專利名稱：Fc區(qū)變體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及多肽Fc區(qū)變體和編碼Fc區(qū)變體的寡核苷酸。具體而言，本發(fā)明提供包含新Fc區(qū)變體的組合物、鑒定有用Fc區(qū)變體的方法和利用Fc區(qū)變體的方法(例如用于治療疾病)。
背景技術(shù)：
人存在五種類型免疫球蛋白。已知這些種類是IgG、IgM、IgD、IgA和IgE，并且是基于重鏈基因同種型(分別為γ、μ、δ、α和ε)區(qū)分的。最常見(jiàn)的同種型是IgG，由兩條完全相同的重鏈多肽和兩條完全相同的輕鏈多肽組成(見(jiàn)圖1)。兩條重鏈通過(guò)二硫鍵彼此共價(jià)連接，每條輕鏈通過(guò)一個(gè)二硫鍵與一條重鏈連接(見(jiàn)圖1)。每條重鏈含大約445個(gè)氨基酸殘基，每條輕鏈含大約215個(gè)氨基酸殘基。
每條重鏈含有四個(gè)明顯的結(jié)構(gòu)域，通常稱作可變結(jié)構(gòu)域(VH)、重鏈恒定結(jié)構(gòu)域1(CH1)、重鏈恒定結(jié)構(gòu)域2(CH2)和重鏈恒定結(jié)構(gòu)域3(CH3)(見(jiàn)圖1)。CH1和CH2結(jié)構(gòu)域由賦予Ig柔性的鉸鏈區(qū)(結(jié)構(gòu)域間部分)連接。每條輕鏈含有兩個(gè)明顯的結(jié)構(gòu)域，通常稱作可變輕鏈(VL)和恒定輕鏈(CL)。
重鏈和輕鏈的可變區(qū)直接結(jié)合抗原并決定Ig多樣性和特異性。每個(gè)VL和VH具有三個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)(CDR，也稱高變區(qū))。當(dāng)VL和VH通過(guò)重鏈和輕鏈的相互作用相遇對(duì)，則CDR形成接觸抗原的結(jié)合表面。
所述的可變區(qū)參與抗原結(jié)合，而重鏈恒定結(jié)構(gòu)域(主要是CH2和CH3)參與非抗原結(jié)合性功能。該區(qū)域通常稱作Fc區(qū)，具有許多重要功能。例如Fc區(qū)結(jié)合補(bǔ)體，這可啟動(dòng)吞噬作用或補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒作用(CDC)。Fc區(qū)還結(jié)合Fc受體，這可啟動(dòng)吞噬作用或抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用(ADCC)。Fc區(qū)還具有輔助維持循環(huán)中免疫球蛋白的作用以及與常用于純化免疫球蛋白的A蛋白相互作用。
近來(lái)人們已經(jīng)致力于提高抗體的免疫原性品質(zhì)和抗原結(jié)合特征。例如，已開(kāi)發(fā)了用于免疫治療的單克隆抗體、嵌合抗體和人源化抗體。已批準(zhǔn)用于人免疫治療的抗體實(shí)例及對(duì)應(yīng)的疾病包括RITUXAN(淋巴瘤)、SYNAGIS(傳染病)、ZENEPAX(腎移植)、REMICADE(克隆病和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎)、HERCEPTIN(乳腺癌)和EDRECOLOMAB(結(jié)腸癌)。然而，許多抗體已進(jìn)入臨床試驗(yàn)但因缺乏功效或者其他相關(guān)問(wèn)題而未獲批準(zhǔn)。
為改善功效和加速批準(zhǔn)另外的治療性抗體，所需要的是組合物及用于改變Fc區(qū)以產(chǎn)生具有改善特性的變體多肽的方法。
發(fā)明簡(jiǎn)述本發(fā)明提供多肽Fc區(qū)變體和編碼Fc區(qū)變體的寡核苷酸及其部分。特別地，本發(fā)明提供包含新Fc區(qū)變體的組合物、鑒定有用Fc區(qū)變體的方法和利用Fc區(qū)變體的方法。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供組合物，其包含具有至少一部分Fc區(qū)的母體多肽變體(或編碼該變體的核酸序列)，其中在效應(yīng)細(xì)胞存在時(shí)，變體比母體多肽更有效地介導(dǎo)抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用(ADCC)，并且變體在Fc區(qū)至少包含247位置處的一處氨基酸修飾。在特定實(shí)施方案中，變體包含抗體(例如抗CD20抗體)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，氨基酸修飾是P247L。
在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明提供組合物，其包含具有至少一部分Fc區(qū)的母體多肽變體(或編碼該變體的核酸序列)，其中在效應(yīng)細(xì)胞存在時(shí)，變體比母體多肽更有效地介導(dǎo)抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用(ADCC)，并且變體在Fc區(qū)至少包含的251位置處的一處氨基酸修飾。在特定實(shí)施方案中，變體包含抗體(例如抗CD20抗體)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，氨基酸修飾是L251F。
在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明提供組合物，其包含具有至少一部分Fc區(qū)的母體多肽變體(或編碼該變體的核酸序列)，其中在效應(yīng)細(xì)胞存在時(shí)，變體比母體多肽更有效地介導(dǎo)抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用(ADCC)，并且變體在Fc區(qū)內(nèi)至少包含256位置處的一處氨基酸修飾。在特定實(shí)施方案中，變體包含抗體(例如抗CD20抗體)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，氨基酸修飾是T256M。
在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明提供組合物，其包含具有至少一部分Fc區(qū)的母體多肽變體(或編碼該變體的核酸序列)，其中在效應(yīng)細(xì)胞存在時(shí)，變體比母體多肽更有效地介導(dǎo)抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用(ADCC)，并且變體在Fc區(qū)內(nèi)至少包含268位置處的一處氨基酸修飾。在特定實(shí)施方案中，變體包含抗體(例如抗CD20抗體)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，氨基酸修飾是H268E。
在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明提供組合物，其包含具有至少一部分Fc區(qū)的母體多肽變體(或編碼該變體的核酸序列)，其中在效應(yīng)細(xì)胞存在時(shí)，變體比母體多肽更有效地介導(dǎo)抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用(ADCC)，并且變體在Fc區(qū)內(nèi)至少包含280位置處的一處氨基酸修飾。在特定實(shí)施方案中，變體包含抗體(例如抗CD20抗體)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，氨基酸修飾是D280A。
在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明提供組合物，其包含具有至少一部分Fc區(qū)的母體多肽變體(或編碼該變體的核酸序列)，其中在效應(yīng)細(xì)胞存在時(shí)，變體比母體多肽更有效地介導(dǎo)抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用(ADCC)，并且變體在Fc區(qū)內(nèi)至少包含330位置處的一處氨基酸修飾。在特定實(shí)施方案中，變體包含抗體(例如抗CD20抗體)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，氨基酸修飾是A330K。
在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明提供組合物，其包含具有至少一部分Fc區(qū)的母體多肽變體(或編碼該變體的核酸序列)，其中在效應(yīng)細(xì)胞存在時(shí)，變體比母體多肽更有效地介導(dǎo)抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用(ADCC)，并且變體在Fc區(qū)內(nèi)至少包含332位置處的一處氨基酸修飾。在特定實(shí)施方案中，變體包含抗體(例如抗CD20抗體)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，氨基酸修飾是I332E。
在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明提供組合物，其包含具有至少一部分Fc區(qū)的母體多肽變體(或編碼該變體的核酸序列)，其中在效應(yīng)細(xì)胞存在時(shí)，變體比母體多肽更有效地介導(dǎo)抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用(ADCC)，并且變體在Fc區(qū)內(nèi)至少包含339位置處的一處氨基酸修飾。在特定實(shí)施方案中，變體包含抗體(例如抗CD20抗體)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，氨基酸修飾是A339T。
在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明提供組合物，其包含具有至少一部分Fc區(qū)的母體多肽變體(或編碼該變體的核酸序列)，其中在全血測(cè)定法中變體比母體多肽更有效地介導(dǎo)靶細(xì)胞(如B細(xì)胞)減少，并且該變體在Fc區(qū)內(nèi)至少包含378位置處的一處氨基酸修飾。在特定實(shí)施方案中，變體包含抗體(例如抗CD20抗體)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，氨基酸修飾是A378D。
在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明提供組合物，其包含具有至少一部分Fc區(qū)的母體多肽變體(或編碼該變體的核酸序列)，其中在效應(yīng)細(xì)胞存在時(shí)，變體比母體多肽更有效地介導(dǎo)抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用(ADCC)，并且變體在Fc區(qū)內(nèi)至少包含440位置處的一處氨基酸修飾。在特定實(shí)施方案中，變體包含抗體(例如抗CD20抗體)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，氨基酸修飾是S440Y。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含在SEQ ID NO15中所示序列的肽(含有P247L氨基酸修飾)。在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明提供編碼帶P247L修飾的CH2區(qū)的核酸序列(例SEQ ID NO40)。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供編碼包含SEQ ID NO15的帶P247L修飾的CH2區(qū)的氨基酸序列。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供具有在SEQ ID NO16中所示序列的肽(含有L251F氨基酸修飾)。在另外的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供編碼帶L251F修飾的CH2區(qū)的核酸序列(例SEQ ID NO41)。在另外的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供編碼包含SEQ ID NO16的帶L251F修飾的CH2區(qū)的氨基酸序列。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含在SEQ ID NO17中所示序列的肽(含有T256M氨基酸修飾)。在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明提供編碼帶T256M修飾的CH2區(qū)的核酸序列(例SEQ ID NO42)。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供編碼包含SEQ ID NO17的帶T256M修飾的CH2區(qū)的氨基酸序列。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含在SEQ ID NO20中所示序列的肽(含有H268E氨基酸修飾)。在另外的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供編碼帶H268E修飾的CH2區(qū)的核酸序列(例SEQ ID NO45)。在另外的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供編碼包含SEQ ID NO20的帶H268E修飾的CH2區(qū)的氨基酸序列。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含在SEQ ID NO21中所示序列的肽(含有D280A氨基酸修飾)。在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明提供編碼帶D280A修飾的CH2區(qū)的核酸序列(例SEQ ID NO46)。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供編碼包含SEQ ID NO21的帶D280A修飾的CH2區(qū)的氨基酸序列。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含在SEQ ID NO23中所示序列的肽(含有A330K氨基酸修飾)。在另外的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供編碼帶A330K修飾的CH2區(qū)的核酸序列(例SEQ ID NO48)。在另外的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供編碼包含SEQ ID NO23的帶A330K修飾的CH2區(qū)的氨基酸序列。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含在SEQ ID NO26中所示序列的肽(含有I332E氨基酸修飾)。在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明提供編碼帶I332E修飾的CH2區(qū)的核酸序列(例SEQ ID NO51)。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供編碼包含SEQ ID NO26的帶I332E修飾的CH2區(qū)的氨基酸序列。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含在SEQ ID NO29中所示序列的肽(含有A339T氨基酸修飾)。在另外的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供編碼帶A339T修飾的CH2區(qū)的核酸序列(例SEQ ID NO54)。在另外的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供編碼包含SEQ ID NO29的帶A339T修飾的CH2區(qū)的氨基酸序列。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含在SEQ ID NO30中所示序列的肽(含有A378D氨基酸修飾)。在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明提供編碼帶A378D修飾的CH2區(qū)的核酸序列(例SEQ ID NO55)。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供編碼包含SEQ ID NO30的帶S440Y修飾的CH2區(qū)的氨基酸序列。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含在SEQ ID NO31中所示序列的肽(含有S440Y氨基酸修飾)。在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明提供編碼帶S440Y修飾的CH2區(qū)的核酸序列(例SEQ ID NO56)。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供編碼包含SEQ ID NO31的帶S440Y修飾的CH2區(qū)的氨基酸序列。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供組合物，其包含具有至少一部分Fc區(qū)的母體多肽變體(或編碼該變體的核酸序列)，其中該變體在Fc區(qū)內(nèi)至少包含247位置處的選自P247H、P247I和P247L的一處氨基酸修飾。在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明提供組合物，其包含具有至少一部分Fc區(qū)的母體多肽變體(或編碼該變體的核酸序列)，其中該變體在Fc區(qū)至少包含251位置處的L251F氨基酸修飾。在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明提供組合物，其包含具有至少一部分Fc區(qū)的母體多肽變體(或編碼該變體的核酸序列)，其中該變體在Fc區(qū)內(nèi)至少包含256位置處的選自T256M和T256P的一處氨基酸修飾。在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明提供組合物，其包含具有至少一部分Fc區(qū)的母體多肽變體(或編碼該變體的核酸序列)，其中該變體在Fc區(qū)內(nèi)至少包含268位置處的選自H268D和H268E的一處氨基酸修飾。在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明提供組合物，其包含具有至少一部分Fc區(qū)的母體多肽變體(或編碼該變體的核酸序列)，其中該變體在Fc區(qū)內(nèi)至少包含280位置處的選自D280A和D280K的一處氨基酸修飾。在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明提供組合物，其包含具有至少一部分Fc區(qū)的母體多肽變體(或編碼該變體的核酸序列)，其中該變體在Fc區(qū)內(nèi)至少包含330位置處的選自A330K和A330R的一處氨基酸修飾。在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明提供組合物，其包含具有至少一部分Fc區(qū)的母體多肽變體(或編碼該變體的核酸序列)，其中該變體在Fc區(qū)內(nèi)至少包含332位置處的選自I332D和I332E的一處氨基酸修飾。在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明提供組合物，其包含具有至少一部分Fc區(qū)的母體多肽變體(或編碼該變體的核酸序列)，其中該變體在Fc區(qū)內(nèi)至少包含339位置處的A339T氨基酸修飾。在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明提供組合物，其包含具有至少一部分Fc區(qū)的母體多肽變體(或編碼該變體的核酸序列)，其中該變體在Fc區(qū)內(nèi)至少包含378位置處的A378D氨基酸修飾。在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明提供組合物，其包含具有至少一部分Fc區(qū)的母體多肽變體(或編碼該變體的核酸序列)，其中該變體在Fc區(qū)內(nèi)至少包含440位置處的S440Y氨基酸修飾。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供組合物，其包含具有至少一部分Fc區(qū)的母體多肽變體，其中在效應(yīng)細(xì)胞存在時(shí)，變體比母體多肽更有效地介導(dǎo)抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用(ADCC)，并且變體在Fc區(qū)內(nèi)至少包含247位置處的一處氨基酸修飾。在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明提供方法，其包括a)提供i)組合物，其包含具有至少一部分Fc區(qū)的母體多肽變體，其中在效應(yīng)細(xì)胞存在時(shí)，變體比母體多肽更有效地介導(dǎo)抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用(ADCC)，并且變體在Fc區(qū)內(nèi)至少包含247位置處的一處氨基酸修飾，和ii)具有一種或多種疾病癥狀的受試者；以及b)在使得至少一種癥狀緩解的條件下向受試者施用該組合物。在特定實(shí)施方案中，變體包含抗體或免疫粘附素并且受試者具有抗體或免疫粘附素應(yīng)答性疾病癥狀。
在某些實(shí)施方案中，變體包含至少一部分Fc區(qū)(例如含有氨基酸修飾的Fc區(qū)的40％、50％、60％、80％或90％或更高)。在一些實(shí)施方案中，多肽變體包含CH2或CH3區(qū)。在又一些實(shí)施方案中，組合物包含含有SEQID NO13的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，組合物包含含有SEQ IDNO14的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，組合物包含含有SEQ ID NO15的氨基酸序列。在某些實(shí)施方案中，組合物包含核酸序列，其中核酸序列包含SEQ ID NO38和/或SEQ ID NO39和/或SEQ ID NO40或其互補(bǔ)物或者在高嚴(yán)格條件下結(jié)合SEQ ID NO38、39或40的序列。在又一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供宿主細(xì)胞(例如CHO細(xì)胞)和包含SEQ ID NO38和/或SEQ ID NO39和/或SEQ ID NO40的載體。在特定實(shí)施方案中，本發(fā)明提供計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)，其中計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)載有SEQ ID NO13、14、15、38、39或40的表現(xiàn)形式。
在某些實(shí)施方案中，多肽變體于效應(yīng)細(xì)胞存在時(shí)比母體多肽更有效地介導(dǎo)抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用(ADCC)。在一些實(shí)施方案中，多肽變體包含抗體或抗體片段(例如多克隆抗體、單克隆抗體、嵌合抗體、人源化抗體或Fc片段)。在一些實(shí)施方案中，母體多肽包含人IgG Fc區(qū)。在另外的實(shí)施方案中，母體多肽包含人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4Fc區(qū)。在其他實(shí)施方案中，母體多肽包含選自SEQ ID NO1-12的氨基酸序列。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，氨基酸修飾是P247H、P247I或P247L。在某些實(shí)施方案中，多肽變體在Fc區(qū)內(nèi)包含第2個(gè)、第3個(gè)、第4個(gè)等的氨基酸修飾(見(jiàn)例如表1)。在一些實(shí)施方案中，變體是CHO所表達(dá)的多肽。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供組合物，其包含具有至少一部分Fc區(qū)的母體多肽變體，其中在效應(yīng)細(xì)胞存在時(shí)，變體比母體多肽更有效地介導(dǎo)抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用(ADCC)，并且變體在Fc區(qū)內(nèi)至少包含251位置處的一處氨基酸修飾。在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明提供方法，其包括a)提供i)組合物，其包含具有至少一部分Fc區(qū)的母體多肽變體，其中在效應(yīng)細(xì)胞存在時(shí)，變體比母體多肽更有效地介導(dǎo)抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用(ADCC)，并且變體在Fc區(qū)內(nèi)至少包含251位置處的一處氨基酸修飾，和ii)具有一種或多種疾病癥狀的受試者；以及b)在使得至少一種癥狀緩解的條件下向受試者施用該組合物。在特定實(shí)施方案中，變體包含抗體或免疫粘附素并且受試者具有抗體或免疫粘附素應(yīng)答性疾病癥狀。
在某些實(shí)施方案中，變體包含至少一部分Fc區(qū)(例如含有氨基酸修飾的Fc區(qū)的40％、50％、60％、80％或90％或更高)。在一些實(shí)施方案中，該多肽變體包含CH2或CH3區(qū)。在又一些實(shí)施方案中，組合物包含含有SEQ ID NO16的氨基酸序列。在某些實(shí)施方案中，組合物包含含有SEQ IDNO41或其互補(bǔ)物或者在高嚴(yán)格條件下結(jié)合SEQ ID NO41的序列的核酸序列。在又一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供宿主細(xì)胞(例如CHO細(xì)胞)和包含SEQ ID NO41的載體。在特定實(shí)施方案中，本發(fā)明提供計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)，其中計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)載有SEQ ID NO16或41的表現(xiàn)形式。
在某些實(shí)施方案中，多肽變體于效應(yīng)細(xì)胞存在時(shí)較母體多肽更有效地介導(dǎo)抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用(ADCC)。在一些實(shí)施方案中，多肽變體包含抗體或抗體片段(例如多克隆抗體、單克隆抗體、嵌合抗體、人源化抗體或Fc片段)。在一些實(shí)施方案中，母體多肽包含人IgG Fc區(qū)。在另外的實(shí)施方案中，母體多肽包含人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4Fc區(qū)。在其他實(shí)施方案中，母體多肽包含選自SEQ ID NO1-12的氨基酸序列。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，氨基酸修飾是L251F。在某些實(shí)施方案中，多肽變體在Fc區(qū)內(nèi)包含第2個(gè)、第3個(gè)、第4個(gè)等的氨基酸修飾(見(jiàn)例如表1)。在一些實(shí)施方案中，變體是CHO所表達(dá)的多肽。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供組合物，其包含具有至少一部分Fc區(qū)的母體多肽變體，其中在效應(yīng)細(xì)胞存在時(shí)，變體較母體多肽更有效地介導(dǎo)抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用(ADCC)，并且變體在Fc區(qū)內(nèi)至少包含256位置處的一處氨基酸修飾。在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明提供方法，其包括a)提供i)組合物，其包含具有至少一部分Fc區(qū)的母體多肽變體，其中在效應(yīng)細(xì)胞存在時(shí)，變體較母體多肽更有效地介導(dǎo)抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用(ADCC)，并且變體在Fc區(qū)內(nèi)至少包含256位置處的一處氨基酸修飾，和ii)具有一種或多種疾病癥狀的受試者；以及b)在使得至少一種癥狀緩解的條件下向受試者施用該組合物。在特定實(shí)施方案中，變體包含抗體或免疫粘附素，并且受試者具有抗體或免疫粘附素應(yīng)答性疾病癥狀。
在某些實(shí)施方案中，變體包含至少一部分Fc區(qū)(例如含有氨基酸修飾的Fc區(qū)的40％、50％、60％、80％或90％或更高)。在一些實(shí)施方案中，多肽變體包含CH2或CH3區(qū)。在又一些實(shí)施方案中，組合物包含含有SEQID NO17的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，組合物包含含有SEQ IDNO18的氨基酸序列。在某些實(shí)施方案中，組合物包含核酸序列，其中所述核酸序列包含SEQ ID NO42和/或SEQ ID NO43或其互補(bǔ)物或者在高嚴(yán)格條件下結(jié)合SEQ ID NO42或43的序列。在又一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供宿主細(xì)胞(例如CHO細(xì)胞)以及包含SEQ ID NO42和/或SEQ IDNO43的載體。在特定實(shí)施方案中，本發(fā)明提供計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)，其中計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)載有SEQ ID NO17、18、42或43的表現(xiàn)形式。
在某些實(shí)施方案中，多肽變體于效應(yīng)細(xì)胞存在時(shí)較母體多肽更有效地介導(dǎo)抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用(ADCC)。在一些實(shí)施方案中，多肽變體包含抗體或抗體片段(例如多克隆抗體、單克隆抗體、嵌合抗體、人源化抗體或Fc片段)。在一些實(shí)施方案中，母體多肽包含人IgG Fc區(qū)。在另外的實(shí)施方案中，母體多肽包含人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4Fc區(qū)。在其他實(shí)施方案中，母體多肽包含選自SEQ ID NO1-12的氨基酸序列。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，氨基酸修飾是T256M或T256P。在某些實(shí)施方案中，多肽變體在Fc區(qū)內(nèi)包含第2個(gè)、第3個(gè)、第4個(gè)等的氨基酸修飾(見(jiàn)例如表1)。在一些實(shí)施方案中，變體是CHO所表達(dá)的多肽。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供組合物，其包含具有至少一部分Fc區(qū)的母體多肽變體，其中在效應(yīng)細(xì)胞存在時(shí)，變體較母體多肽更有效地介導(dǎo)抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用(ADCC)，并且變體在Fc區(qū)內(nèi)至少包含268位置處的一處氨基酸修飾。在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明提供方法，其包括a)提供i)組合物，其包含具有至少一部分Fc區(qū)的母體多肽變體，其中在效應(yīng)細(xì)胞存在時(shí)，變體較母體多肽更有效地介導(dǎo)抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用(ADCC)，并且變體在Fc區(qū)內(nèi)至少包含268位置處的一處氨基酸修飾，和ii)具有一種或多種疾病癥狀的受試者；以及b)在使得至少一種癥狀緩解的條件下向受試者施用該組合物。在特定實(shí)施方案中，變體包含抗體或免疫粘附素，并且受試者具有抗體或免疫粘附素應(yīng)答性疾病癥狀。
在某些實(shí)施方案中，變體包含至少一部分Fc區(qū)(例如含有氨基酸修飾的Fc區(qū)的40％、50％、60％、80％或90％或更高)。在一些實(shí)施方案中，多肽變體包含CH2或CH3區(qū)。在又一些實(shí)施方案中，組合物包含含有SEQID NO19的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，組合物包含含有SEQ IDNO20的氨基酸序列。在某些實(shí)施方案中，組合物包含核酸序列，其中所述核酸序列包含SEQ ID NO44和/或SEQ ID NO45或其互補(bǔ)物或者在高嚴(yán)格條件下結(jié)合SEQ ID NO44或45的序列。在又一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供宿主細(xì)胞(例如CHO細(xì)胞)以及包含SEQ ID NO44和/或SEQ IDNO45的載體。在特定實(shí)施方案中，本發(fā)明提供計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)，其中計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)載有SEQ ID NO19、20、44或45的表現(xiàn)形式。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供組合物，其包含具有至少一部分Fc區(qū)的母體多肽變體，其中在效應(yīng)細(xì)胞存在時(shí)，變體較母體多肽更有效地介導(dǎo)抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用(ADCC)，并且變體在Fc區(qū)內(nèi)至少包含322位置處的一處氨基酸修飾。在特定實(shí)施方案中，至少一處氨基酸修飾是I322K或I322R。
在某些實(shí)施方案中，多肽變體于效應(yīng)細(xì)胞存在時(shí)較母體多肽更有效地介導(dǎo)抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用(ADCC)。在一些實(shí)施方案中，多肽變體包含抗體或抗體片段(例如多克隆抗體、單克隆抗體、嵌合抗體、人源化抗體或Fc片段)。在一些實(shí)施方案中，母體多肽包含人IgG Fc區(qū)。在另外的實(shí)施方案中，母體多肽包含人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4Fc區(qū)。在其他實(shí)施方案中，母體多肽包含選自SEQ ID NO1-12的氨基酸序列。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，氨基酸修飾是H268D或H268E。在某些實(shí)施方案中，多肽變體在Fc區(qū)內(nèi)包含第2個(gè)、第3個(gè)、第4個(gè)等的氨基酸修飾(見(jiàn)例如表1)。在一些實(shí)施方案中，變體是CHO所表達(dá)的多肽。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供組合物，其包含具有至少一部分Fc區(qū)的母體多肽變體，其中在效應(yīng)細(xì)胞存在時(shí)，變體較母體多肽更有效地介導(dǎo)抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用(ADCC)，并且變體在Fc區(qū)至少包含280位置處的一處氨基酸修飾。在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明提供方法，其包括a)提供i)組合物，其包含具有至少一部分Fc區(qū)的母體多肽變體，其中在效應(yīng)細(xì)胞存在時(shí)，變體較母體多肽更有效地介導(dǎo)抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用(ADCC)，并且變體在Fc區(qū)至少包含280位置處的一處氨基酸修飾，和ii)具有一種或多種疾病癥狀的受試者；以及b)在使得至少一種癥狀緩解的條件下向受試者施用該組合物。在特定實(shí)施方案中，變體包含抗體或免疫粘附素，并且受試者具有抗體或免疫粘附素應(yīng)答性疾病癥狀。
在某些實(shí)施方案中，變體包含至少一部分Fc區(qū)(例如含有氨基酸修飾的Fc區(qū)的40％、50％、60％、80％或90％或更高)。在一些實(shí)施方案中，多肽變體包含CH2或CH3區(qū)。在又一些實(shí)施方案中，組合物包含含有SEQID NO21的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，組合物包含含有SEQ IDNO22的氨基酸序列。在某些實(shí)施方案中，組合物包含核酸序列，其中所述核酸序列包含SEQ ID NO46和/或SEQ ID NO47或其互補(bǔ)物或者在高嚴(yán)格條件下結(jié)合SEQ ID NO46和47的序列。在又一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供宿主細(xì)胞(例如CHO細(xì)胞)以及包含SEQ ID NO46和/或SEQ IDNO47的載體。在特定實(shí)施方案中，本發(fā)明提供計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)，其中計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)載有SEQ ID NO21、22、46和47的表現(xiàn)形式。
在某些實(shí)施方案中，多肽變體于效應(yīng)細(xì)胞存在時(shí)較母體多肽更有效地介導(dǎo)抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用(ADCC)。在一些實(shí)施方案中，多肽變體包含抗體或抗體片段(例如多克隆抗體、單克隆抗體、嵌合抗體、人源化抗體或Fc片段)。在一些實(shí)施方案中，母體多肽包含人IgG Fc區(qū)。在另外的實(shí)施方案中，母體多肽包含人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4Fc區(qū)。在其他實(shí)施方案中，母體多肽包含選自SEQ ID NO1-12的氨基酸序列。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，氨基酸修飾是D280A或D280K。在某些實(shí)施方案中，多肽變體在Fc區(qū)內(nèi)包含第2個(gè)、第3個(gè)、第4個(gè)等的氨基酸修飾(見(jiàn)例如表1)。在一些實(shí)施方案中，變體是CHO所表達(dá)的多肽。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供組合物，其包含具有至少一部分Fc區(qū)的母體多肽變體，其中在效應(yīng)細(xì)胞存在時(shí)，變體較母體多肽更有效地介導(dǎo)抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用(ADCC)，并且變體在Fc區(qū)至少包含330位置處的一處氨基酸修飾。在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明提供方法，其包括a)提供i)組合物，其包含具有至少一部分Fc區(qū)的母體多肽變體，其中在效應(yīng)細(xì)胞存在時(shí)，變體較母體多肽更有效地介導(dǎo)抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用(ADCC)，并且變體在Fc區(qū)至少包含330位置處的一處氨基酸修飾，和ii)具有一種或多種疾病癥狀的受試者；以及b)在使得至少一種癥狀緩解的條件下向受試者施用該組合物。在特定實(shí)施方案中，變體包含抗體或免疫粘附素，并且受試者具有抗體或免疫粘附素應(yīng)答性疾病癥狀。
