專利名稱：豆甾烷－3,5,6－三醇及其衍生物用于制備抗病毒藥物的用途以及新的豆甾烷－3,5,6 ...的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及豆甾醇衍生物用于制備抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物的用途，更具體地，本發(fā)明涉及豆甾烷-3，5，6-三醇及其衍生物用于制備抗艾滋病毒(HIV)和抗乙型肝類(lèi)病毒(HBV)的藥物的用途。本發(fā)明還涉及含有豆甾烷-3，5，6-三醇及其衍生物的藥物組合物以及使用豆甾烷-3，5，6-三醇及其衍生物治療艾滋病和乙型肝炎的方法。
背景技術(shù)：
HIV感染已對(duì)我國(guó)人們的健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅。HIV感染者在1989年后急劇上升，到目前為止，為84萬(wàn)，其中艾滋病患者8萬(wàn)，艾滋病死亡人數(shù)已達(dá)22萬(wàn)。其疫情特點(diǎn)是持續(xù)增長(zhǎng)，流行呈聚集性分布，擴(kuò)散跡象形成。專家推測(cè)到2010年將達(dá)到1000萬(wàn)人。
目前，抗HIV藥物研究的重點(diǎn)為融合抑制劑、逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑、蛋白酶抑制劑及整合酶抑制。雖然已有10余種藥物可以有效地緩解癥狀，延長(zhǎng)病程，但仍存在很多問(wèn)題，如不能徹底清除體內(nèi)病毒、停藥反彈、易產(chǎn)生耐藥性、副作用大及每年的昂貴費(fèi)用，使得這些藥物的應(yīng)用受到很大限制。特別是占全球感染者90％以上的廣大發(fā)展中國(guó)家的感染者根本無(wú)法接受治療。因此，進(jìn)一步研制和開(kāi)發(fā)低毒有效甚至能夠清除病毒的抗病毒藥物仍是一項(xiàng)迫切而艱巨的任務(wù)。
式I豆甾烷-3，5，6-三醇為已知化合物，
但到目前為止，關(guān)于其本身及其衍生物在抗逆轉(zhuǎn)錄病毒，尤其是抗HIV病毒和抗HBV病毒方面的用途尚未見(jiàn)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明人在研究中出人意料地發(fā)現(xiàn)具有下式II的豆甾烷-3，5，6-三醇衍生物在抑制HIV病毒和HBV病毒方面顯示出良好的活性。
因此，本發(fā)明的第一方面涉及式II豆甾烷-3，5，6-三醇及其衍生物用于制備抗HIV病毒的藥物的用途 其中，R1，R2和R3相同或不同，各自獨(dú)立地為H、C1-C6烷基、C1-C6烷?；7-C11芳?；⑵咸烟?、半乳糖、甘露糖、鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、核糖、果糖，
R4為具有以下結(jié)構(gòu)的基團(tuán) 本發(fā)明的第二個(gè)方面涉及上述式II豆甾烷-3，5，6-三醇及其衍生物用于制備抗乙型肝炎病毒的藥物的用途。
本發(fā)明的第三個(gè)方面涉及新的式II豆甾烷-3，5，6-三醇衍生物 其中，R1，R2和R3相同或不同，各自獨(dú)立地為H，C1-C6烷基，C1-C6烷?；?，C7-C11芳酰基，葡萄糖，半乳糖，甘露糖，鼠李糖，阿拉伯糖，木糖，核糖，果糖，R4為具有以下結(jié)構(gòu)的基團(tuán) 條件是，當(dāng)R1，R2和R3同時(shí)為H時(shí)，R4不為 本發(fā)明的第四個(gè)方面涉及含有式II豆甾烷-3，5，6-三醇及其衍生物以及一種或多種藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物。
