專利名稱：蛋白酶抑制劑在保護(hù)肝細(xì)胞功能中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及Kunitz型蛋白酶抑制劑(KPI/AβPP)、其制備方法和應(yīng)用，特別是涉及KPI/AβPP的肝細(xì)胞保護(hù)功能，及其在生產(chǎn)用于預(yù)防和治療病理性肝損傷相關(guān)疾病的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明進(jìn)一步涉及由作為基本活性成分的KPI/AβPP及一種或多種醫(yī)藥上可接受的載體或賦形劑組成的藥物組合物。
背景技術(shù)：
與牛胰蛋白酶抑制劑相似，來源于人淀粉樣β蛋白前體(AβPP)的Kunitz型蛋白酶抑制劑區(qū)域(KPI)是一種能夠與絲氨酸蛋白酶結(jié)合并抑制絲氨酸蛋白酶活性的肽。
作為一種由61個(gè)氨基酸組成的多肽，KPI/AβPP分子量相對較小且結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。Kunitz型蛋白酶抑制劑區(qū)域(簡稱KPI或KPI/AβPP)對絲氨酸蛋白酶家族有廣泛的抑制作用，可被抑制的蛋白酶包括胰蛋白酶、糜蛋白酶、激肽釋放酶、纖溶酶、彈性蛋白酶和凝血因子VIIa IXa Xa XIa XIIa等(例如參見美國專利6,613,890)。作為一種絲氨酸蛋白酶抑制劑和活性藥物成分，KPI/AβPP的基本作用在于將病理性升高的蛋白水解酶活性降低到正常水平，緩解與絲氨酸蛋白酶活性升高有關(guān)的臨床癥狀，通常可用于預(yù)防和治療心肺轉(zhuǎn)流術(shù)(CPB)后的大出血，CPB誘導(dǎo)的炎性反應(yīng)以及促進(jìn)傷口愈合等。
然而，迄今為止尚未見有關(guān)KPI/AβPP對肝細(xì)胞的保護(hù)功能以及將其用于預(yù)防和治療各種原因?qū)е碌牟±硇约毙愿谓M織損傷和慢性肝纖維化的報(bào)道。
發(fā)明目的本發(fā)明的一個(gè)目的是提供KPI/AβPP在生產(chǎn)用于預(yù)防和治療病理性肝損傷相關(guān)疾病的藥物中的應(yīng)用。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中所說的KPI/AβPP是以DNA重組技術(shù)制備的。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中所說的KPI/AβPP是人源的。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中所說的病理性肝損傷選自急性或亞急性肝壞死、急性或慢性病毒性肝炎、慢性肝纖維化、中毒性肝炎以及其他原因?qū)е碌睦^發(fā)性慢性肝損傷和肝衰竭。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種用于肝細(xì)胞保護(hù)、預(yù)防和治療病理性肝損傷的基礎(chǔ)上由KPI/AβPP或其類似物以及一種或多種醫(yī)藥上可接受的載體或賦形劑組成的藥物組合物。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，所說的藥物組合物還可含有一種或多種具有協(xié)同或輔助作用的天然或合成或重組來源的其他活性成分。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，所說的藥物組合物被制成適于經(jīng)胃腸道途徑給藥的劑型。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，所說的藥物組合物被制成適于經(jīng)胃腸道外途徑給藥的劑型。


圖1顯示重組人Kunitz型蛋白酶抑制劑(rhKPI/AβPP)對體外原代分離的大鼠肝細(xì)胞的保護(hù)作用。其中圖1a顯示培養(yǎng)基中加入rhKPI/AβPP實(shí)驗(yàn)組肝細(xì)胞的生長狀態(tài)可見肝細(xì)胞呈單層生長，細(xì)胞輪廓清晰，核大，細(xì)胞間連接緊密，仍維持肝細(xì)胞的典型形態(tài)(100×)。圖1b顯示培養(yǎng)基中未添加rhKPI/AβPP陰性對照組肝細(xì)胞的生長狀態(tài)細(xì)胞數(shù)明顯減少，僅有大約10％的細(xì)胞存活，細(xì)胞表面不光滑，結(jié)構(gòu)趨于消失并有融合現(xiàn)象，且有多數(shù)細(xì)胞死亡(100×)。