在某些實(shí)施方案中，變體包含至少一部分Fc區(qū)(例如含有氨基酸修飾的Fc區(qū)的40％、50％、60％、80％或90％或更高)。在一些實(shí)施方案中，多肽變體包含CH2或CH3區(qū)。在又一些實(shí)施方案中，組合物包含含有SEQID NO23的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，組合物包含含有SEQ IDNO24的氨基酸序列。在某些實(shí)施方案中，組合物包含核酸序列，其中所述核酸序列包含SEQ ID NO48和/或SEQ ID NO49或其互補(bǔ)物或者在高嚴(yán)格條件下結(jié)合SEQ ID NO48或49的序列。在又一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供宿主細(xì)胞(例如CHO細(xì)胞)以及包含SEQ ID NO48和/或SEQ IDNO49的載體。在特定實(shí)施方案中，本發(fā)明提供計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)，其中計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)載有SEQ ID NO23、24、48和49的表現(xiàn)形式。
在某些實(shí)施方案中，多肽變體于效應(yīng)細(xì)胞存在時(shí)較母體多肽更有效地介導(dǎo)抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用(ADCC)。在一些實(shí)施方案中，多肽變體包含抗體或抗體片段(例如多克隆抗體、單克隆抗體、嵌合抗體、人源化抗體或Fc片段)。在一些實(shí)施方案中，母體多肽包含人IgG Fc區(qū)。在另外的實(shí)施方案中，母體多肽包含人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4Fc區(qū)。在其他實(shí)施方案中，母體多肽包含選自SEQ ID NO1-12的氨基酸序列。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，氨基酸修飾是A330K或A330R。在某些實(shí)施方案中，多肽變體在Fc區(qū)內(nèi)包含第2個(gè)、第3個(gè)、第4個(gè)等的氨基酸修飾(見(jiàn)例如表1)。在一些實(shí)施方案中，變體是CHO所表達(dá)的多肽。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供組合物，其包含具有至少一部分Fc區(qū)的母體多肽變體，其中在效應(yīng)細(xì)胞存在時(shí)，變體較母體多肽更有效地介導(dǎo)抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用(ADCC)，并且變體在Fc區(qū)至少包含332位置處的一處氨基酸修飾。在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明提供方法，其包括a)提供i)組合物，其包含具有至少一部分Fc區(qū)的母體多肽變體，其中在效應(yīng)細(xì)胞存在時(shí)，變體較母體多肽更有效地介導(dǎo)抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用(ADCC)，并且變體在Fc區(qū)至少包含332位置處的一處氨基酸修飾，和ii)具有一種或多種疾病癥狀的受試者；以及b)在使得至少一種癥狀緩解的條件下向受試者施用該組合物。在特定實(shí)施方案中，變體包含抗體或免疫粘附素，并且受試者具有抗體或免疫粘附素應(yīng)答性疾病癥狀。
在某些實(shí)施方案中，變體包含至少一部分Fc區(qū)(例如含有氨基酸修飾的Fc區(qū)的40％、50％、60％、80％或90％或更高)。在一些實(shí)施方案中，多肽變體包含CH2或CH3區(qū)。在又一些實(shí)施方案中，組合物包含含有SEQID NO25的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，組合物包含含有SEQ IDNO26的氨基酸序列。在某些實(shí)施方案中，組合物包含核酸序列，其中所述核酸序列包含SEQ ID NO50和/或SEQ ID NO51或其互補(bǔ)物或者在高嚴(yán)格條件下結(jié)合SEQ ID NO50或51的序列。在又一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供宿主細(xì)胞(例如CHO細(xì)胞)以及包含SEQ ID NO50和/或SEQ IDNO51的載體。在特定實(shí)施方案中，本發(fā)明提供計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)，其中計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)載有SEQ ID NO25、26、50和51的表現(xiàn)形式。
在某些實(shí)施方案中，多肽變體于效應(yīng)細(xì)胞存在時(shí)較母體多肽更有效地介導(dǎo)抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用(ADCC)。在一些實(shí)施方案中，多肽變體包含抗體或抗體片段(例如多克隆抗體、單克隆抗體、嵌合抗體、人源化抗體或Fc片段)。在一些實(shí)施方案中，母體多肽包含人IgG Fc區(qū)。在另外的實(shí)施方案中，母體多肽包含人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4Fc區(qū)。在其他實(shí)施方案中，母體多肽包含選自SEQ ID NO1-12的氨基酸序列。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，氨基酸修飾是I332D或I332E。在某些實(shí)施方案中，多肽變體在Fc區(qū)內(nèi)包含第2個(gè)、第3個(gè)、第4個(gè)等的氨基酸修飾(見(jiàn)例如表1)。在一些實(shí)施方案中，變體是CHO所表達(dá)的多肽。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供組合物，其包含具有至少一部分Fc區(qū)的母體多肽變體，其中在效應(yīng)細(xì)胞存在時(shí)，變體較母體多肽更有效地介導(dǎo)抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用(ADCC)，并且變體在Fc區(qū)至少包含339位置處的一處氨基酸修飾。在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明提供方法，其包括a)提供i)組合物，其包含具有至少一部分Fc區(qū)的母體多肽變體，其中在效應(yīng)細(xì)胞存在時(shí)，變體較母體多肽更有效地介導(dǎo)抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用(ADCC)，并且變體在Fc區(qū)至少包含339位置處的一處氨基酸修飾，和ii)具有一種或多種疾病癥狀的受試者；以及b)在使得至少一種癥狀緩解的條件下向受試者施用該組合物。在特定實(shí)施方案中，變體包含抗體或免疫粘附素，并且受試者具有抗體或免疫粘附素應(yīng)答性疾病癥狀。
在某些實(shí)施方案中，變體包含至少一部分Fc區(qū)(例如含有氨基酸修飾的Fc區(qū)的40％、50％、60％、80％或90％或更高)。在一些實(shí)施方案中，多肽變體包含CH2或CH3區(qū)。在又一些實(shí)施方案中，組合物包含含有SEQID NO29的氨基酸序列。在某些實(shí)施方案中，組合物包含核酸序列，其中所述核酸序列包含SEQ ID NO54或其互補(bǔ)物或者在高嚴(yán)格條件下結(jié)合SEQ ID NO54的序列。在又一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供宿主細(xì)胞(例如CHO細(xì)胞)以及包含SEQ ID NO54的載體。在特定實(shí)施方案中，本發(fā)明提供計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)，其中計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)載有SEQ ID NO29或54的表現(xiàn)形式。
在某些實(shí)施方案中，多肽變體于效應(yīng)細(xì)胞存在時(shí)較母體多肽更有效地介導(dǎo)抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用(ADCC)。在一些實(shí)施方案中，多肽變體包含抗體或抗體片段(例如多克隆抗體、單克隆抗體、嵌合抗體、人源化抗體或Fc片段)。在一些實(shí)施方案中，母體多肽包含人IgG Fc區(qū)。在另外的實(shí)施方案中，母體多肽包含人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4Fc區(qū)。在其他實(shí)施方案中，母體多肽包含選自SEQ ID NO1-12的氨基酸序列。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，氨基酸修飾是A339T。在某些實(shí)施方案中，多肽變體在Fc區(qū)內(nèi)包含第2個(gè)、第3個(gè)、第4個(gè)等的氨基酸修飾(見(jiàn)例如表1)。在一些實(shí)施方案中，變體是CHO所表達(dá)的多肽。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供組合物，其包含具有至少一部分Fc區(qū)的母體多肽變體，其中在全血測(cè)定法中變體較母體多肽更有效地介導(dǎo)靶細(xì)胞損耗，并且變體在Fc區(qū)至少包含378位置處的一處氨基酸修飾。在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明提供方法，其包括a)提供i)組合物，其包含具有至少一部分Fc區(qū)的母體多肽變體，其中在全血測(cè)定法中變體較母體多肽更有效地介導(dǎo)靶細(xì)胞損耗，并且變體在Fc區(qū)至少包含378位置處的一處氨基酸修飾，和ii)具有一種或多種疾病癥狀的受試者；以及b)在使得至少一種癥狀緩解的條件下向受試者施用該組合物。在特定實(shí)施方案中，變體包含抗體或免疫粘附素，并且受試者具有抗體或免疫粘附素應(yīng)答性疾病癥狀。
在某些實(shí)施方案中，變體包含至少一部分Fc區(qū)(例如含有氨基酸修飾的Fc區(qū)的40％、50％、60％、80％或90％或更高)。在一些實(shí)施方案中，多肽變體包含CH2或CH3區(qū)。在又一些實(shí)施方案中，組合物包含含有SEQID NO30的氨基酸序列。在某些實(shí)施方案中，組合物包含核酸序列，其中所述核酸序列包含SEQ ID NO55或其互補(bǔ)物或者在高嚴(yán)格條件下結(jié)合SEQ ID NO55的序列。在又一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供宿主細(xì)胞(例如CHO細(xì)胞)以及包含SEQ ID NO55的載體。在特定實(shí)施方案中，本發(fā)明提供計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)，其中計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)載有SEQ ID NO30或55的表現(xiàn)形式。
在某些實(shí)施方案中，多肽在全血測(cè)定法中變體較母體多肽更有效地介導(dǎo)靶細(xì)胞損耗。在一些實(shí)施方案中，多肽變體包含抗體或抗體片段(例如多克隆抗體、單克隆抗體、嵌合抗體、人源化抗體或Fc片段)。在一些實(shí)施方案中，母體多肽包含人IgG Fc區(qū)。在另外的實(shí)施方案中，母體多肽包含人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4Fc區(qū)。在其他實(shí)施方案中，母體多肽包含選自SEQ ID NO1-12的氨基酸序列。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，氨基酸修飾是A378D。在某些實(shí)施方案中，多肽變體在Fc區(qū)內(nèi)包含第2個(gè)、第3個(gè)、第4個(gè)等的氨基酸修飾(見(jiàn)例如表1)。在一些實(shí)施方案中，變體是CHO所表達(dá)的多肽。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供組合物，其包含具有至少一部分Fc區(qū)的母體多肽變體，其中在效應(yīng)細(xì)胞存在時(shí)，變體較母體多肽更有效地介導(dǎo)抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用(ADCC)，并且變體在Fc區(qū)至少包含440位置處的一處氨基酸修飾。在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明提供方法，其包括a)提供i)組合物，其包含具有至少一部分Fc區(qū)的母體多肽變體，其中在效應(yīng)細(xì)胞存在時(shí)，變體較母體多肽更有效地介導(dǎo)抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用(ADCC)，并且變體在Fc區(qū)至少包含440位置處的一處氨基酸修飾，和ii)具有一種或多種疾病癥狀的受試者；以及b)在使得至少一種癥狀緩解的條件下向受試者施用該組合物。在特定實(shí)施方案中，變體包含抗體或免疫粘附素，并且受試者具有抗體或免疫粘附素應(yīng)答性疾病癥狀。
在某些實(shí)施方案中，變體包含至少一部分Fc區(qū)(例如含有氨基酸修飾的Fc區(qū)的40％、50％、60％、80％或90％或更高)。在一些實(shí)施方案中，多肽變體包含CH2或CH3區(qū)。在又一些實(shí)施方案中，組合物包含含有SEQID NO31的氨基酸序列。在某些實(shí)施方案中，組合物包含核酸序列，其中所述核酸序列包含SEQ ID NO56或其互補(bǔ)物或者在高嚴(yán)格條件下結(jié)合SEQ ID NO56的序列。在又一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供宿主細(xì)胞(例如CHO細(xì)胞)以及包含SEQ ID NO56的載體。在特定實(shí)施方案中，本發(fā)明提供計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)，其中計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)載有SEQ ID NO31或56的表現(xiàn)形式。
在某些實(shí)施方案中，多肽變體于效應(yīng)細(xì)胞存在時(shí)較母體多肽更有效地介導(dǎo)抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用(ADCC)。在一些實(shí)施方案中，多肽變體包含抗體或抗體片段(例如多克隆抗體、單克隆抗體、嵌合抗體、人源化抗體或Fc片段)。在一些實(shí)施方案中，母體多肽包含人IgG Fc區(qū)。在另外的實(shí)施方案中，母體多肽包含人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4Fc區(qū)。在其他實(shí)施方案中，母體多肽包含選自SEQ ID NO1-12的氨基酸序列。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，氨基酸修飾是S440Y。在某些實(shí)施方案中，多肽變體在Fc區(qū)內(nèi)包含第2個(gè)、第3個(gè)、第4個(gè)等的氨基酸修飾(見(jiàn)例如表1)。在一些實(shí)施方案中，變體是CHO所表達(dá)的多肽。
在又一些實(shí)施方案中，組合物包含核酸序列，其編碼具有至少一部分Fc區(qū)的母體多肽變體，其中在效應(yīng)細(xì)胞存在時(shí)，變體較母體多肽更有效地介導(dǎo)抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用(ADCC)，并且變體在Fc區(qū)至少包含247、251、256、268、280、330、332、339、378或440或其組合位置處的一處氨基酸修飾。在一些實(shí)施方案中，組合物包含這樣的核酸序列，其編碼于效應(yīng)細(xì)胞存在時(shí)較母體多肽更有效地介導(dǎo)抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用(ADCC)的變體Fc多肽，其中變體Fc多肽包含氨基酸247、251、256、268、280、330、332、339、378或440或其組合位置處的氨基酸修飾。
在又一些實(shí)施方案中，組合物包含編碼具有至少一部分Fc區(qū)的母體多肽變體的核酸序列，其中在全血測(cè)定法中變體較母體多肽更有效地介導(dǎo)靶細(xì)胞損耗，并且變體在Fc區(qū)至少包含247、251、256、268、280、330、332、339、378或440或其組合的位置處的一處氨基酸修飾。在一些實(shí)施方案中，組合物包含這樣的核酸序列，其編碼在全血測(cè)定法中較母體多肽更有效地介導(dǎo)靶細(xì)胞損耗的變體Fc多肽，其中變體Fc多肽包含氨基酸247、251、256、268、280、330、332、339、378或440或其組合位置處的氨基酸修飾。
在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的變體以及編碼變體的核酸序列與至少一種其他成分一起提供于試劑盒中。例如試劑盒可包含至少一種類型變體以及使用變體的書面說(shuō)明書。試劑盒還可包含緩沖液以及其他有用試劑。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供方法，其包括a)提供i)表達(dá)靶抗原(例如CD20)的細(xì)胞，ii)組合物，其包含具有至少一部分Fc區(qū)的母體多肽變體，其中該變體在Fc區(qū)內(nèi)至少包含一處氨基酸修飾，iii)效應(yīng)細(xì)胞(例如來(lái)自人類供體的已富集PBMC)，以及b)在使得變體與靶細(xì)胞結(jié)合(例如通過(guò)表達(dá)在該細(xì)胞表面的配體)的條件下，將靶細(xì)胞與組合物和效應(yīng)細(xì)胞接觸，以及c)測(cè)量靶細(xì)胞的殺傷(例如釋放LDH或鉻51)。
在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明提供方法，其包括a)提供i)含有表達(dá)靶抗原的細(xì)胞(例如表達(dá)CD20的B細(xì)胞)的全血樣品和ii)包含具有至少一部分Fc區(qū)的母體多肽變體的組合物，其中變體在Fc區(qū)內(nèi)至少包含一處氨基酸修飾，以及b)在使得變體與靶細(xì)胞結(jié)合(例如通過(guò)表達(dá)在細(xì)胞表面的CD20配體)的條件下，將靶細(xì)胞與組合物接觸，以及c)測(cè)量靶細(xì)胞的消失(例如用Facs分析其他B細(xì)胞標(biāo)志物，如CD19)。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供鑒定雙物種改良變體的方法，其包括a)提供i)靶細(xì)胞，ii)組合物，其包含具有Fc區(qū)的母體多肽的候選變體，其中候選變體在Fc區(qū)內(nèi)至少包含一處氨基酸修飾，并且其中在第一個(gè)物種的效應(yīng)細(xì)胞存在時(shí)，候選變體較母體多肽更有效地介導(dǎo)靶細(xì)胞細(xì)胞毒性，和iii)第二個(gè)物種的效應(yīng)細(xì)胞，以及b)在使得候選變體結(jié)合靶細(xì)胞由此產(chǎn)生結(jié)合候選變體的靶細(xì)胞的條件下，將組合物與靶細(xì)胞溫育，c)將第二個(gè)物種的效應(yīng)細(xì)胞與已結(jié)合候選變體的靶細(xì)胞混合，d)測(cè)量靶細(xì)胞細(xì)胞毒性(例如由該候選變體所介導(dǎo)的細(xì)胞毒性)，e)確定候選變體是否在第二個(gè)物種的效應(yīng)細(xì)胞存在時(shí)較母體多肽更有效地介導(dǎo)靶細(xì)胞細(xì)胞毒性。在一些實(shí)施方案中，該方法還包括用第二個(gè)物種的效應(yīng)細(xì)胞以相同方式篩選母體多肽。在又一些實(shí)施方案中，同時(shí)實(shí)施步驟b)和c)。在特定實(shí)施方案中，方法還包括步驟f)鑒定作為雙物種改良變體的候選變體，其中在第二個(gè)物種的效應(yīng)細(xì)胞存在時(shí)，雙物種改良變體較母體多肽更有效地介導(dǎo)靶細(xì)胞細(xì)胞毒性。在其他實(shí)施方案中，此方法還包括步驟f)鑒定作為雙物種改良變體的候選變體，其中在第二個(gè)物種的效應(yīng)細(xì)胞存在時(shí)，雙物種改良變體較母體多肽以大約1.2倍(或大約1.5倍、5倍或大約10倍)的更有效地介導(dǎo)靶細(xì)胞細(xì)胞毒性(例如觀察到超過(guò)大約1.2倍的靶細(xì)胞裂解)。
在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明提供鑒定雙物種改良變體的方法，其包括a)提供i)靶細(xì)胞，ii)組合物，其包含具有Fc區(qū)的母體多肽的候選變體，其中候選變體在Fc區(qū)內(nèi)至少包含一處氨基酸修飾，iii)第一個(gè)物種的效應(yīng)細(xì)胞和iv)第二個(gè)物種的效應(yīng)細(xì)胞，以及b)在使得候選變體結(jié)合靶細(xì)胞由此產(chǎn)生結(jié)合候選變體的靶細(xì)胞的條件下，將組合物與靶細(xì)胞溫育，c)將第一個(gè)物種的效應(yīng)細(xì)胞與已結(jié)合候選變體的靶細(xì)胞混合，d)測(cè)量靶細(xì)胞細(xì)胞毒性(例如由候選變體所介導(dǎo)的細(xì)胞毒性)，e)確定候選變體是否在第一個(gè)物種的效應(yīng)細(xì)胞存在時(shí)較母體多肽更有效地介導(dǎo)靶細(xì)胞細(xì)胞毒性，f)將第二個(gè)物種的效應(yīng)細(xì)胞與已結(jié)合候選變體的靶細(xì)胞(例如在步驟b中產(chǎn)生的靶細(xì)胞)混合，g)測(cè)量靶細(xì)胞細(xì)胞毒性(例如由候選變體所介導(dǎo)的細(xì)胞毒性)，h)確定候選變體是否在第二個(gè)物種的效應(yīng)細(xì)胞存在時(shí)較母體多肽更有效地介導(dǎo)靶細(xì)胞細(xì)胞毒性。
在特定實(shí)施方案中，方法還包括確定在第一個(gè)物種和/或第二個(gè)物種效應(yīng)細(xì)胞存在時(shí)母體多肽介導(dǎo)靶細(xì)胞細(xì)胞毒性能力的步驟。例如，方法還可包括將第一個(gè)或第二個(gè)物種的效應(yīng)細(xì)胞與已結(jié)合母體多肽的靶細(xì)胞混合，然后測(cè)量靶細(xì)胞細(xì)胞毒性(例如測(cè)定數(shù)值以便將變體的數(shù)值與其比較)。
在某些實(shí)施方案中，方法還包括步驟g)向測(cè)試動(dòng)物施用雙物種改良變體，其中測(cè)試動(dòng)物是第二個(gè)物種的一個(gè)成員。在其他實(shí)施方案中，方法還在步驟a)之前包括一個(gè)步驟，即在Fc受體(FcR)結(jié)合測(cè)定法中篩選候選變體的步驟。在某些實(shí)施方案中，F(xiàn)cR結(jié)合測(cè)定法是Fc新生兒受體(FcRn)結(jié)合測(cè)定法。
在一些實(shí)施方案中，方法還在步驟a)之前包括一個(gè)步驟，即在CDC測(cè)定法中篩選候選變體的步驟(見(jiàn)例如以下第IV部分)。在一些實(shí)施方案中，第一個(gè)物種的效應(yīng)細(xì)胞是人外周血單核細(xì)胞(PBMC)。在其他實(shí)施方案中，第一個(gè)物種的效應(yīng)細(xì)胞是小鼠PBMC或大鼠PBMC。在某些實(shí)施方案中，第二個(gè)物種的效應(yīng)細(xì)胞是小鼠PBMC或大鼠PBMC。在特定實(shí)施方案中，第二個(gè)物種的效應(yīng)細(xì)胞是人PBMC。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供鑒定雙物種改良變體的方法，其包括a)提供i)組合物，其包含具有Fc區(qū)的母體多肽的候選變體，其中候選變體在Fc區(qū)內(nèi)包含至少一處氨基酸修飾，并且其中候選變體較母體多肽更有效地介導(dǎo)CDC，和iii)第二個(gè)物種來(lái)源的補(bǔ)體，以及b)將組合物與第二個(gè)物種來(lái)源的補(bǔ)體溫育，c)確定候選變體是否較母體多肽更有效地介導(dǎo)CDC。在特定實(shí)施方案中，該方法還包括步驟d)鑒定作為雙物種改良變體的候選變體。
在一些實(shí)施方案中，靶細(xì)胞是人細(xì)胞(例如，過(guò)表達(dá)如下一種或多種腫瘤相關(guān)抗原CD20、CD22、CD33、CD40、CD63、EGF受體、her-2受體、前列腺特異性膜抗原、Lewis Y糖類、GD2和GD3神經(jīng)節(jié)苷脂、lamp-1、CO-029、L6和ephA2)。在某些實(shí)施方案中，變體包括靶細(xì)胞特異性的抗體或其部分。在其他實(shí)施方案中，在第一個(gè)物種的效應(yīng)細(xì)胞存在時(shí)，候選變體較母體多肽以大約1.2倍地更有效介導(dǎo)靶細(xì)胞細(xì)胞毒性。在一些實(shí)施方案中，步驟e)包括周母體多肽開(kāi)展對(duì)照反應(yīng)。在另外的實(shí)施方案中，測(cè)量包括靶細(xì)胞死亡或靶細(xì)胞裂解的定量。在其他實(shí)施方案中，靶細(xì)胞被感染病毒(例如HIV、CMV、乙型肝炎病毒或RSV)或微生物(例如葡萄球菌(Staphylococcus)、鏈球菌(Streptococcus)、假單胞菌(Pseudomonas)等)。在某些實(shí)施方案中，靶細(xì)胞是微生物(例如葡萄球菌、鏈球菌、假單胞菌等)。在一些實(shí)施方案中，靶細(xì)胞由病毒替代(例如HIV、CMV、乙型肝炎病毒或RSV)。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含CD20結(jié)合分子或編碼CD20結(jié)合分子的核酸序列的組合物，其中CD20結(jié)合分子包含輕鏈可變區(qū)，并且其中輕鏈可變區(qū)包含在SEQ ID NO57中所示氨基酸序列。在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含CD20結(jié)合分子或編碼CD20結(jié)合分子的核酸序列的組合物，其中CD20結(jié)合分子包含重鏈可變區(qū)，并且其中重鏈可變區(qū)包含在SEQ ID NO58中所示氨基酸序列。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含CD20結(jié)合分子或編碼CD20結(jié)合分子的核酸序列的組合物(見(jiàn)例如圖16)，其中CD20結(jié)合分子包含輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)，其中輕鏈可變區(qū)包含在SEQ ID NO57中所示的氨基酸序列(見(jiàn)圖15)并且其中重鏈可變區(qū)包含在SEQ ID NO58中所示的氨基酸序列(見(jiàn)圖15)。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含多肽的組合物，其中多肽包含i)未修飾的人骨架區(qū)(例如未改變天然存在的人骨架區(qū))，以及ii)變體Fc區(qū)。在某些實(shí)施方案中，未修飾的人骨架區(qū)是人類種系的骨架區(qū)。在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含多肽的組合物，其中多肽包含i)至少一種已隨機(jī)化的CDR序列和ii)變體Fc區(qū)。在又一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含多肽的組合物，其中多肽包含i)未修飾的人骨架區(qū)(例如人類種系的骨架區(qū))，ii)至少一種已隨機(jī)化的CDR序列和iii)變體Fc區(qū)。


圖1顯示了帶有標(biāo)注的多種區(qū)域和部分的IgG分子圖示。
圖2顯示多種母體Fc氨基酸序列的比對(duì)，包括人IgG1(顯示非a同種異型(SEQ ID NO1)和a同種異型)、人IgG2(SEQ ID NO2)、人IgG3(SEQ ID NO3)、人IgG4(SEQ ID NO4)、鼠IgG1(SEQ ID NO5)、鼠IgG2A(SEQ ID NO6)、鼠IgG2B(SEQ ID NO7)和鼠IgG3(SEQID NO8)。
圖3顯示多種氨基酸序列，包括人IgG1的CH2區(qū)(SEQ ID NO9)和CH3區(qū)(SEQ ID NO10)，以及包括CH1區(qū)、鉸鏈區(qū)、CH2區(qū)和CH3區(qū)的人IgG1的f同種異型(SEQ ID NO11)和a、z同種異型(SEQ IDNO12)序列。
圖4顯示在局部周圍序列環(huán)境中的變體中已改變的氨基酸序列。
圖5顯示編碼母體多肽的核苷酸序列。
圖6顯示在局部周圍核酸序列環(huán)境中的變體中已改變的核酸序列。
圖7A顯示野生型Fc區(qū)與在330和332位置上的A330K、A330R、I332E及組合突變的ADCC測(cè)定結(jié)果比較。
圖7B顯示Fc區(qū)氨基酸變體I332D和I332E與Fc區(qū)聚糖修飾變體33(GnTIII)的ADCC測(cè)定結(jié)果比較以及氨基酸修飾外加聚糖修飾33(I332E+GnTIII)對(duì)ADCC活性的影響。
圖8顯示使用純化的變體IgG所獲得的代表性ADCC數(shù)據(jù)。
圖9顯示了對(duì)CD20抗原為低親和性的可變區(qū)變體(6F1)和對(duì)CD20抗原為相對(duì)高親和性的可變區(qū)變體(33和5)針對(duì)Wil-2(A)或SKW6.4(B)靶細(xì)胞系的ADCC活性。
圖10顯示FcγRI結(jié)合Fc區(qū)變體IgG的滴定曲線。
圖11A、B和C顯示從使用人補(bǔ)體和Ramos靶細(xì)胞滴定Fc區(qū)變體所獲得的代表性CDC數(shù)據(jù)。
圖12顯示使用含W(高親和性)基因型FcγRIIIa受體的全血樣品通過(guò)AME-133(帶有I332E Fc變體序列的可變區(qū)33)、Rituxan和非特異性IgG造成的代表性B細(xì)胞損耗。
圖13顯示使用含F(xiàn)F(低親和性)基因型FcγRIIIa受體的全血樣品通過(guò)AME-133(帶有I332E Fc變體序列的可變區(qū)33)、Rituxan和非特異性IgG造成的代表性B細(xì)胞損耗。
圖14顯示使用全血樣品通過(guò)Rituxan、非特異性IgG和變體A378D和T256P、I332E造成的代表性B細(xì)胞損耗。
圖15顯示AME-133(具有I332E的Fc變體序列的可變區(qū)33)的輕鏈氨基酸序列(SEQ ID NO57)和重鏈氨基酸序列(SEQ ID NO58)。
圖16顯示AME-133(具有I332E的Fc變體序列的可變區(qū)33)的輕鏈核苷酸序列(SEQ ID NO59)和重鏈核苷酸序列(SEQ ID NO60)。
定義為便于理解本發(fā)明，眾多術(shù)語(yǔ)如下定義。
如此處所使用，術(shù)語(yǔ)“受試者”和“患者”指任何動(dòng)物，如狗、貓類的哺乳動(dòng)物、鳥(niǎo)、家畜，并且優(yōu)選地是人(例如患有疾病的人)。
如此處所使用，術(shù)語(yǔ)“編碼……的核酸分子”、“編碼……的DNA序列”和“編碼……的DNA”指脫氧核糖核苷酸沿脫氧核糖核酸鏈的順序或序列。這些脫氧核糖核苷酸的順序決定沿多肽(蛋白質(zhì))鏈的氨基酸順序。因此DNA序列編碼氨基酸序列。
將DNA分子稱作具有“5’末端”和“3’末端”，這是因?yàn)榭蓪魏塑账嵋匀绱朔绞椒磻?yīng)以產(chǎn)生寡核苷酸或多核苷酸，即一個(gè)單核苷酸戊糖環(huán)中的5’磷酸通過(guò)磷酸二酯鍵以一個(gè)方向與其臨近單核苷酸戊糖環(huán)中的3’氧連接。因而，如果寡核苷酸或多核苷酸的一個(gè)末端的5’磷酸未與單核苷酸戊糖環(huán)的3’氧連接則將該末端稱為“5’末端”，并且如果一個(gè)末端的3’氧未與下一個(gè)單核苷酸戊糖環(huán)的5’磷酸連接則將該末端稱為“3’末端”。如此處所使用，即便一個(gè)核酸序列位于一個(gè)更大的寡核苷酸或多核苷酸內(nèi)部，仍可稱其具有5’和3’末端。在線性或環(huán)狀DNA分子中，將間斷的元件稱為“下游”或3’端元件的“上游”或5’端。該術(shù)語(yǔ)學(xué)反映了這樣一種事實(shí)，即轉(zhuǎn)錄沿著DNA鏈以5’至3’方式前進(jìn)。指導(dǎo)所連接基因轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子元件通常位于編碼區(qū)的5’端或上游。然而，增強(qiáng)子元件即便位于啟動(dòng)子元件和編碼區(qū)3’端仍能發(fā)揮其作用。轉(zhuǎn)錄終止和多腺苷酸化信號(hào)位于編碼區(qū)3’端或下游。
如此處所使用，術(shù)語(yǔ)“密碼子”或“三聯(lián)體”指三個(gè)毗鄰核苷酸單體的聯(lián)合體，該聯(lián)合體在多肽生物合成中指定二十種天然存在的氨基酸之一。該術(shù)語(yǔ)還包括不指定任何氨基酸的無(wú)義密碼子。
如此處所使用，術(shù)語(yǔ)“具有編碼多肽的核苷酸序列的寡核苷酸”、“具有編碼多肽的核苷酸序列的多核苷酸”和“編碼多肽的核酸序列”意為包含特定多肽編碼區(qū)的核酸序列。該編碼區(qū)可以cDNA、基因組DNA或RNA的形式存在。當(dāng)以DNA形式存在時(shí)，寡核苷酸或多核苷酸可為單鏈(即有義鏈)或雙鏈。可根據(jù)需要在緊臨基因編碼區(qū)處放置適宜控制元件如增強(qiáng)子/啟動(dòng)子、剪接信號(hào)、多腺苷酸化信號(hào)等，以便促使正確的轉(zhuǎn)錄起始和/或初級(jí)RNA轉(zhuǎn)錄物的正確加工。備選地，本發(fā)明表達(dá)載體中所用的編碼區(qū)可含有內(nèi)源性增強(qiáng)子/啟動(dòng)子、剪接信號(hào)、間插序列、多腺苷酸化信號(hào)等等或者內(nèi)源性和外源性控制元件的組合。
如此處所使用，術(shù)語(yǔ)“互補(bǔ)的”或“互補(bǔ)性”用來(lái)指按堿基配對(duì)規(guī)則關(guān)聯(lián)的多核苷酸(即核苷酸序列)。例如，對(duì)于序列“A-G-T”，其與序列“T-C-A”互補(bǔ)?！盎パa(bǔ)”可以是“部分”互補(bǔ)，即僅僅核酸的某些堿基根據(jù)堿基配對(duì)規(guī)則匹配?；蛘?，核酸之間可“完全”互補(bǔ)或“全部”互補(bǔ)。核酸鏈之間的互補(bǔ)程度顯著影響核酸鏈之間雜交的效率和強(qiáng)度。這在擴(kuò)增反應(yīng)以及依賴核酸之間結(jié)合的方法中尤其重要。
如此處所使用，術(shù)語(yǔ)特定序列的“互補(bǔ)物”用來(lái)指與一個(gè)序列在全部長(zhǎng)度上完全互補(bǔ)的序列。例如序列A-G-T-A是序列T-C-A-T的“互補(bǔ)物”。
術(shù)語(yǔ)“同源性”(當(dāng)指核酸序列時(shí))指互補(bǔ)程度。可為部分同源性或完全同源性(即同一性)。部分互補(bǔ)的序列是至少部分抑制完全互補(bǔ)的序列與靶核酸雜交的序列并且用功能性術(shù)語(yǔ)“基本同源的”描述。當(dāng)用來(lái)指核酸結(jié)合時(shí)，術(shù)語(yǔ)“對(duì)結(jié)合的抑制”指通過(guò)同源序列對(duì)靶序列結(jié)合的競(jìng)爭(zhēng)所導(dǎo)致的對(duì)結(jié)合的抑制?？墒褂玫蛧?yán)格條件下的雜交測(cè)定法(Southern或Northern印跡、溶液雜交等等)檢測(cè)對(duì)完全互補(bǔ)序列與靶序列雜交的抑制?；就吹男蛄谢蛱结槍⒃诘蛧?yán)格條件下競(jìng)爭(zhēng)和抑制完全同源序列與靶標(biāo)的結(jié)合(即雜交)。這并不是說(shuō)低嚴(yán)格條件是允許非特異性結(jié)合的條件；低嚴(yán)格條件要求兩種序列的相互結(jié)合應(yīng)當(dāng)是特異性(即選擇性)相互作用?？赏ㄟ^(guò)使用甚至缺乏部分互補(bǔ)性(例如小于大約30％的同一性)的第二個(gè)靶標(biāo)測(cè)試非特異性結(jié)合的缺乏；在沒(méi)有非特異性結(jié)合時(shí)，探針將不與第二個(gè)非互補(bǔ)靶標(biāo)雜交。
本領(lǐng)域眾所周知，眾多等效條件包含低嚴(yán)格條件；要考慮因素例如探針的長(zhǎng)度和性質(zhì)(DNA、RNA、堿基組成)和靶標(biāo)的性質(zhì)(DNA、RNA、堿基組成、存在于溶液中或已固定等)和鹽及其他成分的濃度(例如存在或不存在甲酰胺、硫酸葡聚糖、聚乙二醇)并且可改變雜交溶液以產(chǎn)生不同于、但等效于上述所列的低嚴(yán)格雜交條件。此外，本領(lǐng)域知曉促進(jìn)高嚴(yán)格條件下雜交的條件(例如提高雜交和/或洗滌步驟溫度、在雜交溶液中使用甲酰胺等)。
核酸序列(例如編碼變體Fc區(qū)或其部分)可通過(guò)初級(jí)RNA轉(zhuǎn)錄物的不同剪接產(chǎn)生多種RNA。同一基因的剪接變體將包含序列同一性或完全同源性的區(qū)域(代表在兩種cDNA中存在相同的外顯子或相同的外顯子部分)和完全非同一性的區(qū)域(例如，代表在cDNA1中存在外顯子“A”而cDNA2含有外顯子“B”)。因?yàn)閮煞NcDNA含有序列同一性的區(qū)域，它們都與來(lái)自含有兩種cDNA中均存在序列的完整基因或其部分的探針雜交；因此這兩種剪接變體與此探針基本同源和彼此基本同源。
當(dāng)用來(lái)指單鏈核酸序列時(shí)，術(shù)語(yǔ)“基本同源”指可在低嚴(yán)格條件與單鏈核酸序列雜交的任何探針(即其是該單鏈核酸序列的互補(bǔ)物)。
如此處所使用，術(shù)語(yǔ)“雜交”用來(lái)指互補(bǔ)核酸的配對(duì)。雜交和雜交強(qiáng)度(即核酸之間結(jié)合的強(qiáng)度)受諸如核酸間互補(bǔ)性、所涉及條件的嚴(yán)格性、所形成雜交體的Tm、核酸的G∶C比的因素影響。
如此處所使用，術(shù)語(yǔ)“Tm”用來(lái)指“解鏈溫度”。解鏈溫度是當(dāng)雙鏈核酸分子群體中的一半解離為單鏈時(shí)的溫度。計(jì)算核酸Tm的方程為本領(lǐng)域眾所周知。如標(biāo)準(zhǔn)參考文獻(xiàn)所指出，當(dāng)核酸處于1M NaCl水溶液中時(shí)，可通過(guò)方程Tm＝81.5+0.41(％G+C)計(jì)算來(lái)簡(jiǎn)單估計(jì)Tm值(見(jiàn)例如Anderson和Young，Quantitative Filter Hyberization，in Neucleic AcidHyberization )。其他參考文獻(xiàn)包括更復(fù)雜的計(jì)算，其將結(jié)構(gòu)和序列特征加以考慮計(jì)算Tm，并且在某些情況下，可通過(guò)以所計(jì)算的Tm開(kāi)始測(cè)試溫度小量提高或降低并檢查其對(duì)核酸分子群體的影響來(lái)根據(jù)經(jīng)驗(yàn)確定Tm。
如此處所使用，術(shù)語(yǔ)“嚴(yán)格”用來(lái)指開(kāi)展核酸雜交的溫度、離子強(qiáng)度和其他化合物如有機(jī)溶劑存在的條件。本領(lǐng)域技術(shù)人員將意識(shí)到，可通過(guò)單獨(dú)或一致性地變換上面剛剛描述的參數(shù)來(lái)改變“嚴(yán)格”條件。在“高嚴(yán)格”條件下，核酸堿基配對(duì)將只在具有高頻率互補(bǔ)堿基序列的核酸片段之間發(fā)生(例如“高嚴(yán)格”條件下的雜交可在具有大約85-100％同一性、優(yōu)選大約70-100％同一性的同系物之間發(fā)生)。在中等嚴(yán)格條件下，核酸堿基配對(duì)將在具有中等程度互補(bǔ)堿基序列的核酸之間發(fā)生(例如“中等嚴(yán)格”條件下的雜交可在具有大約50-70％同一性的同系物間發(fā)生。因此，從遺傳多樣的生物來(lái)源的核酸由于互補(bǔ)序列頻率通常較低常需要“弱”或“低”嚴(yán)格條件。
當(dāng)用來(lái)指核酸雜交時(shí)，“高嚴(yán)格條件”包含等效于以下的條件當(dāng)使用長(zhǎng)約500個(gè)核苷酸的探針時(shí)，于42℃在由5×SSPE(43.8g/l NaCl、6.9g/l NaH2PO4H2O和1.85g/l EDTA，用NaOH調(diào)至pH 7.4)、0.5％SDS、5×Denhardt試劑和100μg/ml變性鮭精DNA組成的溶液中結(jié)合或雜交，隨后于42℃在含有0.1×SSPE、1.0％SDS的溶液中洗滌。
當(dāng)用來(lái)指核酸雜交時(shí)，“中嚴(yán)格條件”包含等效于以下的條件當(dāng)使用長(zhǎng)約500個(gè)核苷酸的探針時(shí)，于42℃在由5×SSPE(43.8g/l NaCl、6.9g/l NaH2PO4H2O和1.85g/l EDTA，用NaOH調(diào)至pH 7.4)、0.5％SDS、5×Denhardt試劑和100μg/ml變性鮭精DNA組成的溶液中結(jié)合或雜交，隨后于42℃在含有1.0×SSPE、1.0％SDS的溶液中洗滌。
