專利名稱：用于治療中風(fēng)的非神經(jīng)毒性纖溶酶原激活劑的靜脈注射的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及非神經(jīng)毒性纖溶酶原激活劑在靜脈內(nèi)的應(yīng)用，尤其是用于治療人類中風(fēng)的經(jīng)遺傳學(xué)修飾的纖溶酶原激活劑和源自Desmodus rotundus唾液的纖溶酶原激活劑(DSPA)。由國際專利申請(qǐng)PCT/EP02/12204已知運(yùn)用這些纖溶酶原激活劑治療中風(fēng)，該專利公開的內(nèi)容全文引入作為參考。
中風(fēng)的臨床特征和生物化學(xué)將臨床癥狀相關(guān)的不同臨床現(xiàn)象概括為術(shù)語“中風(fēng)”。根據(jù)各自的發(fā)病機(jī)理，這些臨床現(xiàn)象可能首先區(qū)分為所謂的缺血性和出血性損傷。
缺血性損傷(缺血)的特征是，因動(dòng)脈血供應(yīng)匱乏而導(dǎo)致腦中血液循環(huán)的減少或中斷。這常常是由動(dòng)脈硬化而變窄的血管的血栓引起，或由動(dòng)脈栓塞或心栓塞引起的。
出血性損傷歸因于主要由動(dòng)脈壓過高而損傷形成腦供應(yīng)動(dòng)脈的穿孔。然而，在所有腦損傷中僅有大約20％是由出血性損傷引起的。因此，由血栓形成引起的中風(fēng)更為相關(guān)。
與其他組織缺血相比，神經(jīng)組織缺血普遍伴隨著受影響細(xì)胞的壞死。神經(jīng)組織中提高的壞死發(fā)生率可以用對(duì)“興奮性毒性”現(xiàn)象的新理解來解釋，該現(xiàn)象是一種包括眾多反應(yīng)步驟的復(fù)雜級(jí)聯(lián)反應(yīng)。該級(jí)聯(lián)反應(yīng)由缺氧的缺血神經(jīng)元迅速丟失ATP并去極化引發(fā)。它導(dǎo)致突觸后釋放神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸的增加，該神經(jīng)遞質(zhì)激活調(diào)控陽離子通道的膜結(jié)合谷氨酸受體。然而，由于該谷氨酸釋放的增加使得谷氨酸受體被過度激活。
谷氨酸受體調(diào)控由谷氨酸與受體的結(jié)合而開啟的電壓依賴型陽離子通道。它導(dǎo)致Na+和Ca2+大量流入細(xì)胞從而干擾Ca2+依賴型物質(zhì)細(xì)胞代謝(包括能量代謝)。Ca2+依賴型分解代謝酶的激活尤其可以解釋隨后發(fā)生的細(xì)胞死亡(Lee，Jin-Mo等，″The changing landscape of ischemic brain injury mechanisms″；Dennis W.Zhol″Glutamat neurotoxicity and diseases of the nervoussystem″)。
盡管谷氨酸介導(dǎo)的神經(jīng)毒性機(jī)制還未被完全了解，但是人們都同意其在很大程度上促成了腦缺血后的神經(jīng)細(xì)胞的死亡(Jin-Mo Lee，等)。
中風(fēng)的治療除保證重要機(jī)能的安全和穩(wěn)定生理參數(shù)外，在急性腦缺血的治療中，首先要重新疏通封閉的血管。該目的通過不同的方法進(jìn)行。單純的機(jī)械重新疏通方法，例如心肌梗塞情況下的PTCA術(shù)，迄今為止仍未獲得令人滿意的效果。只有成功的纖維蛋白溶解作用才能使病人的狀況得到令人滿意的改善。
自身的纖維蛋白溶解作用是以絲氨酸蛋白酶纖溶酶的蛋白水解活性為基礎(chǔ)的，該酶由其未激活的前體纖溶酶原經(jīng)催化(激活)形成。纖溶酶原的天然激活是通過自身的纖溶酶原激活劑u-PA(尿激酶型纖溶酶原激活劑)和t-PA(組織纖溶酶原激活劑)進(jìn)行的。與u-PA相反，t-PA與纖維蛋白和纖溶酶原一起形成一個(gè)所謂的激活劑復(fù)合體。因此，t-PA的催化活性是纖維蛋白依賴的，并且在纖維蛋白存在下增強(qiáng)約550倍。除纖維蛋白外，纖維蛋白原也能刺激由t-PA介導(dǎo)的纖溶酶原向纖溶酶轉(zhuǎn)變的催化作用-即使在很小的范圍內(nèi)。在纖維蛋白原存在下，t-PA活性僅增強(qiáng)25倍。纖維蛋白的切割產(chǎn)物(纖維蛋白降解產(chǎn)物(FDP))也能刺激t-PA活性。