圖2顯示rhKPI/AβPP對CCL4誘導(dǎo)的急性肝損傷小鼠的肝細(xì)胞保護(hù)作用。其中圖2a顯示空白對照組的肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝細(xì)胞索以中央靜脈為中心呈放射狀排列、肝竇結(jié)構(gòu)規(guī)整，肝細(xì)胞核呈圓形，胞質(zhì)紅染，匯管區(qū)無炎性細(xì)胞浸潤(400×)。圖2b顯示模型對照組的肝細(xì)胞腫大，肝小葉中央?yún)^(qū)呈彌漫性、多發(fā)性片狀壞死和脂肪變性，炎性細(xì)胞浸潤明顯(200×)。圖2c顯示大劑量實(shí)驗(yàn)組肝小葉周邊部分肝細(xì)胞輕度水腫及輕微脂肪變性，但未見其他明顯的病理改變(200×)。圖2d顯示甘利欣(江蘇正大天晴藥業(yè)股份有限公司，批號200688)組的肝小葉周邊部分肝細(xì)胞輕度水腫及少數(shù)肝細(xì)胞脂肪變性(200×)。
圖3顯示rhKPI/AβPP對CCL4誘導(dǎo)的慢性肝損傷大鼠的肝細(xì)胞保護(hù)作用。其中圖3a顯示空白對照組的肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝細(xì)胞索以中央靜脈為中心呈放射狀排列、肝竇結(jié)構(gòu)規(guī)整，肝細(xì)胞核呈圓形，胞質(zhì)紅染，匯管區(qū)無炎性細(xì)胞浸潤(200×)。圖3b顯示模型對照組的肝纖維增生明顯，將肝小葉分割為大小不等的假小葉，假小葉內(nèi)中央靜脈缺如或偏位，肝細(xì)胞脂肪變性，胞漿內(nèi)可見大小不等的空泡，呈典型肝硬化表現(xiàn)(200×)。圖3c顯示大劑量實(shí)驗(yàn)組的肝細(xì)胞輕度脂肪變性，在肝小葉內(nèi)只見有散在的脂肪變性(200×)。圖3d顯示促肝細(xì)胞生長素組的肝小葉結(jié)構(gòu)模糊，肝小葉周邊及匯管區(qū)周圍肝細(xì)胞中度脂肪變性，相互連接成片，小葉中央肝細(xì)胞病變較輕(200×)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及Kunitz型蛋白酶抑制劑(KPI/AβPP)、其制備方法和應(yīng)用，特別是涉及KPI/AβPP的肝細(xì)胞保護(hù)功能，及其在生產(chǎn)用于預(yù)防和治療病理性肝損傷相關(guān)疾病的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明進(jìn)一步涉及由作為基本活性成分的KPI/AβPP及一種或多種醫(yī)藥上可接受的載體或賦形劑組成的藥物組合物。
可以利用常規(guī)的DNA重組和分子克隆技術(shù)制備重組人Kunitz型蛋白酶抑制劑(rhKPI/AβPP)。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中所說的rhKPI/AβPP可以是由原核、真核或酵母表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)生的。然而，為了本發(fā)明目的，優(yōu)選的表達(dá)系統(tǒng)是巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)。
以下簡單地描述使用優(yōu)化的發(fā)酵培養(yǎng)條件，在80L發(fā)酵罐中工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)rhKPI/AβPP的方法。
