專利名稱：Cns氯化物調(diào)節(jié)及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)神經(jīng)細(xì)胞中的陰離子水平調(diào)節(jié)，尤其是涉及CNS細(xì)胞內(nèi)氯化物水平的調(diào)節(jié)及其在治療、預(yù)防、診斷和預(yù)測(cè)疼痛中的用途。
背景技術(shù)：
針對(duì)疼痛治療的新的改良方法和活性劑的需求是目前醫(yī)學(xué)上的一個(gè)重要的焦點(diǎn)。急性疼痛，例如，與受傷或疾病有關(guān)的疼痛，可能是嚴(yán)重的且對(duì)患者的康復(fù)有關(guān)鍵的影響。而更多的關(guān)注是慢性疼痛，它影響著相當(dāng)大比例的人群，不僅引起顯著的不適，還導(dǎo)致了自卑、沮喪、憤怒，還干擾了或完全妨礙了患者一般的日?；顒?dòng)。
盡管在此領(lǐng)域內(nèi)已進(jìn)行了許多研究，但對(duì)傷害感受覺(jué)中涉及的許多機(jī)制和途徑仍然了解甚微。正如在多種刺激的感覺(jué)的情況中，痛覺(jué)與神經(jīng)元興奮性的改變相關(guān)。
在某些情況中，離子協(xié)同運(yùn)輸被認(rèn)為在某些刺激的處理中發(fā)揮了作用。例如，Howard等(28)已證實(shí)了通過(guò)定向缺失編碼KCC3輸出子(exporter)的Slcl2a6基因而產(chǎn)生的小鼠展示出胼胝體發(fā)育不全，包括運(yùn)動(dòng)缺陷、外周神經(jīng)病以及感覺(jué)運(yùn)動(dòng)門(mén)控缺陷。據(jù)Sung等(29)報(bào)道，與野生型和雜合的(NKCC1+/-)小鼠相比，編碼NKCC1協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的Slcl2a2基因被破壞的小鼠對(duì)熱刺激的敏感性大大降低。
目前仍需要更好的解釋痛覺(jué)中所涉及的機(jī)制，從而提供有關(guān)這方面治療性干預(yù)的新方法。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及疼痛以及治療、預(yù)防、診斷和預(yù)測(cè)所述疼痛的方法。本發(fā)明還涉及與神經(jīng)疼痛和CNS功能異常相關(guān)的疼痛。本發(fā)明另外還涉及降低中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)神經(jīng)細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)氯化物水平的方法。
一方面，本發(fā)明提供了在受試者中治療或預(yù)防疼痛的方法，該方法包括降低該受試者中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)神經(jīng)細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)氯化物水平。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括調(diào)節(jié)CNS細(xì)胞中氯化物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的活性或表達(dá)，從而降低氯化物水平。在另一實(shí)施方案中，氯化物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是KCC2，所述方法包括提高KCC2的活性或表達(dá)。在又一實(shí)施方案中，CNS神經(jīng)細(xì)胞是脊髓神經(jīng)細(xì)胞。在另一實(shí)施方案中，疼痛的信號(hào)源于外周神經(jīng)系統(tǒng)(PNS)細(xì)胞或CNS神經(jīng)細(xì)胞跨突觸的感覺(jué)纖維。在另一實(shí)施方案中，疼痛是神經(jīng)性疼痛(neuropathic pain)，而在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所述神經(jīng)性疼痛是與神經(jīng)或神經(jīng)束損傷相關(guān)的疼痛或選自軀體和內(nèi)臟疼痛。在另一實(shí)施方案中，疼痛選自慢性炎癥疼痛、與關(guān)節(jié)炎相關(guān)的疼痛、纖維肌痛(fibromyalgia)、背痛、癌癥相關(guān)疼痛、消化類疾病相關(guān)性疼痛、克羅恩氏病相關(guān)疼痛、自身免疫病相關(guān)疼痛、內(nèi)分泌病相關(guān)疼痛、糖尿病性神經(jīng)病相關(guān)疼痛、幻肢疼痛、自發(fā)性疼痛、慢性術(shù)后疼痛、慢性顳下頜疼痛、灼痛、皰疹后神經(jīng)痛、艾滋病相關(guān)疼痛、I型和II型復(fù)合性區(qū)域疼痛綜合癥(complex regional pain syndrome type I and II)、三叉神經(jīng)痛、慢性背痛、與脊髓損傷相關(guān)的疼痛以及周期性急性痛。
在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括對(duì)受試者施用能降低CNS細(xì)胞內(nèi)氯化物水平的化合物。在另一實(shí)施方案中，所述化合物能調(diào)節(jié)CNS細(xì)胞中氯化物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的活性或表達(dá)。在另一實(shí)施方案中，所述氯化物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是KCC2，在再一個(gè)實(shí)施方案中，所述化合物能提高KCC2的活性或表達(dá)。在另一實(shí)施方案中，所述化合物是TrkB的抑制劑，諸如K-252a或抗TrkB抗體。在另一實(shí)施方案中，所述化合物是依賴AMP的激酶(PKA)的抑制物(如H-89)。在另一實(shí)施方案中，所述化合物是鈣調(diào)蛋白依賴性激酶(CAM激酶)的抑制物，更具體而言，是KN-93。在一個(gè)實(shí)施方案中，KCC2包含與選自SEQ ID NO2、4、6及其片段的序列基本上相同的氨基酸序列。
本發(fā)明的另一方面提供了用于治療或預(yù)防受試者疼痛的組合物，所述組合物包括能降低CNS神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)氯化物水平的化合物和可藥用載體。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述化合物能調(diào)節(jié)CNS神經(jīng)細(xì)胞中氯化物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的活性或表達(dá)。在另一實(shí)施方案中，所述氯化物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是KCC2，更進(jìn)一步的是，所述化合物能提高KCC2的活性或表達(dá)。
本發(fā)明的另一方面還提供了商業(yè)包裝，其包括本文所述組合物及其用于治療或預(yù)防疼痛的用法說(shuō)明書(shū)。
本發(fā)明的另一方面提供了商業(yè)包裝，其含有能降低CNS神經(jīng)細(xì)胞中細(xì)胞內(nèi)氯化物水平的化合物及其用于治療或預(yù)防疼痛的用法說(shuō)明書(shū)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述化合物能調(diào)節(jié)所述CNS神經(jīng)細(xì)胞中的氯化物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的活性或表達(dá)。在另一實(shí)施方案中，該氯化物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是KCC2，且更進(jìn)一步的是，該化合物能提高所述KCC2的活性或表達(dá)。
本發(fā)明的另一方面提供了本文所述組合物在治療或預(yù)防疼痛以及/或者制備用于治療或預(yù)防疼痛的藥物中的用途。
本發(fā)明的又一方面提供了將能降低CNS神經(jīng)細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)氯化物水平的化合物用于治療或預(yù)防疼痛以及/或者用于制備治療或預(yù)防疼痛的藥物的用途。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述化合物能調(diào)節(jié)所述CNS細(xì)胞中氯化物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的活性或表達(dá)。在另一實(shí)施方案中，所述氯化物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是KCC2，且更進(jìn)一步的是，所述化合物能提高KCC2的活性或表達(dá)。在另一實(shí)施方案中，所述化合物是TrkB的抑制劑，且更進(jìn)一步的是，它選自K-252a或抗TrkB抗體。在另一實(shí)施方案中，所述化合物是依賴cAMP的激酶(PKA)的抑制物，更具體而言，它是H-89。在另一實(shí)施方案中，所述化合物是鈣調(diào)蛋白依賴性激酶的抑制物，更具體而言，它是KN-93。
本發(fā)明的另一方面提供了鑒定或表征用于治療或預(yù)防疼痛的化合物的方法，該方法包括將受試化合物與CNS來(lái)源的細(xì)胞接觸；測(cè)定在受試化合物存在的條件下細(xì)胞內(nèi)氯化物水平是否下降；其中所述下降表明受試化合物可用于治療或預(yù)防疼痛。
本發(fā)明的另一方面提供了鑒定或表征用于治療或預(yù)防疼痛的化合物的方法，該方法包括將受試化合物與表達(dá)氯化物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的CNS來(lái)源的細(xì)胞接觸；測(cè)定在受試化合物存在的條件下該氯化物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的活性或表達(dá)是否受到如此調(diào)節(jié)使得細(xì)胞內(nèi)氯化物水平下降；其中所述調(diào)節(jié)表明受試化合物可用于治療或預(yù)防疼痛。在一個(gè)實(shí)施方案中，氯化物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是KCC2，此外，該方法包括確定在所述受試化合物存在的條件下所述KCC2的表達(dá)或活性是否提高以及該調(diào)節(jié)是增強(qiáng)。在另一實(shí)施方案中，通過(guò)測(cè)量以下參數(shù)來(lái)確定KCC2的活性鉀轉(zhuǎn)運(yùn)、氯化物轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞內(nèi)氯化物水平和陰離子逆轉(zhuǎn)電位。在另一實(shí)施方案中，疼痛包括慢性炎癥疼痛、與關(guān)節(jié)炎相關(guān)的疼痛、纖維肌痛、背痛、癌癥相關(guān)疼痛、消化系統(tǒng)疾病相關(guān)疼痛、克羅恩氏病相關(guān)疼痛、自身免疫病相關(guān)疼痛、內(nèi)分泌病相關(guān)疼痛、糖尿病性神經(jīng)病相關(guān)疼痛、幻肢疼痛、自發(fā)性疼痛、慢性術(shù)后疼痛、慢性顳下頜疼痛、灼痛、皰疹后神經(jīng)痛、艾滋病相關(guān)疼痛、I型和II型復(fù)合性區(qū)域疼痛綜合癥、三叉神經(jīng)痛、慢性背痛、與脊髓損傷相關(guān)的疼痛以及周期性急性痛。
本發(fā)明的另一方面提供了鑒定或表征用于治療或預(yù)防疼痛的化合物的方法，該方法包括將受試化合物與CNS來(lái)源的細(xì)胞接觸，該細(xì)胞包含了具有通常與氯化物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因相關(guān)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件的第一種核酸，它與含有能編碼報(bào)道蛋白的報(bào)道基因的第二種核酸有效連接；確定在受試化合物存在的條件下報(bào)道基因是否表達(dá)或報(bào)道蛋白的活性是否被調(diào)節(jié)；其中報(bào)道基因表達(dá)或報(bào)道蛋白活性的調(diào)節(jié)表明受試化合物可用于治療或預(yù)防疼痛。在另一實(shí)施方案中，所述氯化物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是KCC2，且在受試化合物存在的條件下所述報(bào)道基因表達(dá)或報(bào)道蛋白活性提高。
本發(fā)明的一方面提供了用于減輕受試者中傷害感受的方法，該方法包括減少受試者CNS神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞內(nèi)氯化物。在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法包括調(diào)節(jié)CNS神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)的氯化物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性或表達(dá)。在另一實(shí)施方案中，所述氯化物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是KCC2，此外，該方法包括提高KCC2的活性或表達(dá)。在另一實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括用能增加KCC2活性或表達(dá)的化合物接觸CNS神經(jīng)細(xì)胞。在另一實(shí)施方案中，所述化合物是TrkB的抑制物，而且更進(jìn)一步的是，它選自K-252a和抗-TrkB抗體。在另一實(shí)施方案中，該化合物是依賴cAMP的激酶(PKA)的抑制物，更進(jìn)一步的說(shuō)，是H-89。在另一實(shí)施方案中，該化合物是鈣調(diào)蛋白依賴性激酶抑制物，更進(jìn)一步的說(shuō)，是KN-93。在另一實(shí)施方案中，KCC2包含與選自SEQ IDNO2、4、6及其片段的序列基本上相同的氨基酸序列。
本發(fā)明的另一方面提供了用于在經(jīng)歷疼痛的受試者中診斷或預(yù)測(cè)與CNS功能異常相關(guān)的疼痛的方法，該方法包括確定相對(duì)于相應(yīng)的對(duì)照氯化物水平而言，被測(cè)試的CNS細(xì)胞內(nèi)氯化物水平是否增加，其中增加表明該受試者正在經(jīng)歷與CNS功能異常相關(guān)的疼痛。在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括確定相對(duì)于對(duì)照轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性或表達(dá)而言，CNS氯化物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的活性或表達(dá)是否被調(diào)節(jié)。在另一實(shí)施方案中，所述氯化物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是KCC2，而且，該方法包括確定KCC2的活性或表達(dá)相對(duì)于對(duì)照活性或表達(dá)而言是否降低了。在另一實(shí)施方案中，對(duì)照的細(xì)胞內(nèi)氯化物水平選自已確定的標(biāo)準(zhǔn)、在較早時(shí)間測(cè)定的該受試者中相應(yīng)細(xì)胞內(nèi)氯化物水平、在該受試者傷害感受較輕或基本上無(wú)疼痛時(shí)測(cè)定的相應(yīng)細(xì)胞內(nèi)氯化物水平以及在傷害感受較輕或基本上無(wú)疼痛的對(duì)照受試者中測(cè)定的相應(yīng)細(xì)胞內(nèi)氯化物水平。在另一實(shí)施方案中，對(duì)照的活性或表達(dá)選自KCC2活性或表達(dá)的已確定的標(biāo)準(zhǔn)、在較早時(shí)間測(cè)定的該受試者中相應(yīng)的KCC2活性或表達(dá)水平、當(dāng)該受試者傷害感受較輕或基本上無(wú)疼痛時(shí)測(cè)定的相應(yīng)KCC2活性或表達(dá)水平以及在傷害感受較輕或基本上無(wú)疼痛的對(duì)照受試者中測(cè)定的相應(yīng)KCC2活性或表達(dá)水平。在另一實(shí)施方案中，通過(guò)測(cè)量以下參數(shù)確定KCC2的活性鉀轉(zhuǎn)運(yùn)、氯化物轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞內(nèi)氯化物水平和陰離子逆轉(zhuǎn)電位。在另一實(shí)施方案中，通過(guò)對(duì)受試者施用指示氯化物水平的指示劑化合物使其與受試者的CNS神經(jīng)細(xì)胞接觸并評(píng)估與該指示劑化合物相關(guān)的體內(nèi)信號(hào)來(lái)確定細(xì)胞內(nèi)的氯化物水平。在另一實(shí)施方案中，與CNS功能異常相關(guān)的疼痛是神經(jīng)性疼痛。在另一實(shí)施方案中，指示劑化合物是放射性核素，更具體而言，可選自201Tl、99Tcm-tetrofosmin、99Tcm-MIBI、99Tcm-HMPAO和36Cl。在另一實(shí)施方案中，通過(guò)成像技術(shù)評(píng)估體內(nèi)信號(hào)。在另一實(shí)施方案中，所述體內(nèi)信號(hào)是指示劑化合物的滯留指標(biāo)。在另一實(shí)施方案中，所述成像技術(shù)選自單光子發(fā)射計(jì)算機(jī)層析X射線照相術(shù)、正電子發(fā)射層析X射線照相術(shù)和磁共振成像。在另一實(shí)施方案中，指示劑化合物指示KCC2表達(dá)，更具體而言，指示劑化合物是針對(duì)KCC2的抗體。
本發(fā)明再一方面提供了處理受試者中與CNS功能異常相關(guān)的疼痛的方法，該方法包括依照本文所說(shuō)方法診斷或預(yù)測(cè)受試者中與CNS功能異常相關(guān)的疼痛并降低受試者CNS細(xì)胞中的細(xì)胞內(nèi)氯化物水平。
在一個(gè)實(shí)施方案中，上述受試者是哺乳動(dòng)物，在更進(jìn)一步的實(shí)施方案中，上述受試者是人。
附圖簡(jiǎn)述

圖1外周神經(jīng)損傷(PNI)誘導(dǎo)同側(cè)表面背角(SDH)中片層I(LI)神經(jīng)元內(nèi)陰離子劇降。a)坐骨神經(jīng)的慢性收縮損傷(n＝23)，但不是假手術(shù)(n＝11)，造成對(duì)大鼠后爪機(jī)械刺激的傷害性消除的閾值50％顯著下降(p＜0.01)。b)從首次用于實(shí)驗(yàn)的(Δ)和PNI(o)大鼠LI神經(jīng)元記錄的E陰離子范圍。實(shí)心符號(hào)＝平均E陰離子±SEM。c)顯示出E陰離子對(duì)PNI響應(yīng)偏移的所有類型LI神經(jīng)元(即具有時(shí)相性的(P)、單峰(SS)和強(qiáng)直性(T)峰的特性[19])。比例尺(scale bar)是50mV(y)、150ms(x)。d)響應(yīng)各種Vm下所應(yīng)用的GABA的首次用于實(shí)驗(yàn)的(▲)和PNI(●)大鼠LI神經(jīng)元中測(cè)量到的平均峰電流。水平標(biāo)準(zhǔn)誤差線代表記錄移液器偏移量時(shí)神經(jīng)元之間的差異。插圖來(lái)自某一神經(jīng)元的典型軌跡。比例尺是0.6nA(y)、1.0s(x)。
圖2在L1神經(jīng)元中經(jīng)PNI后從僅GlyR(受體)轉(zhuǎn)換成混合的GABAAR-和GlyR-介導(dǎo)的微型突觸后電流(mPSCs)。a)來(lái)自首次用于實(shí)驗(yàn)的大鼠LI神經(jīng)元的向外(左邊)和向內(nèi)(右邊)微型突觸后事件原始軌跡。所有向外的mPSCs均被馬錢(qián)子堿所消除，而所有向內(nèi)的mPSCs(在馬錢(qián)子堿和荷包牡丹堿的存在下記錄)均被GluR拮抗物CNQX消除。HP-保持電壓。比例尺是20pA(y)，300ms(x)。b)記錄自PNI大鼠LI神經(jīng)元的向內(nèi)(左)和向外(右)微型突觸后活動(dòng)的原始軌跡。與在首次用于實(shí)驗(yàn)的大鼠中不同，同時(shí)需要有馬錢(qián)子堿和荷包牡丹堿才能阻止所有向外的mPSCs。向內(nèi)的mPSCs仍然對(duì)CNQX非常敏感。比例尺是20pA(y)、300ms(x)。c)左圖-記錄自PNI大鼠LI神經(jīng)元的疊加的單個(gè)mPSCs。僅GlyR和僅GABAAR以及混合GABAAR/Glyr-介導(dǎo)的類型可通過(guò)它們對(duì)馬錢(qián)子堿和/或荷包牡丹堿的靈敏度而清楚地鑒別。右圖-記錄自PNI大鼠LI神經(jīng)元的大于100的GlyR-和GABAAR-介導(dǎo)mPSCs的平均值。比例尺是15pA(y)，20ms(x)。d)從首次用于實(shí)驗(yàn)的(N；對(duì)于GlyR而言n＝10；對(duì)于GluR而言n＝5)和PNI(P；對(duì)于GlyR而言n＝9；對(duì)于GluR而言n＝8)LI神經(jīng)元記錄的mPSCs平均峰電導(dǎo)。P(B)顯示了0mV時(shí)在荷包牡丹堿存在條件下記錄的PNI大鼠神經(jīng)元(n＝12)中GlyR介導(dǎo)的mPSC。e)首次用于實(shí)驗(yàn)的大鼠(n＝6)中GlyR介導(dǎo)的mPSC攜帶的凈電荷，PNI大鼠[PNI(Bic)；n＝4]中用荷包牡丹堿分離的GlyR介導(dǎo)的mPSC所攜帶的凈電荷，以及PNI大鼠LI神經(jīng)元(PNI；n＝12)中混合GABAAR/GlyR-介導(dǎo)mPSCs所攜帶的凈電荷。f)描述首次用于實(shí)驗(yàn)的LI神經(jīng)元中僅GlyR mPSC事件間間隔(I.E.I.)和PNI大鼠LI神經(jīng)元[PNI(Bic)]中荷包牡丹堿分離的僅GlyR mPSC事件間間隔之間差異的累積概率圖，均在E陰離子＝0mV的條件下記錄。GABAAR介導(dǎo)的mPSCs(PNI)的加入補(bǔ)償了僅GlyR mPSC頻率的減少。插圖-PNI對(duì)GluR介導(dǎo)的mPSC的頻率無(wú)影響。
圖3與PNI同側(cè)的SDH片層I神經(jīng)元中PNI-誘導(dǎo)的KCC2下調(diào)導(dǎo)致了GlyR/GABAAR-介導(dǎo)的興奮。a)短暫的GABA應(yīng)用(每次加壓30ms)引起來(lái)自PNI大鼠fura-2-am(Ca2+指示劑)負(fù)荷切片的LI神經(jīng)元中[Ca2+]i的河豚毒素(TTX)和荷包牡丹堿敏感性提高。b)應(yīng)用KC1但不應(yīng)用GABA(每次最長(zhǎng)施壓250ms)不會(huì)引起首次用于實(shí)驗(yàn)的大鼠LI神經(jīng)元內(nèi)[Ca2+]i的改變。在存在KCC2特異拮抗劑DIOA的情況下，GABA的應(yīng)用不會(huì)引起首次用于實(shí)驗(yàn)的大鼠LI神經(jīng)元內(nèi)[Ca2+]i的升高。比例尺為0.02(y)、10s(x)。c)展示出GABA-引起的[Ca2+]i增加的LI神經(jīng)元的百分?jǐn)?shù)。該比例該P(yáng)NI大鼠中(x2矯正值＝3.91)以及首次用于實(shí)驗(yàn)的大鼠中存在DIOA情況下(x2矯正值＝4.43)顯著較高。d)證實(shí)外源GABA能在薄層I神經(jīng)元內(nèi)反復(fù)引起動(dòng)作電位的代表性軌跡。上方的比例尺是5mV(y)，200ms(x)。下方的比例尺是30mV(y)，4s(x)。插圖-響應(yīng)去極化脈沖證實(shí)其為單峰值神經(jīng)元(19)。比例尺為20mV(y)，300ms(x)。e)類似地，主要刺激(focal stimuli)(在存在谷氨酸鹽受體阻斷劑的情況下)引起荷包牡丹堿敏感性單突觸去極化突觸后電位，其會(huì)引起PNI大鼠片層I神經(jīng)元中動(dòng)作電位。比例尺是5mV(y)，250ms(x)。插圖-響應(yīng)去極化脈沖證實(shí)其為相位神經(jīng)元(19)。比例尺為20mV(y)，300ms(x)。f)左圖-免疫印跡顯示KCC2水平在腰部SDH平躺的PNI位點(diǎn)同側(cè)(Ipsi)但不是對(duì)側(cè)(Con)有所下降。右圖-從如左圖(參照Con歸一化lpsi)的免疫印跡(n＝4)測(cè)量的KCC2蛋白(對(duì)肌動(dòng)蛋白歸一化)的平均強(qiáng)度(±SEM)。
圖4選擇性封閉或擊倒(knock down)SDH中的突觸后KCC2輸出子顯著降低了傷害感受閾值。a)鞘內(nèi)注射DIOA(n＝5)或載體(n＝3)后觸覺(jué)傷害感受消退閾值作為時(shí)間的函數(shù)。b)鞘內(nèi)注射DIOA(n＝3)或載體(n＝3)后熱傷害感受消退潛伏期作為時(shí)間的函數(shù)。消退時(shí)，大鼠還經(jīng)常舔它們的爪子，表明有傷害感受。c)在DIOA存在或缺失條件下用CsCl(氯化銫)移液器(用于在0mV時(shí)夾住E陰離子)記錄的LI神經(jīng)元內(nèi)自發(fā)的mPSC。比例尺是20pA(y)，300ms(x)。d)累積概率圖(n＝4個(gè)神經(jīng)元X50mPSCs)，其證實(shí)DIOA既不會(huì)影響突觸事件峰電導(dǎo)(p＞0.5)，也不會(huì)影響GABA所引起的反應(yīng)(n＝5；p＞0.5，插圖)并因而不作用于GlyR也不作用于GABAAR。G峰＝峰電導(dǎo)。e)與接受合成的寡脫氧核苷酸的大鼠(n＝7)相比，局部腰椎(鞘內(nèi))施用KCC2反義寡脫氧核苷酸(各12小時(shí))導(dǎo)致首次用于實(shí)驗(yàn)的大鼠(n＝8)中觸覺(jué)傷害感受消退閾值的顯著降低。插圖，經(jīng)反義(AS，12小時(shí)或36小時(shí))或合成的(S，36小時(shí))寡脫氧核苷酸處理后脊髓KCC2蛋白質(zhì)水平(用免疫印跡測(cè)量)下降。f)與SDH相比，在首次用于實(shí)驗(yàn)的大鼠背根神經(jīng)節(jié)(DRG)中KCC2免疫反應(yīng)性缺乏。g)電子顯微鏡照片顯示在SDH樹(shù)突(D)而不在突觸小結(jié)(B)中KCC2的選擇性表達(dá)(定量細(xì)節(jié)參閱圖6)。箭頭指向突觸。比例尺為0.2μm。