“低嚴(yán)格條件”包含等效于以下的條件當(dāng)使用長(zhǎng)約500個(gè)核苷酸的探針時(shí)，于42℃在由5×SSPE(43.8g/l NaCl、6.9g/l NaH2PO4H2O和1.85g/l EDTA，用NaOH調(diào)至pH 7.4)、0.1％SDS、5×Denhardt試劑[每500ml的50×Denhardt含有5g Ficoll(Type 400，Pharmacia)、5g BSA(第V組分；Sigma)]和100μg/ml變性鮭精DNA組成的溶液中結(jié)合或雜交，隨后于42℃在包含5.0×SSPE、0.1％SDS的溶液中洗滌。
用如下術(shù)語(yǔ)描述兩種或多種多核苷酸之間的序列關(guān)系“參考序列”、“序列同一性”和“序列同一性百分?jǐn)?shù)”?！皡⒖夹蛄小笔怯米餍蛄斜容^基礎(chǔ)的已定義的序列；參考序列可以是較大序列的子序列(例如作為在序列列表中所給出的全長(zhǎng)cDNA序列的片段)或包含完整的基因序列。通常，參考序列長(zhǎng)度為至少20個(gè)核苷酸，常常至少25個(gè)核苷酸，并且經(jīng)常至少50個(gè)核苷酸(例SEQ ID NO32-37的任一序列可用作參考序列)。因?yàn)閮煞N多核苷酸的每一種可(1)包含在這兩種多核苷酸間相似的序列(即完整多核苷酸序列的部分)，和(2)還包含在兩種多核苷酸間不相同的序列，所以兩種(或多種)多核苷酸間的序列比較一般通過(guò)比較“比較窗口”中的兩種多核苷酸的序列進(jìn)行以鑒定和比較序列相似的局部區(qū)域。如此處所使用，“比較窗口”指至少20個(gè)連續(xù)核苷酸位置的概念上的片段，其中多核苷酸序列與至少20個(gè)連續(xù)核苷酸的參考序列比較，并且其中為了優(yōu)化兩種序列的比對(duì)在比較窗口內(nèi)的多核苷酸序列部分與參考序列(其不含插入和缺失)相比可包含20％或更低的插入或缺失(即缺口)。用于比較窗口比對(duì)的優(yōu)化的序列比對(duì)可通過(guò)Smith和Waterman的局部同源性算法[Smith和Waterman，Adv.Appl.Math.2482(1981)]、通過(guò)Needleman和Wunsch的同源性比對(duì)算法[Needleman和Wunsch，J.Mol.Biol.48443(1970)]、通過(guò)Pearson和Lipman的相似性搜索方法[Pearson和Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)852444(1988)]、通過(guò)這些算法的計(jì)算機(jī)化執(zhí)行(在Wisconsin Genetics軟件包7.0版中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，Genetics Computer Group，575 ScienceDr.，Madison，Wis.)或通過(guò)檢查進(jìn)行，并且選擇了通過(guò)多種方法產(chǎn)生的最佳比對(duì)(即在比較窗口中產(chǎn)生最高同源性百分?jǐn)?shù))。術(shù)語(yǔ)“序列同一性”意思是指比較窗口中的兩種多核苷酸序列是相同的(即在一個(gè)個(gè)核苷酸的基礎(chǔ)上)。術(shù)語(yǔ)“序列同一性百分?jǐn)?shù)”通過(guò)如下步驟計(jì)算比較在比較窗口內(nèi)經(jīng)優(yōu)化比對(duì)的兩種序列，確定兩種序列中出現(xiàn)的相同核酸堿基(例如A、T、C、G、U或I)的位置數(shù)目以得到配對(duì)位置數(shù)，將配對(duì)位置數(shù)除以比較窗口(即窗口大小)中的位置總數(shù)并且將該結(jié)果乘以100以產(chǎn)生序列同一性百分?jǐn)?shù)。如本申請(qǐng)中所用，比較窗口是所引用參考序列的全長(zhǎng)(即如果將SEQ ID NO33引用作為參考序列，序列同一性百分?jǐn)?shù)在SEQ IDNO33的全長(zhǎng)范圍內(nèi)比較)。
如此處所使用，術(shù)語(yǔ)“探針”指能與另一目的寡核苷酸雜交的寡核苷酸(即核苷酸序列)，而無(wú)論其是天然存在的(作為純化的限制性消化物)還是合成產(chǎn)生的、重組產(chǎn)生的或通過(guò)PCR擴(kuò)增產(chǎn)生的。探針可為單鏈或雙鏈。探針可用于特定基因序列的檢測(cè)、鑒定和分離。可以預(yù)計(jì)，本發(fā)明中所用的任何探針可用任何“報(bào)道分子”標(biāo)記，以便在任何檢測(cè)系統(tǒng)中可檢測(cè)到，其中檢測(cè)系統(tǒng)包括但不限于酶系統(tǒng)(例如ELISA、以及基于酶的組織化學(xué)測(cè)定法)、熒光系統(tǒng)、放射性系統(tǒng)和發(fā)光系統(tǒng)。本發(fā)明將不限于任何特定的探測(cè)系統(tǒng)或標(biāo)記。
如此處所使用，術(shù)語(yǔ)“聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)”(“PCR”)指美國(guó)專利號(hào)4,683,195、4,683,202和4,965,188(在此處引用作為參考)中描述的方法，其描述了用于無(wú)需克隆或純化而提高基因組DNA混合物中靶序列片段濃度的方法。這種擴(kuò)增靶序列的方法為向含有目的靶序列的DNA混合物中加入兩種大大過(guò)量的寡核苷酸引物，隨后在DNA聚合酶存在下按精確順序進(jìn)行熱循環(huán)。兩種引物與雙鏈靶序列中各個(gè)鏈互補(bǔ)。為實(shí)施擴(kuò)增，將混合物變性，然后引物與靶分子內(nèi)的其互補(bǔ)序列退火。退火后，用聚合酶延伸引物以至形成一對(duì)新的互補(bǔ)鏈。變性、引物退火和聚合酶延伸步驟可重復(fù)多次(即變性、退火和延伸構(gòu)成一個(gè)“循環(huán)”，可進(jìn)行許多“循環(huán)”)以便獲得高濃度的目的靶序列的擴(kuò)增片段。目的靶序列擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度由引物彼此間的相對(duì)位置決定，因此其長(zhǎng)度是一個(gè)可控參數(shù)。由于本方法具有可重復(fù)的特點(diǎn)，所以將此方法稱作“聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)”(以下稱作“PCR”)。因?yàn)榘行蛄械哪康臄U(kuò)增片段成為了混合物中的主要序列(就濃度而言)，故他們被稱為是“PCR擴(kuò)增的”。
利用PCR，可將基因組DNA中單拷貝的特定靶序列擴(kuò)增至可通過(guò)幾種不同方法學(xué)(例如使用標(biāo)記探針的雜交；在生物素化引物摻入后用抗生物素蛋白-酶綴合物檢測(cè)；所擴(kuò)增的片段中32P-標(biāo)記脫氧核苷酸三磷酸如dCTP或dATP的摻入)可檢測(cè)的水平。使用適宜的引物分子對(duì)除了可以擴(kuò)增基因組DNA以外，還可擴(kuò)增任何寡核苷酸或多核苷酸序列。具體而言，通過(guò)PCR方法自身所產(chǎn)生的擴(kuò)增片段本身就是后續(xù)PCR擴(kuò)增的高效模板。
術(shù)語(yǔ)“分離的”當(dāng)涉及核酸使用時(shí)，如在“分離的寡核苷酸”或“分離的多核苷酸”中使用時(shí)，是指已鑒定的并且從至少一種在天然來(lái)源中通常結(jié)合的污染物核酸分離的核酸序列。所分離的核酸以一種不同于天然存在時(shí)的方式或環(huán)境存在。因此所分離的核酸分子與在天然細(xì)胞中存在的核酸分子可以區(qū)分。然而，所分離的核酸分子包括通常表達(dá)多肽的細(xì)胞中所含有的核酸分子，例如核酸分子位于與其在天然細(xì)胞的染色體位置不同的染色體位置內(nèi)。所分離的核酸、寡核苷酸或多核苷酸可以單鏈或雙聯(lián)形式存在。當(dāng)所分離的核酸、寡核苷酸或多核苷酸用于表達(dá)蛋白質(zhì)時(shí)，該寡核苷酸或多核苷酸將最低限度地包含有義鏈或編碼鏈(即寡核苷酸或多核苷酸可為單鏈)，但是可包含有義鏈和反義鏈(即寡核苷酸或多核苷酸可為雙鏈)。
如此處所使用，術(shù)語(yǔ)“部分”當(dāng)用來(lái)指核苷酸序列(如在“特定核苷酸序列的部分”)時(shí)指的是該序列的片段。片段大小范圍為從10個(gè)核苷酸至比全部核苷酸序列少一個(gè)核苷酸的核苷酸(例如10個(gè)核苷酸、20個(gè)、30個(gè)、40個(gè)、50個(gè)、100個(gè)、200個(gè)等)。
如此處所使用，術(shù)語(yǔ)“部分”當(dāng)用來(lái)指氨基酸序列(如在“特定氨基酸序列的部分”)時(shí)指的是該序列的片段。片段大小范圍為從6個(gè)氨基酸至比全部氨基酸序列少一個(gè)氨基酸的氨基酸(例如6個(gè)氨基酸、10個(gè)、20個(gè)、30個(gè)、40個(gè)、75個(gè)、200個(gè)等)。
如此處所使用，術(shù)語(yǔ)“純化的”或“純化”指將污染物從樣品中去除。例如，通過(guò)去除污染性非免疫球蛋白的蛋白質(zhì)可純化抗原特異性抗體；還可通過(guò)去除不結(jié)合同一抗原的免疫球蛋白來(lái)純化這些抗體。去除非免疫球蛋白和/或去除不結(jié)合特定抗原的免疫球蛋白導(dǎo)致樣品中抗原特異性免疫球蛋白百分?jǐn)?shù)增加。在另一個(gè)例子中，重組的抗原特異性多肽在細(xì)菌宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，并且通過(guò)去除宿主細(xì)胞蛋白來(lái)純化多肽；由此樣品中重組抗原特異性多肽百分?jǐn)?shù)增加。
如此處所使用，術(shù)語(yǔ)“重組DNA分子”指由通過(guò)分子生物學(xué)技術(shù)連接在一起的DNA片段組成的DNA分子。
如此處所使用，術(shù)語(yǔ)“重組蛋白”和“重組多肽”指由重組DNA分子所表達(dá)的蛋白質(zhì)分子。
如此處所使用，術(shù)語(yǔ)“天然蛋白”指不含由載體序列所編碼的氨基酸殘基的蛋白質(zhì)；即該天然蛋白僅含有通常在天然蛋白質(zhì)內(nèi)存在的那些氨基酸殘基。天然蛋白可通過(guò)重組方式產(chǎn)生或從天然存在來(lái)源中分離。
術(shù)語(yǔ)“Southern印跡”指對(duì)瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠中的DNA進(jìn)行分析，在凝膠中根據(jù)大小分離DNA，隨后將該DNA從凝膠轉(zhuǎn)移至固體支持物如硝酸纖維素膜或尼龍膜。然后用標(biāo)記的探針探測(cè)已固定的DNA以便檢測(cè)與所用探針互補(bǔ)的DNA種類。DNA可在電泳前用限制性酶切割。電泳后，DNA可在轉(zhuǎn)移至固體支持物之前或轉(zhuǎn)移期間部分地脫嘌呤以及變性。Southern印跡是分子生物學(xué)家的標(biāo)準(zhǔn)工具(J.Sambrook等，MolecularCloningA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Press，NY，第9.31-9.58頁(yè) )。
如此處所使用，術(shù)語(yǔ)“Northern印跡”指對(duì)RNA的分析，通過(guò)在瓊脂糖凝膠中將RNA電泳以便根據(jù)大小分離RNA，隨后將RNA從凝膠轉(zhuǎn)移至固體支持物如硝酸纖維素膜或尼龍膜上。然后用標(biāo)記的探針探測(cè)已固定的RNA以便檢測(cè)與所用探針互補(bǔ)的RNA種類。Northern印跡是分子生物學(xué)家的標(biāo)準(zhǔn)工具(J.Sambrook，等，同上，第7.39-7.52頁(yè) )。
術(shù)語(yǔ)“Western印跡”指對(duì)固定于支持物如硝酸纖維素膜或尼龍膜上的蛋白質(zhì)(或多肽)進(jìn)行分析。將蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠上電泳以分離蛋白質(zhì)，隨后將蛋白質(zhì)從凝膠中轉(zhuǎn)移至固體支持物如硝酸纖維素膜或尼龍膜。隨后已固定的蛋白質(zhì)與具有目的抗原反應(yīng)性的抗體接觸。可通過(guò)多種方法包括使用放射性標(biāo)記抗體檢測(cè)抗體的結(jié)合。
如此處所使用，術(shù)語(yǔ)“抗原決定簇”指抗原中與特定抗體接觸的部分(即表位)。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)或蛋白質(zhì)片段用于免疫宿主動(dòng)物時(shí)，該蛋白質(zhì)的多個(gè)區(qū)域可誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性地結(jié)合該蛋白質(zhì)特定區(qū)域或三維結(jié)構(gòu)的抗體，將這些區(qū)域或結(jié)構(gòu)稱做抗原決定簇?？乖瓫Q定簇可與完整抗原(即用于引起免疫應(yīng)答的“免疫原”)競(jìng)爭(zhēng)對(duì)抗體的結(jié)合。
如此處所使用，術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)基因”指通過(guò)向新近受精的卵或早期胚胎導(dǎo)入基因而置于生物中的外來(lái)基因、異源基因或自體基因。術(shù)語(yǔ)“外來(lái)基因”指通過(guò)實(shí)驗(yàn)操作導(dǎo)入動(dòng)物基因組的任何核酸(例如基因序列)，并且可包括該動(dòng)物內(nèi)存在的基因序列，只要所導(dǎo)入基因不處于天然存在基因的同一位置即可。術(shù)語(yǔ)“自體基因”旨在包括天然存在基因的變體(例如多態(tài)性或突變體)。因此，術(shù)語(yǔ)轉(zhuǎn)基因包括用基因的變體形式對(duì)天然存在基因形式的替換。
如此處所使用，術(shù)語(yǔ)“載體”用來(lái)指將DNA片段從一種細(xì)胞轉(zhuǎn)移至另一種細(xì)胞的核酸分子。術(shù)語(yǔ)“運(yùn)載體”有時(shí)與“載體”互換使用。
如此處所使用，術(shù)語(yǔ)“表達(dá)載體”指重組DNA分子，其含有目的編碼序列和對(duì)于有效連接的編碼序列在特定宿主生物中表達(dá)所必需的適宜核酸序列。在原核生物中表達(dá)所必需的核酸序列通常包括經(jīng)常和其他序列在一起的啟動(dòng)子、操縱基因(任選)和核糖體結(jié)合位點(diǎn)。已知真核細(xì)胞利用啟動(dòng)子、增強(qiáng)子以及終止和多腺苷酸化信號(hào)。
如此處所使用，術(shù)語(yǔ)“宿主細(xì)胞”指任何真核或原核細(xì)胞(例如細(xì)菌細(xì)胞如大腸桿菌(E.coli.)、CHO細(xì)胞、酵母細(xì)胞、哺乳動(dòng)物細(xì)胞、禽類細(xì)胞、兩棲類細(xì)胞、植物細(xì)胞、魚類細(xì)胞和昆蟲細(xì)胞)，無(wú)論其位于體外(in vitro)或體內(nèi)(in vivo)。例如，宿主細(xì)胞可位于轉(zhuǎn)基因動(dòng)物內(nèi)。
如此處所使用，術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)染”和“轉(zhuǎn)化”指外來(lái)DNA向細(xì)胞(例如真核以及原核細(xì)胞)中的導(dǎo)入。轉(zhuǎn)染可通過(guò)本領(lǐng)域已知的眾多方法實(shí)現(xiàn)，包括磷酸鈣-DNA共沉淀法、DEAE-葡聚糖介導(dǎo)轉(zhuǎn)染法、Polybrene介導(dǎo)轉(zhuǎn)染法、電穿孔法、微注射法、脂質(zhì)體融合法、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染法、原生質(zhì)體融合法、逆轉(zhuǎn)錄病毒法和生物射彈法。
術(shù)語(yǔ)“穩(wěn)定轉(zhuǎn)染”或“穩(wěn)定地轉(zhuǎn)染”指外來(lái)DNA向所轉(zhuǎn)染細(xì)胞基因組內(nèi)內(nèi)的導(dǎo)入和整合。術(shù)語(yǔ)“穩(wěn)定轉(zhuǎn)染體”指具有已穩(wěn)定整合至基因組DNA內(nèi)的外來(lái)DNA的細(xì)胞。
術(shù)語(yǔ)“瞬時(shí)轉(zhuǎn)染”或“瞬時(shí)地轉(zhuǎn)染”指將外來(lái)DNA向細(xì)胞內(nèi)的導(dǎo)入，其中外來(lái)DNA未整合至所轉(zhuǎn)染細(xì)胞的基因組內(nèi)。外來(lái)DNA在已轉(zhuǎn)染細(xì)胞的細(xì)胞核內(nèi)持續(xù)存留數(shù)日。在此期間，外來(lái)DNA受到?jīng)Q定染色體中內(nèi)源性基因表達(dá)的調(diào)節(jié)控制。術(shù)語(yǔ)“瞬時(shí)轉(zhuǎn)染體”指已接受外來(lái)DNA但是可能并未整合該DNA的細(xì)胞。
術(shù)語(yǔ)“磷酸鈣共沉淀法”指用于將核酸導(dǎo)入細(xì)胞的技術(shù)。當(dāng)核酸作為磷酸鈣-核酸共沉淀物存在時(shí)，增強(qiáng)了細(xì)胞對(duì)該核酸的攝取。Graham和vander Eb的原創(chuàng)技術(shù)(Graham and van der Eb，Virol.，52456 )已經(jīng)由幾個(gè)研究組修改以優(yōu)化用于特定類型細(xì)胞的條件。本領(lǐng)域熟知這類為數(shù)眾多的修改。
如此處所使用，“包含特定多核苷酸序列的組合物”廣泛地指任何含有特定多核苷酸序列的組合物。該組合物可包含水溶液。包含編碼例如變體Fc區(qū)或其片段的多核苷酸序列的組合物可用作雜交探針。在此情況下，編碼變體Fc區(qū)的多核苷酸序列一般在含有鹽(例如NaCl)、去污劑(例如SDS)和其他成分(例如Denhardt溶液、干奶粉、鮭精DNA等)的水溶液中應(yīng)用。
術(shù)語(yǔ)“測(cè)試化合物”或“候選化合物”指可用于治療或預(yù)防疾病、不適、病癥或身體功能紊亂或者改變樣品生理學(xué)或細(xì)胞狀態(tài)的任何化學(xué)實(shí)體、藥物、藥等。測(cè)試化合物包括已知的和潛在的治療化合物?？赏ㄟ^(guò)使用本發(fā)明篩選方法進(jìn)行篩選來(lái)確定測(cè)試化合物的治療性?！耙阎闹委熁衔铩敝敢炎C實(shí)在治療或預(yù)防中有效的(例如通過(guò)動(dòng)物試驗(yàn)或施與人的先前經(jīng)驗(yàn))治療化合物。
如此處所使用，關(guān)于測(cè)定法的術(shù)語(yǔ)“反應(yīng)”指可檢測(cè)信號(hào)的產(chǎn)生(例如報(bào)道蛋白質(zhì)的積累、離子濃度的增加、可檢測(cè)化學(xué)產(chǎn)物的積累)。
如此處所使用，術(shù)語(yǔ)“報(bào)道基因”指編碼可分析蛋白質(zhì)的基因。報(bào)道基因的實(shí)例包括(但不限于)螢光素酶(見(jiàn)例如deWet等，Mol.cell.Biol.7725 和美國(guó)專利號(hào)6,074,859，此處引用作為參考)，綠色熒光蛋白(例如GenBank登錄號(hào)U43284；眾多GFP變體可商業(yè)性地從CLONTECH Laboratories，Palo Alto，CA獲得)、氯霉素乙?；D(zhuǎn)移酶、β-半乳糖苷酶、堿性磷酸酶和辣根過(guò)氧化物酶。
如此處所使用，術(shù)語(yǔ)“計(jì)算機(jī)存儲(chǔ)器”和“計(jì)算機(jī)存儲(chǔ)設(shè)備”指可由計(jì)算機(jī)處理器讀取的任何存儲(chǔ)介質(zhì)。計(jì)算機(jī)存儲(chǔ)器的實(shí)例包括(但不限于)RAM、ROM、計(jì)算機(jī)芯片、數(shù)字視頻光盤(DVD)、壓縮光盤(CD)、硬盤驅(qū)動(dòng)器(HDD)和磁帶。
如此處所使用，術(shù)語(yǔ)“計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)”指用于存儲(chǔ)和向計(jì)算機(jī)處理器提供信息(例如數(shù)據(jù)和指令)的任何設(shè)備或系統(tǒng)。計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)的實(shí)例包括(但不限于)DVD、CD、硬盤驅(qū)動(dòng)器、磁帶和網(wǎng)絡(luò)上的流媒體服務(wù)器。
如此處所使用，短語(yǔ)“計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)載有核酸或氨基酸序列的表現(xiàn)形式”指這樣的計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)，其在已經(jīng)存儲(chǔ)信息后，當(dāng)向處理器傳遞時(shí)，允許該核酸序列或氨基酸序列向用戶顯示(例如打印輸出或顯示于顯示屏)。
如此處所使用，術(shù)語(yǔ)“處理器”和“中央處理單元”或“CPU”可互換使用，并且指能夠從計(jì)算機(jī)存儲(chǔ)器(例如ROM或其他計(jì)算機(jī)存儲(chǔ)器)中讀取程序并根據(jù)該程序執(zhí)行一系列步驟的裝置。
如此處所使用，氨基酸殘基在免疫球蛋白重鏈中的編號(hào)使用EU索引形式，如在Kaba等，Sequence of Proeins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda、MD(1991)，此處特別引用作為參考。“如Kabat中的EU索引形式”指人IgG1 EU抗體的殘基編號(hào)。
如此處所使用，“母體多肽”是包含這樣一種氨基酸序列的多肽，其中氨基酸序列可以變化或改變(例如進(jìn)行氨基酸替代、添加或缺失)以產(chǎn)生變體。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，母體多肽包含天然存在的Fc區(qū)或含有氨基酸序列修飾(例如添加、缺失和/或替代)的Fc區(qū)的至少一部分。在一些實(shí)施方案中，特別考慮了比母體多肽更短或更長(zhǎng)的變體。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，母體多肽在功能(例如效應(yīng)子功能、結(jié)合等)上與變體不同。
如此處所使用，術(shù)語(yǔ)“母體多肽變體”指包含通過(guò)至少一種氨基酸修飾而與母體多肽不同的氨基酸序列的肽。在某些實(shí)施方案中，變體包含至少一部分(例如至少40％、50％、75％或90％)Fc區(qū)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，變體包含具有至少一處氨基酸修飾的母體多肽的Fc區(qū)。
如此處所使用，術(shù)語(yǔ)“Fc區(qū)”指免疫球蛋白重鏈的C末端區(qū)域(例如，如圖1所示)?！癋c區(qū)”可以是天然序列Fc區(qū)或變體Fc區(qū)。雖然通常所認(rèn)可的免疫球蛋白重鏈Fc區(qū)的邊界可變動(dòng)，但是通常將人IgG重鏈Fc區(qū)定義為從Cys226或從Pro230位置的氨基酸殘基至其羧基末端的延伸。在一些實(shí)施方案中，變體僅包含部分Fc區(qū)并且可包括或不包括羧基末端。例如在圖1中所示，免疫球蛋白Fc區(qū)通常包含兩個(gè)恒定結(jié)構(gòu)域，CH2和CH3。在一些實(shí)施方案中，考慮了具有一個(gè)或多個(gè)恒定結(jié)構(gòu)域的變體。在其他實(shí)施方案中，考慮了無(wú)此類恒定結(jié)構(gòu)域(或僅具有一部分的這類恒定結(jié)構(gòu)域)的變體。
如此處所使用，“CH2結(jié)構(gòu)域”(也稱作“Cγ2”結(jié)構(gòu)域)通常包含F(xiàn)c區(qū)(例如在人IgG Fc區(qū))中從大約231位氨基酸至大約340位氨基酸的殘基延伸。CH2結(jié)構(gòu)域的獨(dú)特性在于它不與另一個(gè)結(jié)構(gòu)域緊密配對(duì)。此外，兩個(gè)N-連接的分支糖鏈插入到完整天然IgG分子的兩個(gè)CH2結(jié)構(gòu)域之間。
如此處所使用，“CH3結(jié)構(gòu)域”(也稱作“Cγ3”結(jié)構(gòu)域)通常包含F(xiàn)c區(qū)中CH2結(jié)構(gòu)域的C末端殘基延伸(例如人IgG Fc區(qū)中從大約第341位氨基酸殘基至大約447位氨基酸殘基)。
如此處所使用，F(xiàn)c區(qū)可具有負(fù)責(zé)(例如在受試者中)激活或減弱生物學(xué)活性的“效應(yīng)子功能”。效應(yīng)子功能的實(shí)例包括(但不限于)C1q結(jié)合；補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒作用(CDC)；Fc受體結(jié)合；抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用(ADCC)；吞噬作用；細(xì)胞表面受體(例如B細(xì)胞受體；BCR)的下調(diào)等。此類效應(yīng)子功能需要Fc區(qū)與結(jié)合結(jié)構(gòu)域(例如抗體可變結(jié)構(gòu)域)結(jié)合并且可用多種測(cè)定法估(例如Fc結(jié)合測(cè)定法、ADCC測(cè)定法、CDC測(cè)定法、靶細(xì)胞從全血或分部分離的血液樣品中損耗等)。
如此處所使用，術(shù)語(yǔ)“天然序列Fc區(qū)”或“野生型Fc區(qū)”指與通常在自然中發(fā)現(xiàn)的Fc區(qū)的氨基酸序列相同的氨基酸序列。示例性天然序列的人Fc區(qū)示于圖2，并且包括天然序列的人IgG1 Fc區(qū)(f和a、z同種異型)；天然序列的人IgG2 Fc區(qū)；天然序列的人IgG3 Fc區(qū)和天然序列的人IgG4 Fc區(qū)及其天然存在的變體。天然序列的鼠Fc區(qū)也示于圖2。其他序列是可以預(yù)計(jì)的并且可容易地從多個(gè)網(wǎng)址(例如NCBI的網(wǎng)址)中獲得。
如此處所使用，術(shù)語(yǔ)“變體Fc區(qū)”指由于至少一處氨基酸修飾(例如替代、插入或缺失)而與天然序列Fc區(qū)(或其部分)的氨基酸序列不同的氨基酸序列，包括重鏈亞單位序列彼此不同的異二聚體變體。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，與天然序列Fc區(qū)相比，變體Fc區(qū)具有至少一個(gè)氨基酸替代(例如在天然序列Fc區(qū)中的大約1個(gè)至大約10個(gè)氨基酸替代，并且優(yōu)選地從大約1個(gè)至大約5個(gè)氨基酸替代)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，變體Fc區(qū)與天然序列Fc區(qū)具有至少大約80％的同源性，優(yōu)選至少大約90％的同源性并且更加優(yōu)選至少大約95％的同源性。
如此處所使用，關(guān)于氨基酸序列的術(shù)語(yǔ)“同源性”指在比對(duì)序列并根據(jù)需要導(dǎo)入旨在獲得同源性百分?jǐn)?shù)最大值的缺口之后，在氨基酸序列變體中與天然氨基酸序列相同的殘基百分?jǐn)?shù)。
術(shù)語(yǔ)“包含F(xiàn)c區(qū)的多肽”指多肽，如包含F(xiàn)c區(qū)的抗體或免疫粘附素(見(jiàn)以下定義)。
術(shù)語(yǔ)“Fc受體”和FcR”用于描述結(jié)合Fc區(qū)(例如抗體或抗體片段的Fc區(qū))的受體。該術(shù)語(yǔ)包括負(fù)責(zé)將母體IgG轉(zhuǎn)移至胎兒的新生兒受體FcRn。
如此處所使用，短語(yǔ)“抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用”和“ADCC”是指表達(dá)FcR的細(xì)胞毒性細(xì)胞(例如非特異性的細(xì)胞毒性細(xì)胞)(例如天然殺傷細(xì)胞(NK)、嗜中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞)識(shí)別結(jié)合于靶細(xì)胞的抗體并且隨后引起該靶細(xì)胞裂解的細(xì)胞介導(dǎo)性反應(yīng)。介導(dǎo)ADCC的主要細(xì)胞NK細(xì)胞表達(dá)FcγRIII，而單核細(xì)胞表達(dá)FcγRI、FcγRII和FcγRIII。
如此處所使用，短語(yǔ)“效應(yīng)細(xì)胞”指表達(dá)一種或多種FcR并執(zhí)行效應(yīng)子功能的白細(xì)胞。優(yōu)選地，細(xì)胞至少表達(dá)FcγRIII并執(zhí)行ADCC效應(yīng)子功能。介導(dǎo)ADCC的白細(xì)胞實(shí)例包括外周血單核細(xì)胞(PBMC)、天然殺傷細(xì)胞(NK)、單核細(xì)胞、細(xì)胞毒T細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞。效應(yīng)細(xì)胞可從天然來(lái)源(例如血液)分離。
如此處所使用，短語(yǔ)“全血”指未分部分離的血液樣品。
如此處所使用，具有“改變的”FcR結(jié)合親和性或ADCC活性的多肽變體是這樣一種變體，即與母體多肽或含有天然序列Fc區(qū)的多肽相經(jīng)其具有增強(qiáng)的(即提高的)或減弱的(即降低的)FcR結(jié)合活性和/或ADCC活性。對(duì)FcR“表現(xiàn)出增加結(jié)合”的多肽變體以比母體多肽更佳的親和性結(jié)合至少一種FcR。對(duì)FcR“表現(xiàn)出降低結(jié)合”的多肽變體以比母體多肽更差的親和性結(jié)合至少一種FcR。對(duì)FcR表現(xiàn)出降低結(jié)合的此類變體對(duì)FcR結(jié)合較少或其結(jié)合不可測(cè)量，例如對(duì)FcR的結(jié)合與母體多肽相比為0-20％。以比母體多肽“更佳親和性”結(jié)合FcR的多肽變體是這樣的多肽變體，即當(dāng)在結(jié)合測(cè)定法中多肽變體與母體多肽的量基本相同并且所有其他條件均相同時(shí)，該多肽變體以比母體抗體更高的結(jié)合親和性結(jié)合任何一種或多種如上所鑒定的FcR。例如，具有改善FcR結(jié)合親和性的多肽變體與母體多肽相比在FcR結(jié)合親和性上表現(xiàn)出大約1.10倍至大約100倍(更一般地從大約1.2倍至大約50倍)的改善(即提高)，其中FcR結(jié)合親和性在例如ELISA測(cè)定法中進(jìn)行測(cè)定。
如此處所使用，“氨基酸修飾”指特定氨基酸序列中的氨基酸序列變化。示例性修飾包括(但不限于)氨基酸替代、插入和/或缺失。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，氨基酸修飾是替代(例如在母體多肽的Fc區(qū))。
如此處所使用，在特定位置處(例如在Fc區(qū)內(nèi))的“氨基酸修飾”指所指定殘基的替代或缺失或在鄰近所指定殘基處的至少一個(gè)氨基酸殘基的插入。在“鄰近”指定殘基處插入意味著在該殘基的一至兩個(gè)殘基范圍內(nèi)插入。插入可位于指定殘基的N末端或C末端。
如此處所使用，“氨基酸替代”指以另一個(gè)不同的“替代”氨基酸殘基替代特定氨基酸序列中的至少一個(gè)現(xiàn)存氨基酸殘基。替代殘基可以是“天然存在的氨基酸殘基”(即由遺傳密碼編碼的氨基酸殘基)并且選自丙氨酸(Ala)；精氨酸(Arg)；天冬酰胺(Asn)；天冬氨酸(Asp)；半胱氨酸(Cys)；谷氨酰胺(Gln)；谷氨酸(Glu)；甘氨酸(Gly)；組氨酸(His)；異亮氨酸(Ile)；亮氨酸(Leu)；賴氨酸(Lys)；甲硫氨酸(Met)；苯丙氨酸(Phe)；脯氨酸(Pro)；絲氨酸(Ser)；蘇氨酸(Thr)；色氨酸(Trp)；酪氨酸(Tyr)和纈氨酸(Val)。以一種或多種非天然存在的氨基酸殘基進(jìn)行替代也處于此處氨基酸替代的定義范圍內(nèi)?！胺翘烊淮嬖诘陌被釟埢敝赋艘陨纤心切┨烊淮嬖诘陌被釟埢酝獾臍埢?，其可在多肽鏈中與鄰近氨基酸殘基共價(jià)結(jié)合。非天然存在的氨基酸殘基的實(shí)例包括正亮氨酸、鳥(niǎo)氨酸、正纈氨酸、高絲氨酸和其他氨基酸殘基類似物，例如Ellman等Meth.Enzym.202301-336(1991)(此處引用作為參考)中所描述的那些。
如此處所使用，術(shù)語(yǔ)“氨基酸插入”指至少一個(gè)氨基酸向特定氨基酸序列中的摻入。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，插入通常是一個(gè)或兩個(gè)氨基酸殘基的插入。在其他實(shí)施方案中，插入包括較大肽的插入(例如大約3個(gè)至大約5個(gè)或甚至多達(dá)大約10個(gè)氨基酸殘基的插入。
如此處所使用，術(shù)語(yǔ)“氨基酸缺失”指至少一個(gè)氨基酸殘基從特定氨基酸序列中去除。
術(shù)語(yǔ)“測(cè)定信號(hào)”指來(lái)自檢測(cè)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的任何方法中的輸出結(jié)果，包括但是不限于比色測(cè)定法的吸收率測(cè)量、熒光強(qiáng)度、每分鐘衰變次數(shù)。測(cè)定法形式可包括ELISA、facs或其他方法?！皽y(cè)定信號(hào)”的改變可反映細(xì)胞活力的改變或動(dòng)力學(xué)解離率、動(dòng)力學(xué)結(jié)合率或兩者的改變?！拜^高的測(cè)定信號(hào)”指所測(cè)量的輸出數(shù)大于另一個(gè)數(shù)(例如在ELISA測(cè)定法中變體較母體多肽具有較高(較大)的測(cè)定數(shù))?！拜^低的測(cè)定信號(hào)”指所測(cè)量的輸出數(shù)小于另一個(gè)數(shù)(例如在ELISA測(cè)定法中變體較母體多肽具有較低(較小)的測(cè)定數(shù))。
術(shù)語(yǔ)“結(jié)合親和性”指與每一Fc受體-Fc結(jié)合相互作用相關(guān)的平衡解離常數(shù)(以濃度單位表示)。結(jié)合親和性與動(dòng)力學(xué)解離率(通常以反比時(shí)間單位表示，例如秒-1)除以動(dòng)力學(xué)結(jié)合率(通常以每單位時(shí)間的濃度單位表示，例如摩爾/秒)的比值直接相關(guān)。通常不可能確定無(wú)疑地將平衡解離常數(shù)的改變歸因于結(jié)合率、解離率或兩者的差異，除非實(shí)驗(yàn)測(cè)定了這些參數(shù)中的每一個(gè)(例如通過(guò)BIACORE或SAPIDYNE測(cè)量法)。
如此處所使用，術(shù)語(yǔ)“鉸鏈區(qū)”指人IgG1中從Glu216至Pro230的氨基酸延伸?？梢酝ㄟ^(guò)將形成重鏈間S-S鍵的第一個(gè)和最后一個(gè)半胱氨酸殘基置于相同的位置，將其他IgG同種型的鉸鏈區(qū)與IgG1序列比對(duì)。
如此處所使用，術(shù)語(yǔ)Fc區(qū)的“低鉸鏈區(qū)”指緊鄰鉸鏈區(qū)C末端的氨基酸殘基延伸(例如IgG1 Fc區(qū)中第233至第239位的殘基)。
“C1q”是包含對(duì)免疫球蛋白Fc區(qū)的結(jié)合位點(diǎn)的多肽。C1q與兩種絲氨酸蛋白酶C1r和C1s一起形成復(fù)合物C1，即補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒作用(CDC)途徑中的第一個(gè)成分。
如此處所使用，術(shù)語(yǔ)“抗體”作最廣義使用并且尤其包括單抗克隆抗體(包括全長(zhǎng)單克隆抗體)、多克隆抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)和抗體片段，只要它們表現(xiàn)出所期望生物學(xué)活性即可。
如此處所使用，術(shù)語(yǔ)“抗體片段”指完整抗體的部分?？贵w片段的實(shí)例包括(但不限于)線性抗體；單鏈抗體分子；由抗體片段形成的Fc或Fc’肽，F(xiàn)ab和Fab片段以及多特異性抗體?？贵w片段優(yōu)選地保留至少一部分IgG重鏈鉸鏈區(qū)并且任選地保留IgG重鏈的CH1區(qū)。在其他優(yōu)選的實(shí)施方案中，抗體片段包含至少一部分CH2區(qū)或整個(gè)CH2區(qū)。
如此出所用，當(dāng)用來(lái)指單克隆抗體時(shí)，術(shù)語(yǔ)“功能性片段”旨在指仍保留功能性活性的單克隆抗體部分。功能性活性可以是例如抗原結(jié)合活性或特異性。單克隆抗體的功能性片段包括例如單獨(dú)的重鏈或輕鏈以及其片段，如VL、VH和Fd；單價(jià)片段如Fv、Fab和Fab’；雙價(jià)片段如F(ab’)2；單鏈Fv(scFv)和Fc片段。此類術(shù)語(yǔ)描述于例如Harlowe和Lane，AntibodyA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，NewYork(1989)；Molec.Biology and BiotechnologyA Comprehensive DeskReference(Myers，R.A.(編)，New YorkVCH Publisher，Inc.)；Huston等，Cell Biophysics，22189-224(1993)；Pluckthun和Skerra，Meth.Enzymol.，178497-515(1989)以及Day，E.D.，Advanced Immunochemistry.第二版、Wiley-Liss，Inc.，New York，NY(1990)，所有文獻(xiàn)此處引用作為參考。術(shù)語(yǔ)“功能性片段”旨在包括例如通過(guò)對(duì)單克隆抗體進(jìn)行蛋白酶消化或還原和通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的重組DNA方法所產(chǎn)生的片段。
如此處所使用，非人(例如鼠)抗體的“人源化”形式是含有來(lái)自非人免疫球蛋白的最少序列或不含此類序列的抗體。大多數(shù)情況下，人源化抗體是這樣的人免疫球蛋白(受者抗體)，其中受者高變區(qū)內(nèi)的殘基由具有所預(yù)期特異性、親和性和能力的來(lái)自非人物種(供者抗體)如小鼠、大鼠、兔或非人靈長(zhǎng)類的高變區(qū)殘基替換。在一些情況下，人免疫球蛋白的Fv骨架區(qū)(FR)殘基由相應(yīng)的非人類殘基代替。而且，人源化抗體可包含在受者抗體或供者抗體中不存在的殘基。通常進(jìn)行這些修飾以進(jìn)一步改進(jìn)抗體性能。通常，人源化抗體基本包含至少一個(gè)、一般兩個(gè)可變區(qū)，在此可變區(qū)中，全部或基本上全部的高變區(qū)環(huán)對(duì)應(yīng)于非人免疫球蛋白的全部或基本上全部的高變區(qū)環(huán)，并且全部或基本上全部的FR殘基對(duì)應(yīng)于人免疫球蛋白序列的全部或基本上全部的FR殘基。人源化抗體還可以包含至少一部分的免疫球蛋白恒定區(qū)(Fc)，一般是人免疫球蛋白恒定區(qū)。用于產(chǎn)生人源化抗體的方法實(shí)例描述于Winter等的美國(guó)專利5,225,539中(此處引用作為參考)。
如此處所使用，術(shù)語(yǔ)“高變區(qū)”指抗體中負(fù)責(zé)抗原結(jié)合的氨基酸殘基。高變區(qū)包含來(lái)自“互補(bǔ)決定區(qū)”或“CDR的氨基酸殘基(即輕鏈可變結(jié)構(gòu)域中的殘基24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)以及重鏈可變結(jié)構(gòu)域中的殘基31-35(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)；Kabat等，Sequenceof proteins of Immunological Interest，第五版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD.(1991))和/或那些來(lái)自“高變區(qū)環(huán)”的殘基(即輕鏈可變結(jié)構(gòu)域中的殘基26-32(L1)、50-52(L2)和91-96(L3)以及重鏈可變結(jié)構(gòu)域中的殘基26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)；Chothia和Lesk J.Mol.Biol.196901-917(1987))?！肮羌堋被颉癋R”殘基是除了如此處所定義的高變區(qū)殘基以外的那些可變結(jié)構(gòu)域殘基。
如此處所使用，術(shù)語(yǔ)“免疫粘附素”指與具有免疫球蛋白恒定結(jié)構(gòu)域的異源“粘附”蛋白質(zhì)(例如受體、配體或酶)的結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合的抗體樣分子。在結(jié)構(gòu)上，免疫粘附素包含具有期望結(jié)合特異性的粘附素氨基酸序列(其不同于抗體的抗原識(shí)別和結(jié)合位點(diǎn)(抗原結(jié)合位點(diǎn)))(即為異源性)與免疫球蛋白恒定結(jié)構(gòu)域序列的融合。
如此處所使用，術(shù)語(yǔ)“配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域”指任何天然受體或至少保留相應(yīng)天然受體的定性配體結(jié)合能力的其任何區(qū)域或衍生物。在某些實(shí)施方案中，受體來(lái)自與免疫球蛋白超家族成員同源的具有細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的細(xì)胞表面多肽。非免疫球蛋白超家族成員但本定義明確涵蓋的其他受體是細(xì)胞因子受體，并且尤其是具有酪氨酸激酶活性的受體(受體酪氨酸激酶)、促紅細(xì)胞生成素和神經(jīng)生長(zhǎng)因子受體超家族成員以及細(xì)胞粘附分子(例如E-選凝素、L-選凝素和P-選凝素)。