(1)酵母表達(dá)載體的構(gòu)建以人胎盤組織來源的基因組DNA為模板，使用合成的引物15′-CTCTgAATTCAggTCTgCAgTgAACAAgCC-3′和引物25′-gAAgTCTAgATTAAATggCgCTgCCACACAC-3′，經(jīng)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增得到長度約200bp的產(chǎn)物。酶切后與用同種酶消化的pPICZα載體連接，得到重組質(zhì)粒pPICZα/prekpi。然后，分別合成一段寡核苷酸單鏈5′-TCgAgAAgAgAgAggTTgTTAgAgAggTCTgCA-3′和5′-gACCTCTCTAACAACCTCTCTCTTC-3′(其中包括編碼KPI氨基端四個(gè)氨基酸和α因子信號肽切割位點(diǎn)Lys-Arg的密碼子)。用PstI和XhoI消化重組質(zhì)粒pPICZα/prekpi并與退火后的寡核苷酸雙鏈連接，得到重組質(zhì)粒pPICZα/kpi。酶切分析和測序鑒定表明，pPICZα/kpi，重組質(zhì)粒攜帶了預(yù)期的α因子信號肽和rhKPI/AβPP基因序列。
(2)重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化、陽性克隆的篩選和表達(dá)采用電轉(zhuǎn)化法將pPICZα/kpi轉(zhuǎn)化到酵母菌株X-33中。在YPD zeocin陽性培養(yǎng)基中28℃培養(yǎng)36小時(shí)后，挑取單克隆菌落接種于BMGY培養(yǎng)基中，待細(xì)菌處于對數(shù)生長期(OD600＝2～6)時(shí)，重懸于BMMY培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)。每隔24小時(shí)補(bǔ)加100％甲醇至終濃度為0.5％，以誘導(dǎo)rhKPI/AβPP的表達(dá)。誘導(dǎo)后，每隔24小時(shí)取上清，用胰蛋白酶和底物鹽酸苯甲酰-精氨酸-4-硝基?；桨愤M(jìn)行活性測定，篩選相對高表達(dá)量的菌株。
(3)大規(guī)模發(fā)酵工藝將高密度的(OD600＝10)酵母工程菌接種于含甘油(5％，V/V)加痕量鹽(4.34ml PTM1/L)和生物素(0.08mg/L)的FM21培養(yǎng)基中，在溫度28℃、pH 3.3、溶解氧濃度20％、攪拌速度600轉(zhuǎn)/分鐘，罐內(nèi)壓力12psi條件下，在發(fā)酵罐罐內(nèi)發(fā)酵培養(yǎng)30小時(shí)。當(dāng)濕細(xì)胞重量＞180～220g/L時(shí)，以漸增的速度添加含1.2％PTM1的100％甲醇，誘導(dǎo)rhKPI/AβPP的表達(dá)，其甲醇補(bǔ)加速率為3.6ml/小時(shí)/L→7.3ml/小時(shí)/L→10.9ml/小時(shí)/L，直至發(fā)酵結(jié)束。
(4)表達(dá)產(chǎn)物的純化70L發(fā)酵液離心取上清，用NaOH(1mol/L)調(diào)pH4.0，添加NaAc-HAc緩沖液(終濃度為20mmol/L)和去離子水稀釋后，通過預(yù)先用緩沖液A(20mmol/L NaAc-HAc，pH 4.0)平衡過的Sepharose SP陽離子交換柱。然后連續(xù)加樣，檢測穿透液的活性，待樹脂飽和后用3倍于柱體積的緩沖液A洗柱。用緩沖液B(20mmol/L NaAc-HAc加1mol/L NaCl，pH4.0)洗脫。洗脫液用3000(3K)中空纖維柱除鹽和濃縮。
(5)表達(dá)產(chǎn)物的活性測定以胰蛋白酶活性抑制方法測定表達(dá)產(chǎn)物的活性。將如上純化的rhKPI/AβPP稀釋成不同濃度并與同濃度的胰蛋白酶反應(yīng)，加入底物(鹽酸苯甲酰-精氨酸-4-硝基?；桨?后測定殘余的胰蛋白酶量。結(jié)果可見，如上得到的rhKPI/AβPP對胰蛋白酶有明顯的可逆性抑制作用。
為了深入研究rhKPI/AβPP對大鼠肝細(xì)胞的保護(hù)作用，在體外細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)中，本發(fā)明人首先發(fā)現(xiàn)，與無血清培養(yǎng)的對照組肝細(xì)胞相比，rhKPI/AβPP能夠使大鼠的肝細(xì)胞在無血清培養(yǎng)條件下的存活期明顯延長，并保持原代肝細(xì)胞的完整的細(xì)胞形態(tài)。