圖5體內(nèi)突觸狀況的計(jì)算機(jī)模擬證實(shí)了片層I神經(jīng)元的感受性以E陰離子偏移的函數(shù)發(fā)生。a)左圖-利用模型神經(jīng)元(參閱實(shí)施例)進(jìn)行的計(jì)算機(jī)模擬論證GlyR-和GABAAR介導(dǎo)的PSC[PNI(GlyR+GABAAR)]的PNI誘導(dǎo)的改變?cè)鯓右訥luR介導(dǎo)的PSC頻率的函數(shù)影響LI神經(jīng)元輸出發(fā)放頻率的。此外還顯示了在只考慮GlyR-介導(dǎo)的[PNI(僅GlyR)]或GABAAR-介導(dǎo)的[PNI(僅GABAAR)]突觸事件的影響時(shí)PNI后LI神經(jīng)元中的結(jié)果。右圖-顯示了與左圖相同的數(shù)據(jù)，按照發(fā)放頻率比率表達(dá)，計(jì)算為以特定數(shù)據(jù)集除以無(wú)抑制數(shù)據(jù)集(即，數(shù)據(jù)集的發(fā)放頻率等價(jià)于無(wú)抑制)。盡管正常超極化GlyR介導(dǎo)的PSCs(在首次用于實(shí)驗(yàn)的大鼠中平均E陰離子＝-72.8mV)對(duì)輸出發(fā)放頻率(fout)具有凈抑制作用，但是去極化GlyR-介導(dǎo)的PSCs(在PNI大鼠中平均E陰離子＝-49.0mV)則與無(wú)抑制作用的預(yù)期結(jié)果相比f(wàn)out增加，證明了凈興奮作用。由于GABAAR-介導(dǎo)的PSC攜帶電荷增加而摻入GABAAR組分時(shí)，此刺激作用更占優(yōu)勢(shì)。b)左圖-不同E陰離子值(超出我們研究中所觀察的范圍)對(duì)PNI后LI神經(jīng)元發(fā)放頻率的影響。右圖-以發(fā)放頻率比率表示的與左圖同樣的數(shù)據(jù)(如上)。
圖6KCC2輸出子的表達(dá)局限于背角神經(jīng)元而非感覺(jué)纖維。盡管KCC2水平低于通過(guò)免疫印跡從DRG檢測(cè)的水平(圖4f)，但我們證實(shí)了KCC2是否會(huì)優(yōu)先從細(xì)胞體穿梭至初級(jí)神經(jīng)末端的中央末端。a)電鏡照片顯示了在背角片層I的樹(shù)突(D)上存在KCC2。此外還顯示了片層I神經(jīng)元胞體(S)上的膜界定免疫金染色(箭頭)。相比，在所檢測(cè)的任一隨機(jī)選擇的突觸圖(n＝171)中均未觀察到KCC2免疫染色。b)在明確相應(yīng)于初級(jí)神經(jīng)末端的中央末端(A-和C-纖維[34，35])的片層I和II(I類CI，左圖；II類CII，右圖；箭頭指示了興奮突觸；D樹(shù)突)中突觸神經(jīng)纖維球的中心小結(jié)(n＝42個(gè)隨機(jī)選定的中心小結(jié))內(nèi)也缺乏KCC2免疫反應(yīng)性。比例尺a2μm；b0.5μm(左圖)，0.2μm(右圖)。
圖7從首次用于實(shí)驗(yàn)的和PNI大鼠的片層I神經(jīng)元記錄的多種處理對(duì)陰離子(碳酸氫鹽和氯化物)逆轉(zhuǎn)電位(E陰離子)的影響。
圖8鞘內(nèi)施用受體酪氨酸激酶抑制劑K-252a(6nM)導(dǎo)致觸覺(jué)傷害感受消退閾值的提高。
圖9人KCC2的DNA(SEQ ID NO1)和多肽(SEQ ID NO2)序列。
圖10小鼠KCC2的DNA(SEQ ID NO3)和(SEQ ID NO4)序列。
圖11大鼠KCC2的DNA(SEQ ID NO5)和多肽(SEQ ID NO6)序列。
圖12從采集自灌注了BDNF、NGF或常用的人造腦脊髓液的首次用于實(shí)驗(yàn)的大鼠的切片中從片層I神經(jīng)元測(cè)量的陰離子(氯化物和碳酸氫鹽)逆轉(zhuǎn)電位(E陰離子)的比較(ACSF；圖中的“對(duì)照”)。PNI-外周神經(jīng)損傷。
圖13含片層I神經(jīng)元的切片中測(cè)量的E陰離子比較，所述神經(jīng)元采集自通過(guò)水浴應(yīng)用(bath application)用針對(duì)TrkB(P/TrkBIgG)、H-89(P/H89)、K-252a(P/K252a)和KN-93(P/KN93)的抗體處理的PNI大鼠。PNI-外周神經(jīng)損傷。
圖14用轉(zhuǎn)導(dǎo)BDNF(■)的腺病毒處理的大鼠和用轉(zhuǎn)導(dǎo)綠色熒光蛋白(○)的腺病毒處理的大鼠的觸覺(jué)刺激的傷害感受閾值之間的比較。
圖15用人重組NGF(10μg/天x×天)(■)和用鹽水載體(○)處理的大鼠的觸覺(jué)刺激的傷害感受閾值之間的比較。
圖16用中和性抗-TrkB抗體(抗-TrkB-IgG 12μg/2hrs×3)(■)處理的大鼠和只用載體處理的大鼠(○)的觸覺(jué)刺激的傷害感受閾值之間的比較。
圖17用PKA抑制劑H-89(380nmol)處理的大鼠(■)和只用載體處理的大鼠(○)的機(jī)械刺激的傷害感受閾值之間的比較。
發(fā)明詳述本文所述是外周神經(jīng)損傷后去抑制的新機(jī)制。它涉及表面背角(SDH)片層(lamina)I神經(jīng)元中陰離子體內(nèi)穩(wěn)態(tài)的跨突觸破壞，這是主要的脊髓傷害感受輸出途徑之一(7)。此處顯示了由此產(chǎn)生的跨膜陰離子梯度變化通常導(dǎo)致抑制性陰離子突觸電流興奮，基本上升高了片層I神經(jīng)元的凈興奮性。正如此處所顯示的，外周神經(jīng)損傷是通過(guò)信號(hào)跨突觸傳遞導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)神經(jīng)元中細(xì)胞內(nèi)氯化物水平升高而被感知。此外，此處所述研究證實(shí)了降低CNS神經(jīng)氯化物水平可逆轉(zhuǎn)此現(xiàn)象，正如通過(guò)完整大鼠中脊髓KCC2輸出子的局部阻斷或擊倒顯著降低了傷害感受閾值所顯示的，證明已報(bào)道過(guò)的片層I神經(jīng)元中陰離子體內(nèi)穩(wěn)態(tài)的破壞足以引起神經(jīng)性疼痛。
因此，本文描述的實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究外周神經(jīng)損傷后的下游事件研究了傷害感受覺(jué)的機(jī)制。同樣的，本文還證明了所述事件是跨突觸傳遞的，例如，通過(guò)外周神經(jīng)系統(tǒng)(PNS細(xì)胞或感覺(jué)纖維)傳遞至中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)，在一個(gè)實(shí)施方案中，傳遞至脊髓神經(jīng)元。此處進(jìn)一步的研究證明了傷害感受信號(hào)的傳遞和疼痛的感覺(jué)最終受到CNS組織中細(xì)胞內(nèi)氯化物水平調(diào)節(jié)的影響(例如，受諸如氯化鉀協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白KCC2的氯化物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白調(diào)節(jié))。KCC2(參閱綜述(37))是已在大鼠、小鼠和人中鑒定的氯化鉀協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(對(duì)于人KCC可參閱2003年2月6日公布的Mount等人的美國(guó)專利申請(qǐng)序號(hào)20030027983)。小鼠中KCC2基因的純合和雜合破壞的研究揭示癲癇發(fā)作表型，提示KCC2在癲癇癥中的可能作用(38)。KCC2在CNS功能中的準(zhǔn)確作用尚未完全了解。
申請(qǐng)人在此證明了CNS細(xì)胞或組織中細(xì)胞內(nèi)氯化物水平(如，根據(jù)諸如KCC2等氯化物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的活性/表達(dá))與傷害感受覺(jué)之間的相關(guān)性。正如以下實(shí)施例中所證明的，外周神經(jīng)損傷(PNI)導(dǎo)致了CNS神經(jīng)元(例如，脊髓，例如表面背角(SDH)片層I(L1)神經(jīng)元)的興奮過(guò)度或敏化。這樣的興奮過(guò)度是跨突觸發(fā)生的(即，在受損外周神經(jīng)元的下游)，這是在本文申請(qǐng)人的研究之前未描述的現(xiàn)象。這樣的興奮過(guò)度導(dǎo)致傷害感受閾值的降低。
正如此處所顯示的，上文提及的興奮過(guò)度與SDH中細(xì)胞內(nèi)氯化物水平的提高相關(guān)(例如，氯化物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[諸如KCC2]的調(diào)節(jié)[例如，減少])。在這點(diǎn)上KCC2的作用通過(guò)將KCC2阻斷劑DIOA或KCC2反義寡核苷酸施用于脊髓組織發(fā)現(xiàn)二者均導(dǎo)致疼痛靈敏度閾值迅速降低來(lái)證實(shí)。因此，KCC2活性和/或表達(dá)的降低，如果導(dǎo)致了CNS神經(jīng)元氯化物水平提高，就可能導(dǎo)致疼痛靈敏度閾值的降低，而且，相反的，KCC2活性和/或表達(dá)的增加或誘導(dǎo)，如果導(dǎo)致CNS神經(jīng)元氯化物減少，就可能導(dǎo)致疼痛靈敏度閾值提高，從而起到了預(yù)防和治療疼痛的作用。另一方面，據(jù)報(bào)道，在某些病理生理?xiàng)l件下，例如，當(dāng)[K+]o升高時(shí)，KCC2可能在神經(jīng)元中積聚Cl-，從而提高神經(jīng)元的興奮性(42)。在這樣的情況下，可預(yù)想KCC2對(duì)CNS神經(jīng)元氯化物具有相反作用，從而導(dǎo)致CNS神經(jīng)元氯化物的增加并又降低了傷害感受閾值并提高了疼痛的敏感性。同樣的，KCC2的活性和/或表達(dá)的調(diào)節(jié)可能取決于氯化物離子流動(dòng)的方向性，促進(jìn)或減輕疼痛感受。
因此，第一方面，本發(fā)明涉及治療疼痛的方法和材料，所述方法和材料基于CNS細(xì)胞內(nèi)氯化物水平的調(diào)節(jié)以及氯化物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(例如KCC2氯化鉀協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白)活性和/或表達(dá)的進(jìn)一步調(diào)節(jié)。用于此處時(shí)，“氯化物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白”被定義為細(xì)胞膜結(jié)合的多肽/蛋白質(zhì)或它們的復(fù)合體，所述轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白能實(shí)現(xiàn)氯化物陰離子穿過(guò)細(xì)胞膜。“輸出(輸出子)”指從細(xì)胞內(nèi)向細(xì)胞外的凈穿過(guò)，“輸入(輸入子)”指從細(xì)胞外向細(xì)胞內(nèi)的凈穿過(guò)。
因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及通過(guò)降低例如CNS神經(jīng)細(xì)胞等細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)氯化物水平來(lái)治療疼痛的方法。在另一實(shí)施方案中，氯化物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(例如，KCC2)的調(diào)節(jié)劑可用于降低細(xì)胞內(nèi)的氯化物水平。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及以全身或局部應(yīng)用降低CNS神經(jīng)細(xì)胞中氯化物細(xì)胞內(nèi)水平的化合物或藥物作為減輕疼痛的方法。為了達(dá)到此效果，上述化合物或藥物可調(diào)節(jié)CNS神經(jīng)元中氯化物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(如，KCC2協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白)的功能或表達(dá)。在另一實(shí)施方案中，所述化合物或藥物可增加氯化物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白或KCC2的表達(dá)或活性。
在一個(gè)實(shí)施方案中，其中細(xì)胞內(nèi)氯化物水平正被調(diào)節(jié)的CNS神經(jīng)細(xì)胞可定位于表面背角或脊髓。此外，所述細(xì)胞還可是外圍神經(jīng)細(xì)胞或感覺(jué)纖維跨突觸的，疼痛信號(hào)來(lái)源于所述外圍神經(jīng)細(xì)胞或感覺(jué)纖維。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明還涉及急性和慢性疼痛的治療，更具體而言涉及神經(jīng)性疼痛的治療?！吧窠?jīng)性疼痛”(neuropathic pain)用于此處時(shí)指與神經(jīng)損傷(例如，在神經(jīng)擠壓、橫斷或壓縮后或疾病導(dǎo)致的神經(jīng)衰退后)相關(guān)的慢性疼痛。在一個(gè)實(shí)施方案中，神經(jīng)性疼痛是與神經(jīng)或管道損傷相關(guān)的。在另一實(shí)施方案中，神經(jīng)性疼痛是與內(nèi)臟和/或軀體疼痛相關(guān)的。本發(fā)明還涉及降低CNS神經(jīng)元氯化物的水平(例如，通過(guò)調(diào)節(jié)氯化物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[諸如KCC2]活性和/或表達(dá))以減輕傷害感受?！皞Ω惺堋庇糜诖颂幹柑弁吹母杏X(jué)成分。疼痛可能是多種刺激的結(jié)果，所述刺激包括但不局限于，壓力、損傷、熱刺激或化學(xué)(例如，離子的)刺激。在實(shí)施方案中，所述疼痛可能與許多疾病相關(guān)，諸如慢性炎癥疼痛、與關(guān)節(jié)炎相關(guān)的疼痛、纖維肌痛、背痛、癌癥相關(guān)疼痛、消化系統(tǒng)疾病相關(guān)疼痛、克羅恩氏病相關(guān)疼痛、自身免疫病相關(guān)疼痛、內(nèi)分泌病相關(guān)疼痛、糖尿病性神經(jīng)病相關(guān)疼痛、幻肢疼痛、自發(fā)性疼痛、慢性術(shù)后疼痛、慢性顳下頜疼痛、灼痛、皰疹后神經(jīng)痛、艾滋病相關(guān)疼痛、I型和II型復(fù)合性區(qū)域疼痛綜合癥、三叉神經(jīng)痛、慢性背痛、與脊髓損傷相關(guān)的疼痛和/或周期性急性痛。本發(fā)明還涉及用于評(píng)估與CNS功能異常相關(guān)性疼痛的診斷和預(yù)測(cè)方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述診斷/預(yù)測(cè)可在本文所述治療方法之前或在治療方案期間進(jìn)行，以便進(jìn)一步表征疼痛的特性或其發(fā)展，從而提供信息，其可用于，例如，根據(jù)從此類診斷/預(yù)測(cè)得到的結(jié)果選擇此類疼痛的治療方案。用于此處時(shí)，“與CNS功能異常相關(guān)的疼痛”涉及CNS組織中離子(例如，陰離子)體內(nèi)穩(wěn)態(tài)改變所引起的傷害感受。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述陰離子是氯離子。在另一實(shí)施方案中，所述改變是CNS細(xì)胞中細(xì)胞內(nèi)氯化物水平的提高。在另一實(shí)施方案中，當(dāng)受試者經(jīng)受CNS功能異常相關(guān)性疼痛時(shí)，氯化物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的活性或表達(dá)可被調(diào)節(jié)(例如，KCC2活性或表達(dá)可被調(diào)節(jié)[例如，下降])。
“KCC2”用于此處指表達(dá)于神經(jīng)元的特定類型氯化鉀協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。在實(shí)施方案中，KCC2包含SEQ ID NOs2(人KCC2；參閱圖9)、4(小鼠KCC2；參閱圖10)或6(大鼠KCC2；還參閱圖11)的多肽的序列、它們的片段或基本上與它們相同的序列。在另一實(shí)施方案中，KCC2由能編碼SEQ ID NO2、4或6的多肽或其片段的核酸序列或與它們基本上相同的序列或根據(jù)雜交標(biāo)準(zhǔn)相關(guān)的序列編碼(見(jiàn)下文)。在另一實(shí)施方案中，此類核酸序列包含SEQ ID NO1(人KCC2DNA；參閱圖9)、3(小鼠KCC2DNA；參閱圖10)或5(大鼠KCC2DNA；參閱圖11)、其片段或基本上與其相同的序列或根據(jù)雜交標(biāo)準(zhǔn)相關(guān)的序列(見(jiàn)下文)。
“氯化物轉(zhuǎn)運(yùn)(蛋白)活性”用于此處指通過(guò)細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)氯化物。這樣的轉(zhuǎn)運(yùn)活性可用本領(lǐng)域已知的多種方法通過(guò)直接或間接的方式測(cè)量，其例子在本文中描述。“KCC2活性”用于此處指與KCC2相關(guān)的任何可檢測(cè)表型。在一個(gè)實(shí)施方案中，KCC2活性包括，但不局限于鉀運(yùn)輸、氯化物運(yùn)輸，它們可用例如膜片鉗方法、氯化物/鉀敏感染料(參閱例如Haugland，R.P.，Handbook of Fluorescent Probes and Research Products，第九版，2002，Molecular Probes，Inc.，Eugene，OR，USA)電極等使用例如，逆轉(zhuǎn)電位測(cè)量評(píng)估出入細(xì)胞內(nèi)和/或外的鉀和/或氯化物水平(直接或間接)來(lái)測(cè)定。此外，KCC2活性還可影響神經(jīng)細(xì)胞的陰離子逆轉(zhuǎn)電位(E陰離子)。陰離子逆轉(zhuǎn)電位可用，例如，短桿菌肽穿孔的膜片鉗記錄來(lái)測(cè)定。
“氯化物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)”(例如，KCC2表達(dá))涉及氯化物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白轉(zhuǎn)錄物(例如，KCC2轉(zhuǎn)錄物)或氯化物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白多肽或蛋白質(zhì)(例如，KCC2多肽或蛋白質(zhì))的產(chǎn)生。因此，在實(shí)施方案中，氯化物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)(例如，KCC2的表達(dá))可通過(guò)直接評(píng)估蛋白質(zhì)水平(例如，通過(guò)免疫組織化學(xué)和/或蛋白質(zhì)印跡分析)確定或利用例如逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)[RT-PCR]方法、基于微陣列的方法或RNA印跡分析等測(cè)定編碼氯化物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的核酸的水平(例如，氯化物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼核酸，如氯化物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白mRNA水平)。
能降低CNS神經(jīng)細(xì)胞中細(xì)胞內(nèi)氯化物水平的化合物可，例如，調(diào)節(jié)氯化物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性和表達(dá)(例如，KCC2活性和表達(dá))。在實(shí)施方案中，氯化物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性或表達(dá)(例如，KCC2活性或表達(dá))可增加。在一個(gè)實(shí)施方案中，這些化合物可以以使其接觸CNS組織或CNS細(xì)胞的方式施用?？蓱?yīng)用的化合物包括，但不局限于，直接或間接改變蛋白質(zhì)活性的化合物以及調(diào)節(jié)所述蛋白質(zhì)產(chǎn)量和/或穩(wěn)定性(例如，在轉(zhuǎn)錄、翻譯、成熟、翻譯后修飾、磷酸化和降解水平)的化合物。
一類所述化合物是通過(guò)調(diào)節(jié)KCC2上一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)起作用的化合物。據(jù)報(bào)道，克隆KCC2(20)時(shí)，KCC2不包含與PKA共有的磷酸化位點(diǎn)，但包含5個(gè)與PKC共有的磷酸化位點(diǎn)(Thr34、Ser728、Thr787、Ser940和Ser1034)。對(duì)酪氨酸蛋白磷酸化鑒定的一個(gè)共有位點(diǎn)(Tyr1081)在羧基末端。此酪氨酸激酶共有磷酸化作用位點(diǎn)不存在于KCC1或KCC4同種型中，但保留于KCC3蛋白質(zhì)中(21)。同樣的，能上調(diào)或增加KCC2活性的化合物包括，但不局限于，蛋白質(zhì)激酶抑制物(例如，N-乙基馬來(lái)酰亞胺(23-25)、星形胞菌素(29)和諸如K-252a的受體酪氨酸激酶抑制劑)；針對(duì)某些激酶或KCC2上激酶磷酸化位點(diǎn)產(chǎn)生的抗體或抗體片段；或者較直接(例如，能競(jìng)爭(zhēng)KCC2上磷酸化位點(diǎn)的寡肽)或較不直接(例如，調(diào)節(jié)激酶活性和或表達(dá)的化合物)干擾KCC2磷酸化的化合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述化合物可在介導(dǎo)磷酸化的信號(hào)途徑水平發(fā)揮作用并最終影響KCC2的磷酸化。在另一實(shí)施方案中，可調(diào)節(jié)TrkB以影響KCC2磷酸化并最終調(diào)節(jié)KCC2活性。因而，在一個(gè)實(shí)施方案中，抑制TrkB活性的化合物可，例如，應(yīng)用于這一方面。這樣的化合物可包括，但不局限于，K-252a(可購(gòu)自Calbiochem)或針對(duì)TrkB的中和抗體(抗-TrkB抗體[例如IgG](可購(gòu)自BD Transduction Laboratories)。另一實(shí)施方案中，依賴cAMP的激酶或PKA的調(diào)節(jié)，例如抑制可用于調(diào)節(jié)KCC2的磷酸化并最終用于治療或預(yù)防疼痛。例如，PKA抑制劑H-89(可購(gòu)自EMD Biosciences)可用于這方面。在另一實(shí)施方案中，鈣調(diào)蛋白依賴性激酶(CAM激酶，例如II和IV)的調(diào)節(jié)，例如抑制可通過(guò)調(diào)節(jié)KCC2的活性(例如磷酸化)減輕或預(yù)防受試者的疼痛。能抑制所述激酶的化合物包括，但不局限于，KN-93(可購(gòu)自EMD Biosciences)。在另一實(shí)施方案中，TrkB途徑的其它成員，例如磷脂酰肌醇特異性磷脂酶C或磷脂酰膽堿特異的磷脂酶C，例如，磷脂酶Cγ(PLCγ)的調(diào)節(jié)劑，例如抑制劑，可用于降低CNS神經(jīng)細(xì)胞中的細(xì)胞內(nèi)氯化物水平。這樣的化合物包括，但不局限于，三環(huán)癸-9-基-黃原酸、1-O-十八烷基-2-O-甲基-消旋-甘油基-3-磷酸膽堿、硫酸新霉素、四氫氯酸精胺、1-[6-((17β-3-甲氧基雌-1，3，5(10)-三烯-17-基)氨基)己基]-1H-吡咯-2，5-二酮或1-[6-((17β-3-甲氧基雌-1，3，5(10)-三烯-17-基)氨基)己基]-2，5-吡咯烷二酮。
此外，KCC2表達(dá)的調(diào)節(jié)還可起因于調(diào)節(jié)KCC2表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)節(jié)(例如，通過(guò)磷酸化介導(dǎo)的)。在另一方面，本發(fā)明提供了在受試者或動(dòng)物中治療疼痛或預(yù)防/減輕傷害感受的方法，其包括調(diào)節(jié)，在實(shí)施方案中減少或降低CNS神經(jīng)元或組織中的細(xì)胞內(nèi)氯化物水平。在一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞內(nèi)氯化物水平的所述降低是通過(guò)調(diào)節(jié)，例如降低受試者CNS神經(jīng)元或組織中氯化物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(如，KCC2)的活性或表達(dá)來(lái)完成的。在另一實(shí)施方案中，受試者是脊椎動(dòng)物。在又一實(shí)施方案中，受試者是哺乳動(dòng)物，在更進(jìn)一步的實(shí)施方案中，受試者是人。在一個(gè)實(shí)施方案中，CNS組織是脊髓組織，神經(jīng)細(xì)胞是脊髓神經(jīng)細(xì)胞。