已知的治療學(xué)途徑a)鏈激酶對(duì)急性中風(fēng)進(jìn)行血栓溶解治療的早期嘗試可以追溯至二十世紀(jì)五十年代。用鏈激酶，一種源自β溶血性鏈球菌的纖維蛋白溶解劑，進(jìn)行的首次廣泛臨床試驗(yàn)于1995年才開始。鏈激酶與纖溶酶原形成能將其他纖溶酶原分子轉(zhuǎn)變?yōu)槔w溶酶的復(fù)合體。
由于鏈激酶是一種細(xì)菌蛋白酶從而能在機(jī)體中激發(fā)變態(tài)反應(yīng)，因此采用鏈激酶的療法存在嚴(yán)重缺陷。在之前具有相應(yīng)抗體產(chǎn)生的鏈球菌感染的情況下也可能出現(xiàn)所謂的鏈激酶抗性從而使得該療法更難進(jìn)行。除此之外，歐洲(Multicenter Acute Stroke Trial of Europe(MAST-E)，Multicenter AcuteStroke Trial of Italy(MAST-I))和澳大利亞(Australien StreptokinaseTrial(AST))的臨床試驗(yàn)表明，用鏈激酶治療病人后呈現(xiàn)上升的死亡率風(fēng)險(xiǎn)以及更高的腦內(nèi)出血(intracerebral hemorrhage，ICH)風(fēng)險(xiǎn)。這些試驗(yàn)不得不在早期就被終止。
b)尿激酶作為選擇，也可采用尿激酶—它也是一種“經(jīng)典的”纖溶蛋白溶解劑。與鏈激酶相反，由于它是一種天然存在于大量機(jī)體組織中的酶，因此，它不顯示抗原特性。它是一種纖溶酶原激活劑，且不依賴于輔助因子。尿劑酶由腎細(xì)胞培養(yǎng)物產(chǎn)生。
c)重組體t-PA(rt-PA)已經(jīng)獲得用產(chǎn)自重組倉鼠細(xì)胞的組織型纖溶酶原激活劑—所謂的rt-PA-(參見EP 0 093 619，US 4,766,075)進(jìn)行的治療性血栓溶解的豐富的經(jīng)驗(yàn)。除了急性心肌梗塞為主要指征之外，九十年代用t-PA在全世界范圍內(nèi)完成了一系列臨床研究，得到部分無法理解且矛盾的結(jié)果。在所謂的歐洲急性中風(fēng)試驗(yàn)(ECASS)中，在病人出現(xiàn)中風(fēng)癥狀后6小時(shí)內(nèi)于靜脈內(nèi)使用rt-PA進(jìn)行治療。90天后檢查死亡率和Barthel指數(shù)作為病人的殘疾或獨(dú)立生活能力指標(biāo)。未報(bào)道生活能力的顯著改善，但是報(bào)道了—盡管不顯著—死亡率的上升。因此可以推斷，對(duì)根據(jù)各自病史個(gè)別選擇出的病人在中風(fēng)發(fā)作后即刻用rt-PA進(jìn)行的血栓溶解治療可能是有利的。然而，不推薦rt-PA在中風(fēng)發(fā)作后6小時(shí)內(nèi)的普遍使用，因?yàn)橛^察到在中風(fēng)發(fā)作后僅幾個(gè)小時(shí)內(nèi)的應(yīng)用會(huì)增加腦內(nèi)出血(ICH)的危險(xiǎn)(C.Lewandowski C和Wiliam Barsan，2001Treatment of AcuteStrocke；inAnnals of Emergency Medcine 372；S.202ff)。
中風(fēng)的血栓溶解治療后來也是美國National Institute of NeurologicDisorder and Stroke進(jìn)行的臨床研究(所謂的NINDS rtPA中風(fēng)試驗(yàn))課題。該試驗(yàn)的重點(diǎn)集中在出現(xiàn)癥狀后3小時(shí)內(nèi)用rt-PA靜脈內(nèi)治療的效果上，該效果基于三個(gè)月后患者的健康狀況。由于觀察到該治療對(duì)病人生活力的積極效果，因此推薦在三個(gè)小時(shí)的時(shí)間段內(nèi)用rt-PA進(jìn)行治療，盡管作者在此也發(fā)現(xiàn)了更高的ICH風(fēng)險(xiǎn)。
在另外兩項(xiàng)研究中(ECASS II TrialAlteplase Thrombolysis for AcuteNoninterventional Therapy in Ischemic Stroke(ATLANTIS))調(diào)查了中風(fēng)發(fā)作后三小時(shí)內(nèi)用rt-PA治療的積極效果是否能在六小時(shí)內(nèi)的治療中重現(xiàn)。然而，由于在升高的ICH風(fēng)險(xiǎn)外未曾觀察到臨床癥狀的改善或死亡率的任何降低，這個(gè)問題并不能得到肯定回答。