在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，我們進(jìn)一步觀察了rhKPI/AβPP對活體急性肝損傷及慢性肝纖維化動物模型的血清中酶含量及生化指標(biāo)的影響，同時(shí)對各實(shí)驗(yàn)組動物的肝臟組織進(jìn)行了病理學(xué)觀察和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。在急性肝損傷的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，接受rhKPI/AβPP治療的實(shí)驗(yàn)組動物血清轉(zhuǎn)氨酶和肝重系數(shù)顯著降低。另外，實(shí)驗(yàn)組動物血清及肝組織中的丙氨酸氨基轉(zhuǎn)換酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)換酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)、膽紅素(T-BIL)、γ谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(γ-GT)、羥脯氨酸(HYP)水平明顯降低；而白蛋白(ALB)、總蛋白(TP)、白蛋白比總蛋白(A/G)、唾液酸(SA)、膽堿酯酶(CHE)則升高。病理學(xué)檢查結(jié)果可見，實(shí)驗(yàn)組動物肝小葉周邊部分肝細(xì)胞水腫和脂肪變性程度較模型對照組明顯減輕，匯管區(qū)炎細(xì)胞浸潤也明顯減少。在慢性肝損傷的實(shí)驗(yàn)中，與模型對照組相比，發(fā)現(xiàn)接受rhKPI/AβPP治療的動物肝纖維化程度較輕，同時(shí)肝細(xì)胞脂肪變性和炎性細(xì)胞浸潤也明顯減輕。
基于這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們初步認(rèn)定rhKPI/AβPP有可能作為一種新的肝細(xì)胞保護(hù)劑，用于預(yù)防和治療各種原因特別是毒性因子導(dǎo)致的急性及慢性肝細(xì)胞損傷。
因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供KPI/AβPP在生產(chǎn)用于預(yù)防和治療病理性肝損傷相關(guān)疾病的藥物中的應(yīng)用。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中所說的病理性肝損傷包括但不只限于急性或亞急性肝壞死、急性和慢性病毒性肝炎、活動期慢性病毒性肝炎、中毒性肝炎以及其他原因?qū)е碌睦^發(fā)性肝損傷和肝衰竭。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種具有肝細(xì)胞保護(hù)活性的基礎(chǔ)上由rhKPI/AβPP及一種或多種醫(yī)藥上可接受的載體或賦形劑組成的藥物組合物。
用于本發(fā)明的rhKPI/AβPP可以是具有天然野生序列的生物學(xué)活性多肽，但也可以是為改善產(chǎn)物的生物學(xué)活性，或?yàn)樘岣弋a(chǎn)物的產(chǎn)率或藥物動力學(xué)性質(zhì)目的而在基因水平上進(jìn)行了必要的修飾的rhKPI/AβPP類似物或突變體。這里所說的修飾可以是內(nèi)部或N末端個(gè)別或部分氨基酸的加入、缺失或取代。
本發(fā)明涉及的rhKPI/AβPP可以單獨(dú)使用，也可以作為有各種不同劑型的藥物組合物的形式使用?？梢允褂弥扑幑I(yè)領(lǐng)域已知的方法(參見Remington′sPharmaceutical Sciences，Mack Pub.Co.，Easton，Pa.，1980)，以適于口服或非口服給藥的單位計(jì)量形式制備本發(fā)明的藥物組合物。例如，可將作為活性成分的有效量的rhKPI/AβPP與醫(yī)藥上可接受的載體或賦形劑均勻地混合，制成溶液或懸浮液形式的適于靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、器官腔內(nèi)、皮內(nèi)和皮下等胃腸道外途徑給藥的藥物組合物；或者也可以制成片劑、膠囊劑、粉末劑、乳劑、顆粒劑等形式的適于經(jīng)胃腸道途徑給藥的藥物組合物。
根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物，其中所使用的醫(yī)藥上可接受的載體或賦形劑將依據(jù)所制備的本發(fā)明藥物組合物的劑型而有不同的選擇。