因此，本發(fā)明提供了治療疼痛的方法，其包括對(duì)受試者施用能調(diào)節(jié)，在某些實(shí)施方案中，降低或減少CNS組織(如，CNS神經(jīng)細(xì)胞)中細(xì)胞內(nèi)氯化物水平。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述調(diào)節(jié)作用，例如氯化物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(例如KCC2)活性和/或表達(dá)的增加導(dǎo)致了受試者中細(xì)胞內(nèi)氯化物水平的降低。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述CNS組織是脊髓，而所述神經(jīng)細(xì)胞是脊髓神經(jīng)細(xì)胞。
在一個(gè)實(shí)施方案中，KCC2包含與SEQ ID NO2、4、6所提出序列或其片段基本上相同的氨基酸序列。在另一實(shí)施方案中，KCC2可由與能夠編碼SEQ ID NO2、4、6或其片段的核苷酸序列基本上相同的核酸，諸如與SEQ ID NO1、3、5中提出的序列或其片段基本上相同的序列編碼。
如上所提及的，保持活性的KCC2的同源物、變體和/或片段也可用于本發(fā)明的方法中。同源物包括與KCC2的氨基酸序列基本上相同、與KCC2共有顯著的結(jié)構(gòu)和功能同源性的蛋白質(zhì)序列。變體包括，但不局限于，通過(guò)任何修飾以及/或者氨基酸替換、缺失或添加而與KCC2不同的蛋白質(zhì)或肽。修飾可以在包括多肽主鏈(即氨基酸序列)、氨基酸側(cè)鏈和氨基或羧基末端在內(nèi)的任何部位發(fā)生。這樣的替換、缺失或添加可能涉及一個(gè)或多個(gè)氨基酸。片段包括KCC2的片段或部分或者KCC2同源物或變體的片段或部分。
至于增加或上調(diào)細(xì)胞中KCC2的表達(dá)，可使用將編碼KCC2的核酸引入細(xì)胞中的多種方法，其實(shí)例描述如下。諸如下文討論的基因治療等方法可用于這一方面。編碼KCC2的核酸的例子包括能編碼SEQ ID NO2、4或6的多肽的核酸(例如SEQ ID NO1、3和5的核酸)或與它們基本上相同的核酸。所述方法還可包括通過(guò)例如移植或引入包含所述KCC2編碼核酸的神經(jīng)細(xì)胞或其前體(例如，干細(xì)胞)對(duì)某一區(qū)域或神經(jīng)組織(例如CNS組織)施用包含所述KCC2編碼核酸的細(xì)胞。此外，所述方法可能需要對(duì)受試者施用能調(diào)節(jié)，例如上調(diào)或增加KCC2表達(dá)的化合物。這樣的化合物可用例如下文所述篩選方法鑒別和表征。這種化合物可進(jìn)一步作為含所述化合物和藥學(xué)可接受載體的組合物提供。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述組合物被配制或改裝以便施用于CNS。這樣的化合物或組合物可以配備使用說(shuō)明書(shū)的商業(yè)包裝提供。
“同源性”和“同源的”指兩個(gè)肽或兩個(gè)核酸分子之間的序列相似性。同源性可通過(guò)比較比對(duì)序列中各位置而確定。核酸之間或氨基酸序列之間的同源程度是在序列所共有位置處相同的或匹配的核苷酸或氨基酸數(shù)目的函數(shù)。當(dāng)此術(shù)語(yǔ)用于此處時(shí)，如果兩個(gè)序列基本上相同且序列的功能活性是保守的，則認(rèn)為該核酸序列是與另一序列“同源的”(用于此處時(shí)，術(shù)語(yǔ)“同源的”并不意味著進(jìn)化相關(guān)的)。當(dāng)兩個(gè)核酸序列進(jìn)行最佳序列比對(duì)(允許缺口)時(shí)，如果它們共有至少大約50％的序列相似性或同一性，或者如果所述序列共有限定的功能基元，則認(rèn)為這兩個(gè)核酸序列是基本上相同的。在備選的實(shí)施方案中，最佳比對(duì)的基本上相同序列的序列相似性可以是至少60％、70％、75％、80％、85％、90％或95％。用于此處時(shí)，序列之間給定的同源性百分?jǐn)?shù)指示了任選比對(duì)序列中的序列同一性程度?！胺窍嚓P(guān)”或“非同源的”序列與SEQ ID NO1至6中任一個(gè)共有少于40％的同一性，盡管優(yōu)選少于大約25％的同一性。
基本上互補(bǔ)的核酸是其中一分子的“互補(bǔ)物”基本上與另一分子相同的核酸。用于同一性序列比較的最適序列比對(duì)可用多種算法進(jìn)行，所述算法為諸如局部同源性算法(Smith和Waterman，1981，Adv.Appl Math2482)、同源性比對(duì)算法(Needleman和Wunsch，1970，J.Mol.Biol.48443)、相似性搜索方法(Pearson和Lipman，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 852444)和這些算法的計(jì)算機(jī)實(shí)現(xiàn)(諸如GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，在Wisconsin遺傳學(xué)軟件包中，GeneticsComputer Group，Madison，WI，U.S.A.)。序列同一性也可用BLAST算法確定，參閱Altschul等，1990，J.Mol.Biol.215403-10(用已公布的默認(rèn)設(shè)置)。進(jìn)行BLAST分析的軟件可通過(guò)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NationalCenter for Biotechnology Information)獲得(通過(guò)互聯(lián)網(wǎng)址http//www.ncbi.nlm.nih.gov/)。BLAST算法包括首先通過(guò)識(shí)別查詢序列中與數(shù)據(jù)庫(kù)序列中同樣長(zhǎng)度序列進(jìn)行比對(duì)時(shí)匹配或滿足某些正值閾值得分T的長(zhǎng)度W的短字確定高得分序列對(duì)(HSPs)。T指臨近字得分閾值。最初的鄰近字采樣數(shù)作為起始搜尋的種子以發(fā)現(xiàn)更長(zhǎng)的HSPs。只要累積比對(duì)得分增加，字采樣數(shù)就沿著各序列的兩個(gè)方向延伸。當(dāng)遇到以下參數(shù)時(shí)，字采集點(diǎn)在各方向的延伸暫停累積比對(duì)得分從其獲得的最大值下降量X；由于一個(gè)或多個(gè)負(fù)得分殘基比對(duì)的積累，累積比對(duì)得分達(dá)到0或之下；或者到達(dá)了任一序列的末端。BLAST算法參數(shù)W、T和X確定了比對(duì)的靈敏度和速度。BLAST程序可使用默認(rèn)值序列長(zhǎng)度(W)11、BLOSUM62得分矩陣(Henikoff和Henikoff，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA8910915-10919)比對(duì)(B)50、期望值(E)10(或1或0.1或0.01或0.001或0.0001)、M＝5、N＝4以及兩條鏈的比較。利用BLAST算法進(jìn)行的兩個(gè)序列之間統(tǒng)計(jì)學(xué)相似性的一個(gè)量度是最小總和概率(P(N))，它提供了兩個(gè)核苷酸或氨基酸序列之間會(huì)偶然存在匹配的可能性的指征。在本發(fā)明的備選實(shí)施方案中，如果在被檢測(cè)序列比較中最小總和概率小于大約1，優(yōu)選小于大約0.1，更優(yōu)選小于大約0.01，最優(yōu)選小于大約0.001，則認(rèn)為核苷酸或氨基酸序列基本上相同。
兩個(gè)核酸序列基本上互補(bǔ)的另一指征是兩序列在適度嚴(yán)格或優(yōu)選嚴(yán)格的條件下相互雜交。在適度嚴(yán)格的條件下與濾膜結(jié)合序列的雜交可進(jìn)行如下例如，在0.5M NaHPO4、7％十二烷基硫酸鈉(SDS)、1mM EDTA中65℃進(jìn)行雜交，并在0.2×SSC/0.1％SDS中于42℃漂洗(參閱Ausubel等(編輯)，1989，Current Protocols in Molecular Biology，Vol.1，Green PublishingAssociates，Inc.以及John Wiley & Sons，Inc.，New York，2.10.3)?；蛘撸趪?yán)格條件下與濾膜結(jié)合序列的雜交可進(jìn)行如下例如，在0.5M NaHPO4、7％SDS、1mM EDTA于65℃進(jìn)行雜交，并在0.1×SSC/0.1％SDS于68℃漂洗(參閱Ausubel等(編輯)，1989，同上文)。雜交條件可依照已知方法根據(jù)目的序列而改變(參閱Tijssen，1993，Laboratory Techniques inBiochemistry and Molecular Biology--Hybridization with Nucleic AcidProbes，第一部分，第二章，″Overview of principles of hybridization andthe strategy of nucleic acid probe assays″，Elsevier，紐約)。通常，嚴(yán)格條件選定為，在限定的離子強(qiáng)度和pH條件下較熱解鏈溫度低約5℃。
在另一方面，本發(fā)明還提供了減輕受試者中傷害感受的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法包括調(diào)節(jié)，例如降低受試者細(xì)胞(例如，CNS細(xì)胞)中的細(xì)胞內(nèi)氯化物水平。在另一實(shí)施方案中，所述方法還包括調(diào)節(jié)，例如增加氯化物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性或表達(dá)，如，KCC2活性或表達(dá)。在另一實(shí)施方案中，所述方法還包括使CNS神經(jīng)細(xì)胞與能調(diào)節(jié)氯化物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性的化合物接觸。所述化合物包括，但不局限于，TrkB抑制劑(諸如K-252a或抗-TrkB抗體)、PKA抑制劑(諸如H-89)或CAM激酶抑制劑(諸如KN-93)。
本發(fā)明另外還提供了預(yù)防和/或治療疼痛的組合物，其包含與藥學(xué)可接受載體混合的能調(diào)節(jié)(例如，降低)細(xì)胞內(nèi)氯化物水平的化合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，這樣的組合物可調(diào)節(jié)，例如增加或上調(diào)氯化物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性，例如，KCC2活性和/或表達(dá)。在一個(gè)實(shí)施方案中，這樣的組合物適合或適應(yīng)施用于CNS神經(jīng)細(xì)胞或組織，諸如脊髓組織或細(xì)胞。在另一實(shí)施方案中，這樣的組合物可以是KCC2表達(dá)或活性的誘導(dǎo)劑。用于此處時(shí)，“誘導(dǎo)劑”是直接或間接上調(diào)或增強(qiáng)KCC2基因的表達(dá)、KCC2mRNA的穩(wěn)定性、KCC2mRNA的翻譯、KCC2多肽的成熟、轉(zhuǎn)運(yùn)(例如，KCC2多肽對(duì)細(xì)胞膜的再循環(huán))或KCC2多肽的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性的化合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，“誘導(dǎo)劑”也可以下調(diào)或抑制KCC2抑制劑。
本發(fā)明另外提供了能調(diào)節(jié)(例如，降低)細(xì)胞內(nèi)氯化物水平以治療或預(yù)防疼痛的上述組合物或上述化合物的用途。本發(fā)明還提供了能調(diào)節(jié)(例如，降低)細(xì)胞內(nèi)氯化物水平的上述組合物或上述化合物的用途，用于制備治療或預(yù)防疼痛的藥物。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述化合物或組合物調(diào)節(jié)，例如增加或上調(diào)氯化物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(如，KCC2)活性和/或表達(dá)。在另一實(shí)施方案中，所述化合物或組合物可包括TrkB抑制劑(諸如K-252a或抗-TrkB抗體)、PKA抑制劑(諸如H-89)或CAM激酶抑制劑(諸如KN-93)。在另一實(shí)施方案中，所述藥物可配制成施用于受試者的CNS組織，例如CNS細(xì)胞。此外，所述化合物可以是，例如，KCC2表達(dá)或活性的誘導(dǎo)劑。
本發(fā)明還提供了商業(yè)包裝，其含有能調(diào)節(jié)(例如，降低)細(xì)胞內(nèi)氯化物水平的化合物或上述組合物以及用于治療或預(yù)防疼痛的說(shuō)明書(shū)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述化合物可調(diào)節(jié)(例如，增加或上調(diào))氯化物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白或KCC2活性和/或表達(dá)。
在多個(gè)實(shí)施方案中，能調(diào)節(jié)(例如降低)CNS細(xì)胞中細(xì)胞內(nèi)氯化物水平的化合物可在治療上用于治療疼痛的制劑或藥物中。所述化合物可，例如，調(diào)節(jié)(例如增加或上調(diào))氯化物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(例如，KCC2)的活性和/或表達(dá)。本發(fā)明還提供了相應(yīng)的醫(yī)學(xué)治療方法，其中將能調(diào)節(jié)(在某些實(shí)施方案中降低)細(xì)胞內(nèi)氯化物水平的化合物的治療劑量以藥學(xué)可接受的劑型施用。因此，本發(fā)明還提供了治療組合物，其含有能調(diào)節(jié)(在某些實(shí)施方案中降低)細(xì)胞內(nèi)氯化物水平的化合物以及藥學(xué)可接受的賦形劑或載體。所述治療組合物在生理上可接受的pH條件下可溶于水性溶液。
在一個(gè)實(shí)施方案中，施用本發(fā)明的化合物使其與CNS組織或CNS神經(jīng)元接觸。用于此處時(shí)，“中樞神經(jīng)系統(tǒng)”或CNS是包括腦和脊髓(例如，在腰部區(qū)域)在內(nèi)的神經(jīng)系統(tǒng)的一部分。相反，“外周神經(jīng)系統(tǒng)”或PNS是除了腦和脊髓之外的神經(jīng)系統(tǒng)部分。在一個(gè)實(shí)施方案中，CNS組織是表面背角，在更進(jìn)一步的實(shí)施方案中，CNS組織是片層I神經(jīng)元。同樣的，在實(shí)施方案中，可通過(guò)直接顱內(nèi)或鞘內(nèi)注射或注射入腦脊髓液中施用本發(fā)明的化合物以體內(nèi)處理CNS細(xì)胞。或者，所述化合物可以以能穿越血腦屏障和進(jìn)入CNS的形式全身(例如，靜脈內(nèi)或經(jīng)口)施用?！吧窠?jīng)的”和“神經(jīng)元的”可互換用于此處，均涉及神經(jīng)元和神經(jīng)系統(tǒng)。
本發(fā)明還提供了藥物組合物(藥物)，其含有能調(diào)節(jié)(在一個(gè)實(shí)施方案中降低)CNS細(xì)胞中細(xì)胞內(nèi)氯化物水平的化合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，這樣的組合物包含足以治療或減輕疼痛的治療或預(yù)防有效量化合物以及藥學(xué)可接受載體?！爸委熡行Я俊敝笇?shí)現(xiàn)預(yù)期治療效果，諸如減輕疼痛必須的以劑量和時(shí)限有效的量。能調(diào)節(jié)(在某些實(shí)施方案中降低)CNS細(xì)胞中細(xì)胞內(nèi)氯化物水平的化合物的治療有效量可根據(jù)以下因素而變化諸如個(gè)體的疾病狀態(tài)、年齡、性別、體重、和化合物在該個(gè)體中引起預(yù)期反應(yīng)的能力?？烧{(diào)節(jié)劑量方案以提供最佳的治療反應(yīng)。治療有效量也是治療有益效果超過(guò)該化合物的任何毒性或有害效果的量。“預(yù)防有效量”指實(shí)現(xiàn)諸如預(yù)防或抑制疼痛發(fā)作或疼痛嚴(yán)重程度增加等預(yù)期預(yù)防效果必須的以劑量和時(shí)限有效的量。預(yù)防有效量可按上述確定治療有效量的方法確定。對(duì)于任何具體的受試者而言，可根據(jù)個(gè)體需要以及施用組合物或者監(jiān)督組合物施用的人員的專業(yè)推斷隨時(shí)間調(diào)節(jié)特定劑量方案。
用于此處時(shí)，“藥學(xué)可接受載體”或“賦形劑”包括生理上相容的任一和全部溶劑、分散介質(zhì)、包衣、抗細(xì)菌和抗真菌劑、等滲和吸收延遲劑等等。在一個(gè)實(shí)施方案中，載體適于腸胃外施用?；蛘撸d體可適于靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)、顱內(nèi)、鞘內(nèi)、舌下或經(jīng)口施用。藥學(xué)可接受載體包括無(wú)菌水性溶液或分散劑和用于臨時(shí)制備無(wú)菌注射液或分散體的無(wú)菌粉劑。將所述介質(zhì)和活性劑用于藥學(xué)活性物質(zhì)是本領(lǐng)域眾所周知的。除非任一常規(guī)介質(zhì)或活性劑與活性化合物不相容，否則它們均可預(yù)期用于本發(fā)明藥物組合物中。輔助的活性化合物也可摻入所述組合物中。
治療組合物通常必須在制備和貯存條件下是無(wú)菌和穩(wěn)定的。所述組合物可配制成溶液劑、微乳液、脂質(zhì)體或適于高藥物濃度的其它有序結(jié)構(gòu)。所述載體可以是溶劑或分散介質(zhì)，它們包含例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液態(tài)聚乙二醇，等等)及其合適的混合物。例如，通過(guò)使用諸如卵磷脂的包衣，對(duì)于分散劑和使用表面活性劑的情況下通過(guò)保持所需的顆粒大小可以保持適當(dāng)?shù)牧鲃?dòng)性。在許多情況下，組合物中優(yōu)選包括等滲劑，例如，糖、多元醇，諸如甘露醇、山梨醇或氯化鈉。通過(guò)在組合物中包含例如單硬脂酸鹽和明膠等延遲吸收的活性劑可導(dǎo)致可注射組合物的吸收延長(zhǎng)。此外，能調(diào)節(jié)(在一個(gè)實(shí)施方案中增加或上調(diào))KCC2活性和/或表達(dá)的化合物可以以定時(shí)釋放制劑的形式施用，例如，以包含緩釋聚合物的組合物施用。活性化合物可與保護(hù)化合物免于快速釋放的載體制備，諸如控釋制劑，包括植入物和微膠囊化遞送系統(tǒng)?？墒褂蒙锟山到獾?、生物相容的聚合體，諸如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、膠原、聚原酸酯、聚乳酸和聚乳酸、聚乙醇酸共聚物(PLG)。制備所述制劑的許多方法是已受專利權(quán)保護(hù)或通常對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是已知的。
通過(guò)將必需量活性化合物(例如，能調(diào)節(jié)，在一個(gè)實(shí)施方案中降低CNS細(xì)胞中細(xì)胞內(nèi)氯化物水平的化合物)與上文列舉的一種成分或多種成分的組合摻入適當(dāng)溶劑中，然后無(wú)菌過(guò)濾制備無(wú)菌的可注射溶液。通常，通過(guò)將活性化合物摻入含有基本分散介質(zhì)和上面列舉的所需的其它組分的無(wú)菌賦形劑中制備分散物。在用于無(wú)菌可注射溶液制備的無(wú)菌粉劑的情況中，優(yōu)選的制備方法是真空干燥和凍干，它產(chǎn)生了活性成分粉末及其來(lái)自先前無(wú)菌過(guò)濾溶液的任何附加預(yù)期成分。依照本發(fā)明的另一方面，能調(diào)節(jié)(在一個(gè)實(shí)施方案中降低)CNS細(xì)胞中細(xì)胞內(nèi)氯化物水平的化合物可與一種或多種增強(qiáng)其溶解度的附加化合物配制在一起。
依照本發(fā)明的另一方面，包含能調(diào)節(jié)(在一個(gè)實(shí)施方案中降低)CNS細(xì)胞中細(xì)胞內(nèi)氯化物水平的化合物的本發(fā)明的治療組合物可以以容器或商業(yè)包裝的形式提供，所述容器或商業(yè)包裝還包括所述治療組合物用于治療疼痛的說(shuō)明書(shū)。
由于細(xì)胞中降低的細(xì)胞內(nèi)氯化物水平與氯化物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(KCC2)水平/活性的調(diào)節(jié)(例如增加)相關(guān)，且進(jìn)一步與本文所述傷害感受減輕相關(guān)，所以本發(fā)明的另一方面是通過(guò)對(duì)受試者(例如，CNS組織)施用編碼KCC2的核酸分子或其保持KCC2活性的變體或片段來(lái)治療疼痛。合適的施用方法包括基因治療方法。
可用諸如直接注射DNA、受體介導(dǎo)的DNA吸收、病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染或非病毒轉(zhuǎn)染和基于脂質(zhì)的轉(zhuǎn)染等方法在體內(nèi)將本發(fā)明的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞，所有這些方法都涉及基因治療載體的使用。已利用直接注射將裸DNA在體內(nèi)引入細(xì)胞中(參閱，例如Acsadi等(1991)Nature 332815-818；Wolff等(1990)Science 2471465-1468)?？墒褂迷隗w內(nèi)將DNA注射入細(xì)胞中的遞送裝置(例如“基因槍”)。這樣的裝置可通過(guò)商業(yè)途徑獲得(例如，來(lái)自BioRad)。裸DNA也可通過(guò)DNA與陽(yáng)離子，諸如聚賴氨酸配合而被引入細(xì)胞中，所述陽(yáng)離子可以偶聯(lián)細(xì)胞表面受體的配體(參閱，例如Wu，G.和Wu，C.H.(1988)J.Biol.Chem.26314621；Wilson等人(1992)J.Biol.Chem.267963-967；和美國(guó)專利申請(qǐng)5,166,320)。DNA-配體絡(luò)合物與受體的結(jié)合可通過(guò)受體介導(dǎo)的胞吞作用促進(jìn)DNA的攝取。與破壞核內(nèi)體的腺病毒衣殼連接，從而將物質(zhì)釋放入胞質(zhì)中的DNA-配體絡(luò)合物可用于避免絡(luò)合物被細(xì)胞內(nèi)溶酶體所降解(參閱，例如Curiel等(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 888850；.Cristiano等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 902122-2126)。
為了用作基因治療載體，對(duì)缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒進(jìn)行了很好的表征(綜述參閱Miller，A.D.(1990)Blood 76271)。用于產(chǎn)生重組逆轉(zhuǎn)錄病毒以及利用所述病毒在體外或體內(nèi)感染細(xì)胞的方法可參閱文獻(xiàn)CurrentProtocols in Molecular Biology，Ausubel，F(xiàn).M.等(編輯)Greene PublishingAssociates，(1989)，第9、10-9、14節(jié)，以及其它標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)。適當(dāng)?shù)哪孓D(zhuǎn)錄病毒的例子包括本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的pLJ、pZIP、pWE和pEM。適當(dāng)?shù)陌b病毒系的例子包括.psi.Crip、.psi.Cre、.psi.2和.psi.Am。逆轉(zhuǎn)錄病毒已被用于在體外和/或體內(nèi)將多種基因引入許多不同類型的細(xì)胞中，包括上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、成肌細(xì)胞、肝細(xì)胞、骨髓細(xì)胞(參閱，例如Eglitis等(1985)Science 2301395-1398；Danos和Mulligan(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 856460-6464；Wilson等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 853014-3018；Armentano等(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 876141-6145；Huber等(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 888039-8043；Ferry等(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 888377-8381；Chowdhury等(1991)Science2541802-1805；van Beusechem等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA897640-7644；Kay等(1992)Human Gene Therapy 3641-647；Dai等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8910892-10895；Hwu等(1993)J.Immunol.1504104-4115；美國(guó)專利4,868,116；美國(guó)專利4,980,286；國(guó)際專利申請(qǐng)WO89/07136；國(guó)際專利申請(qǐng)WO89/02468；國(guó)際專利申請(qǐng)WO89/05345和國(guó)際專利申請(qǐng)WO 92/07573)。