根據(jù)一份于1997年首次出版，2001年三月更新的關(guān)于各種中風(fēng)試驗(yàn)的綜述，所有的血栓溶解物治療(尿激酶、鏈激酶、rt-PA或重組尿激酶)特別是由于ICH都導(dǎo)致中風(fēng)后第一個(gè)10天內(nèi)顯著更高的死亡率，盡管在中風(fēng)發(fā)作后六小時(shí)內(nèi)的治療降低了死亡或殘疾病人的總數(shù)。因此，并不推薦血栓溶解物在治療中風(fēng)中的廣泛應(yīng)用。
甚至之前，這樣的結(jié)果使得其他一些作者給出了純粹的諷刺言論中風(fēng)病人必須選擇要么死亡要么殘廢地活著(SCRIP 19972265，26)。
不過，迄今為止使用rt-PA的療法仍然是美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)唯一批準(zhǔn)的急性腦缺血的治療方法。然而，限制是在中風(fēng)后3小時(shí)內(nèi)使用rt-PA。
重組體纖溶酶原激活劑目前以名稱Alteplase或以類似制劑Reteplase銷售。后者是一種半衰期較短的具有治療活性的t-PA片斷。治療劑量，Alteplase是約70-100mg，Reteplase是2×560mg，對(duì)于Alteplase主要通過點(diǎn)滴施用而Reteplase則是通過以大約30分鐘的時(shí)間間隔兩次快速推注施用(Mutschler″Arzneimittelwirkungen″，第八版，512-513頁)。
t-PA的副作用神經(jīng)毒性和興奮性毒性對(duì)rt-PA的批準(zhǔn)是在1996年。之前在1995年，公開了t-PA的神經(jīng)毒性或興奮性毒性作用的原因的第一份聲明，其中為在三小時(shí)之外將t-PA應(yīng)用于中風(fēng)治療時(shí)產(chǎn)生的劇烈效果提供了解釋，據(jù)其所述海馬小膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生參與谷氨酸介導(dǎo)的興奮性毒性的自身性t-PA。該結(jié)論是從一項(xiàng)關(guān)于t-PA缺陷型和野生型小鼠的研究推導(dǎo)得出的，其中將谷氨酸激動(dòng)劑分別注射入它們的海馬。t-PA缺陷型小鼠對(duì)外源(inthrathekal)施用的谷氨酸表現(xiàn)出顯著更高的抗性(Tsirka SE等，Nature，Vol.377，1995，″Exzitoxin-induced neuronaldegeneration and seizure are mediated by tissue plasminogen activator″)。這些結(jié)果在1998年得到證實(shí)，當(dāng)時(shí)Wang等證明當(dāng)靜脈內(nèi)注射t-PA時(shí)t-PA缺陷型小鼠中出現(xiàn)幾乎兩倍量的壞死神經(jīng)組織。在野生型小鼠的情形下，外源t-PA的這一消極結(jié)果僅為約33％(Wang等，1998，Nature，″Tissue plasminogenactivator(t-PA)increases neuronal damage after focal cerebral ischemiain wild type and t-PA deficient mice″)。
2001年初Nicole等發(fā)表了對(duì)由t-PA引起的興奮性毒性的進(jìn)一步研究結(jié)果(Nicole O，Docagne F Ali C；Margaill I；Carmeliet P；MacKenzie ET，VivienD和Buisson A，2001The proteolytic activity of tissue-plasminogenactivator enhances NMDA receptor-mediated signaling；inNat Med 7，59-64)。他們可以證明由去極化皮質(zhì)神經(jīng)元釋放的t-PA與所謂的NMDA型谷氨酸受體的NR1亞單位相互作用并將其分離。該修飾導(dǎo)致受體活性的升高，其致使在施用谷氨酸激動(dòng)劑NMDA后通過引發(fā)的興奮性毒性出現(xiàn)更大的組織破壞。因此，t-PA通過激活NMDA型谷氨酸受體表現(xiàn)出神經(jīng)毒性。中風(fēng)期間由于受影響的組織區(qū)域內(nèi)血腦屏障崩潰，溶解性血漿蛋白樣纖維蛋白原以及治療施用的t-PA得以與神經(jīng)組織接觸，在那里被纖維蛋白原激活的t-PA通過激活谷氨酸受體顯示了它的興奮性毒性效應(yīng)。
