給藥途徑，例如口服、含服、鼻部、眼部、肺部、局部經(jīng)皮、陰道、直腸、眼部、胃腸外(包括上述皮下、肌肉內(nèi)和靜脈內(nèi)等)途徑以各個體有效的劑量給予動物，包括哺乳動物，例如人。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道如何選擇合適的給藥途徑。如上所述，優(yōu)選胃腸外給藥途徑。在一具體實施方案中，這些受體激動劑皮下給藥和/或鼻部給藥。本領(lǐng)域熟知皮下注射易于自行實施。
醫(yī)生不難為每位患者單獨確定適合具體給藥途徑的組合物。標準制劑的專題論文描述了各種藥學上可接受的運載體及它們的制劑，例如E.W.Martin的《雷明頓藥物科學》(Remington′s Pharmaceutical Sciences)。
含有本發(fā)明化合物的藥物組合物可以是固體、半固體或液體組合物形式。就胃腸外應(yīng)用而言，這些組合物通常是液體組合物形式或是用于植入的半固體或固體形式。
可通過靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、鞘內(nèi)、硬膜外、腹膜內(nèi)或皮下注射或輸液給予作為無菌溶液或分散體的液體組合物。可將這些化合物制備成無菌固體組合物，在給藥前或給藥時用無菌水、鹽水或其它合適的無菌可注射介質(zhì)溶解或分散。
組合物的液體形式可以是溶液、乳液(包括納米乳液)、懸液、分散液、脂質(zhì)體組合物、混合物、噴劑或氣溶膠(后兩種類型特別適用于鼻部給藥)。
溶液或分散液的合適的介質(zhì)通常是水或藥學上可接受的溶劑，例如油(如芝麻油或花生油)或有機溶劑，例如丙醇或異丙醇。本發(fā)明的組合物可含有其它藥學上可接受的賦形劑，例如pH調(diào)節(jié)劑、滲透壓活性物質(zhì)(例如為了將組合物的等滲性調(diào)節(jié)到生理上可接受的水平)、粘度調(diào)節(jié)劑、懸浮劑、乳化劑、穩(wěn)定劑、防腐劑、抗氧化劑等。優(yōu)選的介質(zhì)是水。
鼻部給藥的組合物也可含有本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的合適的無刺激性運載體，例如聚乙二醇、乙氧基化四氫糠醇(glycofurol)等以及吸收增強劑(例如參見《雷明頓藥物科學》)。
就胃腸外給藥而言，在一個實施方案中，一般通過將所需純度、單位劑量可注射形式(溶液、懸液或乳液)的受體激動劑與藥學上可接受的賦形劑或運載體，即在所用劑量和濃度時對受者無毒并且與組合物的其它成分相容的物質(zhì)相混合來配制。
總體上，通過使受體激動劑與液體運載體或精細分級的固體運載體或二者均勻緊密地接觸來制備制劑。然后視需要將產(chǎn)品做成所需制劑的外形。運載體優(yōu)選胃腸外運載體，更優(yōu)選與受者血液等滲的溶液。這種運載體的例子包括水、鹽水、林格溶液和葡萄糖溶液。非水性運載體，例如不易揮發(fā)的油和油酸乙酯以及脂質(zhì)體也可用于本發(fā)明。由于本文所述肽的兩親性質(zhì)，合適的劑型也包括膠束制劑、脂質(zhì)體和包含一種或多種合適脂質(zhì)如磷脂的其它類型制劑。
優(yōu)選將這些受體激動劑懸浮在水性運載體中，例如pH約3.0-約8.0、優(yōu)選pH約3.5-約7.4、3.5-6.0或3.5-約5的等滲緩沖溶液。有用的緩沖物質(zhì)包括乙酸鹽、檸檬酸鹽、磷酸鹽、硼酸鹽、碳酸鹽，例如檸檬酸鈉-檸檬酸緩沖液。
這些組合物也可設(shè)計為在給藥后受控遞送或持續(xù)遞送所述受體激動劑以獲得頻率更低的給藥方案。通常認為每日1-2次的劑量方案可接受，但是本發(fā)明也包括其它給藥方案，例如頻率更高或更低。為實現(xiàn)持續(xù)遞送該受體激動劑，可采用含有例如脂質(zhì)或油的合適運載體從而在給藥部位形成長效形式而將受體激動劑緩慢釋放入循環(huán)系統(tǒng)，或者可采用植入物。該方面合適的組合物包括摻有受體激動劑的脂質(zhì)體和生物可降解顆粒。
在需要固體組合物的情況中，該固體組合物可以是片劑形式，例如常規(guī)藥片、泡騰片、包衣片、融解片或舌下片、藥丸、粉末、粒劑、顆粒、顆粒材料、固體分散體或固體溶液。
該組合物的半固體形式可以是咀嚼膠、軟膏、乳膏、涂抹劑、糊劑、凝膠或水凝膠。
本發(fā)明的藥物組合物的其它合適劑型可以是陰道栓(vagitories)、栓劑、膏劑、貼片、片劑、膠囊、小囊、錠劑、裝置等。
劑型可設(shè)計為以化合物自由或受控方式釋放，例如帶有合適包衣的片劑。
該藥物組合物可含有治療有效量的本發(fā)明化合物。
本發(fā)明組合物中本發(fā)明化合物的含量是，例如占該藥物組合物的約0.1-100％w/w。
藥物制劑配制的技術(shù)人員可用熟知的方法制備這些藥物組合物。
在這些藥物組合物中，所述化合物通常與藥學賦形劑，即治療上惰性物質(zhì)或運載體相混合。
所述運載體根據(jù)所需劑型和給藥途徑可采取各種形式。
藥學上可接受的賦形劑可以是，例如填充劑、粘合劑、崩解劑、稀釋劑、潤滑劑、溶劑、乳化劑、懸浮劑、穩(wěn)定劑、增強劑、調(diào)味劑、色素、pH調(diào)節(jié)劑、滯留劑、潤濕劑、表面活性劑、防腐劑、抗氧化劑等。詳見藥物手冊，例如《雷明頓藥物科學》或《藥物賦形劑手冊》(Pharmaceutical Excipient Handbook)。
以下實施例描述了本發(fā)明一些具體激動劑的制備方法與活性。
合成可通過固相肽合成采用自動肽合成儀或傳統(tǒng)的分步合成(bench synthesis)來合成本發(fā)明的肽激動劑。固體支持物可以是，例如氯三苯甲基(Cl)或Wang(OH)樹脂，二者均不難購得。這些樹脂的活性基團易于和N-Fmoc氨基酸的羧基反應(yīng)，從而使其與聚合物共價結(jié)合?？赏ㄟ^與哌啶接觸使結(jié)合在樹脂上的胺去保護。然后將第二種N-保護的氨基酸偶聯(lián)于樹脂-氨基酸。重復(fù)這些步驟直至獲得所需序列。合成結(jié)束時，結(jié)合在樹脂上的受保護肽可去保護并用三氟乙酸(TFA)從樹脂上切下。有助于將新的氨基酸偶聯(lián)于結(jié)合在樹脂上的氨基酸鏈的試劑例子有四甲基脲六氟磷酸(HATU)、O-(1H-苯并三唑-1-基)-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸(HBTU)，O-(1H-苯并三唑-1-基)-N，N，N′，N′-四甲基脲四氟硼酸(TBTU)、1H-羥基苯并三唑(HOBt)。
除固相化學方法外，通過溶液化學方法肽合成也是可行的。
例如，修飾肽鏈中氨基酸的側(cè)鏈氨基或羧基以引入上述GAG-結(jié)合基序或其它基序是不涉及此反應(yīng)的其它反應(yīng)活性側(cè)鏈基團的選擇性保護和去保護的簡單方法。
本文所稱的肽可用Fmoc化學方法用超過5倍量的試劑在PAL Peg-PS樹脂(酰胺樹脂(amide resin Applied Bioscience，Warrington，UK GEN913401)上通過固相合成來制備。整個偶聯(lián)過程通過HCTU，用DMF作為溶劑進行。用DMF配制的20％哌啶處理10-15分鐘以除去Fmoc。然而，這些肽也可用各種其它標準的肽合成方法來合成，例如除固相方法以外的tBOC化學法和溶液化學法。下文說明了合成方法，但本發(fā)明考慮的其它肽可通過類似的方法制備；合成[Cys2，D-Cys27]PP總體上，側(cè)基保護是標準的Fmoc(方法)，除了Arg＝Fmoc Arg(Pbf)-OHAsn，Gln＝Fmoc Asn(Trt)-OHThr，Ser，Asp，Glu，Tyr＝叔丁基Lys＝Fmoc Lys(tBoc)-OHAla-Ser 22-23＝Fmoc AlaSer擬脯氨酸(pseudoproline)在[Cys2，D-Cys27]PP例子中，采用以下特定的保護基團以獲得選擇性去保護Cys27＝Fmoc DLys(Trt)-OH采用Fmoc化學方法用超過5倍摩爾量的試劑在PAL Peg-PS樹脂(切割后可產(chǎn)生生物學上重要的羧酰胺基團的樹脂)上進行肽的固相合成。整個偶聯(lián)過程通過HCTU，用DMF作為溶劑進行。每步偶聯(lián)后，用DMF配制的20％哌啶處理10-15分鐘以除去Fmoc。每步后通過定量茚三酮試驗核查偶聯(lián)情況。在某些例子中可進行雙重偶聯(lián)。
然后將樹脂分為不同的批次以產(chǎn)生肽。
為進一步說明可用于制備本發(fā)明考慮的Y4選擇性激動劑的合成方法，給出了以下僅作為例子的方案合成[Lys13]PP2-36(SEQ ID No54)及其類似物下文描述了Y4選擇性肽[Lys13]PP3-36與其在Lys13的ε氨基上連有GAG-結(jié)合基序、血清蛋白結(jié)合基序或聚乙二醇部分的類似物的合成方法。
總體上，側(cè)基保護是標準的Fmoc(方法)，除了Arg＝Fmoc Arg(Pbf)-OHAsn，Gln＝Fmoc Asn(Trt)-OHThr，Ser，Asp，Glu，Tyr＝叔丁基Ala-Ser22-23＝Fmoc AlaSer擬脯氨酸在[Lys13]PP2-36的情況中，為獲得選擇性去保護，采用以下特定的保護基團Lys13＝Fmoc Lys(Dde)-OH肽采用Fmoc化學方法用超過5倍摩爾的試劑在PAL Peg-PS樹脂(切割后可產(chǎn)生生物學上重要的羧酰胺基團的樹脂)上進行固相合成。整個偶聯(lián)過程通過HCTU，用DMF作為溶劑進行。每步偶聯(lián)后，用DMF配制的20％哌啶處理10-15分鐘以除去Fmoc。每步后通過定量茚三酮試驗檢查偶聯(lián)情況。在特定的情況中可以進行雙重偶聯(lián)。
全長肽合成后，通過用DMF配制的2％肼處理15-20分鐘除去Lys13的ε氨基上的保護基團，而肽仍連接在樹脂上。
然后將樹脂分為不同的批次以產(chǎn)生未衍生的肽以及3種不同的基序修飾肽1.將[Lys13]PP2-36(“母體肽”)從樹脂上切下并通過95％三氟乙酸∶2.5％水∶2.5％三丙基硅烷處理2-3小時去保護。
通過反向HPLC純化肽Vydac300柱，在250mm×10mm柱中用30-80％緩沖液B梯度(緩沖液A＝用水配制的0.05％TFA；緩沖液B＝60％MeCN∶40％水∶0.05％TFA)洗脫20分鐘，流速2ml/分鐘。測定OD 215nm，收集含有特定肽的洗脫液并凍干。
通過質(zhì)譜、氨基酸分析，如果需要也通過氨基酸序列分析來確認肽結(jié)構(gòu)。
2.[N-(8-(8-γ谷氨?；被?辛?；被?-辛酰基)-[Lys13]PP2-36(SEQ IDNo55)-為連接血清白蛋白結(jié)合基序，除去保護性Dde基團，肽仍連接在樹脂上，用受保護的氨基辛酸(處理)兩次然后用受保護的γ谷氨酸(處理)，從而通過肽合成將8-(8-γ谷氨?；被?辛?；被?-辛?；鶊F連接到Lys13的游離ε氨基上。
按上文對“母體肽”的描述從樹脂上切下基序修飾的肽、去保護并純化。
