專利名稱：新生兒腦膜炎的益生性治療和大腸桿菌致病因子的應(yīng)用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及感染性疾病和分子生物學(xué)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
Escherichia coli(E.coli)是引起新生兒腦膜炎的最常見的革蘭氏陰性菌[Huang SH etal.，(2002).Microbes and Infection.21137-44；Huang and Jong(2001)Cellular Microbiology 3277-87]。這種疾病的致病過程尚未被完全確定。在微生物致病的演化過程中，基因的獲得是導(dǎo)致微生物病原體產(chǎn)生和演變的主要途徑之一，因此那些導(dǎo)致感染癥的微生物病原體所具有的特征或一系列特征通常有別于非疾病或共生菌株。包括E.coli在內(nèi)的胃腸內(nèi)微生物群體是出生后迅速獲得的，并在人體的整個一生中保持著相對穩(wěn)定性。這些非病毒性(益生性)細菌對于人類的體內(nèi)平衡是必需的[Huang，S.H.etal.，(2002)，F(xiàn)unc Integr Genomics 1331-44]導(dǎo)致腦膜炎的菌株其特點不同于E.coli的共生菌株，也不同于其他致病菌株，例如不同于那些引起腹瀉和尿道感染(UTI)的菌株。E.coli的腦膜炎菌株具有如下鑒別特征這些菌株構(gòu)成數(shù)目有限的一組O型血型簇群(O1，O2，O7，O18，O83)，均能形成S型纖毛(S fimbriac)，攜帶ibeA遺傳(GimA)且攜帶大量K1囊狀體(高于84％)。這些特征的出現(xiàn)提示腦膜炎菌株具有一組特定的致病因子，由此才可能允許細菌穿越血腦屏障進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)。這樣的一組潛在的致病基因(基于序列信息)，被稱為遺傳島，已被建議稱為腦膜炎病原體N.MeningitiS，E.coli K-1和H.influenzae，但還需要通過離體或在體實驗方法來加以確定[Bloch，C.H.et al.，(1996)FEMSMicrobiol.Lett.，144171-176；Bonacoorsi SP et al.，(2000)InfectImmun.682096-2101；Chang CC et al.，(2000)Infect Immun.67230-236]。這種遺傳島，例如GimA，攜帶有致病因子，而這些致病因子可能會使非致病性的E.coli轉(zhuǎn)變?yōu)槟X膜炎致病菌株。
盡管抗微生物化療取得進展，但與新生兒革蘭氏陰性bacillary性腦膜炎相關(guān)的死亡率和發(fā)病率依然很高。因此，對細菌性腦膜炎發(fā)病過程(例如由細菌病原體導(dǎo)致的血腦屏障的突破，對人類內(nèi)皮和神經(jīng)細胞的細胞凋亡過程的誘導(dǎo))相關(guān)的細菌基因和細菌蛋白的進一步了解，將有助于發(fā)展出針對這種疾病的新的治療、預(yù)防和診斷工具。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及到調(diào)整E.coli菌，特別是E.coli的腦膜炎菌株的基因和蛋白質(zhì)。更特別的是，本發(fā)明涉及到對ibeA基因簇(GimA)基因及由這些基因，特別是ibeA基因所編碼的蛋白質(zhì)的特征所進行的鑒定，也涉及到相同的基因組成以及涉及到申請利用這些基因組成。
本發(fā)明的目的之一是提供分離或純化的核酸序列，該序列編碼ibeA基因簇中的基因。
本發(fā)明的另一目的是為由ibeA基因簇基因編碼的蛋白質(zhì)提供氨基酸。
本發(fā)明的另一目的是提供一種重組分子，這種重組分子由一種載體和ibeA基因簇的一個或多個基因的全部或部分核酸序列。
本發(fā)明的另一目的是生產(chǎn)有ibeA基因簇編碼的重組蛋白質(zhì)。
本發(fā)明的另一目的是提供診斷E.coli腦膜炎的方法。
本發(fā)明的另一目的是提升我們對親生物學(xué)及其在感染性疾病的管理，尤其是對新生兒細菌性腦膜炎管理方面的應(yīng)用的理解。
本發(fā)明的另一目的也是要提供疫苗和抗微生物制劑，以此來特異性攻擊腦膜炎細菌但同時又能保護益生性微生物。
本發(fā)明一種新生兒腦膜炎的益生性治療和大腸桿菌致病因子的應(yīng)用方法，其特征在于它提供一種完整核酸序列的方法，該核酸序列編碼一種ibeA基因簇中的某一基因，包括以下步驟(a)鑒定出大腸桿菌(Escherichia Coli)中與侵入BMEC相關(guān)的結(jié)構(gòu)為一種ibeA；(b)從大腸桿菌中提取和純化的ibeA進行分析；和(c)確定ibeA的完整核酸序列。
本發(fā)明一種新生兒腦膜炎的益生性治療和大腸桿菌致病因子的應(yīng)用方法，其特征在于該種提供完整核酸序列的方法，進一步包括以下步驟(e)制備一種發(fā)生框架內(nèi)缺失的ibeA的突變體；(f)將ibeA的框架內(nèi)缺失突變體一種ibeA組合從而形成一種轉(zhuǎn)化體；和(g)進行互補性分析以測試是否具備對BMEC的某種侵入能力。
本發(fā)明一種新生兒腦膜炎的益生性治療和大腸桿菌致病因子的應(yīng)用方法，其特征在于它提供一種預(yù)防和治療由腦膜炎性微生物導(dǎo)致的新生兒腦膜炎的益生菌(probiotic)，該益生菌包括本身具有抑制性腦膜炎致病因子的活體微生物。
本發(fā)明一種新生兒腦膜炎的益生性治療和大腸桿菌致病因子的應(yīng)用方法，其特征在于該種預(yù)防和治療由腦膜炎性微生物導(dǎo)致的新生兒腦膜炎的益生菌中，該腦膜炎致病因子包括GimA。
本發(fā)明一種新生兒腦膜炎的益生性治療和大腸桿菌致病因子的應(yīng)用方法，其特征在于該種預(yù)防和治療由腦膜炎性微生物導(dǎo)致的新生兒腦膜炎的益生菌中，該腦膜炎致病微生物選自包括攜帶GimA的E，coli K1和B組鏈球菌(GBS)在內(nèi)的一組微生物。
本發(fā)明一種新生兒腦膜炎的益生性治療和大腸桿菌致病因子的應(yīng)用方法，其特征在于該種預(yù)防和治療由腦膜炎性微生物導(dǎo)致的新生兒腦膜炎的益生菌中，該腦膜炎致病微生物選自包括攜帶GimA的E，coli K1和B組鏈球菌(GBS)在內(nèi)的一組微生物。
本發(fā)明一種新生兒腦膜炎的益生性治療和大腸桿菌致病因子的應(yīng)用方法，其特征在于該種預(yù)防和治療由腦膜炎性微生物導(dǎo)致的新生兒腦膜炎的益生菌中，該膜炎致病微生物選自包括攜帶GimA的E，coli菌素，GBS菌素，單核細胞增多性李斯特菌屬(steria monocytogenes)，假單胞菌屬(Pseudomonas species)，肺炎鏈球菌屬(StreptococcusPueumoniae)，腦膜炎李瑟菌屬(Neissria meningitides)，流感嗜血桿菌屬(Haemophilus influenzae)，檸檬桿菌屬(itronacterspecies)，白色念球菌(Candia abbicans)，真菌類，腸道病毒(enteroviruses)單純皰疹病毒，和兔弓形蟲(Toxoplasma gondii)寄生蟲在內(nèi)的一組微生物。
本發(fā)明一種新生兒腦膜炎的益生性治療和大腸桿菌致病因子的應(yīng)用方法，其特征在于該種預(yù)防和治療由腦膜炎性微生物導(dǎo)致的新生兒腦膜炎的益生菌中，該膜炎致病微生物選自包括攜帶GimA的E，coli菌素，GBS菌素，單核細胞增多性李斯特菌屬(steria monocytogenes)，假單胞菌屬(Pseudomonas species)，肺炎鏈球菌屬(StreptococcusPueumoniae)，腦膜炎李瑟菌屬(Neissria meningitides)，流感嗜血桿菌屬(Haemophilus influenzae)，檸檬桿菌屬(itronacterspecies)，白色念球菌(Candia abbicans)，真菌類，腸道病毒(enteroviruses)單純皰疹病毒，和兔弓形蟲(Toxoplasma gondii)寄生蟲在內(nèi)的一組微生物。
本發(fā)明一種新生兒腦膜炎的益生性治療和大腸桿菌致病因子的應(yīng)用方法，其特征在于該種預(yù)防和治療由腦膜炎性微生物導(dǎo)致的新生兒腦膜炎的益生菌中，該活體微生物包括乳酸桿菌屬(Lactobacillusspecies)，雙叉桿菌屬(Bifidobacterium species)，E.coli Nissle1917，和攜帶針對包括GimA在內(nèi)的一或多個致病因子的抗原的Probiotic菌。
本發(fā)明一種新生兒腦膜炎的益生性治療和大腸桿菌致病因子的應(yīng)用方法，其特征在于該種預(yù)防和治療由腦膜炎性微生物導(dǎo)致的新生兒腦膜炎的益生菌中，該活體微生物包括本身能抑制包括GimA在內(nèi)的一或多種腦膜炎致病因子的酵母菌。
本發(fā)明一種新生兒腦膜炎的益生性治療和大腸桿菌致病因子的應(yīng)用方法，其特征在于它包括一種預(yù)防和治療由腦膜炎病原微生物引起的新生兒腦膜炎的益生菌方法，其包括施用一種具有療效的益生菌制劑，以次來增進益生菌生物的有益作用，同時又對一種或多種腦膜炎致病因子產(chǎn)生抑制。
本發(fā)明一種新生兒腦膜炎的益生性治療和大腸桿菌致病因子的應(yīng)用方法，其特征在于該種預(yù)防和治療由腦膜炎病原微生物引起的新生兒腦膜炎的益生菌方法中的腦膜炎致病因子是指GimA。
本發(fā)明一種新生兒腦膜炎的益生性治療和大腸桿菌致病因子的應(yīng)用方法，其特征在于該種預(yù)防和治療由腦膜炎病原微生物引起的新生兒腦膜炎的益生菌方法中的益生菌(Probiotic)制劑選自一組寡糖，它們包括果糖寡糖(fructooligosaccharides(FOS))，菌粉(mulin)，乳果糖(Lactulose)和半乳糖寡糖(galacta oligosaccharides)。
本發(fā)明一種新生兒腦膜炎的益生性治療和大腸桿菌致病因子的應(yīng)用方法，其特征在于該種預(yù)防和治療由腦膜炎病原微生物引起的新生兒腦膜炎的益生菌方法中的益生菌(Probiotic)制劑選自一組寡糖，它們包括果糖寡糖(fructooligosaccharides(FOS))，菌粉(mulin)，乳果糖(Lactulose)和半乳糖寡糖(galacta oligosaccharides)。
本發(fā)明一種新生兒腦膜炎的益生性治療和大腸桿菌致病因子的應(yīng)用方法，其特征在于該種新生兒腦膜炎的益生性治療和大腸桿菌致病因子的應(yīng)用方法中，該種預(yù)防和治療由腦膜炎病原微生物引起的新生兒腦膜炎的益生菌方法中的益生菌(Probiotic)制劑包括的細菌選自下列一組細菌Lactobacillus species，Bifidobacterium species，E.coli Nissle1917，和攜帶有針對包括GimA在內(nèi)的一種或多種致病因子的抗原的Probiotic菌類。
本發(fā)明一種新生兒腦膜炎的益生性治療和大腸桿菌致病因子的應(yīng)用方法，其特征在于該種預(yù)防和治療由腦膜炎病原微生物引起的新生兒腦膜炎的益生菌方法中，該益生菌(Probiotic)制劑是非消化性的食物，這些食是通過促進有益細菌的生長或活性和抑制包括GimA在內(nèi)的所說的腦膜炎致病因子來改善健康的。
本發(fā)明一種新生兒腦膜炎的益生性治療和大腸桿菌致病因子的應(yīng)用方法，其特征在于它包括一種治療由腦膜炎病原微生物導(dǎo)致的新生兒腦膜炎的益生菌(Probiotic)方法，其包括施用一種具有治療效果的益生菌(Probiotic)制劑來增強益生菌(Probiotic)生物的有益作用，同時對一種或多種腦膜炎致病因子產(chǎn)生抑制。
本發(fā)明一種新生兒腦膜炎的益生性治療和大腸桿菌致病因子的應(yīng)用方法，其優(yōu)點和達到的功效是盡管抗微生物化療取得進展，但與新生兒革蘭氏陰性bacillary性腦膜炎相關(guān)的死亡率和發(fā)病率依然很高。因此，對細菌性腦膜炎發(fā)病過程和相關(guān)的細菌基因和細菌蛋白的進一步了解，有助于發(fā)展出針對這種疾病的新的治療、預(yù)防和診斷工具，這有助減低死亡率和發(fā)病率。所以，本發(fā)明涉及一種新生兒腦膜炎的益生性治療和大腸桿菌致病因子的應(yīng)用方法，提供一種完整核酸序列的方法，對細菌性腦膜炎發(fā)病過程和相關(guān)的細菌基因和細菌蛋白的進一步了解，有助于發(fā)展出針對這種疾病的新的治療、預(yù)防和診斷工具。
本發(fā)明涉及到調(diào)整E.coli菌，特別是E.coli的腦膜炎菌株的基因和蛋白質(zhì)。并對ibeA基因簇(GimA)基因及由這些基因，特別是ibeA基因所編碼的蛋白質(zhì)的特征所進行的鑒定，和相同的基因組成以及利用這些基因組成，提供分離或純化的核酸序列，序列編碼ibeA基因簇中的基因，為由ibeA基因簇基因編碼的蛋白質(zhì)提供氨基酸，提供一種重組分子，而這種重組分子由一種載體和ibeA基因簇的一個或多個基因的全部或部分核酸序列，并生產(chǎn)有ibeA基因簇編碼的重組蛋白質(zhì)，提供診斷E.coli腦膜炎的方法，所以，提升我們對親生物學(xué)及其在感染性疾病的管理，尤其是對新生兒細菌性腦膜炎管理方面的應(yīng)用的理解，并提供疫苗和抗微生物制劑，以此來特異性攻擊腦膜炎細菌但同時又能保護益生性微生物。
本發(fā)明也涉及一種細菌性腦膜炎的治療發(fā)，特別是用益生菌/益生素方法和細菌通透性增強蛋白來治療新生兒腦膜炎的方法。益生菌/益生素能通補充被抑制的非致病性細菌和抑制病原微生物的生長來增加正常微生物菌落，并提供一種篩選測定方法，用來評估候選制劑的治療潛力，即評估該制劑是否能抑制IBEA蛋白誘導(dǎo)的細胞凋亡。
本發(fā)明的證據(jù)提示微生物對血腦屏障的穿透和進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)是多種微生物與BMEC-BBB的一種主要成分之間的特異性相互作用的結(jié)果，并查明了有幾種大腸桿菌K1的效應(yīng)物在細菌對BMEC的侵入中起作用。