適于胃腸道外給藥的制劑可含有無菌水或鹽水、聚乙二醇、油和氫化萘等常用的賦形劑。特別是，可以使用生物相容的、生物可降解的丙交酯聚合物、丙交酯/乙交酯共聚物、聚氧乙烯/聚氧丙烯共聚物作為賦形劑，以控制活性成分的緩慢釋放。在其他適于胃腸道外給藥的制劑中，還包括含有水楊酸的直腸給藥制劑和含有甘膽酸鹽的含服給藥制劑。
具體地說，可以使用乳糖、葡萄糖、蔗糖、甘露醇和甲基纖維素等賦形劑，淀粉、海藻酸鈉、羧甲基纖維素鈣和結(jié)晶纖維素等崩解劑，硬脂酸鎂和滑石等潤滑劑，明膠、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、甲基纖維素和羥丙基纖維素等黏結(jié)劑，和蔗糖脂肪酸酯、山梨醇脂肪酸酯等表面活性劑，以及著色劑、甜味劑、香料、分散劑等輔助成分，以常規(guī)方法制備片劑。
可以使用乳糖和甘露醇等賦形劑，淀粉等崩解劑，明膠等黏結(jié)劑，以常規(guī)方法制備顆粒劑。
或者，可以使用乳糖和蔗糖等賦形劑，以常規(guī)方法制備粉末劑。使用明膠、水、蔗糖、阿拉伯膠、山梨醇、甘油、結(jié)晶纖維素、硬脂酸鎂和滑石等，以常規(guī)方法制備膠囊劑。
可以使用水、生理鹽水、植物油(如橄欖油和花生油)、油酸乙酯和丙二醇等溶劑，苯甲酸鈉，水楊酸鈉和氨基甲酸乙酯等增溶劑，氯化鈉和葡萄糖等等滲劑，青霉素和鏈霉素及其他抗真菌劑等抗生素，苯酚、甲酚、對位羥基苯甲酸酯、三氯叔丁醇、度米酚和山梨酸等防腐劑，抗壞血酸和焦磷酸鈉等抗氧化劑，以常規(guī)方法制備注射劑。
在任何情況下，所說的可注射制劑均應(yīng)是無菌和可流動并適于通過注射器注射給藥的。另外，在生產(chǎn)、運(yùn)輸和儲存條件下，所說的制劑還必須是穩(wěn)定的，并且能夠?qū)辜?xì)菌和真菌等微生物的污染。
另外，也可使用制藥工業(yè)中已知的方法和輔助成份，將本發(fā)明的藥物組合物制成微膠囊劑或脂質(zhì)體包裹劑。
本發(fā)明的藥物組合物除含有作為基本活性成分rhKPI/AβPP或其類似物或突變體外，還可含有一種或多種合成的、天然的或重組來源的具有協(xié)同或輔助作用的其他活性成分。這些活性成分包括但不只限于具有免疫刺激或調(diào)節(jié)活性、病毒復(fù)制抑制活性、功能性肝細(xì)胞修復(fù)活性的其他成分，例如可以是干擾素、白介素、胸腺素、肝細(xì)胞生長因子和成纖維細(xì)胞生長因子等。
本發(fā)明的藥物組合物對功能性肝細(xì)胞具有良好的保護(hù)作用。雖然有關(guān)作用機(jī)理目前尚不明確，但我們推測可能與rhKPI/AβPP或其類似物作用于肝細(xì)胞并抑制細(xì)胞表面上的絲氨酸蛋白酶類有關(guān)。
可使用本發(fā)明的藥物組合物預(yù)防或治療的疾病包括但不只限于人或哺乳動物的急性或亞急性肝壞死、急性或慢性病毒性肝炎、中毒性肝炎以及其他原因?qū)е碌睦^發(fā)性肝損傷和肝衰竭。
基于以上的描述，本領(lǐng)域技術(shù)人員完全可以理解到，rhKPI/AβPP除具有其固有的蛋白酶抑制活性并因此可用于治療絲氨酸活性升高相關(guān)疾病外，也可以用于預(yù)防和治療病理性肝損傷及相關(guān)疾病。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中所說的rhKPI/AβPP或其類似物通過抑制肝細(xì)胞膜表面的絲氨酸蛋白酶提高肝細(xì)胞的存活性。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中所說的病理性肝損傷包括但不只限于急性或亞急性肝壞死、急性或慢性病毒性肝炎、中毒性肝炎以及其他原因?qū)е碌睦^發(fā)性肝損傷和肝衰竭。
一般說來，本發(fā)明藥物組合物的給藥劑量約為0.01-500mg/kg，較好為0.1-100mg/kg?？梢砸钥诜⑵は禄蚣∪庾⑸?、腹腔注射、靜脈內(nèi)注射等多種途徑藥給。當(dāng)然，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解到，為有效地治療病人所需的確切的給藥劑量，應(yīng)根據(jù)待治療的病癥或病理狀態(tài)的性質(zhì)、嚴(yán)重程度、病人的年齡、體重和一般健康狀態(tài)，所用藥物的劑型、病人對所用藥物的敏感性和耐受性，以及所使用給藥途徑等因素，按照個(gè)體化的原則由臨床醫(yī)生確定。