3.熒光素-[N-{(Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Ala-Arg-Ala)3}-[Lys13]PP2-36(SEQ ID No39)-為了連接GAG-結(jié)合基序，在除去Dde基團后，用上述標準的Fmoc化學試劑，在仍連在樹脂上的肽上利用Lys13的游離ε氨基通過肽合成逐步構(gòu)建該基序以此方式連接的GAG結(jié)合序列是Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Ala-Arg-Ala-Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Ala-Arg-Ala-Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Ala-Arg-Ala。為體外和體內(nèi)分析的目的，給最終的GAG-結(jié)合序列的N-末端加入熒光素標記基團的5，6異構(gòu)體(NHS酯，超過10倍，72小時)。
按上文對“母體肽”的描述從樹脂上切下GAG結(jié)合基序修飾的肽、去保護并純化。
4.[N-{N’-(21-氨基-4，7，10，13，16，19-六氧雜二十一烷?；?}-γ谷氨酰基-Lys13]PP2-36(SEQ ID No40)-為了連接聚乙二醇部分與Y4選擇性肽，除去Dde基團后，在仍連在樹脂上的肽上利用Lys13的游離ε氨基通過肽合成，然后通過受保護的γ-谷氨酸連接受保護的21-氨基-4，7，10，13，16，19-六氧雜二十一烷酸。
按上文對“母體肽”的描述從樹脂上切下PEG化的肽、去保護并純化。
結(jié)構(gòu) 分子式 分子量 理論值測量值保留時間純度分析m/z m/z 分鐘 ％ 方法PP2-36C182H282N 4110.7 4109.2 18.1 96.2 C52O53S2[His34]-PPC186H286N 4222.1 704.7 704.6 14.7 95.6 B54O55S2[M+6H][M+6H][Pro34]-PYY C195H294N 4306.7 4279.6 13.5 91.6 A54O57[M+H][Ala1，Pro34]-C189H290N 4214.7 4188.3 13.1 95.0 APYY 54O56[M+H][Ala30，Pro34]- C192H288N 4264.7 4239.0 13.7 90.0 APYY 54O57[M+H][Glu4，Pro34] C194H290N 4306.7 4281.8 13.2 100 APYY 54O58[Arg26，Pro34]P C194H298N 4298.8 4300.1 13.4 98.9 AYY54O57[Ile28，Pro34]PY C195H294N 4306.8 4281.2 13.6 97.0 AY 54O57Met30，Pro34]PY C194H292N 4324.8 4298.5 13.2 96.9 AY 54O57S-PP 53O53S4[CLTRPRY-酰 C80H130N21868.21812.110.099.3A胺]×2(SEQ ID 8O20S2No18)[CTRPRY-酰胺] C68H108N21641.91584.9 8.9100 A×2(SEQ ID6O18S2No7)分析性HPLC方法A柱＝Vydac C18肽-蛋白質(zhì)柱，250×4.6mm緩沖液A＝水配制的0.05％TFA緩沖液B＝100％MeCN配制的0.05％TFA梯度＝20分鐘內(nèi)從0％B到60％B流速＝1.00mL/分鐘波長＝215nm質(zhì)譜＝用龍膽酸或□氰基羥基肉桂酸作為基質(zhì)的MALDI-TOF分析性HPLC方法B柱＝Hypersil ODS-2，250×4.6mm緩沖液A＝100％MeCN配制的0.1％TFA緩沖液B＝100％水配制的0.1％TFA梯度＝25分鐘內(nèi)從24％A到35％A流速＝1.00mL/分鐘波長＝220nm質(zhì)譜＝ESI[霧化器氣體流速1.5L/分鐘；CDL-20.0v；CDL溫度250℃；阻斷溫度(block temp)200℃；探針偏置(probe bias)+4.5kv；檢測器1.5kv；T.流速0.2mL/分鐘；B.濃度50％H20/50％CAN.]分析性HPLC方法C柱＝Vydac C18 218TP54，250×4.6mm
緩沖液A＝20mL MeCN和2mL水配制的TFA(總體積2000mL)緩沖液B＝2mL水配制的TFA(總體積2000mL)梯度＝27分鐘從25％B到75％B流速＝1.00mL/分鐘波長＝215nm注射體積＝10μL生物試驗和結(jié)果I.測定肽親和力和效力的體外試驗人Y2受體親和力試驗在競爭性結(jié)合試驗中利用結(jié)合于COS-7細胞中的125I-PYY來測定測試化合物對人Y2受體的親和力，所述COS-7細胞采用標準磷酸鈣轉(zhuǎn)染方法用人Y2受體瞬時轉(zhuǎn)染。
轉(zhuǎn)染1天后，轉(zhuǎn)染的COS-7細胞以40×103細胞/孔的密度轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)板，目標為結(jié)合5-8％的放射性配體。轉(zhuǎn)染兩天后，利用25pM的125I-PYY(Amersham，Little Chalfont，UK)在4℃進行競爭性結(jié)合試驗3小時。結(jié)合試驗在0.5mL補充了以下成分的50mM Hepes緩沖液，pH7.4中進行1mM CaCl2、5mM MgCl2和0.1％(w/v)牛血清白蛋白和100μg/ml桿菌肽。由于是在含有1μM未標記的PYY時(進行)結(jié)合，測定了非特異性結(jié)合。細胞用0.5ml冰冷卻的緩沖液洗滌兩次，加入0.5-1ml裂解緩沖液(8M脲，3M乙酸配制的2％NP40)，用γ計數(shù)器計算結(jié)合的放射活性。測定按一式兩份進行。用放射性配體在這些條件下達到穩(wěn)態(tài)結(jié)合。
利用標準的藥理學數(shù)據(jù)處理軟件，Prism3.0(graphPad Sofware，San Diego，USA)計算EC50值。
人Y4受體親和力試驗除了利用人Y4-轉(zhuǎn)化的COS-7細胞，其方案同Y2親和力試驗一樣，競爭性試驗采用125I-PP，而PP用于非特異性結(jié)合的測定。
人Y1受體親和力試驗除了采用人Y1-轉(zhuǎn)化的COS-7細胞和以1.5×106細胞/孔的密度轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)板外，其方案同Y2親和力試驗一樣，競爭性試驗采用125I-NPY，而NPY用于非特異性結(jié)合的測定。
人Y5受體親和力試驗除了采用人Y5-轉(zhuǎn)化的COS-7細胞和以5×105細胞/孔的密度轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)板外，其方案同Y2親和力試驗一樣，競爭性試驗采用125I-NPY，而NPY用于測定非特異性結(jié)合。
在以上親和力試驗中測試NPY、PYY、PYY3-36、PP和本發(fā)明的其它一些激動劑的結(jié)果見表1表1
人Y2受體效力試驗在COS-7細胞中進行劑量-反應(yīng)實驗以測定測試化合物對人Y2受體的效力，COS-7細胞用人Y2受體以及能確保Y2受體經(jīng)導致磷酸肌醇酯轉(zhuǎn)化增加Gq途徑偶聯(lián)的混雜G蛋白Gqi5瞬時轉(zhuǎn)染。
磷脂酰肌醇轉(zhuǎn)化-轉(zhuǎn)染一天后，將COS-7細胞與5μCi的[3H]-肌醇(Amersham，PT6-271)在補加了10％胎牛血清、2mM谷氨酰胺和0.01mg/ml慶大霉素/孔的1ml培養(yǎng)基中培育24小時。細胞用補加了140mM NaCl、5mMKCl、1mM MgSO4、1mM CaCl2、10mM葡萄糖、0.05％(w/v)牛血清的20mMHEPES，pH7.4的緩沖液洗滌兩次；用補加了10mM LiCl的0.5ml緩沖液37℃培育30分鐘。在37℃用各種濃度的肽刺激45分鐘后，用10％冰冷卻的高氯酸提取細胞，然后在冰上培育30分鐘。用HEPES緩沖液配制的KOH中和得到的上清液，在Bio-Rad AG 1-X8陰離子交換樹脂上純化產(chǎn)生的[3H]-磷酸肌醇酯并用β計數(shù)器計數(shù)。測定按一式兩份進行。利用標準的藥理學數(shù)據(jù)處理軟件，Prism3.0(graphPad Sofware，San Diego，USA)計算EC50值。
人Y4受體效力試驗除了采用人Y4-轉(zhuǎn)化的COS-7細胞以外，其方案同Y2效力試驗一樣。
人Y1受體效力試驗除了采用人Y1-轉(zhuǎn)化的COS-7細胞以外，其方案同Y2效力試驗一樣。
人Y5受體效力試驗除了采用人Y5-轉(zhuǎn)化的COS-7細胞以外，其方案同Y2效力試驗一樣。
在以上效力試驗中測定NPY、PYY、PYY3-36、PP和本發(fā)明四種激動劑的結(jié)果見表2表2
II.測定蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的體外試驗本發(fā)明許多肽的重要量度是蛋白質(zhì)穩(wěn)定性，特別是例如對酶降解的穩(wěn)定性，因為與例如PYY3-36相比，設(shè)計的這些肽具有增加的穩(wěn)定性，或者甚至與全長PYY和PP相比，其穩(wěn)定性增加。
PP-折疊的穩(wěn)定性-測定了所述肽對在能切割例如環(huán)形區(qū)的內(nèi)切肽酶降解的穩(wěn)定性，該區(qū)域如所述具有相對可彎曲性(O’Hare，M.和Schwartz，T.W.1990，在《生物活性物質(zhì)的降解生理學和病理生理學》(Degradation of BioactiveSubstancesPhysiology and Pathophysiology)中所述，J.Henriksen編，CRC Press，Boca Raton，F(xiàn)l.)。利用內(nèi)切蛋白酶Asp-N(Pierce)作為模型酶。該酶在Asp殘基的N-末端側(cè)，例如PP中殘基9和10(Asp)之間切割。根據(jù)生產(chǎn)商的說明，將這些肽于室溫在0.01M Tris/HCl，pH7.5的緩沖液中與有效劑量的內(nèi)切肽酶Asp-N一起培育24小時以上不同時間段后取樣。HPLC分析樣品并跟蹤這些肽隨時間推移的逐步降解情況。比較這些肽與PYY、PYY13-36和PP的穩(wěn)定性。
對氨肽酶的穩(wěn)定性-方法如上述內(nèi)切肽酶測定的，但采用氨肽酶N和二肽基肽酶IV。特別設(shè)計了能耐受這些氨肽酶的一些肽，例如PYY2-36、N-末端乙酰化的肽衍生物和在N-末端含有白蛋白結(jié)合部分的烷基化肽衍生物。比較這些肽與PYY、PYY3-36和PP的穩(wěn)定性。
III.測定糖胺聚糖(GAG)結(jié)合的體外試驗在體外試驗中利用固定的肝素，即肝素瓊脂糖作為親和基質(zhì)，使用HiTrap肝素-瓊脂糖柱(Amersham Pharmacia Biotech，Uppsala，Sweden)或肝素HPLC柱監(jiān)測測試化合物結(jié)合GAG的能力，用含2mM DTT和1mM MgEDTA的50mM磷酸鈉(pH7.3)配制的線性梯度0-0.5M NaCl洗脫50分鐘，流速1ml/分鐘。用緩沖液A配制的1M NaCl洗滌此柱51-55分鐘以再生。