本發(fā)明證明與父本菌株相比ibeA(10A-23)的突變型TnphoA在體外對BMEC及在血源性腦膜炎的新生大鼠模型中的侵入性均明顯低下。由部分ibeA基因編碼的一種小的重組蛋白片段(8.2kDa)能阻斷大腸桿菌K1對人類BMEC的侵入。對ibeA基因特點的進一步堅定中，我們獲得了多方面的證據(jù)來表明全長ibeA基因編碼產(chǎn)物是一種5kDa的蛋白質(zhì)，推斷的蛋白質(zhì)序列提示IbeA是一種含有三個跨膜區(qū)結(jié)構(gòu)的潛在的膜結(jié)合蛋白。由此，本發(fā)明測定了完整的50kDa的IbeA重組蛋白更能有效地阻斷大腸桿菌K1對BMEC的侵入，僅1μg的劑量就能達到相同的抑制程度，即IbeA的8.2kDa的片段代表了該蛋白與IbeAR相互作用的部分結(jié)合區(qū)，而IbeA的其他結(jié)構(gòu)則需要用來完成細菌與BMEC之間優(yōu)化的相互作用。相對已存技術(shù)曾證明IbeA的部分片段抑制大腸桿菌K1對BMEC的侵入，需要高劑量(50μg)才能達到大約80％的抑制效應(yīng)。
本發(fā)明的數(shù)據(jù)進一步支持，ibeA是大腸桿菌侵入BMEC的一種主要的效應(yīng)物，而這種侵入是腦膜喪性大腸桿菌致病的一個必要步驟。本發(fā)明的研究是要闡明ibeA位點在協(xié)助大腸桿菌侵入血腦屏障過程中的作用機制。
本發(fā)明的數(shù)據(jù)標(biāo)明，在E44中，IbeA是誘導(dǎo)人的EC發(fā)生細胞凋亡的一個主要的凋亡誘導(dǎo)因子，但該因子的作用可被抗內(nèi)毒素蛋白的BPI所抑制。在很多大腦疾病包括細菌性腦膜炎中，神經(jīng)原的損傷和壞死均歸因于細胞凋亡。因而用BPI這樣的抗凋亡制劑來阻斷IbeA對凋亡過程的誘導(dǎo)將會是預(yù)防和治療新生兒大腸桿菌腦膜炎的一種新方法。
本發(fā)明涉及一種新生兒腦膜炎的益生性治療和大腸桿菌致病因子的應(yīng)用方法的一種新方法，提供一種完整核酸序列的方法，對細菌性腦膜炎發(fā)病過程和相關(guān)的細菌基因和細菌蛋白的進一步了解，有助于發(fā)展出針對這種疾病的新的治療、預(yù)防和診斷工具。


圖1 表示大腸桿菌K1菌株中ibeA基因的完整核酸序列和推斷的氨基酸序列。該蛋白質(zhì)的全長片段的計算分子量為50-KDa。黑體標(biāo)注的核酸序列包含潛在的核糖體結(jié)合部位(RBS)和-10及-35啟動子區(qū)。N一端的前15個氨基酸殘基(意大利字體)與分離的50-KDa蛋白質(zhì)的N一端序列的衍生序列完全相同，這種分離的蛋白質(zhì)為攜帶有ibeA基因(圖2B中縱列)的E.coli BL21(DE3)菌種所表達產(chǎn)生。畫有底線的部分為三個有爭議的跨膜區(qū)域。黑體標(biāo)注氨基酸序列表示前述ibeA的部分開放閱讀框架(ORF)[Huang SH.et al，Infect Immun(1995)；634470-5]。箭頭分別指示ibeA中的TnphoA插入部分(nt 506和nt 507之間的垂直箭頭)和ZD1的缺失(右向箭頭，起始于nt 151；左向箭頭，起始于nt 1455)。
圖2 表示IbeA蛋白質(zhì)在體外和體內(nèi)的生物合成。在A組中，兩個在E.coli T7S30提取測是系統(tǒng)中的兩個體外相連的轉(zhuǎn)錄/翻譯的產(chǎn)物在同一十二烷基硫酸鈉一聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)(10％的聚丙烯酰胺)中平行電泳。右邊指出分子量標(biāo)示物的大小。后面的模版被加到反應(yīng)混合物中縱列1，是攜有ibeA一個2.3kb位點的pFN23A；縱列2是Pfn476(載體)。一種50-Kda的蛋白質(zhì)產(chǎn)生于pFN23A(縱列1)而不是在pFN476(縱列2)。在B組中，是在IPTG-誘導(dǎo)下，用載體pFN476轉(zhuǎn)化的E.coli BL21(DE3)的總蛋白提取物的SDS-PAGE圖譜(縱列1)，和用攜有ibeA基因全部ORF衍生于pFN476的質(zhì)粒pFN23A的總蛋白提取物的SDS-PAGE圖譜(縱列2)蛋白質(zhì)標(biāo)準品的混合物(低分子標(biāo)示物)走膠于縱列3，其分子量數(shù)值(用Kda)已被標(biāo)示出?？v列1(圖2A)和縱列2(圖2B)中多出的蛋白條帶可能來源于IbA蛋白質(zhì)過分表達時產(chǎn)生的殘缺蛋白。
圖3 表示IbA蛋白的表達和純化。A組中，顯示了用IPTG誘導(dǎo)，用載體Pff28a(t)轉(zhuǎn)化的E.coli BL21(DE3)的總蛋白抽提物的SDS-PAGE(10％pOlyacrylamide)圖譜(縱列1)，和用攜有ibeA基因(1.7kb)完整ORF的，由pET28a(t)衍生而來的質(zhì)粒pET12A轉(zhuǎn)化的E.coli BL21(DE3)的可溶性蛋白質(zhì)(縱列2)和不可溶蛋白質(zhì)(縱列3)的SDS-PAGE圖譜。標(biāo)準蛋白混合物(低分子標(biāo)示物)走膠于縱列4，其分子量用Kda標(biāo)出?？扇苄?縱列2)和非可溶(縱列3)部分的不同方式的蛋白分離區(qū)帶中，顯示一種53-Kda的蛋白質(zhì)顯著存在于包含體中(縱列3)，在B組中可以看出，一種在N-端帶有組胺酸標(biāo)記的53-Kda的重組IbeA蛋白質(zhì)在1PTG誘導(dǎo)后表達于PET17A的BL21(DE3)菌株中，這種蛋白質(zhì)經(jīng)由Ni-NTA瓊脂糖凝膠茶和柱純化，然后按材料和方法里敘述的序列分析法再折疊。這些蛋白質(zhì)經(jīng)SDS-Polyacrylamide凝膠分離，后經(jīng)柯瑪氏亮蘭染色?？v列1純化和再折疊的IbeA；縱列2分子量標(biāo)示物。
圖4 表示親和純化和再折疊的IbeA蛋白質(zhì)對E.coli K1侵入BMEC的抑制。人類BMEC單層伸展培養(yǎng)時加入BSA(對照)(μg/well)，或IbeA蛋白質(zhì)(μg/well)，37℃，1小時后，再加入細菌。侵入測定按實例中材料和方法中敘述的方法進行。每一測定值代表至少4次三復(fù)管實驗的平均值，誤差柱表示標(biāo)準誤差。
圖5 表示E44非侵入性突變體菌株與PUC23A和含有ibeA位點的PUC1030的互補性。E.coli E44是表達IbeA的RS218的一種自發(fā)的rifampin-抗體突變竹。10A-23和ZD1分別為TnphoA插入和isogenic缺失性突變株，其ibeA均衍生自E44。侵入性測定按實例中材料和方法中敘述的方法進行。圖中顯示突變株相較于親代株E44的相對侵入性。也顯示出TnphoA突變株10A-23(A)和ibeA的等基因缺失突變株(B)之間的互補性。結(jié)果為4次不同實驗的平均數(shù)；短柱代表標(biāo)準誤差(SD)。
圖6 顯示了涵蓋20.3kb gimA的重疊DNA克隆和通過引物行走(Primer-Walking)方法來進行的DNA測序結(jié)果。通過篩選Lanbda GEM-12/RS218基因組DNA文庫(A10-8和A10-30)和PCR克隆方法，鑒定出3個重疊的克隆。圖中表示A10-8和A10-3兩者之間ibeA的共同區(qū)域，以及L7和A10-8之間的重疊區(qū)域。30TT(a-f)，30TT(1-3)，8T3(a-c)8T3(1-6)，10A5-(2-11)，10A3-(1-7)，和L7SP1表示用來進行DNA序列分析的引物。
圖7 顯示了遺傳島gimA的相關(guān)遺傳位點和操縱子結(jié)構(gòu)。開放的長方形表示GimA的ORFS及其在E.coli K12基因中的定位。轉(zhuǎn)錄方向用箭頭朝向來表示。該GimA由4個Operous構(gòu)成(GimA 1，2，3，4)。
圖8 通過序列比較來展示ORF注解。在E.coli K-1菌株RS218中15個由遺傳島GimA編碼的ORFs中有13個ORFs顯示出與E.coli K-12菌株的相應(yīng)的共生同源性體有明顯的序列同源性。
圖9 表示基于與ClustalW的多種組合而產(chǎn)生的GimA的12種基因產(chǎn)物的系譜樹。
ECOK1E.coli K1株；ECOK12aE.coli K12株；ECOK12bE.coli K12株；ECOK12cE.coli K12株；CORGLBACSUMYCTUHAEIMHaemophilusinfluenzae；SYNY3AISCMAVLMYCLALCEURalstonia eutropha；CAEELCaenorhabditis elegans；DROMEDrosophila melanoguster；STRCOStreptomyces coelicolor；TRYBBVIBPAPAEPUBACIPSEPUBACIPSEUCITFRPICPAPichia pastoris；SCHPOSchizosaccharomyces Pambe；PICANPichia angusta；PSEAECBK12GARK12RHOCARhodobacter capsalatus；SALTYLACSKLISMOSTAAUMYCPNMCYGELYCEXANCPXanthomohascampestris PV.Campestris。
圖10 表示Na(+)H(+)反向轉(zhuǎn)運體的4種序列的多種組合，如同在CLUSTALW和DIALIGN中見到的情況。在序列中有高于52％的相同或相似殘基分別用黑色和陰影背景畫出。按從、上排至下排順序，序列名稱分別為來自E.coli K-1(ECOK1)的IbgT；來自H.influenzae(HAEIN)(Q57007)的Na(+)H(+)反向轉(zhuǎn)運體來自B.firmas(BACF1)(P27611)和B.subtilis(BACSU)(P54571)的Na(+)H(+)反向轉(zhuǎn)運體。
圖11A-11D(即序列表)表示ibeA基因簇的核酸序列。其中各種基因的起始位點在表4的第4欄中給出。例如PptE的起始位點是在其互補鏈上的第1694位點。由gimA1和gimA！操縱子編碼的蛋白質(zhì)是由圖11A-D上核酸序列的一條互補核酸序列編碼的。
圖12表示的氨基酸序列是下列基因的產(chǎn)物，分別為PgdK(GimA1)；PptE(GimA1)；PmpT(GimA1)；PdaK(GimA1)；CgrD(GimA2)；CgrD GimA2)；gxT(GimA2)；CdlD(GimA2)；Cnit(GimA2)；GcxK(GimA2)；GcxR(GimA3)；GclA(GimA3)；GhyI(GimA3)；IbgR(GimA4)；IbgT(GimA4)。
圖13 表示IbeA蛋白對細胞凋亡的誘導(dǎo)(右上格)及細菌通透性增強蛋白(BPI)對這種誘導(dǎo)活性的抑制(右下格，IbeA與BPI之間的比率為1∶1)。左上格表示內(nèi)皮細胞孵育中同時加有BSA和IbeB蛋白。左下格表示在內(nèi)皮細胞孵育僅單獨加有BPI。
具體實施例方式
“核酸序列”一詞在本發(fā)明中用來表示脫氧核糖核酸(DNA)，核糖核酸(RNA)，也表示cDNA。這里所說的基本同源是指IbeA基因簇中某些核酸的基因序列之間基本上是相符合的(圖1；圖11)?；旧贤词侵复蠹s30％至100％的同源，優(yōu)先為大約60至67到100％的同源。更優(yōu)先為大約80-100％的同源性，這種同源性是指某一IbeA基因簇序列和另一任何一種其他種類核酸序列之間的同源。另外，本文也用基本同源來表示IBEA基因簇的某一氨基酸序列(圖1和圖11所示)和另一種其他類型的氨基酸序列之間的基本相符。
“調(diào)整(modulation)”用來表示某種基因轉(zhuǎn)錄或蛋白質(zhì)表達，或蛋白質(zhì)活性的增加或減少。
“可特異性雜交”一詞用來表示互補或精確配對的充分程度，即是否能在某種核酸序列和目標(biāo)DNA或RNA之間發(fā)生穩(wěn)定和特異的結(jié)合。從文獻中已了解到要獲得特異的雜交并不需要某一核酸序列與目標(biāo)核酸序列之間要達到100％的互補。
“相應(yīng)于(corresponds to)”一詞用來表示與設(shè)定序列之間的同源和基本相同或功能上的相同性。
本發(fā)明提供ibeA基因簇基因的核酸序列(圖1；圖11)，這些序列編碼15種蛋白質(zhì)(圖2，圖12)，這些蛋白質(zhì)可調(diào)整腦膜炎性E.coli的毒性及由此產(chǎn)生的致病力，如在新生兒中發(fā)生的細菌性腦膜炎。例如，IbeA基因可調(diào)整腦膜炎性E.coli穿越血腦屏障(BBB)的能力，并誘生細胞調(diào)亡。圖1和圖11(表4)中所示的IbeA基因簇的核酸序列代表本發(fā)明優(yōu)選的具體實施例范。然而，對于本技術(shù)領(lǐng)域的熟練人員來說，這一點是可以理解的，即由于圖1和圖11所示的基因序列的遺傳編碼變異中的簡并仍將導(dǎo)致一種DNA序列，該序列有可能編碼相應(yīng)于那種基因序列的IBEA蛋白質(zhì)。這種DNA序列因而在功能上相同于圖1和圖11中提出的序列，因而來發(fā)明有意將其包含在其中。另外，在本技術(shù)領(lǐng)域的熟練人員也將理解，將會有自然發(fā)生的等位基因變異會出現(xiàn)在圖1和圖11顯示的某一特定種類的核酸序列中，因而這些變異也將為本發(fā)明有意包含在內(nèi)。
本發(fā)明進一步包括在功能上與本發(fā)明的IbeA的操縱下蛋白或基因簇蛋白基因相同的蛋白質(zhì)或多肽或它們的類似物。這些蛋白質(zhì)或多肽包括但不限于一種蛋白質(zhì)的片段，或某一種蛋白質(zhì)的替換添加或缺失突變體。本發(fā)明也包括那些與IbeA基因簇產(chǎn)生的任何一種蛋白質(zhì)基本同源的蛋白質(zhì)或肽類?；就词侵副景l(fā)明的任何一種蛋白質(zhì)與其他任何一種氨基酸序列或蛋白質(zhì)或肽類之間70～100％的同源，優(yōu)選80～100％的同源，最優(yōu)選90～100％的同源。