為了用作基因治療載體，可對(duì)腺病毒基因組進(jìn)行處理使其編碼和表達(dá)本發(fā)明的多肽化合物，但在正常溶胞病毒生活周期中的復(fù)制能力失活。例子參閱Berkner等(1988)BioTechniques 6616；Rosenfeld等(1991)Science252431-434；和Rosenfeld等(1992)Cell 68143-155。來(lái)自腺病毒株Ad type5d1324或其它腺病毒株(例如Ad2，Ad3，Ad7等)的適當(dāng)腺病毒載體是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。重組腺病毒的有利之處在于它們作為有效的基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體不需要分裂細(xì)胞，且可用于感染多種的細(xì)胞類型，包括呼吸道上皮細(xì)胞(Rosenfeld等(1992)見(jiàn)上文)、內(nèi)皮細(xì)胞(Lemarchand等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 896482-6486)、肝細(xì)胞(Herz和Gerard(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 902812-2816)和肌細(xì)胞(Quantin等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 892581-2584)。
腺伴隨病毒(AAV)可用作基因治療載體轉(zhuǎn)運(yùn)DNA達(dá)到基因治療的目的。AAV是天然存在缺陷病毒，其需要另一病毒，諸如腺病毒或皰疹病毒作為輔助病毒用于有效復(fù)制和再生性生命周期(Muzyczka等Curr.Topicsin Micro.and Immunol.(1992)15897-129)。AAV可用于將DNA整合入非分裂細(xì)胞中(參閱例如Flotte等(1992)Am.J.Respir.Cell.Mol.Biol.7349-356；Samulski等(1989)J.Virol.633822-3828；和McLaughlin等(1989)J.Virol.621963-1973)。諸如Tratschin等(1985)Mol.Cell.Biol.5.3251-3260)所述AAV載體可用于將DNA引入細(xì)胞中(參閱，例如Hermonat等(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA816466-6470；Tratschin等(1985)Mol.Cell.Biol.42072-2081；Wondisford等(1988)Mol.Endocrinol.232-39；Tratschin等(1984)J.Virol.51611-619；和Flotte等(1993)J.Biol.Chem.2683781-3790)。慢病毒(Lentiviral)基因治療載體也適于用于本發(fā)明中。
基因治療的通用方法是本領(lǐng)域所已知的。參閱，例如，Anderson等人的美國(guó)專利5,399,346。用于遞送遺傳物質(zhì)的生物相容的膠囊可參閱Baetge等人的國(guó)際專利申請(qǐng)WO 95/05452。將基因轉(zhuǎn)移入造血細(xì)胞的方法先前也有報(bào)道(參閱Clapp，D.W.等，Blood 781132-1139(1991)；Anderson，Science288627-9(2000)；和Cavazzana-Calvo等，Science 288669-72(2000))。本發(fā)明還涉及移植方法，其用于在受試者中引入含有能編碼KCC2的核酸的細(xì)胞，或在受試者中引入已在體外或先體外后體內(nèi)用能降低細(xì)胞內(nèi)氯化物水平的化合物處理過(guò)的細(xì)胞(例如，通過(guò)在含有所述化合物的適宜培養(yǎng)基在培養(yǎng)該細(xì)胞)。在一個(gè)實(shí)施方案中，這樣的細(xì)胞是神經(jīng)細(xì)胞或其前體，例如能發(fā)育/分化成神經(jīng)細(xì)胞的干細(xì)胞(神經(jīng)祖細(xì)胞)。涉及神經(jīng)干細(xì)胞分離、增殖、表征和/或移植的方法參閱文獻(xiàn)，例如，美國(guó)專利5,851,832；5,968,829；5,411,883；5,750,376；6,040,180；5,753,506和6,001,654。核酸可存在于如上所述載體中，該載體通過(guò)如上所述方法在體外被引入細(xì)胞中。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述細(xì)胞是自體的且獲自所述受試者。在某些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞是異源或異種的。
由于CNS細(xì)胞中細(xì)胞內(nèi)氯化物水平和疼痛之間具有相關(guān)性，所以能調(diào)節(jié)(例如降低)CNS細(xì)胞中細(xì)胞內(nèi)氯化物水平的化合物可用于預(yù)防和治療疼痛。在一個(gè)實(shí)施方案中，可用調(diào)節(jié)(例如增加或上調(diào))氯化物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(例如KCC2)活性/表達(dá)的化合物降低細(xì)胞內(nèi)氯化物水平并最終預(yù)防或治療疼痛。因此，本發(fā)明還涉及用于鑒定和表征能調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)氯化物水平和/或氯化物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性和/或表達(dá)的篩選方法。因此，本發(fā)明還提供了確定候選化合物是否能調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)氯化物水平并因此用于預(yù)防和治療疼痛的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括將CNS來(lái)源的細(xì)胞接觸所述候選化合物并測(cè)定在受試化合物存在的條件下細(xì)胞內(nèi)氯化物水平是否下降。細(xì)胞內(nèi)氯化物水平的下降表明受試化合物可用于治療或預(yù)防疼痛。用于此處時(shí)，“CNS來(lái)源的細(xì)胞”是分離或來(lái)自CNS組織的細(xì)胞，在實(shí)施方案中既包括初級(jí)神經(jīng)元培養(yǎng)物，又包括永生的神經(jīng)元細(xì)胞系，以及被接受的體外神經(jīng)元模型系統(tǒng)(例如，在體外分化成神經(jīng)元的細(xì)胞)。在一個(gè)實(shí)施方案中，上述細(xì)胞具有氯化物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白或KCC2活性。在另一實(shí)施方案中，所述細(xì)胞內(nèi)源性表達(dá)氯化物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(例如，KCC2)。在又一實(shí)施方案中，上述細(xì)胞已被基因工程化以表達(dá)氯化物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因或KCC2基因。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述細(xì)胞可以是含有外來(lái)引入氯化物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(諸如KCC2)來(lái)源的適當(dāng)宿主細(xì)胞?？赏ㄟ^(guò)將編碼氯化物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白或KCC2的核酸序列引入宿主細(xì)胞并提供所述核酸表達(dá)所需的條件來(lái)制備這種宿主細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，這樣的核酸是DNA。所述宿主細(xì)胞可以是真核的，諸如兩棲動(dòng)物或哺乳動(dòng)物細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，這樣的宿主細(xì)胞是人的細(xì)胞。
本發(fā)明還提供了用于鑒定或表征對(duì)治療和預(yù)防疼痛有效的藥物的另一種方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括將CNS來(lái)源的細(xì)胞接觸候選化合物并測(cè)定在受試化合物存在的條件下氯化物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的活性是否被調(diào)節(jié)。氯化物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性的調(diào)節(jié)，例如增加表明受試化合物可用于治療或預(yù)防疼痛。在一個(gè)實(shí)施方案中，該氯化物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是KCC2。KCC2的活性可通過(guò)例如測(cè)量鉀運(yùn)輸、氯化物運(yùn)輸、細(xì)胞內(nèi)氯化物水平和陰離子逆轉(zhuǎn)電位來(lái)確定。
對(duì)于一種受試化合物或數(shù)種受試化合物或受試化合物文庫(kù)(例如，組合文庫(kù))而言都可應(yīng)用上述方法。在后一種情況下，也可鑒定和表征化合物組合所產(chǎn)生的協(xié)同作用。上述化合物可用于預(yù)防和/或治療疼痛，或可用作先導(dǎo)化合物用于開(kāi)發(fā)和檢測(cè)具有改良的特異性、功效和/或藥理學(xué)(例如藥物動(dòng)力學(xué))特性的其它化合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述化合物可以是前體藥物，其在例如CNS組織(例如，脊髓)等適當(dāng)?shù)淖饔梦稽c(diǎn)轉(zhuǎn)換成活性形式。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的篩選/檢測(cè)方法中的一個(gè)或多個(gè)步驟可以自動(dòng)化。
如上所述，本發(fā)明還涉及用于鑒定和表征能調(diào)節(jié)(在某些實(shí)施方案中增加)氯化物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(例如KCC2)基因表達(dá)的化合物的方法。這樣的方法可包括在受試化合物存在或缺失的條件下檢測(cè)氯化物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(例如KCC2)的基因表達(dá)。這樣的基因表達(dá)可通過(guò)檢測(cè)相應(yīng)的RNA或蛋白質(zhì)，或者通過(guò)使用適報(bào)道構(gòu)建體來(lái)檢測(cè)，其中所述構(gòu)建體含有通常與所述氯化物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白或KCC2基因結(jié)合的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件，所述基因有效連接報(bào)道基因。當(dāng)?shù)谝环N核酸序列與第二種核酸序列在功能上相關(guān)時(shí)，第一種核酸序列可以“有效連接”第二種核酸序列。例如，如果啟動(dòng)子影響編碼序列的轉(zhuǎn)錄或表達(dá)，則啟動(dòng)子有效連接編碼序列。通常，有效連接的DNA序列在讀框中是相鄰的，且在必要的情況下連接兩個(gè)蛋白質(zhì)編碼區(qū)。不過(guò)，由于例如增強(qiáng)子通常在與啟動(dòng)子間隔數(shù)千個(gè)堿基的情況下仍能發(fā)揮作用且內(nèi)含子序列可能是不同長(zhǎng)度的，所以某些多核苷酸元件可以有效連接但不是相鄰的。“轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件”是一個(gè)指誘導(dǎo)或調(diào)節(jié)與其有效連接的蛋白質(zhì)編碼序列轉(zhuǎn)錄的DNA序列的一般術(shù)語(yǔ)，諸如起始和終止信號(hào)、增強(qiáng)子和啟動(dòng)子、剪接信號(hào)、聚腺苷酸化信號(hào)。這種報(bào)道基因的表達(dá)可在轉(zhuǎn)錄或翻譯水平上進(jìn)行測(cè)量，例如，通過(guò)檢測(cè)所產(chǎn)生的RNA或蛋白質(zhì)的量。RNA可通過(guò)例如RNA印跡或逆轉(zhuǎn)錄酶-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)方法分析(參閱，例如Sambrook等(1989)Molecular CloningA Laboratory Manual(第二版)，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NewYork，USA)。蛋白質(zhì)水平可用親和試劑(例如，抗體或其片段[方法參閱例如Harlow，E.和Lane，D(1988)AntibodiesA Laboratory Manual，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY]；結(jié)合蛋白質(zhì)的配體)或通過(guò)其它特性(例如在綠色熒光蛋白的情況下是熒光)直接檢測(cè)，或者通過(guò)測(cè)量可能使其具有酶活性從而產(chǎn)生可檢測(cè)產(chǎn)物(例如，具有改變的分光光度特性)或可檢測(cè)表型(例如細(xì)胞生長(zhǎng)的變化)的蛋白質(zhì)活性進(jìn)行測(cè)定。合適的報(bào)道基因包括，但不局限于，氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶、β-D-半乳糖苷酶、螢光素酶或綠色熒光蛋白。在一個(gè)實(shí)施方案中，候選化合物可進(jìn)一步被檢測(cè)以確定其是否能調(diào)節(jié)氯化物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白介導(dǎo)的過(guò)程(例如KCC2介導(dǎo)的過(guò)程)或氯化物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性(例如KCC2活性)。在一個(gè)實(shí)施方案中，這樣的氯化物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白介導(dǎo)的過(guò)程是離子轉(zhuǎn)運(yùn)，例如鉀或氯化物轉(zhuǎn)運(yùn)，通過(guò)例如評(píng)估鉀和/或氯化物水平(例如細(xì)胞內(nèi)的)或通過(guò)測(cè)量陰離子逆轉(zhuǎn)電位(電生理學(xué))、膜電位來(lái)測(cè)定，例如下文實(shí)施例中所描述的。
本發(fā)明還涉及疼痛的診斷和預(yù)測(cè)。在一個(gè)實(shí)施方案中，疼痛是由受試者神經(jīng)系統(tǒng)(例如中樞神經(jīng)系統(tǒng))中離子(例如陰離子或氯化物)內(nèi)穩(wěn)態(tài)的變化所引起的。不被任何具體理論所束縛，從中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)神經(jīng)元輸出鉀和氯化物能力的降低可能導(dǎo)致持久的神經(jīng)元超興奮性和最終導(dǎo)致疼痛。
本發(fā)明由此提供了用于診斷或預(yù)測(cè)與CNS功能異常相關(guān)的疼痛的方法。用于此處時(shí)，“CNS功能異?！笔荂NS中神經(jīng)元離子內(nèi)穩(wěn)態(tài)的變化。在一個(gè)實(shí)施方案中，與所述CNS功能異常相關(guān)的疼痛是神經(jīng)性疼痛。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括測(cè)定CNS神經(jīng)細(xì)胞中的細(xì)胞內(nèi)氯化物水平并將該氯化物水平與相應(yīng)的對(duì)照水平進(jìn)行比較。在此具體方法中，檢測(cè)水平相對(duì)于對(duì)照水平的增加表明受試者正經(jīng)受CNS功能異常相關(guān)性疼痛。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法可以包括確定CNS氯化物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性或表達(dá)(例如，KCC2活性或表達(dá))相對(duì)于對(duì)照活性或表達(dá)而言是否被調(diào)節(jié)，例如上調(diào)或增加。在另一實(shí)施方案中，對(duì)照氯化物水平可選自已建立的標(biāo)準(zhǔn)、較早時(shí)間測(cè)定的受試者中相應(yīng)的氯化物水平、當(dāng)受試者經(jīng)受疼痛較輕(相對(duì)于上文提及的當(dāng)前傷害感受而言)或基本上無(wú)疼痛時(shí)在所述受試者中測(cè)定的相應(yīng)氯化物水平；或者當(dāng)對(duì)照受試者經(jīng)受疼痛較輕(相對(duì)于上文提及的測(cè)試組受試者中當(dāng)前傷害感受而言)或基本上無(wú)疼痛時(shí)在對(duì)照受試者中測(cè)定的相應(yīng)氯化物水平。在一個(gè)實(shí)施方案中，經(jīng)受疼痛較輕或基本上無(wú)疼痛的受試者或?qū)φ帐茉囌呶闯尸F(xiàn)出明顯的中樞或外周神經(jīng)系統(tǒng)損傷(例如，神經(jīng)性疼痛)或持續(xù)的疼痛。在另一實(shí)施方案中，對(duì)照活性或表達(dá)可選自已KCC2活性或表達(dá)的建立的標(biāo)準(zhǔn)、在較早時(shí)間測(cè)定的受試者中KCC2活性或表達(dá)的相應(yīng)水平、當(dāng)受試者傷害感受較輕(如上所述)或基本上無(wú)疼痛時(shí)測(cè)定的受試者中KCC2活性或表達(dá)的相應(yīng)水平、或者在所經(jīng)受傷害感受較輕(如上所述)或基本上無(wú)疼痛的對(duì)照受試者中測(cè)定的KCC2活性或表達(dá)的相應(yīng)水平。在一個(gè)實(shí)施方案中，KCC2的活性可如上所述測(cè)定。
例如，通過(guò)對(duì)受試者施用能接觸該受試者CNS神經(jīng)細(xì)胞的指示劑化合物(諸如指示氯化物水平的化合物)可測(cè)定細(xì)胞內(nèi)的氯化物水平。在施用指示劑化合物后，可進(jìn)行與該指示劑化合物相關(guān)的體內(nèi)信號(hào)評(píng)估。在一個(gè)實(shí)施方案中，可以使用指示劑化合物，諸如放射性核素(例如，鉈-201(201Tl)、99Tcm-tetrofosmin、99Tcm-MIBI或99mTc-HMPAO或它們的氯化物綴合物)或指示KCC2表達(dá)的化合物(諸如基于免疫檢測(cè)的試劑(例如，針對(duì)KCC2多肽的抗體、單鏈抗體或Fab片段))。在另一實(shí)施方案中，指示劑化合物通過(guò)靜脈內(nèi)注射時(shí)可穿過(guò)血腦屏障并積累于類似于鉀的CNS神經(jīng)元中，即反應(yīng)鉀水平。在另一實(shí)施方案中，所述放射性核素(例如201Tl)的劑量可以是大約100MBq(3mCi)。在另一實(shí)施方案中，放射性核素(例如201Tl)可在進(jìn)行SPECT成像之前15-20分鐘注射。注射指示劑化合物后，可采用成像技術(shù)評(píng)估體內(nèi)與指示劑化合物相關(guān)的信號(hào)。這樣的成像技術(shù)包括，但不局限于，單光子發(fā)射計(jì)算機(jī)層析X射線照相術(shù)(SPECT)、正電子發(fā)射層析X射線照相術(shù)和/或磁共振成像。成像技術(shù)可評(píng)估指示劑化合物的體內(nèi)信號(hào)，諸如神經(jīng)鉀梯度。圖象可通過(guò)，例如，用裝備有高分辨率(5-7mm)瞄準(zhǔn)儀并連接了專用計(jì)算機(jī)系統(tǒng)的γ照相機(jī)獲得。在一個(gè)實(shí)施方案中，可在180°弧獲得連續(xù)投影圖像。在另一實(shí)施方案中，神經(jīng)元的放射性核素(例如201Tl)滯留可表示為滯留指數(shù)(RI)。“滯留指數(shù)”按本文所述定義為(延時(shí)滯留-早期滯留)×100/早期滯留。
在一個(gè)實(shí)施方案中，“滯留指數(shù)”的“滯留”在此定義為在某一時(shí)間內(nèi)被特定組織保留的指示劑化合物(例如，示蹤物或放射性核素)的量。在另一實(shí)施方案中，在延時(shí)滯留之前評(píng)估早期滯留。在又一實(shí)施方案中，測(cè)量CNS組織中滯留指數(shù)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，上文提及的診斷/預(yù)測(cè)方法可與上文提及的治療/預(yù)防方法聯(lián)合進(jìn)行，用于預(yù)防或治療受試者中與CNS功能異常相關(guān)的疼痛。所述方法因此包括CNS功能異常相關(guān)疼痛的診斷或預(yù)測(cè)，且根據(jù)診斷/預(yù)測(cè)，降低受試者中CNS細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)氯化物水平從而預(yù)防或治療疼痛。
盡管本文描述了多種實(shí)施方案，但可依照本領(lǐng)域技術(shù)人員共有的常規(guī)知識(shí)在本發(fā)明范圍內(nèi)進(jìn)行許多改變和修飾。這樣的修飾包括為了以基本上相同的方式達(dá)到相同的效果針對(duì)本發(fā)明任一方面的已知等價(jià)方案的替代。數(shù)字范圍包括定義該范圍的數(shù)字。在權(quán)利要求中，單詞“包含”被用作一個(gè)開(kāi)放的術(shù)語(yǔ)，基本上等同于短語(yǔ)“包括，但不局限于”。以下實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明各個(gè)方面的舉例說(shuō)明，而非限制本文所公開(kāi)的本發(fā)明的廣泛方面。在整篇申請(qǐng)中，引用了許多文獻(xiàn)以便更完整的描述本發(fā)明所屬的領(lǐng)域。這些參考文獻(xiàn)的公開(kāi)因此作為參考并入本公開(kāi)。
實(shí)施例實(shí)施例1方法神經(jīng)損傷簡(jiǎn)而言之，如文獻(xiàn)所述(16)通過(guò)外科手術(shù)在成年雄性Spague-Dawley大鼠的坐骨神經(jīng)周?chē)踩刖垡蚁┨?長(zhǎng)～2mm，內(nèi)徑0.7mm)。還有一組大鼠也接受假手術(shù)。只有顯示出機(jī)械閾值(在14-17天中)逐漸降低至2.0g或更少的動(dòng)物才用于進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)。
行為檢測(cè)如文獻(xiàn)所述(17)檢測(cè)傷害感受消退反射的熱和機(jī)械閾值。
切片制備如文獻(xiàn)所述(9)從成年(大于50天)雄性大鼠制備脊髓旁矢狀面切片(300-350μm)。用含以下成分(mM)的人造腦脊髓液(ACSF)不斷澆注切片(2-3ml/分鐘)126NaCl，2.6NaHCO3，10葡萄糖，2.5KCl，2CaCl2，2MgCl2，1.25NaH2PO4，0.001TTX(通入95％O2-5％CO2，pH～7.4)；當(dāng)測(cè)量GABAA/GlyR-介導(dǎo)的電流時(shí)，加入10μM 6-氰基-7-硝基喹喔啉-2，3-二酮(CNQX)和40μM D2-氨基-5-膦?；焖?APV)以阻斷快速的谷氨酸能傳遞。
記錄為了進(jìn)行穿孔膜片鉗(perforated patch)記錄，在移液器頭上吸滿含以下成分的溶液(mM)130葡糖酸銫(CsGluc)，5CsCl，2MgCl2，11BAPTA鈣螯合劑(緩沖液)，1CaCl2，4ATP，0.4GTP，10HEPES(pH～7.4)。移液器回吸補(bǔ)充了25μg/ml短桿菌肽D(短桿菌肽貯存液是溶于DMSO中10mg/ml)的相同溶液。當(dāng)接入電阻(access resistance)穩(wěn)定在25-45MQ之間時(shí)選擇此方式的記錄。為了進(jìn)行全細(xì)胞電壓鉗記錄，使移液器吸滿無(wú)短桿菌肽D的上述溶液。類似的，用吸了電壓鉗所用溶液的相同的細(xì)胞內(nèi)溶液進(jìn)行全細(xì)胞電流鉗記錄，不同之處在于用甲基硫酸鉀(KMeSOe)代替CsGluc。為了在0mV夾住E陰離子，在細(xì)胞內(nèi)溶液中用110mM CsCl代替CsGluc。所有E陰離子＝0mV時(shí)的全細(xì)胞記錄都是在Vm＝-60mV且存在GluR阻斷劑的條件下進(jìn)行的。用板式微量移液器(patch micropipette)通過(guò)壓力噴射局部應(yīng)用GABA 30-250ms。如文獻(xiàn)所述(9)進(jìn)行數(shù)據(jù)采集和PSC分析。若非特別指明，所有的測(cè)量以平均值±SEM給出。用斯氏t-檢驗(yàn)比較平均值的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性、卡方檢驗(yàn)檢測(cè)相依表以及混合設(shè)計(jì)ANOVAs(post-hoc-Tukey′s HSD)檢測(cè)重復(fù)測(cè)量的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。