IV.測定這些肽對食欲、食物攝入和體重作用的體內(nèi)研究Y4選擇性激動劑對小鼠急性食物攝入的作用采用ddy品系小鼠，34-37g和8-9周齡(Japan SLC，Shizuuoka，Japan)。小鼠分別養(yǎng)在12-小時白天-黑夜周期，7 AM開始日照的受控環(huán)境中(22℃，55％濕度)。實驗開始前(見下文)可隨意吃食和飲水。在實驗開始前的一星期中使小鼠適應(yīng)皮下注射。每只小鼠在實驗中使用一次。給藥之前用生理鹽水稀釋肽作皮下注射，100μL體積。結(jié)果表示為平均值+/-SE。方差分析后用Bonferroni試驗評估各組間差異。
在實際測試前16小時，小鼠不許進食但可隨意飲水，實驗在第二天上午10時開始。采用標準飲食(CLEA Japan，Inc.，Tokyo，Japan)，給藥后通過從最初預(yù)先測量過的食物減去未吃的食物來測定食物攝入并檢查食物的散落情況。各組8只小鼠接受鹽水、1μgPP2-36或10μgPP2-36測試化合物。
PP2-36(Seq ID No10)作為測試化合物的結(jié)果見圖2。
序列NPY (SEQ ID No1)H2N-Tyr-Pro-Ser-Lys-Pro-Asp-Asn-Pro-Gly-Glu-Asp-Ala-Pro-Ala-Glu-Asp-Met-Ala-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ala-Leu-Arg-His-Tyr-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-CONH2PYY(SEQ ID No2)H2N-Tyr-Pro-e-Lys-Pro-Glu-Ala-Pro-Gly-Glu-Asp-Ala-Ser-Pro-Glu-Glu-Leu-Asn-Arg-Tyr-Tyr-Ala-Ser-Leu-Arg-His-Tyr-Leu-Asn-Leu-Val-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-CONH2PP(SEQ ID No3)H2N-Ala-Pro-Leu-Glu-Pro-Val-Tyr-Pro-Gly-Asp-Asn-Ala-Thr-Pro-Glu-Gln-Met-A la-Gln-Tyr-Ala-Ala-Asp-Leu-Arg-Arg-Tyr-Ile-Asn-Met-Leu-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-CONH2[Cys2，DCys27]-PP SEQ ID. No4) [Lys28，Glu32]PP25-36(SEQ ID.No5)H2N-Ala-Pro-Leu-Glu-Pro-Val-Tyr-Pro-Gly-Asp-Asn-Ala-Thr-Pro-Glu-Gln-Met-Ala-Gln-Tyr-A la-Ala-Asp-Leu-Arg-Arg-Tyr-Lys-Asn-Met-Leu-Glu-Arg-Pro-Arg-Tyr-CONH2[GIu28，Lys32]PP25-36(SEQ ID.No6)H2N-Ala-Pro-Leu-Glu-Pro-Val-Tyr-Pro-Gly-Asp-Asn-Ala-Thr-Pro-Glu-Gln-Met-Ala-Gln-Tyr-Ala-Ala-Asp-Leu-Arg-Arg-Tyr-Glu-Asn-Met-Leu-Lys-Arg-Pro-Arg-Tyr-CONH2S-Cys-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-CONH2|S-Cys-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-CONH2(SEQ ID.No7)S-Cys-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-CONH2|S-Cys-Thr-Arg-His-Arg-Tyr-CONH2(SEQ ID.No8)[Cys2，Aoc5-24，Dcys27]-PP(SEQ ID.No9)S ———————— S| |H2N-Ala-Cys-Leu-Glu-Aoc5-24-Arg-Arg-(D-Cys)--Ile-Asn-Met-Leu-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-CONH2PP2-36(SEQ ID.No10)
H2N-Pro-Leu-Glu-Pro-Val-Tyr-Pro-Gly-Asp-Asn-Ala-Thr-Pro-Glu-Gln-Met-Ala-Gln-Tyr-Ala-Ala-Asp-Leu-Arg-Arg-Tyr-Ile-Asn-Met-Leu-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-CONH2[His34]-PP(SEQ ID.No11)H2N-Ala-Pro-Leu-Glu-Pro-Val-Tyr-Pro-Gly-Asp-Asn-Ala-Thr-Pro-Glu-Gln-Met-Ala-Gln-Tyr-Ala-Ala-Asp-Leu-Arg-Arg-Tyr-Ile-Asn-Met-Leu-Thr-Arg-His-Arg-Tyr-CONH2[Ala1，Pro34]-PYY(SEQ ID.No12)H2N-Ala-Pro-Ile-Lys-Pro-Glu-Ala-Pro-Gly-Glu-Asp-Ala-Ser-Pro-Glu-Glu-Leu-Asn-Arg-Tyr-Tyr-Ala-Ser-Leu-Arg-His-Tyr-Leu-Asn-Leu-Val-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-CONH2[Ala2，Pro34]-PYY(SEQ ID.No13)H2N-Tyr-Ala-Ile-Lys-Pro-Glu-Ala-Pro-Gly-Glu-Asp-Ala-Ser-Pro-Glu-Glu-Leu-Asn-Arg-Tyr-Tyr-Ala-Ser-Leu-Arg-His-Tyr-Leu-Asn-Leu-Val-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-CONH2[Glu4，Pro34]-PYY (SEQ ID.No14)H2N-Tyr-Pro-Ile-Glu-Pro-Glu-Ala-Pro-Gly-Glu-Asp-Ala-Ser-Pro-Glu-Glu-Leu-Asn-Arg-Tyr-Tyr-Ala-Ser-Leu-Arg-His-Tyr-Leu-Asn-Leu-Val-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-CONH2[Arg26，Pro34]-PYY (SEQ ID.No15)H2N-Tyr-Pro-Ile-Lys-Pro-Glu-Ala-Pro-Gly-Glu-Asp-Ala-Ser-Pro-Glu-Glu-Leu-Asn-Arg-Tyr-Tyr-Ala-Ser-Leu-Arg-Arg-Tyr-Leu-Asn-Leu-Val-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-CONH2[Ile28，Pro34]-PYY (SEQ ID.No16)H2N-Tyr-Pro-Ile-Lys-Pro-Glu-Ala-Pro-Gly-Glu-Asp-Ala-Ser-Pro-Glu-Glu-Leu-Asn-Arg-Tyr-Tyr-Ala-Ser-Leu-Arg-His-Tyr-Ile-Asn-Leu-Val-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-CONH2[Met30，Pro34]-PYY(SEQ ID.No17)H2N-Tyr-Pro-Ile-Lys-Pro-Glu-Ala-Pro-Gly-Glu-Asp-Ala-Ser-Pro-Glu-Glu-Leu-Asn-Arg-Tyr-Tyr-Ala-Ser-Leu-Arg-His-Tyr-Leu-Asn-Met-Val-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-CONH2S-Cys-Leu-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-CONH2|S-Cys-Leu-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-CONH2(SEQ ID.No18)S-Cys-Leu-Thr-Arg-His-Arg-Tyr-CONH2|S-Cys-Leu-Thr-Arg-His-Arg-Tyr-CONH2(SEQ ID.No19)[十四烷?；?Ala1]-PP(SEQ ID No20)CH2(CH2)12CONH-Ala-Pro-Leu-Glu-Pro-Val-Tyr-Pro-Gly-Asp-Asn-Ala-Thr-Pro-Glu-Gln-Met-Ala-Gln-Tyr-Ala-Ala-Asp-Leu-Arg-Arg-Tyr-Ile-Asn-Met-Leu-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-CONH2PP(SEQ ID No23)H2N-Ala-Pro-Leu-Glu-Pro-Val-Tyr-Pro-Gly-Asp-Asn-Ala-Thr-Pro-Glu-Gln-Met-Lys-Gln-Tyr-Ala-Ala-Asp-Leu-Arg-Arg-Tyr-Ile-Asn-Met-Leu-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-CONH2Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Ala-Arg-Ala-Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Ala-Arg-Ala-Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Ala-Arg-Ala-PP(SEQ ID No24)H2N-Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Ala-Arg-Ala-Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Ala-Arg-Ala-Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Ala-Arg-Ala-Ala-Pro-Leu-Glu-Pro-Val-Tyr-Pro-Gly-Asp-Asn-Ala-Thr-Pro-Glu-Gln-Met-Ala-Gln-Tyr-Ala-Ala-Asp-Leu-Arg-Arg-Tyr-Ile-Asn-Met-Leu-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-CONH2[Ala1，Glu4，Pro34r-PYY(SEQ ID