如此處所使用，術(shù)語(yǔ)“受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域”指受體的任何天然配體，包括細(xì)胞粘附分子或至少保留相應(yīng)天然配體的定性受體結(jié)合能力的此天然配體的任何區(qū)域或衍生物。
如此處所使用，術(shù)語(yǔ)“抗體-免疫粘附素嵌合體”包括這樣的分子，其將至少一個(gè)抗體結(jié)合結(jié)構(gòu)域與至少一種免疫粘附素結(jié)合。此類分子的實(shí)例包括(但不限于)在Berg等，PNAS(USA)884723-4727(1991)和Charnow等，J.Immunol.，1534268(1994)中描述的雙特異性CD4-IgG嵌合體，該兩篇文獻(xiàn)此處引用作為參考。
如此處所使用，“分離的”多肽是已鑒定并從其天然環(huán)境成分中分離和/或回收的多肽。多肽的天然環(huán)境污染性成分是將會(huì)干擾該多肽的診斷性或治療性用途的物質(zhì)，其包括酶、激素和其他蛋白質(zhì)性質(zhì)或非蛋白質(zhì)性質(zhì)的溶質(zhì)。在某些實(shí)施方案中，將分離的多肽純化至(1)如通過(guò)Lowry方法所測(cè)定，大于95％(以多肽重量計(jì))，并且優(yōu)選地大于99％(以重量計(jì))，(2)足以通過(guò)使用旋杯測(cè)序儀(spinning cup sequenator)獲得N末端或內(nèi)部氨基酸序列的至少15個(gè)殘基的程度或(3)通過(guò)還原或非還原條件的SDS-PAGE使用考馬斯藍(lán)或銀染顯示出均質(zhì)性。因?yàn)槎嚯奶烊画h(huán)境中的至少一種組分將不存在，故分離的多肽包括在重組細(xì)胞內(nèi)原位存在的多肽。然而，通常通過(guò)至少一個(gè)純化步驟來(lái)制備分離的多肽。
如此處所使用，術(shù)語(yǔ)“治療”指治療性治療以及預(yù)防性或防止性措施。需要治療者包括已經(jīng)患有病癥的那些患者以及有待防止病癥的那些患者。
如此處所使用，術(shù)語(yǔ)“病癥( )”指從使用多肽變體治療中獲益的狀況，包括慢性和急性病癥或疾病(例如使患者易患特定病癥的病理性狀況)。在某些實(shí)施方案中，病癥是癌。
如此處所使用，術(shù)語(yǔ)“癌”和“癌的”指或描述哺乳動(dòng)物中一般表征為無(wú)節(jié)制的細(xì)胞生長(zhǎng)的生理狀況。癌的實(shí)例包括(但不限于)癌、淋巴瘤、胚細(xì)胞瘤、肉瘤和白血病。此類癌的更特別實(shí)例包括鱗狀細(xì)胞癌、小細(xì)胞肺癌、非小細(xì)胞肺癌、肺腺癌、肺鱗狀細(xì)胞癌、腹膜癌、肝細(xì)胞癌、胃腸癌、胰腺癌、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、宮頸癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝細(xì)胞瘤、乳腺癌、結(jié)腸癌、結(jié)腸直腸癌、子宮內(nèi)膜或子宮癌、唾液腺癌、腎癌、前列腺癌、外陰癌、甲狀腺癌、肝臟癌癥和多種類型的頭頸癌。
如此處所使用，短語(yǔ)“表達(dá)HER2的癌”是包含這樣一種細(xì)胞的癌，其中細(xì)胞在其表面具有HER2受體蛋白(例如Genebank登錄號(hào)X03363)，以至于抗HER2抗體能夠與這種癌結(jié)合。
如此處所使用，術(shù)語(yǔ)“標(biāo)記”指直接或間接與多肽綴合的可檢測(cè)化合物或組合物。標(biāo)記本身是可探測(cè)的(例如放射性同位素標(biāo)記或熒光標(biāo)記)，或者在酶標(biāo)記情況下，標(biāo)記可以催化可檢測(cè)的底物化合物或組合物發(fā)生化學(xué)改變。
如此處所使用，術(shù)語(yǔ)“控制元件”、“控制序列”和“調(diào)節(jié)元件”指控制核酸序列表達(dá)的一些方面的遺傳元件。例如，啟動(dòng)子是促進(jìn)已有效連接的編碼區(qū)轉(zhuǎn)錄起始的調(diào)節(jié)元件。其他調(diào)節(jié)元件包括剪接信號(hào)、多腺苷酸化信號(hào)、終止信號(hào)等。適于原核生物的控制元件包括例如啟動(dòng)子，任選地包括操縱基因序列以及核糖體結(jié)合位點(diǎn)。已知真核細(xì)胞可利用啟動(dòng)子、多腺苷酸化信號(hào)和增強(qiáng)子。
如此處所使用，當(dāng)核酸與另一核酸序列處于功能性聯(lián)系時(shí)，該核酸被“有效連接”。例如，若前序列或分泌前導(dǎo)序列DNA作為參與多肽分泌的前蛋白表達(dá)，則其與多肽DNA是有效連接的；若啟動(dòng)子或增強(qiáng)子影響序列的轉(zhuǎn)錄，則其與編碼序列是有效連接的；或者如果核糖體結(jié)合位點(diǎn)位于促進(jìn)翻譯的位置，則其與編碼序列是有效連接的。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，“有效地連接”意指所連接的DNA序列是連續(xù)的，并且在分泌前導(dǎo)序列的情況下其是連續(xù)的且符合讀碼框的。然而，例如增強(qiáng)子不必為連續(xù)的。連接可通過(guò)例如常規(guī)限制性位點(diǎn)處的連接實(shí)現(xiàn)。如果此類位點(diǎn)不存在，可根據(jù)常規(guī)實(shí)踐使用合成的寡核苷酸接頭或連結(jié)體。
如此處所使用，措辭“細(xì)胞”、“細(xì)胞系”和“細(xì)胞培養(yǎng)”可互換使用并且所有此類名稱包括其后代。因此詞匯“轉(zhuǎn)化體”和“轉(zhuǎn)化的細(xì)胞”包括原代受試者細(xì)胞和其衍生培養(yǎng)物，而無(wú)論傳代次數(shù)多少。還應(yīng)當(dāng)理解，由于有意的或無(wú)意的突變所有子代在DNA含量上并非完全相同?？砂ㄈ缭谧畛蹀D(zhuǎn)化的細(xì)胞中所篩選的具有相同功能或生物學(xué)活性的突變的后代。旨在明確指定時(shí)，將從上下文中予以明確。
如此處所使用，“分析物”指待分析的物質(zhì)。優(yōu)選的分析物是待分析其結(jié)合Fc受體能力的包含F(xiàn)c區(qū)的多肽。
如此處所使用，術(shù)語(yǔ)“受體”指能夠結(jié)合至少一種配體的多肽。優(yōu)選的受體是具有細(xì)胞外配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域且任選地具有其他結(jié)構(gòu)域(例如跨膜結(jié)構(gòu)域、細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域和/或膜錨定區(qū))的細(xì)胞表面受體或可溶性受體。在此處所述測(cè)定法中進(jìn)行評(píng)價(jià)的受體可以是完整受體或者其片段或衍生物(例如包含與一種或多種異源多肽融合的受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的融合蛋白)。而且，待進(jìn)行結(jié)合特性評(píng)價(jià)的受體可存在于細(xì)胞中或者被分離且任選地被包被于測(cè)定平板或其他固相上或者被直接標(biāo)記并用作探針。
如此處所使用，短語(yǔ)“CHO表達(dá)的多肽”指已經(jīng)在中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞內(nèi)重組表達(dá)的多肽。
如此處所使用，術(shù)語(yǔ)“抗體應(yīng)答性疾病”指已證實(shí)用抗體療法可治療的、至少可部分治療的任何疾病或醫(yī)學(xué)狀況。此類疾病和醫(yī)學(xué)狀況的實(shí)例包括(但不限于)淋巴瘤(證實(shí)可用RITUXAN治療)、傳染病(證實(shí)可用SYNAGIS治療)、腎移植(已證實(shí)ZENAPAX有益)、克隆病和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(證實(shí)可用REMICADE治療)、乳腺癌(證實(shí)可用HERCEPTIN治療)和結(jié)腸癌(證實(shí)可用EDRECOLOMAB治療)。如此處所使用，術(shù)語(yǔ)“免疫粘附素應(yīng)答性疾病”指已證實(shí)用免疫粘附素療法可治療的、至少可部分治療的任何疾病或醫(yī)學(xué)狀況。
如此處所使用，較母體抗體“在人效應(yīng)細(xì)胞存在時(shí)更有效地介導(dǎo)抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用(ADCC)”的多肽變體是這樣一種多肽變體，即在測(cè)定法中所用的多肽變體與母體抗體的量基本相同時(shí)，其在體外或體內(nèi)基本上更有效地介導(dǎo)ADCC。例如，該變體在特定ADCC測(cè)定法中引起的靶細(xì)胞裂解較母體多肽在同一ADCC測(cè)定法中引起的靶細(xì)胞裂解的數(shù)量更大?？捎靡环NADCC測(cè)定法鑒定此類變體，但也可應(yīng)用其他測(cè)定ADCC活性的測(cè)定法或方法(例如動(dòng)物模型)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，該多肽變體較母體多肽以大約1.2倍、1.5倍、50倍、100倍、大約500倍或大約1000倍地更有效介導(dǎo)ADCC。
如此處所使用，較母體抗體“更有效地介導(dǎo)全血中的抗體依賴性B細(xì)胞損耗”的多肽變體是這樣一種多肽變體，即在測(cè)定法中所用的多肽變體與母體抗體的量基本相同時(shí)，其在體外或體內(nèi)基本上更有效地介導(dǎo)B細(xì)胞損耗。例如，在特定的測(cè)定法中此變體引起的B細(xì)胞損耗程度高于在同一測(cè)定法中母體多肽所引起的B細(xì)胞損耗程度。同樣，此變體可損耗B細(xì)胞至與母體多肽在同一測(cè)定法中引起的B細(xì)胞損耗相同的程度，但其濃度要低于母體多肽所需濃度。例如可用一種ADCC測(cè)定法鑒定該變體，但是也可應(yīng)用另一些測(cè)定ADCC活性的測(cè)定法或方法(例如動(dòng)物模型)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，相對(duì)于母體多肽的損耗增強(qiáng)不依賴于FcRIIIa位置158處的基因型(V或F)和FcRIIa位置131處的基因型(H或R)，并且多肽變體較母體多肽以大約1.2倍、1.5倍、50倍、100倍、大約500倍或大約1000倍地更有效介導(dǎo)B細(xì)胞損耗。
術(shù)語(yǔ)“抗體或免疫粘附素應(yīng)答性疾病癥狀”指通常與特定疾病相關(guān)的那些癥狀。例如，通常與克隆病相關(guān)的癥狀包括腹痛、腹瀉、直腸出血、體重減輕、發(fā)熱、厭食、脫水、貧血、膨脹、纖維變性、腸道發(fā)炎和營(yíng)養(yǎng)不良。
短語(yǔ)“在使得癥狀緩解的條件下”指任何抗體或免疫粘附素應(yīng)答性疾病的可檢測(cè)癥狀的任何程度的定性或定量減少，包括但不限于對(duì)疾病恢復(fù)速率的可檢測(cè)影響(例如體重增加率)或至少一種通常與特定疾病相關(guān)癥狀的減輕(例如若抗體或免疫粘附素應(yīng)答性疾病是克隆病，至少如下癥狀之一減輕腹痛、腹瀉、直腸出血、體重減輕、發(fā)熱、厭食、脫水、貧血、膨脹、纖維變性、腸道發(fā)炎和營(yíng)養(yǎng)不良)。
發(fā)明詳述本發(fā)明提供多肽Fc區(qū)變體和編碼Fc區(qū)變體的寡核苷酸。具體而言，本發(fā)明提供包含新Fc區(qū)變體的組合物、用于鑒定有用Fc區(qū)變體的方法以及用于應(yīng)用Fc區(qū)變體治療疾病的方法。在以下部分中描述本發(fā)明I.)抗體Fc區(qū)；II.)變體Fc區(qū)；III.)組合變體；IV.)變體多肽測(cè)定法；V.)示例性的含變體Fc區(qū)的分子；VI.)編碼Fc區(qū)變體的核酸序列；VII.)治療性用途和制劑；VIII.)額外的變體Fc區(qū)的用途。
I.抗體Fc區(qū)如上所述，抗體具有參與非抗原結(jié)合功能的區(qū)域，主要是CH2和CH3區(qū)。通常將這些區(qū)共同稱作Fc區(qū)，并且這些區(qū)具有數(shù)種由效應(yīng)分子結(jié)合所介導(dǎo)的效應(yīng)子功能。
抗體Fc區(qū)介導(dǎo)的效應(yīng)子功能可分為兩類(1)在抗體結(jié)合抗原后產(chǎn)生的效應(yīng)子功能(這些功能涉及例如補(bǔ)體級(jí)聯(lián)或攜帶Fc受體(FcR)細(xì)胞的參與)；和(2)不依賴于抗原結(jié)合而產(chǎn)生的效應(yīng)子功能(這些功能賦予例如循環(huán)中的持久性和通過(guò)轉(zhuǎn)胞吞作用跨細(xì)胞屏障的轉(zhuǎn)運(yùn)能力)。例如，補(bǔ)體CI成分與抗體的結(jié)合活化了補(bǔ)體系統(tǒng)。在調(diào)理作用后，補(bǔ)體的活化對(duì)細(xì)胞病原體的裂解是重要的。補(bǔ)體的活化還刺激炎癥反應(yīng)并且還參與自身免疫超敏。此外，抗體通過(guò)Fc區(qū)結(jié)合細(xì)胞，其中抗體Fc區(qū)上的Fc受體結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合細(xì)胞上的Fc受體(FcR)。存在對(duì)不同類的抗體特異的多種Fc受體，包括IgG(γ受體)、IgE(ε受體)、IgA(α受體)和IgM(μ受體)。盡管本發(fā)明不受任何特定機(jī)制限制，抗體與細(xì)胞表面Fc受體的結(jié)合啟動(dòng)了眾多重要而不同的生物學(xué)反應(yīng)，包括內(nèi)吞和破壞由抗體包被的顆粒、清除免疫復(fù)合物、通過(guò)殺傷細(xì)胞裂解由抗體包被的靶細(xì)胞(稱為抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用或ADCC)、釋放炎性介質(zhì)、胎盤轉(zhuǎn)移和控制免疫球蛋白產(chǎn)生。
數(shù)種抗體效應(yīng)子功能通過(guò)與抗體Fc區(qū)結(jié)合的Fc受體(FcR)介導(dǎo)。通過(guò)其對(duì)免疫球蛋白同種型的特異性定義了FcR；將IgG抗體的Fc受體稱作FcγR，IgE抗體的Fc受體稱作FcεR，IgA抗體的Fc受體稱作FcαR等。已鑒定出三亞類FcγRFcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)和FcγRIII(CD16)。
因?yàn)槊恳籉cγR亞類均由兩個(gè)或三個(gè)基因編碼，并且可變RNA剪接導(dǎo)致產(chǎn)生多種轉(zhuǎn)錄物，因此FcγR同種型存在廣泛的多樣性。編碼FcγRI亞類(FcγRIA、FcγRIB和FcγRIC)的三個(gè)基因聚集在1號(hào)染色體長(zhǎng)臂的1q21.1區(qū)內(nèi)；編碼FcγRII同工型(FcγRIIA、FcγRIIB和FcγRIIC)的基因和編碼FcγRIII(FcγRIIIA和FcγRIIIB)的兩個(gè)基因均聚集在1q22區(qū)內(nèi)。這些不同的FcR亞型在不同細(xì)胞類型中表達(dá)(見(jiàn)例如Ravetch和Kinet，Annu.Rev.Immunol.9457-492(1991))。例如對(duì)于人，僅在嗜中性粒細(xì)胞上發(fā)現(xiàn)FcγRIIIB，而在巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、天然殺傷細(xì)胞(NK)和T-細(xì)胞的一個(gè)亞群中發(fā)現(xiàn)了FcγRIIIA。值得注意的是，F(xiàn)cγRIIIA存在于NK細(xì)胞上，該細(xì)胞是一種在ADCC中發(fā)揮作用的細(xì)胞類型。
人FcγRIIIA(CD16)受體在其細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域中的第158位置處具有一個(gè)常見(jiàn)多態(tài)性，在此位置編碼苯丙氨酸或纈氨酸。FcγRIIIA的V等位基因?qū)θ薎gG1的親和性高于F等位基因。V158等位基因還更有效地介導(dǎo)ADCC。臨床數(shù)據(jù)表明，在經(jīng)歷Rituxan治療的患者中FcγRIIIA受體基因型與治療反應(yīng)之間存在關(guān)聯(lián)。證實(shí)在FcγRIIIA-158V基因型純合的患者中(大約占群體的20％)臨床和分子的應(yīng)答和進(jìn)展時(shí)間較好。相反，在低親和性FcγRIIIA-158F基因型雜合或純合的患者中(大約占群體的80％)應(yīng)答較差。這些數(shù)據(jù)表明增強(qiáng)158F攜帶者ADCC活性的Fc突變可增強(qiáng)基于抗體的癌癥治療法的臨床功效。在人FcγRIIA(CD32)受體的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域第131位置內(nèi)也存在一個(gè)遺傳多態(tài)性，在此位置編碼組氨酸(H)或精氨酸(R)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)第131位置內(nèi)的多態(tài)性影響人FcγRIIA(CD32)受體結(jié)合人IgG的能力。最新數(shù)據(jù)還表明，在FcγRIIA位置131的多態(tài)性與對(duì)Rituxan的臨床應(yīng)答之間的存在關(guān)聯(lián)。H131等位基因純合的患者較其他兩組具有顯著高的應(yīng)答率。
FcγRI、FcγRII和FcγRIII是免疫球蛋白超家族(IgSF)受體；FcγRI在其細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域有三個(gè)IgSF結(jié)構(gòu)域，而FcγRII和FcγRIII在其細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域僅有兩個(gè)IgSF結(jié)構(gòu)域。
Fc受體的另一種類型是新生兒Fc受體(FcRn)。FcRn在結(jié)構(gòu)上類似于主要組織相容性復(fù)合體(MHC)，并且由與β2微球蛋白非共價(jià)結(jié)合的一條α鏈組成。
II.變體Fc區(qū)本發(fā)明提供多肽變體、編碼此多肽變體的核酸序列和用于產(chǎn)生多肽變體的方法。優(yōu)選地，本發(fā)明的多肽因至少一處氨基酸修飾而與母體多肽不同?！澳阁w”多肽、“野生型”多肽、“起始”多肽或“非變體”多肽優(yōu)選地包含至少一部分抗體Fc區(qū)，并且可使用本領(lǐng)域可獲得的用于產(chǎn)生包含F(xiàn)c區(qū)或其部分的多肽的技術(shù)來(lái)制備。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，母體多肽是抗體。然而母體多肽可為包含至少一部分Fc區(qū)的任何其他多肽(例如免疫粘附素)。在某些實(shí)施方案中，可產(chǎn)生變體Fc區(qū)(例如根據(jù)此處公開(kāi)的方法)并且變體Fc區(qū)可與所選擇的異源多肽如抗體的可變結(jié)構(gòu)域或者受體或配體的結(jié)合結(jié)構(gòu)域融合。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，母體多肽包含F(xiàn)c區(qū)或其功能性部分。通常，母體多肽的Fc區(qū)將包含天然序列Fc區(qū)，并且優(yōu)選地包含人的天然序列Fc區(qū)。然而，母體多肽的Fc區(qū)可具有一個(gè)或多個(gè)來(lái)自天然序列Fc區(qū)內(nèi)的先前存在的氨基酸序列改變或修飾。例如，F(xiàn)c區(qū)的C1q結(jié)合活性可能先前已經(jīng)改變或者Fc區(qū)的FcγR結(jié)合親和性可能已經(jīng)改變。在另外的實(shí)施方案中，母體多肽Fc區(qū)為概念性的(例如智力思考或在計(jì)算機(jī)或紙張上的可視形式)，然而即便其并非物質(zhì)存在，但抗體工程師可確定所預(yù)期的變體Fc區(qū)的氨基酸序列并產(chǎn)生包含該序列的多肽或編碼所預(yù)期變體Fc區(qū)氨基酸序列的DNA。然而，在優(yōu)選的實(shí)施方案中，編碼母體多肽Fc區(qū)的核酸可以獲得并且將該核酸序列進(jìn)行改變以產(chǎn)生編碼Fc區(qū)變體的變體核酸序列。
可通過(guò)本領(lǐng)域所知方法使用本說(shuō)明書對(duì)于特定序列的指導(dǎo)來(lái)制備編碼母體多肽變體的核酸。這些方法包括(但不限于)通過(guò)對(duì)早期制備的編碼多肽的核酸進(jìn)行位點(diǎn)定向(或寡核苷酸介導(dǎo))誘變、PCR誘變和盒式誘變而制備。位點(diǎn)定向誘變是用于制備變體的優(yōu)選方法。該技術(shù)為本領(lǐng)域眾所周知(見(jiàn)例如Carter等，Nucleic Acids Res.134431-4443(1985)和Kunkel等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82488(1987)，兩篇文獻(xiàn)在此處引用作為參考)。簡(jiǎn)而言之，在實(shí)施DNA位點(diǎn)定向誘變時(shí)，首先通過(guò)編碼預(yù)期突變的一種或多種寡核苷酸與該起始DNA的單鏈同時(shí)雜交而改變?cè)撈鹗糄NA。雜交后，利用已雜交的寡核苷酸為引物并以起始DNA的單鏈為模板，使用DNA聚合酶合成完整的第二鏈，并且使用DNA連接酶連接第二鏈以形成環(huán)狀雙鏈DNA。因此將編碼所預(yù)期突變的寡核苷酸摻入所得到的雙鏈DNA中。
PCR誘變也適用于產(chǎn)生起始多肽的氨基酸序列變體(見(jiàn)例如Vallette等，Nuc.Acids Res.17723-733(1989)，此處引用作為參考)。簡(jiǎn)而言之，當(dāng)小量模板DNA用作PCR中的起始材料時(shí)，可用與來(lái)自模板DNA對(duì)應(yīng)區(qū)域內(nèi)的序列略微不同的引物產(chǎn)生相對(duì)大量的特定DNA片段，該DNA片段僅在引物不同于模板的位置處與模板序列不同。
另一種用于制備變體的方法，即盒式變體基于Wells等，Gene 34315-323(1985)(此處引用作為參考)描述的技術(shù)。起始材料是包含待突變的起始多肽DNA的質(zhì)粒(或另其他載體)。鑒定了待突變的起始DNA中的密碼子。在已鑒定的突變位點(diǎn)的兩側(cè)必須存在一個(gè)唯一的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。如果沒(méi)有這類限制性位點(diǎn)，可使用上述寡核苷酸介導(dǎo)誘變方法在起始多肽DNA內(nèi)的適宜位置處導(dǎo)入這些限制性位點(diǎn)。在這些位點(diǎn)處切割質(zhì)粒DNA以使之線性化。使用標(biāo)準(zhǔn)方法合成編碼限制性位點(diǎn)之間的DNA序列且含有預(yù)期突變的雙鏈寡核苷酸，其中分別合成寡核苷酸的兩條鏈，隨后使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)使之雜交。將此種雙鏈寡核苷酸稱作盒。將該盒設(shè)計(jì)為具有與已線性化的質(zhì)粒末端相容的5’和3’末端，以便將此盒與質(zhì)粒直接連接。質(zhì)粒現(xiàn)已包含已突變的DNA序列。
備選地或額外地，可對(duì)編碼多肽變體的預(yù)期氨基酸序列測(cè)序，并且可合成性產(chǎn)生編碼此氨基酸序列變體的核酸序列。
可以修飾母體多肽的氨基酸序列以產(chǎn)生具有改變的體外和/或體內(nèi)Fc受體結(jié)合親和性或活性和/或改變的體外和/或體內(nèi)抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用(ADCC)活性的變體Fc區(qū)。還可修飾母體多肽的氨基酸序列以產(chǎn)生具有改變的補(bǔ)體結(jié)合特性和/或循環(huán)半衰期的變體Fc區(qū)。
對(duì)Fc區(qū)生物學(xué)特性的顯著修飾可通過(guò)選擇替代實(shí)現(xiàn)，其中選擇替代對(duì)改變(a)替代范圍內(nèi)的多肽主鏈結(jié)構(gòu)，例如片層或螺旋構(gòu)象，(b)靶位點(diǎn)處分子的電荷或疏水性，或(c)側(cè)鏈體積，(d)與糖類相互作用，或(e)結(jié)構(gòu)域運(yùn)動(dòng)靈活性的影響顯著不同?；诠餐膫?cè)鏈特性將天然存在的殘基分為如下幾類(1)疏水性正亮氨酸、甲硫氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸；(2)中性親水半胱氨酸、絲氨酸、蘇氨酸；(3)酸性天冬氨酸、谷氨酸；(4)堿性天冬酰胺、谷氨酰胺、組氨酸、賴氨酸、精氨酸；(5)影響鏈方向的殘基甘氨酸，脯氨酸；和(6)芳香族色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸。
非保守性替代必須是這些類中的一個(gè)類別的成員與另一類別的成員的交換。保守性替代必須是這些類中的一個(gè)類別中的一個(gè)成員與同一類別的另一成員的交換。
如以下實(shí)施例中所示，F(xiàn)c區(qū)變體可設(shè)計(jì)為具有改變的活性(效應(yīng)子功能和藥物動(dòng)力學(xué))。例如可修飾Fc區(qū)的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基以便改變(例如提高或降低)ADCC活性。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，修飾包括這里所鑒定的一個(gè)或多個(gè)Fc區(qū)殘基(見(jiàn)例如實(shí)施例2和WO0042072，此處引用作為參考用于所有目的)。通常，對(duì)此處已鑒定的影響ADCC活性的一個(gè)或多個(gè)Fc區(qū)殘基進(jìn)行氨基酸替代，以便產(chǎn)生此種Fc區(qū)變體。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，將不超過(guò)1個(gè)至大約10個(gè)Fc區(qū)殘基進(jìn)行缺失或替代。此處包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸修飾(例如替代)的Fc區(qū)將優(yōu)選地保留至少80％、并且優(yōu)選至少大約90％以及最優(yōu)選至少大約95％的母體Fc區(qū)序列或天然序列的人Fc區(qū)。
還可產(chǎn)生氨基酸插入的Fc區(qū)變體，這種變體具有改變的效應(yīng)子功能。例如，可在此處已鑒定的影響FcR結(jié)合的一個(gè)或多個(gè)Fc區(qū)位置附近導(dǎo)入至少一個(gè)氨基酸(例如導(dǎo)入1-2個(gè)氨基酸殘基并且通常不超過(guò)10個(gè)殘基)。在“附近”意指在此處所鑒定的Fc區(qū)殘基的1-2個(gè)氨基酸殘基范圍內(nèi)。此Fc區(qū)變體可表現(xiàn)出相對(duì)母體分子增強(qiáng)或減弱的FcR結(jié)合和/或ADCC活性。為了產(chǎn)生此類插入變體，可評(píng)估包含F(xiàn)cR結(jié)合區(qū)域(例如目的FcR的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域)和待插入氨基酸殘基的Fc區(qū)的多肽的共結(jié)晶結(jié)構(gòu)(見(jiàn)例如Sondermann等，Nature 406267(2000)；Deisenhofer、Biochemistry 20(9)2361-2370(1981)和Burmeister等，Nature 342379-383，(1994)；所有文獻(xiàn)此處引用作為參考)，以便合理地設(shè)計(jì)具有例如改善FcR結(jié)合能力的Fc區(qū)變體。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，可在Fc區(qū)環(huán)內(nèi)而不是在Fc區(qū)的二級(jí)結(jié)構(gòu)(β-鏈)內(nèi)進(jìn)行此類插入。
通過(guò)在母體Fc區(qū)中導(dǎo)入適宜的氨基酸序列修飾，可產(chǎn)生成變體Fc區(qū)，該變體Fc區(qū)較母體多肽(a)在人效應(yīng)細(xì)胞存在下更高效或更低效地介導(dǎo)抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用(ADCC)和/或(b)在人補(bǔ)體存在下更高效或更低效地介導(dǎo)補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒作用(CDC)和/或(c)在不同pH以所期望的親和性結(jié)合Fcγ受體(FcγR)或Fc新生兒受體(FcRn)。此類Fc區(qū)變體通常在其Fc區(qū)內(nèi)包含至少一處氨基酸修飾。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，母體多肽Fc區(qū)是人Fc區(qū)，例如人IgG1(f和a、z同種異型)、IgG2、IgG3、IgG4天然人Fc區(qū)和從任何物種中所發(fā)現(xiàn)和所知的全部同種異型。此類區(qū)域具有如圖2(SEQ ID NO1-8)、圖3(SEQ ID NO9-12)和圖5(SEQ ID NO32-37)中所示的序列。
在某些實(shí)施方案中，為了產(chǎn)生具有改善ADCC活性的Fc區(qū)，母體多肽優(yōu)選具備先前存在的ADCC活性(例如包含人IgG1或人IgG3 Fc區(qū)的母體多肽)。在一些實(shí)施方案中，具有改善ADCC的變體較具有天然序列IgG1或IgG3 Fc區(qū)的抗體基本上更有效地介導(dǎo)ADCC(例如P247L和I332E變體)。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，將氨基酸修飾導(dǎo)入Fc區(qū)的CH2和/或CH3結(jié)構(gòu)域。對(duì)于為產(chǎn)生具有改變ADCC活性的變體IgG Fc區(qū)而進(jìn)行的突變，有用的氨基酸位置包括如下任何一個(gè)或多個(gè)氨基酸位置Fc區(qū)中的247、251、256、268、269、270、272、276、278、280、283、285、286、289、290、292、293、294、295、296、298、300 301、303、305、307、309、330、331、332、333、334、335、337、338、339、340、360、373、376、416、419、430、434、435、437、438、439或440。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，用作模板以產(chǎn)生此類變體的母體Fc區(qū)包括人IgG Fc區(qū)。
在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含具有Fc區(qū)的母體多肽變體的組合物，其中變體在效應(yīng)細(xì)胞存在時(shí)介導(dǎo)抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用(ADCC)并且在Fc區(qū)內(nèi)至少包含247位置處的一處氨基酸修飾。在某些實(shí)施方案中，氨基酸修飾是P247L。在另外的實(shí)施方案中，氨基酸修飾是P247I或P247H。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含具有Fc區(qū)的母體多肽變體的組合物，其中變體在效應(yīng)細(xì)胞存在時(shí)介導(dǎo)抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用(ADCC)并且在Fc區(qū)內(nèi)至少包含251位置處的一處氨基酸修飾。在某些實(shí)施方案中，氨基酸修飾是L251F。
在特定實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含具有Fc區(qū)的母體多肽變體的組合物，其中變體在效應(yīng)細(xì)胞存在時(shí)介導(dǎo)抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用(ADCC)并且在Fc區(qū)內(nèi)至少包含256位置處的一處氨基酸修飾。在某些實(shí)施方案中，氨基酸修飾是T256M或T256P。
在特定實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含具有Fc區(qū)的母體多肽變體的組合物，其中變體在效應(yīng)細(xì)胞存在時(shí)介導(dǎo)抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用(ADCC)并且在Fc區(qū)內(nèi)至少包含268位置處的一處氨基酸修飾。在某些實(shí)施方案中，氨基酸修飾是H268D或H268E。
在特定實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含具有Fc區(qū)的母體多肽變體的組合物，其中變體在效應(yīng)細(xì)胞存在時(shí)介導(dǎo)抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用(ADCC)并且在Fc區(qū)內(nèi)至少包含280位置處的一處氨基酸修飾。在某些實(shí)施方案中，氨基酸修飾是D280A或D280K。
在特定實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含具有Fc區(qū)的母體多肽變體的組合物，其中變體在效應(yīng)細(xì)胞存在時(shí)介導(dǎo)抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用(ADCC)并且在Fc區(qū)內(nèi)至少包含330位置處的一處氨基酸修飾。在某些實(shí)施方案中，氨基酸修飾是A330K或A330R。
在特定實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含具有Fc區(qū)的母體多肽變體的組合物，其中變體在效應(yīng)細(xì)胞存在時(shí)介導(dǎo)抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用(ADCC)并且在Fc區(qū)內(nèi)至少包含332位置處的一處氨基酸修飾。在某些實(shí)施方案中，氨基酸修飾是I332D、I332E、I332K或I332R。
在特定實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含具有Fc區(qū)的母體多肽變體的組合物，其中變體在效應(yīng)細(xì)胞存在時(shí)介導(dǎo)抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用(ADCC)并且在Fc區(qū)內(nèi)至少包含339位置處的一處氨基酸修飾。在某些實(shí)施方案中，氨基酸修飾是A339T。
在特定實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含具有Fc區(qū)的母體多肽變體的組合物，其中變體在效應(yīng)細(xì)胞存在時(shí)介導(dǎo)抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用(ADCC)并且在Fc區(qū)內(nèi)至少包含378位置處的一處氨基酸修飾。在某些實(shí)施方案中，氨基酸修飾是A378D。
在特定實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含具有Fc區(qū)的母體多肽變體的組合物，其中變體在效應(yīng)細(xì)胞存在時(shí)介導(dǎo)抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用(ADCC)并且在Fc區(qū)內(nèi)至少包含440位置處的一處氨基酸修飾。在某些實(shí)施方案中，氨基酸修飾是S440Y。
可對(duì)上述多肽變體進(jìn)一步修飾，這取決于對(duì)該多肽所期望或所計(jì)劃的用途。此類修飾可包括例如氨基酸序列的進(jìn)一步改變(氨基酸殘基的替代、插入和/或缺失)、糖修飾、與異源多肽融合和/或共價(jià)修飾。此類另外的修飾可在如上所公開(kāi)的氨基酸修飾之前、同時(shí)或隨后進(jìn)行，導(dǎo)致Fc受體結(jié)合和/或ADCC活性的改變。
備選地或額外地，將氨基酸修飾與改變Fc區(qū)的C1q結(jié)合和/或補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒作用功能的一種或多種另外的氨基酸修飾結(jié)合是有用的。此處特別感興趣的起始多肽是一種結(jié)合C1q并表現(xiàn)出補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒作用(CDC)的多肽。此處所述的氨基酸替代可改變?cè)撈鹗级嚯慕Y(jié)合C1q的能力和/或修飾其補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒作用功能(例如降低并且優(yōu)選地消除這些效應(yīng)子功能)。然而這里構(gòu)想了在所述的一個(gè)或多個(gè)位置處包含替代的具有改善C1q結(jié)合和/或補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒作用(CDC)功能的多肽。例如，起始多肽不能夠結(jié)合C1q和/或介導(dǎo)CDC并且可根據(jù)此處的教導(dǎo)得以修飾以至于獲得這些另外的效應(yīng)子功能。此外，可對(duì)具有先前存在的C1q結(jié)合活性、任選地還具有介導(dǎo)CDC的能力的多肽進(jìn)行修飾，以至于這類活性中的一種或兩種活性得到增強(qiáng)。在例如WO0042072(此處引用作為參考)中描述了改變C1q和/或修飾其補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒作用功能的氨基酸修飾。
如上所公開(kāi)，可通過(guò)例如修飾CDC活性和/或ADCC活性對(duì)具有改變的效應(yīng)子功能的Fc區(qū)或其部分進(jìn)行設(shè)計(jì)。例如，可生成具有改善CDC活性和改善ADCC活性的變體Fc區(qū)(例如既具有改善的ADCC活性又具有改善的CDC活性)。備選地，在需要降低或消除效應(yīng)子功能時(shí)，可設(shè)計(jì)具有降低CDC活性和/或降低ADCC活性的變體Fc區(qū)。在其他實(shí)施方案中，可僅僅提高這些活性中的一種活性，并且任選地還可降低其他活性，以產(chǎn)生例如具有改善的ADCC活性但降低的CDC活性的Fc區(qū)變體或具有改善的CDC活性但降低的ADCC活性的Fc區(qū)變體。此外，還可設(shè)計(jì)對(duì)FcRn、A蛋白和/或另一些Fc結(jié)合蛋白質(zhì)具有修飾的結(jié)合親和性的變體Fc區(qū)。
氨基酸替代的另一類型起改變多肽糖基化方式的作用。這可通過(guò)例如缺失多肽內(nèi)存在的一個(gè)或多個(gè)糖類部分和/或添加一個(gè)或多個(gè)多肽中不存在的糖基化位點(diǎn)而實(shí)現(xiàn)。備選地，這可以通過(guò)改變糖基化位點(diǎn)以外的氨基酸或通過(guò)將細(xì)胞工程化而間接實(shí)現(xiàn)。多肽的糖基化一般是N-連接或O-連接。N-連接指糖類部分與天冬酰胺殘基側(cè)鏈連接。天冬酰胺-X-絲氨酸和天冬酰胺-X-蘇氨酸的肽序列是糖部分與天冬酰胺側(cè)鏈進(jìn)行酶性連接的識(shí)別序列，其中X為除脯氨酸以外的任意氨基酸。因此，在多肽中出現(xiàn)這兩種肽序列之一則產(chǎn)生潛在的糖基化位點(diǎn)。O-連接的糖基化指N-乙?；肴樘前贰肴樘腔蚰咎侵慌c羥氨基酸的連接，盡管也可以利用5-羥脯氨酸或5-羥賴氨酸，但在多數(shù)情況下該羥氨基酸是絲氨酸或蘇氨酸。
可通過(guò)改變氨基酸序列以至于該多肽含有一個(gè)或多個(gè)上述三肽序列(對(duì)于N連接的糖基化位點(diǎn))方便地實(shí)現(xiàn)向多肽中添加糖基化位點(diǎn)。這種改變還可以通過(guò)向原始多肽序列中添加或替代一個(gè)或多個(gè)絲氨酸或蘇氨酸殘基(對(duì)于O-連接的糖基化位點(diǎn))實(shí)現(xiàn)。示例性糖基化變體含有重鏈Asn297殘基的氨基酸替代。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含具有Fc區(qū)的母體多肽變體的組合物，其中變體包含至少一處表面殘基氨基酸修飾(見(jiàn)例如Deisenhofer，Biochemistry，28；20(9)2361-70，1981年4月以及WO0042072，此處引用作為參考)。在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含具有Fc區(qū)的母體多肽變體的組合物，其中變體包含至少一處非表面殘基氨基酸修飾。在另外一些實(shí)施方案中，本發(fā)明包含具有Fc區(qū)的母體多肽變體，其中變體包含至少一處表面殘基氨基酸修飾和至少一處非表面殘基氨基酸修飾。