“類似物(analog)”一詞包括與本文特別顯示(圖1和12)的任何一種氨基酸序列相比其氨基酸殘基基因相同的多肽，在這種多肽中，其一種或多個殘基已被一種功能上相似的殘基進行了保守性地替換，同時這種多肽也展現(xiàn)了本文描述的任何一種蛋白質(zhì)的功能。保守性替換的例證包括一個非極性(疏水性)殘基的替換，如異亮、纈亮或蛋氨酸被另一個非極性殘基和極性(親水性)殘基之間的替換，如精氨酸和賴氨酸之間，谷氨酸和天冬氨酸之間，甘氨酸和綠氨酸之間，一種堿性殘基的替換，如賴、精或組氨酸被其他殘基替換，或一種酸性殘基如天冬氨酸或谷氨酸被其他殘基所替換。
詞組“保守性替換”也包括用一種化學(xué)派生的殘基賴替一種非派生性殘基?！盎瘜W(xué)派生”表示已主體多肽含有一個或多個化學(xué)派生性殘基，這種化學(xué)派生是通過一種旁側(cè)功能團反應(yīng)賴進行的。例如這種派生分子包括這樣的分子，即在這些分子中，自由胺基功能團被誘導(dǎo)行程鹽酸胺，對一甲苯磺?；?p-toluene sulfonyl groups)碳苯甲?；?carbobenzoxy groups)，t-butyloxy carboxyl groups，氯化乙?；?chloroacetyl groups)或甲?；?formylgroups)，自由羧基(carboxyl groups)可能被誘導(dǎo)行程鹽類，甲基(methyl)和乙醚，或其他類型的醚類(esters)或酰？類(hydrazides)。自由化氫氧基可被誘生成氧-?；?O-acyl)或氧-烷基(O-alkyl)衍生物。組氨酸的咪唑氮(imidazole nitrogen)有可能被誘導(dǎo)形成氮-咪唑-苯甲基組氨酸(N-im-benzylhistidine)。其他化學(xué)派生物也包括那些含有一個或多個在20個標(biāo)準氨基酸基礎(chǔ)上自然發(fā)生氨基酸派生的蛋白質(zhì)或肽類。例如4-羥脯氨酸有可能用來替換脯氨酸，5-羥脯氨酸有可能取代賴氨酸；3-甲基組氨酸有可能取代組氨酸；α-氨基-Y-羥丁酸(homoserine)可能取代綠氨酸；另外鳥氨酸可能取代賴氨酸。本發(fā)明的蛋白質(zhì)或多肽也包括任何蛋白質(zhì)和多肽，只要這種蛋白質(zhì)和多肽含有一個或多個添加和/或缺失或殘基與IbeA基因簇的某一核酸序列編碼的一種序列相關(guān)。
本發(fā)明也提供了一種重組分子，該重組分子的組成一個或多個核酸序列(圖1和圖11)的全部或部分及一個載體。表達載體和制備表達載體的方法已可通過文獻廣泛被了解，適合本發(fā)明采用的表達載體至少包含一個與核酸序列可操控性連接的表達控制元件。該表達控制原件被插入到載體中，以便能控制和調(diào)節(jié)核酸序列的表達?？杀皇煜ぴ摷夹g(shù)的人員所理解的是，獲得正確的重組或獲得優(yōu)選的表達控制原件將取決于所選擇的宿主體統(tǒng)。
可被進一步理解的是，表達載體應(yīng)該含有額外的原件，而這些多出的原件對于含有核酸序列的表達載體在宿主中的轉(zhuǎn)染和隨后的復(fù)制是必要的。例如這些原件包括但并不限于復(fù)制起點和選擇用標(biāo)志物。對該技術(shù)熟悉的人員也會建議部理解這種載體可以采用傳統(tǒng)方法(見Ausubel et al，(1987)于Current Protocols in Molecular Biology”一書，John Wiley and Sons，New York，N.Y.)中介紹的常規(guī)方法賴容易地構(gòu)建而成，或已知商業(yè)方法。
本發(fā)明另一方面也設(shè)計重組表達載體導(dǎo)入的某種宿主體或細胞。有可能被采用的宿主細胞的實例包括但并不限于真核細胞，例如動物(內(nèi)皮細胞、上皮細胞)、植物、昆蟲和酵母細胞，及原核細胞如大腸桿菌。將攜有基因的載體有可能導(dǎo)入細胞的方法包括但不僅限于微量注射，電穿孔，轉(zhuǎn)導(dǎo)或利用DEAE-葡聚核，Iipofection，磷酸鈣或為本專業(yè)熟練人員在Sambrook et al，(1989)于”Molecular Cloning.A Laboratory Manual”(Cold SpringHarbor Press，Plainview，N.Y.)一書的專述中所了解到的其他方法。在某種優(yōu)選的實際應(yīng)用中，在真核細胞中有限的真核細胞表達載體被采用。這種載體的例子包括但并不局限于逆病毒載體，牛痘病毒載體，胰病毒載體，皰疹病毒載體，禽痘病毒載體，細菌表達載體，質(zhì)?；驐U狀病毒轉(zhuǎn)染載體。優(yōu)選的載體包括但并不限于pET28a核pCMV-HA。優(yōu)選的真核細胞株包括但并不限于內(nèi)皮或上皮細胞。
進一步的具體實用中，有宿主細胞表達的重組蛋白可通過粗制水解方法獲得，或能通過文獻中了解的標(biāo)準蛋白純化步驟加以純化，這些步驟中包括差別性沉淀，分子篩層折，離子交換層析，等電聚焦，凝膠電泳，親和或免疫親和層析等等[Ausubel et al(1987)見”Current Protocols in MolecularBiology”，John Wiley and Sons，New York，N.Y.]。當(dāng)進行免疫親和層析時，重組蛋白的純化有可能要通過一種結(jié)合有針對本發(fā)明蛋白的特異抗體的樹脂柱來進行[Ausubel et al(1987)見”Current Protocols in Molecular Biology”，John Wileyand Sons，New York，N.Y.]。
本發(fā)明的核酸序列或其部分序列可作為探針來檢測IbeA基因簇的任何一種基因，或檢測例如生物樣品中的任何一種基因產(chǎn)物(如信使核糖核酸(mRNAs))。從生物樣品中分離核酸可按標(biāo)準方法進行[Ausubel et al(1987)見”Current Protocols in Molecular Biology”，John Wiley and Sons，New York，N.Y.]。檢測則可按不同的常規(guī)方法學(xué)中的標(biāo)準方法來進行，這包括當(dāng)并不限于Northern Blot分析，PCR等[Ausubel et al(1987)見”Current Protocols inMolecular Biology”，John Wiley and Sons，New York，N.Y.]。本發(fā)明的探針是為進行檢測而優(yōu)選標(biāo)記和提供，標(biāo)記的實例包括當(dāng)并不限于放射性標(biāo)記，熒光標(biāo)記，光化學(xué)標(biāo)記[Ausubel et al(1987)見”Current Protocols in Molecular Biology”，John Wiley and Sons，New York，N.Y.]。在一個優(yōu)選的具體實施中一種生物樣品被用來檢測其中是否存在IbeA或IbeB基因或其基因產(chǎn)物，本發(fā)明的核酸序列(圖1和圖11)也可用作探針來檢測其他物種的同源性。
本發(fā)明的核酸序列或其部分序列對于腦膜炎性大腸桿菌特別是新生兒腦膜炎性大腸桿菌的診斷檢測是有用的。這種診斷性檢測按上述方法進行，即從生物樣品中檢測核酸序列，這種被檢測的核酸序列與本發(fā)明的核酸序列是互補性的。例如在一種生物樣品中，該診斷檢測方法可能由本發(fā)明的一系列核酸附著到一種支持物(例如半點印跡到尼龍雜交膜，參見Sambrook et al.)上，這種支持物再與從生物樣品尼龍中分離出的核酸相接觸。該診斷檢測的一個優(yōu)選實例體現(xiàn)在用本發(fā)明的核酸構(gòu)成一種微陣列(microarray)。
本發(fā)明的核酸序列可被用作微陣列的探針，構(gòu)成微陣列的表面固相，即將本發(fā)明的一系列核酸固定到微陣列的表面。微陣列可通過多種方式制備產(chǎn)生。兒探針可被連接到固定支持物或膜表面，這種支持物或其表面可用不同物質(zhì)來制成，例如玻璃，塑料(如聚丙烯、尼龍)，聚丙烯？胺，硝酸纖維素或其他物品將核酸連接到固相表面的方法包括當(dāng)并不限于在玻璃板上印刷(Schena et al，1995 Science 270467-470；DeRisi et al，1996，NatureGenetics 14457-460；Shalon et al，1995，Proc Natl，Acad，Sci，U.S.A.9310539-11286)；或噴墨打印機；或寡核苷酸合成(美國專利申請?zhí)?9/1008,120，申請日1998年1月16日)。
上述微陣列也可能是寡核苷酸的高密度陣列。已知的技術(shù)在用來制備這樣列陣時包含由上千中寡核苷酸，這些寡核苷酸與一確定的序列互補(見Fodor et al，1991，Science 251767-773；Pease et al，1994，Proc Natl，Acad，Sci.U.S.A.915022-502b；Lockhart et al.，1996，Nature Bietechnology 141675；U.S.Pat.Nos.5,578,832；5,556,752；和5,510,270；Blanchard et al.，Biosensors &Bioelectronics 11687-690)。其他制備微陣列的方法也可能被采用(Maskosand Soathern，1992，Nuc.Acids.Res.201679-1684；美國專利6136592；WO200054883；WO 200055363；WO 200053812；WO 200014273)。該微陣列可被用作生物芯片、多孔或其他裝置，或被整合進生物芯片，多孔或其他裝置。
本發(fā)明優(yōu)選的微陣列除采用本發(fā)明的一種或多種接酸外，還包括用作對照的非腦膜炎性大腸桿菌菌株的核酸。一個優(yōu)選的實例是在微陣列中包含了全部的IbeA基因簇。
熟悉本技術(shù)的人員將會了解到雜交和洗脫條件要進行選擇，由此本發(fā)明分析的核酸序列(如從生物樣品中分離的核酸)才能“特異性結(jié)合”或“特異性雜交”到核酸序列列陣中。優(yōu)化的雜交條件將取決于探針的長度(例如寡聚體與多達200個堿基的多聚核苷酸)核類型(如核糖核酸(RNA)或脫氧核糖核酸(DNA)及靶向核酸。核酸的特異(即嚴格的)雜交條件的常規(guī)參數(shù)已有人加以描述(Sambrook et al.，(Supra)；Ausubel et al.，1987，Current Protocols in Molecolar Biology，Greene Publishing and Wiley-Interscience，New York)。
可被用于上述檢測方法的生物樣品的案例包括，但并不限于腦脊髓液，血液，尿液，活檢標(biāo)本，病理標(biāo)本，和尸檢標(biāo)本。本發(fā)明的核酸序列(圖1和圖11)液能用來分析其他物種的同源性。
本發(fā)明進一步包括與IBEA蛋白活其多肽或其一部分發(fā)生反應(yīng)的一種或多種抗體。本發(fā)明的一個具體實例是這些抗體是起源于單克隆或多克隆的抗體，可通過常規(guī)方法來制備(Kohler and Milstein(1975)Nature 256 495-497，Campell“Monoclonal Autibody Technology，the Production and Characterization ofRodent and Human Hybridomas”in Burdon et al<eds.>(1985)“LaloratoryTechniques in Biochemistry and Molecular Biology.”Volume 13，Elsevier SciencePublishers，Amsterdam；PCT Patent opplications Pullication number WO 901443，WO 901443 and WO 9014424 and in Huse et al.，(1989)Science 2461275-1281)。用來產(chǎn)生抗體的蛋白質(zhì)或其一部分可從腦膜炎性大腸桿菌K1菌株中分離出，也可重組性制備，或化學(xué)合成(Merrifield，R B(1963)J.Amer.soc.852149)。假如選用來制備抗體的蛋白片段太短而缺乏抗原性，可將該片段連接到載體分子上以便增強肽片段的抗原性。載體分子的例子包括但不限于人白大奶，牛白蛋白和鑰孔蟲戚血羊素(”Basic and ClinicalImmunology”(1991)Stites，D.P.and Terr A.I.(eds)Appleton and Lange，Nor WalkConn.，San Mateo；Calif)。
本發(fā)明的抗體也可用于免疫測定以便能檢測省去樣品中的新的蛋白質(zhì)?？赡懿捎玫拿庖邷y定方法暴客但不限于放射免疫測定，Western Blot測定，免疫組化測定，免疫熒光測定，酶聯(lián)免疫測定，化學(xué)發(fā)光測定，等(In“Principles and Practice of Immunoassay”(1991)Christopher P.Price and David J.Neoman(eds)，Stocktom Press，New York，N.Y.；Ausubel et al.，(eds)(1987)in“Current Protocols in Molecular Biology”John Wiley and Sons，New York，N.Y.)。適用于這些檢測方法的生物樣品包括但不限于血液樣品，腦脊髓液，尿樣，活檢標(biāo)本，病理標(biāo)本，尸檢標(biāo)本。蛋白質(zhì)可按常規(guī)方法(見Ausubel etal.，(eds)(1987)in“Current Protocols in Molecular Biology”John Wiley and Sons，NewYork，N.Y.)。從生物樣品中分離提取。
本發(fā)明的蛋白或其部分片段可能被用于制成疫苗。該疫苗首先用作任何一種細菌性腦膜炎的臨床指征，或在感染期用于增強兵刃自身針對攜帶致病性蛋白的腦膜炎病原體而不是益生性細菌的免疫反應(yīng)。