具體實(shí)施例方式
下列實(shí)施例旨在進(jìn)一步舉例說明而不是限制本發(fā)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解到，在不背離本發(fā)明的精神和原則的前提下，對本發(fā)明的任何平行改變和改動都將落入本發(fā)明的待批權(quán)利要求范圍內(nèi)。
實(shí)施例1rhKPI/AβPP對體外原代分離的大鼠肝細(xì)胞的保護(hù)作用本實(shí)施例舉例說明rhKPI/AβPP對分離的原代大鼠肝細(xì)胞存活期的影響。
采用在Seglen法基礎(chǔ)上改進(jìn)的兩步原位灌流法，分離Wistar大鼠(150g-200g)肝細(xì)胞。將肝細(xì)胞用培養(yǎng)液A〔含8％新生牛血清(NBCS)、地塞米松(1μM)和胰島素(0.1μM)的Williams’E培養(yǎng)液〕懸浮后，接種在96孔培養(yǎng)板的小孔(105個(gè)細(xì)胞/孔)中，并置于37℃，5％CO2環(huán)境下培養(yǎng)。6小時(shí)后待細(xì)胞完全貼壁時(shí)，依次更換培養(yǎng)液B〔含2％NBCS、地塞米松(1μM)，胰島素(0.1μM)的Williams’E培養(yǎng)液〕、培養(yǎng)液A、添加rhKPI/AβPP(10μg/ml)的培養(yǎng)液B和添加牛蛋白酶抑制劑(BPTI，10μg/ml)的培養(yǎng)液B繼續(xù)培養(yǎng)。每間隔24小時(shí)分別在相差倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)和數(shù)量的變化，并用MTT法檢測存活的細(xì)胞數(shù)。同時(shí)；接種相同密度的鼠肝細(xì)胞，用添加不同濃度的rhKPI/AβPP的培養(yǎng)液B分別連續(xù)培養(yǎng)3天，同時(shí)用含不同血清濃度的培養(yǎng)液B和相同密度的鼠肝細(xì)胞作為對照，觀察和評價(jià)rhKPI/AβPP對大鼠肝細(xì)胞的存活性的影響及量效關(guān)系。結(jié)果如下列表1和2所示。
表1rhKPI/AβPP對原代大鼠肝細(xì)胞的保護(hù)作用(x±s)

與2％NBCS的對照組比較，*P＜0.05.
從表1所示的結(jié)果可以看出，rhKPI/AβPP體外培養(yǎng)第四天的大鼠肝細(xì)胞存活數(shù)顯著高于2％NBCS對照組(P＜0.05)。肝細(xì)胞呈單層生長，細(xì)胞輪廓清晰，核大，細(xì)胞間連接緊密，仍維持肝細(xì)胞的典型形態(tài)。MTT值與鏡下觀察的結(jié)果相一致(參見圖1a和1b)。
表2rhKPI/AβPP對大鼠肝細(xì)胞保護(hù)作用的量效關(guān)系(x±s)

從表2所示的結(jié)果可以看出，rhKPI/AβPP在濃度為2.5μg/ml時(shí)開始發(fā)揮作用，10μg/ml時(shí)達(dá)到最高水平，顯示了較好的量效關(guān)系。最小有效劑量與5％血清濃度的MTT值在統(tǒng)計(jì)學(xué)無顯著性差別(P＞0.05數(shù)據(jù)未給出)。
實(shí)施例2rhKPI/AβPP對急性肝損傷小鼠模型的肝細(xì)胞保護(hù)作用本實(shí)施例舉例說明rhKPI/AβPP對四氯化碳誘導(dǎo)的急性肝損傷小鼠模型的功能性肝細(xì)胞保護(hù)作用。
將健康昆明種小鼠60只(6～8周齡，平均體重20g～22g，雌雄各半)隨機(jī)分為6組，每組10只動物。(1)空白對照組；(2)模型對照組(腹腔注射生理鹽水)；(3～5)分別為rhKPI/AβPP小、中、大三個(gè)不同劑量組(分別按4.5mg/kg、9mg/kg、18mg/kg腹腔注射)；(6)甘利欣注射液組(江蘇正大天晴藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，25mg/kg腹腔注射)。每天給藥一次，連續(xù)7天。末次給藥后1小時(shí)，第1組小鼠腹腔注射花生油(10ml/kg)，第2～6組小鼠按10ml/kg腹腔注射含0.2％CCL4的花生油，造成急性肝損傷。禁食，不禁水。16小時(shí)后再給藥1次，末次給藥1小時(shí)后摘眼球取血，按改良賴氏法測定血清中ALT、AST含量。然后，處死小鼠，稱取肝臟總重量，測定肝重系數(shù)的變化；取肝大葉相同部位的肝組織固定于10％甲醛溶液中，按常規(guī)方法制備病理切片并進(jìn)行HE染色。所Dunnet T檢驗(yàn)進(jìn)行比較。