本發(fā)明的第五個(gè)方面涉及治療艾滋病和乙型肝炎的方法，該方法包括給予需要治療的對(duì)象治療有效量的式I或式II化合物。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式，在式III豆甾烷-3，5，6-三醇衍生物中，R1，R2和R3相同或不同，為乙?；?、丙?；⒍□；虮郊柞；?br> 活性成分的提取根據(jù)本發(fā)明，式I豆甾烷-3，5，6-三醇是已知化合物，其可通過(guò)本領(lǐng)域已知方法得到，例如可以通過(guò)以下方法獲得用95％的乙醇加熱回流提取杜仲，減壓濃縮后的浸膏采用不同極性的溶劑依次進(jìn)行提取，對(duì)其中的乙酸乙酯部分進(jìn)行純化，以石油醚氯仿系統(tǒng)進(jìn)行梯度洗脫，收集有關(guān)餾分，即可得到豆甾烷-3，5，6-三醇。
抗病毒活性研究采用HIV病毒感染的MT4細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，以病毒引起的合胞體的產(chǎn)生為評(píng)價(jià)指標(biāo)，觀察藥物的作用。研究發(fā)現(xiàn)，式I豆甾烷-3，5，6-三醇及其衍生物可以有效地保護(hù)病毒感染的細(xì)胞，使其不產(chǎn)生病變，并且效果顯著，IC50值為9.38μg.ml-1，從而首次發(fā)現(xiàn)豆甾烷-3，5，6-三醇及其衍生物具有抗HIV作用。另外，采用HepG 2.2215細(xì)胞系對(duì)豆甾烷-3，5，6-三醇及其衍生物的抗HBV活性進(jìn)行了測(cè)定。


圖1和圖2顯示了正常的MT4細(xì)胞。
圖3和圖4顯示了被HIV感染的MT4細(xì)胞。
圖5顯示了豆甾烷-3，5，6-三醇對(duì)于被HIV感染的MT4細(xì)胞的抗細(xì)胞病理作用。
具體實(shí)施例方式
儀器與材料MSZabspec高分辨質(zhì)譜儀(Micromass公司)。
NMRJNM-ECA-400超導(dǎo)核磁共振儀(日本電子株式會(huì)社)，TMS為內(nèi)標(biāo)。
VarianUNITYINOVA600超導(dǎo)核磁共振儀。
熔點(diǎn)儀RY-1熔點(diǎn)儀(天津市分析儀器廠)。
硅膠薄層層析用硅膠H、HF254(青島海洋化工廠)。
纖維素板Merk公司。
薄層顯色紫外燈254，366nm，碘蒸汽、1％FeCl3醇溶液。
藥材來(lái)源中藥杜仲皮，購(gòu)自廣州南方醫(yī)院中藥房。
實(shí)施例1 豆甾烷-3，5，6-三醇的提取、分離和結(jié)構(gòu)鑒定將藥材(10Kg)用95％乙醇加熱回流提取三次，合并提取液，減壓濃縮至干，得浸膏736g。將浸膏溶于水中，必要時(shí)加熱使其完全溶解。采用不同極性的溶液依次進(jìn)行萃取，分為石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、水四個(gè)部分，對(duì)乙酸乙酯部分進(jìn)行純化分離。用石油醚-氯仿系統(tǒng)(50∶1-5∶1)作洗脫劑進(jìn)行硅膠柱層析，收集第14-24餾分，合并后在甲醇中析出白色片狀結(jié)晶，mp249-252℃，稱為式I化合物。
上述白色片狀結(jié)晶的Libermann-Burchard反應(yīng)呈陽(yáng)性，EI-MS給出分子離子峰M/Z 448(M+)，結(jié)合13C-DEPT和1HNMR確定分子組成C29H52O3，不飽和度為4，13C-DEPT顯示29個(gè)碳信號(hào)，其中在δ60-80區(qū)域有2個(gè)連氧叔碳(CH)δ65.63和74.22，一個(gè)連氧季碳δ75.85。EI-MS譜上可見(jiàn)連續(xù)脫水的碎片峰M/Z 430.2(M-H2O，100)，412.2(M-2H2O，74)，上述數(shù)據(jù)表明為甾醇類(lèi)化合物。