盡管t-PA具有神經(jīng)毒性副作用以及上升的死亡率效應(yīng)，它仍然得到了FDA的藥物授權(quán)批準(zhǔn)。這是因?yàn)槿狈o害而有效的替代物和非常實(shí)用的成本效益分析。然而一如繼往地存在對(duì)于安全療法的需求。如果不能完全排除血栓溶解作用，在開發(fā)新的血栓溶解藥物的情況下出就必須考慮神經(jīng)毒性問題(參見如Wang等a.a.O.；Lewandowski和Barsan 2001a.a.O.)。
出于該原因，盡管原則上所有血栓溶解藥物都可能適用，還是終止了為開發(fā)中風(fēng)治療新藥物而進(jìn)行的對(duì)包括DSPA(Desmodus rotundus纖溶酶原激活劑)在內(nèi)的已知血栓溶解藥物的進(jìn)一步研究。例如就DSPA而言，較早期就已經(jīng)指出了它對(duì)該適應(yīng)征的撒用性(Medan P；Tatlisumak T；Takano K；Carano RAD；Hadley SJ；Fisher MThrombolysis with recombinant Desmodus salivaplasminogen activator(rDSPA)in a rat embolic stroke model；inCerebrovasc Dis 19966；175-194(第四版International Symposium onThrombolic Therapy in Acute Ishemic Stroke))。DSPA是一種與t-PA高度同源(相似)的纖溶酶原激活劑，以致在意識(shí)到t-PA的神經(jīng)毒性副作用的同時(shí)，也不對(duì)DSPA抱有希望。
替代的治療學(xué)途徑目前，替代的治療學(xué)途徑的研究例如集中在抗凝血?jiǎng)?，例如肝素、阿司匹林或安克洛酶—馬來響尾蛇(Malayischen Grubenotter)毒液中的活性物質(zhì)。然而尤其是兩個(gè)檢驗(yàn)肝素效果的臨床研究(International Stroke Trial(IST)和Trial of ORG 10172 in Acute Stroke Trea tment(TOAST))并未顯示出對(duì)死亡率的顯著改善或?qū)χ酗L(fēng)再發(fā)的預(yù)防。
另一種的新療法的焦點(diǎn)既非集中于血栓也非稀釋血液或抗凝結(jié)作用，而是嘗試提高因中斷血液供應(yīng)而受損的細(xì)胞的生命力(WO 01/51613 A1和WO01/51614A1)。為了達(dá)到該目的，使用了源自醌類、氨基糖苷類或氯霉素類的抗生素?；谙嗨圃?，進(jìn)一步建議從中風(fēng)發(fā)作后立即施加胞磷膽堿開始。胞磷膽堿在體內(nèi)被切割為胞苷和膽堿。切割產(chǎn)物形成神經(jīng)元細(xì)胞膜的一部分并因此支持受損組織的再生(US 5,827,832)。
近期對(duì)安全治療的研究基于新發(fā)現(xiàn)，即，中風(fēng)的致命后果部分是僅僅由中斷的血液供應(yīng)間接導(dǎo)致而由在過度激活的谷氨酸受體的參與下的興奮性毒性或神經(jīng)毒性直接導(dǎo)致的。t-PA加強(qiáng)這一效應(yīng)(參見上述)。因此一種降低興奮性毒性的配方是應(yīng)用所謂的神經(jīng)保護(hù)劑。它們可以單獨(dú)使用或與纖維蛋白溶解劑聯(lián)合使用以減小神經(jīng)毒性效應(yīng)。它們能夠或者例如作為谷氨酸受體拮抗劑直接地降低興奮性毒性、或者通過阻斷電壓依賴型鈉或鈣離子通道間接地消弱興奮性毒性(Jin-Mo Lee等a.a.O.)。
在此用例如2-氨基-5-膦酰戊酸鹽(APV)或2-氨基-5-膦酰庚酸鹽(APH)產(chǎn)生對(duì)NMDA型谷氨酸受體的競爭性抑制(拮抗作用)是可能的?？梢杂美缃Y(jié)合于通道苯環(huán)利定(Phencyclidin)端的物質(zhì)來實(shí)現(xiàn)非競爭性抑制。這樣的物質(zhì)可以是苯環(huán)利定、MK-801、右啡烷或氯胺酮(ketamin)。
迄今為止，采用神經(jīng)保護(hù)劑的治療還未表現(xiàn)出所期望的成功，可能因?yàn)樯窠?jīng)保護(hù)劑要表現(xiàn)它們的保護(hù)效應(yīng)必須與血栓溶解劑結(jié)合。這適用于其它活性物質(zhì)(參見