從下列表3所示的結(jié)果可以看出，與空白對照組相比較，模型對照組動物的血清ALT和AST活力水平均明顯升高(p＜0.01)。投用rhKPI/AβPP后，可見治療組動物的ALT和AST活力水平均顯著降低(與模型對照組比較差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義p＜0.05或p＜0.01)。
表3rhKPI/AβPP對CCL4誘導(dǎo)的急性肝損傷小鼠的肝保護(hù)作用(x±s，n＝10)

與空白對照組比較##P＜0.01；與模型對照組比較*p＜0.05**p＜0.01另一方面，各組動物肝臟組織病理檢查結(jié)果顯示空白對照組所有小鼠的肝組織結(jié)構(gòu)均未見任何病理改變。模型對照組肝細(xì)胞腫大，肝小葉中央?yún)^(qū)呈現(xiàn)彌漫性多發(fā)性片狀壞死，肝細(xì)胞呈彌漫性脂肪變性，炎性細(xì)胞浸潤明顯。rhKPI/AβPP小劑量組肝小葉中央?yún)^(qū)部分肝細(xì)胞壞死，肝小葉彌漫性水腫、脂肪變性，炎性細(xì)胞浸潤較輕。rhKPI/AβPP中劑量組肝小葉周邊部分少數(shù)肝細(xì)胞輕度壞死，肝小葉周邊部少量脂肪變性，其壞死和脂肪變性程度比模型組明顯減輕，炎性細(xì)胞浸潤更輕。rhKPI/AβPP大劑量組肝小葉周邊部少數(shù)肝細(xì)胞輕度水腫及輕微脂肪變性，炎性細(xì)胞浸潤不明顯。甘利欣注射液組肝小葉周邊部肝細(xì)胞壞死及輕度水腫，少數(shù)肝細(xì)胞脂肪變性，炎性細(xì)胞浸潤不明顯(參見表4和圖2)。
這些結(jié)果表明，大劑量組rhKPI/AβPP對小鼠急性肝損傷具有明顯的保護(hù)作用，而且保護(hù)作用可以與甘利欣注射液(25mg/kg)相比。
表4rhKPI/AβPP對CCL4誘導(dǎo)的急性肝損傷小鼠肝組織病理改變的影響(n＝10)

實(shí)施例3rhKPI/AβPP對小鼠慢性肝損傷模型的肝細(xì)胞保護(hù)作用本實(shí)施例舉例說明rhKPI/AβPP對四氯化碳誘導(dǎo)的慢性肝損傷小鼠模型的功能性肝細(xì)胞保護(hù)作用。
Wistar大鼠體重190g～210g，雌雄各半。首次給予皮下注射40％CCL4(5ml/kg)，以后每周注射25％CCL42次，連續(xù)12周?？瞻讓φ战M注射花生油。于實(shí)驗(yàn)第8周時(shí)，由眼眶靜脈叢取血測定ALT、TP、A、A/G。根據(jù)ALT活力和A/G比值將動物分層隨機(jī)分為6組小、中、大三個(gè)劑量組(分別腹腔注射rhKPI/AβPP 3mg/kg、6mg/kg和12mg/kg)，促肝細(xì)胞生長素組(腹腔注射陽性對照藥物促肝細(xì)胞生長素100mg/kg)。正常組與慢性肝損傷模型組(腹腔注射等容量生理鹽水)。各組均連續(xù)給藥4周。末次給藥后24小時(shí)，從腹主動脈取血，測定血清ALT、AST、TP、ALB、γ-GT、T-BIL、ALP、CHE、SA、A/G值。然后處死大鼠，取肝組織加冷生理鹽水制成10％肝組織勻漿，采用比色法測定Hyp的含量。同時(shí)，取肝大葉的相同部位的肝組織固定于10％福爾馬林，常規(guī)法制做切片后分別進(jìn)行HE染色和膠原纖維染色，在光鏡下觀察肝細(xì)胞變性壞死和肝間質(zhì)纖維增生程度，并進(jìn)行分級統(tǒng)計(jì)。
從下列表5所示的結(jié)果可以看出，與空白對照組相比較，模型組動物的血清學(xué)及生化學(xué)指標(biāo)的水平均明顯不同，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05或p＜0.01)，說明慢性肝損傷模型的建立成功。投用rhKPI/AβPP后，可見治療組動物血清中ALT、AST、ALP、T-BIL、γ-GT顯著降低，而ALB、SA、CHE、A/G顯著升高；肝組織中Hyp活力水平顯著降低(與模型組比較差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義p＜0.05或p＜0.01)(參見表5)。