鈣成像如上文關(guān)于電生理分析從PNI和首次用于實(shí)驗(yàn)的大鼠制備切片。在ACSF中孵育15分鐘后，在切片裝入溶于HEPES緩沖鹽水(+10％DMSO)的10μM Fura-2-AM(熒光測(cè)定鈣指示劑，AM＝乙酸基甲基)1小時(shí)。先用ACSF漂洗切片～15分鐘再固定于記錄室中，在記錄室中繼續(xù)對(duì)切片澆注ACSF(2-3ml/分鐘)。用裝備了表面熒光光學(xué)系統(tǒng)的Zeiss Axioscope熒光檢測(cè)[Ca2+]i。用與CCD照相機(jī)連接的TILL Photonics單色儀獲取圖像并在清楚的明顯神經(jīng)元細(xì)胞體中標(biāo)出目的區(qū)域(用于定量)。
免疫印跡從PNI和首次用于實(shí)驗(yàn)的成年大鼠二者的腰膨大制備SDH水平切片(150μm)。通過(guò)用特氟隆研杵在含以下成分的緩沖液中勻漿制備組織提取物0.32M蔗糖，0.5mM Tris-HCl，pH 7.5，2mM二乙胺四乙酸(EDTA)，2.5mM β-巰基乙醇和蛋白酶抑制劑的混合物(CompleteTM，RocheDiagnostics)。收集3,000g(20分鐘)和10,000g(30分鐘)離心的上清液。將稀釋于樣品緩沖液中的等量蛋白質(zhì)(20μg/泳道)在37℃預(yù)熱30分鐘，用SDS-PAGE解析，并電印跡至硝酸纖維素膜上。將膜在溶于TBST緩沖液(150mM NaCl，10mM Tris-HCl，pH 7.4，0.05％Tween-20)的5％脫脂干奶中封閉30分鐘并在4℃與兔抗KCC2抗體(1∶1000，Upstate Biotechnology)孵育過(guò)夜。用TBST漂洗數(shù)次后，將膜與過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔抗體(1∶2000)一起在室溫孵育30分鐘。用Super Signal FemtoTM(PierceBiotechnology)檢測(cè)化學(xué)發(fā)光條帶。用VersaDocTM成像系統(tǒng)(BioRad)捕捉數(shù)碼圖像并用QuantityOneTM軟件(BioRad)分析數(shù)據(jù)。
寡脫氧核糖核苷酸如文獻(xiàn)所述(18)設(shè)計(jì)在所有位置硫代磷酸酯化的KCC2反義和合成的寡脫氧核糖核苷酸反義5′-TCTCCTTGGGATTGCCGTCA-3′(SEQ IDNO7；相對(duì)于ATG起始信號(hào)+59處)；合成的寡脫氧核糖核苷酸5′-TCTTCTTGAGACTGCAGTCA-3′(SEQ ID NO8)。
鞘內(nèi)注射至少在藥物施用前三天，如文獻(xiàn)所述(11)用戊巴比妥鈉(65mg/kg)麻醉大鼠并將腰脊椎導(dǎo)管插入鞘內(nèi)空間。簡(jiǎn)而言之，在大池處產(chǎn)生一個(gè)小開(kāi)口，將導(dǎo)管插入蛛網(wǎng)膜下空間并從尾部徑直前進(jìn)～8cm至脊髓的腰膨大。從外科手術(shù)恢復(fù)后，通過(guò)鞘內(nèi)(i.t.)注射利多卡因(2％，30μl)誘導(dǎo)下身麻痹從而證實(shí)正確的導(dǎo)管定位。只有對(duì)利多卡因呈現(xiàn)出適當(dāng)?shù)亩虝郝楸袁F(xiàn)象以及無(wú)運(yùn)動(dòng)缺陷的動(dòng)物被用于行為試驗(yàn)。在施用藥物/載體后，處死動(dòng)物并解剖它們的脊柱以在視覺(jué)上證實(shí)導(dǎo)管的正確放置。藥物包括DIOA(10-30μg，在0.9％NaCl，10％DMSO中)和寡脫氧核糖核苷酸(每劑2μg，0小時(shí)、12小時(shí)和24小時(shí)各一劑；0.9％NaCl)。如上所述進(jìn)行行為試驗(yàn)，在接受藥物或載體之前，在首次用于實(shí)驗(yàn)的大鼠中證實(shí)了消退反應(yīng)的正常(～15g)機(jī)械閾值。在所使用的劑量時(shí)，根據(jù)抓握、直立和放置反射以及行為觀察(17)評(píng)估發(fā)現(xiàn)沒(méi)有化合物產(chǎn)生運(yùn)動(dòng)干擾或鎮(zhèn)靜。
計(jì)算機(jī)模擬(參閱圖5)所有的模擬都通過(guò)NEURON 4.3.1基于(19)利用具有形態(tài)學(xué)和被動(dòng)膜(passive membrane)性質(zhì)的普通脊髓片層I紡錘狀神經(jīng)元的區(qū)室模型進(jìn)行。將最多分叉至第四級(jí)且軸突與文獻(xiàn)(19)所述相似的樹(shù)突附著于軀體?；?30)的快速Na+和延遲的整流器K+電流分別以0.1和0.01S/cm2插入軀體和軸突起始段及節(jié)點(diǎn)處，形成尖峰的電壓閾值是-49mV。兩套抑制性突觸隨機(jī)分布于周?chē)w細(xì)胞區(qū)(perisomatic region)，而四套興奮性突觸則在更末梢，每一套都通過(guò)獨(dú)立的Poisson方法以文獻(xiàn)(31)和(32)外推的速率驅(qū)動(dòng)。
電子顯微術(shù)(參閱圖6)
如文獻(xiàn)(35)所述處理組織用于超結(jié)構(gòu)分析。簡(jiǎn)而言之，先用0.9％NaCl，后用含4％多聚甲醛(Sigma-Aldrich，德國(guó))的固定液從主動(dòng)脈弓灌注大鼠。灌注后，除去脊髓，解剖冠狀阻滯，然后低溫保護(hù)切下60μm薄的切片并液氮凍融，用磷酸緩沖液漂洗數(shù)次后在初次抗血清中孵育。在含2％牛血清白蛋白(BSA)的封閉液中孵育后，將切片在兔抗KCC2(1∶500，UpstateBiotechnology，USA)中4℃孵育48小時(shí)。充分洗滌后，將切片在1nm金綴合的抗兔二級(jí)抗體(1∶250，Aurion)中4℃孵育12小時(shí)，隨后銀強(qiáng)化(SE-EM，Aurion)。將切片用0.5％OsO4處理(20min)，梯度乙醇中脫水，然后在氧化丙烯中脫水，并包埋于Durcupan ACM(Fluka)中。超切片后(Ultracut UCT，Leica，德國(guó))，用電子顯微鏡(Philips Tecnai 12，配備了MegaViewTMCCD照相機(jī))檢查樣本。用電鏡分析非連續(xù)(間隔＞3μm)超薄切片。隨機(jī)選擇具有突觸特征的小結(jié)并用片層I和II及白質(zhì)分析KCC2蛋白質(zhì)的表達(dá)(36)。
鞘內(nèi)施用K-252a(參閱圖8)用25μl含10％DMSO的0.9％NaCl溶液配制K-252a。通過(guò)在大池產(chǎn)生一個(gè)小的開(kāi)口并將P10聚乙烯管插入蛛網(wǎng)膜下空間-從尾部徑直～8cm至脊髓的腰膨大處，從而完成鞘內(nèi)導(dǎo)管插入術(shù)。
實(shí)施例2結(jié)果通過(guò)長(zhǎng)期壓縮坐骨神經(jīng)誘導(dǎo)外周神經(jīng)病(圖1a)。為了檢測(cè)外周神經(jīng)損傷(PNI)后的SDH神經(jīng)元的超興奮性(致敏)是否與陰離子梯度(陰離子)的變化相關(guān)，用穿孔短桿菌肽膜片鉗記錄檢測(cè)陰離子逆轉(zhuǎn)電位(E陰離子)。此技術(shù)避免了細(xì)胞內(nèi)陰離子濃度的破壞(8)。對(duì)外源GABA應(yīng)用的反應(yīng)顯示來(lái)自PNI大鼠片層I(LI)神經(jīng)元的陰離子逆轉(zhuǎn)電位(E陰離子)是-49.0±2.3mV(范圍-40至-62.2mV，n＝9)，相比，來(lái)自首次用于實(shí)驗(yàn)的大鼠LI神經(jīng)元的陰離子逆轉(zhuǎn)電位為-72.6±3.5mV(范圍-63.0到-79.9mV，n＝5；p＜0.005)(圖1b-d)。PNI(-62±4mV，n＝7)和首次用于實(shí)驗(yàn)的大鼠LI神經(jīng)元(-61±2mV，n＝16；p＞0.1)之間的靜息膜電位無(wú)顯著的差異。在快速谷氨酸受體(GluR)阻斷劑存在條件下從PNI大鼠LI神經(jīng)元記錄的自發(fā)和激發(fā)的突觸后電流(PSCs)也是內(nèi)向的(從靜止去極化)，它們的平均逆轉(zhuǎn)電位相對(duì)于首次用于實(shí)驗(yàn)的大鼠片層I神經(jīng)元中的逆轉(zhuǎn)電位而言提高了16.1mV(n＝6，PNI；n＝4，首次用于實(shí)驗(yàn)的)。
然后研究PNI后SDH中突觸傳遞的其它特性是否改變。即使從局部抑制性中間神經(jīng)元共釋放出GABA和甘氨酸，僅甘氨酸受體(GlyR)也能介導(dǎo)首次用于實(shí)驗(yàn)的大鼠的LI神經(jīng)元中的抑制性小型PSCs(mPSCs)(9；圖2a)。而在所有來(lái)自PNI大鼠的被檢測(cè)細(xì)胞中，GluR-介導(dǎo)的mPSC均未受PNI的影響(圖2b)，在GlyR拮抗劑馬錢(qián)子堿存在的條件下持續(xù)出現(xiàn)0mV外向的一群mPSC(最大1μm；n＝4)。這些殘留的mPSC是由GABAARs介導(dǎo)的，因?yàn)樗鼈儽缓砂档A(10μM)所阻斷并且與GlyR介導(dǎo)的組分相比呈現(xiàn)出延長(zhǎng)的衰減動(dòng)力學(xué)(τD(GABAAR)＝34.0±2.9ms，n＝5相對(duì)于τD(GlyR)＝11.3±1.3ms，n＝6；p＜0.01；圖2C)。
動(dòng)力學(xué)分析進(jìn)一步顯示出mPSC的36.9±2.3％衰減期遵循雙指數(shù)函數(shù)(dual exponential function)(τD1＝7.5±2.0ms且τD2＝51.3±7.9ms；n＝6；圖2c)。這些事件具有GABAAR和GlyR介導(dǎo)的成分，因?yàn)轳R錢(qián)子堿或荷包牡丹堿都可導(dǎo)致它們相應(yīng)成分的消除(n＝4)。因此，與陰離子衰減相并行，PNI引起了LI突觸處的再組織，從而暴露出除了GlyR單獨(dú)介導(dǎo)的mPSC之外由GABAAR單獨(dú)介導(dǎo)以及混合GABAAR/GlyR-介導(dǎo)的mPSC。此突觸組織與不成熟LI-II神經(jīng)元中觀察到的類似(9)。此突觸開(kāi)關(guān)的凈效果是它產(chǎn)生了一組具有顯著較長(zhǎng)的衰減動(dòng)力學(xué)的量子突觸事件。
為了檢查PNI-誘導(dǎo)的GABAAR-介導(dǎo)的對(duì)mPSC的貢獻(xiàn)，我們分析了峰電導(dǎo)和mPSC的頻率。此操作的完成是利用填充了CsCl的移液器夾住來(lái)自PNI和首次用于實(shí)驗(yàn)的大鼠的LI神經(jīng)元在0mV的E陰離子以防止由于驅(qū)動(dòng)力改變而導(dǎo)致的mPSC的有偏檢測(cè)。在來(lái)自PNI大鼠的LI神經(jīng)元中記錄到的僅GlyR的mPSC的峰電導(dǎo)明顯小于(～1/2)從首次用于實(shí)驗(yàn)的大鼠LI神經(jīng)元記錄得到的數(shù)據(jù)(圖2d)。不過(guò)，在PNI條件下增加GABAAR-介導(dǎo)的事件部分補(bǔ)償了僅GlyR時(shí)電導(dǎo)的降低。GluR介導(dǎo)的量子事件的峰電導(dǎo)在來(lái)自首次用于實(shí)驗(yàn)的大鼠和PNI大鼠的LI神經(jīng)元之間無(wú)顯著差異(圖2d)。
通過(guò)對(duì)峰電導(dǎo)、動(dòng)力學(xué)和驅(qū)動(dòng)力改變的綜合因素分析，在來(lái)自PNI大鼠的LI神經(jīng)元中靜息膜電位上GlyR單獨(dú)介導(dǎo)的mPSC攜帶的凈電荷大約為首次用于實(shí)驗(yàn)的大鼠中的1/3(圖2e)。不過(guò)，在有GABAAR貢獻(xiàn)的情況下，PNI大鼠中mPSC所攜帶的凈電荷回升至首次用于實(shí)驗(yàn)的大鼠中GlyR介導(dǎo)的水平。此結(jié)果顯示，盡管大小相當(dāng)，但是首次用于實(shí)驗(yàn)的大鼠LI神經(jīng)元中超極化電荷只是由GlyR-介導(dǎo)的mPSC攜帶，而在PNI大鼠LI神經(jīng)元中，由于GABAAR-介導(dǎo)的mPSC衰減動(dòng)力學(xué)的延長(zhǎng)，去極化電荷主要是通過(guò)GABAAR轉(zhuǎn)移。
據(jù)觀察在來(lái)自PNI大鼠的LI神經(jīng)元記錄到的僅GlyR mPSC的頻率(0.13±0.04Hz，n＝5)顯著低于首次用于實(shí)驗(yàn)的大鼠LI神經(jīng)元在僅GlyR的mPSC頻率(0.18±0.04Hz，n＝6；p＜0.05；圖2f)。不過(guò)，如同峰電導(dǎo)一樣，GABAAR-介導(dǎo)的mPSC的加入補(bǔ)償了PNI-導(dǎo)致的頻率減小(0.22±0.10Hz，n＝4，對(duì)于所有GABAAR和/或GlyR-介導(dǎo)的事件組合而言，p＞0.5)。相反，分離自PNI大鼠的LI神經(jīng)元中的GluR介導(dǎo)的事件頻率(1.51±0.90Hz，n＝9)與分離自首次用于實(shí)驗(yàn)的大鼠的LI神經(jīng)元中的(0.82±40Hz，n＝S；p＞0.3；圖2f)相比較無(wú)顯著變化。
如果去極化GABAAR/GlyR-介導(dǎo)的突觸后電流在PNI LI神經(jīng)元中產(chǎn)生凈興奮作用，它們應(yīng)直接引起動(dòng)作電位，并因此導(dǎo)致Ca2+內(nèi)向通量。為了檢驗(yàn)這一假設(shè)，我們利用切片中負(fù)荷fura-2-am的LI神經(jīng)元進(jìn)行Ca2+成像以獲得大數(shù)據(jù)集。對(duì)神經(jīng)元體施用外源GABA在PNI部位身體同側(cè)的19％LI神經(jīng)元中導(dǎo)致了細(xì)胞內(nèi)Ca2+([Ca2+]i)濃度的顯著增加(n＝53；圖3a，c)。這代表與首次用于實(shí)驗(yàn)的大鼠和/或?qū)?cè)背角中發(fā)現(xiàn)的LI神經(jīng)元相比增加了7倍，其中在被檢測(cè)的37個(gè)神經(jīng)元中只觀察到1個(gè)具有針對(duì)GABA施用而產(chǎn)生的[Ca2+]i增加(圖3b、c)。這些反應(yīng)可以被荷包牡丹堿(10μM；n＝5)以及電壓敏感鈉通道阻斷劑河豚毒素(TTX；1μM；n＝31)所阻斷。然后我們進(jìn)一步從電生理學(xué)上證實(shí)了應(yīng)用的GABA和突觸引起的陰離子突觸后電位可直接引起動(dòng)作電位(圖3d、e)。這些結(jié)果表明突觸后陰離子內(nèi)向通量可在PNI大鼠的片層I神經(jīng)元中引起凈興奮。我們?nèi)缓笸ㄟ^(guò)對(duì)SDH的水平切片進(jìn)行免疫印跡比較了KCC2蛋白質(zhì)水平。相對(duì)于受傷部位的對(duì)側(cè)而言，在PNI同側(cè)的腰SDH中KCC2表達(dá)水平顯著降低(＞2倍)(圖3f)。在首次用于實(shí)驗(yàn)的大鼠中，兩側(cè)之間無(wú)顯著的差異(n＝3)。
如果KCC2轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)的減少導(dǎo)致神經(jīng)元[Cl-]i的增加并，又導(dǎo)致了GABAAR-介導(dǎo)的去極化作用，那么在來(lái)自首次用于實(shí)驗(yàn)的大鼠LI神經(jīng)元中KCC2轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的藥理學(xué)阻斷應(yīng)具有相同的效果。為了檢測(cè)此可能性，我們對(duì)首次用于實(shí)驗(yàn)的脊髓切片水浴應(yīng)用選擇性的KCC2阻斷劑DIOA(30μM)。如在PNI情況中，DIOA存在時(shí)應(yīng)用GABA引起30％被檢測(cè)的首次用于實(shí)驗(yàn)的LI神經(jīng)元中[Ca2+]i增加(圖3b、c)。為了檢查憑經(jīng)驗(yàn)確定的GABAAR/GlyR-介導(dǎo)的突觸后控制的變化是否足以導(dǎo)致PNI之后中樞敏化，我們利用就生物物理學(xué)而言逼真的神經(jīng)元模型模擬體內(nèi)情況(圖5)。模擬證實(shí)PNI之后，LI神經(jīng)元敏化的程度隨它們的E陰離子而變，從輕微的去抑制至凈超興奮變化。
為了檢測(cè)此超興奮性(敏化)是否將導(dǎo)致引起傷害感受消退反射的刺激閾值的降低，我們通過(guò)鞘內(nèi)導(dǎo)管將DIOA(15-30μg)直接施用于完整大鼠中脊椎的腰膨大處。DIOA導(dǎo)致了針對(duì)對(duì)機(jī)械和熱刺激物的傷害感受閾值快速且可逆的降低(圖4a-b)。通過(guò)脊髓施用針對(duì)KCC2mRNA的反義寡脫氧核苷酸選擇性擊倒(knock-down)所述轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，也得到了傷害感受閾值的相似降低(圖4e)，更進(jìn)一步證實(shí)了KCC2下調(diào)的功能性影響。
如圖7中所示，我們證實(shí)了在取自患外周神經(jīng)病大鼠的片層I神經(jīng)細(xì)胞中，跨膜陰離子逆轉(zhuǎn)電位(E陰離子)的去極化程度顯著高于取自首次用于實(shí)驗(yàn)的大鼠的片層I神經(jīng)元中的E陰離子。記錄自首次用于實(shí)驗(yàn)的大鼠片層I神經(jīng)元的陰離子(碳酸氫鹽和氯化物)逆轉(zhuǎn)電位(E陰離子)顯著小于從已接受外周神經(jīng)損傷(PNI)的大鼠的片層I神經(jīng)元中記錄的E陰離子。水浴應(yīng)用(bath application)BDNF(50ng/ml；N/BDNF)和NGF(50ng/ml；N/NGF)二者都導(dǎo)致記錄自首次用于實(shí)驗(yàn)的大鼠片層I神經(jīng)元的E陰離子變得顯著去極化，標(biāo)志著跨膜陰離子梯度的衰減。或者，對(duì)取自PNI大鼠的片層I神經(jīng)元水浴應(yīng)用TrkB拮抗劑K-252a(200nM；P/K252a)導(dǎo)致E陰離子超極化至與取自首次用于實(shí)驗(yàn)的大鼠片層I神經(jīng)元中觀察到的相似的水平。所有的E陰離子值都利用短桿菌肽-D穿孔膜片電壓鉗記錄得以證實(shí)。如上文所提及的，此去極化E陰離子是由于在取自神經(jīng)病大鼠的片層I神經(jīng)元中KCC2協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)下降所導(dǎo)致的。在取自首次用于實(shí)驗(yàn)的大鼠的片層I神經(jīng)元中，本文進(jìn)一步表明可通過(guò)灌注生長(zhǎng)因子NGF和BDNF顯著去極化E陰離子，表明這些生長(zhǎng)因子可降低表面背角中KCC2蛋白質(zhì)的功能和/或表達(dá)?；蛘?，本文表明在取自神經(jīng)病大鼠的片層I神經(jīng)元中用蛋白激酶抑制劑K-252a阻斷BDNF受體TrkB逆轉(zhuǎn)了E陰離子的去極化，使該值回復(fù)到與首次用于實(shí)驗(yàn)的大鼠片層I神經(jīng)元中觀察到的相似的水平。此外，如在圖8中所示的，鞘內(nèi)施用受體酪氨酸激酶抑制劑K-252a(6nM)(而非只注射載體)在已接受外周神經(jīng)損傷的大鼠中導(dǎo)致觸覺(jué)傷害感受消退的閾值提高。因此K-252a可在外周神經(jīng)損傷后外周神經(jīng)再發(fā)育之后逆轉(zhuǎn)痛覺(jué)過(guò)敏/異常性疼痛。根據(jù)抓握、直立和放置反射以及行為觀察進(jìn)行評(píng)估，K-252a不產(chǎn)生任何運(yùn)動(dòng)干擾或鎮(zhèn)靜作用。預(yù)計(jì)，此抑制劑通過(guò)阻斷磷酸化再次激活了取自神經(jīng)病大鼠的片層I神經(jīng)元中KCC2協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，所述磷酸化可能是在轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白或其轉(zhuǎn)錄因子(或其它調(diào)節(jié)底物)上蛋白質(zhì)酪氨酸激酶位點(diǎn)處。
此處的結(jié)果表明，PNI后導(dǎo)致疼痛的神經(jīng)病變可通過(guò)KCC2exporter下調(diào)和脊髓LI神經(jīng)元中陰離子的所得變化來(lái)解釋。它們還證實(shí)了在成年動(dòng)物中所述陰離子的改變可發(fā)生于損傷部位跨突觸的神經(jīng)元中。早先為了鑒定外圍神經(jīng)病超興奮特性潛在底物所作的努力都集中于測(cè)量GABA能中間神經(jīng)元的數(shù)目、GABA含量或GABAAR表達(dá)的改變。結(jié)果是矛盾的(3-6)。本文所介紹的發(fā)現(xiàn)提供了了解所述去抑制機(jī)制的新途徑。通過(guò)陰離子的變化，GABAAR/GlyR-介導(dǎo)的突觸后作用的轉(zhuǎn)變提供了中樞敏化(centralsensitization)的機(jī)械基礎(chǔ)，包括神經(jīng)元反應(yīng)性和興奮輸入的增加。
脊髓的重要特征是它利用了兩條非常不同的GABA能抑制機(jī)制感覺(jué)纖維中樞末端的GABA能控制涉及去極化機(jī)制(39)，與GABA能抑制作用涉及超極化的背角細(xì)胞相反。因此，此處所報(bào)道的KCC2表達(dá)的變化只影響了控制感覺(jué)輸入的兩種抑制機(jī)制中一種的GABA活動(dòng)的極性。這一點(diǎn)通過(guò)初級(jí)傳入缺乏KCC2表達(dá)這一事實(shí)得以證實(shí)(圖4f、g；也參閱圖6)。
GABA/甘氨酸介導(dǎo)的去極化作用也可用作門(mén)控機(jī)制使得可通過(guò)電壓敏感的Ca2+通道(VSCC)和NMDA受體/通道激活(10)。經(jīng)由這些通道的Ca2+內(nèi)向通量被認(rèn)為對(duì)于脊髓神經(jīng)元的敏化是重要的(11)。確實(shí)，已證實(shí)在神經(jīng)性疼痛的治療中通過(guò)諸如加巴噴丁和氯胺酮等藥物阻斷人體內(nèi)的這些Ca2+通道非常有效(12-14)。不過(guò)，使用Ca2+通道阻斷劑，尤其是氯胺酮和其它NMDA拮抗劑，是與許多不希望的副作用相關(guān)的(14，15)。
實(shí)施例3-KCC2的體外TrkB-依賴性調(diào)節(jié)制備來(lái)自首次用于實(shí)驗(yàn)的大鼠或PNI大鼠背角的旁矢狀面切片(250-300μm)。用加氧的林格溶液持續(xù)灌注切片并在進(jìn)行進(jìn)一步處理前將切片平衡至少1.5小時(shí)。除非另外說(shuō)明，用10μM CNQX-一種非NMDA離子型谷氨酸受體的阻斷劑進(jìn)一步灌注切片。用短桿菌肽-D穿孔膜片或全細(xì)胞電壓膜片鉗記錄儀對(duì)肉眼可識(shí)別的片層I神經(jīng)元進(jìn)行記錄。在兩種情況下，用移液器吸取含甲基硫酸鉀或葡糖酸銫的細(xì)胞內(nèi)溶液作為主要的離子類型。通過(guò)對(duì)目的神經(jīng)元體連續(xù)短暫(5-10ms)應(yīng)用外源GABA來(lái)檢測(cè)E陰離子；通過(guò)操縱神經(jīng)元的膜電位，將GABA既不引起內(nèi)向也不引起外向陰離子電流的點(diǎn)作為E陰離子。對(duì)液體接點(diǎn)電位、移液器偏移量和電阻校正膜電位的所有測(cè)量。
如圖12中所示，腦源神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF；50ng/ml浴中)介導(dǎo)的TrkB活化和神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF；50ng/ml浴中)介導(dǎo)的TrkA活化均在首次用于實(shí)驗(yàn)的大鼠片層I神經(jīng)元中導(dǎo)致陰離子逆轉(zhuǎn)電位(E陰離子)顯著的去極化作用。
利用取自外周神經(jīng)損傷(PNI)大鼠的切片，其中E陰離子是慢性去極化的，應(yīng)用與TrkB受體偶聯(lián)的細(xì)胞內(nèi)途徑組分的多種抑制劑，發(fā)現(xiàn)這引起了E陰離子(碳酸氫鹽和氯化物)顯著的超極化，其程度達(dá)到了與在首次用于實(shí)驗(yàn)的大鼠切片中觀察到的相似的水平(圖13)。導(dǎo)致此效果的活性劑包括，但不局限于，針對(duì)TrkB的抗體(抗-TrkB-IgG 1μg/ml浴中)；K-252a(TrkA/B自磷酸化的抑制劑(200nM溶液))；H-89，依賴cAMP的激酶(PKA)的膜滲透性抑制劑(15μM浴中))；以及KN-93(鈣調(diào)蛋白依賴性激酶II和IV的膜可滲透性抑制劑(5μM浴中))。
實(shí)施例4-體內(nèi)傷害感受閾值的TrkB-依賴型調(diào)節(jié)用于通過(guò)鞘內(nèi)導(dǎo)管局部脊髓遞送的所有藥物都溶于加有或未加10％v/v DMSO的0.9％NaCl中。通過(guò)在大池產(chǎn)生一個(gè)小的開(kāi)口并將一短的P10聚乙烯管插入蛛網(wǎng)膜下空間-從尾部徑直～8cm至脊髓的腰膨大(L4-5)，完成鞘內(nèi)導(dǎo)管插入術(shù)。根據(jù)通過(guò)抓握、直立和放置反射以及其它行為觀察所進(jìn)行的評(píng)估，施用的藥物都不產(chǎn)生運(yùn)動(dòng)干擾或鎮(zhèn)靜作用。利如前所述(41)用Von Frey試驗(yàn)評(píng)估機(jī)械刺激的50％消退閾值。所有的實(shí)驗(yàn)都在完整成年Sprague-Dawley大鼠中進(jìn)行。
利用鞘內(nèi)導(dǎo)管局部脊髓遞送多種活性劑可鑒定導(dǎo)致首次用于實(shí)驗(yàn)的大鼠中觸覺(jué)刺激的傷害感受閾值下降或提高PNI大鼠中傷害感受閾值的幾種化合物。
局部脊髓遞送轉(zhuǎn)導(dǎo)BDNF(圖14)或人重組BDNF(10μg/天，共6天)的腺病毒而不是轉(zhuǎn)導(dǎo)綠色熒光蛋白的腺病毒導(dǎo)致首次用于實(shí)驗(yàn)的大鼠中機(jī)械刺激的傷害感受閾值顯著降低。同樣的，鞘內(nèi)遞送人重組NGF(圖15；10μg/天，共6天)至首次用于實(shí)驗(yàn)的大鼠導(dǎo)致所述傷害感受閾值非常相似的降低。