作為一種免疫原，該疫苗可包括本發(fā)明的一種或多種蛋白質(zhì)或其部分片段。疫苗的應(yīng)用可按創(chuàng)規(guī)方法進行。例如，免疫原可用于一種適合的稀釋液如鹽水或水，或完全佐劑，或不完全的佐劑。此外，免疫原可以或者也不必與一種載體結(jié)合從而成為免疫原性蛋白。這些載體分子的例證包括但不限于牛血清白蛋白(BSA)，鑰孔嘁血蘭素(KLH)，破傷風(fēng)類酶素(tetanus toxoid)，等。這些免疫原也可與脂蛋白偶聯(lián)或制成脂質(zhì)體形成或與佐劑相聯(lián)。這些免疫原的實施可通過任一適宜的途徑進行，例如經(jīng)由靜脈，腹腔，肌肉內(nèi)，皮下等。該免疫原可一次施用或周期性間隔施用，直到抗-GIMA的免疫細胞或抗體的效價顯著產(chǎn)生時為止。此外，本發(fā)明的表達載體也可能被用來制作疫苗。例如一種包含GimA及ibeA基因的全部或部分基因序列的表達載體，其表達的蛋白質(zhì)已表明是具有棉衣原性的致病因子。該GimA基因能被克隆進一種質(zhì)粒載體例如pVR1020(Vical，Inc.，SanDiego，Calif)該疫苗可用小鼠這樣的動物模型來加以測試。這種DNA疫苗能通過皮內(nèi)接種導(dǎo)入小鼠，并可通過酶聯(lián)免疫吸附測定來檢測免疫小鼠血清中的抗體效價。被誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體也可通過GimA及ibeA蛋白質(zhì)免疫印跡來測定。在完成了初次免疫和間隔2周的多次加強免疫后，就可在大腸桿菌腦膜炎的新生小鼠模型中測試免疫菌的保護性。
本發(fā)明的抗體亦可作為一種抗腦膜炎性細菌的制劑用于某一研究對象。優(yōu)選將這種抗體的使用過程作出這樣的設(shè)計，從而降低該抗體在使用過程產(chǎn)生的針對其自身的逆免疫反應(yīng)。(如嵌合抗體，具有人類屬性的抗體；Robinson et al.，International Patent Application 148，187；Taniguchi.M.，Eurpoean Patent Application 171，496；Morrison et al.，European Patent Application173，494；Neuberger et al.，PCT Application WO 86/01533；Cabilly et al.，1987 PNASUSA 843439；Nishimura et al.，1987，Canc.Res.47999；Wood et al.，1985 Nature314446；shaw et al.，1988 J.Natl Cancer Inst.8015553；Morrison S.，1985 Science2291202 and Oi et al.，1986 BioTechnigues 42147)。
盡管采用純化或基本純化的方法來施用上述疫苗或抗體是可能的，但還是優(yōu)選采用藥物學(xué)特性的制劑、配方或制備物。為適宜用于獸醫(yī)和人類，本發(fā)明的配方同時含有本發(fā)明的一種或多種疫苗或抗體及一種或多種藥物學(xué)上可接受的載體和選擇性地采用其他活化劑(如，添加抗原以便形成多價疫苗，抗生素，細菌通透性增強蛋白(BPI)等或治療性成分。這些載體必須是可接受的，即在與本配方的其他成分的相容性方面講是“可被接受的”，同時對于接受者來說的無害的。載體的特性將取決于實施途徑。這種制劑也可能含有其他額外的載體；稀釋劑；填充物；鹽類；緩沖劑；穩(wěn)定劑；溶解劑及其他在文獻中了解到的物質(zhì)。配方的制備可按藥物學(xué)文獻中普遍了解的任一方法來進行。
設(shè)計到配方時，溶液將被采用一種與劑量配方，有效劑量和不同劑型相適應(yīng)的方式。例如，本發(fā)明的一種有效濃度的制劑，可能用于口服，外服，眼睛內(nèi)，非腸道的，鼻腔內(nèi)，靜脈內(nèi)，肌肉內(nèi)，皮下，皮內(nèi)；或任何其他有效的途徑。這些獨特的水溶液特別適用于靜脈內(nèi)，肌肉內(nèi)，皮下，腹腔，口服，腦腔內(nèi)，，腦脊髓液，胸腔內(nèi)，眼睛，或外服(皮膚抹液)。對于配方來說，溶液將被采用一種與劑量配方、有效劑量和多種不同劑型相適應(yīng)的方式。
本發(fā)明也涉及一種細菌性腦膜炎的治療發(fā)，特別是用益生菌/益生素方法和細菌通透性增強蛋白(BPI)來治療新生兒腦膜炎的方法。益生菌/益生素(probiotics/prebiotics)能通補充被抑制的非致病性細菌和抑制病原微生物的生長來增加正常微生物菌落。例如干酪乳酸桿菌(Lactobacillas Casei GG(LGG))被用于多種嬰幼兒腸道紊亂，包括腹瀉，養(yǎng)料吸收障礙(malabsorption)和艱難梭菌性結(jié)腸炎(Clostridium difficile colitis)[Matter，A.F.et al.，(2002)，pediater Sura Iut.18586-90]的治療。有建議指出母乳能增加胃腸道內(nèi)雙叉桿菌(Bifidobacterium)，由此，相對于配方食品喂養(yǎng)來講，母乳喂養(yǎng)對嬰兒的健康更為有利。益生性細菌(Probiotic bacteria)如乳酸桿菌素(Lactobacillus)，雙叉桿菌素(Bifidobacterium)和多形擬桿菌素(Bacteroidesthetaiotaomicron)可能會抑制腦膜炎病原菌的生長。益生菌方法治療可用腦膜炎大腸桿菌的新生鼠模型來進行測試。BPI能與內(nèi)毒素高親和性結(jié)合(見實例13所示)并阻斷IbeA誘導(dǎo)的細胞凋亡。用BPI來進行的治療可首先用腦膜炎大腸桿菌的新生鼠模型來進行測試。人類臨床實驗的劑量基于BPI逐漸加量的臨床試驗來決定。本專業(yè)的熟練人員將知道劑量的選擇需要因人而異，以便對某一施用主體達到最大效應(yīng)。這些熟練人員也會進一步理解劑量的采用對一個正在進行治療的個體來講也會依據(jù)該個體的年齡，感染的嚴重程度或階段，及對此治療過程的發(fā)揚而有所變化。這些熟練技術(shù)人員也會知道通過本文陳述的方法來評估臨床參數(shù)，從而為正接受治療的主體決定適宜的劑量。這種劑量將可由醫(yī)生決定有必要施用的次數(shù)和時段。
本發(fā)明也涉及一種篩選測定方法，該方法用來評估候選制劑的治療潛力，即評估該制劑是否能抑制IBEA蛋白誘導(dǎo)的細胞凋亡。在實例中，一種候選制劑的治療潛力可通過實例13敘述的方法來緊張測定。多種不同的細胞(例如內(nèi)皮或上皮細胞)。適用于本主體申請的測定方法的候選制劑可以是例如來源于化學(xué)、營養(yǎng)或生物成分的任何類型的分子。這些候選制劑可能包括多種不同的化學(xué)分類物質(zhì)，盡管典型的化學(xué)物質(zhì)是有機化學(xué)分子，然而優(yōu)選的則是小分子有機化合物，而這些化合物的分子量介于50-2,500道爾頓(Daltons)之間。這些分子可能包含某些功能基因，而這些功能團是與蛋白或核酸發(fā)生結(jié)構(gòu)上的相互作用所必要的。在實例中，化學(xué)制劑可能是新的，未經(jīng)過試驗的化合物，類似物，拮抗物，或已知治療制劑的改型劑。
上述制劑也可以從生物分子中找到，這些分子包括，但不限于肽類，多糖類，脂肪酸，抗體，類固醇，嘌呤，嘧啶，與毒素偶聯(lián)的細胞因子，以及這些分子的衍生物或結(jié)構(gòu)類似物；或人工制劑的與一種生物反應(yīng)修飾因子的功能相仿的分子。營養(yǎng)物來源的該類制劑的例子包括，但不限于植物或動物的提取物，或這些提取物的提取物。制劑也包括反義寡核苷酸，包括反義肽段的核酸(Good et al.，(2001)Nature Biotechology 19360)。
上述制劑可獲得很多種來源包括人工合成或天然化合物文庫。此外，以細菌，真菌，植物和動物提取物形式存在的天然化合物文庫已可獲得或容易產(chǎn)生，天然或人工合成產(chǎn)生的文庫或化合物也容易通過常規(guī)化學(xué)、物理和生物方法來加以修飾，并可能用來產(chǎn)生組合性文庫。已知的藥物學(xué)制劑有可能被用來加以隨機的或指定的化學(xué)修飾，如?；?，烷基化，脂化，酰胺化等，由此生成結(jié)構(gòu)類似物。
也提供了進行本發(fā)明測定的試劑盒(如診斷測定)。這些試劑盒包括本發(fā)明的微陣列。這種微陣列可能被體現(xiàn)為一種生物芯片或多孔構(gòu)造或任一其他形式的構(gòu)造。這些試劑盒進一步可能包括一個或多個添加劑，例如緩沖劑，引物，酶，標(biāo)記物等，以便于進行檢測。這些試劑盒進一步有可能包括或被共同包裝于一種儀器，以便于檢測的實施或分析。這種儀器可能是一種抽吸器，注射器，加樣器，鑷子，量匙，眼滴管或任何一種在醫(yī)學(xué)上被認可的輸送器。本發(fā)明的試劑盒也包括一張說明書，該說明書明確解釋了反義寡核苷酸的使用方法。本發(fā)明的試劑盒內(nèi)將典型地包括一種裝置，該裝置，例如注射或吹氣成型的塑料容器，能緊密填裝理想的試管以便市售。其他儀器包括能進行閱讀或監(jiān)控反應(yīng)的裝置。
本文參閱的所有書籍、文獻和專利已標(biāo)示于參閱引述處。以下應(yīng)用實例將說明本發(fā)明的不同方面，但這絕不是有意要將本發(fā)明局限于這些范圍之內(nèi)。
實施例1-6為了查明大腸桿菌涉及侵入大腦微血管內(nèi)皮細胞(BMEC)的結(jié)構(gòu)成分，先前曾采用轉(zhuǎn)座子TnphoA的突變發(fā)生來生產(chǎn)一組非侵入性的突變株。有4個非侵入性突變體10A-23，TA-33；23A-20和27A-6均各自含有一個單獨的TnphoA插入片段分別位于ibeA，ibeB，yijP和aslP，而這4個菌株對體外單層培養(yǎng)的大腦微細血管內(nèi)皮細胞的侵入性顯著降低，對hematogenous腦膜炎性大腸桿菌的新生大鼠模型的侵入性也明顯降低(Hoffman JA，et al.，InfectImmun(2000)685062-7；Huang SH，et al，Infect Immun(1995)；634470-5，HnangSH et al，Infect Immun(1999)；672103-9，Wang Y et al，Infect Immun(1999)；6674751-6)。
IbeA(ibe10)基因的部分內(nèi)部序列編碼一朝8.2-kDa的蛋白區(qū)域，通過PCR技術(shù)將該部分序列已被克隆，該克隆編碼產(chǎn)生的重組蛋白能抑制大腸桿菌K1菌株(如C5和RS218)對單層培養(yǎng)的BEMC的其如。IbeA基因普遍發(fā)現(xiàn)存在于腦脊髓液(CSF)中分離到的大腸桿菌K12(如DH5α和HB101)的實驗室菌株及非侵入性大腸桿菌株K1(如E412)則缺乏ibeA[Huang SH，et al，Infect Immun(1995)；634470-5；Bingen E，et al，J Infect Dis(1998)；177642-50；Bonacorsi Sp，et al，Infect Immun(2000)；682096-101]。此外，我們已在BMEC的便帽鑒定到一種約為55-kDa的受提蛋白(IbeAR)，該受體蛋白能與大腸桿菌的侵入性蛋白IbeA發(fā)生相互作用，對該受體蛋白的鑒定是采用IbeA-Ni-瓊脂糖和層析方法進行的[Prasadarao NV，et al，Infect Immun(1999)；671131-8]，提示IbeA參與大腸桿菌K1株侵入BEMC的過程是通過配體-受體相互作用進行的。
為評估IbeA介導(dǎo)的侵入在穿越血腦屏障中的重要性，應(yīng)該測試ibeA的全長基因和其等基因突變體編碼的侵入性蛋白的生物活性。在這種工作中，我們進一步通過染色體基因的置換，互補，體外翻譯和體內(nèi)蛋白表達方法對ibeA基因及其侵入性蛋白質(zhì)的特性作了鑒定。
實施例1-6的材料和方法菌株，質(zhì)粒和培養(yǎng)基菌株，質(zhì)粒載體，及它們的相關(guān)特性在表1中述及。本研究采用的突變株衍生自E44，一種自發(fā)的利福平抗性突變株，起源于腦脊髓液中的K1囊狀大腸桿菌RS218(018K1H7)，該菌株的特性已被鑒定[Kim，KS，et al，J CIM Invest(1992)；90897-905；Huang SH，et al，InfectImmun(1995)；634470-5，Silver RP，et al，Infect Immun(1980)；29”200-6].DH5α被用來作為宿主菌株，用于亞克隆和質(zhì)粒制備，以便于DNA序列的確定。BL21(DE3)攜有T7 RNA聚合酶基因，因而被用作IbeA蛋白表達的宿主菌。SM10(λpir)和DH5α(λpir)被用來制備ibeA的等基因突變株[Donnenberg MS，et al，Infect Immun(1990)，581565-71；Donnenberg MS，et al，Infect Immun(1991)，594310-7]。將含有質(zhì)粒的菌株培養(yǎng)于37℃的L broth(肉湯)(每升含有10克tryptone(胰凍)，5克氯化納(NaCl)和5克酵母粉(yeast extract)，L broth中還含有氨芐青霉素(ampicillin)(100μg/ml)，卡那霉素(Kanamycin)(50μg/ml)和利福平(rifampin)(100μg/ml)，以用作質(zhì)?；蚓甑年栃赃x擇(見表1)。細菌培養(yǎng)于L broth，并在-70℃中凍存于加有20％在甘油(glycerol)的L broth中。
化學(xué)物品和酶限制性內(nèi)切酶，T4 DNA連接酶，和其他酶類均購自新英格蘭生物實驗室(New England Biolabs，Beverly，MA)，除非另有說明?；瘜W(xué)物品均購自西格瑪公司(Sigma，St.Louis，Mo)。所有同位素均獲自新英格蘭原子能公司(New England Nuclear Corp.，Boston，MA)。用于制備DNA測序膠的試劑均為超純品質(zhì)，均來自國立診斷品公司(National Diagnostics，Atlanta，GA)。用于DNA測序反應(yīng)中與測序酶一起采用的試劑和其他化學(xué)品均購聯(lián)邦生化公司(United States Biochemical Corp.，Cleveland，OH)。DNA測序試劑盒及染料終止劑均獲自PE應(yīng)用生物系統(tǒng)公司(PE Applied Biosystem，F(xiàn)oster City，CA)。