進(jìn)一步根據(jù)EI-MS譜所示有失去C17側(cè)鏈的離子峰M/Z290(M-H2O-C10H20，26)，271(M-2H2O-C10H21，22)，說(shuō)明該化合物為具有10個(gè)飽和碳的側(cè)鏈，這與豆甾烷類(lèi)化合物的質(zhì)譜裂解規(guī)律基本吻合，故將化合物13C-DEPT和1H-NMR與類(lèi)似母核的豆甾烷醇類(lèi)化合物進(jìn)行比較歸屬，化合物的EI-MS，1HNMR，13CNMR與文獻(xiàn)報(bào)道的豆甾烷-3，5，6-三醇基本吻合(蔡雄，譚小秋，潘德濟(jì)，等.玉柏石松的甾體成分研究.中草藥，1989，744；Deshmane.S.S，Sukh Dev.High Isoprenoids-II Triterpenoidsand Steroids of Saccharum Officinarum.Tetrahedron，1971，271109-1118；Zhao M，Duan J.A，Huang WZ，et al.Steroids andAnthraquinones from Astragalus hoantchy.Journal of ChinaPharmaceutical University，2003，34(3)216；以及于德泉，楊峻山，分析化學(xué)手冊(cè)(7)化學(xué)工業(yè)出版社，2002，891)，故確定式I化合物為具有以下結(jié)構(gòu)的豆甾烷-3，5，6-三醇。
式I化合物的波譜數(shù)據(jù)EI-MS(M/Z，％)456(M+，2)，438(2)，300(4)，248(100)，235(4)，207(40)，203(50)，189(17)，133(51)。
1H-NMR(DMSO-d6，600Hz)δppm 0.65(3H，s，18-H)，1.02(3H，s，19-H)，3.61(1H，s，3-H)，3.80(1H，m，3-H)，4.37，4.13(1H，1H，d，d，J＝4.2H z，6.0Hz，5-OH，6-OH)，3.61(1H，s，5-OH)13C-NMR(DMSO-d6)δppm 39.03(C-1)，30.98(C-2)，65.63(C-3)，31.89(C-4)，74.22(C-5)，75.85(C-6)，42.17(C-7)，29.90(C-8)，45.02(C-9)，35.47(C-10)，20.62(C-11)，40.82(C-12)，39.02(C-13)，55.57(C-14)，23.78(C-15)，27.78(C-16)，55.77(C-17)，11.68(C-18)，16.19(C-19)，37.69(C-20)，18.50(C-21)，33.25(C-22)，25.47(C-23)，44.46(C-24)，28.62(C-25)，19.62(C-26)，18.85(C-27)，22.52(C-28)，11.82(C-29)。
實(shí)施例2 式I化合物抗HIV作用研究材料與方法藥物將實(shí)施例1中所得的式I化合物樣品用DMSO溶解，以DMSO二倍稀釋成六個(gè)濃度。對(duì)照藥物AZT購(gòu)自Sigma公司。
試劑DMSO軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院進(jìn)口分裝；RPMI-1640培養(yǎng)基Invitrogen公司；小牛血清杭州四季青生物工程材料有限公司。
細(xì)胞和病毒MT4細(xì)胞株引自日本；HIV-1 IIIB引自美國(guó)。
病毒毒力測(cè)定10倍稀釋8個(gè)濃度HIV在RPMI-1640培養(yǎng)液中觀察細(xì)胞病變，計(jì)算TCID50為10-6。