另一方面，通過(guò)鞘內(nèi)導(dǎo)管對(duì)PNI大鼠連續(xù)施用針對(duì)TrkB的抗體(抗-TrkB-IgG 12μg/2小時(shí)，共3次)實(shí)現(xiàn)對(duì)機(jī)械刺激的傷害感受閾值顯著提高(圖16)。局部脊髓遞送PKA抑制劑H-89(380nmol)也導(dǎo)致傷害感受閾值的提高(圖17)。
在整篇申請(qǐng)書(shū)中，引用了多種文獻(xiàn)，它們更完整地描述了本發(fā)明所屬領(lǐng)域的狀況。這些文獻(xiàn)的公開(kāi)在此引用作為本公開(kāi)的參考。
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<221>CDS<222>(1)..(3351)<400>1atg ccc aac aac ctg acg gac tgc gag gac ggc gat ggg gga gcc aac48Met Pro Asn Asn Leu Thr Asp Cys Glu Asp Gly Asp Gly Gly Ala Asn1 5 10 15ccg ggt gat ggc aac ccc aag gaa agc agt ccc ttc atc aac agc acc96Pro Gly Asp Gly Asn Pro Lys Glu Ser Ser Pro Phe Ile Asn Ser Thr20 25 30gac aca gag aag gga aag gag tat gat ggc aag aac atg gcc ttg ttt144Asp Thr Glu Lys Gly Lys Glu Tyr Asp Gly Lys Asn Met Ala Leu Phe35 40 45gag gag gag atg gac acc agc cct atg gtg tcc tcc ttg ctc agt ggc192Glu Glu Glu Met Asp Thr Ser Pro Met Val Ser Ser Leu Leu Ser Gly50 55 60ctg gcc aac tac acc aac ctg ccc cag gga agt agg gag cat gaa gag240Leu Ala Asn Tyr Thr Asn Leu Pro Gln Gly Ser Arg Glu His Glu Glu65 70 75 80gca gaa aac aat gag ggt gga aaa aag aag ccg gtg cag gcc cca cgc288Ala Glu Asn Asn Glu Gly Gly Lys Lys Lys Pro Val Gln Ala Pro Arg
85 90 95atg ggc acc ttc atg ggc gtg tac ctg ccg tgc ctg cag aac atc ttt 336Met Gly Thr Phe Met Gly Val Tyr Leu Pro Cys Leu Gln Asn Ile Phe100 105 110ggc gtc atc ctc ttc ctg cgg ctc acc tgg gtg gtg ggc att gca ggc 384Gly Val Ile Leu Phe Leu Arg Leu Thr Trp Val Val Gly Ile Ala Gly115 120 125atc atg gag tcc ttc tgc atg gtg ttc atc tgc tgc tcc tgt acg atg 432Ile Met Glu Ser Phe Cys Met Val Phe Ile Cys Cys Ser Cys Thr Met130 135 140ctc acg gcc atc tcc atg agt gca att gca acg aat ggt gtt gtg cct 480Leu Thr Ala Ile Ser Met Ser Ala Ile Ala Thr Asn Gly Val Val Pro145 150 155 160gct ggt ggc tcc tac tac atg att tcc agg tct ctg ggc cca gag ttt 528Ala Gly Gly Ser Tyr Tyr Met Ile Ser Arg Ser Leu Gly Pro Glu Phe165 170 175ggg ggt gcc gtg ggc ctc tgc ttc tac ctg ggc act acc ttt gca gga 576Gly Gly Ala Val Gly Leu Cys Phe Tyr Leu Gly Thr Thr Phe Ala Gly180 185 190gcc atg tac atc ctg ggc acc atc gaa atc ctg ctg gct tac ctc ttc 624Ala Met Tyr Ile Leu Gly Thr Ile Glu Ile Leu Leu Ala Tyr Leu Phe195 200 205cca gcc atg gcc atc ttc aag gca gaa gat gcc agt ggg gag gca gca 672Pro Ala Met Ala Ile Phe Lys Ala Glu Asp Ala Ser Gly Glu Ala Ala210 215 220gcc atg ctg aac aac atg cgt gtt tac ggc acc tgt gtg ctc acc tgc 720Ala Met Leu Asn Asn Met Arg Val Tyr Gly Thr Cys Val Leu Thr Cys225 230 235 240atg gcc act gtg gtg ttt gtg ggt gtc aag tat gtc aac aag ttt gcc 768Met Ala Thr Val Val Phe Val Gly Val Lys Tyr Val Asn Lys Phe Ala245 250 255ctt gtc ttc ctg ggt tgt gtc atc ctc tcc atc ctg gcc atc tat gct 816Leu Val Phe Leu Gly Cys Val Ile Leu Ser Ile Leu Ala Ile Tyr Ala260 265 270ggg gtc atc aag tct gcc ttc gac cca ccc aac ttc ccg atc tgc ctc 864Gly Val Ile Lys Ser Ala Phe Asp Pro Pro Asn Phe Pro Ile Cys Leu275 280 285
ctg ggt aac cgc acg ctg tct cgc cat ggc ttt gat gtc tgt gcc aag 912Leu Gly Asn Arg Thr Leu Ser Arg His Gly Phe Asp Val Cys Ala Lys290 295 300ctg gct tgg gaa gga aat gag acg gtg acc aca cgg cta tgg ggc ctt 960Leu Ala Trp Glu Gly Asn Glu Thr Val Thr Thr Arg Leu Trp Gly Leu305 310 315 320ttc tgc tcc tct cgc ttc ctc aac gcc acc tgt gat gaa tac ttc acc 1008Phe Cys Ser Ser Arg Phe Leu Asn Ala Thr Cys Asp Glu Tyr Phe Thr325 330 335cga aac aat gtc aca gag atc cag ggc atc cct ggt gct gcc agt ggc 1056Arg Asn Asn Val Thr Glu Ile Gln Gly Ile Pro Gly Ala Ala Ser Gly340 345 350ctc atc aaa gag aac ctc tgg agc tcc tac ctg acc aag ggc gtg att 1104Leu Ile Lys Glu Ash Leu Trp Ser Ser Tyr Leu Thr Lys Gly Val Ile355 360 365gtg gag agg agt ggg atg acc tcg gtg ggc ctg gcc gat ggc act cct 1152Val Glu Arg Ser Gly Met Thr Ser Val Gly Leu Ala Asp Gly Thr Pro370 375 380atc gac atg gac cae cct tat gtc ttc agt gat atg acc tcc tac ttc 1200Ile Asp Met Asp His Pro Tyr Val Phe Ser Asp Met Thr Ser Tyr Phe385 390 395 400acc ctg ctg gtt ggc atc tac ttc ccc tca gtc aca ggg atc atg gct 1248Thr Leu Leu Val Gly Ile Tyr Phe Pro Ser Val Thr Gly Ile Met Ala405 410 415ggt tct aac cgc tct ggg gac ctg agg gat gcc cag aag tca atc ccc 1296Gly Ser Asn Arg Ser Gly Asp Leu Arg Asp Ala Gln Lys Ser Ile Pro420 425 430act ggc acc atc ctg gcc atc gcc acc acc tct gct gtc tac atc agc 1344Thr Gly Thr Ile Leu Ala Ile Ala Thr Thr Ser Ala Val Tyr Ile Ser435 440 445tcc gtt gtt ctg ttt ggg gcc tgc att gag ggg gtc gtc ctg cgg gac 1392Ser Val Val Leu Phe Gly Ala Cys lle Glu Gly Val Val Leu Arg Asp450 455 460aag ttt ggc gaa gct gtg aat ggc aac ctc gtg gtg ggc act ctg gcc 1440Lys Phe Gly Glu Ala Val Asn Gly Asn Leu Val Val Gly Thr Leu Ala465 470 475 480
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Gln Leu Leu Val Leu Val Arg Val Asp Gln Asp Gln Asn Val Val His675 680 685ccc cag ctg ctc tca ctg acc tcc cag ctg aag gca ggg aag ggc ctg 2112Pro Gln Leu Leu Ser Leu Thr Ser Gln Leu Lys Ala Gly Lys Gly Leu690 695 700acc atc gtg ggc tct gtc ctt gag ggc acc ttt ctg gaa aat cat cca 2160Thr Ile Val Gly Ser Val Leu Glu Gly Thr Phe Leu Glu Asn His Pro705 710 715 720cag gcc cag cgg gca gaa gag tct atc agg cgc ctg atg gag gca gag 2208Gln Ala Gln Arg Ala Glu Glu Ser Ile Arg Arg Leu Met Glu Ala Glu725 730 735aag gtg aag ggc ttc tgc cag gtg gtg atc tcc tcc aac ttg cgt gat 2256Lys Val Lys Gly Phe Cys Gln ValVal Ile Ser Ser Asn Leu Arg Asp740 745 750ggc gtg tcc cat ctg atc cag tcc ggg ggc ctc ggg ggg ctg cag cac 2304Gly Val Ser His Leu Ile Gln Ser Gly Gly Leu Gly Gly Leu Gln His755 760 765aac act gtg ctt gtt ggc tgg ccc cgc aac tgg cgc cag aag gaa gat 2352Asn Thr Val Leu Val Gly Trp Pro Arg Asn Trp Arg Gln Lys Glu Asp770 775 780cat cag acg tgg agg aac ttc att gag ctg gtc cgg gaa acc aca gct 2400His Gln Thr Trp Arg Asn Phe Ile Glu Leu Val Arg Glu Thr Thr Ala785 790 795 800ggc cac tta gcc ctg ctg gtc acc aag aac gtt tcc atg ttt cct ggg 2448Gly His Leu Ala Leu Leu Val Thr Lys Asn Val Ser Met Phe Pro Gly805 810 815aac cct gag cgc ttc tct gag ggc agc atc gac gtt tgg tgg att gtg 2496Asn Pro Glu Arg Phe Ser Glu Gly Ser Ile Asp Val Trp Trp Ile Val820 825 830cac gat gga ggc atg ctc atg ctg ctg ccc ttc ctg ctg cgg cac cac 2544His Asp Gly Gly Met Leu Met Leu Leu Pro Phe Leu Leu Arg His His835 840 845aag gtc tgg cgg aag tgc aag atg cgt atc ttc act gtg gcc cag atg 2592Lys Val Trp Arg Lys Cys Lys Met Arg Ile Phe Thr Val Ala Gln Met850 855 860gat gac aat agc atc cag atg aag aag gat ctg acc aca ttt ctg tat 2640Asp Asp Asn Ser Ile Gln Met Lys Lys Asp Leu Thr Thr Phe Leu Tyr
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Leu Ile Lys Glu Asn Leu Trp Ser Ser Tyr Leu Thr Lys Gly Val Ile355 360 365Val Glu Arg Ser Gly Met Thr Ser Val Gly Leu Ala Asp Gly Thr Pro370 375 380Ile Asp Met Asp His Pro Tyr Val Phe Ser Asp Met Thr Ser Tyr Phe385 390 395 400Thr Leu Leu Val Gly Ile Tyr Phe Pro Ser Val Thr Gly Ile Met Ala405 410 415Gly Ser Asn Arg Ser Gly Asp Leu Arg Asp Ala Gln Lys Ser Ile Pro420 425 430Thr Gly Thr Ile Leu Ala Ile Ala Thr Thr Ser Ala Val Tyr Ile Ser435 440 445Ser Val Val Leu Phe Gly Ala Cys Ile Glu Gly Val Val Leu Arg Asp450 455 460Lys Phe Gly Glu Ala Val Asn Gly Asn Leu Val Val Gly Thr Leu Ala465 470 475 480Trp Pro Ser Pro Trp Val Ile Val Ile Gly Ser Phe Phe Ser Thr Cys485 490 495Gly Ala Gly Leu Gln Ser Leu Thr Gly Ala Pro Arg Leu Leu Gln Ala500 505 510Ile Ser Arg Asp Gly Ile Val Pro Phe Leu Gln Val Phe Gly His Gly515 520 525Lys Ala Asn Gly Glu Pro Thr Trp Ala Leu Leu Leu Thr Ala Cys Ile530 535 540
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acc tgt gat gag tac ttc acc cga aac aat gtc aca gag atc cag ggc 1120Thr Cys Asp Glu Tyr Phe Thr Arg Asn Asn Val Thr Glu Ile Gln Gly330 335 340 345att cct ggt gct gcc agt ggt ctc atc aaa gag aac ctg tgg agt tct 1168lle Pro Gly Ala Ala Ser Gly Leu Ile Lys Glu Asn Leu Trp Ser Ser350 355 360tac ctg acc aaa ggg gtg att gtc gag agg cgt ggg atg ccc tct gtg 1216Tyr Leu Thr Lys Gly Val Ile Val Glu Arg Arg Gly Met Pro Ser Val365 370 375ggc ctg gca gac ggt acc ccc gta gac atg gac cac ccc tat gtc ttc 1264Gly Leu Ala Asp Gly Thr Pro Val Asp Met Asp His Pro Tyr Val Phe380 385 390agt gat atg acc tcc tac ttc acc ctg ctc gtt ggt atc tac ttc ccc 1312Ser Asp Met Thr Ser Tyr Phe Thr Leu Leu Val Gly Ile Tyr Phe Pro395 400 405tca gtc aca ggg atc atg gct ggc tca aac cga tct gga gac ctg cgg 1360Ser Val Thr Gly Ile Met Ala Gly Ser Asn Arg Ser Gly Asp Leu Arg410 415 420 425gat gcc cag aag tct atc cct act gga act atc ctg gcc att gct acc 1408Asp Ala Gln Lys Ser Ile Pro Thr Gly Thr Ile Leu Ala Ile Ala Thr430 435 440acc tct gct gtc tac atc agc tct gtt gtt ctg ttt gga gcc tgc atc 1456Thr Ser Ala Val Tyr Ile Ser Ser Val Val Leu Phe Gly Ala Cys Ile445 450 455gag ggg gtc gtc tta cgg gac aag ttt ggg gaa gct gtg aat ggc aac 1504Glu Gly Val Val Leu Arg Asp Lys Phe Gly Glu Ala Val Asn Gly Asn460 465 470ttg gtg gtg ggc acc ctg gcc tgg cct tct ccc tgg gtc atc gtc ata 1552Leu Val Val Gly Thr Leu Ala Trp Pro Ser Pro Trp Val Ile Val Ile475 480 485ggc tct ttc ttc tct acc tgt ggg gct gga tta cag agc ctc aca ggg 1600Gly Ser Phe Phe Ser Thr Cys Gly Ala Gly Leu Gln Ser Leu Thr Gly490 495 500 505gcc cca cgt ctg ctg cag gcc atc tcc cgg gat ggc ata gtg ccc ttc 1648Ala Pro Arg Leu Leu Gln Ala Ile Ser Arg Asp Gly Ile Val Pro Phe510 515 520ctg cag gtc ttt ggc cat ggc aaa gct aat gga gag cca acc tgg gcg 1696
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Arg Val Met Leu Val Arg Gly Gly Gly Arg Glu Val Ile Thr Ile1100 1105 1110Tyr Ser1115<210>5<211>5566<212>DNA<213>大鼠(Rattus norvegicus)<220>
<221>CDS<222>(116)..(3466)<400>5ccgctccacg gagagcaagc gacagagctc gagcaagcga gcgagcggcg aaggcgggca60gaggggcgcg ggcgaagagg cgcagccatc ccgagcccgg cgccgcgcag ccacc atg 118Met1ctc aac aac ctg acg gac tgc gag gac ggc gat ggg gga gcc aac ccg 166Leu Asn Asn Leu Thr Asp Cys Glu Asp Gly Asp Gly Gly Ala Asn Pro5 10 15ggt gac ggc aat ccc aag gag agc agc ccc ttc atc aac agc acg gac 214Gly Asp Gly Asn Pro Lys Glu Ser Ser Pro Phe Ile Asn Ser Thr Asp20 25 30acg gag aag ggg aga gag tat gat ggc agg aac atg gcc ctg ttt gag 262Thr Glu Lys Gly Arg Glu Tyr Asp Gly Arg Asn Met Ala Leu Phe Glu35 40 45gag gag atg gac acc agc ccc atg gta tcc tcc ctg ctc agt ggg ctg 310Glu Glu Met Asp Thr Ser Pro Met Val Ser Ser Leu Leu Ser Gly Leu50 55 60 65gcc aac tac acc aac ctg cct cag gga agc aaa gag cac gaa gaa gca 358Ala Asn Tyr Thr Asn Leu Pro Gln Gly Ser Lys Glu His Glu Glu Ala70 75 80gaa aac aat gag ggc gga aag aag aag ccg gtg cag gcc cca cgc atg 406Glu Asn Asn Glu Gly Gly Lys Lys Lys Pro Val Gln Ala Pro Arg Met
85 90 95ggc acc ttc atg ggc gtg tac ctc ccg tgc ctg cag aac atc ttt ggt 454Gly Thr Phe Met Gly Val Tyr Leu Pro Cys Leu Gln Asn Ile Phe Gly100 105 110gtt atc ctc ttt ctg cgg ctc act tgg gtg gtg gga atc gca ggc atc 502Val Ile Leu Phe Leu Arg Leu Thr Trp Val Val Gly Ile Ala Gly Ile115 120 125atg gag tcc ttc tgc atg gtc ttc atc tgc tgc tcc tgc acg atg ctc 550Met Glu Ser Phe Cys Met Val Phe Ile Cys Cys Ser Cys Thr Met Leu130 135 140 145aca gcc att tcc atg agc gca att gca acc aat ggt gtt gtg cct gct 598Thr Ala Ile Ser Met Ser Ala Ile Ala Thr Asn Gly Val Val Pro Ala150 155 160ggt ggc tcc tac tac atg att tcc agg tct ctg ggc ccg gag ttt ggg 646Gly Gly Ser Tyr Tyr Met Ile Ser Arg Ser Leu Gly Pro Glu Phe Gly165 170 175ggc gcc gtg ggc ctc tgc ttc tac ctg ggc act acc ttt gct ggg gct 694Gly Ala Val Gly Leu Cys Phe Tyr Leu Gly Thr Thr Phe Ala Gly Ala180 185 190atg tac atc ctg ggc acc atc gag atc ctg ctg gct tac ctc ttc cca 742Met Tyr Ile Leu Gly Thr Ile Glu Ile Leu Leu Ala Tyr Leu Phe Pro195 200 205gcg atg gcc atc ttc aag gca gaa gat gcc agt ggg gag gca gcc gcc 790Ala Met Ala Ile Phe Lys Ala Glu Asp Ala Ser Gly Glu Ala Ala Ala210 215 220 225atg ttg aat aac atg cgg gtg tat ggc acc tgt gtg ctc acc tgc atg 838Met Leu Asn Asn Met Arg Val Tyr Gly Thr Cys Val Leu Thr Cys Met230 235 240gcc acc gta gtc ttt gtg ggc gtc aag tac gtg aac aag ttt gcc ctg 886Ala Thr Val Val Phe Val Gly Val Lys Tyr Val Asn Lys Phe Ala Leu245 250 255gtc ttc ctg ggt tgc gtg atc ctc tcc atc ctg gcc atc tac gca ggg 934Val Phe Leu Gly Cys Val Ile Leu Ser Ile Leu Ala Ile Tyr Ala Gly260 265 270gtc atc aag tct gcc ttc gat cca ccc aat ttc ccg att tgc ctc ctg 982Val Ile Lys Ser Ala Phe Asp Pro Pro Asn Phe Pro Ile Cys Leu Leu275 280 285