質(zhì)粒的提取，處理和亞克隆所有遺傳物質(zhì)的操作均按標(biāo)準方法進行[Sambrook J，F(xiàn)ritsch EF，Maniatis T，Molecular cloninga laboratory manual，2nded.Cold Spring Harbor，New York；Cold Spring Harbor Laboratory Press，19891.1-18.57]。質(zhì)粒DNA的提取采用一種Plasmid Mini Kit C Qiagen Inc.，Chatsuorth，CA)。DNA片段的純化和瓊脂糖凝膠采用Geneclean來進行(Biolol，La Jolla，CA)。大腸桿菌的反應(yīng)潛能細胞在10％的甘油中制備，然后按前述電穿孔方法進行轉(zhuǎn)化[Huang SH，et al，Infect Immun(1995)；672103-9]。
侵入活性的測定侵入活性的測定按前述方法在人類BMEC中進行[Huang SH，et al，Infect Immun(1995)；634470-5，Huang SH，et al，Infect Immun(1999)；672103-9；Kim KS，et al，Subcell Biochem(2000)；3347-59；Stins MF，et al，Am J Pathol，(1994)；1451228-36；Stins MF，et al，J Neuroimmunol(1997)；7681-90]。大約107細菌加入到BMEC的匯合單層細胞中，感染復(fù)數(shù)為100。侵入百分率的計算公式為100×(細胞中細菌的回收數(shù))/(細菌的接種數(shù))。結(jié)果表示為相對侵入性(相對于親本大腸桿菌K1株的侵入性的百分比率)。
大腸桿菌RS218基因組文庫的構(gòu)建和篩選按前述方法從大腸桿菌K1菌株中純化出高分子量的染色體DNA[Huang SH，etal，Infect Immun(1995)；634470-5]。用Sau3Al(NEW Englang Birlabs，Beverly，MA)將基因組DNA做部分消化(15-23kb)然后用dGTP和dATP做部分添加。突種在5’端突出的懸掛部分(5’-GA-3’)被連接到LambdaGEMTM-12臂的相容性Xhol半位是(5’-TC-3’)上。Lambdu噬菌體的連接和包裝按廠家說明書進行(PromeguMadison，WI)。大腸桿菌的基因組難用DNA雜交方法來篩選[Huang SH，etal，Infect Immun(1995)；634470-5]，從而鑒定出含有ibeA的噬菌體克隆。含于pCIB10B的一種0.58-kb號的ibeA DNA后段[Huang SH，etal，Infect Immun(1995)；634470-5]在EcoRI作用下釋放出來，經(jīng)制備性瓊脂糖凝膠電泳和Geneclean(Biolol，Lo Jolla，CA)方法純化，再用寡核荷酸標(biāo)記試劑盒將[α32P]dCTP對其標(biāo)記(Pharmacia，Peapack，NJ)，即可用作篩選探針(＞1×108cpm/μg)。噬菌斑被復(fù)制到尼龍濾膜上，紫外光連接和雜交均按前述方法進行[Huang SH，etal，Infect Immun(1995)；634470-5；Huang etal，DNA Cell Biol(1994)；13461-71]。噬菌體與探針的雜交通過放射自顯影來鑒定，然后被純化。
體外轉(zhuǎn)錄和翻譯為了確定ibeA ORF的長度，用含有ibeA基因的DNA片段在體外進行轉(zhuǎn)錄和翻譯，實驗中采用了大腸桿菌T7S30提取物測定系統(tǒng)，按廠家說明書進行操作(Promega，Madison，WI)。反應(yīng)在50μl的反應(yīng)混合物中進行，反應(yīng)中要補充20μCi的[35S]蛋氨酸，和2μg的純化pFN476或重組的pFN23A，在30℃反應(yīng)2小時，取5μl含有35S-標(biāo)記蛋白的反應(yīng)液體作10％SDS-分析，待膠干燥后在Kodak X-Omat膠片上顯影過夜。
體內(nèi)蛋白表達和胺基端測序?qū)⒑衖beA的2.3kb的Sphl DNA片段克隆和表達于一種低拷貝數(shù)的質(zhì)粒載體pFN476上，該載體已成功用于十多種大腸桿菌K12的染色體基因克隆的表達分析，以制作出一種明確的表達圖譜[21]。重組質(zhì)粒pFN23A及其載體(pFN47b)被用來轉(zhuǎn)化一種大腸桿菌株BL21(DE3)，后者含有一種整體的T7 RNA聚合酶基因。這種載體中的大腸桿菌基因能優(yōu)先利用其T7啟動子來進行表達[Studier FW，et al，methodsEnzymol(1990)；18560-89]。為排除染色體基因的表達，利福平被用來阻斷大腸桿菌聚合酶的作用，然后加入IPTG。全部蛋白質(zhì)被用來進行10％ SDS-PAGE分析。待蛋白被電泳分離后，轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。用pFN23A轉(zhuǎn)化后過度表達的50kDa蛋白相應(yīng)的區(qū)帶剪下后作胺基端氨基酸序列的分析。
DNA測序和分析ibeA的完整核酸序列的測定采用Sanger等人的雙脫氧終端法進行[Sanger F，et al，PNAS USA(1977)；745463-7]，同時采用了Sequenase Version 2.0Kit，該試劑盒購自U.S.Biochemicals Corp(Cleveland，OH)，及購自Du Pont NEN Research Products(Boston，MA)。采用primer-walking技術(shù)來分析部分ibeA基因的旁側(cè)DNA的序列。DNA的兩條鏈均重復(fù)測序，采用熒光標(biāo)記核苷酸進行全動測序(373A ABI自動測序儀)，以確保測序的準確性，而序列測定數(shù)據(jù)則經(jīng)由威斯康辛大學(xué)遺傳學(xué)計算機小組研發(fā)的DNA分析程式來進行分析。DNA和推斷的蛋白質(zhì)序列被用來搜尋國立生物技術(shù)倍息中心的DNA和蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)[國立醫(yī)學(xué)圖書館，(National Library ofMedicine)，Washiagton，D.C.]，進行此項工作時采用了BLAST規(guī)則系統(tǒng)(algorithm)。
等基因框架內(nèi)缺失突變株的構(gòu)建為了查明腦膜炎性大腸桿菌在致病過程中其ibeA基的作用，通過重組體自滅性質(zhì)粒pVZD的整合生成了ibeA的框架內(nèi)缺失突變體。pVZD的構(gòu)建如下將兩個PCR產(chǎn)生的DNA片段，Z(0.9-kb)和D(1.2-kb)；鄰近一個1.3kb的區(qū)域，該區(qū)域在采用兩種引物(10A5-4a/10ZM6為Z和10A5M/10D3為D)后產(chǎn)生缺失，然后通過連接作用產(chǎn)生一個2.1kb的片段(ZD)，該片段攜有的ibeA存有著內(nèi)確實(表2)。用Smal將該ZD片段亞克隆到pVZD422重[17]。然后將攜有pVZD的SM10λpir與E44結(jié)合，即可獲得突變株，該突變株的選擇在含有ampicillin和利福平的LB瓊脂上進行。將單個形成的這種突變株克隆挑出后培養(yǎng)在LBbroth(肉湯培基)上，不加選擇地讓其生長到對數(shù)生長的后期。然后將稀釋夜鋪在LB培養(yǎng)板上，這種培養(yǎng)板不含氯化鈉，但含有5％的蔗糖。蔗糖抗性克隆被測試其是否喪失了ampicillin抗性，由此測知其載體序列是否丟失。PCR和DNA測序用來查證pVZD中的內(nèi)缺失，并確認該突變體中確定存在所需的染色體基因ibeA，這項工作需用引物10A5-3 Sa和10B3-4a(表2)。DNA擴增按以下循環(huán)程序進行35個循環(huán)；94℃ 1分鐘，58℃ 1分鐘，和70℃ 1.5分鐘[Kolmodin LA，et al，Methods Mol Biol(1997)；671-15]。
互補性分析在一個2.3-kb的Sphl片段中含有完整的ibeA ORF，該片段是在Sphl作用下從含有18Kb DNA片段的pUC1030中分離出來，在亞克隆pUC13。該結(jié)構(gòu)設(shè)定為pUC23A。E44菌株和ZD1突變株均由載體pUC13和重組質(zhì)粒pUC23A和pUC1030進行轉(zhuǎn)化。將E44用pUC13進行轉(zhuǎn)化。然后檢測這些突變株對BMEC的侵入能力。
構(gòu)建產(chǎn)生在N端帶有組氨酸標(biāo)記的重組ibeA蛋白下列重組結(jié)構(gòu)的制備按先前方法進行[Huang SH，etal，Infect Immun(1995)；634470-5]。來自pCR17A的BamHI-EcoRI片段含有IbeA編碼，將其消化后在1％瓊脂糖凝膠上分離，洗脫純化后連接到pET28a(+)的相同限制性位點上(Novagen)。這種構(gòu)建體(pET17A)的表達導(dǎo)致了一種融合蛋白的產(chǎn)生，即一種33個氨基酸肽鏈(包含T7-標(biāo)記和6X組氨酸標(biāo)記融合到IbeA的N端。該融合蛋白的分子量為53-kDa。含有T7RNA聚合酶基因的BL21(DE3)被用來作為pET17A轉(zhuǎn)化的宿主菌株。轉(zhuǎn)化體通過予測表型來鑒定(卡那霉素抗性)。蛋白表達的誘導(dǎo)通過0.5mM的IPTG在37℃時進行。
IbeA蛋白的純化按廠家說明書來進行重組蛋白的小規(guī)模表達和純化(Novagen，Madison，WI)。蛋白制備物分離自離心上清和沉淀，然后將此蛋白制備進行10％的SDS-PAGE分離。帶有組氨酸標(biāo)記的非溶性IbeA蛋白氨廠家說明在8M脲素條件下通過結(jié)合到Ni-NTA樹脂上來進行純化(Novagen，Madison，WI)。含有8M脲素的洗脫蛋白質(zhì)按先前方法再行折疊[Huang SH，et al，Infect Immun(1995)；634470-5]。終產(chǎn)物的純度按Laemmli步驟來進行評估，即將指定量的蛋白質(zhì)作10％SDS-PAGE分析[Sambrook J，F(xiàn)ritsch EF，Mahiatis T.Molecular Cloninga Laboratory Manuol，znd ed.Cold Spring Harbor，New York；Cold Spring Harbor Laboratory Press，19891.1-18.57]。蛋白濃度則按廠家說明采用BioRad蛋白標(biāo)準檢測劑來進行測定。蛋白質(zhì)對E44菌株侵入BMEC的影響將被檢測。簡單來講，是將純化的IbeA蛋白或牛血清白蛋白(用作陰性對照)在室溫條件下與BMEC共同培養(yǎng)1小時(0.125至1.5μg/孔)，然后加入細菌，侵入性實驗測定按上述方法進行。
實施例1含有全長ibeA基因的大片段DNA的分離和亞克隆大腸桿菌K1株RS218用來作為克隆實驗的DNA來源。已證明該菌株能侵入BMEC并在新生大鼠中誘發(fā)腦膜炎[Huang SH，et al，Infect Immun(1995)；634470-5]。為了克隆來自RS218的侵入性決定子，用LambdaGEM-12來構(gòu)建了該菌株的基因組文庫。采用ibeA的部分序列(0.58kb)作為探針。從大約5×105個重組噬菌體中篩選出2株克隆，被確定含有ibeA。該重組噬菌體的DNA被純化后再用Notl進行消化。插入片段的查過度介于16-18kb。一種含有ibeA的18kb片段被用來亞克隆進pUC13(pUV1030)和pWKS30(pWKS1030)。
實施例2ibeA的序列分析為進一步確認全長片段的ibeA基因，對含有全長ibeA基因的2.3kb Sphl片段堿性了測序。在這個區(qū)域中只鑒定到一個單獨ORF。如圖1所示，一個由1,368個核苷酸組成的指定為ibeA基因編碼的開放閱讀框架中含有456個氨基酸的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)的計算分子量為50kDa(圖1)。部分基因的少數(shù)測序誤差已被糾正。在Genbank中進行DNA和蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)的搜尋后，沒有觀察到ibeA和其他已知基因之間有明顯的序列同源性。潛在的-10(CTTATA)和-35(GTTAAT)啟動子區(qū)域存在于ibeA的5’端非編碼區(qū)。
實施例3核酸序列的存取編號(accession no.)ibeA的完整核酸序列已被存入基因庫的核酸序列數(shù)據(jù)文庫(GenBank Nucleotide Sequence Data Library)，其在GenBank中的進入序號為AF289032。
實施例4體外轉(zhuǎn)錄/翻譯和體內(nèi)蛋白質(zhì)表達系統(tǒng)產(chǎn)生的IbeA其分子量的確認IbeA蛋白的大小在一種大腸桿菌T7 S30提取檢測系統(tǒng)中通過蛋白表達實驗來甲乙查證。在這種系統(tǒng)中，含有ibeA基因的DNA片段的體外轉(zhuǎn)錄和翻譯是偶聯(lián)進行的。首先用這種系統(tǒng)檢測含有18kb ibeA位點的pWKS1030和從pWKS1030衍生而來的幾個限制性片段。一種50kDa的蛋白質(zhì)僅在pWKS1030中合成(未顯示數(shù)據(jù))和在攜有2.3kb Sphl片段的pFN23A中合成，提示全長ibeA基因很可能位于這個區(qū)域。如圖2A所示，含有全長ibeA基因的重組質(zhì)粒pFN23A在上述反應(yīng)混合系統(tǒng)中合成了一種50kDa的蛋白質(zhì)。這種通過ibeA結(jié)構(gòu)在體外翻譯系統(tǒng)中進行的50kDa蛋白質(zhì)的合成提示IbeA蛋白的大小為50kDa。為進一步明確ibeA的分子大小，pFN23A被用來進行體內(nèi)蛋白質(zhì)表達[Sanker P，et al，J Bacteriol(1993)；1755145-52]。這種表達系統(tǒng)在T7 RNA聚合酶的適時控制條件下可減弱毒性基因的作用。同樣大小(50kDa)的蛋白產(chǎn)物也出現(xiàn)在SDS-PAGE分析的凝膠中(見圖2B)。該蛋白區(qū)帶被分離出來用于N-端序列分析。IbeA N-端的氨基酸序列在圖1中表示。體內(nèi)外表達蛋白的大小和N-端序列正好與分子量和N-端序列相吻合(圖1)。