式I化合物對(duì)細(xì)胞的毒性測(cè)定按照文獻(xiàn)(Rudi Pauwels，Jan Balzarini，Masanori Baba，etal.Rapid and automated tetrazolium-based colorimetric assay forthe detection of anti-HIV compounds.J Virol Meth，1988，20309)描述的方法，將MT4細(xì)胞2×105個(gè)/ml接種于96孔板中，0.1ml/孔，加入驗(yàn)證化合物，驗(yàn)證化合物二倍稀釋為1000μg/ml-7.8μg/ml，陽(yáng)性對(duì)照藥AZT三倍稀釋為500μg/ml-6.3μg/ml，每個(gè)濃度接種3孔，同時(shí)設(shè)正常細(xì)胞對(duì)照，DMSO溶劑對(duì)照及空白MT4細(xì)胞對(duì)照(不加病毒)，置37℃5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)6天。MTT法測(cè)定細(xì)胞活性，確定CC50值。
式I化合物對(duì)HIV誘導(dǎo)的MT4細(xì)胞病變的抑制作用按照文獻(xiàn)(陳春英，黃學(xué)華，周井炎等，硫酸酯化箬葉多糖的結(jié)構(gòu)修飾及其抗艾滋病病毒作用，藥學(xué)學(xué)報(bào)，1998，33264)所述方法，將MT4細(xì)胞2×105個(gè)/ml接種于96孔板中，0.1ml/孔，分別加入1000TCID50的HIV病毒100μl，同時(shí)設(shè)正常細(xì)胞對(duì)照和病毒對(duì)照，然后分別加入成倍稀釋五個(gè)濃度的樣品及AZT 100μl，每個(gè)樣品濃度設(shè)三個(gè)平行孔，置37℃ 5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，72小時(shí)后在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞病變(CPE)。CPE判定標(biāo)準(zhǔn)無(wú)合胞體形成“-”，無(wú)合胞體形成但細(xì)胞不規(guī)則“±”，有合胞體形成“+”。
IC50的判定(1)只一復(fù)孔為“+”，另兩復(fù)孔為“-”或“-”與“±”，此藥物濃度可視為IC50。
(2)三復(fù)孔分別為“+”，“-”與“±”，此藥物濃度可視為IC50。
(3)三復(fù)孔均為“±”，此藥物濃度可視為IC50。
(4)三復(fù)孔均為“+”，下一個(gè)濃度作用下的三復(fù)孔均為“-”，兩個(gè)濃度的中間值可視為IC50。
選擇指數(shù)(SI)CC50/IC50。
結(jié)果HIV誘導(dǎo)MT4細(xì)胞病變模型的建立正常MT4細(xì)胞為懸浮細(xì)胞，呈聚集狀生長(zhǎng)，邊界清晰，折光性好(圖1和2)。HIV感染細(xì)胞3天，有合胞體產(chǎn)生，但細(xì)胞活性基本正常(圖3)。HIV感染細(xì)胞第7天，細(xì)胞出現(xiàn)死亡，合胞體產(chǎn)生，有大的空泡出現(xiàn)(圖4)，說(shuō)明細(xì)胞病變明顯。
式I化合物抑制細(xì)胞病變作用及細(xì)胞毒性結(jié)果顯示，式I化合物的抗HIV作用顯著，抑制細(xì)胞病變的IC50值為9.38μg/ml(表1)。細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)顯示，該化合物的CC50值大于1000μg/ml。并且，式I化合物的SI值大于50，說(shuō)明其抗HIV作用強(qiáng)。
表1.在HIV-1/MT4培養(yǎng)體系中的式I化合物對(duì)于HIV-1誘導(dǎo)的CPE的抑制作用

由抑制細(xì)胞病變結(jié)果可見(jiàn)，式I化合物對(duì)細(xì)胞病變具有顯著的抑制作用。加藥后第三天，未見(jiàn)有病變產(chǎn)生，細(xì)胞狀態(tài)好，與正常對(duì)照組無(wú)差別。加藥第7天觀察，未見(jiàn)有細(xì)胞病變產(chǎn)生，細(xì)胞呈簇狀生長(zhǎng)，邊界光滑，且細(xì)胞活性好于正常對(duì)照組細(xì)胞(圖5)。