表5rhKPI/AβPP對CCL4所致慢性肝損傷大鼠的肝保護(hù)作用(x±s，n＝10)

與空白對照組比較#P＜0.05##P＜0.01；與模型對照組比較*p＜0.05**p＜0.01從肝臟組織病理檢查結(jié)果顯示(見表6圖3)，空白對照組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝細(xì)胞索以中央靜脈為中心呈放射狀排列、肝竇結(jié)構(gòu)規(guī)整，肝細(xì)胞核圓形，胞質(zhì)紅染，肝匯管區(qū)無炎細(xì)胞浸潤，為正常肝臟組織結(jié)構(gòu)。模型對照組肝纖維組織增生明顯，將肝小葉分割為大小不等的假小葉，假小葉內(nèi)中央靜脈缺如或偏位。可見肝細(xì)胞壞死，肝細(xì)胞脂肪變性，胞漿內(nèi)可見大小不等的圓形空泡，炎性細(xì)胞浸潤較輕。小劑量實(shí)驗(yàn)組肝小葉結(jié)構(gòu)模糊，肝細(xì)胞索不連續(xù)，部分肝細(xì)胞崩解壞死，匯管區(qū)周圍肝細(xì)胞脂肪變性較重，肝細(xì)胞內(nèi)可見多數(shù)大小不等的圓形空泡，部分肝細(xì)胞水樣變性較重，炎性細(xì)胞浸潤較輕。中劑量實(shí)驗(yàn)組肝小葉結(jié)構(gòu)模糊，少數(shù)肝細(xì)胞壞死，肝小葉中央?yún)^(qū)及部分匯管區(qū)可見中度脂肪變性，肝細(xì)胞內(nèi)可見大小不等的圓形空泡，炎性細(xì)胞浸潤更輕。大劑量實(shí)驗(yàn)組肝纖維化程度輕，10只大鼠未見肝細(xì)胞壞死。肝輕度脂肪變性，在肝小葉內(nèi)可見散在脂肪變性，炎性細(xì)胞浸潤更輕。促肝細(xì)胞生長素組部分肝小葉結(jié)構(gòu)模糊，肝細(xì)胞壞死較輕，肝小葉周邊區(qū)及匯管區(qū)周圍肝細(xì)胞中度脂肪變性，相互連接成片，小葉中央肝細(xì)胞病變較輕，炎性細(xì)胞浸潤較輕。
表6rhKPI/AβPP對CCL4誘導(dǎo)的慢性肝損傷大鼠肝組織病理改變的影響(n＝10)

由以上的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見，rhKPI/AβPP具有肝細(xì)胞的保護(hù)功能，因此可用于預(yù)防和治療各種原因?qū)е碌牟±硇约毙愿谓M織損傷和慢性肝纖維化。
權(quán)利要求
1.Kunitz型蛋白酶抑制劑在生產(chǎn)用于預(yù)防和治療病理性肝損傷相關(guān)疾病的藥物中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的應(yīng)用，其中所說的Kunitz型蛋白酶抑制劑是以DNA重組技術(shù)制備的。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的應(yīng)用，其中所說的Kunitz型蛋白酶抑制劑是人源的。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的應(yīng)用，其中所說的病理性肝損傷選自急性或亞急性肝壞死、急性或慢性病毒性肝炎、慢性肝纖維化、中毒性肝炎以及各種原因?qū)е碌睦^發(fā)性肝損傷和肝衰竭。
5.一種由Kunitz型蛋白酶抑制劑以及一種或多種醫(yī)藥上可接受的載體或賦形劑組成的藥物組合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及Kunitz型蛋白酶抑制劑(KPI/AβPP)、其制備方法和應(yīng)用，特別是涉及Kunitz型蛋白酶抑制劑的肝細(xì)胞保護(hù)功能，及其在生產(chǎn)用于預(yù)防和治療病理性肝損傷相關(guān)疾病的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明進(jìn)一步涉及由作為基本活性成分的Kunitz型蛋白酶抑制劑及一種或多種醫(yī)藥上可接受的載體或賦形劑組成的藥物組合物。
文檔編號A61P1/00GK1923277SQ20051001708
公開日2007年3月7日 申請日期2005年8月29日 優(yōu)先權(quán)日2005年8月29日
發(fā)明者顏煒群, 賀巾超 申請人:吉林圣元科技有限責(zé)任公司