圖10)。
然而，甚至t-PA和神經(jīng)保護(hù)劑的組合也僅導(dǎo)致有限的損傷。缺陷在于，未避免所使用的纖維蛋白溶解劑的神經(jīng)毒性。
非神經(jīng)毒性的纖溶酶原激活劑由國際專利申請(qǐng)PCT/EP02/12204獲知用于治療中風(fēng)的纖溶酶原激活劑，其酶的活性被纖維蛋白高選擇性地增強(qiáng)許多倍，即大于650倍。這一公開的內(nèi)容全部引入作為參考。
纖溶酶原激活劑的特征和施用是基于以下知識(shí)，即組織纖溶酶原激活劑(t-PA)的神經(jīng)毒性歸因于下列事實(shí)，那就是血腦屏障由于因中風(fēng)導(dǎo)致的腦內(nèi)組織損傷而受到損傷或破壞，于是，在血液中循環(huán)的纖維蛋白原能進(jìn)入腦神經(jīng)組織，在那里它激活了t-PA，通過激活谷氨酸受體或激活纖溶酶原間接導(dǎo)致了進(jìn)一步的組織損傷。(參見上述)。
為了避免這種效應(yīng)，應(yīng)用一種纖溶酶原激活劑，它顯示了一種增加的纖維蛋白選擇性，并且作為一種相反的結(jié)果，顯示了降低的纖維蛋白原可活化性。因此這些纖溶酶原激活劑并不會(huì)，或者與t-PA相比而言程度較低地，被由于血腦屏障受損而從血液進(jìn)入神經(jīng)組織的纖維蛋白原激活，因?yàn)閠-PA的激活劑纖維蛋白由于其大小以及不溶性而不能進(jìn)入神經(jīng)組織。這些纖溶酶原激活劑是非神經(jīng)毒性的。
a)經(jīng)遺傳學(xué)修飾的纖溶酶原激活劑根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式，使用了非毒性纖溶酶原激活劑，其包括至少一種所謂的酶原三聯(lián)體元件。一個(gè)類似的已知三聯(lián)體是來自胰凝乳蛋白酶家族的絲氨酸蛋白酶的催化中心，它由三個(gè)相互作用的氨基酸即天門冬氨酸194、組氨酸40和絲氨酸32組成。然而，該三聯(lián)體并不存在于屬于胰凝乳蛋白酶類絲氨酸蛋白酶家族的t-PA中。不過，已知向天然t-PA的適宜位點(diǎn)導(dǎo)入至少一個(gè)上述氨基酸的定向誘變導(dǎo)致在纖維蛋白存在下原酶活性(單鏈t-PA)減弱和成熟酶活性(雙鏈t-PA)增強(qiáng)。因此，三聯(lián)體中至少一個(gè)氨基酸，或具有對(duì)應(yīng)于三聯(lián)體中的功能的氨基酸的導(dǎo)入，能增強(qiáng)t-PA的酶原性(Zymogenitt)(也就是成熟酶活性與原酶活性的比率)。結(jié)果導(dǎo)致纖維蛋白特異性顯著提高。這是由所導(dǎo)入的氨基酸殘基和/或野生型序列氨基酸殘基之間的構(gòu)象相互作用引起的。
已知，t-PA中用His取代Phe305(F305H)和用Ser取代Ala 292(A292S)的誘變使酶原性增強(qiáng)20倍，而單純的F305H變體就已經(jīng)使酶原性增強(qiáng)5倍(ELMadison，Kobe A，Gething M-J；Sambrook JF，Goldsmith EJ 1993ConvertingTissue Plasminogen Activator to a ZymogenA regulatory Triad ofAsp-His-Ser；Science262，419-421)。存在纖維蛋白時(shí)，這些t-PA突變體活性分別增強(qiáng)30000倍(F305H)和130000倍(F305H，A292S)。另外，這兩個(gè)突變體還包括將Arg275置換為R275E以防止纖溶酶在切割位點(diǎn)Arg275-Ile276的切割而將單鏈t-PA轉(zhuǎn)變?yōu)殡p鏈形式。單一的突變體R275E使t-PA的纖維蛋白特異性增強(qiáng)6900倍(K Tachias，Madison EL 1995Variants of Tissue-typePlasminogen Activator Which Display Substantially Enhanced Stimulationby Fibrin，inJournal of Biological Chemistry 270，3118319-18322)。