III.組合變體在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的變體包含兩處或多處氨基酸修飾(例如替代)?？赏ㄟ^(guò)選擇兩處或多處上面所詳述的氨基酸修飾產(chǎn)生此類組合變體。下表1提供了兩處或多處氨基酸替代的示例性組合。例如，表1的第一行顯示了P247H與位置251、256、268、280、330、332、339、378和440上的其他氨基酸替代的可能組合(例如這一行顯示了2處、3處、4處、5處、6處、7處、8處、9處和10處氨基酸修飾的組合)。
表1.示例性組合變體


**注意本表使用了如在Kabat中的EU編號(hào)。
示于表1中的組合變體和其他組合變體(如在WO0042072中公開(kāi)的那些組合變體)可在多種測(cè)定法(見(jiàn)以下IV部分)中測(cè)試特定的活性(例如FcR結(jié)合活性、ADCC活性和CDC活性)。就此而言，可鑒定出有用的組合變體。
在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合變體具有一處提高ADCC活性的氨基酸修飾和一處提高新生兒Fc受體(FcRn)結(jié)合親和性(例如在pH 6.0，而不是在pH 7.0或7.4)的氨基酸修飾。在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合變體具有一處表面氨基酸修飾和一處非表面氨基酸修飾。可通過(guò)將兩處或多處此處所述氨基酸修飾進(jìn)行組合或者將至少一處此處所述氨基酸修飾與WO004207中所述的那些氨基酸修飾進(jìn)行組合產(chǎn)生另一些組合變體。
IV.變體多肽測(cè)定法本發(fā)明提供用于篩選Fc區(qū)變體的多種測(cè)定法。篩選測(cè)定法可用于發(fā)現(xiàn)或證實(shí)有用的變體。例如可篩選組合變體(見(jiàn)表1)以發(fā)現(xiàn)具有改變的FcR結(jié)合和/或改變的ADCC和/或改變的CDC活性(例如提高的或降低的ADCC或CDC活性)和/或修飾的從全血損耗靶細(xì)胞(例如B細(xì)胞)能力的變體。如下所述，本發(fā)明的測(cè)定法還可用于發(fā)現(xiàn)或證實(shí)在受試者(例如具有抗體或免疫粘附素應(yīng)答性疾病癥狀的人)中表現(xiàn)有益治療性活性的變體?？墒褂枚喾N類型的測(cè)定法，以便評(píng)價(jià)與母體多肽相比變體的任何變化(見(jiàn)WO0042072中所提供的篩選測(cè)定法，此處引用作為參考)。另一些示例性測(cè)定法如下描述。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的變體是與非變體(母體)多肽相比基本保留結(jié)合抗原的能力(通過(guò)未修飾的抗原結(jié)合區(qū)域或經(jīng)修飾的抗原結(jié)合區(qū)域)(例如結(jié)合能力優(yōu)選地不低于非變體多肽結(jié)合能力大約20倍或不低于大約5倍)的抗體。此多肽變體結(jié)合抗原的能力可使用技術(shù)例如ELISA、熒光激活細(xì)胞分選(FACS)分析或放射免疫沉淀(RIA)測(cè)定。
Fc受體(FcR)結(jié)合測(cè)定法可用于評(píng)估本發(fā)明的變體。例如，可使用特異性結(jié)合多肽變體的抗體，以ELISA方式滴定多肽變體和測(cè)量所結(jié)合多肽變體(見(jiàn)以下實(shí)施例)來(lái)測(cè)量對(duì)Fc受體例如FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIII、FcRn等的結(jié)合。例如，可在標(biāo)準(zhǔn)ELISA測(cè)定法中篩選包含抗體的變體以便確定在pH 6.0和pH 7.0或7.4時(shí)與FcRn的結(jié)合?？捎靡寻绘溍褂H和素或中性鏈親和素(Neutravidin)的固體表面捕獲生物素標(biāo)記的任何物種(如小鼠或人)FcRn。封閉后，將已捕獲的受體與在pH 6.0或pH 7.0的緩沖液中稀釋的變體多肽(抗體)溫育。在后續(xù)步驟中加入對(duì)人抗體特異的分子(如綴合一種酶的山羊(Fab’)2抗人Fab)。隨后加入底物，以測(cè)定與在pH 6.0或pH 7.0或7.4時(shí)固定化FcRn結(jié)合的變體多肽的量。將該測(cè)定結(jié)果與母體(非變體)多肽與同一FcR結(jié)合的能力進(jìn)行比較。在其他優(yōu)選的實(shí)施方案中，將用于實(shí)施篩選變體的ELISA(例如用FcRn)的成分包裝于試劑盒中(例如與使用說(shuō)明書一起)。
抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用(ADCC)測(cè)定法還可用于篩選本發(fā)明的變體。ADCC測(cè)定法可在體外或體內(nèi)進(jìn)行。為評(píng)估多肽變體的ADCC活性，可開(kāi)展效應(yīng)物靶比例可變的體外ADCC測(cè)定法。示例性ADCC測(cè)定法可使用表達(dá)如下任一靶抗原的靶細(xì)胞系CD20、CD22、CD33、CD40、CD63、EGF受體、her-2受體、前列腺特異性膜抗原、Lewis Y糖類、GD2和GD3神經(jīng)節(jié)苷脂、lamp-1、CO-029、L6和ephA2。效應(yīng)細(xì)胞可從健康供者中獲得(例如在試驗(yàn)當(dāng)日)并且可使用Histopaque(Sigma)純化PBMC。在與效應(yīng)細(xì)胞按照例如40∶1、20∶1和10∶1的效應(yīng)物∶靶比例混合之前，靶細(xì)胞與例如0.1-1,000ng/ml的IgG變體預(yù)先溫育大約30分鐘。隨后使用細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒(Roche Molecular Biochemicals)比色測(cè)量ADCC活性，其中試劑盒基于測(cè)量從所破壞細(xì)胞的胞質(zhì)中釋放到上清液中的乳酸脫氨酶(LDH)活性來(lái)定量細(xì)胞的死亡和裂解。對(duì)于已經(jīng)加入鉻51的靶細(xì)胞測(cè)定法，還可通過(guò)測(cè)量所釋放得到的鉻51來(lái)測(cè)量ADCC活性?？贵w非依賴性細(xì)胞的細(xì)胞毒作用可通過(guò)測(cè)量無(wú)抗體時(shí)來(lái)自靶細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞的LDH活性確定。在1％Triton X-100加至靶細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞的混合物中后測(cè)量總釋放量。在優(yōu)化的時(shí)間段(0.54-18小時(shí))內(nèi)于37℃在5.0％CO2中進(jìn)行靶細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞的溫育，然后離心測(cè)定培養(yǎng)板。將上清液轉(zhuǎn)移至96孔培養(yǎng)板并且與LDH檢測(cè)試劑于25℃溫育30分鐘。然后使用微量培養(yǎng)板讀數(shù)器在490nm測(cè)量樣品吸收。隨后使用如下方程式計(jì)算細(xì)胞毒性百分?jǐn)?shù)細(xì)胞毒性％＝試驗(yàn)值-低對(duì)照/高對(duì)照-低對(duì)照×100％?？笴D20和變體的細(xì)胞毒性百分?jǐn)?shù)可與等量RITUXAN直接比較以測(cè)量相對(duì)有效性。示例性ADCC測(cè)定法可使用過(guò)表達(dá)CD20抗原的SKW6.4細(xì)胞(例如購(gòu)自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心)作為靶細(xì)胞源。此測(cè)定法的多種變化為本領(lǐng)域所知(見(jiàn)例如Zuckerman等，CRC Crit Rev Microbiol 1978；7(1)1-26，此處引用作為參考)。
用于這類測(cè)定法的效應(yīng)細(xì)胞包括(但不限于)天然殺傷細(xì)胞(NK)、巨噬細(xì)胞和其他外周血單核細(xì)胞(PBMC)。備選地或額外地，本發(fā)明多肽變體的ADCC活性可在如Clynes等(PNAS(USA)95652-656(1998)，此處引用作為參考)所公開(kāi)的動(dòng)物模型中進(jìn)行體內(nèi)確定。還可篩選本發(fā)明變體的補(bǔ)體活化作用。為評(píng)估補(bǔ)體活化作用，可實(shí)施補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒作用(CDC)測(cè)定法(見(jiàn)例如Gazzano-Santoro等，J.Immunol.Methods，202163(1996)，此處引用作為參考)。例如，可用緩沖液將多肽變體和人補(bǔ)體稀釋為多個(gè)濃度。將表達(dá)多肽變體所結(jié)合抗原的細(xì)胞稀釋至～1×106細(xì)胞/ml的密度。多肽變體、已稀釋的人補(bǔ)體和表達(dá)所述抗原的細(xì)胞的混合物可加至96孔平底組織培養(yǎng)平板并且于37℃在5％CO2中溫育2小時(shí)以促進(jìn)補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞裂解。然后可向每孔加入50μl alama藍(lán)(AccumedInternational)并且于37℃溫育過(guò)夜。使用96孔熒光計(jì)在530nm激發(fā)光和590nm發(fā)射光下測(cè)量吸收度。將結(jié)果表示為相對(duì)熒光單位(RFU)。樣品濃度可從標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算并且與非變體多肽相比的活性百分?jǐn)?shù)表示為目的多肽變體的活性百分?jǐn)?shù)。
在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的變體不活化補(bǔ)體。例如，與具有未突變IgGl Fc區(qū)的對(duì)照抗體相比，多肽變體在該測(cè)定法中表現(xiàn)出大約0-10％的CDC活性。優(yōu)選地，在以上CDC測(cè)定法中，該變體不具有任何CDC活性(例如高于背景)。在其他實(shí)施方案中，與母體多肽相比，本發(fā)明的變體具有增強(qiáng)的CDC活性(例如當(dāng)比較IC50值時(shí)，表現(xiàn)出體內(nèi)或體外CDC活性改善大約2倍至大約100倍(或更高))。
還可在全血測(cè)定法中篩選本發(fā)明變體對(duì)靶細(xì)胞的損耗。例如，使用facs(Vugmeyster等，2003 Cytometry 52A，101-109)對(duì)多種濃度的具有CD20靶特異性的多肽變體在全血測(cè)定法中對(duì)B細(xì)胞的損耗進(jìn)行篩選。新鮮抽取的血液與不同濃度的多肽變體于37℃在5％CO2中溫育4小時(shí)(時(shí)間可變動(dòng))。溫育后，根據(jù)制造商說(shuō)明書用氯化銨試劑(Beckton-Dickinson，目錄號(hào)#555899)裂解紅細(xì)胞并且使用B細(xì)胞特異性熒光標(biāo)記抗體(例如抗CD19)通過(guò)facs檢測(cè)B細(xì)胞。結(jié)果表示為相對(duì)于未處理樣品或用無(wú)關(guān)(非損耗作用的)抗體溫育后樣品的B細(xì)胞損耗的百分?jǐn)?shù)。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，變體較母體多肽更有效地?fù)p耗B細(xì)胞。變體以大約2倍或更大程度、并且優(yōu)選大約5倍或更大程度地?fù)p耗B細(xì)胞。同樣，變體在損耗B細(xì)胞方面表現(xiàn)出更大的潛力。例如，可使用少大約5倍且優(yōu)選少大約10倍的變體抗體而得到與母體多肽所損耗B細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)相同。與母體多肽相比，變體所介導(dǎo)的靶細(xì)胞損耗提高大約5倍至大約100倍，并且優(yōu)選地從大約5倍至大約1000倍。
還可體內(nèi)篩選本發(fā)明的變體?？刹捎萌魏晤愋偷捏w內(nèi)測(cè)定法。如下提供一種類型測(cè)定法的特定實(shí)例。該示例性測(cè)定法可以用于Fc變體的體內(nèi)臨床前評(píng)估?？稍谝阎哂心承┗钚缘奶囟贵w的Fc區(qū)中加入待測(cè)試變體。例如，可通過(guò)誘變將變體加入到抗CD20 IgG的Fc區(qū)。而這可將母體IgG和Fc變體IgG與RITUXAN(已知促進(jìn)腫瘤消退)直接比較?？稍趦善?藥物代謝動(dòng)力學(xué)期和藥物效應(yīng)動(dòng)力學(xué)期)中進(jìn)行臨床前評(píng)估。I期藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究的目標(biāo)是確定Fc變體IgG和具有已知體內(nèi)活性的抗體(例如RITUXAN)之間的清除率是否存在差異。清除率的差異可引起血清中IgG穩(wěn)態(tài)水平的差異。因此，若檢測(cè)到穩(wěn)態(tài)濃度的差異，應(yīng)當(dāng)進(jìn)行歸一化以便進(jìn)行精確比較。II期藥物效應(yīng)動(dòng)力學(xué)研究的目標(biāo)是確定Fc突變對(duì)腫瘤生長(zhǎng)(本例中)的效應(yīng)。先前用RITUXAN進(jìn)行的研究使用了完全抑制腫瘤生長(zhǎng)的單個(gè)劑量。因?yàn)檫@種劑量不能測(cè)量定量性差異，因此應(yīng)當(dāng)使用一個(gè)劑量范圍。
可按照如下方式實(shí)施Fc變體、野生型母體Fc和RITUXAN的I期藥物代謝動(dòng)力學(xué)比較。首先，向每只動(dòng)物靜脈內(nèi)注射40μg，并且在第0、0.25、0.5、1、24、48、72、96、120、168和336小時(shí)定量血漿IgG水平。例如，可使用藥物代謝動(dòng)力學(xué)程序(WinNonLin)利用零延遲二室藥物代謝動(dòng)力學(xué)模型過(guò)濾數(shù)據(jù)以獲得清除率。清除率可在如下等式中用于描述穩(wěn)態(tài)血漿水平C＝劑量/(清除率×τ)，其中τ是劑量之間的間隔期并且C是穩(wěn)態(tài)時(shí)的血漿水平。藥物代謝動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)可在不帶腫瘤的小鼠中實(shí)施，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)用最少5只小鼠。
可按如下方式在下一期中使用動(dòng)物模型?？上駽B17-SCID小鼠右腹部皮下移植106個(gè)Raji細(xì)胞。移植后可立即靜脈注射Fc變體、野生型Fc和RITUXAN并且持續(xù)至腫瘤直徑大于2cm。在每周一、周三、周五使用測(cè)徑器測(cè)量腫瘤的長(zhǎng)、寬和高來(lái)確定腫瘤體積(腫瘤體積＝W×L×D)。腫瘤體積對(duì)時(shí)間的曲線將給出用于藥物代謝動(dòng)力學(xué)計(jì)算的腫瘤生長(zhǎng)率。每組應(yīng)當(dāng)最少使用大約10只動(dòng)物。
可按如下方式實(shí)施Fc變體、野生型Fc和RITUXAN的II期藥物效應(yīng)動(dòng)力學(xué)比較。基于已公開(kāi)的數(shù)據(jù)，每周10μg/g的RITUXAN完全抑制體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)(Clynes等，Nat.Med.2000年4月；6(4)443-6，2000，此處引用作為參考)。因此可測(cè)試如下的每周劑量范圍10μg/g、5μg/g、1μg/g、0.5μg/g和0μg/g。通過(guò)穩(wěn)態(tài)血漿水平和效力間的相互關(guān)系圖表確定抑制腫瘤生長(zhǎng)50％的穩(wěn)態(tài)血漿水平。穩(wěn)態(tài)血漿水平可如上所述計(jì)算。根據(jù)需要，對(duì)于每個(gè)Fc變體和Fc野生型可根據(jù)它們的藥物代謝動(dòng)力學(xué)特性相應(yīng)調(diào)整τ以取得與RITUXAN可比的穩(wěn)態(tài)血漿水平。與母體多肽(例如Fc野生型)和RITUXAN相比，F(xiàn)c變體的在統(tǒng)計(jì)學(xué)上改善的藥物效應(yīng)動(dòng)力學(xué)數(shù)值通常說(shuō)明Fc變體提供了改善的體內(nèi)活性。
如前所述(Reff等，Blood 83，435-445、1994)，可在食蟹猴中進(jìn)行Fc變體、野生型Fc和RITUXAN的另外的藥物效應(yīng)動(dòng)力學(xué)比較。損耗外周B細(xì)胞和淋巴結(jié)B細(xì)胞的劑量反應(yīng)可用于比較靜脈內(nèi)和/或皮下所施用Fc變體與野生型Fc和Rituxan的相對(duì)潛能。與母體多肽(例如Fc野生型)和RITUXAN相比，F(xiàn)c變體的在統(tǒng)計(jì)學(xué)上改善的藥物效應(yīng)動(dòng)力學(xué)數(shù)值通常說(shuō)明Fc變體賦予了改善的體內(nèi)活性。
在另外一些實(shí)施方案中，對(duì)本發(fā)明的變體進(jìn)行篩選以至于鑒定出在至少兩個(gè)物種中具有治療用途的變體。此類變體在此處稱作“雙物種改良變體”，并且該類變體尤其用于鑒定在人中有療效、并且在動(dòng)物模型中也表現(xiàn)(或有可能表現(xiàn))功效的變體。就此而言，本發(fā)明提供鑒定變體的方法，其中變體很有可能被批準(zhǔn)用于人臨床測(cè)試，因?yàn)閯?dòng)物模型數(shù)據(jù)將有可能支持向政府管理機(jī)構(gòu)(如美國(guó)食品藥品管理局)提出的任何人類測(cè)試申請(qǐng)。
在某些實(shí)施方案中，如下鑒定雙物種改良變體，即首先實(shí)施使用人效應(yīng)細(xì)胞的ADCC測(cè)定法以發(fā)現(xiàn)改良的變體，然后使用小鼠、大鼠或非人靈長(zhǎng)類效應(yīng)細(xì)胞進(jìn)行ADCC測(cè)定法以便鑒定作為雙物種改良變體的改良變體的亞類。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供鑒定雙物種改良變體的方法，其包括a)提供i)靶細(xì)胞，ii)組合物，其包含具有至少一部分Fc區(qū)的母體多肽的候選變體，其中候選變體在Fc區(qū)內(nèi)包含至少一處氨基酸修飾，并且其中該候選變體在第一個(gè)物種(例如人)效應(yīng)細(xì)胞存在時(shí)較母體多肽更有效地介導(dǎo)靶細(xì)胞細(xì)胞毒性，和iii)第二個(gè)物種(例如小鼠、大鼠或非人靈長(zhǎng)類)效應(yīng)細(xì)胞，以及b)將組合物與靶細(xì)胞在使得候選變體結(jié)合靶細(xì)胞的條件下溫育，以至于產(chǎn)生結(jié)合該候選變體的靶細(xì)胞，c)將第二個(gè)物種的效應(yīng)細(xì)胞與已結(jié)合候選變體的靶細(xì)胞混合，以及d)測(cè)量由該候選變體介導(dǎo)的靶細(xì)胞細(xì)胞毒性。在某些實(shí)施方案中，方法還包括步驟e)確定在第二個(gè)物種細(xì)胞應(yīng)細(xì)胞存在時(shí)候選變體是否較母體多肽更有效地介導(dǎo)靶細(xì)胞細(xì)胞毒性。在一些實(shí)施方案中，方法還包括步驟f)鑒定作為雙物種改良變體的候選變體，其中在第二個(gè)物種的效應(yīng)細(xì)胞存在時(shí)雙物種改良變體較母體多肽更有效地介導(dǎo)靶細(xì)胞細(xì)胞毒性。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，隨后在一種或多種動(dòng)物測(cè)定法中體內(nèi)篩選所鑒定的雙物種變體。
在某些實(shí)施方案中，如下鑒定雙物種改良變體，即首先使用人的血液進(jìn)行全血測(cè)定以發(fā)現(xiàn)改良的變體，然后使用小鼠、大鼠或非人靈長(zhǎng)類的血液進(jìn)行全血測(cè)定以便鑒定作為雙物種改良變體的改良變體的亞類。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于鑒定雙物種改良變體的方法，其包括a)提供i)靶細(xì)胞，ii)組合物，其包含具有至少一部分Fc區(qū)的母體多肽的候選變體，其中候選變體在Fc區(qū)內(nèi)包含至少一處氨基酸修飾，并且其中該候選變體在第一個(gè)物種(例如人)血液存在時(shí)較母體多肽更有效地介導(dǎo)靶細(xì)胞損耗，和iii)第二個(gè)物種(例如小鼠、大鼠或非人的靈長(zhǎng)類)血液，以及b)將組合物與靶細(xì)胞在使得候選變體結(jié)合靶細(xì)胞的條件下一起溫育，以至于產(chǎn)生結(jié)合該候選變體的靶細(xì)胞，c)將第二個(gè)物種血液與已結(jié)合候選變體的靶細(xì)胞混合，以及d)測(cè)量由候選變體介導(dǎo)的靶細(xì)胞損耗。在某些實(shí)施方案中，方法還包括步驟e)確定在第二個(gè)物種血液存在時(shí)候選變體是否較母體多肽更有效地介導(dǎo)靶細(xì)胞損耗。在一些實(shí)施方案中，方法還包括步驟f)鑒定作為雙物種改良變體的候選變體，其中在第二個(gè)物種血液存在時(shí)雙物種改良變體較母體多肽更有效地介導(dǎo)靶細(xì)胞損耗。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，隨后在一種或多種動(dòng)物測(cè)定法中體內(nèi)篩選所鑒定的雙物種變體。
在某些實(shí)施方案中，通過(guò)使用人成分(例如人細(xì)胞、人Fc受體等)開(kāi)展以上任意測(cè)定法以鑒定改良的變體，隨后以使用非人的動(dòng)物成分(例如小鼠細(xì)胞、小鼠Fc受體等)的相同測(cè)定法鑒定雙物種改良變體。就此而言，可鑒定出在基于人的測(cè)定法和基于第二個(gè)物種的測(cè)定法中根據(jù)特定標(biāo)準(zhǔn)表現(xiàn)均為良好的變體亞類。
用于鑒定雙物種改良變體的示例性方法如下。首先，將編碼至少一部分IgG Fc區(qū)的核酸序列突變，以便所表達(dá)的氨基酸序列具有至少一處氨基酸改變，由此產(chǎn)生變體。隨后，該種表達(dá)的IgG變體在使用人PBMC或亞類(例如NK細(xì)胞或巨噬細(xì)胞)的ADCC測(cè)定法中進(jìn)行表征。如果發(fā)現(xiàn)ADCC活性增強(qiáng)，隨后在使用小鼠或大鼠PBMC的第二個(gè)ADCC測(cè)定法中篩選該變體。備選地或額外地，測(cè)定變體對(duì)克隆的嚙齒類受體或細(xì)胞系的結(jié)合。最后，如果在第二個(gè)測(cè)定法中發(fā)現(xiàn)該變體得到改善，則認(rèn)定其為雙改良變體，然后在小鼠或大鼠中體內(nèi)篩選該變體。
V.含變體Fc區(qū)的示例性分子本發(fā)明的變體Fc區(qū)可以是較大分子的一部分。較大分子可以是例如單克隆抗體、多克隆抗體、嵌合抗體、人源化抗體、雙特異性抗體、免疫粘附素等。因此，顯而易見(jiàn)本發(fā)明的變體Fc區(qū)應(yīng)用范圍廣泛。
A.含有變體Fc區(qū)的抗體在優(yōu)選的實(shí)施方案中，含有變體Fc區(qū)的分子(例如多肽)是抗體。產(chǎn)生抗體的技術(shù)如下所述。
(i)抗原選擇和制備通常，當(dāng)含有變體Fc區(qū)的分子是抗體時(shí)，該抗體針對(duì)目的抗原。優(yōu)選地，抗原是多肽并且抗體向患有疾病或病癥的哺乳動(dòng)物的施用可以在該哺乳動(dòng)物中產(chǎn)生治療性益處。然而還可使用針對(duì)非多肽抗原(如腫瘤相關(guān)糖脂抗原；見(jiàn)美國(guó)專利5,091,178，此處引用作為參考)的抗體。
示例性抗原包括(但不限于)如下分子如腎素；生長(zhǎng)素，包括人生長(zhǎng)激素和牛生長(zhǎng)激素；生長(zhǎng)激素釋放因子；甲狀旁腺素；促甲狀腺激素；脂蛋白；α-1-抗胰蛋白；胰島素A-鏈；胰島素B-鏈；胰島素原；促卵泡激素；降鈣素；促黃體激素；胰高血糖素；凝血因子如因子VIIIC、因子IX、組織因子(TF)和血管性血友病因子；抗凝血因子如蛋白C；心房鈉尿因子；肺表面活性物質(zhì)；纖溶酶原激活物如尿激酶或人尿或組織型纖溶酶原激活物(t-PA)；鈴蟾肽；凝血酶；造血生長(zhǎng)因子；腫瘤壞死因子-α和腫瘤壞死因子-β；腦啡肽酶；RANTES(對(duì)正?；罨疶-細(xì)胞的表達(dá)和分泌的調(diào)節(jié))；人巨噬細(xì)胞炎癥蛋白(MIP-1-α)；血清白蛋白如人血清白蛋白；Muellerian-抑制性物質(zhì)；松弛素A-鏈；松弛素B-鏈；松弛素原；小鼠促性腺激素相關(guān)肽；微生物的蛋白質(zhì)如β-內(nèi)酰胺酶；DNA酶；IgE；細(xì)胞毒T-淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原(CTLA)如CTLA-4；抑制素；激活素；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)；激素或生長(zhǎng)因子的受體；蛋白質(zhì)A或D；類風(fēng)濕因子；神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，如骨源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)蛋白-3、-4、-5或-6(NT-3、NT-4、NT-5或NT-6)或神經(jīng)生長(zhǎng)因子；血小板衍生生長(zhǎng)因子(PDGF)；成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子如αFGF和βFGF；表皮生長(zhǎng)因子(EGF)；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)如TGF-α和TGFβ，包括TGF-1、TGF-2、TGF-3、TGF-4或TGF-5；胰島素樣生長(zhǎng)因子-I和-II(IGF-I和IGF-II)；des(1-3)-IGF-I(腦IGF-I)、胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白；CD蛋白如CD3、CD4、CD8、CD19和CD20；促紅細(xì)胞生成素；骨誘導(dǎo)因子；免疫毒素；骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)；干擾素如干擾素-α、-β和-γ；集落刺激因子(CSF)如M-CSF、GM-CSF和G-CSF；白介素(IL)、例如IL-1至IL-10；超氧化物歧化酶；T-細(xì)胞受體；表面膜蛋白；衰變加速因子；病毒抗原如AIDS包膜蛋白的部分；轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白；歸巢受體；地址素；調(diào)節(jié)蛋白；整合素如CD11a、CD11b、CD11c、CD18、ICAM、VLA-4和VCAM；腫瘤相關(guān)抗原如HER2、HER3或HER4受體；凋亡途徑成員和以上所列任一多肽的片段。
優(yōu)選的抗原包括(但不限于)CD蛋白如CD3、CD4、CD8、CD19、CD20和CD34；ErbB受體家族成員如EGF受體、HER2、HER3或HER4受體；細(xì)胞粘附分子如LFA-1、Mac1、p150.95、VLA-4、ICAM-1、VCAM、包括其a或多個(gè)亞基的a4/p7整合素和(Xv/p3整合素(例如抗CD11a、抗CD18或抗CD11b抗體)；生長(zhǎng)因子如VEGF；組織因子(TF)；α干擾素(a-IFN)；白介素如IL-8；IgE；血型抗原；flk2/flt3受體；肥胖癥(OB)受體；mpl受體；CTLA-4；蛋白C等。
任選地與其他分子綴合的可溶性抗原或其片段可用作產(chǎn)生抗體的免疫原。對(duì)于跨膜分子，例如受體或其片段(例如受體的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域)可用作免疫原。備選地，表達(dá)跨膜分子的細(xì)胞可用作免疫原。此類細(xì)胞可源自天然來(lái)源(例如癌細(xì)胞系)或是已經(jīng)通過(guò)重組技術(shù)轉(zhuǎn)化而表達(dá)跨膜分子的細(xì)胞。用于制備抗體的其他抗原及其形式對(duì)于本領(lǐng)域人員是顯而易見(jiàn)的。
(ii)多克隆抗體本發(fā)明提供具有變體Fc區(qū)的多克隆抗體。例如，可將含有已修飾G1恒定區(qū)的人免疫球蛋白庫(kù)移植給免疫球蛋白失活小鼠，產(chǎn)生表達(dá)含有已修飾Fc區(qū)的人免疫球蛋白庫(kù)的小鼠(見(jiàn)例如Mendez，MJ等，Nature Genetics15146(1997)，此處引用作為參考)。多克隆抗體優(yōu)選地在動(dòng)物中通過(guò)多點(diǎn)皮下(sc)或腹膜內(nèi)(ip)注射相關(guān)抗原和佐劑產(chǎn)生?？梢允褂秒p功能劑或衍生劑(例如通過(guò)半胱氨酸殘基綴合的馬來(lái)酰亞胺苯甲?；腔牾啺孵ァ⑼ㄟ^(guò)賴氨酸殘基綴合的N-羥基琥珀酰亞胺、戊二醛、琥珀酸酐、SOCl2或R1N＝C＝NR，其中R和R1是不同烷基)將相關(guān)抗原與在待免疫物種中具有免疫原性的蛋白質(zhì)(例如鑰孔血藍(lán)蛋白、血清白蛋白、牛甲狀腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制物)綴合。
用于兔和鼠的示例性的常規(guī)免疫方法如下。通過(guò)將例如100μg或5μg蛋白質(zhì)或綴合物(例如分別用于兔或小鼠)與3倍體積的弗氏完全佐劑混合并將該溶液皮內(nèi)多點(diǎn)注射，來(lái)對(duì)動(dòng)物實(shí)施針對(duì)抗原、免疫原性綴合物或衍生物的免疫。一個(gè)月后，用混于弗氏完全佐劑中的最初量1/5或1/10的肽或綴合物皮下多點(diǎn)注射強(qiáng)化免疫該動(dòng)物。7至14天后，從該動(dòng)物采血并測(cè)定血清抗體滴度。將動(dòng)物加強(qiáng)免疫直至滴度達(dá)到平臺(tái)期。優(yōu)選地，用不同蛋白質(zhì)和/或經(jīng)不同交聯(lián)劑綴合的同一抗原綴合物強(qiáng)化免疫動(dòng)物。綴合物還可以作為蛋白融合物在重組細(xì)胞培養(yǎng)物中產(chǎn)生。此外，諸如明礬的聚集劑適用于增強(qiáng)免疫應(yīng)答。
(iii)單克隆抗體本發(fā)明提供具有變體Fc區(qū)的單克隆抗體?？梢远喾N方式產(chǎn)生單克隆抗體，包括使用雜交瘤方法(例如Kohler等，Nature，256495，1975所述，此處引用作為參考)或通過(guò)重組DNA方法(例如美國(guó)專利號(hào)4,816,567，此處引用作為參考)。
在雜交瘤方法中，免疫小鼠或其他適宜宿主動(dòng)物如倉(cāng)鼠或獼猴，以引發(fā)出產(chǎn)生或能夠產(chǎn)生可特異性結(jié)合免疫所用蛋白質(zhì)的抗體的淋巴細(xì)胞。備選地，可體外免疫淋巴細(xì)胞。隨后使用合適融合劑，如聚乙二醇將淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合形成雜交瘤細(xì)胞。然后將如此制備的雜交瘤細(xì)胞在合適培養(yǎng)基中接種和生長(zhǎng)，其中培養(yǎng)基優(yōu)選含有一種或多種抑制未融合的母體骨髓瘤細(xì)胞生長(zhǎng)或存活的物質(zhì)。例如，若母體骨髓瘤細(xì)胞缺乏次黃嘌呤鳥(niǎo)嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HGPRT或HPRT)，用于此雜交瘤的培養(yǎng)基一般將包括次黃嘌呤、氨基喋呤和胸苷(HAT培養(yǎng)基)，這些物質(zhì)阻止HGPRT缺陷型細(xì)胞的生長(zhǎng)。
優(yōu)選的骨髓瘤細(xì)胞是有效融合的、通過(guò)所選擇的抗體產(chǎn)生細(xì)胞穩(wěn)定高水平生產(chǎn)抗體的并且對(duì)培養(yǎng)基如HAT培養(yǎng)基敏感的骨髓瘤細(xì)胞。其中，優(yōu)選的骨髓瘤細(xì)胞系是鼠骨髓瘤系，如從Salk研究所細(xì)胞銷售中心(SalkInstitute Cell Distribution Center，San Diego，California，美國(guó))獲得的MOPC-21和MPC-11鼠腫瘤衍生的那些以及從美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(Rockville，Maryland，美國(guó))獲得的SP-2或X63-Ag8-653細(xì)胞。還已經(jīng)描述過(guò)用于生產(chǎn)人單克隆抗體的人骨髓瘤和小鼠-人異種骨髓瘤(heteromyeloma)(例如Kozbor，J.Immunol.，1333001(1984)，此處引用作為參考)。
為產(chǎn)生針對(duì)抗原的單克隆抗體，測(cè)定雜交瘤細(xì)胞正生長(zhǎng)于其中的培養(yǎng)基。優(yōu)選地，雜交瘤細(xì)胞所產(chǎn)生單克隆抗體的結(jié)合特異性可通過(guò)免疫沉淀或通過(guò)體外結(jié)合測(cè)定法，如放射免疫測(cè)定法(RIA)或酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)測(cè)定。在鑒定出可產(chǎn)生具有期望特異性、親和性和/或活性的抗體的雜交瘤細(xì)胞后，可將該克隆通過(guò)有限稀釋法進(jìn)行亞克隆并且通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法生長(zhǎng)。適用于此目的的培養(yǎng)基包括例如D-MEM或RPMI-1640培養(yǎng)基。此外，可將雜交瘤細(xì)胞作為動(dòng)物腹水腫瘤在體內(nèi)生長(zhǎng)。由亞克隆所分泌的單克隆抗體經(jīng)常規(guī)免疫球蛋白純化方法從培養(yǎng)基、腹水或血清中適當(dāng)?shù)胤蛛x，其中常規(guī)免疫球蛋白純化方法例如A蛋白-瓊脂糖法、羥基磷灰石層析法、凝膠電泳法、透析法或親和層析法。
使用常規(guī)方法(例如通過(guò)使用能夠特異性結(jié)合編碼單克隆抗體重鏈和輕鏈的基因的寡核苷酸探針)容易地分離編碼單克隆抗體的DNA和測(cè)序。雜交瘤細(xì)胞作為該DNA的優(yōu)選來(lái)源。一旦分離了DNA，可將該DNA置于表達(dá)載體內(nèi)，隨后將該載體轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，如大腸桿菌細(xì)胞、猿猴COS細(xì)胞、中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞或不產(chǎn)生免疫球蛋白的骨髓瘤細(xì)胞，在重組宿主細(xì)胞中合成單克隆抗體。如下更詳細(xì)地描述抗體的重組生產(chǎn)。
在一些實(shí)施方案中，從使用如McCafferty等，Nature，348552554(1990)所述技術(shù)生成的抗體噬菌體文庫(kù)中分離抗體或抗體片段。Clackson等，Nature，352624-628(1991)和Marks等，J.Mol.Biol.，222581-597(1991)分別描述了使用噬菌體文庫(kù)對(duì)鼠和人抗體的分離。隨后的出版物描述了通過(guò)鏈改組法(Marks等，BioTechnology，10779-783(1992))以及作為構(gòu)建極其巨大噬菌體文庫(kù)策略的組合性感染和體內(nèi)重組法(例如Waterhouse等，Nuc.Acids.Res.，212265-2266(1993))生產(chǎn)高親和性(nM級(jí))人抗體。因此，這類技術(shù)和類似技術(shù)有效替代了用于單克隆抗體分離的常規(guī)單克隆抗體雜交瘤技術(shù)。
同樣，可通過(guò)用人重鏈和輕鏈恒定區(qū)的編碼序列替代同源的鼠序列(例如美國(guó)專利號(hào)4,816,567和Morrison等，Proc.Nat.Acad.Sci USA，816851(1984)，均在此處引用作為參考)或通過(guò)將免疫球蛋白編碼序列與全部或部分非免疫球蛋白多肽編碼序列共價(jià)連接來(lái)修飾DNA。
一般地，此類非免疫球蛋白多肽替代抗體的恒定區(qū)或者替代抗體中一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)的可變結(jié)構(gòu)域，從而產(chǎn)生嵌合雙價(jià)抗體，該嵌合雙價(jià)抗體包含對(duì)一個(gè)抗原具有特異性的一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)和對(duì)不同的抗原具有特異性的另一抗原結(jié)合位點(diǎn)。
(iv)人源化抗體和人抗體本發(fā)明提供具有變體Fc區(qū)的人源化抗體和人抗體。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，人源化抗體包含人抗體氨基酸序列以及非人抗體的氨基酸殘基。在一些實(shí)施方案中，人源化抗體中的人序列包含骨架區(qū)(FR)并且非人抗體序列或殘基包含一個(gè)或多個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)。
值得注意的是，可基于重鏈和輕鏈可變區(qū)內(nèi)的氨基酸殘基編號(hào)定義FR和CDR。術(shù)語(yǔ)“互補(bǔ)決定區(qū)”或CDR旨在指在重鏈和輕鏈多肽可變區(qū)內(nèi)存在的非連續(xù)性抗原結(jié)合位點(diǎn)。這些區(qū)域已經(jīng)由Kabat等(J.Biol.Chem.2526609-6616(1977)和Kabat等，Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest(1991)；“Kabat”)、Chothia等(J.Mol.Biol.196901-917(1987)；“Chothia”)和MacCallum等(J.Mol.Biol.262732-745(1996)“MacCallum”)定義，其中該定義包括當(dāng)彼此比較時(shí)氨基酸殘基的重疊或亞型。然而，在提及抗體(包括人源化抗體)的CDR時(shí)，任何這些單獨(dú)定義(例如，Kabat定義)或組合定義(例如，Kabat和Chothia的組合性定義)的應(yīng)用均處于如此處所描述和使用的術(shù)語(yǔ)范圍內(nèi)。包含由以上引用每一文獻(xiàn)所定義CDR的氨基酸殘基列于下表6以便比較。
表6CDR定義

另外，術(shù)語(yǔ)“骨架”當(dāng)用來(lái)指抗體可變區(qū)時(shí)旨在指抗體可變區(qū)中CDR區(qū)域以外的所有氨基酸殘基。因此，可變區(qū)骨架長(zhǎng)度在大約100-120個(gè)氨基酸之間，但其僅旨在指CDR區(qū)域以外的那些氨基酸。術(shù)語(yǔ)“骨架區(qū)”旨在指由CDR所分隔的骨架的每一結(jié)構(gòu)域。因此，如Kabat所定義，對(duì)于重鏈可變區(qū)和CDR的特定實(shí)例而言，骨架區(qū)1(FRI)對(duì)應(yīng)于包含第1-30位氨基酸的可變區(qū)結(jié)構(gòu)域；骨架區(qū)2(FR2)對(duì)應(yīng)于包含第36-49位氨基酸的可變區(qū)結(jié)構(gòu)域；骨架區(qū)3(FR3)對(duì)應(yīng)于包含第66-94位氨基酸的可變區(qū)結(jié)構(gòu)域；骨架區(qū)4(FR4)對(duì)應(yīng)于從第103位氨基酸至可變區(qū)末尾的可變區(qū)結(jié)構(gòu)域。類似地，輕鏈骨架區(qū)由每一輕鏈可變區(qū)CDR分隔。類似地，使用Chothia或MacCallum的CDR定義或CDR定義的任何組合，骨架的邊界由如上所述的各個(gè)CDR末端分隔。盡管存在多種CDR的定義，但是在一些實(shí)施方案中，優(yōu)選使用Kabat定義對(duì)CDR進(jìn)行定義。
人源化抗體中非人抗體殘基可以是從另一物種(包括但不限于小鼠)中輸入或衍生的殘基或序列，或者這些序列是插入到人源化抗體序列中的隨機(jī)氨基酸序列(例如從隨機(jī)化核酸序列產(chǎn)生)。如上所述，人源化抗體中的人氨基酸序列優(yōu)選地是骨架區(qū)，而非人抗體殘基(不管是來(lái)自另一個(gè)物種還是隨機(jī)氨基酸序列)優(yōu)選地對(duì)應(yīng)于CDR。然而，在一些實(shí)施方案中，一個(gè)或多個(gè)骨架區(qū)可含有一個(gè)或多個(gè)非人類的氨基酸殘基。以對(duì)人類骨架進(jìn)行改變或修飾(例如通過(guò)導(dǎo)入非人的殘基)為例，改變的或修飾的骨架區(qū)可以與來(lái)自另一個(gè)物種的修飾的CDR或隨機(jī)CDR序列毗鄰，而在其他實(shí)施方案中，改變的骨架區(qū)與來(lái)自另一個(gè)物種的改變的CDR或隨機(jī)CDR序列不毗鄰。在一些實(shí)施方案中，人源化抗體的骨架序列完全是人的骨架序列(即對(duì)人的骨架未作任何改變)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，人源化抗體的骨架序列完全是人類種系的骨架序列(即對(duì)人類種系骨架未作任何的改變)。