No25)H2N-Ala-Pro-Ile-Glu-Pro-Glu-Ala-Pro-Gly-Glu-Asp-Ala-Ser-Pro-Glu-Glu-Leu-Asn-Arg-Tyr-Tyr-Ala-Ser-Leu-Arg-His-Tyr-Leu-Asn-Leu-Val-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-CONH2S-Cys-Leu-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-CONH2|S-Cys-Leu-Thr-Arg-His-Arg-Tyr-CONH2(SEQ ID No26)Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-PP(SEQ ID No27)H2N-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-LysAla-Pro-Leu-Glu-Pro-Val-Tyr-Pro-Gly-Asp-Asn-Ala-Thr-Pro-Glu-Gln-Met-Ala-Gln-Tyr-Ala-Ala-Asp-Leu-Arg-Arg-Tyr-Ile-Asn-Met-Leu-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-CONH2Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-[His34]PP(SEQ ID No28)H2N-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-LysAla-Pro-Leu-Glu-Pro-Val-Tyr-Pro-Gly-Asp-Asn-Ala-Thr-Pro-Glu-Gln-Met-Ala-Gln-Tyr-Ala-Ala-Asp-Leu-Arg-Arg-Tyr-Ile-Asn-Met-Leu-Thr-Arg-His-Arg-Tyr-CONH2S-Cys-[N-(N’-十六烷酰基)-γ谷氨?；鵠-Lys-Thr-Arg-Leu-Arg-TyrCONH2|S-Cys-Leu-Thr-Arg-Leu-Arg-Tyr-CONH2(SEQ ID.No29)NHCOCH2CH(COOH)NHCO(CH2)14CH3|S-CYs-Lys-Thr-Arg-Leu-Arg-TyrCONH2|S-Cys-Leu-Leu-Thr-Arh-Leu-Arg-Tyr-CONH2
N-乙酰基-PP(SEQ ID.No30)CH3CONH-Ala-Pro-Leu-Glu-Pro-Val-Tyr-Pro-Gly-Asp-Asn-Ala-Thr-Pro-Glu-Gln-Met-Ala-Gln-Tyr-Ala-Ala-Asp-Leu-Arg-Arg-Tyr-Ile-Asn-Met-Leu-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-CONH2N-(N’-十六烷?；?-γ谷氨?；?PP(SEQ ID No31)CH3(CH2)14CONHCH(COOH)CH2CH2CONH-Ala-Pro-Leu-Glu-Pro-Val-Tyr-Pro-Gly-Asp-Asn-Ala-Thr-Pro-Glu-Gln-Met-Ala-Gln-Tyr-Ala-Ala-Asp-Leu-Arg-Arg-Tyr-Ile-Asn-Met-Leu-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-CONH2[Nle17]PP(SEQ ID.No32)H2N-A1a-Pro-Leu-Glu-Pro-Val-Tyr-Pro-Gly-Asp-Asn-Ala-Thr-Pro-Glu-Gln-Nle-Ala-Gln-Tyr-Ala-Ala-Asp-Leu-Arg-Arg-Tyr-Ile-Asn-Met-Leu-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-CONH2[Nle30]PP(SEQ ID.No33)H2N-Ala-Pro-Leu-Glu-Pro-Val-Tyr-Pro-Gly-Asp-Asn-Ala-Thr-Pro-Glu-Gln-Met-Ala-Gln-Tyr-Ala-Ala-Asp-Leu-Arg-Arg-Tyr-Ile-Asn-Nle-Leu-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-CONH2[Nle17，Nle30]PP(SEQ ID.No34)H2N-Ala-Pro-Leu-Glu-Pro-Val-Tyr-Pro-Gly-Asp-Asn-Ala-Thr-Pro-Glu-Gln-Nle-Ala-Gln-Tyr-Ala-Ala-Asp-Leu-Arg-Arg-Tyr-Ile-Asn-Nle-Leu-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-CONH2[N-(N’-十六烷?；?-γ谷氨?；?Lys13，Nle30]PP(SEQ ID No35)CH3(CH2)14CONHCH(COOH)CH2CH2CONH|H2N-Ala-Pro-Leu-Glu-Pro-Val-Tyr-Pro-Gly-Asp-Asn-Ala-Lys-Pro-Glu-Gln-Met-Ala-Gln-Tyr-Ala-Ala-Asp-Leu-Arg-Arg-Tyr-Ile-Asn-Nle-Leu-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-CONH2[N-{(Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Ala-Arg-Ala)3}-Lys13]PP(SEQ ID No36)Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Ala-Arg-Ala)3CONH|H2N-Ala-Pro-Leu-Glu-Pro-Val-Tyr-Pro-Gly-Asp-Asn-Ala-Lys-Pro-Glu-Gln-Met-Ala-Gln-Tyr-Ala-Ala-Asp-Leu-Arg-Arg-Tyr-Ile-Asn-Met-Leu-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-CONH2[Nle17]PP2-36(SEQ ID.No37)H2N-Pro-Leu-Glu-Pro-Val-Tyr-Pro-Gly-Asp-Asn-Ala-Thr-Pro-Glu-Gln-Nle-Ala-Gln-Tyr-Ala-Ala-Asp-Leu-Arg-Arg-Tyr-Ile-Asn-Met-Leu-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-CONH2[Nle30]PP2-36(SEQ ID.No38)H2N-Pro-Leu-Glu-Pro-Val-Tyr-Pro-Gly-Asp-Asn-Ala-Thr-Pro-Glu-Gln-Met-Ala-Gln-Tyr-Ala-Ala-Asp-Leu-Arg-Arg-Tyr-Ile-Asn-Nle-Leu-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-CONH2PP2-36(SEQ ID No39)CH3(CH2)12CONHCH(COOH)CH2CH2CONH|H2N-Pro-Leu-Glu-Pro-Val-Tyr-Pro-Gly-Asp-Assn-Ala-Lys-Pso-Glu-Glu-Met-Ala-Gln-Tyr-Ala-Ala-Asp-Leu-Arg-Arg-Tyr-Ile-Asn-Met-Leu-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-CONH2[N-{(Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Ala-Arg-Ala)3}-Lys13]PP2-36(SEQ ID No40)Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Ala-Arg-Ala)3CONH|H2N-Pro-Leu-Glu-Pro-Val-Tyr-Pro-Gly-Asp-Asn-Ala-Lys-Pro-Glu-Gln-Met-Ala-Gln-Tyr-Ala-Ala-Asp-Leu-Arg-Arg-Tyr-Ile-Asn-Met-Leu-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-CONH2[Nle17，His34]-PP(SEQ ID.No41)H2N-Ala-Pro-Leu-Glu-Pro-Val-Tyr-Pro-Gly-Asp-Asn-Ala-Thr-Pro-Glu-Gln-Nle-Ala-Gln-Tyr-Ala-Ala-Asp-Leu-Arg-Arg-Tyr-Ile-Asn-Met-Leu-Thr-Arg-His-Arg-Tyr-CONH2[Nle30，His34]-PP(SEQ ID.No42)H2N-Ala-Pro-Leu-Glu-Pro-Val-Tyr-Pro-Gly-Asp-Asn-Ala-Thr-Pro-Glu-Gln-Met-Ala-Gln-Tyr-Ala-Ala-Asp-Leu-Arg-Arg-Tyr-Ile-Asn-Nle-Leu-Thr-Arg-His-Arg-Tyr-CONH2[Nle17，Nle30，His34]-PP(SEQ ID.No43)H2N-Ala-Pro-Leu-Glu-Pro-Val-Tyr-Pro-Gly-Asp-Asn-Ala-Thr-Pro-Glu-Gln-Nle-Ala-Gln-Tyr-Ala-Ala-Asp-Leu-Arg-Arg-Tyr-Ile-Asn-Nle-Leu-Thr-Arg-His-Arg-Tyr-CONH2[N-(N’-十四烷?；?-γ谷氨?