t-PA的位點(diǎn)305和292與胰凝乳蛋白酶中的絲氨酸蛋白酶的已知三聯(lián)體的位點(diǎn)His40和Ser32同源。通過分別用組氨酸或絲氨酸進(jìn)行的相應(yīng)取代，這些氨基酸能與t-PA的天門冬氨酸477相互作用從而在t-PA突變體中產(chǎn)生已知的三聯(lián)體功能(Madison等，1993)。
根據(jù)本發(fā)明，由于這些t-PA突變體因其增強(qiáng)的纖維蛋白特異性而不具有或—與野生型t-PA相比—僅具有顯著降低的神經(jīng)毒性，因此可將它們用于治療中風(fēng)。為公開已述及的t-PA單純F305H；F305H；A292S突變體或與R275E的組合突變，引入Madison等(1993)的出版物，以及將Tachias和Madison(1995)的全文引作參考。
作為替代地，纖溶酶原激活劑纖維蛋白特異性的增強(qiáng)可通過Asp194(或同源位點(diǎn)的天門冬氨酸)的點(diǎn)突變實(shí)現(xiàn)。纖溶酶原激活劑屬于胰凝乳蛋白酶家族中絲氨酸蛋白酶組，且因此它包含負(fù)責(zé)成熟蛋白酶的催化活性構(gòu)象穩(wěn)定性的保守氨基酸Asp194。已知在絲氨酸蛋白酶的酶原中Asp194與His40相互作用。通過酶原的激活性切割該相互作用被阻斷，Asp194側(cè)鏈旋轉(zhuǎn)約170°以與Ile16形成一個(gè)新鹽橋。該鹽橋參與成熟絲氨酸蛋白酶的催化三聯(lián)體的氧陰離子穴(Oxyanion-Tasche)的穩(wěn)定性。它也存在于t-PA中。
Asp194的點(diǎn)突變首先阻礙絲氨酸蛋白酶催化構(gòu)象的形成或穩(wěn)定性。盡管如此，該突變的纖溶酶原激活劑在它們的輔因子纖維蛋白的存在下顯示出顯著增強(qiáng)的活性(特別是與成熟野生型相比)，這只能解釋為與纖維蛋白的相互作用允許促進(jìn)催化活性的構(gòu)象變化(L Strandberg，Madison EL，1995Variants ofTissue-type Plasminogen Activator with Substantially Enhanced Responseand Selectivity towards Fibrin co-factors，inJournal of BiologicalChemistry 270，402344-2349)。由此顯示纖溶酶原激活劑的Asp194突變體在纖維蛋白存在下其活性高度增強(qiáng)，這使其作為非神經(jīng)毒性的纖溶酶原激活劑的應(yīng)用成為可能。
在這類非神經(jīng)毒性的纖溶酶原激活劑的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，使用了t-PA突變體，該突變體中Asp194被谷氨酸(D194E)或天冬酰胺(D194N)取代。這些突變體中的t-PA活性在無纖維蛋白時(shí)減少1-2000倍，而當(dāng)纖維蛋白存在時(shí)其活性增強(qiáng)可達(dá)到498000-1050000倍。這些突變體可進(jìn)一步包含Arg15至R15E的取代，它防止纖溶酶在肽鍵Arg15-Ile16處切割單鏈t-PA而形成雙鏈形式的t-PA。該單一突變將纖維蛋白對(duì)t-PA的激活增強(qiáng)12000倍。為公開在位點(diǎn)194和15的t-PA突變，引入Strandberg和Madison(1995)全文作為參考。
也可以通過在所謂的“自溶環(huán)(Autolyse-Schleife)”中導(dǎo)入點(diǎn)突變來增強(qiáng)纖溶酶原激活劑對(duì)纖維蛋白的依賴性。該氨基酸片斷已知源于胰蛋白酶；在絲氨酸蛋白酶的同源片斷中也能發(fā)現(xiàn)該成分，且尤以三個(gè)疏水氨基酸(Leu、Pro和Phe)為特征。纖溶酶原激活劑中的自溶環(huán)負(fù)責(zé)與纖溶酶原的相互作用。該區(qū)域中的點(diǎn)突變使纖溶酶原與纖溶酶原激活劑間不再有效形成蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用。這些突變僅在缺少纖維蛋白時(shí)是功能相關(guān)的。相反在存在纖維蛋白時(shí)，它們負(fù)責(zé)纖溶酶原激活劑活性的增強(qiáng)(K Song-Hua，Tachias K，Lamba D，BodeW，madison EL，1997Identifikation of a Hydrophobic exocite on TissueType Plasminogen Activator That Modulates Specificity for Plasminogen，InJournal of Biological Chemistry 272；3，181-1816)。