ggg aac cgc acg ctg tct cgc cat ggc ttt gat gtc tgt gcc aag ctg 1030Gly Asn Arg Thr Leu Ser Arg His Gly Phe Asp Val Cys Ala Lys Leu290 295 300 305gct tgg gaa gga aat gag aca gtg acc aca cgg ctc tgg ggc cta ttc 1078Ala Trp Glu Gly Asn Glu Thr Val Thr Thr Arg Leu Trp Gly Leu Phe310 315 320tgt tcc tcc cgc ctc ctc aat gcc acc tgt gat gag tac ttc acc cga 1126Cys Ser Ser Arg Leu Leu Asn Ala Thr Cys Asp Glu Tyr Phe Thr Arg325 330 335aac aat gtc aca gag atc cag ggc att cct ggt gct gca agt ggc ctc 1174Ash Asn Val Thr Glu Ile Gln Gly Ile Pro Gly Ala Ala Ser Gly Leu340 345 350atc aaa gag aac ctg tgg agt tcc tac ctg acc aag ggg gtg atc gtg 1222Ile Lys Glu Asn Leu Trp Ser Ser Tyr Leu Thr Lys Gly Val Ile Val355 360 365gag agg cgt ggg atg ccc tct gtg ggc ctg gca gat ggt acc ccc gtt 1270Glu Arg Arg Gly Met Pro Ser Val Gly Leu Ala Asp Gly Thr Pro Val370 375 380 385gac atg gac cac ccc tat gtc ttc agt gat atg acc tcc tac ttc acc 1318Asp Met Asp His Pro Tyr Val Phe Ser Asp Met Thr Ser Tyr Phe Thr390 395 400ctg ctt gtt ggc atc tat ttc ccc tca gtc aca ggg atc atg gct ggc 1366Leu Leu Val Gly Ile Tyr Phe Pro Ser Val Thr Gly Ile Met Ala Gly405 410 415tcg aac cgg tcc gga gac ctg cgg gat gcc cag aag tct atc cct act 1414Ser Asn Arg Ser Gly Asp Leu Arg Asp Ala Gln Lys Ser Ile Pro Thr420 425 430gga act atc ttg gcc att gct acg acc tct gct gtc tac atc agc tct 1462Gly Thr Ile Leu Ala Ile Ala Thr Thr Ser Ala Val Tyr Ile Ser Ser435 440 445gtt gtt ctg ttc gga gcc tgc atc gaa ggg gtc gtc cta cgg gac aag 1510Val Val Leu Phe Gly Ala Cys Ile Glu Gly Val Val Leu Arg Asp Lys450 455 460 465ttt ggg gaa gct gtg aat ggc aat ctg gtg gtg ggc acc ctg gcc tgg 1558Phe Gly Glu Ala Val Asn Gly Asn Leu Val Val Gly Thr Leu Ala Trp470 475 480
cct tct cct tgg gtc att gtc ata ggc tct ttc ttc tct acc tgc gga 1606Pro Ser Pro Trp Val Ile Val Ile Gly Ser Phe Phe Ser Thr Cys Gly485 490 495gct gga cta cag agc ctc aca ggg gcc cca cgc ctg ctg cag gcc atc 1654Ala Gly Leu Gln Ser Leu Thr Gly Ala Pro Arg Leu Leu Gln Ala Ile500 505 510tcc cgg gat ggc ata gtg ccc ttc ctg cag gtc ttt ggc cat ggc aaa 1702Ser Arg Asp Gly Ile Val Pro Phe Leu Gln Val Phe Gly His Gly Lys515 520 525gcc aac gga gag cca acc tgg gcg ctg ctg ctg act gcc tgc atc tgt 1750Ala Asn Gly Glu Pro Thr Trp Ala Leu Leu Leu Thr Ala Cys Ile Cys530 535 540 545gag atc ggc atc ctc atc gcc tcc ctg gat gag gtc gcc cct atc ctt 1798Glu Ile Gly Ile Leu Ile Ala Ser Leu Asp Glu Val Ala Pro Ile Leu550 555 560tcc atg ttc ttc ctg atg tgt tac atg ttt gtg aac ttg gct tgc gcg 1846Ser Met Phe Phe Leu Met Cys Tyr Met Phe Val Asn Leu Ala Cys Ala565 570 575gtg cag aca ctg ctg agg acg ccc aac tgg agg cca cgc ttc cga tat 1894Val Gln Thr Leu Leu Arg Thr Pro Asn Trp Arg Pro Arg Phe Arg Tyr580 585 590tac cac tgg acc ctc tcc ttc ctg ggc atg agc ctc tgc ctg gcc ctg 1942Tyr His Trp Thr Leu Ser Phe Leu Gly Met Ser Leu Cys Leu Ala Leu595 600 605atg ttc att tgc tcc tgg tat tat gcg ctg gta gct atg ctc atc gct 1990Met Phe Ile Cys Ser Trp Tyr Tyr Ala Leu Val Ala Met Leu Ile Ala610 615 620 625ggc ctc atc tat aag tac atc gag tac cgg ggg gca gag aag gag tgg 2038Gly Leu Ile Tyr Lys Tyr Ile Glu Tyr Arg Gly Ala Glu Lys Glu Trp630 635 640ggg gat ggg atc cga ggc ctg tct ctc agt gca gct cgc tat gct ctc 2086Gly Asp Gly Ile Arg Gly Leu Ser Leu Ser Ala Ala Arg Tyr Ala Leu645 650 655ttg cgt ctg gag gaa gga ccc ccg cat aca aag aac tgg agg ccc cag 2134Leu Arg Leu Glu Glu Gly Pro Pro His Thr Lys Asn Trp Arg Pro Gln660 665 670cta ctg gtg ctg gtg cgt gtg gac cag gac cag aac gtg gtg cac ccg 2182
Leu Leu Val Leu Val Arg Val Asp Gln Asp Gln Asn Val Val His Pro675 680 685cag ctg ctg tcc ttg acc tcc cag ctc aag gca ggg aag ggc ctg acc 2230Gln Leu Leu Ser Leu Thr Ser Gln Leu Lys Ala Gly Lys Gly Leu Thr690 695 700 705att gtg ggc tct gtc ctt gag ggc acc ttt ctg gac aac cac cct cag 2278Ile Val Gly Ser Val Leu Glu Gly Thr Phe Leu Asp Asn His Pro Gln710 715 720gct cag cgg gca gag gag tct atc cgg cgc ctg atg gag gct gag aag 2326Ala Gln Arg Ala Glu Glu Ser Ile Arg Arg Leu Met Glu Ala Glu Lys725 730 735gtg aag ggc ttc tgc cag gta gtg atc tcc tcc aac ctg cgt gac ggt 2374Val Lys Gly Phe Cys Gln Val Val Ile Ser Ser Asn Leu Arg Asp Gly740 745 750gtg tcc cac ctg atc caa tcc ggg ggc ctc ggg ggc ctg caa cac aac 2422Val Ser His Leu Ile Gln Ser Gly Gly Leu Gly Gly Leu Gln His Asn755 760 765act gtg cta gtg ggc tgg cct cgc aac tgg cga cag aag gag gat cat 2470Thr Val Leu Val Gly Trp Pro Arg Asn Trp Arg Gln Lys Glu Asp His770 775 780 785cag aca tgg agg aac ttc atc gaa ctc gtc cgg gaa act aca gct ggc 2518Gln Thr Trp Arg Asn Phe Ile Glu Leu Val Arg Glu Thr Thr Ala Gly790 795 800cac ctc gcc ctg ctg gtc acc aag aat gtt tcc atg ttc ccc ggg aac 2566His Leu Ala Leu Leu Val Thr Lys Asn Val Ser Met Phe Pro Gly Asn805 810 815cct gag cgt ttc tct gag ggc agc att gac gtg tgg tgg atc gtg cac 2614Pro Glu Arg Phe Ser Glu Gly Ser Ile Asp Val Trp Trp Ile Val His820 825 830gac ggg ggc atg ctc atg ctg ttg ccc ttc ctc ctg cgt cac cac aag 2662Asp Gly Gly Met Leu Met Leu Leu Pro Phe Leu Leu Arg His His Lys835 840 845gtc tgg agg aaa tgc aaa atg cgg atc ttc acc gtg gcg cag atg gat 2710Val Trp Arg Lys Cys Lys Met Arg Ile Phe Thr Val Ala Gln Met Asp850 855 860 865gac aac agc att cag atg aag aaa gac ctg acc acg ttt ctg tac cac 2758Asp Asn Ser Ile Gln Met Lys Lys Asp Leu Thr Thr Phe Leu Tyr His
870 875 880tta cga att act gca gag gtg gaa gtc gtg gag atg cac gag agc gac 2806Leu Arg Ile Thr Ala Glu Val Glu Val Val Glu Met His Glu Ser Asp885 890 895atc tca gca tac acc tac gag aag aca ttg gta atg gaa caa cgt tct 2854Ile Ser Ala Tyr Thr Tyr Glu Lys Thr Leu Val Met Glu Gln Arg Ser900 905 910cag atc ctc aaa cag atg cac ctc acc aag aac gag cgg gaa cgg gag 2902Gln Ile Leu Lys Gln Met His Leu Thr Lys Asn Glu Arg Glu Arg Glu915 920 925atc cag agc atc aca gat gaa tct cgg ggc tcc att cgg agg aag aat 2950Ile Gln Ser Ile Thr Asp Glu Ser Arg Gly Ser Ile Arg Arg Lys Asn930 935 940 945cca gcc aac act cgg ctc cgc ctc aat gtt ccc gaa gag aca gct tgt 2998Pro Ala Asn Thr Arg Leu Arg Leu Asn Val Pro Glu Glu Thr Ala Cys950 955 960gac aac gag gag aag cca gaa gag gag gtg cag ctg atc cat gac cag 3046Asp Asn Glu Glu Lys Pro Glu Glu Glu Val Gln Leu Ile His Asp Gln965 970 975agt gct ccc agc tgc cct agc agc tcg ccg tct cca ggg gag gag cct 3094Ser Ala Pro Ser Cys Pro Ser Ser Ser Pro Ser Pro Gly Glu Glu Pro980 985 990gag ggg gag ggg gag aca gac cca gag aag gtg cat ctc acc tgg acc 3142Glu Gly Glu Gly Glu Thr Asp Pro Glu Lys Val His Leu Thr Trp Thr995 1000 1005aag gat aag tca gcg gct cag aag aac aaa ggc ccc agt ccc gtc 3187Lys Asp Lys Ser Ala Ala Gln Lys Asn Lys Gly Pro Ser Pro Val1010 1015 1020tcc tcg gag ggg atc aag gac ttc ttc agc atg aag ccg gag tgg 3232Ser Ser Glu Gly Ile Lys Asp Phe Phe Ser Met Lys Pro Glu Trp1025 1030 1035gaa aac ttg aac cag tcc aac gtg cgg cgc atg cac aca gct gtg 3277Glu Asn Leu Asn Gln Ser Asn Val Arg Arg Met His Thr Ala Val1040 1045 1050cgg ctg aac gag gtc atc gtg aat aaa tcc cgg gat gcc aag ttg 3322Arg Leu Asn Glu Val Ile Val Asn Lys Ser Arg Asp Ala Lys Leu1055 1060 1065
gtg ttg ctc aac atg ccc ggg cct ccc cgc aac cgc aat gga gat 3367Val Leu Leu Asn Met Pro Gly Pro Pro Arg Asn Arg Asn Gly Asp1070 1075 1080gaa aac tac atg gaa ttc ctg gag gtc ctc act gag caa ctg gac 3412Glu Asn Tyr Met Glu Phe Leu Glu Val Leu Thr Glu Gln Leu Asp1085 1090 1095cgg gtg atg ctg gtc cgc ggt ggt ggc cga gag gtc atc acc atc 3457Arg Val Met Leu Val Arg Gly Gly Gly Arg Glu Val Ile Thr Ile1100 1105 1110tac tcc tga aggccaggac ctgccactcc ggcccgagcg agcccggccc3506Tyr Ser1115gcggccccgg agccctcgcc gcgcctcccc gccgctgtca ccgtttacat aagaccccgt 3566tgcccgtgcc ctggccctct tccctcccgc tgcctgcggc ccggaggcct tgcccgtcgg 3626ggctgacccg gagggcggcc cgtgggcccc ttttctgagc ccggcctcgc cctgccggag 3686tagacgttgc aataaaggtg gcgaggcggc gtggagagga gcggaaccgt ggtcccgggc 3746cggggagccc cgagcccgtc cctccccacg ccccgccgcg ctccccccgg accctggtcg 3806ctgagcccgg gcgccgctcg gctgcgctat acatagtgta caggagacat cgagtgtatt 3866tttaatgtcc ccatatttct gtaaactaga aacgcaacgg actcctcgcc acggccgcgc 3926tctccccgct gcgggcgccc aggaaggcgg agacccggga agccagggtt ccctgcgctc 3986ccgagctgag agccaagtgc tttaaggccg gcgctctcct ttccctttcc tgtccacggc 4046ccgggcttcc ctctcttccc tccagttctt ggcgaacaca ggtgaagccc tgcccggtgc 4106cttcgtggag gagcaggcgt ctctcctctg ttggcttgcc gcctgctccc cctgtcccgt 4166ggctcctcgc caaagactga atttgtggag ctggagggca caccctcccc actttccttc 4226ctgggacagg tgaggggcca atgccagtct aggggccgac tcacaggagg cctcgcgcag 4286cctcttggtc cccactctgc aagtcctgcc tggggaccca gcccccctgg tggttctggg 4346gcggagcttt gctgcctagc agcaagtcct tagttactgt ctccagatac caggacctgg 4406agtagggaat ggagtcatat gggttcagtt gttcctggcg cttctctgcc ccctgctccc 4466
cctctccccc tctcgtagga cacaaggact ttggctttct taactcatcc ttggcgcttc 4526cgctccacca cgcccacctg tggggaggag ccctcagccc tagagaggcg tttggctggt 4586tcccttcccc cagggcacgt tactaagagg acaggcactg catgctcctt taagcgccct 4646ctgggactgg gtacagtgcc tccagcccca gggccctggt ctgcgcacct agttagacat 4706cattgcccac tccagggcca gggccactag ctgacctcac cacctttttc cttgagccca 4766aggcagagag agctgcagct ggtgccatct agacaggctc aagtgtggcc agtggcaggg 4826ctcgagggcc actgccctgt tgcttggctc aggacctctc tgagatttga tggggactgg 4886atattcttcc aggtagtagc catcaagtcg gaagtgttgg acccaggacc tgacattcct 4946tcaagactgc cctcccttgc tgtggttttg ccttttgggg caagagaggg gctgggcaaa 5006cggggaggag gcagtatcaa caccgattag ggaaccaaag ttgcactacc tgggcccagc 5066ctctggttgg caagagcaaa gtttctgttg atgaaaacaa acagcccaca acaacacccc 5126cccccccgtt ttctgtgctc catgtgcaat atttgttatg aaccttgtgt cgttcaagtc 5186acctttataa tcactgtagc tagatgttcc atgtccatcc aggtgacttt actctgagtg 5246caatatttca atagcctggt agtgagaaga gtgttgcttt tgtttcagcc gacctatgtg 5306cagggcaatg caatgcagtc caaaaccctt gtaaatagga gaggttgcaa gccaaatcaa 5366gagtatttat cgttattact attattatta ggcctgcctt taattttagt gtttcggtat 5426ttcgcatcct gcctcggtat tgatcgtgtg ttctctgtgc caatatgcaa aggagaggat 5486cagttctttc ctttactgtt gaatgctccc atttactgct ttaaggcttt tactgtgttc 5546attttttaga tacctgtctg 5566<210>6<211>1116<212>PRT<213>大鼠<400>6Met Leu Asn Asn Leu Thr Asp Cys Glu Asp Gly Asp Gly Gly Ala Asn1 5 10 15
Pro Gly Asp Gly Asn Pro Lys Glu Ser Ser Pro Phe Ile Asn Ser Thr20 25 30Asp Thr Glu Lys Gly Arg Glu Tyr Asp Gly Arg Asn Met Ala Leu Phe35 40 45Glu Glu Glu Met Asp Thr Ser Pro Met Val Ser Ser Leu Leu Ser Gly50 55 60Leu Ala Asn Tyr Thr Asn Leu Pro Gln Gly Ser Lys Glu His Glu Glu65 70 75 80Ala Glu Asn Asn Glu Gly Gly Lys Lys Lys Pro Val Gln Ala Pro Arg85 90 95Met Gly Thr Phe Met Gly Val Tyr Leu Pro Cys Leu Gln Asn Ile Phe100 105 110Gly Val Ile Leu Phe Leu Arg Leu Thr Trp Val Val Gly Ile Ala Gly115 120 125Ile Met Glu Ser Phe Cys Met Val Phe Ile Cys Cys Ser Cys Thr Met130 135 140Leu Thr Ala Ile Ser Met Ser Ala Ile Ala Thr Asn Gly Val Val Pro145 150 155 160Ala Gly Gly Ser Tyr Tyr Met Ile Ser Arg Ser Leu Gly Pro Glu Phe165 170 175Gly Gly Ala Val Gly Leu Cys Phe Tyr Leu Gly Thr Thr Phe Ala Gly180 185 190Ala Met Tyr Ile Leu Gly Thr Ile Glu Ile Leu Leu Ala Tyr Leu Phe195 200 205
Pro Ala Met Ala Ile Phe Lys Ala Glu Asp Ala Ser Gly Glu Ala Ala210 215 220Ala Met Leu Asn Asn Met Arg Val Tyr Gly Thr Cys Val Leu Thr Cys225 230 235 240Met Ala Thr Val Val Phe Val Gly Val Lys Tyr Val Asn Lys Phe Ala245 250 255Leu Val Phe Leu Gly Cys Val Ile Leu Ser Ile Leu Ala Ile Tyr Ala260 265 270Gly Val Ile Lys Ser Ala Phe Asp Pro Pro Asn Phe Pro Ile Cys Leu275 280 285Leu Gly Asn Arg Thr Leu Ser Arg His Gly Phe Asp Val Cys Ala Lys290 295 300Leu Ala Trp Glu Gly Asn Glu Thr Val Thr Thr Arg Leu Trp Gly Leu305 310 315 320Phe Cys Ser Ser Arg Leu Leu Asn Ala Thr Cys Asp Glu Tyr Phe Thr325 330 335Arg Asn Asn Val Thr Glu Ile Gln Gly Ile Pro Gly Ala Ala Ser Gly340 345 350Leu Ile Lys Glu Asn Leu Trp Ser Ser Tyr Leu Thr Lys Gly Val Ile355 360 365Val Glu Arg Arg Gly Met Pro Ser Val Gly Leu Ala Asp Gly Thr Pro370 375 380Val Asp Met Asp His Pro Tyr Val Phe Ser Asp Met Thr Ser Tyr Phe385 390 395 400Thr Leu Leu Val Gly Ile Tyr Phe Pro Ser Val Thr Gly Ile Met Ala