；?Lys13，His34]-PP(SEQ ID No44)CH3(CH2)12CONHCH(COOH)CH2CH2CONH|H2N-Ala-Pro-Leu-Glu-Pro-Val-Tyr-Pro-Gly-Asp-Asn-Ala-Lys-Pro-Glu-Gln-Met-Ala-Gln-Tyr-Ala-Ala-Asp-Leu-Arg-Arg-Tyr-Ile-Asn-Met-Leu-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-CONH2[N-{(Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Ala-Arg-Ala)3}-Lys13，His34]PP(SEQ ID No45)(Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Ala-Arg-Ala)3CONH|H2N-Ala-Pro-Leu-Glu-Pro-Val-Tyr-Pro-Gly-Asp-Asn-Ala-Lys-Pro-Glu-Gln-Met-Ala-Gln-Tyr-Ala-A la-Asp-Leu-Arg-Arg-Tyr-Ile-Asn-Met-Leu-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-CONH2[Ala30，Pro34]-PYY(SEQ ID.No46)H2N-Tyr-Pro-Ile-Lys-Pro-Glu-Ala-Pro-Gly-Glu-Asp-Ala-Ser-Pro-Glu-Glu-Leu-Asn-Arg-Tyr-Tyr-Ala-Ser-Leu-Arg-His-Tyr-Leu-Asn-Ala-Val-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-CONH2-PYY(SEQ ID No47)CH3(CH2)12CONHCH(COOH)CH2CH2CONH|H2N-Tyr-Pro-Ile-Lys-Pro-Glu-Ala-Pro-Gly-Glu-Asp-Ala-Lys-Pro-Glu-Glu-Leu-Asn-Arg-Tyr-Tyr-Ala-Ser-Leu-Arg-His-Tyr-Leu-Asn-Ala-Val-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-CONH2[Cys2，N-(N’-十四烷?；?-γ谷氨?；?Lys13，DCys27]-PP(SEQ ID No48) S-Cys-Leu-Thr-Arg-Leu-Arg-Tyr-CONH2|S-Cys-Leu-Thr-Arg-Leu-Arg-Tyr-CONH2(SEQ ID.No49)S-Cys-Leu-Thr-Arg-Ile-Arg-Tyr-CONH2|S-Cys-Leu-Thr-Arg-Ile-Arg-Tyr-CONH2(SEQ ID.No50)[Leu34]-PP(SEQ ID.No51)H2N-Ala-Pro-Leu-Glu-Pro-Val-Tyr-Pro-Gly-Asp-Asn-Ala-Thr-Pro-Glu-Gln-Met-Ala-Gln-Tyr-Ala-Ala-Asp-Leu-Arg-Arg-Tyr-Ile-Asn-Met-Leu-Thr-Arg-Leu-Arg-Tyr-CONH2[Ile34]-PP(SEQ ID.No52)H2N-Ala-Pro-Leu-Glu-Pro-Val-Tyr-Pro-Gly-Asp-Asn-Ala-Thr-Pro-Glu-Gln-Met-Ala-Gln-Tyr-Ala-Ala-Asp-Leu-Arg-Arg-Tyr-Ile-Asn-Met-Leu-Thr-Arg-Ile-Arg-Tyr-CONH2[Phe34]-PP(SEQ ID.No53)H2N-Ala-Pro-Leu-Glu-Pro-Val-Tyr-Pro-Gly-Asp-Asn-Ala-Thr-Pro-Glu-Gln-Met-Ala-Gln-Tyr-Ala-Ala-Asp-Leu-Arg-Arg-Tyr-Ile-Asn-Met-Leu-Thr-Arg-Phe-Arg-Tyr-CONH2[Lys13]PP2-36(SEQ ID No54)H2N-Pro-Leu-Glu-Pro-Val-Tyr-Pro-Gly-Asp-Asn-Ala-Lys-Pro-Glu-Gln-Met-Ala-Gln-Tyr-Ala-Ala-Asp-Leu-Arg-Arg-Tyr-Ile-Asn-Met-Leu-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-CONH2[N-(8-(8-γ谷氨?；被?辛?；被?-辛?；?-[Lys13]PP2-36(SEQ ID No55)H2NCH(COOH)CH2CH2CONH(CH2)7CONH(CH2)7CONH|H2N-Pro-Leu-Glu-Pro-Val-Tyr-Pro-Gly-Asp-Asn-Ala-Lys-Pro-Glu-Gln-Met-Ala-Gln-Tyr-Ala-Ala-Asp-Leu-Arg-Arg-Tyr-Ile-Asn-Met-Leu-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-CONH2
附錄我們的名為“用于治療性干預(yù)的Y2選擇性受體激動劑”的待批國際專利申請描述了Y4選擇性激動劑在各種治療和美容中的應(yīng)用，例如用于治療肥胖癥和超重以及認為這些情況是影響因素的疾病。
該申請的Y2受體激動劑是以下的一種(a)選自PYY、NPY、PYY模擬物和NPY模擬物的PP-折疊肽或PP-折疊肽模擬物，這些肽或肽模擬物具有C-末端Y2受體識別氨基酸序列和不具有對應(yīng)于NPY的Tyr1的酪氨酸殘基和/或不具有對應(yīng)于NPY的Pro2的脯氨酸殘基和/或不具有對應(yīng)于NPY的Ser3的絲氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、蘇氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、甲硫氨酸、色氨酸、酪氨酸或苯丙氨酸殘基不具有對應(yīng)于NPY的Lys4的賴氨酸或精氨酸殘基和/或在對應(yīng)于NPY的Leu24位具有除亮氨酸以外的殘基和/或在對應(yīng)于NPY的Arg25位具有除精氨酸以外的殘基和/或在對應(yīng)于NPY的His26位具有除組氨酸以外的殘基和/或在對應(yīng)于NPY的Ile28位具有除異亮氨酸以外的殘基和/或在對應(yīng)于NPY的Asn29位具有天冬酰胺以外的殘基和/或在對應(yīng)于NPY的Leu30位具有除亮氨酸或甲硫氨酸以外的殘基；或(b)是選自PP和PP-模擬物的PP-折疊肽或PP-折疊肽模擬物，這些肽和肽模擬物具有C-末端Y2受體識別氨基酸序列以及在對應(yīng)于PP的Pro2位不具有脯氨酸殘基和/或在對應(yīng)于PP的Ile3位不具有亮氨酸殘基和/或在對應(yīng)于PP的Glu4位不具有谷氨酸殘基；或(c)(i)具有C-末端Y2受體識別氨基酸序列，該序列在N-末端與毗鄰所述Y2受體識別序列的N-末端處具有至少一個α螺旋轉(zhuǎn)角的兩親性氨基酸序列結(jié)構(gòu)域融合，所述轉(zhuǎn)角因分子內(nèi)共價鍵而束縛于螺旋構(gòu)型中，和(ii)，如果該激動劑具有類似于NPY或PYY的N-末端結(jié)構(gòu)，其具有一個或多個以上(a)所列出的修飾，以及如果所述激動劑具有類似于PP的N-末端結(jié)構(gòu)，其具有一個或多個以上(b)所列出的修飾。
總體上，該申請的(a)型激動劑是NPT或PYY的PP-折疊類似物，或NPY或PYY的PP-折疊模擬物，這些類似物或模擬物具有基本上降低它們對Y1受體效力的修飾，包括在對應(yīng)于NPY的Tyr1位具有除Tyr、Trp或Phe以外的殘基和/或在對應(yīng)于NPY的Pro2位具有除Pro以外的殘基和/或在對應(yīng)于NPY的Ser3位具有除Ile、Leu、Val、Phe、Trp、Tyr、Ser、Thr和Asn以外的殘基和/或在對應(yīng)于NPY的Lys4位具有除賴氨酸或精氨酸以外的殘基。這種激動劑包括具有和人NPY相同的序列的肽，除了在1位是除Tyr、Trp或Phe以外的殘基和/或在2位是除Pro以外的殘基和/或在3位是除Ile、Leu、Val、Phe、Trp、Tyr、Ser、Thr和Asn以外的殘基和/或在4位是除賴氨酸或精氨酸以外的殘基。
總體上，該申請的(b)型激動劑是PP的PP-折疊類似物，或PP的PP-折疊模擬物，這些類似物或模擬物具有基本上降低它們對Y4受體效力和增加它們對Y2受體效力的修飾。它們包括以下激動劑在34位具有Gln或結(jié)構(gòu)類似的殘基和在對應(yīng)于PP的Pro2位具有除Pro、Tyr、Phe和Trp的殘基/或在對應(yīng)于PP的Ile3位具有除Ile、Leu、Met和Val以外的殘基和/或?qū)?yīng)于PP的Glu4位具有除Glu或Asp以外的殘基。該類型的激動劑的一亞組由具有與人PP序列相同的序列的肽構(gòu)成，除了在34位是Gln殘基和在2位是除Pro、Tyr、Phe和Trp以外的殘基和/或在3位是除Ile、Leu、Met和Val以外的殘基和/在4位是除Glu或Asp以外的殘基。
該申請的(c)型激動劑的特征在于分子內(nèi)連接鍵，它既在天然NPY、PYY或PP肽中無等價物，又對應(yīng)于或用共價鍵替代非共價相互作用，并且包括含有與人PYY的序列的相同序列的那些激動劑，除了束縛螺旋轉(zhuǎn)角的分子內(nèi)連接鍵從兩親性結(jié)構(gòu)域的一個氨基酸殘基延伸至聚脯氨酸結(jié)構(gòu)域的N-末端部分的連接點。這種鍵可在5位和20位或8位和16位，特別是2位和27位的殘基之間，例如27位的D-Cys和2位的Cys之間的二硫鍵。在另一組(c)型激動劑中，束縛螺旋轉(zhuǎn)角的分子內(nèi)連接鍵在α螺旋結(jié)構(gòu)域的最后一個螺旋轉(zhuǎn)角中的殘基之間延伸，例如在螺旋轉(zhuǎn)角的Lys和Glu殘基之間形成的內(nèi)酰胺鍵，或在C-末端Y2識別氨基酸序列中的殘基和α螺旋結(jié)構(gòu)域的最后一個螺旋轉(zhuǎn)角中的殘基之間延伸。
該申請考慮的Y2選擇性的所有3種類型的激動劑具有C-末端Y2受體識別氨基酸序列。存在于本發(fā)明激動劑中的一組C-末端Y2受體識別氨基酸序列用-X-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-C(＝O)NR1R2表示其中X不是堿性或酸性殘基，R1和R1獨立為氫或C1-C6烷基，或其保守取代的變體，其中Thr被His或Asn取代和/或Tyr被Trp或Phe取代；和/或Arg被Lys取代。本發(fā)明優(yōu)選R1和R2可以均是氫。具體的C-末端Y2受體識別氨基酸序列是-Ile-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-C(＝O)NH2，另一序列是-Ala-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-C(＝O)NH2。
在所有的(a)、(b)或(c)三類中，含有Y2受體識別氨基酸序列的C-末端序列可在其N-末端與兩親性氨基酸序列結(jié)構(gòu)域融合，所述結(jié)構(gòu)域含有毗鄰所述表位N-末端的至少一個α螺旋轉(zhuǎn)角和至少兩個氨基酸的N-末端氨基序列，所述C-和N-末端氨基酸序列通過肽鍵與接頭基團相連，該接頭基團可以是任選含有一個或多個雙鍵或三鍵的直鏈或支鏈亞烷基基團。例如[Cys2，Aoc5-24，D-Cys27]PYY。
該申請?zhí)峒暗腨2選擇性激動劑的具體例子有PYY2-36NPY2-36[D-Ala1]PYY[D-Ala2]PYY[Ala28]PYY[Ala30]PYY[Ala31]PYY[Lys4，Gln34]PP[Cys2，D-Cys27]PYY[Cys2，D-Cys27]NPY[Cys2，Ile3，D-Cys27，Val31]NPY[Cys2，Aoc5-24，D-Cys27]NPY[Cys2，Ile3，Aoc5-24，D-Cys27，Val31]NPY[Lys28，Glu32]PYY25-36[Glu28，Lys32]PYY25-36[D-Ala2]PYY2-36[Lys4，Leu17，Gln34]PP[Lys4，Leu17，Leu30，Gln34]PPPP[Cys2，Ile3，D-Cys27，Leu28，Val31]NPY[Cys2，Ile3，Nle17，D-Cys27，Nle28，Val31]NPY[Cys2，Ile3，Aoc5-24，D-Cys27，Val31]NPY[Cys2，Lys13，D-Cys27]PYY