實(shí)施例3 式I化合物的抗HBV作用研究材料和方法藥物將實(shí)施例1所得的式I化合物樣品用DMSO溶解，以DMSO二倍稀釋成六個(gè)濃度。對(duì)照藥物GS101(阿昔洛韋)由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院二所提供。
細(xì)胞培養(yǎng)HepG2.2215細(xì)胞系為HBV DNA克隆轉(zhuǎn)染的人肝癌細(xì)胞(HepG2)，由美國(guó)Mount Sinai醫(yī)學(xué)中心構(gòu)建，軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院引進(jìn)，用含10％胎牛血清、谷胺酰胺、100μg.ml-1青霉素、100μg.ml-1鏈霉素、100μg.ml-1卡那霉素的MEM培養(yǎng)液培養(yǎng)。定期用含380μg.ml-1G418的培養(yǎng)液篩選。選取生長(zhǎng)良好的HepG2.2215細(xì)胞，用胰蛋白酶消化成單細(xì)胞懸液，濃度為1×105個(gè).L-1。懸液接種于96孔培養(yǎng)板中，正常培養(yǎng)48小時(shí)后加入含有不同濃度藥物的培養(yǎng)液，培養(yǎng)4d后更換含相同藥物濃度的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)4d。收集8d細(xì)胞上清檢測(cè)HBsAg、HBeAg及細(xì)胞存活率。
試劑HBsAg、HBeAg ELISA檢測(cè)試劑盒，HBV DNA PCR檢測(cè)試劑盒(北京華美生物工程有限公司)；噻唑藍(lán)(MTT)；胰蛋白酶；EaglesMEM細(xì)胞培養(yǎng)干粉，G-418(Geneticin)，美國(guó)GIBCO公司；胎牛血清，美國(guó)Hyclone Lab公司。
藥物對(duì)細(xì)胞的毒性實(shí)驗(yàn)藥物用DMSO配制成2mg.ml-1，2倍稀釋成6個(gè)濃度加入96孔板，每濃度4孔，另設(shè)空白對(duì)照組，每4天換同濃度藥液，再培養(yǎng)4天，設(shè)無(wú)藥物細(xì)胞對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)第8天，傾去培養(yǎng)液，每孔加入含MTT的培養(yǎng)液(400μg.ml-1)，每孔100μl，37℃，5％CO2孵育4小時(shí)，棄上清，加DMSO 100μl溶解，待甲瓚顆粒完全溶解后，酶標(biāo)儀540nm波長(zhǎng)測(cè)定OD值。結(jié)果顯示，豆甾烷-3，5，6-三醇的半數(shù)無(wú)毒濃度(CC50)大于1000μg/ml。
細(xì)胞存活實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)采用MTT法檢測(cè)，方法與上述細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)相同。藥物濃度為100μg.ml-1-3.125μg.ml-1。細(xì)胞用藥后，檢測(cè)得各個(gè)濃度孔中培養(yǎng)上清的光密度值，取均值后按下式計(jì)算細(xì)胞存活率，其中給藥組為給予不同濃度的實(shí)驗(yàn)組；空白組為不加酶結(jié)合底物而平行操作的空白對(duì)照組；對(duì)照組為不加藥物處理的細(xì)胞對(duì)照組。細(xì)胞存活率＝[(D給藥組-D空白組)/(D對(duì)照組-D空白組)]×100％。鏡檢未見(jiàn)給藥組與對(duì)照組細(xì)胞存在形態(tài)學(xué)差異。