將來(lái)自另一物種或隨機(jī)序列的非人類的氨基酸殘基常稱作“輸入”殘基，該殘基一般從“輸入”可變結(jié)構(gòu)域中獲得?？砂凑誛inter及其合作者(例如Jones等，Nature，321522-525(1986)；Riechmann等，Nature，332323-327(1988)；Verhoeyen等，Science，2391534-1536(1988)，所有文獻(xiàn)在此處引用作為參考)的方法通過(guò)用嚙齒類(或其他哺乳動(dòng)物)CDR或CDR序列替代人抗體的相應(yīng)序列基本實(shí)現(xiàn)人源化。此外，還可生成這樣的抗體，其中在該抗體中大大小于完整人可變結(jié)構(gòu)域的可變結(jié)構(gòu)域由來(lái)自非人物種的對(duì)應(yīng)序列替代(例如4,816,567，此處引用作為參考)。實(shí)際上，人源化抗體一般是這樣的人抗體，即其中一些CDR殘基和可能的一些FR殘基由嚙齒類抗體中相似位點(diǎn)的殘基替代，或者如上所述，其CDR序列由隨機(jī)序列替代。例如，向抗體的受者可變區(qū)骨架提供供者CDR結(jié)合親和性的方法描述于WO 01/27160 A1(此處引用作為參考)以及美國(guó)專利申請(qǐng)09/434,870和09/982,464(此處全部引用作為參考)。
在產(chǎn)生人源化抗體中，對(duì)人輕鏈和重鏈可變結(jié)構(gòu)域的選擇重要的是降低抗原性。根據(jù)所謂“最佳擬合”方法，針對(duì)已知人可變結(jié)構(gòu)域的完整文庫(kù)篩選待人源化的嚙齒類抗體的可變結(jié)構(gòu)域序列。將最接近嚙齒類的人序列用作人源化抗體的人骨架區(qū)(FR)(例如Sims等，J.Immunol.，1512296(1993)和Chothia等，J.Mol.Biol.，196901(1987)，兩篇文獻(xiàn)此處引用作為參考)。另一種方法是使用從特定亞類輕鏈和重鏈中的全部人抗體一致序列衍生的特定骨架。同一骨架可用于幾個(gè)不同的人源化抗體(例如Carter等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，894285(1992)；Presta等，J.Immunol.，1512623(1993)，兩篇文獻(xiàn)此處引用作為參考)。
在其他實(shí)施方案中，無(wú)需“預(yù)選”特定的人抗體骨架(即無(wú)需選擇與待人源化的特定候選抗體在同源性或序列同一性上最接近的人骨架)。在這些實(shí)施方案，常見(jiàn)或通用的人骨架可用于接受一個(gè)或多個(gè)非人的CDR。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，將一個(gè)通用的完全人骨架用作所有待人源化抗體的骨架，而不考慮該骨架與候選抗體骨架序列的同源性。就此而言，可生成骨架區(qū)內(nèi)沒(méi)有任何變化的人源化抗體。這種通用的完全人骨架隨后可接受一個(gè)或多個(gè)CDR序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，一個(gè)或多個(gè)CDR序列是來(lái)自另一物種(例如小鼠或大鼠)抗體的CDR序列，其中與來(lái)自另一物種的完整抗體中相應(yīng)CDR序列相比，CDR序列已經(jīng)被修飾(即將導(dǎo)入通用的人骨架的CDR同時(shí)進(jìn)行導(dǎo)入和修飾)。修飾對(duì)應(yīng)著與來(lái)自另一物種完整抗體中的相應(yīng)CDR相比一處或多處氨基酸的變化(在修飾的CDR內(nèi))。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述CDR內(nèi)的全部氨基酸殘基被納入文庫(kù)，而在其他實(shí)施方案中，并非所有CDR中的氨基酸殘基均納入文庫(kù)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，一個(gè)或多個(gè)CDR序列是替代CDR序列的隨機(jī)序列。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，抗體人源化后保留了對(duì)抗原的高親和性和其他有利的生物學(xué)特性。在一些實(shí)施方案中，人源化抗體對(duì)抗原的親和性高于相應(yīng)非人源化抗體、完整抗體或其片段或部分(例如候選的嚙齒類抗體)的親和性。就此而言，在一些實(shí)施方案中，通過(guò)使用母體序列和人源化序列的三維模型分析對(duì)母體序列和多種概念性人源化產(chǎn)物進(jìn)行分析的方法產(chǎn)生人源化抗體。免疫球蛋白三維模型通常是本領(lǐng)域技術(shù)人員可以獲得的且熟悉的。圖解并顯示所選擇的候選免疫球蛋白序列的三維構(gòu)象結(jié)構(gòu)的計(jì)算機(jī)程序是可得的。檢查這些顯示的結(jié)構(gòu)可分析殘基在候選免疫球蛋白序列功能中的可能作用，即分析影響候選免疫球蛋白結(jié)合其抗原能力的殘基。以如此方式，可選擇出FR殘基并將來(lái)自受者的FR殘基和輸入序列組合獲得預(yù)期的抗體特征，如提高的對(duì)靶抗原的親和性。通常，CDR殘基直接并且最大限度地影響抗原結(jié)合。
本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的多種具體方法可用于向抗體骨架中導(dǎo)入抗體CDR(或替代抗體CDR的隨機(jī)序列)(見(jiàn)例如，US專利申請(qǐng)09/434,879和09/982,464)。在一些實(shí)施方案中，相互重疊的寡聚物用于合成抗體基因或其部分(例如，編碼人源化抗體的基因)。在其他實(shí)施方案中，可使用Kunkel方法(見(jiàn)下)實(shí)施對(duì)抗體模板的誘變，以導(dǎo)入修飾的CDR和隨機(jī)序列以替代CDR。在一些實(shí)施方案中，輕鏈和重鏈可變區(qū)分別經(jīng)過(guò)人源化，然后作為人源化的可變區(qū)共表達(dá)。在其他實(shí)施方案中，人源化的可變區(qū)組成了完整抗體可變區(qū)。在一些實(shí)施方案中，包含人源化可變區(qū)的完整抗體的Fc區(qū)已經(jīng)被修飾(例如在該Fc區(qū)中已經(jīng)進(jìn)行了至少一處氨基酸修飾)。例如，已經(jīng)用隨機(jī)化CDR進(jìn)行人源化并且骨架未變動(dòng)的抗體可在Fc區(qū)中包含至少一處氨基酸修飾。
在其他實(shí)施方案中，使用了在缺乏內(nèi)源免疫球蛋白產(chǎn)生的情況下當(dāng)免疫時(shí)能夠產(chǎn)生全套人抗體的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(例如小鼠)。例如，已經(jīng)描述，在嵌合突變小鼠和種系突變小鼠中抗體重鏈連接區(qū)(JH)基因的純含性缺失導(dǎo)致內(nèi)源性抗體產(chǎn)生的完全抑制。將人類種系的免疫球蛋白基因列陣轉(zhuǎn)移至該種系突變小鼠中將導(dǎo)致在抗原刺激后產(chǎn)生人抗體(見(jiàn)例如Jakobovits等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，902551(1993)以及Jakobovits等，Nature，362255-258(1993)，兩篇文獻(xiàn)此處引用作為參考)。還可以從噬菌體展示文庫(kù)中衍生人抗體(例如Hoogenboom等，J.Mol.Biol.，227381(1991)以及Vaughan等Nature Biotech 14309(1996)，兩篇文獻(xiàn)此處引用作為參考)。
本發(fā)明提供產(chǎn)生(與具有Fc區(qū)的母體多肽相比)在Fc區(qū)內(nèi)包含至少一處氨基酸修飾的人源化抗體(和抗體片段)的方法。以下討論用于產(chǎn)生此類人源化抗體的另外方法。本發(fā)明還提供包含由這些方法產(chǎn)生的抗體和抗體片段的組合物。重要的是，以下討論的人源化方法和其他人源化方法(例如以上討論)可組合地用于本發(fā)明的Fc變體。就此而言，根據(jù)本發(fā)明可構(gòu)建具有改變的、獨(dú)特Fc區(qū)的人源化抗體。
在一些實(shí)施方案中，提供了構(gòu)建一群編碼改變的重鏈可變區(qū)的核酸的方法，其包括A)提供第一個(gè)和第二個(gè)參考氨基酸序列的表現(xiàn)形式，其中第一個(gè)參考序列包含供者重鏈可變區(qū)序列，該供者可變區(qū)包括i)骨架區(qū)和ii)三個(gè)如Kabat和Chothia的組合性定義所定義的互補(bǔ)決定區(qū)；第二個(gè)參考序列包含含有骨架區(qū)的受者重鏈可變區(qū)序列；B)合成a)第一個(gè)寡核苷酸，其編碼受者重鏈可變區(qū)中骨架區(qū)的部分，其中當(dāng)與第二個(gè)參考序列比較時(shí)，骨架區(qū)的部分未被修飾；以及b)第二個(gè)寡核苷酸群體，其中每個(gè)寡核苷酸編碼i)已被修飾的第一個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)的至少一部分，其中第一個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)選自HCDR1、HCDR2和HCDR3，其中與第一個(gè)參考序列中相應(yīng)的供者互補(bǔ)決定區(qū)相比，已經(jīng)修飾的第一個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)在一個(gè)或多個(gè)位置處包含不同的氨基酸，和ii)未修飾骨架區(qū)的一部分或多個(gè)部分，其能夠與第一個(gè)寡核苷酸雜交；C)將第二個(gè)寡核苷酸群體與第一個(gè)寡核苷酸混合以產(chǎn)生重疊性寡核苷酸；和D)在使得可構(gòu)建一群編碼改變的重鏈可變區(qū)的核酸的條件下處理重疊性寡核苷酸，其中由改變的重鏈可變區(qū)編碼核酸編碼的骨架區(qū)相對(duì)于第二個(gè)參考序列而言是未修飾的。
在一些實(shí)施方案中，第一個(gè)和第二個(gè)參考序列的表現(xiàn)形式為電子形式。在一些實(shí)施方案中，方法還包括步驟(E)共表達(dá)一群改變的重鏈可變區(qū)編碼核酸和輕鏈可變區(qū)編碼核酸，以產(chǎn)生改變的異聚性可變區(qū)的不同群體。在一些實(shí)施方案中，合成包括化學(xué)性合成。在一些實(shí)施方案中，受者是人。在一些實(shí)施方案中，處理步驟D)包括通過(guò)聚合酶進(jìn)行的延伸。
在其他實(shí)施方案中，提供了構(gòu)建一群編碼改變的輕鏈可變區(qū)的核酸的方法，其包括A)提供第一個(gè)和第二個(gè)參考氨基酸序列的表現(xiàn)形式，其中第一個(gè)參考序列包含供者輕鏈可變區(qū)序列，該供者可變區(qū)包括i)骨架區(qū)和ii)三個(gè)如Kabat和Chothia的組合性定義所定義的互補(bǔ)決定區(qū)；第二個(gè)參考序列包含含有骨架區(qū)的受者輕鏈可變區(qū)序列；B)合成a)第一個(gè)寡核苷酸，其編碼受者輕鏈可變區(qū)中骨架區(qū)的一部分，其中與第二個(gè)參考序列相比，骨架區(qū)的一部分未被修飾；以及b)第二個(gè)寡核苷酸群體，其中每個(gè)寡核苷酸編碼i)已修飾的第一個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)的至少一部分，其中第一個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)選自LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中與第一個(gè)參考序列中相應(yīng)的供者互補(bǔ)決定區(qū)相比已修飾的第一個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)在一個(gè)或多個(gè)位置處包含不同的氨基酸，和ii)未修飾骨架區(qū)的一部分或多個(gè)部分，其能夠與第一個(gè)寡核苷酸雜交；C)將第一個(gè)寡核苷酸與第二個(gè)寡核苷酸群體混合以產(chǎn)生重疊性寡核苷酸；和D)在可構(gòu)建已改變的輕鏈可變區(qū)編碼核酸群體的條件下處理重疊性寡核苷酸，其中由改變的輕鏈可變區(qū)編碼核酸編碼的骨架區(qū)相對(duì)于第二個(gè)參考序列而言是未修飾的。
在一些實(shí)施方案中，第一個(gè)和第二個(gè)參考序列的表現(xiàn)形式為電子形式。在一些實(shí)施方案中，方法還包括步驟(E)共表達(dá)一群已改變的輕鏈可變區(qū)編碼核酸和重鏈可變區(qū)編碼核酸，以產(chǎn)生經(jīng)改變的異聚性可變區(qū)的不同群體。在一些實(shí)施方案中，合成包括化學(xué)性合成。在一些實(shí)施方案中，受者是人。在一些實(shí)施方案中，處理步驟D)包括通過(guò)聚合酶進(jìn)行的延伸。
在一些實(shí)施方案中，考慮了構(gòu)建已改變的重鏈可變區(qū)編碼核酸群的方法，其包括A)提供第一個(gè)和第二個(gè)參考氨基酸序列的表現(xiàn)形式，其中第一個(gè)參考序列包含供者重鏈可變區(qū)序列，該供者可變區(qū)包括i)骨架區(qū)和ii)三個(gè)如Kabat和Chothia的組合性定義所定義的互補(bǔ)決定區(qū)；第二個(gè)參考序列包含含有骨架區(qū)的受者重鏈可變區(qū)序列；B)合成a)第一個(gè)寡核苷酸群，其中每個(gè)寡核苷酸編碼選自HCDR1、HCDR2和HCDR3的第一個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)的至少一部分，其中與第一個(gè)參考序列中相應(yīng)的供者互補(bǔ)決定區(qū)相比，已修飾的第一個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)在一個(gè)或多個(gè)位置處包含不同的氨基酸；b)第二個(gè)寡核苷酸，其編碼i)受者重鏈可變區(qū)中骨架區(qū)的一部分，其中與第二個(gè)參考序列相比，骨架區(qū)的一部分未被修飾，和ii)互補(bǔ)決定區(qū)的一部分或多個(gè)部分，其能夠與第一個(gè)寡核苷酸群體雜交；C)將第一個(gè)寡核苷酸群與第二個(gè)寡核苷酸混合以產(chǎn)生重疊性寡核苷酸；和D)在可構(gòu)建已改變的重鏈可變區(qū)編碼核酸群的條件下處理重疊性寡核苷酸，其中所述由已改變的重鏈可變區(qū)編碼核酸編碼的骨架區(qū)與第二個(gè)參考序列相比未被修飾。
在一些實(shí)施方案中，第一個(gè)和第二個(gè)參考序列的表現(xiàn)形式為電子形式。在一些實(shí)施方案中，方法還包括步驟(E)共表達(dá)已改變的重鏈可變區(qū)編碼核酸群和輕鏈可變區(qū)編碼核酸，以產(chǎn)生經(jīng)改變的異聚性可變區(qū)的不同群體。在一些實(shí)施方案中，合成包括化學(xué)性合成。在一些實(shí)施方案中，受者是人。在一些實(shí)施方案中，處理步驟D)包括通過(guò)聚合酶進(jìn)行的延伸。
在其他實(shí)施方案中，考慮了構(gòu)建已改變的輕鏈可變區(qū)編碼核酸群的方法，其包括A)提供第一個(gè)和第二個(gè)參考氨基酸序列的表現(xiàn)形式，其中第一個(gè)參考序列包含供者輕鏈可變區(qū)序列，該供者可變區(qū)包括i)骨架區(qū)和ii)三個(gè)如Kabat和Chothia的組合性定義所定義的互補(bǔ)決定區(qū)；第二個(gè)參考序列包含含有骨架區(qū)的受者輕鏈可變區(qū)序列；B)合成a)第一個(gè)寡核苷酸群，其中每個(gè)寡核苷酸編碼選自LCDR1、LCDR2和LCDR3的第一個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)的至少一部分，其中與第一個(gè)參考序列中相應(yīng)的供者互補(bǔ)決定區(qū)相比，已修飾的第一個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)在一個(gè)或多個(gè)位置處包含不同的氨基酸；b)第二個(gè)寡核苷酸，其編碼i)受者輕鏈可變區(qū)中骨架區(qū)的一部分，其中與第二個(gè)參考序列相比，骨架區(qū)的一部分未被修飾，和ii)互補(bǔ)決定區(qū)的一部分或多個(gè)部分，其能夠與第一個(gè)寡核苷酸群體雜交；C)將第一個(gè)寡核苷酸群與第二個(gè)寡核苷酸混合以產(chǎn)生重疊性寡核苷酸；和D)在可構(gòu)建已改變的輕鏈可變區(qū)編碼核酸群的條件下處理重疊性寡核苷酸，其中由改變的輕鏈可變區(qū)編碼核酸編碼的骨架區(qū)相對(duì)于第二個(gè)參考序列而言是未修飾的。
在一些實(shí)施方案中，第一個(gè)和第二個(gè)參考序列的表現(xiàn)形式為電子形式。在一些實(shí)施方案中，方法還包括步驟(E)共表達(dá)一群已改變的輕鏈可變區(qū)編碼核酸和重鏈可變區(qū)編碼核酸，以產(chǎn)生經(jīng)改變的異聚性可變區(qū)的多樣群體。在一些實(shí)施方案中，合成包括化學(xué)性合成。在一些實(shí)施方案中，受者是人。在一些實(shí)施方案中，處理步驟D)包括通過(guò)聚合酶進(jìn)行的延伸。
在其他實(shí)施方案中，考慮了構(gòu)建已改變的重鏈可變區(qū)編碼核酸群的方法，其包括a)提供第一個(gè)和第二個(gè)參考氨基酸序列的表現(xiàn)形式，其中第一個(gè)參考序列包含供者重鏈可變區(qū)序列，該供者可變區(qū)包括i)骨架區(qū)和ii)三個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)；第二個(gè)參考序列包含一個(gè)重鏈可變區(qū)序列；b)合成已改變重鏈可變區(qū)抗體基因序列群，其中已改變重鏈可變區(qū)的骨架區(qū)與第二個(gè)參考序列的骨架區(qū)完全一致，并且已改變重鏈可變區(qū)中的至少第一個(gè)CDR已被修飾，其中與第一個(gè)參考序列中相應(yīng)的供者CDR相比，經(jīng)修飾的第一個(gè)CDR在一個(gè)或多個(gè)位置處包含不同的氨基酸。
在一些實(shí)施方案中，第一個(gè)和第二個(gè)參考序列的表現(xiàn)形式為電子形式。在一些實(shí)施方案中，方法還包括步驟(E)共表達(dá)一群已改變的重鏈可變區(qū)編碼核酸和輕鏈可變區(qū)編碼核酸，以產(chǎn)生經(jīng)改變的異聚性可變區(qū)的多樣群體。在一些實(shí)施方案中，受者是人。在一些實(shí)施方案中，合成涉及互相重疊的寡核苷酸的使用。在一些實(shí)施方案中，CDR由Kabat定義描述。
在其他實(shí)施方案中，考慮了構(gòu)建已改變的輕鏈可變區(qū)編碼核酸群的方法，其包括A)提供第一個(gè)和第二個(gè)參考氨基酸序列的表現(xiàn)形式，其中第一個(gè)參考序列包含供者輕鏈可變區(qū)序列，該供者可變區(qū)包括i)骨架區(qū)和ii)三個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)；第二個(gè)參考序列包含一個(gè)含有骨架區(qū)的受者輕鏈可變區(qū)序列；b)合成已改變輕鏈可變區(qū)抗體的基因序列群，其中已改變輕鏈可變區(qū)的骨架區(qū)與第二個(gè)參考序列的骨架區(qū)完全一致，并且已改變的抗體輕鏈可變區(qū)中至少第一個(gè)CDR已被修飾，其中與第一個(gè)參考序列中相應(yīng)的供者CDR相比，經(jīng)修飾的第一個(gè)CDR在一個(gè)或多個(gè)位置處包含不同的氨基酸。
在一些實(shí)施方案中，第一個(gè)和第二個(gè)參考序列的表現(xiàn)形式為電子形式。在一些實(shí)施方案中，方法還包括步驟(E)共表達(dá)一群已改變的輕鏈可變區(qū)編碼核酸和重鏈可變區(qū)編碼核酸，以產(chǎn)生經(jīng)改變的異聚性可變區(qū)的多樣群體。在一些實(shí)施方案中，受者是人。在一些實(shí)施方案中，合成涉及互相重疊的寡核苷酸的使用。
還在其他實(shí)施方案中，考慮了構(gòu)建已改變的重鏈可變區(qū)編碼核酸群的方法，其包括a)提供參考氨基酸序列的表現(xiàn)形式，該參考序列包含含有骨架區(qū)的受者重鏈可變區(qū)序列；b)合成已改變重鏈可變區(qū)抗體基因序列群，其中已改變重鏈可變區(qū)的骨架區(qū)與參考序列骨架區(qū)完全一致，并且已改變抗體重鏈可變區(qū)中至少第一個(gè)CDR包含隨機(jī)氨基酸序列。
在一些實(shí)施方案中，參考序列的表現(xiàn)形式為電子形式。在一些實(shí)施方案中，方法還包括步驟(E)共表達(dá)已改變的重鏈可變區(qū)編碼核酸群和輕鏈可變區(qū)編碼核酸，以產(chǎn)生經(jīng)改變的異聚性可變區(qū)的多樣群體。在一些實(shí)施方案中，受者是人。在一些實(shí)施方案中，合成涉及互相重疊的寡核苷酸的使用。在一些實(shí)施方案中，CDR由Kabat定義描述。
在其他實(shí)施方案中，考慮了構(gòu)建已改變的輕鏈可變區(qū)編碼核酸群的方法，其包括a)提供參考氨基酸序列的表現(xiàn)形式，其中參考序列包含含有骨架區(qū)的受者輕鏈可變區(qū)序列；b)合成已改變輕鏈可變區(qū)抗體基因序列群，其中已改變輕鏈可變區(qū)的骨架區(qū)與參考序列骨架區(qū)完全一致，并且已改變抗體輕鏈可變區(qū)中至少第一個(gè)CDR包含隨機(jī)氨基酸序列。
在一些實(shí)施方案中，參考序列的表現(xiàn)形式為電子形式。在一些實(shí)施方案中，方法還包括步驟(E)共表達(dá)已改變的輕鏈可變區(qū)編碼核酸群和重鏈可變區(qū)編碼核酸，以產(chǎn)生經(jīng)改變的異聚性可變區(qū)的多樣群體。在一些實(shí)施方案中，受者是人。在一些實(shí)施方案中，合成涉及互相輕疊的寡核苷酸的使用。在一些實(shí)施方案中，CDR由Kabat定義描述。
還在其他實(shí)施方案中，考慮了構(gòu)建已改變的重鏈可變區(qū)編碼核酸群的方法，其包括a)提供參考氨基酸序列的表現(xiàn)形式，其中參考序列包含含有骨架區(qū)的人類受者重鏈可變區(qū)序列；b)合成已改變重鏈可變區(qū)抗體基因序列群，其中已改變重鏈可變區(qū)的骨架區(qū)與人類參考序列骨架區(qū)完全一致，并且已改變抗體重鏈可變區(qū)中至少第一個(gè)CDR包含隨機(jī)氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，人類參考序列的表現(xiàn)形式為電子形式。在一些實(shí)施方案中，方法還包括步驟(E)共表達(dá)已改變的重鏈可變區(qū)編碼核酸群和輕鏈可變區(qū)編碼核酸，以產(chǎn)生經(jīng)改變的異聚性可變區(qū)的多樣群體。在一些實(shí)施方案中，合成涉及互相重疊的寡核苷酸的使用。在一些實(shí)施方案中，CDR由Kabat定義描述。
在其他實(shí)施方案中，考慮了構(gòu)建已改變的輕鏈可變區(qū)編碼核酸群的方法，其包括a)提供參考氨基酸序列的表現(xiàn)形式，其中參考序列包含含有骨架區(qū)的人類受者輕鏈可變區(qū)序列；b)合成已改變輕鏈可變區(qū)抗體基因序列群，其中已改變輕鏈可變區(qū)的骨架區(qū)與人類參考序列骨架區(qū)完全一致，并且已改變抗體輕鏈可變區(qū)中至少第一個(gè)CDR包含隨機(jī)氨基酸序列。
在一些實(shí)施方案中，所述人類參考序列的表現(xiàn)形式為電子形式。在一些實(shí)施方案中，方法還包括步驟(E)共表達(dá)已改變的輕鏈可變區(qū)編碼核酸群和重鏈可變區(qū)編碼核酸，以產(chǎn)生經(jīng)改變的異聚性可變區(qū)的多樣群體。在一些實(shí)施方案中，合成涉及互相重疊的寡核苷酸的使用。在一些實(shí)施方案中，CDR由Kabat定義描述。
在一些實(shí)施方案中，在修飾一個(gè)或多個(gè)骨架區(qū)的同時(shí)導(dǎo)入一個(gè)或多個(gè)已修飾的CDR。在其他實(shí)施方案中，已修飾骨架與已修飾的CDR毗鄰。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供構(gòu)建已改變的重鏈可變區(qū)編碼核酸群的方法，包括a)提供第一個(gè)和第二個(gè)參考氨基酸序列的表現(xiàn)形式，其中第一個(gè)參考氨基酸序列包含供者重鏈可變區(qū)序列，該供者可變區(qū)包括i)骨架區(qū)和ii)三個(gè)如Kabat和Chothia的組合性定義所定義的互補(bǔ)決定區(qū)；第二個(gè)參考氨基酸序列包含含有骨架區(qū)的受者重鏈可變區(qū)序列；b)合成a)第一個(gè)寡核苷酸群，其包含編碼已修飾的重鏈可變區(qū)的骨架區(qū)或其部分的寡核苷酸，其中與受者骨架區(qū)參考序列相比，重鏈可變區(qū)的骨架區(qū)或其部分在一個(gè)或多個(gè)位置處含有多個(gè)已改變的氨基酸，其中被改變的骨架位置選自第二個(gè)參考序列中與第一個(gè)參考序列的供者骨架位置相比在相應(yīng)位置不同的受者骨架位置；以及b)第二個(gè)寡核苷酸群，每個(gè)寡核苷酸編碼i)至少一個(gè)已修飾的互補(bǔ)決定區(qū)或其部分，其中與相應(yīng)的供者互補(bǔ)決定區(qū)氨基酸參考序列相比，已修飾的互補(bǔ)決定區(qū)或其部分在一個(gè)或多個(gè)位置處包含不同的氨基酸，以及ii)相鄰骨架區(qū)的一個(gè)或多個(gè)部分，其能夠與第一個(gè)寡核苷酸群雜交；c)將所述第一個(gè)和第二個(gè)寡核苷酸群混合，以產(chǎn)生重疊性寡核苷酸；和d)在可構(gòu)建已改變的重鏈可變區(qū)編碼核酸群的條件下處理重疊性寡核苷酸。在某些實(shí)施方案中，第一個(gè)和第二個(gè)參考序列的表現(xiàn)形式為電子形式。在其他實(shí)施方案中，方法還包括步驟(e)共表達(dá)已改變的重鏈可變區(qū)編碼核酸群和輕鏈可變區(qū)編碼核酸，以產(chǎn)生經(jīng)改變的異聚性可變區(qū)的多樣群體。在另外的實(shí)施方案中，合成包括化學(xué)性合成。在一些實(shí)施方案中，受者是人。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，一個(gè)或多個(gè)已改變的異聚性可變區(qū)的多樣群體是包含F(xiàn)c區(qū)的抗體的一部分，其中與具有Fc區(qū)的母體多肽相比，所述Fc區(qū)包含至少一處氨基酸修飾。
在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明提供構(gòu)建一群編碼改變的輕鏈可變區(qū)的核酸的方法，包括a)提供第一個(gè)和第二個(gè)參考氨基酸序列的表現(xiàn)形式，其中第一個(gè)參考氨基酸序列包含供者輕鏈可變區(qū)序列，該供者可變區(qū)包括i)骨架區(qū)和ii)三個(gè)如Kabat和Chothia的組合性定義所定義的互補(bǔ)決定區(qū)；第二個(gè)參考氨基酸序列包含含有骨架區(qū)的受者輕鏈可變區(qū)序列；b)合成a)第一個(gè)寡核苷酸群，其包含編碼已修飾的輕鏈可變區(qū)的骨架區(qū)或其部分的寡核苷酸，其中與受者骨架區(qū)參考序列相比，輕鏈可變區(qū)的骨架區(qū)或其部分在一個(gè)或多個(gè)位置處含有多個(gè)已改變的氨基酸，其中被改變的骨架位置選自第二個(gè)參考序列中與第一個(gè)參考序列的供者骨架位置相比在對(duì)應(yīng)位置上不同的受者骨架位置；以及b)第二個(gè)寡核苷酸群，每個(gè)寡核苷酸編碼i)至少一個(gè)已修飾的互補(bǔ)決定區(qū)或其部分，其中與相應(yīng)的供者互補(bǔ)決定區(qū)氨基酸參考序列相比，已修飾的互補(bǔ)決定區(qū)或其部分在一個(gè)或多個(gè)位置處包含不同的氨基酸，以及ii)相鄰骨架區(qū)的一個(gè)或多個(gè)部分，其能夠與第一個(gè)寡核苷酸群雜交；c)將第一個(gè)和第二個(gè)寡核苷酸群混合，以產(chǎn)生重疊性寡核苷酸；和d)在可構(gòu)建已改變的輕鏈可變區(qū)編碼核酸群的條件下處理重疊性寡核苷酸。在其他實(shí)施方案中，第一個(gè)和第二個(gè)參考序列的表現(xiàn)形式為電子形式。在另外的實(shí)施方案中，方法還包括步驟(e)共表達(dá)一群編碼已改變的輕鏈可變區(qū)的核酸和重鏈可變區(qū)編碼核酸，以產(chǎn)生經(jīng)改變的異聚性可變區(qū)的多樣群體。
在一些實(shí)施方案中，方法包括a)提供第一個(gè)和第二個(gè)參考氨基酸序列的表現(xiàn)形式，其中第一個(gè)參考氨基酸序列包含供者重鏈可變區(qū)序列，該供者可變區(qū)包括i)骨架區(qū)和ii)三個(gè)如Kabat和Chothia的組合性定義所定義的互補(bǔ)決定區(qū)；第二個(gè)參考氨基酸序列包含含有骨架區(qū)的受者重鏈可變區(qū)序列；b)合成a)第一個(gè)寡核苷酸群，其包含編碼已修飾的重鏈可變區(qū)的骨架區(qū)或其部分的寡核苷酸，其中與受者骨架區(qū)參考序列相比，重鏈可變區(qū)的骨架區(qū)或其部分在一個(gè)或多個(gè)位置處含有多個(gè)已改變的氨基酸，其中被改變的骨架位置選自第二個(gè)參考序列中與第一個(gè)參考序列的供者骨架位置相比在相應(yīng)位置上不同的受者骨架位置，以及b)第二個(gè)寡核苷酸群，每個(gè)寡核苷酸編碼i)至少一個(gè)已修飾的互補(bǔ)決定區(qū)或其部分，其中與相應(yīng)的供者互補(bǔ)決定區(qū)氨基酸參考序列相比，已修飾的互補(bǔ)決定區(qū)或其部分在一個(gè)或多個(gè)位置處包含不同的氨基酸，以及ii)相鄰骨架區(qū)的一個(gè)或多個(gè)部分，其能夠與第一個(gè)寡核苷酸群雜交；c)將第一個(gè)和第二個(gè)寡核苷酸群混合，以產(chǎn)生重疊性寡核苷酸；和d)在可構(gòu)建已改變的重鏈可變區(qū)編碼核酸群的條件下，用DNA聚合酶延伸重疊性寡核苷酸。
仍在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供構(gòu)建一群編碼改變的輕鏈可變區(qū)的核酸的方法，包括a)提供第一個(gè)和第二個(gè)參考氨基酸序列的表現(xiàn)形式，其中第一個(gè)參考氨基酸序列包含供者輕鏈可變區(qū)序列，該供者可變區(qū)包括i)骨架區(qū)和ii)三個(gè)如Kabat和Chothia的組合性定義所定義的互補(bǔ)決定區(qū)；第二個(gè)參考氨基酸序列包含含有骨架區(qū)的受者輕鏈可變區(qū)序列；b)合成a)第一個(gè)寡核苷酸群，其包含編碼已修飾的輕鏈可變區(qū)的骨架區(qū)或其部分的寡核苷酸，其中與受者骨架區(qū)參考序列相比，輕鏈可變區(qū)的骨架區(qū)或其部分在一個(gè)或多個(gè)位置處含有多個(gè)已改變的氨基酸，其中被改變的骨架位置選自第二個(gè)參考序列中與第一個(gè)參考序列的供者骨架位置相比在相應(yīng)位置上不同的受者骨架位置；以及b)第二個(gè)寡核苷酸群，每個(gè)寡核苷酸編碼i)至少一個(gè)已修飾的互補(bǔ)決定區(qū)或其部分，其中與相應(yīng)的供者互補(bǔ)決定區(qū)氨基酸參考序列相比，已修飾的互補(bǔ)決定區(qū)或其部分在一個(gè)或多個(gè)位置處包含不同的氨基酸，以及ii)相鄰骨架區(qū)的一個(gè)或多個(gè)部分，其能夠與第一個(gè)寡核苷酸群雜交；c)將第一個(gè)和第二個(gè)寡核苷酸群混合，以產(chǎn)生重疊性寡核苷酸；和d)在可構(gòu)建已改變的輕鏈可變區(qū)編碼核酸群的條件下用DNA聚合酶延伸重疊性寡核苷酸。
在一些實(shí)施方案中，在向骨架區(qū)引入一個(gè)或多個(gè)修飾的同時(shí)導(dǎo)入一個(gè)或多個(gè)已修飾的CDR。與參考序列的相應(yīng)CDR相比，修改的CDR可包含一處或多處氨基酸改變。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供構(gòu)建已改變的重鏈可變區(qū)編碼核酸群的方法，包括a)提供第一個(gè)和第二個(gè)參考氨基酸序列的表現(xiàn)形式，其中第一個(gè)參考氨基酸序列包含供者重鏈可變區(qū)序列，該供者可變區(qū)包括i)骨架區(qū)和ii)三個(gè)如Kabat和Chothia的組合性定義所定義的互補(bǔ)決定區(qū)；第二個(gè)參考氨基酸序列包含含有骨架區(qū)的受者重鏈可變區(qū)序列；b)合成i)第一個(gè)寡核苷酸群，每個(gè)寡核苷酸編碼至少一個(gè)已修飾的互補(bǔ)決定區(qū)，其中與相應(yīng)的供者互補(bǔ)決定區(qū)氨基酸參考序列相比，已修飾的互補(bǔ)決定區(qū)在一個(gè)或多個(gè)位置處含有不同的氨基酸，以及ii)第二個(gè)寡核苷酸群，其包含編碼重鏈可變區(qū)骨架的已修飾部分的寡核苷酸，其中與受者骨架區(qū)參考序列相比，已修飾部分在一個(gè)或多個(gè)位置處包含多個(gè)已改變的氨基酸，其中被改變的骨架位置選自第二個(gè)參考序列中與第一個(gè)參考序列的供者骨架位置相比在相應(yīng)位置上不同的受者骨架位置；c)在使得寡核苷酸中的一部分發(fā)生雜交的條件下將第一個(gè)和第二個(gè)寡核苷酸群混合，以至于產(chǎn)生重疊性寡核苷酸；和d)在可構(gòu)建已改變的重鏈可變區(qū)編碼核酸群的條件下處理重疊性寡核苷酸。在某些實(shí)施方案中，第一個(gè)和第二個(gè)參考序列的表現(xiàn)形式為電子形式。在其他實(shí)施方案中，方法還包括步驟(e)共表達(dá)已改變的重鏈可變區(qū)編碼核酸群和輕鏈可變區(qū)編碼核酸，以產(chǎn)生經(jīng)改變的異聚性可變區(qū)的多樣群體。在一些實(shí)施方案中，受者是人。
在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明提供構(gòu)建一群編碼改變的輕鏈可變區(qū)的核酸的方法，包括a)提供第一個(gè)和第二個(gè)參考氨基酸序列的表現(xiàn)形式，其中第一個(gè)參考氨基酸序列包含供者輕鏈可變區(qū)序列，該供者可變區(qū)包括i)骨架區(qū)和ii)三個(gè)如Kabat和Chothia的組合性定義所定義的互補(bǔ)決定區(qū)；第二個(gè)參考氨基酸序列包含含有骨架區(qū)的受者輕鏈可變區(qū)序列；b)合成i)第一個(gè)寡核苷酸群，每個(gè)寡核苷酸編碼至少一個(gè)已修飾的互補(bǔ)決定區(qū)，其中與相應(yīng)的供者互補(bǔ)決定區(qū)氨基酸參考序列相比，已修飾的互補(bǔ)決定區(qū)在一個(gè)或多個(gè)位置處含有不同的氨基酸，以及ii)第二個(gè)寡核苷酸群，其包含編碼輕鏈可變區(qū)骨架的已修飾部分的寡核苷酸，其中與受者骨架區(qū)參考序列相比，已修飾部分在一個(gè)或多個(gè)位置處含有多個(gè)已改變的氨基酸，其中被改變的骨架位置選自第二個(gè)參考序列中與第一個(gè)參考序列的供者骨架位置相比在相應(yīng)位置上不同的受者骨架位置；c)在使得寡核苷酸中的至少一部分發(fā)生雜交的條件下將第一個(gè)和第二個(gè)寡核苷酸群混合，以至于產(chǎn)生重疊性寡核苷酸；和d)在可構(gòu)建已改變的輕鏈可變區(qū)編碼核酸群的條件下處理重疊性寡核苷酸。
在某些實(shí)施方案中，可產(chǎn)生包含F(xiàn)c變體和改變的重鏈變體區(qū)域的抗體或抗體片段。例如，在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供構(gòu)建已改變的重鏈可變區(qū)編碼核酸群的方法，包括a)提供第一個(gè)和第二個(gè)參考氨基酸序列的表現(xiàn)形式，其中第一個(gè)參考序列包含供者重鏈可變區(qū)序列，該供者可變區(qū)包括i)骨架區(qū)和ii)三個(gè)如Kabat和Chothia的組合性定義所定義的互補(bǔ)決定區(qū)；第二個(gè)參考序列包含含有骨架區(qū)的受者重鏈可變區(qū)序列；b)合成A)第一個(gè)寡核苷酸，其編碼受者重鏈可變區(qū)中骨架區(qū)的一部分，其中與第二個(gè)參考序列相比，骨架區(qū)的一部分未被修飾；以及B)第二個(gè)寡核苷酸群，其中每個(gè)寡核苷酸編碼i)已修飾的第一個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)的至少一部分，其中第一個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)選自HCDR1、HCDR2和HCDR3，其中與第一個(gè)參考序列中相應(yīng)的供者互補(bǔ)決定區(qū)相比，已修飾的第一個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)在一個(gè)或多個(gè)位置處包含不同的氨基酸，以及ii)未修飾骨架區(qū)的一部分或多個(gè)部分，其能夠與第一個(gè)寡核苷酸雜交；c)將第一個(gè)寡核苷酸與第二個(gè)寡核苷酸群混合以產(chǎn)生重疊性寡核苷酸；和d)在可構(gòu)建已改變的重鏈可變區(qū)編碼核酸群的條件下，處理重疊性寡核苷酸，其中相對(duì)于第二個(gè)參考序列而言，由已改變的重鏈可變區(qū)編碼核酸所編碼的骨架區(qū)是未被修飾的。在一些實(shí)施方案中，方法還包括步驟(E)共表達(dá)已改變的重鏈可變區(qū)編碼核酸群和輕鏈可變區(qū)編碼核酸，以產(chǎn)生經(jīng)改變的異聚性可變區(qū)的多樣群體。
在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明提供構(gòu)建一群編碼改變的輕鏈可變區(qū)的核酸的方法，包括a)提供第一個(gè)和第二個(gè)參考氨基酸序列的表現(xiàn)形式，其中第一個(gè)參考序列包含供者輕鏈可變區(qū)序列，該供者可變區(qū)包括i)骨架區(qū)和ii)三個(gè)如Kabat和Chothia的組合性定義所定義的互補(bǔ)決定區(qū)；第二個(gè)參考序列包含含有骨架區(qū)的受者輕鏈可變區(qū)序列；b)合成a)編碼受者輕鏈可變區(qū)中骨架區(qū)的一部分的第一個(gè)寡核苷酸，其中與第二個(gè)參考序列相比，骨架區(qū)的一部分未被修飾；以及b)第二個(gè)寡核苷酸群，其中每個(gè)寡核苷酸編碼i)已被修飾的第一個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)的至少一部分，其中第一個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)選自LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中與第一個(gè)參考序列中相應(yīng)的供者互補(bǔ)決定區(qū)相比，已修飾的第一個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)在一個(gè)或多個(gè)位置處包含不同的氨基酸，以及ii)能夠與第一個(gè)寡核苷酸雜交的未修飾骨架區(qū)的一個(gè)或多個(gè)部分；c)將第一個(gè)寡核苷酸與第二個(gè)寡核苷酸群混合，以產(chǎn)生重疊性寡核苷酸；和d)在可構(gòu)建已改變的輕鏈可變區(qū)編碼核酸群的條件下，處理重疊性寡核苷酸，其中相對(duì)于第二個(gè)參考序列而言，由已改變的輕鏈可變區(qū)編碼核酸所編碼的骨架區(qū)未被修飾。
在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明提供構(gòu)建已改變的重鏈可變區(qū)編碼核酸群的方法，包括A)提供第一個(gè)和第二個(gè)參考氨基酸序列的表現(xiàn)形式，其中第一個(gè)參考序列包含供者重鏈可變區(qū)序列，該供者可變區(qū)包括i)骨架區(qū)和ii)三個(gè)如Kabat和Chothia的組合性定義所定義的互補(bǔ)決定區(qū)；第二個(gè)參考序列包含含有骨架區(qū)的受者重鏈可變區(qū)序列；B)合成a)第一個(gè)寡核苷酸群，每個(gè)寡核苷酸編碼選自HCDR1、HCDR2和HCDR3的第一個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)的至少一部分，其中與第一個(gè)參考序列中相應(yīng)的供者互補(bǔ)決定區(qū)相比，已修飾的第一個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)在一個(gè)或多個(gè)位置處含有不同氨基酸，以及b)第二個(gè)寡核苷酸，其編碼i)受者重鏈可變區(qū)內(nèi)的骨架區(qū)的一部分，其中與參考序列相比，骨架區(qū)的一部分未被修飾和ii)互補(bǔ)決定區(qū)的一個(gè)或多個(gè)部分，其能夠與第一個(gè)寡核苷酸群雜交，C)將第一個(gè)寡核苷酸群與第二個(gè)寡核苷酸混合，以至于產(chǎn)生重疊性寡核苷酸；以及d)在可構(gòu)建已改變的重鏈可變區(qū)編碼核酸群的條件下，處理重疊性寡核苷酸，其中相對(duì)于第二個(gè)參考序列而言，由已改變的重鏈可變區(qū)編碼核酸的編碼的骨架區(qū)未被修飾。在某些實(shí)施方案中，方法還包括步驟(E)共表達(dá)已改變的重鏈可變區(qū)編碼核酸群和輕鏈可變區(qū)編碼核酸，以產(chǎn)生經(jīng)改變的異聚性可變區(qū)的多樣群體。