權(quán)利要求
1.除PP以外的Y4受體激動劑在制備用于治療對Y4受體激活起反應(yīng)的疾病的組合物中的應(yīng)用，所述激動劑對Y4受體的選擇性超過Y1和Y2受體，(a)所述激動劑是PP-折疊肽或PP-折疊肽模擬物，其具有(i)以-X-Thr-Arg-X3-Arg-Tyr-C(＝O)NR1R2表示的C-末端Y4受體識別氨基酸序列，其中R1和R1獨立為氫或C1-C6烷基，X是Val、Ile、Leu或Ala，X3是除Gln以外的殘基，或其保守性取代變體，其中Thr被His或Asn取代和/或Tyr被Trp或Phe取代；和/或Arg被Lys取代，和(ii)以H2N-X1-Pro-X2-(Glu或Asp)-表示的N-末端Y受體識別氨基酸序列，其中X1不存在或是任何氨基酸殘基，X2是Leu、Ile或Ser，或其保守性取代變體，或(b)所述激動劑含有如以上(i)所定義的C-末端Y4受體識別序列，所述序列與毗鄰所述六肽序列的N-末端處具有至少一個α螺旋轉(zhuǎn)角的兩親性氨基酸序列結(jié)構(gòu)域融合，所述轉(zhuǎn)角因分子內(nèi)共價鍵而束縛于螺旋構(gòu)型中，和任選的始于以上(ii)所定義的Y4受體識別氨基酸序列的N-末端序列；或(c)所述激動劑含有兩條共價連接的C-末端Y4受體識別氨基酸序列，其中每條含有以上(i)所定義序列的最后4個殘基。
2.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，在所述激動劑的C末端Y4受體識別氨基酸序列中，R1和R2各自是氫。
3.如權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其特征在于，在所述C-末端Y4受體識別序列中，殘基X3不是Asn。
4.如權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其特征在于，在所述C-末端Y4受體識別序列中，殘基X3不是Lys、Arg、Asp或Glu。
5.如權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其特征在于，在所述C-末端Y4受體識別序列中，殘基X3是Pro。
6.如權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其特征在于，在所述C-末端Y4受體識別序列中，殘基X3是His。
7.如權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其特征在于，在所述C-末端Y4受體識別序列中，X3是選自4-羥脯氨酸、氮雜環(huán)丁烷-2-羧酸、氮雜環(huán)丁烷-3-羧酸、氮雜脯氨酸和1-氨基環(huán)丁烷羧酸的非天然Pro類似物。
8.如以上權(quán)利要求中任一項所述的應(yīng)用，其特征在于，在所述激動劑的C-末端Y4受體識別序列中，殘基X是Leu。
9.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述激動劑含有以-XA-X-Thr-Arg-X3-Arg-Tyr-C(＝O)NR1R2表示的C-末端七肽，其中XA是非堿性和非酸性的，序列-X-Thr-Arg-X3-Arg-Tyr-C(＝O)NR1R2如權(quán)利要求1到8中任一項所定義。
10.如權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于，在所述激動劑的C-末端七肽序列中，所述非堿性和非酸性氨基酸殘基XA是Leu或Met。
11.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述激動劑含有以-XC-Tyr-XB-Asn-XA-X-Thr-Arg-X3-Arg-Tyr-C(＝O)NR1R2表示的C-末端十一肽，其中序列-XA-X-Thr-Arg-X3-Arg-Tyr-C(＝O)NR1R2如權(quán)利要求9或10所定義，XC是Arg或Lys，XB是Ile、Leu或Val。
12.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述激動劑含有C-末端十一肽序列-Arg-Tyr-Ile-Asn-(Leu或Met)-Leu-Thr-Arg-(Pro或His)-Arg-Tyr-C(＝O)NH2。
13.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述激動劑含有以-XC-Tyr-XB-Asn-XA-X-Thr-Arg-X3-Arg-Tyr-C(＝O)NR1R2表示的C-末端十一肽序列，其中序列-XA-X-Thr-Arg-X3-Arg-Tyr-C(＝O)NR1R2如權(quán)利要求9或10所定義，XC是His、Asn或Gln，XB是Ile、Leu或Val。
14.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述激動劑含有C-末端十一肽序列-His-Tyr-(Ile或Leu)-Asn-Leu-(Val/Ile)-Thr-Arg-(Pro或His)-Arg-Tyr-C(＝O)NH2。
15.如以上權(quán)利要求中任一項所述的應(yīng)用，其特征在于，在所述激動劑的N-末端Y4受體識別氨基酸序列中，當殘基X1存在時是Ala，或者不存在。
16.如以上權(quán)利要求中任一項所述的應(yīng)用，其特征在于，在所述激動劑的N-末端Y4受體識別氨基酸序列中，當殘基X2存在時是Leu、lle或Ser。
17.如權(quán)利要求1到14中任一項所述的應(yīng)用，其特征在于，具有N-末端序列H2N-Ala-Pro-Leu-Glu-或H2N-Pro-Leu-Glu-。
18.如以上權(quán)利要求中任一項所述的應(yīng)用，其特征在于，所述激動劑是含有N-末端Y4受體識別序列的(b)型，并且具有PP-折疊結(jié)構(gòu)，其中束縛螺旋轉(zhuǎn)角的分子內(nèi)連接鍵從兩親性結(jié)構(gòu)域的一個氨基酸殘基延伸至與反平行延伸至兩親性結(jié)構(gòu)域的PP-折疊肽聚脯氨酸結(jié)構(gòu)域相對應(yīng)的激動劑N-末端部分的連接點。
19.如權(quán)利要求18所述的應(yīng)用，其特征在于，在所述激動劑中，束縛螺旋轉(zhuǎn)角的分子內(nèi)連接鍵是二硫鍵或內(nèi)酰胺鍵。
20.如權(quán)利要求19所述的應(yīng)用，其特征在于，在所述激動劑中，其分子內(nèi)共價鍵是在α螺旋中的L-或D-Cys殘基和位于與反平行延伸至兩親性結(jié)構(gòu)域的PP-折疊肽聚脯氨酸結(jié)構(gòu)域相對應(yīng)的激動劑N-末端部分的Cys殘基之間形成的二二硫鍵。
21.如權(quán)利要求1到17中任一項所述的應(yīng)用，其特征在于，所述激動劑是(b)型，所述激動劑中束縛螺旋轉(zhuǎn)角的分子內(nèi)連接鍵是在所述螺旋轉(zhuǎn)角的Lys和Glu殘基之間、或在所述螺旋轉(zhuǎn)角的Lys或Glu殘基與C-末端Y4受體識別序列的Glu或Lys殘基之間形成的內(nèi)酰胺鍵。
22.如權(quán)利要求1到17中任一項所述的應(yīng)用，其特征在于，所述激動劑是(a)或(b)型并且具有如權(quán)利要求1或權(quán)利要求2到14中任一項所定義的C-末端六肽Y4受體識別序列和如權(quán)利要求1或權(quán)利要求15到17中任一項所定義的N-末端Y4受體識別序列，所述C-末端六肽序列在其N-末端與含有至少一個毗鄰該六肽序列N-末端的α螺旋轉(zhuǎn)角的兩親性氨基酸序列結(jié)構(gòu)域相融合，所述C-和N-末端氨基酸序列通過肽鍵分別與式NH2(CH2)nCO2H所示氨基酸的羧基和氨基相連，其中n是2到12。
23.如權(quán)利要求22所述的應(yīng)用，其特征在于，在所述激動劑中，n是6、7、8、9或10。
24.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述激動劑是(c)型，該兩條序列通過位于兩條序列中每一條的C末端至少4個殘基處的至少一對殘基之間的交聯(lián)鍵而連接。
25.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述激動劑是(c)型，該兩條序列通過位于兩條序列中每一條的C末端至少4個殘基處的兩對殘基之間的一對交聯(lián)鍵而連接。
26.如權(quán)利要求24或25所述的應(yīng)用，其特征在于，所述交聯(lián)鍵通過以下鍵構(gòu)成半胱氨酸殘基之間的二硫鍵，或一條序列中2，3-丙酸殘基的3-氨基與另一序列中殘基側(cè)鏈的羧基之間的酰胺鍵，或雙氨基酸HOOCCH(NH2)(CH2)1-6CH(NH2)COOH形成的-(CH2)1-6-鍵，其末端在每條序列中形成殘基。
27.如權(quán)利要求24到26中任一項所述的應(yīng)用，其特征在于，所述兩條共價連接的C-末端Y4受體識別氨基酸序列不同。
28.如權(quán)利要求24到27中任一項所述的應(yīng)用，其特征在于，所述兩條共價連接的序列含有如權(quán)利要求1到14中任一項所定義的C-末端序列的最后5個或最后6個殘基。
29.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述激動劑選自去保守取代的類似物。