HBsAg、HBeAg含量的檢測(cè)收集用藥后培養(yǎng)上清，按HBsAg、HBeAg ELISA檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)得各個(gè)濃度孔中培養(yǎng)上清的OD值，取均值后按下式計(jì)算抗原抑制率，抗原抑制率＝[(D對(duì)照組-D給藥組)/(D對(duì)照組-D空白組)]×100％。實(shí)驗(yàn)重復(fù)進(jìn)行3次。藥物對(duì)抗原的半數(shù)有效濃度(IC50)，按Logistic法計(jì)算，Logistic法擬和作圖，曲線形狀若為典型的S型濃度-效應(yīng)曲線，可以說(shuō)明藥物具有良好的量效關(guān)系，可以得到在不同濃度藥物處理時(shí)抗原生成量，測(cè)定最大值和最小值，最大抑制率、最低抑制率、抑制50％所需濃度(IC50)。IC50為抑制曲線中最重要的參數(shù)，濃度越低表示藥物的抑制活性越高。檢測(cè)半數(shù)無(wú)毒濃度CC50。治療指數(shù)(SI)＝CC50/IC50。結(jié)果見(jiàn)表2，經(jīng)計(jì)算得到的抗原抑制率在30-40％之間。
表2.式I化合物對(duì)HBV抗原表達(dá)和細(xì)胞增殖的作用(n＝3，x±s)

*P＜0.05 **P＜0.01。
權(quán)利要求
1.式II豆甾烷-3，5，6-三醇及其衍生物用于制備抗HIV病毒藥物的用途 其中，R1，R2和R3相同或不同，各自獨(dú)立地為H、C1-C6烷基、C1-C6烷?；?、C7-C11芳?；⑵咸烟?、半乳糖、甘露糖、鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、核糖、果糖，R4為具有以下結(jié)構(gòu)的基團(tuán)
2.式II豆甾烷-3，5，6-三醇及其衍生物用于制備抗乙型肝炎病毒的藥物的用途 其中，R1，R2和R3相同或不同，各自獨(dú)立地為H、C1-C6烷基、C1-C6烷?；?、C7-C11芳酰基、葡萄糖、半乳糖、甘露糖、鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、核糖、果糖，R4為具有以下結(jié)構(gòu)的基團(tuán)
3.式II的豆甾烷-3，5，6-三醇衍生物 其中，R1，R2和R3相同或不同，各自獨(dú)立地為H，C1-6烷基，C1-C6烷?；?，C7-C11芳?；?，葡萄糖，半乳糖，甘露糖，鼠李糖，阿拉伯糖，木糖，核糖，果糖，R4為具有以下結(jié)構(gòu)的基團(tuán) 條件是，當(dāng)R1，R2和R3同時(shí)為H時(shí)，R4不為
4.權(quán)利要求3的式II豆甾烷-3，5，6-三醇衍生物，其中，R1，R2和R3相同或不同，為乙?；?、丙酰基、丁?；虮郊柞；?。
5.含有權(quán)利要求3或4所述的式II豆甾烷-3，5，6-三醇衍生物及一種或多種藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物。
6.治療HIV病毒感染的方法，包括給予需要治療的對(duì)象治療有效量的權(quán)利要求1，3或4所定義的豆甾烷-3，5，6-三醇及其衍生物。
7.治療乙型肝炎病毒感染的方法，包括給予需要治療的對(duì)象治療有效量的權(quán)利要求1，3或4所定義的豆甾烷-3，5，6-三醇及其衍生物。
全文摘要
本發(fā)明涉及豆甾烷－3，5，6－三醇及其衍生物用于制備抗艾滋病毒(HIV)和乙型肝炎病毒(HBV)的藥物的用途。本發(fā)明還涉及新的豆甾烷－3，5，6－三醇衍生物、含有豆甾烷－3，5，6－三醇及其衍生物的藥物組合物以及使用豆甾烷－3，5，6－三醇及其衍生物治療艾滋病和乙型肝炎的方法。
文檔編號(hào)A61P31/14GK1726922SQ20051007439
公開(kāi)日2006年2月1日 申請(qǐng)日期2005年5月26日 優(yōu)先權(quán)日2004年7月28日
發(fā)明者孫燕榮, 張嘉杰, 徐偉, 吳曙光 申請(qǐng)人:南方醫(yī)科大學(xué)