在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明提供構(gòu)建一群編碼改變的輕鏈可變區(qū)的核酸的方法，包括A)提供第一個(gè)和第二個(gè)參考氨基酸序列的表現(xiàn)形式，其中第一個(gè)參考序列包含供者輕鏈可變區(qū)序列，該供者可變區(qū)包括i)骨架區(qū)和ii)三個(gè)如Kabat和Chothia的組合性定義所定義的互補(bǔ)決定區(qū)；第二個(gè)參考序列包含含有骨架區(qū)的受者輕鏈可變區(qū)序列；B)合成a)第一個(gè)寡核苷酸群，每個(gè)寡核苷酸編碼選自LCDR1、LCDR2和LCDR3的第一個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)的至少一部分，其中與第一個(gè)參考序列中相應(yīng)的供者互補(bǔ)決定區(qū)相比，已修飾的第一個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)在一個(gè)或多個(gè)位置處包含不同的氨基酸，以及b)第二個(gè)寡核苷酸，其編碼i)受者輕鏈可變區(qū)內(nèi)的骨架區(qū)的一部分，其中與參考序列相比，骨架區(qū)的一部分未被修飾和ii)互補(bǔ)決定區(qū)的一個(gè)或多個(gè)部分，其能夠與第一個(gè)寡核苷酸群雜交；C)將第一個(gè)寡核苷酸群與第二個(gè)寡核苷酸混合，以產(chǎn)生重疊性寡核苷酸；以及d)在構(gòu)建已改變的輕鏈可變區(qū)編碼核酸群的條件下，處理重疊性寡核苷酸，其中由已改變的輕鏈可變區(qū)編碼核酸所編碼的骨架區(qū)相對(duì)于第二個(gè)參考序列而言未被修飾。
在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明提供改善突變的人源化抗體可變區(qū)的結(jié)合親和性的方法，包括a)提供編碼第一個(gè)已突變?nèi)嗽椿贵w可變區(qū)的核酸序列，已突變可變區(qū)包含(i)野生型人抗體骨架，(ii)三個(gè)非人類重鏈互補(bǔ)決定區(qū)，以及(iii)三個(gè)非人類輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)，其中互補(bǔ)決定區(qū)如Kabat和Chothia的組合性定義描述，其中至少一個(gè)輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)是含有突變的輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)，與相應(yīng)的野生型非人類互補(bǔ)決定區(qū)相比，其在至少一個(gè)位置處包含至少一個(gè)不同的氨基酸，并且其中第一個(gè)已突變抗體可變區(qū)具有高于相應(yīng)未突變的抗體可變區(qū)的結(jié)合親和性；b)在使得第二個(gè)已突變?nèi)嗽椿贵w可變區(qū)編碼的條件下，將編碼第一個(gè)已突變抗體可變區(qū)的核酸序列突變，其中第二個(gè)已突變?nèi)嗽椿贵w可變區(qū)在含有突變的輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)中的至少一處位置上包含至少一個(gè)額外的不同氨基酸，額外突變與第一個(gè)突變一起導(dǎo)致產(chǎn)生更高的結(jié)合親和性。在一些實(shí)施方案中，第一個(gè)已突變?nèi)嗽椿贵w可變區(qū)中含有突變的輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)是互補(bǔ)決定區(qū)3(LCDR3)。在其他實(shí)施方案中，第一個(gè)已突變?nèi)嗽椿贵w可變區(qū)中的至少一個(gè)非人類重鏈互補(bǔ)決定區(qū)包含一個(gè)突變，以致于當(dāng)與相應(yīng)的野生型非人類互補(bǔ)決定區(qū)相比，在至少一個(gè)位置處編碼不同的氨基酸。在另外的實(shí)施方案中，重鏈互補(bǔ)決定區(qū)突變位于HCDR3。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供在構(gòu)建已改變的重鏈可變區(qū)編碼核酸群的同時(shí)修飾至少一個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)和至少一個(gè)骨架區(qū)(FR)的方法，包括a)提供第一個(gè)和第二個(gè)參考氨基酸序列的表現(xiàn)形式，第一個(gè)參考氨基酸序列包含供者重鏈可變區(qū)序列，其中供者可變區(qū)包括i)四個(gè)骨架區(qū)和ii)三個(gè)如Kabat和Chothia的組合性定義所定義的互補(bǔ)決定區(qū)；第二個(gè)參考氨基酸序列包含了如Kabat和Chothia的組合性定義所定義的含有四個(gè)骨架區(qū)的受者重鏈可變區(qū)序列；b)合成i)對(duì)于待修飾的每個(gè)骨架區(qū)的寡核苷酸群，每個(gè)寡核苷酸編碼一個(gè)修飾的骨架區(qū)或其部分，已修飾的骨架區(qū)或其部分與受者重鏈可變區(qū)參考序列相比，在一個(gè)或多個(gè)位置處含有多個(gè)改變的氨基酸，其中被改變的骨架區(qū)位置選自于第二個(gè)參考序列中與第一個(gè)參考序列的供者骨架區(qū)位置相比在相應(yīng)位置不同的受者骨架位置；和ii)對(duì)于待修飾的每個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)的寡核苷酸群，每個(gè)寡核苷酸編碼一個(gè)修飾的互補(bǔ)決定區(qū)或其部分，其中修飾的互補(bǔ)決定區(qū)與供者互補(bǔ)決定區(qū)氨基酸參考序列相比在一個(gè)或多個(gè)位置處含有不同的氨基酸；和iii)對(duì)于任一剩余的和未修飾的骨架區(qū)的寡核苷酸，寡核苷酸編碼骨架區(qū)或其部分，并具有與第二個(gè)參考受者序列的相應(yīng)骨架區(qū)相同的序列；和iv)對(duì)于任一剩余的和未修飾的互補(bǔ)決定區(qū)的寡核苷酸，寡核苷酸編碼互補(bǔ)決定區(qū)或其部分，并具有與第一個(gè)參考供者序列的相應(yīng)互補(bǔ)決定區(qū)相同的序列，其中編碼重鏈可變區(qū)中毗鄰部分的從(i)至(iv)的各個(gè)寡核苷酸在其末端具有重疊的序列；以及c)將步驟b)中所合成的寡核苷酸和寡核苷酸群在使得各個(gè)寡核苷酸的重疊序列發(fā)生雜交條件下混合，以至于產(chǎn)生重疊的寡核苷酸，和d)在使得已改變的重鏈可變區(qū)編碼核苷酸群形成的條件下處理重疊的寡核苷酸。在某些實(shí)施方案中，第一個(gè)和第二個(gè)參考序列的表現(xiàn)形式為電子形式。在又一些實(shí)施方案中，待修飾的骨架區(qū)選自HFR1、HFR2和HFR3。在其他實(shí)施方案中，待修飾的互補(bǔ)決定區(qū)是HCDR3。在其他實(shí)施方案中，方法還包括步驟e)共表達(dá)重鏈可變區(qū)編碼核酸群與輕鏈可變區(qū)編碼核酸，以致于產(chǎn)生已改變的異聚可變區(qū)的多樣群體。在不同的實(shí)施方案中，方法還包括步驟e)共表達(dá)重鏈可變區(qū)編碼核酸群與輕鏈可變區(qū)編碼核酸群，以致于產(chǎn)生已改變的異聚可變區(qū)的多樣性群體。
在其他實(shí)施方案中，應(yīng)用了在構(gòu)建已改變的輕鏈可變區(qū)編碼核酸群時(shí)同時(shí)修飾至少一個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)和至少一個(gè)骨架區(qū)(FR)的方法，其中所述方法包括a)提供第一個(gè)和第二個(gè)參考氨基酸序列的表現(xiàn)形式，第一個(gè)參考氨基酸序列包含供者輕鏈可變區(qū)序列，其中供者可變區(qū)包括i)四個(gè)骨架區(qū)和ii)三個(gè)如Kabat和Chothia的組合性定義所定義的互補(bǔ)決定區(qū)；第二個(gè)參考氨基酸序列包含了如Kabat和Chothia的組合性定義所定義的含有四個(gè)骨架區(qū)的受者輕鏈可變區(qū)序列；b)合成i)對(duì)于待修飾的每個(gè)骨架區(qū)的寡核苷酸群，每個(gè)寡核苷酸編一個(gè)修飾的骨架區(qū)或其部分，修飾的骨架區(qū)或其部分與受者輕鏈可變區(qū)參考序列的相應(yīng)骨架區(qū)相比在一個(gè)或多個(gè)位置處含有多個(gè)改變的氨基酸，其中被改變的骨架區(qū)位置選自于第二個(gè)參考序列中與第一個(gè)參考序列的供者骨架區(qū)位置相比在相應(yīng)位置不同的受者骨架位置；和ii)對(duì)于待修飾的每個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)的寡核苷酸群，每個(gè)寡核苷酸編碼一個(gè)已修飾的互補(bǔ)決定區(qū)或其部分，其中已修飾的互補(bǔ)決定區(qū)與相應(yīng)的供者互補(bǔ)決定區(qū)氨基酸參考序列相比在一個(gè)或多個(gè)位置處含有不同的氨基酸；和iii)對(duì)于任一剩余的和未修飾的骨架區(qū)的寡核苷酸，寡核苷酸編碼骨架區(qū)或其部分，并寡核苷酸具有與第二個(gè)參考受者序列的相應(yīng)骨架區(qū)相同的序列；和iv)對(duì)于任一剩余的和未修飾的互補(bǔ)決定區(qū)的寡核苷酸，寡核苷酸編碼互補(bǔ)決定區(qū)或其部分并具有與第一個(gè)參考供者序列的對(duì)應(yīng)互補(bǔ)決定區(qū)相同的序列，其中編碼輕鏈可變區(qū)中毗鄰部分的從(i)至(iv)的各個(gè)寡核苷酸在其末端具有重疊的序列；和c)將步驟b)中所合成的寡核苷酸和寡核苷酸群在使得各個(gè)寡核苷酸的重疊序列雜交的條件下混合，以至于產(chǎn)生重疊寡核苷酸，和d)在使得已改變的輕鏈可變區(qū)編碼核苷酸群形成的條件下處理所述重疊的寡核苷酸。在某些實(shí)施方案中，所述方法還包括步驟e)共表達(dá)輕鏈可變區(qū)編碼核酸群和重鏈可變區(qū)編碼核酸群，以致于產(chǎn)生已改變的異聚可變區(qū)的多樣性群體。
(v)多特異性抗體本發(fā)明提供包含變體Fc區(qū)的多特異性抗體。多特異性抗體具有針對(duì)至少兩種不同抗原的結(jié)合特異性。盡管此類分子通常僅僅結(jié)合兩種抗原(即雙特異性抗體，BsAb)，當(dāng)在此處使用時(shí)，本表述還包括具有額外特異性的抗體，如三特異性抗體。BsAb的實(shí)例包括(但不限于)這樣的BsAb，即一條臂針對(duì)腫瘤細(xì)胞抗原而另一條臂針對(duì)細(xì)胞毒性啟動(dòng)分子的抗體，如抗FcγRI/抗CD15、抗p185HER2/FcγRIII(CD16)、抗CD3/抗惡性B-細(xì)胞(1D10)、抗CD3/抗p185HER2、抗CD3/抗p97、抗CD3/抗腎細(xì)胞癌、抗CD3/抗OVCAR-3、抗CD3/L-D1(抗結(jié)腸癌)、抗CD3/抗黑色素細(xì)胞雌激素類似物、抗EGF受體/抗CD3、抗CD3/抗CAMA1、抗CD3/抗CD19、抗CD3/MoV18、抗神經(jīng)細(xì)胞粘附分子(NCAM)/抗CD3、抗葉酸結(jié)合蛋白質(zhì)(FBP)/抗CD3、抗胰腺癌相關(guān)抗原(AMOC-31)/抗CD3；一條臂特異性結(jié)合腫瘤抗原和一條臂結(jié)合毒素的BsAb，如抗鞘脂激活蛋白/抗id-1、抗CD22/抗鞘脂激活蛋白、抗CD7/抗鞘脂激活蛋白、抗CD38/抗鞘脂激活蛋白、抗CEA/抗蓖麻毒蛋白A鏈、抗干擾素-a(IFN-a)/抗雜交瘤獨(dú)特型、抗CEA/抗長(zhǎng)春花生物堿；轉(zhuǎn)化受酶活化的前體藥物的BsAb，如抗CD30/抗堿性磷酸酶(其催化絲裂霉素磷酸酯前體藥物轉(zhuǎn)化為絲裂霉素醇)；可用作纖溶劑的BsAb，如抗纖維蛋白/抗組織纖溶酶原激活物(tPA)、抗纖維蛋白/抗尿激酶型纖溶酶原激活物(uPA)；用于將免疫復(fù)合物靶向細(xì)胞表面受體的BsAb，如抗低密度脂蛋白(LDL)/抗Fc受體(例如FcγRI、FcRγII或FcRγIII)；治療傳染性疾病的BsAb，如抗CD3/抗單純皰疹病毒(HSV)、抗T-細(xì)胞受體CD3復(fù)合物/抗流感病毒、抗FcyR/抗HIV；用于腫瘤體外或體內(nèi)檢測(cè)的BsAb，如抗CEA/抗EOTUBE、抗CEA/抗DPTA、抗p185HER2/抗半抗原；作為疫苗佐劑的BsAb；以及作為診斷性工具的BsAb，如抗兔IgG/抗鐵蛋白、抗辣根過(guò)氧化物酶(HRP)/抗激素、抗促生長(zhǎng)素抑制素/抗P物質(zhì)、抗HRP/抗FITC、抗CEA/抗β-半乳糖苷酶。三特異性抗體的實(shí)例包括(但不限于)抗CD3/抗CD4/抗CD37、抗CD3/抗CD5/抗CD37和抗CD3/抗CD8/抗CD37。雙特異性抗體可制備成全長(zhǎng)抗體或抗體片段(例如F(ab’)2雙特異性抗體)。
產(chǎn)生雙特異性抗體的方法為本領(lǐng)域所知。傳統(tǒng)的全長(zhǎng)雙特異性抗體生產(chǎn)基于兩個(gè)免疫球蛋白重鏈-輕鏈對(duì)的共表達(dá)，其中兩個(gè)鏈具有不同特異性(例如Millstein等，Nature，305537-539(1983)，此處引用作為參考)。由于免疫球蛋白重鏈和輕鏈隨機(jī)搭配，這些雜交瘤(四雜交留(quadromas))產(chǎn)生10種不同抗體分子的潛在混合物，其中只有一種分子具有正確的雙特異性結(jié)構(gòu)?？赏ㄟ^(guò)親和層析步驟純化正確分子。類似方法公開(kāi)于WO93/08829和Traunecker等，EMBO J.，103655-3659(1991)，兩篇文獻(xiàn)此處引用作為參考。
在另一方法中，具有預(yù)期結(jié)合特異性的抗體可變結(jié)構(gòu)域(抗體-抗原結(jié)合位點(diǎn))與免疫球蛋白恒定結(jié)構(gòu)域序列發(fā)生融合。優(yōu)選地，與包含至少一部分鉸鏈、CH2和CH3區(qū)的免疫球蛋白重鏈恒定結(jié)構(gòu)域融合。在至少一種融合物中出現(xiàn)含有輕鏈結(jié)合所需位點(diǎn)的第一個(gè)重鏈恒定區(qū)(CH1)為優(yōu)選的。將編碼免疫球蛋白重鏈融合物的DNA以及根據(jù)需要編碼免疫球蛋白輕鏈的DNA分別插入表達(dá)載體并且共轉(zhuǎn)染至合適宿主生物內(nèi)。當(dāng)在構(gòu)建中所用的三種多肽鏈的不等比例提供最佳產(chǎn)量時(shí)，這種方式可為實(shí)施方案中調(diào)整三種多肽片段的相互比例提供極大靈活性。然而，當(dāng)?shù)缺壤磉_(dá)至少兩種多肽鏈導(dǎo)致高產(chǎn)量或當(dāng)比例無(wú)特別意義時(shí)，可以將兩種或全部三種多肽鏈的編碼序列插入一個(gè)表達(dá)載體內(nèi)。在該方法的優(yōu)選的實(shí)施方案中，雙特異性抗體由一條臂內(nèi)具有第一種特異性的雜合免疫球蛋白重鏈和另一條臂內(nèi)的雜合免疫球蛋白重鏈-輕鏈對(duì)(提供第二種結(jié)合特異性)組成(見(jiàn)例如WO 94/04690)。根據(jù)WO 96/27011(此處引用作為參考)中所描述的另一種方法，可將一對(duì)抗體分子間的界面設(shè)計(jì)成使從重組細(xì)胞培養(yǎng)中回收的異二聚體的百分?jǐn)?shù)最大化。雙特異性抗體還包括交聯(lián)的或“異綴合體(heteroconjugate)”抗體。例如異綴合體中的抗體之一可與親合素偶聯(lián)，而另一個(gè)抗體與生物素偶聯(lián)。
B.免疫粘附素分子本發(fā)明還提供包含變體Fc區(qū)的免疫粘附素分子。一種免疫粘附素設(shè)計(jì)類型是聯(lián)合粘附素的結(jié)合結(jié)構(gòu)域(例如受體的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域(ECD))與免疫球蛋白重鏈的Fc區(qū)(例如變體的Fc區(qū))。通常，當(dāng)制備本發(fā)明的免疫粘附素時(shí)，編碼粘附素結(jié)合結(jié)構(gòu)域的核酸的C末端與編碼免疫球蛋白恒定結(jié)構(gòu)域序列N末端的核酸融合，然而，也可以是N末端融合。
一般地，在此類融合中，所編碼的嵌合多肽將至少保留免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)中的功能活性鉸鏈、CH2和CH3結(jié)構(gòu)域。還可與恒定結(jié)構(gòu)域Fc部分的C末端或緊鄰重鏈CH1的N末端或輕鏈的相應(yīng)區(qū)域融合。融合的精確位點(diǎn)并不重要；特定的位點(diǎn)是眾所周知的，并且可以選擇特定位點(diǎn)以優(yōu)化免疫粘附素的生物學(xué)活性、分泌或結(jié)合特征。
在一些實(shí)施方案中，粘附素序列與免疫球蛋白G1的變體Fc區(qū)的N末端融合?？梢詫⒄麄€(gè)重鏈恒定區(qū)與粘附素序列融合。然而，在優(yōu)選的實(shí)施方案中，在融合中使用了這樣一種序列，即從緊鄰化學(xué)性界定IgG Fc的木瓜蛋白酶切割位點(diǎn)(即殘基216，重鏈恒定區(qū)第一個(gè)殘基為114)或其它免疫球蛋白的類似位點(diǎn)上游的鉸鏈區(qū)開(kāi)始的序列。在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，粘附素氨基酸序列與lgG重鏈的(a)鉸鏈區(qū)和CH2及CH3或者(b)CH1、鉸鏈、CH2和CH3結(jié)構(gòu)域融合。在一些實(shí)施方案中，免疫粘附素是雙特異性的。
備選地，粘附素序列可在免疫球蛋白重鏈和輕鏈序列之間插入，以致于獲得包含嵌合重鏈的免疫球蛋白。在此類實(shí)施方案中，粘附素序列可在免疫球蛋白的每一條臂內(nèi)與免疫球蛋白重鏈的3’末端融合，或者位于鉸鏈和CH2結(jié)構(gòu)域之間，或者位于CH2和CH3之間(見(jiàn)例如Hoogenboom等，Mol.Immunol.281027-1037(1991)，此處引用作為參考)。
雖然在本發(fā)明的免疫粘附素內(nèi)無(wú)需存在免疫球蛋白輕鏈，但是可以出現(xiàn)與粘附素-免疫球蛋白重鏈融合多肽共價(jià)性結(jié)合或直接與粘附素融合的免疫球蛋白輕鏈。在前一種情況下，編碼免疫球蛋白輕鏈的DNA一般與編碼粘附素-免疫球蛋白重鏈融合蛋白的DNA共表達(dá)。一旦分泌，雜交的重鏈和輕鏈共價(jià)結(jié)合以提供包含由兩個(gè)二硫鍵所連接的免疫球蛋白重鏈-輕鏈對(duì)的免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)物。適于制備此類結(jié)構(gòu)物的方法公開(kāi)于如美國(guó)專利號(hào)4,816,567，此處引用作為參考。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過(guò)編碼粘附素部分的cDNA序列按符合閱讀框的方式與免疫球蛋白cDNA序列融合，構(gòu)建免疫粘附素。然而，還可使用與基因組免疫球蛋白片段的融合。通常，后一類型的融合需要存在用于表達(dá)的Ig調(diào)節(jié)序列。基于已公開(kāi)序列，通過(guò)雜交或者通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)可以從來(lái)自脾和外周淋巴細(xì)胞的cDNA文庫(kù)分離編碼IgG重鏈恒定區(qū)的cDNA。編碼免疫粘附素中“粘附素”和免疫球蛋白部分的cDNA可以串聯(lián)方式插入到在選定宿主細(xì)胞中指導(dǎo)高效表達(dá)的質(zhì)粒載體內(nèi)。
VI.編碼Fc區(qū)變體的核酸序列本發(fā)明還提供編碼Fc區(qū)變體的核酸序列，以及包含編碼Fc區(qū)變體核酸序列的組合物、載體和宿主細(xì)胞。本發(fā)明還提供產(chǎn)生Fc區(qū)變體的重組方法。
通常，對(duì)于變體的重組生產(chǎn)，將編碼變體的核酸分離并插入載體。將載體轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，因此使該核酸序列擴(kuò)增和/或產(chǎn)生變體肽。編碼本發(fā)明肽變體的核酸序列可使用常規(guī)方法分離和測(cè)序(例如使用能夠特異性結(jié)合編碼該變體的核酸的寡核苷酸探)。通常，編碼變體的核酸序列有效地與其他元件連接，如信號(hào)序列(例如分泌性信號(hào)序列)、復(fù)制起點(diǎn)、至少一種標(biāo)記基因、增強(qiáng)子、啟動(dòng)子或轉(zhuǎn)錄終止子。在某些實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞用編碼變體的核酸穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，以產(chǎn)生表達(dá)特定變體的細(xì)胞系。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，變體在CHO、NSO、Sp2/0、PER.C6或HEK293細(xì)胞中表達(dá)。重組方法為本領(lǐng)域眾所周知。
可將核酸序列突變以至于產(chǎn)生變體Fc區(qū)。例如，可將編碼母體Fc區(qū)的核酸序列(例SEQ ID NO32)突變，以致于表達(dá)該核酸序列時(shí)至少一處氨基酸發(fā)生改變。也可將編碼母體Fc區(qū)的至少一部分的核酸序列突變，以產(chǎn)生包含至少一部分Fc區(qū)變體的氨基酸序列。例如，可突變SEQ IDNO32，以致于得到至少一種氨基酸序列(見(jiàn)例如SEQ ID NO38、SEQ IDNO39、SEQ ID NO40、SEQ ID NO41、SEQ ID NO42、SEQ ID NO43、SEQ ID NO44、SEQ ID NO45、SEQ ID NO46、SEQ ID NO47、SEQ IDNO48、SEQ ID NO49、SEQ ID NO50、SEQ ID NO51、SEQ ID NO52、SEQ ID NO53、SEQ ID NO54、SEQ ID NO55和SEQ ID NO56)。
在某些實(shí)施方案中，使用了基于密碼子的合成以便產(chǎn)生突變的序列?；诿艽a子的合成的實(shí)例包括例如在美國(guó)專利5,264,563、5,523,388和5,808,022中描述的那些實(shí)例，所有專利此處引用作為參考。簡(jiǎn)而言之，基于密碼子的合成可通過(guò)在分開(kāi)的支持物上順序連接單體進(jìn)行，以形成至少兩種不同的三聯(lián)體?？稍诜珠_(kāi)的反應(yīng)容器內(nèi)進(jìn)行連接，然后將來(lái)自反應(yīng)容器的支持物混合，并且將已混合的支持物分配至兩個(gè)或多個(gè)分開(kāi)的反應(yīng)容器內(nèi)，并且在所述反應(yīng)容器內(nèi)重復(fù)連接、混合及分配步驟一次或多次，以混合或分配步驟結(jié)束。此外，可從支持物上切下寡核苷酸。
VII.治療性用途和制劑在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含此處所述變體的治療性制劑。本發(fā)明將不受限于治療性組合物的特定性質(zhì)。例如，此類組合物可包括與生理上可耐受液體、膠體、固體載體、稀釋劑、佐劑和賦形劑及其組合一起提供(見(jiàn)例如Remington’s Pharmaceutical Sciences第16版，Osol，A.編.(1980)，此處引用作為參考)的多肽變體(或其部分)。
此外，多肽變體可與其他治療劑共同使用，治療劑包括但不限于水楊酸、類固醇、免疫抑制劑、抗體或抗生素?？膳c本發(fā)明的變體共同使用的特定治療劑包括但不限于下列治療劑偶氮苯化合物(美國(guó)專利號(hào)4,312,806，此處引用作為參考)、芐基取代的羅丹明衍生物(美國(guó)專利號(hào)5,216,002，此處引用作為參考)、L-肌肽鋅(美國(guó)專利號(hào)5,238,931，此處引用作為參考)、3-苯基-5-羧基吡唑和異噻唑(美國(guó)專利號(hào)5,294,630，此處引用作為參考)、IL-10(美國(guó)專利號(hào)5,368,854，此處引用作為參考)、喹啉白三烯合成抑制物(美國(guó)專利號(hào)5,391,555，此處引用作為參考)、2’-鹵代-2，脫氧腺苷(美國(guó)專利號(hào)5,506,213，此處引用作為參考)、酚和苯甲酰胺化合物(美國(guó)專利號(hào)5,552,439，此處引用作為參考)、甘油三丁酸酯(美國(guó)專利號(hào)5,569,680，此處引用作為參考)、某些肽(美國(guó)專利號(hào)5,756,449，此處引用作為參考)、Ω-3多不飽和酸(美國(guó)專利號(hào)5,792,795，此處引用作為參考)、VLA-4封阻劑(美國(guó)專利號(hào)5,932,214，此處引用作為參考)、脫氫皮質(zhì)醇金屬硫代苯甲酸酯(美國(guó)專利號(hào)5,834,021，此處引用作為參考)、細(xì)胞因子抑制劑(美國(guó)專利號(hào)5,888,969，此處引用作為參考)和煙堿(美國(guó)專利號(hào)5,889,028，此處引用作為參考)。
多肽變體可與降低細(xì)胞活性或增殖能力的制劑共同使用。降低細(xì)胞活性或增值潛力的制劑可以多種方式起作用，包括例如抑制DNA合成、抑制細(xì)胞分裂、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡或誘導(dǎo)非凋亡性細(xì)胞死亡。細(xì)胞毒劑和細(xì)胞生長(zhǎng)抑制劑的特定實(shí)例包括但不限于美洲商陸抗病毒蛋白、相思豆毒蛋白、蓖麻毒蛋白和這三種蛋白的A鏈；阿霉素、順鉑、碘-131、釔-90、錸-188、鉍-212、紫杉醇、5-氟尿嘧啶VP-16、博來(lái)霉素、氨甲蝶呤、長(zhǎng)春地辛、羥基柔紅霉素、長(zhǎng)春新堿、長(zhǎng)春堿、BCNU、絲裂霉素和環(huán)磷酰胺以及某些細(xì)胞因子如TNF-α和TNF-β。因此，細(xì)胞毒劑或細(xì)胞生長(zhǎng)抑制劑可包括如放射性核素、化學(xué)治療藥物、蛋白質(zhì)和凝集素。
治療性組合物可含有例如通常所用的添加劑，如粘合劑、填充劑、載體、防腐劑、穩(wěn)定劑、乳化劑、緩沖劑和賦形劑，例如藥用級(jí)甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、纖維素、碳酸鎂等。這些組合物一般含有1％-95％的活性組分，優(yōu)選2％-70％的活性組分。
本發(fā)明的多肽變體還可以與兼容的和可生理耐受的稀釋劑或賦形劑混合。合適的稀釋劑和賦形劑例如水、鹽水、葡萄糖、甘油等或其組合。此外，如果需要，組合物可含有少量輔助物質(zhì)，如潤(rùn)濕劑或乳化劑、穩(wěn)定劑或pH緩沖劑。
在一些實(shí)施方案中，將本發(fā)明的治療性組合物制備成液體溶液或混懸液、噴霧劑或固體形式?？诜苿┩ǔ０ㄍǔＫ玫奶砑觿缯澈蟿?、填充劑、載體、防腐劑、穩(wěn)定劑、乳化劑、緩沖劑和賦形劑，例如藥用級(jí)的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、纖維素、碳酸鎂等。這些組合物通常采用溶液劑、混懸劑、片劑、丸劑、膠囊劑、緩釋制劑或散劑的形式，并且一般含有1％-95％的活性組分，優(yōu)選2％-70％的活性組分。一個(gè)用于遞送本發(fā)明治療性組合物的口服組合物的實(shí)例描述于美國(guó)專利號(hào)5,643,602中(此處引用作為參考)。
另一些適合其它施用方式(如局部施用)的制劑包括油膏劑、酊劑、乳膏劑、洗劑、透皮貼劑和栓劑。對(duì)于油膏和乳膏劑，常用粘合劑、載體和賦形劑可包括例如聚二醇或甘油三酯。局部遞送方法的一個(gè)實(shí)例描述于美國(guó)專利號(hào)5,834,016(此處引用作為參考)。還可使用其他的脂質(zhì)體遞送方法(見(jiàn)例如美國(guó)專利號(hào)5,851,548和5,711,964，兩篇文獻(xiàn)此處引用作為參考)。
制劑還可含有一種以上對(duì)于被治療的特定適應(yīng)癥所需的活性化合物，優(yōu)選那些具有彼此不妨害的互補(bǔ)性活性的化合物。此類分子以對(duì)于預(yù)期目的有效的量組合存在。
還可制備緩釋制劑。緩釋制劑的合適實(shí)例包括含有多肽變體的固體疏水聚合物半透性基質(zhì)，其中基質(zhì)為成形的形式，如膜，或微膠囊。緩釋基質(zhì)的實(shí)例包括但不限于聚酯、水凝膠(例如聚(2-羥乙基-異丁烯酸)或聚(乙烯醇))、聚交酯、L-谷氨酸和y乙基-L-谷氨酸酯共聚物、不可降解的乙烯-醋酸乙烯酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物如LUPRON DEPOT(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮異瑞林組成的可注射微球)以及聚-D-(-)-3-羥丁酸。聚合物如乙烯-醋酸乙烯酯和乳酸-乙醇酸可使分子釋放超過(guò)100天，而某些水凝膠釋放蛋白質(zhì)的時(shí)間段較短。
本發(fā)明的多肽變體可用于治療受試者。此類治療可向患有疾病的受試者施用，或者向受試者(例如易患疾病的受試者)預(yù)防性施用?？芍委煹膶?shí)例包括但不限于癌(例如其中多肽變體結(jié)合HER2受體、CD20或血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF))；過(guò)敏性疾病如哮喘(用抗IgE抗體)和LFA-1-介導(dǎo)性疾病(例如其中多肽變體是抗LFA-1或抗ICAM-1抗體)等。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，用于治療受試者的變體包含抗體或免疫粘附素。而且在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所治療的疾病是抗體或免疫粘附素應(yīng)答性疾病?？贵w應(yīng)答性疾病的實(shí)例包括疾病和醫(yī)學(xué)狀態(tài)，如淋巴瘤(證實(shí)可用抗CD20的抗體RITUXAN治療)、傳染病(證實(shí)可用針對(duì)呼吸道合胞體病毒F蛋白的抗體SYNAGIS治療)、腎移植(證實(shí)抗IL-2受體的抗體ZENAPAX是有益的)、克隆病和類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(證實(shí)可用抗TNFα的抗體REMICADE治療)、乳腺癌(證實(shí)可用抗HER2的抗體HERCEPTIN治療)和結(jié)腸癌(證實(shí)可用抗17-1A的抗體EDRECOLOMAB抗體治療)。
在一些實(shí)施方案中，將具有改善ADCC活性的多肽變體(例如P247L或I332K變體)用于治療需要將組織或外來(lái)微生物破壞或消滅的疾病或病癥。例如，變體可用于治療癌；炎性疾??；感染(例如細(xì)菌性、病毒性、真菌性或酵母感染)和其他的需要去除組織的疾病(如甲狀腺腫)。在其他實(shí)施方案中，多肽變體具有降低的ADCC活性(例如I332R或I332K變體)。此類變體可用于治療這樣的疾病或病癥，即在疾病或病癥中需要具備長(zhǎng)半壽期的含有Fc區(qū)的多肽，但是多肽優(yōu)選地不具有不良效應(yīng)子功能。例如，含F(xiàn)c區(qū)多肽可以是抗組織因子(TF)抗體；抗IgE抗體和抗整合素抗體(例如抗α4β7抗體)。此類含F(xiàn)c區(qū)多肽的預(yù)期作用機(jī)制是阻斷配體-受體結(jié)合對(duì)。此外，具有降低ADCC活性的含有Fc區(qū)多肽可以是激動(dòng)劑抗體。
本發(fā)明的多肽變體可通過(guò)任何適宜方法施用，包括腸胃外、皮下、局部、腹膜內(nèi)、肺內(nèi)和鼻內(nèi)和傷口內(nèi)施用(例如用于局部免疫抑制治療)。腸胃外輸注包括肌內(nèi)、靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、腹膜內(nèi)或皮下施用。此外，多肽變體通過(guò)脈沖輸注施用，尤其以遞減的多肽變體劑量。優(yōu)選地，通過(guò)注射給藥，最優(yōu)選地通過(guò)靜脈內(nèi)注射或皮下注射給藥，這部分地取決于所述施用是短期的還是長(zhǎng)期的。
對(duì)于預(yù)防或治療疾病，多肽變體的適宜劑量將取決于待治療疾病類型、疾病的嚴(yán)重性和病程、多肽變體是否為預(yù)防性或治療性施用、先前治療、患者臨床史和對(duì)多肽變體的反應(yīng)以及主治醫(yī)師的判斷。多肽變體在次治療或一系列治療中合適地施與患者。
例如，根據(jù)疾病類型和嚴(yán)重性，向患者施用的起始候選劑量為大約1μg/kg至15mg/kg(例如0.120mg/kg)的多肽變體，無(wú)論是一次或多次分別施用還是持續(xù)輸注施用。一般日劑量范圍從大約1μg/kg至100mg/kg或者更高，這取決于以上提及的因素。對(duì)于經(jīng)過(guò)數(shù)日或更長(zhǎng)時(shí)間的反復(fù)施用，取決于所述的疾病狀況治療將持續(xù)直至癥狀明顯減弱或消失。該治療的過(guò)程通過(guò)常規(guī)技術(shù)和測(cè)定法可容易地監(jiān)測(cè)，并且可用于調(diào)整劑量以實(shí)現(xiàn)治療效果。
待施用多肽變體的有效治療量是為了減弱被治療疾病癥狀患者所需要的劑量水平。多肽變體不必、但任選地可與一種或多種目前用于預(yù)防或治療所述疾病的藥劑一起配制成制劑。此類其他藥劑的有效量取決于制劑中多肽變體的量、疾病或治療類型以及上述其他的因素。
VIII.變體Fc區(qū)的額外用途本發(fā)明的變體、編碼變體的核酸序列可以多種方式使用。例如，本發(fā)明的變體可用于藥物篩選測(cè)定法。例如，可通過(guò)將變體與候選化合物接觸并測(cè)定該候選化合物與變體的結(jié)合，來(lái)評(píng)估這些候選化合物改變或干擾Fc效應(yīng)子功能的能力。所述變體可用本領(lǐng)域所知的方法固定化，如將GST-變體融合蛋白與含有谷胱苷肽的聚合物珠結(jié)合。通過(guò)編碼目的變體的DNA和編碼GST羧基末端的DNA的融合構(gòu)建編碼GST融合蛋白的嵌合基因(見(jiàn)例如Smith等，Gene 6731 )。然后將融合構(gòu)建體轉(zhuǎn)化至合適的表達(dá)系統(tǒng)內(nèi)(例如大腸桿菌(E.coli)XA90)，在該表達(dá)系統(tǒng)中可用異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)GST融合蛋白表達(dá)。IPTG的誘導(dǎo)產(chǎn)生作為可溶性細(xì)胞蛋白主要成分的融合蛋白。該融合蛋白可由本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的方法純化，包括通過(guò)谷胱苷肽親和層析純化。候選化合物與變體的結(jié)合與該化合物破壞一種或多種效應(yīng)子功能的能力有關(guān)。
在另一篩選方法中，使用本領(lǐng)域所知方法固定變體或所選擇的FcR，如吸附于塑料微量滴定板或GST-融合蛋白特異性結(jié)合含有谷胱苷肽的聚合物珠。例如，GST-變體結(jié)合到谷胱苷肽-瓊脂糖珠上。固定化的變體隨后與Fc受體和候選化合物接觸。然后去除未結(jié)合的肽并且溶解和分析復(fù)合物以測(cè)定結(jié)合所標(biāo)記肽的量。結(jié)合的降低表明候選化合物抑制變體與Fc受體的相互作用。這種篩選方法尤其用于本發(fā)明的具有提高的Fc受體結(jié)合水平的變體(例如由于許多母體Fc受體為低親和性受體，如FcγRIII、FcγRIIb和FcγRIIa)。本方法的變例可用于篩選能破壞先前形成的變體/Fc受體復(fù)合物的化合物。例如，在一些實(shí)施方案中，如上所述，將包含結(jié)合了Fc受體的變體復(fù)合物固定化并且與候選化合物接觸。該候選化合物對(duì)所述復(fù)合物的分解與該化合物破壞或抑制測(cè)試變體和測(cè)試受體間相互作用的能力相關(guān)。就此而言，可鑒定具有治療功效(例如在人體中)的化合物(例如用于治療人疾病如自身免疫疾病的化合物)。
用于藥物篩選的另一技術(shù)可高通量地篩選對(duì)變體肽具有合適結(jié)合親和性的化合物，其詳細(xì)描述于WO 84/03564中，此處引用作為參考。簡(jiǎn)而言之，在固體底物(如塑料針或一些其他表面)上合成較大數(shù)量的不同的小肽測(cè)試化合物。然后這些肽測(cè)試化合物與變體肽反應(yīng)并且洗滌。然后用本領(lǐng)域眾所周知的方法檢測(cè)已結(jié)合的變體肽。
另一項(xiàng)技術(shù)使用了針對(duì)變體肽的抗體。此類能夠特異性結(jié)合變體肽的抗體同測(cè)試化合物競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合特定受體。以這種方式，該抗體可用于檢測(cè)與變體肽共有一個(gè)或多個(gè)抗原決定簇的任何肽的存在。
本發(fā)明考慮了篩選化合物的眾多其它方法。僅描述以上提供的實(shí)例以說(shuō)明大量技術(shù)是可以利用的。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將理解，可使用許多其他篩選方法。
具體而言，本發(fā)明考慮了細(xì)胞系的用途，其中細(xì)胞系用編碼至少一種Fc區(qū)變體的核酸轉(zhuǎn)染，其用于篩選具有活性的化合物，并且具體而言是用于高通量地從組合文庫(kù)(例如含有超過(guò)104種化合物的文庫(kù))中篩選化合物。本發(fā)明的細(xì)胞系可用于眾多篩選方法。
本發(fā)明的變體可用作親和純化試劑。例如，可使用本領(lǐng)域眾所周知的方法在固相上固定化變體，如在Sephadex樹(shù)脂或?yàn)V紙上。隨后將固定化的變體與含有待純化抗原的樣品接觸，然后用適宜溶劑(基本上去除了樣品中除已與固定化多肽變體結(jié)合的待純化抗原以外的其他所有物質(zhì))洗滌。最后，用另一種合適溶劑如pH 5.0的甘氨酸緩沖液洗滌，該緩沖液將抗原從多肽變體中釋放。
多肽變體還可用于診斷性測(cè)定法(例如用于檢測(cè)特定細(xì)胞、組織或血清中目的抗原的表達(dá))。對(duì)于診斷性應(yīng)用，通常將變體用可檢測(cè)部分標(biāo)記(此類標(biāo)記還可用于上述的Fc區(qū)測(cè)定法)?？衫帽姸嗟臉?biāo)記，其包括但不限于放射性同位素(例如35S、14C、125I、3H和131I)、熒光標(biāo)記(例如稀土螯合物(銪螯合物)或熒光素及其衍生物、羅丹明及其衍生物、丹酰、麗絲胺、藻紅蛋百和德州紅)以及多種酶-底物標(biāo)記(見(jiàn)例如美國(guó)專利號(hào)4,275,149，此處引用作為參考，以及螢光素酶、螢光素、2，3-二氫2，3-二氮雜萘二酮(2，3-dihydrophthalazinediones)、蘋果酸脫氫酶、脲酶、過(guò)氧化物酶如辣根過(guò)氧化物酶(HRPO)、堿性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖淀粉酶、溶菌酶、糖氧化酶(例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶和葡萄糖-6-磷酸脫氫酶)、雜環(huán)氧化酶(如尿酸酶和黃嘌呤氧化酶)、乳酸過(guò)氧化物酶、微過(guò)氧化物酶等)。酶-底物組合的實(shí)例包括例如(i)辣根過(guò)氧化物酶(HRPO)與作為底物的過(guò)氧化氫，其中過(guò)氧化氫酶氧化染料前體(例如鄰苯二胺(OPD)或3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺鹽酸鹽(TMB))；(ii)堿性磷酸酶(AP)與作為生色底物的對(duì)硝基苯磷酸鹽，以及(iii)-D-半乳糖苷酶(R-D-Gal)與生色底物或熒光底物。
本發(fā)明的變體還可用于體內(nèi)診斷性測(cè)定法。例如，將變體用放射性核素標(biāo)記以便可使用免疫閃爍照相法定位抗原或表達(dá)該抗原的細(xì)胞。
實(shí)施例提供如下實(shí)施例旨在說(shuō)明或進(jìn)一步圖解說(shuō)明本發(fā)明的某些優(yōu)選的實(shí)施方案和方面，并且不得解釋為限制其范圍。
在后續(xù)的試驗(yàn)性公開(kāi)中，使用如下縮寫N(正常)；M(摩爾濃度)；mM(毫摩爾濃度)；μM(微摩爾濃度)；mol(摩爾)；mmol(毫摩爾)；μmol(微摩爾)；nmol(納摩爾)；pmol(皮摩爾)；g(克)；mg(毫克)；ug(微克)；ng(納克)；l或L(升)；ml(毫升)；μl(微升)；cm(厘米)；mm(毫米)；μm(微米)；nm(納米)；DS(硫酸葡聚糖)和C(攝氏度)。
實(shí)施例1在ADCC測(cè)定法中篩選變體本實(shí)施例描述如何在ADCC測(cè)定法中篩選變體。所篩選的全部變體為抗CD20抗體(基于可變區(qū)特異性)。