實施例5用純化的IbeA來阻斷大腸桿菌K1對BMEC的侵入，本工作克隆的DNA片段的IbeA的ORF被用來在大腸桿菌BL21(DE3)/pET28a的表達系統(tǒng)中進行表達，以便檢測這種蛋白的功能。這種結(jié)構(gòu)表達了一種功能性蛋白質(zhì)(組氨酸6-IbeA)，該蛋白由一種組氨酸6標(biāo)記物和全部ibeA ORF(50kDa)構(gòu)成。但這種可被鑒定的組氨酸6-IbeA融合蛋白在大腸桿菌BL21(DE3)菌株中表達時，一種53kDa的蛋白質(zhì)便出現(xiàn)在包含體中(圖3A)。用Ni-NTA親和層析方法可以從非溶性部分將組氨酸6-IbeA蛋白純化出來(圖3A)。重新折疊導(dǎo)致一種可溶性IbeA的遷移，也形成一個相同大小的單個區(qū)帶(圖3B)。對這種蛋白的功能進行了測試，即對這種純化的重組性IbeA蛋白是否能抑制E44菌種對BMEC的侵入進行了測試。測試用0.125至1.5μg的純化IbeA在室溫條件下與BMEC一起予孵1小時。然后在BMEC匯合生長的單層細胞中加入細菌以便檢測其侵入性。如圖4所示，這種IbeA蛋白能有效地抑制大腸桿菌K1對BMEC的侵入，并呈現(xiàn)劑量反應(yīng)方式，而對照蛋白BSA(牛血清白蛋白)則無此抑制作用。IbeA和BSA在這種實驗條件下對細菌的存活性均無影響。更重要的是，完整的重組性IbeA蛋白相對于其部分蛋白片段來，對于大腸桿菌K1對BMEC的侵入顯示出更高效率的阻斷作用(50倍)[Huang SH，et al，Infect Immun(1995)；634470-5]。表明完整蛋白質(zhì)更具有更高的功能活性。
實施例6ibeA-缺失突變株ZD1的結(jié)構(gòu)和互補性為了闡明TnphoA突變株10A-23的非侵入性表型是否與一種極性效應(yīng)有關(guān)，我們構(gòu)建了一種ZD1突變株，該突變株攜有的ibeA ORF缺失了95％。IbeA的缺失已通過PCR和DNA測序加以證實。在圖5中顯示了10A-23和ZD1的非侵入性表型。然而用攜有ibeA基因全部編碼區(qū)的pUC23A和帶有大部分ibeA區(qū)域的pUC1030均可完全恢復(fù)非侵入性突變株ZD1的侵入能力(圖5B)。pUC1030能完全互補TnphoA插入性突變體10A-23，而pUC23A能部分逆轉(zhuǎn)10A-23的非侵入性表型(圖5A)，提示添加的下游基因可能受入TnphoA插入片段的影響。然而，pUC1030并不能充分地互補非致病性大腸桿菌K12菌株HB101(未顯示數(shù)據(jù))。這些數(shù)據(jù)提供了進一步的證據(jù)來表明ibeA基因是涉及大腸桿菌K1侵入BMEC的主要效應(yīng)物之一。
表1大腸桿菌K1(腦膜炎相交的)或K12(非病原性的菌性和本研究所用的質(zhì)粒)


表1的參考文獻(1)Hiffman JA，ct al，Infect Immun(2000)；Huang SH，et al.Infect Immum(1995)；634470-5；Huang SH，et al，Infect Immun(1999)672103-9；(2)Huang SH，et al，Infect Immun(1995)；63；4470-5；(3)Donnenberg MS，et al，Infect Imman(1991)；594310-7；(4)Donnenberg MS，et al，Infect Imman(1990)；581565-71；Donnenberg MS，et al，Infect Imumun(1991)；594310-7；(5)Sankar P，et al，J Bacteriol(1993)；1755145-52；(6)Wang Y.et al，Infect Immum(1999)；67475 1-6；(7)Wang RF，et al，Gene(1991)；100195-9表2用來對ibeA基因進行克隆，測序和造成缺失突變的寡核苷酸

討論目前的證據(jù)提示微生物對血腦屏障(BBB)的穿透和進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)是多種微生物與BMEC-BBB的一種主要成分之間的特異性相互作用的結(jié)果[Huang SH，et al，Microbes and Infection(2000)；21237-44；Kim KS，et al，SubcellBiochem 2000)；3347-59]。
我們在大腸桿菌上對這個問題的研究表明大腸桿菌要成功地穿越BBB需要細菌和BMEC之間兩個互為獨立的相互作用，即大腸桿菌要先與BMEC結(jié)合，然后再侵入BMEC。我們先前已證明S fimbriae在大腸桿菌與BMEC的結(jié)合中發(fā)揮作用[Stins MF，et al，Am J Pathol.(1994)；1451228-36]；但通過SFimbriae與BMEC的結(jié)合并不伴隨對BMEC的侵入。隨后我們查明了有幾種大腸桿菌K1的效應(yīng)物在細菌對BMEC的侵入中起作用，這些效應(yīng)物即為IbeA，IbeB，YijP，AstA，和OmpA[Hoffman IJA；et al，Infect Immun(2000)；685062-7；Huang.SH，et al，Infect Immun(2000)；685062-7；Huang.SH，et al，Infect Immun(1995)；6344470-5；Huang.SH，et al，Infect Immun(1999)；672103-9；Wang Y，et al，Infect Immun(1999)；674751-6；Prasadaro NV.et al，Infect Immun(1996)；64146-51]。
IbeB，yijP，asiA，和ompA在大腸桿菌K12的基因組中存在同源性，但從腦脊髓液呈分離出的大腸桿菌長1菌株中，僅有ibeA基因被發(fā)現(xiàn)是一種特異的致病因子[Huang SH，et al，Infect Immun(1995)；634470-5；Bingen E，et al，J Infect Dis(1998)；177642-50；Bonacorsi SP，et al，Infect Immun(2000)；682096-101]。
我們先前曾證明與父本菌株相比ibeA(10A-23)的突變型TnphoA在體外對BMEC及在血源性腦膜炎的新生大鼠模型中的侵入性均明顯低下。由部分ibeA基因編碼的一種小的重組蛋白片段(8.2kDa)能阻斷大腸桿菌K1對人類BMEC的侵入[Huang SH，et al，Infect Immun(1995)；634470-5]。對ibeA基因特點的進一步堅定中，我們獲得了多方面的證據(jù)來表明全長ibeA基因編碼產(chǎn)物是一種5kDa的蛋白質(zhì)。第一個證據(jù)來自一種在大腸桿菌T7S30提取測試系統(tǒng)中進行的轉(zhuǎn)錄/翻譯實驗，表明ibeA的合成產(chǎn)物是一種50kDa的蛋白質(zhì)。該數(shù)據(jù)得到進一步支持，即測出體內(nèi)蛋白表達系統(tǒng)中表達和純化的IbeA蛋白與上述基因產(chǎn)物具有相同的分子量。且這種純化蛋白的前20個N-端氨基酸與根據(jù)DNA序列數(shù)列推斷的ORF的氨基酸序列的情況完全吻合。這些結(jié)果說明IbeA蛋白的分子量為50kDa。推斷的蛋白質(zhì)序列提示IbeA是一種含有三個跨膜區(qū)結(jié)構(gòu)的潛在的膜結(jié)合蛋白(圖1)。但是，未發(fā)現(xiàn)該基因與已知基因，包括其他任何一種已鑒定出的侵入蛋白基因之間的明顯同源性，因而建議IbeA是一種已知的但卻是獨特的微生物致病蛋白。
如前所述，ibeA基因最初是通過TnphoA的突變發(fā)生而得以鑒定到的[Huang SH，et al，Infect Immun(1995)；634470-5]。
為了排除一種可能性，即10A-23的非侵入特性可能涉及TnphoA的一種極性效應(yīng)，該效應(yīng)可能作用于其他涉及侵入特性的基因發(fā)生作用，因而建立了ibeA的一種等基因缺失突變體ZD1，并測試其對BMEC的侵入性表型特征。與Tnpho A突變型10A-23相同，ZD1對BMEC的侵入性也低。而ibeA基因編碼的50kDa的IbeA蛋白質(zhì)卻能部分或全部恢復(fù)10A-23和ZD-1突變體的侵入特性，達到其父本菌株E44的水平，由此提示下游部分增加的基因可能會受到ibeA基因中TnphoA插入片段的影響。此外，大腸桿菌K12菌株HB101不被pUC1030(未顯示數(shù)據(jù))互補，提示這些增加的效應(yīng)物可能有利于大腸桿菌在BMEC中的內(nèi)化過程和細胞內(nèi)存活。但仍需進一步查明大腸桿菌K1的多種不同的侵入性效應(yīng)物是如何協(xié)助細菌穿越的腦屏障的。
最近我們從BMEC中發(fā)現(xiàn)一種55kDa的膜蛋白，該蛋白與IbeA的部分片段(8.2kDa)相結(jié)合。這種IbeA變體(IbeAR)的可溶性形式和一種針對IbeAR的多克隆抗體能阻斷大腸桿菌K1對BMEC的侵入[Prasadarao NV，etal；Infect immun(1999)；671131-8]。
我們以前曾證明IbeA的部分片段抑制大腸桿菌K1對BMEC的侵入，但需要高劑量(50μg)才能達到大約80％的抑制效應(yīng)[Huang SH，et al InfectImmun(1995)；634470-5]。
但如同本報告所示，完整的50kDa的IbeA重組蛋白更能有效地阻斷大腸桿菌K1對BMEC的侵入，僅1μg的劑量就能達到相同的抑制程度?？傊?，這些發(fā)現(xiàn)建議以前報道的IbeA的8.2kDa的片段代表了該蛋白與IbeAR相互作用的部分結(jié)合區(qū)，而IbeA的其他結(jié)構(gòu)則需要用來完成細菌與BMEC之間優(yōu)化的相互作用。
由此可以得出這樣的結(jié)論，我們的數(shù)據(jù)進一步支持，ibeA是大腸桿菌侵入BMEC的一種主要的效應(yīng)物，而這種侵入是腦膜喪性大腸桿菌致病的一個必要步驟。正在進行的研究是要闡明ibeA位點在協(xié)助大腸桿菌侵入血腦屏障過程中的作用機制。
實施例7-12為了查明E.coli中與侵入血腦屏障(BBB)相關(guān)的結(jié)構(gòu)，我們采用轉(zhuǎn)座子TnphoA的突變誘發(fā)(transposon TnphoA mutagenesis)來產(chǎn)生了一組非侵入性的突變體。其中有4個非侵入性突變體即10A-23，7A-33，23A-20和27A-6中均各只含一個單獨的TnphoA插入片段，也不具有任何其他的表型和遺傳型特征的變化，它們在體外對BMEC單層細胞和在血源性腦膜炎型E.coli的新生大鼠模型中對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的侵入性均顯著降低(Huang et al，(2000)，Microbes and Infection.21137-44；Huang and Jong(2001)CellularMicrobiology；Huang et al.，(2001)J.Infect.Dis.1831071-8；Hoffman，J.A.et al2000)Infect.Immun.685062 5067)。此外，與E.coli侵入BBB相關(guān)的4個遺傳決定子ibeA，ibeB，yijp和aslA都已準鑒定。IbeB，yijp和aslA也同源性地存在于非被性E.coli K-12的基因組中。只有編碼一種50kDa蛋白質(zhì)的ibeA基因存在與腦脊髓液中分離出的E.coli K12(如C5和RS218)中；然后在E.coli K-12的實驗室菌株和非致密性與E.coli(如E412)中，無ibeA(HuangSH，et al.(1995)Infect Immun，634470-4475；Huang SH，et al.，(2001)J.Infect.Dis.1831071-8；Johnson，JR et al，(2001)J Infect Dis。183425-34)。IbeA位點能完全互補TnphoA插入片段和等基因缺失突變體10A-23和ZD1(Huang et al.)(2001)J.Infect Dis.1831071-8。
在此我們報告了一種20.3-kb的位點，該位點喊有的ibeA基因被發(fā)現(xiàn)在E.coli菌株中是獨特的。該基因位于yijD和yijE之間，與fim操縱從子相鄰接，但在非致病性E.coli菌株中缺如。該基因的G+C含量在某些區(qū)域與其他基因組不同，說明這種基因簇是一種含有ibeA的腦膜炎性E.coli的遺傳島(genetic island of meningitic E.coli containing ibeA(gimA))。此外，14個新的開放閱讀框架(ORF)已被鑒定。
實例7-12的材料和方法細菌株，質(zhì)粒和培養(yǎng)基，E.coli菌株(O18:K1:H7)是治療以上患有腦膜炎的新生片的腦脊髓液本分離得到[Huang SH.et al，(1995)Infect Immun，634470-4475]。E44是RS218的自發(fā)性利福平抗性突變株。該菌株的特性已被鑒定(Huang，S.H.et al，(1995)Infect.Immun，634470-4475；Huang，S.H.et al，(1999)(Infect.Immun，672183-2189；Huang，SH et al.，(2001)J.Infect.Dis，1831071-8)。DH52作為宿主菌株，用于DNA序列測定時受需的亞克隆和質(zhì)粒的制備。含有質(zhì)粒的菌株在37℃條件培養(yǎng)于含有氨芐青霉素(100pg/ml)。卡那霉素(50pg/ml)的L肉湯以麗質(zhì)粒的陽性篩選。細菌在L肉湯中培養(yǎng)，細菌的保存則用含有20％甘油的上肉湯，凍存于-70℃。