30.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述激動劑選自[Cys2，DCys27]-PP(SEQ ID.No4)[Lys28，Glu32]PP25-36(SEQ ID.No5)[Glu28，Lys32]PP25-36(SEQ ID.No6)[Cys2，Aoc5-24，Dcys27]-PP(SEQ ID.No9)PP2-36(SEQ ID.No10)[His34]-PP(SEQ ID.No11)[Alal，Pro34]-PYY(SEQ ID.No12)[Ala2，Pro34]-PYY(SEQ ID.No13)[Glu4，Pro34]-PYY(SEQ ID.No14)[Arg26，Pro34]-PYY(SEQ ID.No15)[Ile28，Pro34]-PYY(SEQ ID.No16)[Met30，Pro34]-PYY(SEQ ID.No17)[Alal，Glu4，Pro34]-PYY(SEQ ID No25)[Nle17]PP(SEQ ID.No32)[Nle30]PP(SEQ ID.No33)[Nle17，Nle30]PP(SEQ ID.No34)[Nle17]PP2-36(SEQ ID.No37)[Nle30]PP2-36(SEQ ID.No38)[Nle17，His34]-PP(SEQ ID.No41)[Nle30，His34]-PP(SEQ ID.No42)[Nle17，Nle30，His34]-PP(SEQ ID.No43)[Ala30，Pro34]-PYY(SEQ ID.No46)[Leu34]-PP(SEQ ID.No51)[Ile34]-PP(SEQ ID.No52)[Phe34]-PP(SEQ ID.No53)[Lys13]PP2-36(SEQ ID No54)S-Cys-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-CONH2｜S-Cys-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-CONH2(SEQ ID.No7)S-Cys-Leu-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-CONH2｜S-Cys-Leu-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-CONH2(SEQ ID.No18)S-Cys-Leu-Thr-Arg-His-Arg-Tyr-CONH2｜S-Cys-Leu-Thr-Arg-His-Arg-Tyr-CONH2(SEQ ID.No19)S-Cys-Leu-Thr-Arg-Leu-Arg-Tyr-CONH2｜S-Cys-Leu-Thr-Arg-Leu-Arg-Tyr-CONH2(SEQ ID.No49)S-Cys-Leu-Thr-Arg-Ile-Arg-Tyr-CONH2｜S-Cys-Leu-Thr-Arg-Ile-Arg-Tyr-CONH2(SEQ ID.No50)和它們保守取代的類似物。
31.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述激動劑是PP2-36(SEQ IDNo10)、[His34]-PP(SEQ ID No11)或[Cys2，DCys27]-PP(SEQ ID No4)或它們保守取代的類似物。
32.在其N-末端酰化的PP在制備用于治療對Y4受體激活起反應(yīng)的疾病的組合物中的應(yīng)用。
33.如權(quán)利要求1到23、29或31中任一項所述的應(yīng)用，其特征在于，所述激動劑在其N-末端?；再x予耐受氨肽酶的活性。
34.如權(quán)利要求32或33所述的應(yīng)用，其特征在于，用具有2到24個碳原子的碳鏈在所述激動劑的N-末端?；?。
35.如權(quán)利要求34所述的應(yīng)用，其特征在于，所述激動劑在其N-末端乙酰化，例如N-乙?；?PP(SEQ ID.No30)。
36.經(jīng)修飾含有血清白蛋白結(jié)合基序、或糖胺聚糖(GAG)結(jié)合基序、或螺旋誘導基序的PP，或PEG化的PP在制備用于治療對Y4受體激活起反應(yīng)的疾病的組合物中的應(yīng)用。
37.如權(quán)利要求1到36中任一項所述的應(yīng)用，其特征在于，所述激動劑如任一權(quán)利要求所定義并且含有血清白蛋白激活基序、或糖胺聚糖(GAG)結(jié)合基序、或螺旋誘導基序，或被PEG化。
38.如權(quán)利要求36或37所述的應(yīng)用，其特征在于，在所述激動劑中，該血清白蛋白激活基序是親脂基團。
39.如權(quán)利要求38所述的應(yīng)用，其特征在于，在所述激動劑中，該親脂基團含有任選取代的、飽和或未飽和的、直鏈或支鏈的10到24個碳原子的烴基團。
40.如權(quán)利要求38或39所述的應(yīng)用，其特征在于，在所述激動劑中，該親脂基團是該激動劑骨架的側(cè)鏈或是其一部分。
41.如權(quán)利要求40所述的應(yīng)用，其特征在于，在所述激動劑中，該含有親脂基團的側(cè)鏈經(jīng)醚、硫醚、氨基、酯或酰胺鍵與骨架中的殘基相連。
42.如權(quán)利要求41所述的應(yīng)用，其特征在于，在所述激動劑中，所述含有親脂基團的側(cè)鏈選自CH3(CH2)nCH(COOH)NH-CO(CH2)2CONH-，其中n是9-15的一個整數(shù)，CH3(CH2)rCO-NHCH(COOH)(CH2)2CONH-，其中r是9-15的一個整數(shù)，和CH3(CH2)sCO-NHCH((CH2)2COOH)CONH-，其中s是9-15的一個整數(shù)，CH3(CH2)mCONH-，其中m是8-18的一個整數(shù)，-NHCOCH((CH2)2COOH)NH-CO(CH2)pCH3，其中p是10-16的一個整數(shù)，和-NHCO(CH2)2CH(COOH)NH-CO(CH2)qCH3，其中q是10-16的一個整數(shù)，CH3(CH2)nCH(COOH)NHCO-，其中n是9-15的一個整數(shù)，CH3(CH2)pNHCO-，其中p是10-18的一個整數(shù)，-CONHCH(COOH)(CH2)4NH-CO(CH2)mCH3，其中m是8-18的一個整數(shù)，-CONHCH(COOH)(CH2)4NH-COCH((CH2)2COOH)NH-CO(CH2)pCH3，其中p是10-16的一個整數(shù)，-CONHCH(COOH)(CH2)4NH-CO(CH2)2CH(COOH)NH-CO(CH2)qCH3，其中q是10-16的一個整數(shù)，和部分或完全氫化的環(huán)戊菲骨架。
43.如權(quán)利要求40所述的應(yīng)用，其特征在于，在所述激動劑中，該含有親脂基團的側(cè)鏈是?；嬖谟谠摷觿┕羌軞埢膫?cè)鏈中的氨基的C12、C14、C16或C18?；?。
44.如權(quán)利要求40所述的應(yīng)用，其特征在于，在所述激動劑中，該含有親脂基團的側(cè)鏈是?；嬖谟诩觿┕羌軞埢膫?cè)鏈中的氨基的十四烷?；?，例如N-(N’-十六烷酰基)-γ谷氨?；?PP(SEQ ID No31)[N-(N’-十六烷酰基)-γ谷氨?；?Lys13，Nle30]PP(SEQ ID No35)[N-(N’-十四烷酰基)-γ谷氨?；?Lys13]PP2-36(SEQ ID No39)[N-(N’-十四烷酰基)-γ谷氨?；?Lys13，His34]-PP(SEQ ID No44)[N-(N’-十四烷?；?-γ谷氨?；?Lys13，Ala30，Pro34]-PYY(SEQ ID No47)[Cys2，N-(N’-十四烷?；?-γ谷氨?；?Lys13，DCys27]-PP(SEQ ID No48)[N-(8-(8-γ谷氨?；被?辛酰基氨基)-辛?；?-[Lys13]PP2-36(SEQ ID No55)或S-Cys-[N-(N’-十六烷?；?-γ谷氨?；鵠-Lys]-Thr-Arg-Leu-Arg-Tyr-CONH2｜S-Cys-Leu-Thr-Arg-Leu-Arg-Tyr-CONH2(SEQ ID.No29)或它們保守取代的類似物。
45.如權(quán)利要求38所述的應(yīng)用，其特征在于，所述激動劑是[十四烷酰基-Alal]-PP(SEQ ID No.20)或[十四烷?；?Alal，His34]-PP(SEQ ID No21)或它們保守取代的類似物。
46.如權(quán)利要求36或37所述的應(yīng)用，其特征在于，在所述激動劑中，該GAG結(jié)合基序是氨基酸序列，該序列是該激動劑骨架的側(cè)鏈或是其一部分。
47.如權(quán)利要求46所述的應(yīng)用，其特征在于，在所述激動劑中，該GAG結(jié)合基序含有氨基酸序列XBBXBX和/或XBBBXXBX，其中B是堿性氨基酸殘基，X是任何氨基酸殘基。
48.如權(quán)利要求46或47所述的應(yīng)用，其特征在于，在所述激動劑中，該GAG-結(jié)合基序是多聯(lián)體或枝狀體。
49.如權(quán)利要求46到48中任一項所述的應(yīng)用，其特征在于，該GAG-結(jié)合基序是通過在多聯(lián)體GAG-結(jié)合基序的C-末端和[Lys18，His34]-PP(SEQ IDNo22)或[Lys18]PP(SEQ ID No23)的ε氨基之間形成的酰胺鍵偶聯(lián)的Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Ala-Arg-Ala-Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Ala-Arg-Ala。
50.如權(quán)利要求46到48中任一項所述的應(yīng)用，其特征在于，該GAG-結(jié)合基序是通過在多聯(lián)體GAG-結(jié)合基序的C-末端和[Lys18，His34]-PP(SEQ IDNo22)或[Lys18]PP(SEQ ID No23)的ε氨基之間形成的酰胺鍵偶聯(lián)的Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Ala-Arg-Ala-Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Ala-Arg-Ala-Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Ala-Arg-Ala。
51.如權(quán)利要求36或37所述的應(yīng)用，其特征在于，在所述激動劑中，該GAG-結(jié)合基序直接或經(jīng)接頭基團與該激動劑的C-或N-末端共價偶聯(lián)。
52.如權(quán)利要求51所述的應(yīng)用，其特征在于，在所述激動劑中，該GAG-結(jié)合基序直接或經(jīng)接頭基團與該激動劑的N-末端共價偶聯(lián)。
53.如權(quán)利要求51或52所述的應(yīng)用，其特征在于，在所述激動劑中，該GAG-結(jié)合基序含有氨基酸序列XBBXBX和/或XBBBXXBX，其中B是堿性氨基酸殘基，X是任何氨基酸殘基。
54.如權(quán)利要求51或52所述的應(yīng)用，其特征在于，在所述激動劑中，該GAG-結(jié)合基序含有氨基酸序列[XBBBXXBX]n，其中n是1到5，B是堿性氨基酸殘基，X是任何氨基酸殘基。
55.如權(quán)利要求36所述的應(yīng)用，其特征在于，所述肽是Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Ala-Arg-Ala-Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Ala-Arg-Ala-Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Ala-Arg-Ala-PP(SEQ ID No24)[N-{(Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Ala-Arg-Ala)3}-Lys13]PP(SEQ ID No36)[N-{(Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Ala-Arg-Ala)3}-Lys13]PP2-36(SEQ ID No40)或[N-{(Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Ala-Arg-Ala)3}-Lys13，His34]PP(SEQ ID No45)