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，使用在位點(diǎn)420至423間具有點(diǎn)突變的t-PA。若這些殘基經(jīng)定向點(diǎn)突變?nèi)〈涫沟胻-PA的纖維蛋白依賴性增強(qiáng)直至61000倍(K Song-Hua等)。Song-Hua等檢測了點(diǎn)突變L420A、L420E、S421G、S421E、P422A、P422G、P422E、F423A和F423E。為公開根據(jù)本發(fā)明的用途將這些出版物全文引入作為參考。
根據(jù)進(jìn)一步的有利實(shí)施方式，使用具有SEQ ID Nr.1(附圖13)所示氨基酸序列的經(jīng)修飾的組織纖溶酶原激活劑。該經(jīng)修飾的t-PA與野生型t-PA的區(qū)別在于，其自溶環(huán)中位點(diǎn)420至423間的疏水氨基酸的替換如下His420、Asp421、Ala422和Cys423。該t-PA優(yōu)選在位點(diǎn)194具有一個(gè)苯丙氨酸。進(jìn)一步，位點(diǎn)275可為谷氨酸。有利的是，位點(diǎn)194為苯丙氨酸。
進(jìn)一步，根據(jù)本發(fā)明可使用經(jīng)修飾的尿激酶。根據(jù)本發(fā)明，尿激酶可以具有根據(jù)SEQ ID Nr.2(附圖14)所示的氨基酸序列，其中自溶環(huán)的疏水氨基酸被Val420、Thr421、Asp422和Ser423取代。有利的是，尿激酶帶有一個(gè)Ile275和一個(gè)Glu194。該突變體具有與野生型尿激酶相比增強(qiáng)500倍的纖維蛋白特異性。
該兩種突變體—尿激酶與t-PA—都進(jìn)行了半定量試驗(yàn)分析，且與野生型t-PA相比都顯示增強(qiáng)的纖維蛋白特異性。
b)源自吸血蝙蝠(Desmodus rotundus)的纖溶酶原激活劑(DSPA)源自吸血蝙蝠唾液的纖溶酶原激活劑(DSPA)在纖維蛋白存在時(shí)也表現(xiàn)出高度增強(qiáng)的活性—增強(qiáng)100000倍，其因此可被用于非毒性纖溶酶原激活劑。術(shù)語DSPA包括四種不同的蛋白酶，它們完成吸血蝙蝠的基本需求即獵物傷口流血時(shí)間的延長(Cartwright，1974)。這四種蛋白酶(DSPAα1、DSPAα2，DSPAβ、DSPAγ)相對(duì)于人t-PA呈現(xiàn)一致的高度的相似性(同源性)。它們也表現(xiàn)出相似或一致的生理活性，使它們合理地被概括于上位術(shù)語DSPA下。DSPA公開于專利EP 0 352 119 A1和US 6 008 019和5 830 849中，因此為滿足公開將它們?nèi)囊胱鳛閰⒖肌?br> 迄今為止，DSPAα1是該組中最徹底分析的蛋白酶。其氨基酸序列與已知的人t-PA氨基酸序列具有大于72％的同源性(Krtzschmar等，1991)。然而，t-PA和DSPA間有兩個(gè)本質(zhì)性的區(qū)別。首先，DSPA作為單鏈分子對(duì)于肽底物表現(xiàn)為完全活性的分子，其與t-PA相反，不轉(zhuǎn)變?yōu)殡p鏈形式(Gardell等，1989；Krtzschmar等，1991)。其次，DSPA的催化活性幾乎完全依賴于纖維蛋白(Gardell等，1989；Bringmann等，1995；Toschi等，1998)。例如，在纖維蛋白存在下，DSPAα1的活性增強(qiáng)100000倍而t-PA的活性僅增強(qiáng)550倍。相反，纖維蛋白原對(duì)DSPA活性的誘導(dǎo)顯著較弱，其活性僅增強(qiáng)7-9倍(Bringmann等，1995)。DSPA比僅被纖維蛋白激活550倍的野生型t-PA顯著更依賴于纖維蛋白且更為纖維蛋白特異性。
由于其纖維蛋白溶解性以及與t-PA極大相似，DSPA成為血栓溶解試劑開發(fā)中一種令人感興趣的候選物。盡管如此，DSPA作為血栓溶解試劑的醫(yī)療用途過去被限制于對(duì)心肌梗死的治療，由于t-PA參與谷氨酸誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性，人們不能合理預(yù)測與t-PA高度近似的纖溶酶原激活劑可被成功應(yīng)用于急性中風(fēng)的治療。