化學(xué)品和酶、限制性地酶，T4 DNA連接酶和其他酶類均購自NewEngland Biolabs(Beverly，mass.)除非另有說明?；瘜W(xué)品則購自Sigma(St.Louis，A10)。所有同位素產(chǎn)品獲自New England Nuclear Corp.(Baston，Mass.)DNA測序膠制備試劑均為超純品質(zhì)，購自National Diagnostics(Atlanta，Georgia)。用于與測序酶一起進行DNA測序反應(yīng)的試劑和及其化學(xué)品均購自United States Biochemical Corp.(Cleveland，Ohio)。DNA測序試劑盒及染料終止物(dye terminators)均購自PE Applied Biosystem(GreatBritain)。
質(zhì)粒的提取，處理和亞克??；所有遺傳常處理均按標(biāo)準方法進行(Sambrool，J，et al，(1929)Molecular Cloning a Laboratory Mannal，2nd ed.ColdSpring)。質(zhì)粒DNA的提取采用Plasmid mini kit(Qiagen Inc.Chatsworth，Calif)。DNA片段的純化和從瓊脂糖凝膠茶帶中提取采用GeuecleanTM(Bio101，Lajolla，Calif)。E coli的反應(yīng)潛能細胞在10％的甘油中制備，并用電穿孔方法進行轉(zhuǎn)化(Huang SH，et al，(1999)Infect，Immun.672103-2109；Huang SH，et al，(2001)J.Infect.Dis.1831071-8)。基因組DNA采用SauA3I來進行部分消化(New England Biolabs)，該DNA也相溶于Bam HI。部分消化的基因組DNA(15至23kb)用dGTP和dATP來進行部分填充。該DNA被連接到帶有Xhol Half-Site的LambdaGEMTM一次臂上。重組入噬菌體的連接和包裝按廠家說明進行(Promega)。用DNA雜交方法來對E.coli基因文庫進行篩選(Huang et al，1999，2001)以便鑒定出含有ibeA的噬菌體克隆。采用EcoRI將pCIB10B中的一個8.58-kb的ibeA DNA片段釋放出來，用制備性瓊脂糖凝膠電泳和Geneclean(Bio101)進行純化，然后用oligolabeling kit(Pharmacia)將[α32P]dCTP標(biāo)記該純化片段，該標(biāo)記的片段即可在篩選時用作探針(＞1×108cpm/μg)。將噬菌斑復(fù)制到尼龍濾膜上進行UV-連接和雜交，方法照前述(Huang et al，1999，2001)。與探針雜交的菌斑用放射自顯影進行鑒定，然后進行純化。
用DNA雜交方法對E.coli RS218基因組文庫進行篩選按前述方法構(gòu)建E.coli RS218的基因組文庫(Huang，SH et al.，(2001)J.Infect.Dis.1831071-8)。用DNA雜交方法從該E.coli基因組文庫中篩選并分離出含有ibeA基因座的噬菌體克隆。0.58kb的ibeA DNA片段用瓊脂糖凝膠電泳和GenecleanTM(Bio101)進行純化，用Oligolabeling Kit(Pharmocia)來進行[α32P]dCTP標(biāo)記，然后用作篩選探針(＞1×108cpm/μg)。按前述方法將噬菌斑復(fù)制到尼龍濾膜上進行UV-連接和雜交。與探針雜交的噬菌斑用放射自顯影進行鑒定，然后進行純化。
PCRPCR按標(biāo)準方法進行。左側(cè)鄰接區(qū)的擴增采用引物YjD1(5’-AATGCT GTA CCA CGA CG-3’)和8T3a(5’-TCAT A6T CTA CGT CTC GCC GAC-3’)，循環(huán)30次，每次循環(huán)包括94℃ 1分鐘，58℃ 1分鐘和70℃ 3分鐘。
核酸測序模版的制備采用Primer-Walking方法進行測序，被測序的克隆有3個，即2個相互重疊的基因組克隆(10-8和10-30)和一個PCR克隆，后者是用E.coli RS218的基因組DNA來制備，并在先前被發(fā)現(xiàn)帶有E.coli K1菌株的特異DNA序列。
DNA的測序和分析首先對gimA的部分DNA序列進行測定，方法是Sanger等人的雙脫氧鏈終止方法；同時結(jié)合使用U.S.Biochemicals Corp.的Sequenase Version 2.0 kit(Cleveland，Ohio)和Taq DNA聚合酶。DNA序列分析用人工進行，采用Du Pont NEN Research Products(Bosten，Mass.)的[35S]dATP(1,000至1,500Ci/mmol)。然后換為DNA自動測序方法，該方法采用熒光標(biāo)記核苷酸(373 ABI automated sequencer)，因此更為快速，低成本，并避免了高含量G+C衍生的人為電泳性壓縮。全部ibeA基因簇均通過Primer-Walking來進行測序，DNA的兩條鏈均被測序以確保測序的正確無誤。
生物信息學(xué)方法采用科教軟件公司(Scientific & Education Software，Durhan，NC)開發(fā)的DNA分析軟件來對測序資料進行分析。DNA和推測的蛋白序列用來進行DNA和蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫的搜尋，該數(shù)據(jù)庫建立于National Centerfer BiotechnologyInformation(National Library of midicine，Washington，D.C)搜尋時要采用BLAST規(guī)則系統(tǒng)。ClustalW(Thompson JD et al(1994)Nucleic Acids Res.224673-4680)和Boxhade(Hofmann K et al，1999)Nucleac Acids Res.27215-9)，被用來進行蛋白序列的多重調(diào)準。對遺傳離子的A基因的注釋采用了兩種不同概念的方法。首先將序列與已有序列進行比較，而這些已知序列的蛋白質(zhì)功能已經(jīng)知道。由此以便能堅定出同源區(qū)域，然后予測新基因的功能性。其次，一種統(tǒng)一的希頓馬可夫模型(Hidden Markov Model)，該模型被用來注釋原核生物基因，在這里被用推測gimA的未致基因(Shmatkov AM et al，(1999)Bioinformatics 15874-86)由于緊密包裝的原核基因常常相互重選，因而BioNavigator容易通過耙向基因起點和重選基因來檢測翻譯的起始位點，因而也就能準確預(yù)測原核生物基因。將比較性分析和“框架連框架”規(guī)則系統(tǒng)”(Frame-by-frame)的結(jié)合應(yīng)用。從而導(dǎo)致對指定的新基因作出注釋。種系發(fā)生分析則通過生物技術(shù)導(dǎo)航器(BioNavigator)(http//www bionavigator.com)來進行。
實施例子E.coli RS218的ibeA基因簇的克隆和亞克隆E.coli K1 RS218菌株用作克隆實驗的DNA來源。這種CSF分離菌株能侵入人和牛的大腦微血管內(nèi)皮細胞(BMEC)，而且能在新生大鼠的菌血癥之后誘發(fā)腦膜炎。為了從RS218中克隆ibeA決定子，一種基因組文庫物構(gòu)建于Lambda GEM-12為構(gòu)建這種文庫，在載體中采用了Xhol的半位點，在基因組插入部分采用SauA3I酶切位點，載體和基因組序列的自身連接被排除，因為只有含有適宜長度(15-23kb)的單個插入片段的重組噬菌體才有可能被包裝。用一種ibeA片段(0.58kb)作為探針對大約5×105個重組噬菌體進行了篩選。三個相互重疊的ibeA克隆被鑒定出。對這種重組噬菌體進行純化和用Notl進行消化。兩個重疊的插入片段其大小分別為17.3(A10-8)何等18(A10-30)kb。這些含有ibeA基因簇的插入片段亞克隆進pBluescript KS(pKS108和pKS1030)的Notl位點。
實施例8銜接區(qū)域的鑒定右邊銜接區(qū)(這里“右邊”定義為在E.coli K12的連接圖譜中與數(shù)字較高的部分相連的序列)通過T3引物在A10-30進行鑒定。一個530bp序列的伸展區(qū)被確定。對GenBank的搜尋顯示該區(qū)域與E.colik12中yjiD(12bp)和yjiE(518bp)的C-端編碼序列相同。該gimA插入位點位于yjiD ORF之內(nèi)，在yjiD終止密碼子的上游第9個bp處，并處于yjiE ORF之外，位于yjiE終止密碼子的上游第4個bp。18kb的序列獲自A10-8和A10-30克隆。按物理學(xué)圖譜法(Bloch et al，1996)，gimA的長度約為20kb。為了鑒定這個基因缺口，分別從yjiD終止密碼子的上游第62個bp和已知的gimA序列的5’區(qū)域排除5’-引物(10YiD1)和3’-引物(8T3a)。為了分離和查證(verify)gimA的左邊junction，這兩種引物用于PCR，以便直接從E44基因組DNA中擴增該區(qū)域。一個2.4kb的DNA被分離出來并亞克隆到pGEM-T簡易載體(E44L7)。對該PCR克隆進行序列分析后確定了它的左側(cè)junction，同時顯示2.3kb的序列是E.coli K1的特有序列，而且該序列與gimA序列有30個bp的重疊區(qū)。因此gimA的長度為20.3kb。
實施例9gimA的核酸序列ibeA基因簇的DNA序列通過Primer-walking方法來確定，這里所用的引物與S10-8，A10-30和E44L7中g(shù)imA基因的兩條鏈互補。對該DNA序列書記的分析結(jié)果表明gimA位于98微區(qū)(min)兩個噬菌體克隆(A10-8和A10-30)之間有一個重疊區(qū)域，在該區(qū)域中，這兩個克隆具有相同的ibeA和下游區(qū)域(圖6)。開放閱讀框架ORF的分析結(jié)果和gimA的特征概述于圖7和圖8及表4。
實施例10gimA內(nèi)的新基因為了查明gimA內(nèi)的ORF，對全部基因簇作了核苷酸序列測定。在這個區(qū)域中明顯含有一個20.3-kb的gimA，同時在這個區(qū)域中鑒定出15個ORF，其中包括已知的ibeA基因(圖9)。已進行測序的ORF的基因可能與碳氧化合物的代謝，轉(zhuǎn)運系統(tǒng)，蛋白結(jié)合及轉(zhuǎn)錄的調(diào)控有關(guān)。
實施例11插入序列和轉(zhuǎn)座子尚未從gimA及其銜接區(qū)內(nèi)鑒定到已知的插入序列。但對GenBank的搜尋結(jié)果指出有一個57kp的區(qū)域(5358-5414)與Pseudomonas Putida中的轉(zhuǎn)座子Tn5542有顯著同源性(85％)。
實施例12gimA的其他特征RS218菌株的gimA作為一組致病基因表現(xiàn)出兩個共同特征。首先，其GC在序列中的含量，不包括K12來源的GC含量是46.2％。其次是，gimA序列僅為E.coli K1株所特有，它與K-12來源的序列并無明顯同源性。
討論E.coli RS218是從感染了腦膜炎性大腸桿菌的新生兒的CSF中分離到的，通過分離重疊性噬菌體，PCR克隆，限制性酶地圖譜制造，亞克隆和DNA序列測定(圖7)，最終對來自菌株的一個20.3kb的DNA區(qū)域的特征進行了鑒定。在這個區(qū)域中，我們鑒定了一個包括15個ORF的稱之為遺傳島的結(jié)構(gòu)(表4和圖9)。和相鄰的DNA片段相比，該遺傳島或致病島的GC含量特征性地降低，而且其基因簇的各個基因之間處于相互鄰接的位置，共同組成一種單一的致病特性。RS218的gimA的長度為20.3kb，GC含量為46.2％(相對應(yīng)的，K-12的基因組DNA的GC含量為50.2％)。
RS218的20.3kb的gimA的核酸序列中含有14個新描述的基因。在腦膜性E.coli中必然性發(fā)現(xiàn)存在ibeA基因，同時明顯多地在Sfa/foc操縱子陽性，而不是陰性菌株中測到。因此，我們推測這些新描述的基因以及ibeA基因可能共同組成了一個遺傳島(孤立的結(jié)構(gòu)區(qū)域)并由其介導(dǎo)了E.coli誘導(dǎo)的新生兒腦膜炎發(fā)病過程。IbeA基因的插入和缺失均能在體內(nèi)外導(dǎo)致RS218出現(xiàn)非侵入性表型，由此建議這個致病決定子與E.coli對血腦屏障的侵入油光(Huang，SH，et al(1995)Infect Immun，634470-4475；Huang，SH，et al，(2001)J，Infect，Dis，1831071-8)。當(dāng)我們對RS218的遺傳島作進一步研究時，我們將選用更多的突變體進行研究，這些突變體的表型可能與致病性有關(guān)，例如代謝物的攝取和轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)。我們將通過特異基因的等位交換來誘發(fā)突變，同時在體外通過BMEC侵入性試驗和在體內(nèi)通過腦膜炎的新生大鼠模型來測試這些等基因突變。通過這些突變，我們希望找出更多的腦膜炎性E.coli的致病表型有關(guān)的gimA基因。但是，可能在腦膜炎性E.coli的RS218菌株中已包含有額外的遺傳島。在最近研究的兩個尿道致病性菌536和J96中發(fā)現(xiàn)，每一個菌株均含有兩個分離的病原島(PAT)。在536菌株中，190和70kb的病原島分別位于97微區(qū)(min)(leu×內(nèi))和82min(Sel.C內(nèi))。而在J96菌株中，110和大于170kb的PAI則分別位于94min(pheR內(nèi))和64min(pheV內(nèi))。從非侵入性TnphoA突變性的圖譜中可發(fā)現(xiàn)至少兩個有爭議的遺傳島，即包括gimA和在一個120kb的RS218-特異的染色體片段中的12個TnphoA，這些均出現(xiàn)在RS218的基因組中(Bloch，CA，et al.，(1996)FEMS Microbiol.Lett.，144171-176)。最近實驗室(Rode CK，etal.，(1999)Infect Immun，67230-236)和Bingench組(BonacorsiSP et al.，(2000)Infect Immun.682096-2011)分別通過比較性宏觀限制性圖譜和表觀性差異分析方法在RS218的基因組中探測到R個新的遺傳島。由于RS218中新的遺傳島的長度尚不明確，因而有可能存在與gimA以外的若干種其他致病基因也與該菌株的致病性有關(guān)。