i.PBMC(外周血單核細(xì)胞)分離從健康供者取得大約50mL外周血并用pH 7.0的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)1∶2稀釋。溫和旋轉(zhuǎn)試管混合該溶液。在已稀釋的血液樣品下小心鋪一層大約12ml的Histopaque-1077(Sigma目錄號(hào)No.1077-1)，隨后用吊桶式轉(zhuǎn)頭在Sorvall RT6000B離心機(jī)內(nèi)以1000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，同時(shí)關(guān)閉制動(dòng)。將梯度的上層相抽吸棄去，收集白色的含有PBMC的中間相，用Hanks平衡鹽溶液溶液(Gibco目錄號(hào)No.14025-092)洗滌3次。將洗滌后的細(xì)胞沉淀在20mL含有10％胎牛血清(FBS)(Omega Scientific目錄號(hào)FB-01)的RPMI 1640培養(yǎng)基中重懸。將重懸后的PBMC分置于兩個(gè)T-175培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，并向每個(gè)培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)添加30mL含有10％FBS的RPMI，隨后在5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)于37℃培養(yǎng)過(guò)夜。次日，將未粘附的PBMC收集至50mL Falcon管內(nèi)，離心同上并且在含1％FBS的無(wú)酚紅RPMI中重懸。將所重懸細(xì)胞的一小部分稀釋10倍并且用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)。將其余PBMC置于培養(yǎng)箱內(nèi)直至需要。
ii.靶細(xì)胞系(對(duì)于抗CD20ADCC測(cè)定法特異的細(xì)胞)表達(dá)CD20的B-細(xì)胞系Wil.2和SKW6.4自ATCC獲得并按推薦方式培養(yǎng)。在使用前一天，將細(xì)胞2分法分瓶。次日將細(xì)胞數(shù)調(diào)整至4×105細(xì)胞/mL并且將50μL等份(20,000細(xì)胞/孔)加入96孔組織培養(yǎng)板中。
iii.IgG稀釋液在篩選前，表達(dá)IgG變體并用標(biāo)準(zhǔn)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)定量。對(duì)于初級(jí)單點(diǎn)ADCC篩選，將IgG變體在含1％FBS的無(wú)酚紅RPMI培養(yǎng)基中稀釋。測(cè)定法中IgG的終濃度按4倍方式稀釋(即終濃度10ng/mL)。向靶細(xì)胞中加入50μl等份的IgG，并且在將效應(yīng)細(xì)胞加入已調(diào)理的靶細(xì)胞之前于37℃溫育大約15分鐘。
當(dāng)?shù)味↖gG時(shí)，IgG濃度在大約0.0001至1μg/mL范圍內(nèi)變動(dòng)。使用96孔微量滴定板，在含1％FBS的無(wú)酚紅RPMI培養(yǎng)基中稀釋樣品制備IgG稀釋液。隨后向含有靶細(xì)胞的測(cè)定法平板中加入已稀釋的IgG樣品。
iv.效應(yīng)細(xì)胞調(diào)整PBMC的濃度使效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞之比為10-20∶1(即2-4×106細(xì)胞/mL)。向每一個(gè)含有已調(diào)理靶細(xì)胞的孔內(nèi)加入100μl重懸的PBMC。將平板在存在5％CO2的情況下于37℃溫育3-4小時(shí)。
v.乳酸脫氫酶(LDH)釋放的檢測(cè)通過(guò)檢測(cè)從受損細(xì)胞的細(xì)胞漿釋放至培養(yǎng)上清液的乳酸脫氫酶來(lái)測(cè)定靶細(xì)胞裂解。在將調(diào)理的靶細(xì)胞與效應(yīng)細(xì)胞溫育后，將測(cè)定平板以2000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘。將大約75lμL的細(xì)胞培養(yǎng)上清液小心去除并避開(kāi)沉淀的細(xì)胞和殘片。向微量滴定板中直接加入該上清液，并且向該上清液中加入75μL的LDH檢測(cè)試劑(Roche目錄號(hào)1 644 793)。然后將微量滴定板溫育大約15-30分鐘，并用Molecular Devices的Vmax動(dòng)力學(xué)微孔滴定板讀數(shù)儀讀取490nm處的吸收度。
vi.數(shù)據(jù)分析所有單點(diǎn)ADCC篩選測(cè)定法一式二份進(jìn)行。每個(gè)測(cè)定平板含有自發(fā)靶細(xì)胞裂解對(duì)照、在無(wú)IgG時(shí)自發(fā)的效應(yīng)細(xì)胞和靶細(xì)胞裂解對(duì)照以及靶細(xì)胞全部裂解對(duì)照。向靶細(xì)胞中加入1％的Triton X-100實(shí)現(xiàn)靶細(xì)胞全部裂解。在每個(gè)測(cè)定平板中包含三個(gè)野生型對(duì)照并且將ADCC測(cè)定信號(hào)平均。從每個(gè)樣品中減去從自發(fā)裂解對(duì)照中所獲得的背景值。從每個(gè)樣品中減去從稀釋IgG得到的背景值?；谧园l(fā)裂解對(duì)照和全部裂解對(duì)照，將所述數(shù)據(jù)從吸收度值轉(zhuǎn)換為特異性裂解的百分?jǐn)?shù)。特異性裂解的百分?jǐn)?shù)用下式計(jì)算特異性裂解百分?jǐn)?shù)＝(試驗(yàn)A490-背景A490)/(最大A490-背景A490)×100，其中背景A490是從無(wú)IgG時(shí)的效應(yīng)細(xì)胞和靶細(xì)胞中所獲得的A490加上因粗提的IgG上清液中存在的污染性LDH所致的IgG背景總和。將Fc變體活性的百分?jǐn)?shù)相對(duì)于已平均的野生型對(duì)照進(jìn)行歸一化。將兩個(gè)測(cè)定平板的歸一化活性百分?jǐn)?shù)加以平均，并且對(duì)每個(gè)樣品計(jì)算各個(gè)測(cè)定平板間的標(biāo)準(zhǔn)差。
vii.結(jié)果相對(duì)ADCC比活性示于表2。如實(shí)施例4中所述，產(chǎn)生該表內(nèi)所報(bào)道的CDC值，并且如實(shí)施例5中所述，產(chǎn)生該表中所報(bào)道的FcRn結(jié)合測(cè)定值。
表2

圖7A顯示了滴定IgG變體后所獲得的代表性ADCC數(shù)據(jù)。在此實(shí)驗(yàn)中，用單氨基酸Fc區(qū)IgG變體和雙氨基酸Fc區(qū)IgG變體調(diào)理SKW6.4細(xì)胞，隨后以15∶1的比例加入PBMC。將測(cè)定平板在5％CO2存在情況下于37℃溫育3小時(shí)，然后離心。收集部分上清液并轉(zhuǎn)移至微量滴定板，通過(guò)加入等體積LDH底物測(cè)定上清液中的LDH活性。顯色后，讀取490nm處的吸收度。測(cè)量因粗提IgG上清液中存在的污染性LDH所致的背景，并且從原始A490中減去這些背景值，得到圖7A中所示的數(shù)據(jù)。這些數(shù)據(jù)顯示，與野生型抗CD20抗體相比，單氨基酸變體A330K、A330R和I332E的ADCC活性增強(qiáng)。而A330K或A330R與I332E的組合變體進(jìn)一步改善了ADCC活性。非特異性IgG在這些測(cè)定條件下沒(méi)有活性。其中糖基化被改變的類似測(cè)定法的結(jié)果示于圖7B中。具體而言，7B(標(biāo)記為GnTIII的樣品)顯示，I332變體的活性在糖基化作用改變后(例如通過(guò)提高等分性GlcNAc的含量)可進(jìn)一步增強(qiáng)。
圖8顯示了使用純化的IgG所獲得的代表性ADCC數(shù)據(jù)。該圖顯示了細(xì)胞毒性百分?jǐn)?shù)對(duì)非特異性IgG、野生型抗CD20以及Fc區(qū)變體I332D和I332E的IgG濃度。細(xì)胞毒性百分?jǐn)?shù)基于下式計(jì)算％細(xì)胞毒性＝(試驗(yàn)A490-背景A490)/(最大A490-背景90)×100，其中背景A490從無(wú)IgG時(shí)的效應(yīng)細(xì)胞和靶細(xì)胞中獲得。該數(shù)據(jù)顯示，I332D和I332E變體的活性較野生型增加。本實(shí)驗(yàn)中所用的靶細(xì)胞是SKW6.4，并且在標(biāo)準(zhǔn)3小時(shí)的ADCC測(cè)定法中使用15∶1的效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞比。
圖9顯示除了使用較低親和性可變區(qū)以外(AME 6F1，而不是AME33)相同類型的ADCC活性。此圖說(shuō)明，用該特定抗CD20特異性以及Wil-2和SKW6.4細(xì)胞系的ADCC活性獨(dú)立于可變區(qū)親和性。
圖10顯示FcγRI受體結(jié)合。在HEK-293A細(xì)胞中表達(dá)人FcγRI受體(CD64)的細(xì)胞外部分，其中加入了C末端6-his標(biāo)簽以替代假定的跨膜結(jié)構(gòu)域，并且使用Ni柱純化。該受體在ELISA平板上4℃包被過(guò)夜，隨后用Superblock封閉該平板。封閉和洗滌之后，制備IgG稀釋液并且加入到至受體包被的平板中，隨后于37℃溫育2小時(shí)。未結(jié)合的IgG通過(guò)洗滌去除并且用1∶1000的抗人κ堿性磷酸酶綴合的二級(jí)抗體檢測(cè)結(jié)合的抗體。洗滌后，通過(guò)加入磷酸酶底物(單磷酸酚酞)(PPMP)(JBL Scientific)檢測(cè)結(jié)合的IgG，用VMAX微孔板讀數(shù)儀(Molecular Devices，Sunnyvale，CA)比色測(cè)定560nm處的吸收度。將數(shù)據(jù)以IgG濃度的對(duì)數(shù)值對(duì)吸收度作圖。
實(shí)施例2在全血測(cè)定法中篩選損耗B細(xì)胞的變體本實(shí)施例描述了在全血測(cè)定法中篩選損耗B細(xì)胞的變體。
i.FcγRIIA基因分型用QiaAmp試劑盒(Qiagen，目錄號(hào)51104)從外周血液樣品中分離基因組DNA。通過(guò)使用引物(5’GGAAAATCCCAGAAATTCTCGC 3’-SEQ ID NO61)和(5’CAACAGCCTGACTACCTATTACGCGGG 3’-SEQ ID NO62)的PCR擴(kuò)增FcγRIIA。PCR產(chǎn)物用MinElute PCR純化試劑盒(Qiagen，目錄號(hào)28006)純化并用限制性酶BstUI于60℃消化12小時(shí)。已消化的樣品在3％瓊脂糖凝膠上分析。所有PCR產(chǎn)物在不依賴于H或R基因型的一個(gè)內(nèi)部BstUI位點(diǎn)被切割。擁有R等位基因的產(chǎn)物在額外一個(gè)BstUI位點(diǎn)處被切割。結(jié)果為出現(xiàn)一個(gè)337bp的片段則鑒定為H/H，出現(xiàn)337bp和316bp的兩個(gè)片段則鑒定為H/R且出現(xiàn)一個(gè)316bp的片段則鑒定為R/R。
ii.FcγRIIIA基因分型用QiaAmp試劑盒(Qiagen，目錄號(hào)51104)從外周血液樣品中分離基因組DNA。通過(guò)使用引物(5’ATATTTACAGAATGGCA3’-SEQIDNO63)和(5’GGTGATGTTCACAGTCTCTGAAGACACATTTTTACTGTCAA3’-SEQ ID NO64)的PCR擴(kuò)增FcγRIIIA。PCR產(chǎn)物用MinElute PCR純化試劑盒(Qiagen，目錄號(hào)28006)純化，并以限制性酶HincII于37℃消化16小時(shí)。已消化的樣品在3％的NuSieve瓊脂糖凝膠上分析。HincII切割V等位基因，但不切割F等位基因。因此F/F產(chǎn)生一個(gè)148bp的片段，F(xiàn)/V產(chǎn)生148、109和39bp的三個(gè)片段，而V/V產(chǎn)生109和39bp的兩個(gè)片段。
iii.B細(xì)胞損耗測(cè)定法(使用全血)從健康志愿者中抽取已肝素化的外周血。將血液與用FACS緩沖液(磷酸緩沖鹽水+2％胎牛血清)稀釋的變體、Rituxan或非特異性IgG(陰性對(duì)照)混合。將管于37℃溫育4小時(shí)，隨后以熒光素-抗CD45(鑒定白細(xì)胞)(BD，目錄號(hào)555482)和藻紅蛋血-抗CD19(鑒定B細(xì)胞)(BD，目錄號(hào)555413)室溫染色30分鐘。通過(guò)加入BD PharmLyse(BD，目錄號(hào)555899)裂解紅細(xì)胞，使用用于Becton Dickinson FACSort流式細(xì)胞儀的FACS緩沖液洗滌并重懸樣品。鄰近分析前，向樣品中添加終濃度為的0.1μg/ml碘化丙錠(PI)，以區(qū)分活細(xì)胞和死細(xì)胞。對(duì)照包含已與FACS緩沖液?jiǎn)为?dú)溫育的細(xì)胞、未染色的樣品、單一染色的樣品。每種樣品重復(fù)三次并且收集10,000個(gè)落入淋巴細(xì)胞前向/側(cè)向散射(FSC/SSC)門內(nèi)的PI-陰性事件。用WinMDI軟件分析數(shù)據(jù)。為了分析，基于CD45陽(yáng)性染色、PI陰性和FSC/SSC特征鑒定活淋巴細(xì)胞。在每個(gè)樣品中，鑒定具有這些特征的CD19+細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)。將數(shù)據(jù)表示為CD19+細(xì)胞百分?jǐn)?shù)平均值加/減1個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差。備選地，為了便于在供者間比較，將數(shù)據(jù)表示為剩余的起始CD19+細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)，即(處理后剩余的CD19+淋巴細(xì)胞的百分?jǐn)?shù))/(在FACS緩沖液處理后樣品中的CD19+淋巴細(xì)胞的百分?jǐn)?shù))×100％。
圖12顯示代表性B細(xì)胞損耗數(shù)據(jù)，表明I332E變體在含有W(高親和性)基因型的FcγRIIIa受體的全血樣品中較Rituxan更有力地并且更大程度地?fù)p耗B細(xì)胞。
圖13顯示代表性B細(xì)胞損耗數(shù)據(jù)，表明I332E變體在含有FF(低親和性)基因型的FcγRIIIa受體的全血樣品中較Rituxan更有力地并且更大程度地?fù)p耗B細(xì)胞。當(dāng)用表現(xiàn)為受體VF(雜合)基因型FcγRIIIa受體或HH、HR或RR基因型FcγRIIa受體的全血實(shí)施該測(cè)定時(shí)，獲得了類似結(jié)果(表3)。
表3.在最大損耗時(shí)剩余B細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)


圖14顯示代表性B細(xì)胞損耗數(shù)據(jù)，表明與在體外ADCC和CDC測(cè)定法中具有相等或更強(qiáng)活性的變體相比，A378D變體出乎意料地更有力且更大程度地?fù)p耗B細(xì)胞。
實(shí)施例3變體的親和性測(cè)定本實(shí)施例描述如何測(cè)定FcγRIIIa(FF基因型)與野生型或者母體Fc以及變體I332E之間相互作用的親和性(Kd)。
i.FcγRIIIa/IgG Kd分析在293細(xì)胞中表達(dá)人FcγRIIIa(158F)可溶性細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域并通過(guò)Ni-NTA樹(shù)脂(結(jié)合在其中所設(shè)計(jì)的6-組氨酸標(biāo)簽)純化。
在pH 9.3碳酸氫鈉緩沖液中將一管Azlactone珠(Sapidyne)與1mg的FcγRIII(158F)偶聯(lián)。該漿液于4℃翻動(dòng)過(guò)夜，用PBS洗滌兩遍，并且用封閉緩沖液(1M Tris pH 7.4+1％BSA)室溫封閉1小時(shí)。隨后將該珠用PBS洗滌三次并且在50ml含0.01％疊氮化物的PBS中重懸。在運(yùn)行緩沖液(PBS pH 7.4，0.1％BSA，0.01％疊氮化物)中制備均含有7.5nMIgG和滴定為4μM至1.95nM的FcγRIII的12個(gè)平衡物并且在室溫平衡16小時(shí)。所有實(shí)驗(yàn)均在室溫的運(yùn)行緩沖液中進(jìn)行，流速0.5ml/分。在裝置的流動(dòng)室中裝填FcγRIII珠后，從第一個(gè)平衡物中捕獲游離IgG。然后洗滌所述珠子并且用山羊抗人Fc(Fab’)2-FITC綴合物(JacksonImmunochemicals)檢測(cè)所結(jié)合的IgG。隨后對(duì)剩余11個(gè)平衡物重復(fù)實(shí)施該過(guò)程并且用Kinexa Pro軟件分析測(cè)定Kd。利用這種方法，所測(cè)定的FcγRIIIa(FF基因型)與野生型或母體Fc間相互作用的親和性為387nM，而與變體I332E的親和性是52nM。糖化設(shè)計(jì)的抗體(GnTIII)的Kd是83nM，而組合變體(L256P、I332E)的Kd為21nM。
實(shí)施例4變體CDC活性的表征本實(shí)施例描述如何測(cè)定多種Fc區(qū)變體的CDC活性。
i.測(cè)定法本測(cè)定法使用人補(bǔ)體(Quidel Corp.，目錄號(hào)A113)在Ramos(RA#1)細(xì)胞(ATCC目錄號(hào)CRL-1596)上實(shí)施。Ramos細(xì)胞在37℃和5％CO2條件下于含有10％FBS的Gibco RPMl1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)。分析前一天，將細(xì)胞以1×106個(gè)細(xì)胞接種于T175瓶。次日，將細(xì)胞在含有1％FBS的無(wú)酚紅RPMI1640中重懸至3.57×105細(xì)胞/ml。向Costar 3917平底培養(yǎng)板內(nèi)每孔中加入70μl的細(xì)胞。對(duì)于滴定曲線，在RPMI1640培養(yǎng)基中進(jìn)行3倍系列稀釋來(lái)準(zhǔn)備變體IgG。對(duì)于單點(diǎn)文庫(kù)篩選測(cè)定法，將培養(yǎng)物上清液內(nèi)瞬時(shí)表達(dá)的IgG變體在模仿培養(yǎng)基中標(biāo)準(zhǔn)化至1μg/ml。向靶細(xì)胞添加30微升變體IgG(即終濃度200ng/ml)和以1∶5稀釋于RPMI1640+1％FBS中的50μl人補(bǔ)體(Quidel Corp.，目錄號(hào)A113)，并且用移管溫和吹吸充分混合。將該平板在5％CO2存在下于37℃溫育1.5小時(shí)。加入15μl/孔Alamar藍(lán)(Serotec，目錄號(hào)BUF012B)后，繼續(xù)溫育過(guò)夜。次日早晨，用PerkinElmer的EnVision 2100多重標(biāo)記讀數(shù)儀以560nm激發(fā)光和590nm發(fā)射光測(cè)量熒光信號(hào)。
ii.數(shù)據(jù)分析所有的單點(diǎn)測(cè)定法重復(fù)兩次實(shí)施。每個(gè)測(cè)定培養(yǎng)板含有無(wú)IgG時(shí)由人補(bǔ)體所致的自發(fā)靶細(xì)胞裂解對(duì)照和存在1％Triton X-100時(shí)靶細(xì)胞的最大裂解對(duì)照。每個(gè)測(cè)定培養(yǎng)板內(nèi)包含三個(gè)野生型對(duì)照，并且將CDC測(cè)定信號(hào)平均。從每個(gè)樣品中減去從自發(fā)裂解對(duì)照所獲得的背景值。基于自發(fā)裂解對(duì)照和最大裂解對(duì)照，將數(shù)據(jù)從熒光信號(hào)轉(zhuǎn)化為特異性裂解百分?jǐn)?shù)。從下式計(jì)算特異性裂解百分?jǐn)?shù)特異性裂解百分?jǐn)?shù)＝(試驗(yàn)熒光信號(hào)-自發(fā)信號(hào))/(最大裂解信號(hào)-天然信號(hào))×100。隨后計(jì)算Fc變體超過(guò)三個(gè)野生型對(duì)照平均值的活性百分?jǐn)?shù)。將兩次測(cè)定培養(yǎng)板中的超過(guò)野生型的百分活性加以平均并且計(jì)算各個(gè)測(cè)定培養(yǎng)板之間的標(biāo)準(zhǔn)差。
圖11A、B和C顯示在IgG變體滴定后所獲得的代表性CDC數(shù)據(jù)。在本實(shí)驗(yàn)中，用單一氨基酸Fc區(qū)IgG變體或雙氨基酸Fc區(qū)IgG變體和人補(bǔ)體裂解Romas細(xì)胞。將測(cè)定培養(yǎng)板在5％CO2存在下于37℃溫育1.5小時(shí)，隨后加入15μl Alamar藍(lán)并溫育過(guò)夜。測(cè)量熒光信號(hào)并且對(duì)IgG濃度作圖。這些數(shù)據(jù)顯示，與野生型抗CD20抗體相比，CDC活性在單氨基酸變體I332D、I332E(圖11A)的情況下稍稍增強(qiáng)，并且在T256P和S440Y(圖11B)以及T256P和I332E組合(圖11C)的情況下顯著增強(qiáng)。在變體A378D的情況下CDC活性減弱(圖11C和表2)。
實(shí)施例5對(duì)FcRn結(jié)合的表征本實(shí)施例描述用于Fc新生兒受體(FcRn)結(jié)合變體IgG的測(cè)定法。于4℃下，用溶于50mM碳酸鹽緩沖液(pH 9.3)中的2μg/ml中性鏈親和素(Pierce Biotechnology，目錄號(hào)31000)以每孔50μl將U形底96孔ELISA平板包被過(guò)夜。移去未結(jié)合的中性鏈親和素并且用PBST(含有0.1％Tween 20的PBS)洗滌平板三次。向每孔中加入50μl的2.5μg/ml(溶于PBS)的生物素標(biāo)記的可溶性FcRn并且室溫溫育1小時(shí)。隨后向平板中加入75μl酪蛋白封閉緩沖液(Pierce Biotechnology，目錄號(hào)37528)封閉1小時(shí)。隨后用PBST洗滌ELISA板并且與50μl/孔的變體IgG溫育。對(duì)于滴定曲線，在FcRn結(jié)合緩沖液(不同pH(從6.0至7.4)的100mMNaPO4，0.05％Tween-20)中3倍系列稀釋準(zhǔn)備變體IgG。對(duì)于單點(diǎn)篩選，將培養(yǎng)物上清液中瞬時(shí)表達(dá)的變體IgG歸一化至50ng/ml(對(duì)于pH 7.4結(jié)合為200ng/ml)并用FcRn結(jié)合緩沖液調(diào)整pH至6.0。在以下步驟中，使用相應(yīng)pH的FcRn結(jié)合緩沖液洗滌平板和稀釋試劑。室溫進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)1小時(shí)。三次洗滌之后，用山羊(Fab’)2抗人-Fab-HRP綴合物檢測(cè)已結(jié)合的IgG 1小時(shí)。HRP活性在Pierce的HRP底物(TurboTMB-ELISA，目錄號(hào)34022)中顯色5-30分鐘。加入50μl的2M H2SO4終止反應(yīng)并且用VMAX微量滴定板讀數(shù)儀(Molecular Devices)讀取450nm處的吸收度。
實(shí)施例6抗CD20-I332E Fc變體的人體治療體外研究和鼠腫瘤模型(Clynes RA，等Nat Med.6443(2000))提供了ADCC在抗CD20抗體(如RITUXAN)的抗腫瘤效應(yīng)中起作用的證據(jù)?？捎每笴D20-I332E Fc變體抗體(圖15和16)或RITUXAN以與Cartron等，Blood 99754(2002)(此處引用作為參考)中所公開(kāi)類似的方式治療人類患者。例如，表現(xiàn)為Ann-Arbor分類中第II至IV期疾病的患者(具有至少一個(gè)可測(cè)量的疾病位點(diǎn)，并且根據(jù)GELF標(biāo)準(zhǔn)具有低的腫瘤負(fù)荷)可通過(guò)靜脈內(nèi)輸注(第1、8、15和22天)總共4次大約375mg/m2劑量的抗CD20-I332E Fc變體或RITUXAN來(lái)治療。主要的功效終點(diǎn)是目標(biāo)反應(yīng)率，即根據(jù)最近由國(guó)際專家委員會(huì)提出的標(biāo)準(zhǔn)，實(shí)現(xiàn)完全緩解(CR)、未證實(shí)的CR(Cru)或部分反應(yīng)(PR)的患者比例。臨床反應(yīng)可在第2個(gè)月(M2)進(jìn)行評(píng)估。還可在一年時(shí)(M12)在患者中評(píng)估進(jìn)程。
可將RITUXAN或抗CD20-I332E治療的患者在M2和M12時(shí)的目標(biāo)反應(yīng)率進(jìn)行比較，以致于可定量由I332E變體所提供的改善的ADCC活性。該實(shí)施例可用其他抗CD20變體(例如I332D、P247L A330K、A339T、A378D或如表1中所示組合)重復(fù)。
另外，變體的增強(qiáng)功效允許進(jìn)行不同途徑施用、較低頻率注射和/或較小劑量施用。
將以上說(shuō)明書中所提到的全部出版物和專利在此處引用作為參考。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言顯而易見(jiàn)，本發(fā)明中所述方法和系統(tǒng)的多種修改和變化并未脫離本發(fā)明的范圍和構(gòu)思。雖然本發(fā)明已經(jīng)通過(guò)特定優(yōu)選的實(shí)施方案得以描述，應(yīng)當(dāng)理解如所要求的本發(fā)明不應(yīng)當(dāng)過(guò)分地受限于此類特定的實(shí)施方案。實(shí)際上，為實(shí)施本發(fā)明對(duì)已描述模式的多種修改(其對(duì)化學(xué)、分子生物學(xué)或相關(guān)領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見(jiàn)的)將處于如下的權(quán)利要求范圍內(nèi)。
序列表序列表<110>應(yīng)用分子進(jìn)化公司(Applied Molecular Evolution)<120>Fc區(qū)變體<130>X-16757<150>60/535,764<151>2004-01-12<160>56<170>PatentIn版本3.3<210>1<211>218<212>PRT<213>人<400>1Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro1 5 10 15Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys20 25 30Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp35 40 45Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu50 55 60Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu65 70 75 80His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn85 90 95Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly100 105 110Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu115 120 125Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr130 135 140
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100 105 110Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu115 120 125Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr130 135 140Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Ser Gly Gln Pro Glu Asn145 150 155 160Asn Tyr Asn Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe165 170 175Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn180 185 190Ile Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr195 200 205Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys210 215<210>4<211>218<212>PRT<213>人<400>4Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro1 5 l0 15Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys20 25 30Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp35 40 45Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu50 55 60Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu65 70 75 80
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn85 90 95Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly100 105 110Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu115 120 125Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr130 135 140Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glx Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn145 150 155 160Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe165 170 175Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn180 185 190Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr195 200 205Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys210 215<210>5<211>215<212>PRT<213>鼠<400>5Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys1 5 10 15Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val20 25 30Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp35 40 45Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe50 55 60
Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp65 70 75 80Cys Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe85 90 95Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys100 105 110Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys115 120 125Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp130 135 140Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys145 150 155 160Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser165 170 175Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr180 185 190Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser195 200 205Leu Ser His Ser Pro Gly Lys210 215<210>6<211>218<212>PRT<213>鼠<400>6Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro1 5 10 15Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys20 25 30Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp35 40 45
Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg50 55 60Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln65 70 75 80His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn85 90 95Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly100 105 110Ser Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu115 120 125Met Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met130 135 140Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu145 150 155 160Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe165 170 175Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn180 185 190Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val His Glu Gly Leu His Asn His His Thr195 200 205Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly Lys210 215<210>7<211>218<212>PRT<213>鼠<400>7Pro Ala Pro Asn Leu Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro1 5 10 15Asn Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys
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<400>33gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc60ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca tgc 93<210>34<211>87<212>DNA<213>人<400>34gtggtggtgg acgtgagcca cgaagaccct gaggtcaagt tcaactggta cgtggacggc60gtggaggtgc ataatgccaa gacaaag87<210>35<211>90<212>DNA<213>人<400>35tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa60gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc 90<210>36<211>69<212>DNA<213>人<400>36tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacgc agaagagcct ctccctgtct60ccgggtaaa69<210>37<211>66<212>DNA<213>人<400>37tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag60ccggag 66<210>38<211>93<212>DNA<213>人<400>38gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc ttcctcttcc ccccaaaaca caaggacacc60
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權(quán)利要求
1.一種包含母體人Fc區(qū)變體或其部分的抗體，其中與母體Fc區(qū)相比，變體包含至少一處氨基酸替代，并且其中氨基酸替代位于對(duì)應(yīng)于選自如下的人Fc序列的位置247、251、256、268、280、330、332、339、378和440。
2.權(quán)利要求1所述的抗體，其中替代選自247L、247H、247I、251F、256M、256P、258E、268D、280A、280K、330K、330R、332E、332D、332K、332R、339T、378D和440Y。
3.權(quán)利要求1所述的抗體，其中在變體Fc區(qū)內(nèi)的至少一處氨基酸替代位于對(duì)應(yīng)于人Fc序列的332位置。
4.權(quán)利要求3所述的抗體，其中替代選自332E、332D、332K和332R。
5.權(quán)利要求1所述的抗體，其中在變體Fc區(qū)內(nèi)的至少一處氨基酸替代是378D。
6.權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的抗體，其中在效應(yīng)細(xì)胞存在時(shí)，包含母體Fc區(qū)變體的抗體比包含母體Fc區(qū)的抗體更有效地介導(dǎo)抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用(ADCC)。
7.權(quán)利要求6所述的抗體，其中在同一測(cè)定法中，當(dāng)包含母體Fc區(qū)的抗體表現(xiàn)為100的相對(duì)ADCC比活性時(shí)，包含變體Fc區(qū)的抗體表現(xiàn)出大于100的相對(duì)ADCC比活性值。
8.權(quán)利要求6所述的抗體，其中在同一測(cè)定法中，當(dāng)包含母體Fc區(qū)的抗體表現(xiàn)為100的相對(duì)ADCC比活性時(shí)，包含變體Fc區(qū)的抗體表現(xiàn)出小于100的相對(duì)ADCC比活性值。
9.權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的抗體，其中包含母體Fc區(qū)變體的抗體比包含母體Fc區(qū)的抗體更有效地介導(dǎo)補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒作用(CDC)。
10.權(quán)利要求9所述的抗體，其中在同一測(cè)定法中，當(dāng)包含母體Fc區(qū)的抗體顯示為100的相對(duì)CDC比活性時(shí)，包含母體Fc區(qū)變體的抗體表現(xiàn)出大于100的相對(duì)CDC比活性值。
11.權(quán)利要求9所述的抗體，其中在同一測(cè)定法中，當(dāng)包含母體Fc區(qū)的抗體表現(xiàn)為100的相對(duì)CDC比活性時(shí)，包含母體Fc區(qū)變體的抗體表現(xiàn)出小于100的相對(duì)CDC比活性值。
12.權(quán)利要求1-11中任一項(xiàng)所述的抗體，其中母體Fc區(qū)是選自IgG、IgM、IgA、IgD和IgE的一類。
13.權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)所述的抗體，其中母體Fc區(qū)是選自IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的一個(gè)亞類。
14.權(quán)利要求1-13中任一項(xiàng)所述的抗體，其中抗體是單克隆抗體。
15.權(quán)利要求14所述的單克隆抗體，其中單克隆抗體包含兩條相同的重鏈多肽和兩條相同的輕鏈多肽。
16.權(quán)利要求1-15中任一項(xiàng)所述的抗體，其中抗體與人CD20特異性結(jié)合。
17.一種單克隆抗體，其中單克隆抗體包含輕鏈多肽，并且其中輕鏈多肽包含具有SEQ ID NO57中所示序列的多肽。
18.權(quán)利要求17所述的單克隆抗體，其還包含重鏈多肽，其中重鏈多肽包含具有SEQ ID NO58中所示序列的多肽。
19.包含權(quán)利要求1-18中任一項(xiàng)所述抗體的藥物組合物。
全文摘要
本發(fā)明提供多肽Fc區(qū)變體和編碼Fc區(qū)變體的寡核苷酸。具體而言，本發(fā)明提供包含新Fc區(qū)變體的組合物、鑒定有用Fc區(qū)變體的方法以及應(yīng)用Fc區(qū)變體治療疾病的方法。
文檔編號(hào)A61K39/395GK1918178SQ200580004924
公開(kāi)日2007年2月21日 申請(qǐng)日期2005年1月10日 優(yōu)先權(quán)日2004年1月12日
發(fā)明者B·W·艾倫, D·M·馬奎斯, Y·唐, J·D·沃特金斯 申請(qǐng)人:應(yīng)用分子進(jìn)化公司