405 410 415Gly Ser Asn Arg Ser Gly Asp Leu Arg Asp Ala Gln Lys Ser Ile Pro420 425 430Thr Gly Thr Ile Leu Ala Ile Ala Thr Thr Ser Ala Val Tyr Ile Ser435 440 445Ser Val Val Leu Phe Gly Ala Cys Ile Glu Gly Val Val Leu Arg Asp450 455 460Lys Phe Gly Glu Ala Val Asn Gly Asn Leu Val Val Gly Thr Leu Ala465 470 475 480Trp Pro Ser Pro Trp Val Ile Val Ile Gly Ser Phe Phe Ser Thr Cys485 490 495Gly Ala Gly Leu Gln Ser Leu Thr Gly Ala Pro Arg Leu Leu Gln Ala500 505 510Ile Ser Arg Asp Gly Ile Val Pro Phe Leu Gln Val Phe Gly His Gly515 520 525Lys Ala Asn Gly Glu Pro Thr Trp Ala Leu Leu Leu Thr Ala Cys Ile530 535 540Cys Glu Ile Gly Ile Leu Ile Ala Ser Leu Asp Glu Val Ala Pro Ile545 550 555 560Leu Ser Met Phe Phe Leu Met Cys Tyr Met Phe Val Asn Leu Ala Cys565 570 575Ala Val Gln Thr Leu Leu Arg Thr Pro Asn Trp Arg Pro Arg Phe Arg580 585 590Tyr Tyr His Trp Thr Leu Ser Phe Leu Gly Met Ser Leu Cys Leu Ala595 600 605
Leu Met Phe Ile Cys Ser Trp Tyr Tyr Ala Leu Val Ala Met Leu Ile610 615 620Ala Gly Leu Ile Tyr Lys Tyr Ile Glu Tyr Arg Gly Ala Glu Lys Glu625 630 635 640Trp Gly Asp Gly Ile Arg Gly Leu Ser Leu Ser Ala Ala Arg Tyr Ala645 650 655Leu Leu Arg Leu Glu Glu Gly Pro Pro His Thr Lys Asn Trp Arg Pro660 665 670Gln Leu Leu Val Leu Val Arg Val Asp Gln Asp Gln Asn Val Val His675 680 685Pro Gln Leu Leu Ser Leu Thr Ser Gln Leu Lys Ala Gly Lys Gly Leu690 695 700Thr Ile Val Gly Ser Val Leu Glu Gly Thr Phe Leu Asp Asn His Pro705 710 715 720Gln Ala Gln Arg Ala Glu Glu Ser Ile Arg Arg Leu Met Glu Ala Glu725 730 735Lys Val Lys Gly Phe Cys Gln Val Val Ile Ser Ser Asn Leu Arg Asp740 745 750Gly Val Ser His Leu Ile Gln Ser Gly Gly Leu Gly Gly Leu Gln His755 760 765Asn Thr Val Leu Val Gly Trp Pro Arg Asn Trp Arg Gln Lys Glu Asp770 775 780His Gln Thr Trp Arg Asn Phe Ile Glu Leu Val Arg Glu Thr Thr Ala785 790 795 800
Gly His Leu Ala Leu Leu Val Thr Lys Asn Val Ser Met Phe Pro Gly805 810 815Asn Pro Glu Arg Phe Ser Glu Gly Ser Ile Asp Val Trp Trp Ile Val820 825 830His Asp Gly Gly Met Leu Met Leu Leu Pro Phe Leu Leu Arg His His835 840 845Lys Val Trp Arg Lys Cys Lys Met Arg Ile Phe Thr Val Ala Gln Met850 855 860Asp Asp Asn Ser Ile Gln Met Lys Lys Asp Leu Thr Thr Phe Leu Tyr865 870 875 880His Leu Arg Ile Thr Ala Glu Val Glu Val Val Glu Met His Glu Ser885 890 895Asp Ile Ser Ala Tyr Thr Tyr Glu Lys Thr Leu Val Met Glu Gln Arg900 905 910Ser Gln Ile Leu Lys Gln Met His Leu Thr Lys Asn Glu Arg Glu Arg915 920 925Glu Ile Gln Ser Ile Thr Asp Glu Ser Arg Gly Ser Ile Arg Arg Lys930 935 940Asn Pro Ala Asn Thr Arg Leu Arg Leu Asn Val Pro Glu Glu Thr Ala945 950 955 960Cys Asp Asn Glu Glu Lys Pro Glu Glu Glu Val Gln Leu Ile His Asp965 970 975Gln Ser Ala Pro Ser Cys Pro Ser Ser Ser Pro Ser Pro Gly Glu Glu980 985 990
Pro Glu Gly Glu Gly Glu Thr Asp Pro Glu Lys Val His Leu Thr Trp995 1000 1005Thr Lys Asp Lys Ser Ala Ala Gln Lys Asn Lys Gly Pro Ser Pro1010 1015 1020Val Ser Ser Glu Gly Ile Lys Asp Phe Phe Ser Met Lys Pro Glu1025 1030 1035Trp Glu Asn Leu Asn Gln Ser Asn Val Arg Arg Met His Thr Ala1040 1045 1050Val Arg Leu Asn Glu Val Ile Val Asn Lys Ser Arg Asp Ala Lys1055 1060 1065Leu Val Leu Leu Asn Met Pro Gly Pro Pro Arg Asn Arg Asn Gly1070 1075 1080Asp Glu Asn Tyr Met Glu Phe Leu Glu Val Leu Thr Glu Gln Leu1085 1090 1095Asp Arg Val Met Leu Val Arg Gly Gly Gly Arg Glu Val Ile Thr1100 1105 1110Ile Tyr Ser1115<210>7<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸<400>7tctccttggg attgccgtca 20<210>8
<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸<400>8tcttcttgag actgcagtca 20
權(quán)利要求
1.治療或預(yù)防受試者中疼痛的方法，所述方法包括降低所述受試者中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)神經(jīng)細(xì)胞中的細(xì)胞內(nèi)氯化物水平。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述方法包括調(diào)節(jié)所述CNS細(xì)胞中氯化物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的活性或表達(dá)，從而降低所述氯化物水平。
3.權(quán)利要求2的方法，其中所述氯化物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是KCC2。
4.權(quán)利要求3的方法，所述方法還包括增加所述KCC2的活性或表達(dá)。
5.權(quán)利要求1的方法，其中所述CNS神經(jīng)細(xì)胞是脊髓神經(jīng)細(xì)胞。
6.權(quán)利要求1的方法，其中所述疼痛信號(hào)發(fā)源于外周神經(jīng)系統(tǒng)(PNS)細(xì)胞或所述CNS神經(jīng)細(xì)胞跨突觸的感覺(jué)纖維。
7.權(quán)利要求1的方法，其中所述疼痛是神經(jīng)性疼痛。
8.權(quán)利要求7的方法，其中所述神經(jīng)性疼痛與神經(jīng)或神經(jīng)束損傷有關(guān)。
9.權(quán)利要求7的方法，其中所述神經(jīng)性疼痛選自軀體疼痛和內(nèi)臟疼痛。
10.權(quán)利要求1的方法，其中所述疼痛選自慢性炎癥疼痛、與關(guān)節(jié)炎相關(guān)的疼痛、纖維肌痛、背痛、癌癥相關(guān)疼痛、消化系統(tǒng)疾病相關(guān)疼痛、克羅恩氏病相關(guān)疼痛、自身免疫病相關(guān)疼痛、內(nèi)分泌病相關(guān)疼痛、糖尿病性神經(jīng)病相關(guān)疼痛、幻肢疼痛、自發(fā)性疼痛、慢性術(shù)后疼痛、慢性顳下頜疼痛、灼痛、皰疹后神經(jīng)痛、艾滋病相關(guān)疼痛、I型和II型復(fù)合性區(qū)域疼痛綜合癥、三叉神經(jīng)痛、慢性背痛、與脊髓損傷相關(guān)的疼痛以及周期性急性痛。
11.權(quán)利要求1的方法，其中所述方法包括對(duì)所述受試者施用能降低所述CNS細(xì)胞中所述細(xì)胞內(nèi)氯化物水平的化合物。
12.權(quán)利要求11的方法，其中所述化合物能調(diào)節(jié)所述CNS細(xì)胞中氯化物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的活性或表達(dá)。
13.權(quán)利要求12的方法，其中所述氯化物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是KCC2。
14.權(quán)利要求13的方法，其中所述化合物能增加所述KCC2的活性或表達(dá)。
15.權(quán)利要求14的方法，其中所述化合物是TrkB的抑制劑。
16.權(quán)利要求15的方法，其中所述抑制劑選自K-252a和抗-TrkB抗體。
17.權(quán)利要求13的方法，其中所述化合物是依賴cAMP的激酶(PKA)的抑制劑。
18.權(quán)利要求17的方法，其中所述抑制劑是H-89。
19.權(quán)利要求13的方法，其中所述化合物是鈣調(diào)蛋白依賴性激酶(CAM激酶)的抑制劑。
20.權(quán)利要求19的方法，其中所述抑制劑是KN-93。
21.權(quán)利要求3的方法，其中所述KCC2包含與選自SEQ ID NO2、4、6及其片段的序列基本上相同的氨基酸序列。
22.用于治療或預(yù)防受試者中疼痛的組合物，所述組合物包含(a)能降低CNS神經(jīng)細(xì)胞中細(xì)胞內(nèi)氯化物水平的化合物；和(b)藥學(xué)可接受的載體。
23.權(quán)利要求22的組合物，其中所述化合物能調(diào)節(jié)所述CNS神經(jīng)細(xì)胞中氯化物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的活性或表達(dá)。
24.權(quán)利要求23的組合物，其中所述氯化物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是KCC2。
25.權(quán)利要求24的組合物，其中所述化合物能增加所述KCC2的活性或表達(dá)。
26.商業(yè)包裝，其包含權(quán)利要求22的組合物以及其用于治療或預(yù)防疼痛的說(shuō)明書(shū)。
27.商業(yè)包裝，其包含能降低CNS神經(jīng)細(xì)胞中細(xì)胞內(nèi)氯化物水平的化合物以及其用于治療或預(yù)防疼痛的說(shuō)明書(shū)。
28.權(quán)利要求27的商業(yè)包裝，其中所述化合物能調(diào)節(jié)所述CNS神經(jīng)細(xì)胞中氯化物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的活性或表達(dá)。
29.權(quán)利要求28的商業(yè)包裝，其中所述氯化物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是KCC2。
30.權(quán)利要求29的商業(yè)包裝，其中所述化合物能增加所述KCC2活性或表達(dá)。
31.權(quán)利要求22的組合物的用途，用于治療或預(yù)防疼痛。
32.權(quán)利要求22的組合物的用途，用于制備治療或預(yù)防疼痛的藥物。
33.能降低CNS神經(jīng)細(xì)胞中細(xì)胞內(nèi)氯化物水平的化合物的用途，用于治療或預(yù)防疼痛。
34.能降低CNS神經(jīng)細(xì)胞中細(xì)胞內(nèi)氯化物水平的化合物的用途，用于制備治療或預(yù)防疼痛的藥物。
35.權(quán)利要求33的用途，其中所述化合物能調(diào)節(jié)所述CNS細(xì)胞中氯化物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的活性或表達(dá)。
36.權(quán)利要求35的用途，其中所述氯化物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是KCC2。
37.權(quán)利要求36的用途，其中所述化合物能增加所述KCC2活性或表達(dá)。
38.權(quán)利要求37的用途，其中所述化合物是TrkB的抑制劑。
39.權(quán)利要求38的用途，其中所述抑制劑選自K-252a和抗-TrkB抗體。
40.權(quán)利要求37的用途，其中所述化合物是依賴cAMP的激酶(PKA)的抑制劑。
41.權(quán)利要求40的用途，其中所述抑制劑是H-89。
42.權(quán)利要求37的用途，其中所述化合物是鈣調(diào)蛋白依賴性激酶的抑制劑。
43.權(quán)利要求42的用途，其中所述抑制劑是KN-93。
44.鑒定或表征用于治療或預(yù)防疼痛的化合物的方法，所述方法包括(a)將受試化合物接觸CNS來(lái)源的細(xì)胞；和(b)測(cè)定在所述受試化合物存在下所述細(xì)胞內(nèi)氯化物水平是否降低；其中所述降低表明所述受試化合物可用于治療或預(yù)防疼痛。
45.鑒定或表征用于治療或預(yù)防疼痛的化合物的方法，所述方法包括(c)將受試化合物接觸表達(dá)氯化物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的CNS來(lái)源的細(xì)胞；和(d)測(cè)定在所述受試化合物存在下所述氯化物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的活性或表達(dá)是否以使得細(xì)胞內(nèi)氯化物水平降低的方式受到調(diào)節(jié)；其中所述調(diào)節(jié)表明所述受試化合物可用于治療或預(yù)防疼痛。
46.權(quán)利要求45的方法，其中所述氯化物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是KCC2。
47.權(quán)利要求46的方法，其中所述方法包含確定在受試化合物存在下所述KCC2表達(dá)或活性是否增加和所述調(diào)節(jié)是否為增加。
48.權(quán)利要求47的方法，其中通過(guò)測(cè)量選自鉀轉(zhuǎn)運(yùn)、氯化物轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞內(nèi)氯化物水平和陰離子逆轉(zhuǎn)電位的參數(shù)確定所述KCC2活性。
49.權(quán)利要求44的方法，其中所述疼痛選自慢性炎癥疼痛、與關(guān)節(jié)炎相關(guān)的疼痛、纖維肌痛、背痛、癌癥相關(guān)疼痛、消化系統(tǒng)疾病相關(guān)疼痛、克羅恩氏病相關(guān)疼痛、自身免疫病相關(guān)疼痛、內(nèi)分泌病相關(guān)疼痛、糖尿病性神經(jīng)病相關(guān)疼痛、幻肢疼痛、自發(fā)性疼痛、慢性術(shù)后疼痛、慢性顳下頜疼痛、灼痛、皰疹后神經(jīng)痛、艾滋病相關(guān)疼痛、I型和II型復(fù)合性區(qū)域疼痛綜合癥、三叉神經(jīng)痛、慢性背痛、與脊髓損傷相關(guān)的疼痛以及周期性急性痛。
50.鑒定或表征用于治療或預(yù)防疼痛的化合物的方法，所述方法包括(a)將受試化合物接觸包含第一種核酸的CNS來(lái)源的細(xì)胞，所述第一種核酸包含通常與氯化物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因結(jié)合的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件，所述氯化物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因有效連接包含能編碼報(bào)道蛋白的報(bào)道基因的第二種核酸；和(b)在所述受試化合物存在下測(cè)定報(bào)道基因表達(dá)或報(bào)道蛋白活性是否被調(diào)節(jié)；其中報(bào)道基因表達(dá)或報(bào)道蛋白活性的所述調(diào)節(jié)表明所述受試化合物可用于治療或預(yù)防疼痛。
51.權(quán)利要求50的方法，其中所述氯化物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是KCC2。
52.權(quán)利要求51的方法，其中在所述受試化合物存在下所述報(bào)道基因表達(dá)或報(bào)道蛋白活性增加。
53.減輕受試者中傷害感受的方法，所述方法包括減少所述受試者中細(xì)胞內(nèi)氯化物。
54.權(quán)利要求53的方法，其中所述方法包含調(diào)節(jié)所述CNS神經(jīng)細(xì)胞中氯化物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性或表達(dá)。
55.權(quán)利要求54的方法，其中所述氯化物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是KCC2。
56.權(quán)利要求55的方法，所述方法還包括增加所述KCC2活性或表達(dá)。
57.權(quán)利要求55的方法，其中所述方法還包括將所述CNS神經(jīng)細(xì)胞接觸能增加KCC2活性或表達(dá)的化合物。
58.權(quán)利要求57的方法，其中所述化合物是TrkB的抑制劑。
59.權(quán)利要求58的方法，其中所述抑制劑選自K-252a和抗-TrkB抗體。
60.權(quán)利要求57的方法，其中所述化合物是依賴cAMP的激酶(PKA)的抑制劑。
61.權(quán)利要求60的方法，其中所述抑制劑是H-89。
62.權(quán)利要求57的方法，其中所述化合物是鈣調(diào)蛋白依賴性激酶的抑制劑。
63.權(quán)利要求62的方法，其中所述抑制劑是KN-93。
64.權(quán)利要求55的方法，其中所述KCC2包含與選自SEQ ID NO2、4、6及其片段的序列基本上相同的氨基酸序列。
65.診斷或預(yù)測(cè)經(jīng)受疼痛的受試者中與CNS功能異常相關(guān)的疼痛的方法，所述方法包括確定相對(duì)于相應(yīng)的對(duì)照氯化物水平，受試CNS細(xì)胞內(nèi)氯化物水平是否提高；其中所述提高表明該受試者正經(jīng)受與CNS功能異常相關(guān)的疼痛。
66.權(quán)利要求65的方法，所述方法還包括確定相對(duì)于對(duì)照轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性或表達(dá)，CNS氯化物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性或表達(dá)是否受到調(diào)節(jié)。
67.權(quán)利要求66的方法，其中所述氯化物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是KCC2。
68.權(quán)利要求67的方法，所述方法還包括確定相對(duì)于所述對(duì)照活性或表達(dá)，所述KCC2活性或表達(dá)是否降低。
69.權(quán)利要求65的方法，其中所述對(duì)照細(xì)胞內(nèi)氯化物水平選自(a)已建立的標(biāo)準(zhǔn)；(b)較早時(shí)候在所述受試者中測(cè)定的相應(yīng)細(xì)胞內(nèi)氯化物水平；(c)當(dāng)所述受試者所經(jīng)受的疼痛較輕或基本上無(wú)疼痛時(shí)測(cè)定的所述受試者中相應(yīng)細(xì)胞內(nèi)氯化物水平；和(d)在經(jīng)受疼痛較輕或基本上無(wú)疼痛的對(duì)照受試者中測(cè)定的相應(yīng)細(xì)胞內(nèi)氯化物水平。
70.權(quán)利要求68的方法，其中所述對(duì)照活性或表達(dá)選自(a)KCC2活性或表達(dá)的已建立的標(biāo)準(zhǔn)；(b)較早時(shí)候在所述受試者中測(cè)定的KCC2活性或表達(dá)的相應(yīng)水平；(c)當(dāng)所述受試者所經(jīng)受的疼痛較輕或基本上無(wú)疼痛時(shí)測(cè)定的所述受試者中KCC2活性或表達(dá)的相應(yīng)水平；和(d)在經(jīng)受疼痛較輕或基本上無(wú)疼痛的對(duì)照受試者中測(cè)定的KCC2活性或表達(dá)的相應(yīng)水平。
71.權(quán)利要求67的方法，其中通過(guò)測(cè)量選自鉀轉(zhuǎn)運(yùn)、氯化物轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞內(nèi)氯化物水平和陰離子逆轉(zhuǎn)電位的參數(shù)確定所述KCC2活性。
72.權(quán)利要求65的方法，其中通過(guò)(a)對(duì)所述受試者施用指示細(xì)胞內(nèi)氯化物水平的指示劑化合物從而該化合物接觸所述受試者的CNS神經(jīng)細(xì)胞；(b)評(píng)估與所述指示劑化合物相關(guān)的體內(nèi)信號(hào)；來(lái)測(cè)定所述細(xì)胞內(nèi)氯化物水平。
73.權(quán)利要求65的方法，其中所述與CNS功能異常相關(guān)的疼痛是神經(jīng)性疼痛。
74.權(quán)利要求73的方法，其中所述指示劑化合物是放射性核素。
75.權(quán)利要求75的方法，其中放射性核素選自201Tl、99Tcm-tetrofosmin、99Tcm-MIBI、99Tcm-HMPAO和36Cl。
76.權(quán)利要求73的方法，其中通過(guò)成像技術(shù)評(píng)估所述體內(nèi)信號(hào)。
77.權(quán)利要求72的方法，其中所述體內(nèi)信號(hào)是所述指示劑化合物的滯留指數(shù)。
78.權(quán)利要求76的方法，其中所述成像技術(shù)選自單光子發(fā)射計(jì)算機(jī)層析X射線照相術(shù)、正電子發(fā)射層析X射線照相術(shù)和磁共振成像。
79.權(quán)利要求73的方法，其中所述指示劑化合物指示KCC2表達(dá)。
80.權(quán)利要求79的方法，其中所述指示劑化合物是針對(duì)KCC2的抗體。
81.治療受試者中與CNS功能異常相關(guān)的疼痛的方法，所述方法包括(a)根據(jù)權(quán)利要求65的方法，診斷或預(yù)測(cè)所述受試者中與CNS功能異常相關(guān)的疼痛；(b)降低所述受試者的CNS細(xì)胞中細(xì)胞內(nèi)氯化物水平。
全文摘要
描述了用于減弱或治療疼痛和減輕傷害感受的方法和產(chǎn)品。所述方法和產(chǎn)品是以CNS細(xì)胞內(nèi)氯化物水平的調(diào)節(jié)為基礎(chǔ)的。所述方法和產(chǎn)品還涉及諸如KCC2氯化鉀協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白等氯化物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的活性和/或表達(dá)的調(diào)節(jié)。本文還描述了以所述調(diào)節(jié)為基礎(chǔ)的商業(yè)包裝及其用途。本文還描述了用于鑒定或表征治療疼痛的化合物、減輕傷害感受以及診斷和預(yù)測(cè)疼痛的有關(guān)方法。
文檔編號(hào)A61K31/00GK1805769SQ200480016630
公開(kāi)日2006年7月19日 申請(qǐng)日期2004年5月14日 優(yōu)先權(quán)日2003年5月16日
發(fā)明者Y·德科寧克, P·德科寧克, J·A·M·庫(kù)爾 申請(qǐng)人:拉瓦勒大學(xué)