56.如權(quán)利要求36或37所述的應(yīng)用，其特征在于，在所述激動劑中，該PEG是分子量最高約20kDa的聚乙二醇或聚環(huán)氧乙烷。
57.如權(quán)利要求36或37所述的應(yīng)用，其特征在于，所述激動劑是PP或[His34]PP(SEQ ID No11)。
58.如權(quán)利要求36或37所述的應(yīng)用，其特征在于，在所述激動劑中，該螺旋誘導肽是直接或經(jīng)接頭基團與該激動劑的C-或N-末端共價偶聯(lián)。
59.如權(quán)利要求36或37所述的應(yīng)用，其特征在于，在所述激動劑中，該螺旋誘導肽是直接或經(jīng)接頭基團與該激動劑的N-末端共價偶聯(lián)。
60.如權(quán)利要求58或59所述的應(yīng)用，其特征在于，所述螺旋誘導肽具有4到20個選自下列的氨基酸殘基Ala、Leu、Ser、Thr、Tyr、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、Arg、His、Met、Orn和式-NH-C(R1)(R2)-CO-所示的氨基酸殘基，其中R1是氫，R2任選是取代的C1-C6烷基、苯基或苯基甲基，或者R1和R2與和它們相連的C原子結(jié)合形成環(huán)戊基、環(huán)己基或環(huán)庚基環(huán)。
61.如權(quán)利要求58或59所述的應(yīng)用，其特征在于，所述螺旋誘導肽含有4、5或6個Lys殘基。
62.如權(quán)利要求59所述的應(yīng)用，其特征在于，所述激動劑是Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-PP(SEQ ID No27)或Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-[His34]PP(SEQ ID No28)。
63.如權(quán)利要求38到44、46到48或56中任一項所述的應(yīng)用，其特征在于，在所述激動劑中，該血清白蛋白結(jié)合基序、或GAG結(jié)合基序、或PEG基團是骨架碳的側(cè)鏈或形成部分骨架碳的側(cè)鏈，所述骨架碳對應(yīng)于以下任何PYY或PP位置1、3、6、7、10、11、12、13、15、16、17、18、19、21、22、23、25、26、28、29、30和32，或?qū)?yīng)于以下任何NPY位置1、3、6、7、10、11、12、14、15、16、17、18、19、21、22、23、25、26、28、29、30和32。
64.一種如上述任一權(quán)利要求所定義的對Y4受體的選擇性超過Y1和Y2受體的Y受體激動劑。
65.一種選自以下的對Y4受體的選擇性超過Y1和Y2受體的Y受體激動劑[Cys2，DCys27]-PP(SEQ ID.No4)[Lys28，Glu32]PP25-36(SEQ ID.No5)[Glu28，Lys32]PP25-36(SEQ ID.No6)[Cys2，Aoc5-24，Dcys27]-PP(SEQ ID.No9)PP2-36(SEQ ID.No10)[His34]-PP(SEQ ID.No11)[Ala1，Pro34]-PYY(SEQ ID.No12)[Ala2，Pro34]-PYY(SEQ ID.No13)[Glu4，Pro34]-PYY(SEQ ID.No14)[Arg26，Pro34]-PYY(SEQ ID.No15)[Ile28，Pro34]-PYY(SEQ ID.No16)[Met30，Pro34]-PYY(SEQ ID.No17)[Alal，Glu4，Pro34]-PYY(SEQ ID No25)[Nle17]PP(SEQ ID.No32)[Nle30]PP(SEQ ID.No33)[Nle17，Nle30]PP(SEQ ID.No34)[Nle17]PP2-36(SEQ ID.No37)[Nle30]PP2-36(SEQ ID.No38)[Nle17，His34]-PP(SEQ ID.No41)[Nle30，His34]-PP(SEQ ID.No42)[Nle17，Nle30，His34]-PP(SEQ ID.No43)[Ala30，Pro34]-PYY(SEQ ID.No46)[Leu34]-PP(SEQ ID.No51)[Ile34]-PP(SEQ ID.No52)[Phe34]-PP(SEQ ID.No53)[Lys13]PP2-36(SEQ ID No54)S-Cys-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-CONH2｜S-Cys-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-CONH2(SEQ ID.No7)S-Cys-Leu-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-CONH2｜S-Cys-Leu-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-CONH2(SEQ ID.No18)S-Cys-Leu-Thr-Arg-His-Arg-Tyr-CONH2｜S-Cys-Leu-Thr-Arg-His-Arg-Tyr-CONH2(SEQ ID.No19)S-Cys-Leu-Thr-Arg-Leu-Arg-Tyr-CONH2｜S-Cys-Leu-Thr-Arg-Leu-Arg-Tyr-CONH2(SEQ ID.No49)S-Cys-Leu-Thr-Arg-Ile-Arg-Tyr-CONH2｜S-Cys-Leu-Thr-Arg-Ile-Arg-Tyr-CONH2(SEQ ID.No50)N-乙酰基-PP(SEQ ID.No30)N-(N’-十六烷?；?-γ谷氨?；?PP(SEQ ID No31)[N-(N’-十六烷?；?-γ谷氨酰基-Lys13，Nle30]PP(SEQ ID No35)[N-(N’-十四烷酰基)-γ谷氨?；?Lys13]PP2-36(SEQ ID No39)[N-(N’-十四烷?；?-γ谷氨?；?Lys13，His34]-PP(SEQ ID No44)[N-(N’-十四烷酰基)-γ谷氨?；?Lys13，Ala30，Pro34]-PYY(SEQ ID No47)[Cys2，N-(N’-十四烷?；?-γ谷氨酰基-Lys13，DCys27]-PP(SEQ ID No48)[N-(8-(8-γ谷氨酰基氨基-辛?；被?-辛?；?-[Lys13]PP2-36(SEQ ID No55)S-Cys-[N-(N’-十六烷?；?-γ谷氨?；鵠-Lys-Thr-Arg-Leu-Arg-Tyr-CONH2｜S-Cys-Leu-Thr-Arg-Leu-Arg-Tyr-CONH2(SEQ ID.No29)[N-{(Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Ala-Arg-Ala)3}-Lys13]PP(SEQ ID No36)[N-{(Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Ala-Arg-Ala)3}-Lys13]PP2-36(SEQ ID No40)[N-{(Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Ala-Arg-Ala)3}-Lys13，His34]PP(SEQ ID No45)和它們保守取代的類似物。
66.一種選自PP2-36(SEQ ID No10)、[His34]-PP(SEQ ID No11)或[Cys2，DCys27]-PP(SEQ ID No4)和它們保守取代的類似物的對Y4受體的選擇性超過Y1和Y2受體的Y受體激動劑。
67.一種治療對Y4受體激活起反應(yīng)的疾病的方法，所述方法包括給予需要治療的患者有效量的權(quán)利要求1到66中任一項所定義的Y4選擇性受體激動劑。
68.如權(quán)利要求1到63所述的應(yīng)用或如權(quán)利要求67所述的方法，其特征在于，所治療的疾病是一種顯示需要調(diào)節(jié)能量攝入或能量代謝、控制腸分泌、降低胃腸道能動性或降低胃排空率的疾病。
69.如權(quán)利要求68所述的應(yīng)用或方法，其特征在于，所治療的疾病是肥胖癥或超重，或認為肥胖或超重是影響因素的疾病。
70.如權(quán)利要求69所述的應(yīng)用或方法，其特征在于，所治療的疾病是炎性腸病、食欲過勝、神經(jīng)性貪食、X綜合征(代謝綜合征)、糖尿病、2型糖尿病或非胰島素依賴型糖尿病(NIDDM)、高血糖、胰島素耐受、葡萄糖耐受不良、心血管疾病、高血壓、動脈粥樣硬化、冠狀動脈病、心肌梗塞、周圍血管病、中風、血栓栓塞性疾病、高膽固醇血癥、高脂血癥、膽囊疾病、骨關(guān)節(jié)炎、睡眠呼吸暫停、生殖性疾病如多囊性卵巢綜合征，或乳腺癌、前列腺癌或結(jié)腸癌。
71.如權(quán)利要求67或68所述的方法，其特征在于，所述激動劑給予禁食狀態(tài)的患者。
72.如權(quán)利要求1到63任一項所述的應(yīng)用或如權(quán)利要求66所述的方法，其特征在于，所治療的疾病是腹瀉或腸造口術(shù)的過度分泌。
73.如權(quán)利要求1到63任一項所述的應(yīng)用或如權(quán)利要求66所述的方法，其特征在于，所治療的疾病是惡心或嘔吐。
74.PP在制備治療惡心或嘔吐的組合物中的應(yīng)用。
75.如權(quán)利要求73或74所述的應(yīng)用或方法，其特征在于，所治療的惡心或嘔吐疾病是隨另一種藥物治療而出現(xiàn)的，或預(yù)期隨另一種藥物治療而出現(xiàn)。
76.如權(quán)利要求68到75中任一項所述的應(yīng)用或方法，其特征在于，所述Y4選擇性受體激動劑含有GAG-結(jié)合基序。
77.如權(quán)利要求68到75中任一項所述的應(yīng)用或方法，其特征在于，所述Y4選擇性受體激動劑含有血清結(jié)合基序。
78.如權(quán)利要求68到75中任一項所述的應(yīng)用或方法，其特征在于，所述Y4選擇性受體激動劑被PEG化。
79.如權(quán)利要求67-78中任一項所述的方法，其特征在于，所述激動劑經(jīng)胃腸外途徑給予患者，包括皮下、肌肉內(nèi)、靜脈內(nèi)、鼻部、透皮或含服給藥。
全文摘要
對Y4受體的選擇性超過Y1和Y2受體的Y4受體激動劑可用于治療對Y4受體激活起反應(yīng)的疾病。這些Y4選擇性激動劑(a)是具有如說明書中所述的C－和N－末端序列特征的PP－折疊肽或PP－折疊肽模擬物，或(b)具有共價分子內(nèi)鍵，或(c)含有兩個共價連接的C－末端Y4受體識別氨基酸序列，其中每條含有(a)型激動劑的C－末端識別序列的最后4個殘基。
文檔編號A61P3/04GK1953763SQ200580008721
公開日2007年4月25日 申請日期2005年3月17日 優(yōu)先權(quán)日2004年3月17日
發(fā)明者T·施瓦茨 申請人:7Tm制藥聯(lián)合股份有限公司