表3Oligonucleotides used for cloning and sequencing


表4Gene annotation of the ibeA gene cluster(gimA)


C＝complememary strand實施例13IbeA對細胞凋亡的誘導(dǎo)一些研究工作認為腦內(nèi)海馬的凋亡是人類細菌性腦膜炎和多種腦膜炎動物模型的一種典型特征(Nau R et al.，J Neuropathol Exp Neurol.1999，58(3)265-74；Loeffler JM et al.，J Infect Dis.2001，183(2)247-252；Bottcher Tet al.，J Infect Dis.2000，181(6)2095-8；Braun JS et al.，Nat Med 1999，5(3)298-302；Leib SL et al.，J Clin Invest.1996，98(11)2639-9)。如我們先前的工作所示，IbeA依賴的E.coli K1的侵入性在腸上皮細胞和大腦內(nèi)皮細胞中均能觀察到。由于細胞凋亡是細菌性腦膜炎的一個主要特征，因此我們建議細胞凋亡有可能與E44的侵入相關(guān)。為查明細胞凋亡是否在E.coli腦膜炎菌株的致病中產(chǎn)生作用，我們測試了IbeA和IbeB蛋白的凋亡誘導(dǎo)活性。人類的EC培養(yǎng)于膠原蛋白包被的8-孔室載玻片上。當(dāng)這些細胞達到匯含生長時，用5μg的蛋白質(zhì)[純化的E.coli蛋白IbeA，IbeB，BPI或BSA(IbeB和BSA用作對照)]進行處理，并在37℃中孵育6小時。然后用實驗培養(yǎng)液將人的EC洗3遍，在4℃條件下固定于含1％多聚甲醛paraformaldchyde的Pbs中(Stins，M.F et al.，J.Neurovirol.待出版)。凋亡細胞的檢測用ApopTag in situ apoptosis detection kit來進行(Intergen，digoxigenin Diaminobenzidine Purchase，NY)，按廠家說明進行操作。簡單講，先將DNA片段的3’端羥基變成為終端脫氧核苷酸?；D(zhuǎn)移酶(TdT)的底物，然后通過催化作用異羥基洋地黃毒元標(biāo)記的(digoxingamin)核苷酸加到凋亡過程中產(chǎn)生的DNA終端上。這些核苷酸的檢測采用連接有過氧化氫酶的抗-digoxigenin抗體來進行。二氨基聯(lián)苯胺(Diaminonbenzidine)用來與過氧化氫霉反應(yīng)并產(chǎn)生非溶性棕色產(chǎn)物，這些產(chǎn)物堆積在DNA斷片出現(xiàn)的凋亡體中。然后在顯微鏡對這些載玻片進行觀察和拍照(Stins，M.F.et al.，J Neuro-Wirol.出版中)。所圖13所示，僅IbeA能在人的EC中誘導(dǎo)出細胞凋亡，而BPI，BSA和IbeB均不能，但BPI能阻斷IbeA對凋亡的誘導(dǎo)。在相同的條件下，另外純化的侵入性蛋白IbeB(Huang SH et al.，1999)也不能在人的內(nèi)皮細胞(EC)中誘生細胞凋亡。綜上所述，我們的數(shù)據(jù)標(biāo)明，在E44中，IbeA是誘導(dǎo)人的EC發(fā)生細胞凋亡的一個主要的凋亡誘導(dǎo)因子，但該因子的作用可被抗內(nèi)毒素蛋白的BPI所抑制(Arditi，m.et al.，Infect Immun.1994，623930-6)。在很多大腦疾病包括細菌性腦膜炎中，神經(jīng)原的損傷和壞死均歸因于細胞凋亡。因而用BPI這樣的抗凋亡制劑來阻斷IbeA對凋亡過程的誘導(dǎo)將會是預(yù)防和治療新生兒大腸桿菌腦膜炎的一種新方法。
熟識該項技術(shù)的人將明白上述本發(fā)明圖式中的實施例及實體均系例子說明及不會因此而產(chǎn)生規(guī)限性。而本發(fā)明的目的將系完全及有效地達到。上述所示實施例系以說明功能及結(jié)構(gòu)的原理，及系于不離本發(fā)明的原理下有所變更。故此，本發(fā)明系包括所有權(quán)利要求書中的精神及范圍及依其為根據(jù)的變化。
權(quán)利要求
1.一種新生兒腦膜炎的益生性治療和大腸桿菌致病因子的應(yīng)用方法，其特征在于它提供一種完整核酸序列的方法，該核酸序列編碼一種ibeA基因簇中的某一基因，包括以下步驟(a)鑒定出大腸桿菌(Escherichia Coli)中與侵入BMEC相關(guān)的結(jié)構(gòu)為一種ibeA；(b)從大腸桿菌中提取和純化的ibeA進行分析；和(c)確定ibeA的完整核酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種新生兒腦膜炎的益生性治療和大腸桿菌致病因子的應(yīng)用方法，其特征在于該種提供完整核酸序列的方法，進一步包括以下步驟(e)制備一種發(fā)生框架內(nèi)缺失的ibeA的突變體；(f)將ibeA的框架內(nèi)缺失突變體一種ibeA組合從而形成一種轉(zhuǎn)化體；和(g)進行互補性分析以測試是否具備對BMEC的某種侵入能力。
3.一種新生兒腦膜炎的益生性治療和大腸桿菌致病因子的應(yīng)用方法，其特征在于它提供一種預(yù)防和治療由腦膜炎性微生物導(dǎo)致的新生兒腦膜炎的益生菌(probiotic)，該益生菌包括本身具有抑制性腦膜炎致病因子的活體微生物。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種新生兒腦膜炎的益生性治療和大腸桿菌致病因子的應(yīng)用方法，其特征在于該種預(yù)防和治療由腦膜炎性微生物導(dǎo)致的新生兒腦膜炎的益生菌中，該腦膜炎致病因子包括GimA。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種新生兒腦膜炎的益生性治療和大腸桿菌致病因子的應(yīng)用方法，其特征在于該種預(yù)防和治療由腦膜炎性微生物導(dǎo)致的新生兒腦膜炎的益生菌中，該腦膜炎致病微生物選自包括攜帶GimA的E，coli K1和B組鏈球菌(GBS)在內(nèi)的一組微生物。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種新生兒腦膜炎的益生性治療和大腸桿菌致病因子的應(yīng)用方法，其特征在于該種預(yù)防和治療由腦膜炎性微生物導(dǎo)致的新生兒腦膜炎的益生菌中，該腦膜炎致病微生物選自包括攜帶GimA的E，coli K1和B組鏈球菌(GBS)在內(nèi)的一組微生物。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種新生兒腦膜炎的益生性治療和大腸桿菌致病因子的應(yīng)用方法，其特征在于該種預(yù)防和治療由腦膜炎性微生物導(dǎo)致的新生兒腦膜炎的益生菌中，該膜炎致病微生物選自包括攜帶GimA的E，coli菌素，GBS菌素，單核細胞增多性李斯特菌屬(steria monocytogenes)，假單胞菌屬(Pseudomonas species)，肺炎鏈球菌屬(StreptococcusPueumoniae)，腦膜炎李瑟菌屬(Neissria meningitides)，流感嗜血桿菌屬(Haemophilus influenzae)，檸檬桿菌屬(itronacter species)，白色念球菌(Candia abbicans)，真菌類，腸道病毒(enteroviruses)單純皰疹病毒，和兔弓形蟲(Toxoplasma gondii)寄生蟲在內(nèi)的一組微生物。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種新生兒腦膜炎的益生性治療和大腸桿菌致病因子的應(yīng)用方法，其特征在于該種預(yù)防和治療由腦膜炎性微生物導(dǎo)致的新生兒腦膜炎的益生菌中，該膜炎致病微生物選自包括攜帶GimA的E，coli菌素，GBS菌素，單核細胞增多性李斯特菌屬(steria monocytogenes)，假單胞菌屬(Pseudomonas species)，肺炎鏈球菌屬(StreptococcusPueumoniae)，腦膜炎李瑟菌屬(Neissria meningitides)，流感嗜血桿菌屬(Haemophilus influenzae)，檸檬桿菌屬(itronacter species)，白色念球菌(Candia abbicans)，真菌類，腸道病毒(enteroviruses)單純皰疹病毒，和兔弓形蟲(Toxoplasma gondii)寄生蟲在內(nèi)的一組微生物。
9.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種新生兒腦膜炎的益生性治療和大腸桿菌致病因子的應(yīng)用方法，其特征在于該種預(yù)防和治療由腦膜炎性微生物導(dǎo)致的新生兒腦膜炎的益生菌中，該活體微生物包括乳酸桿菌屬(Lactobacillusspecies)，雙叉桿菌屬(Bifidobacterium species)，E.coli Nissle1917，和攜帶針對包括GimA在內(nèi)的一或多個致病因子的抗原的Probiotic菌。
10.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種新生兒腦膜炎的益生性治療和大腸桿菌致病因子的應(yīng)用方法，其特征在于該種預(yù)防和治療由腦膜炎性微生物導(dǎo)致的新生兒腦膜炎的益生菌中，該活體微生物包括本身能抑制包括GimA在內(nèi)的一或多種腦膜炎致病因子的酵母菌。
11.一種新生兒腦膜炎的益生性治療和大腸桿菌致病因子的應(yīng)用方法，其特征在于它包括一種預(yù)防和治療由腦膜炎病原微生物引起的新生兒腦膜炎的益生菌方法，其包括施用一種具有療效的益生菌制劑，以次來增進益生菌生物的有益作用，同時又對一種或多種腦膜炎致病因子產(chǎn)生抑制。
12，根據(jù)權(quán)利要求11所述的一種新生兒腦膜炎的益生性治療和大腸桿菌致病因子的應(yīng)用方法，其特征在于該種預(yù)防和治療由腦膜炎病原微生物引起的新生兒腦膜炎的益生菌方法中的腦膜炎致病因子是指GimA。
13.根據(jù)權(quán)利要求11所述的一種新生兒腦膜炎的益生性治療和大腸桿菌致病因子的應(yīng)用方法，其特征在于該種預(yù)防和治療由腦膜炎病原微生物引起的新生兒腦膜炎的益生菌方法中的益生菌(Probiotic)制劑選自一組寡糖，它們包括果糖寡糖(fructooligosaccharides(FOS))，菌粉(mulin)，乳果糖(Lactulose)和半乳糖寡糖(galacta oligosaccharides)。
14.根據(jù)權(quán)利要求12所述的一種新生兒腦膜炎的益生性治療和大腸桿菌致病因子的應(yīng)用方法，其特征在于該種預(yù)防和治療由腦膜炎病原微生物引起的新生兒腦膜炎的益生菌方法中的益生菌(Probiotic)制劑選自一組寡糖，它們包括果糖寡糖(fructooligosaccharides(FOS))，菌粉(mulin)，乳果糖(Lactulose)和半乳糖寡糖(galacta oligosaccharides)。
15.根據(jù)權(quán)利要求11所述的一種新生兒腦膜炎的益生性治療和大腸桿菌致病因子的應(yīng)用方法，其特征在于該種新生兒腦膜炎的益生性治療和大腸桿菌致病因子的應(yīng)用方法中，該種預(yù)防和治療由腦膜炎病原微生物引起的新生兒腦膜炎的益生菌方法中的益生菌(Probiotic)制劑包括的細菌選自下列一組細菌Lactobacillus species，Bifidobacterium species，E.coli Nissle1917，和攜帶有針對包括GimA在內(nèi)的一種或多種致病因子的抗原的Probiotic菌類。
16.根據(jù)權(quán)利要求11所述的一種新生兒腦膜炎的益生性治療和大腸桿菌致病因子的應(yīng)用方法，其特征在于該種預(yù)防和治療由腦膜炎病原微生物引起的新生兒腦膜炎的益生菌方法中，該益生菌(Probiotic)制劑是非消化性的食物，這些食是通過促進有益細菌的生長或活性和抑制包括GimA在內(nèi)的所說的腦膜炎致病因子來改善健康的。
17.一種新生兒腦膜炎的益生性治療和大腸桿菌致病因子的應(yīng)用方法，其特征在于它包括一種治療由腦膜炎病原微生物導(dǎo)致的新生兒腦膜炎的益生菌(Probiotic)方法，其包括施用一種具有治療效果的益生菌(Probiotic)制劑來增強益生菌(Probiotic)生物的有益作用，同時對一種或多種腦膜炎致病因子產(chǎn)生抑制。
全文摘要
本發(fā)明公布了腦膜炎性大腸桿菌，特別是導(dǎo)致新生兒腦膜炎的大腸桿菌菌株的致病力的調(diào)整基因和蛋白。本文還特別提供了lbeA基因簇(GimA)基因的序列及由這些基因編碼的蛋白質(zhì)的序列。還提供了利用這些序列資料來產(chǎn)生的制劑和診斷檢測。
文檔編號A61K35/74GK1695638SQ20051000539
公開日2005年11月16日 申請日期2005年2月5日 優(yōu)先權(quán)日2004年2月13日
發(fā)明者黃勝和 申請人:黃勝和