令人驚訝的是，即使DSPA顯示出與t-PA高度相似(同源)并且其生理效應(yīng)在很大程度上也與t-PA類似，DSPA卻沒有神經(jīng)毒性效應(yīng)。上述結(jié)論導(dǎo)致產(chǎn)生這樣一種認(rèn)識(shí)，DSPA也許可以在中風(fēng)治療中成功用作血栓溶解試劑而不造成神經(jīng)組織損傷的嚴(yán)重危險(xiǎn)。這特別意味著，DSPA也可以在出現(xiàn)中風(fēng)癥狀3小時(shí)后使用。
DSPA不具有神經(jīng)毒害性的試驗(yàn)證明對(duì)于這種纖溶酶原激活劑不具有神經(jīng)毒性的新認(rèn)識(shí)是以基于一方面t-PA和另一方面DSPA的神經(jīng)變性效應(yīng)的體內(nèi)對(duì)比實(shí)驗(yàn)為基礎(chǔ)的。該實(shí)驗(yàn)是借助于所謂的“紅藻氨酸-模型”以及用于檢測NMDA誘導(dǎo)的紋狀體損傷的模型進(jìn)行的。
紅藻氨酸模型(也稱為紅藻氨酸損傷模型)以通過外部應(yīng)用紅藻氨酸(KA)作為紅藻氨酸型(KA型)谷氨酸受體以及NMDA和AMPA谷氨酸受體的激動(dòng)劑刺激神經(jīng)毒性谷氨酸級(jí)聯(lián)反應(yīng)為基礎(chǔ)。以t-PA缺陷型小鼠腦干作為試驗(yàn)?zāi)Ｐ停梢燥@示只有在補(bǔ)加外源t-PA后實(shí)驗(yàn)動(dòng)物對(duì)紅藻氨酸的敏感性才能達(dá)到野生型小鼠的水平。相反，相同實(shí)驗(yàn)條件下輸注等摩爾濃度的DSPA不能恢復(fù)對(duì)紅藻氨酸(KA)的敏感性。得出結(jié)論，t-PA的神經(jīng)毒性效應(yīng)不能由DSPA替代。這些結(jié)果的總結(jié)見圖15(表1)。
基于該模型的定量研究顯示，甚至10倍的DSPA濃度增長也不能恢復(fù)t-PA缺陷型小鼠對(duì)KA處理的敏感性，而降低10倍的t-PA濃度就已經(jīng)導(dǎo)致KA誘導(dǎo)的組織損傷。由此得出結(jié)論，就促使KA處理后的神經(jīng)變性刺激而言，DSPA具有比t-PA至少低100倍的活性(同時(shí)參見附圖11和12)。
在第二個(gè)神經(jīng)變性模型中，用野生型小鼠比較了t-PA以及DSPA促使NMDA依賴型神經(jīng)變性的可能效應(yīng)。為此目的，向野生型小鼠單獨(dú)注射NMDA，或者與t-PA或DSPA組合注射NMDA(用作NMDA型谷氨酸受體的激動(dòng)劑)。該模型可以在最終會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)變性和因血腦屏障被破壞而血漿蛋白質(zhì)流入的條件下檢測這些蛋白酶的效果(Chen等，1999)。
該模型的操作使NMDA的注射導(dǎo)致小鼠紋狀體的可重復(fù)性損傷。t-PA和NMDA的聯(lián)合注射使損傷量增加至少50％。相反，用DSPAα1的共注射不會(huì)導(dǎo)致由NMDA引起的損傷擴(kuò)大的增強(qiáng)。甚至在能夠擴(kuò)散于由NMDA引起的損傷區(qū)域中的血漿蛋白質(zhì)存在下，DSPA也不會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)變性的增強(qiáng)。這些結(jié)果的總結(jié)見圖16(表2)。
首個(gè)臨床試驗(yàn)結(jié)果顯示這些結(jié)果也適用于人類中風(fēng)治療。已經(jīng)確認(rèn)成功灌注后患者得到顯著改善(改善8個(gè)點(diǎn)NIHSS或HIHSS值0到1)。附圖17(表3)表明了這一情況。
在進(jìn)一步的試驗(yàn)中檢驗(yàn)靜脈注射給藥時(shí)，t-PA和DSPA是否能夠透過受損的血腦屏障并增加腦中的組織損害。對(duì)此，將NMDA立體定向(stereotaktisch)注射到小鼠用于在紋狀體產(chǎn)生組織損傷，在NMDA注射后6或24小時(shí)靜脈內(nèi)施用t-PA或DSPA。與陰性對(duì)照相比，當(dāng)在NMDA注射后24小時(shí)輸注t-PA時(shí)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物顯示出被NMDA注射損傷的組織面積增加了約30％，而用DSPA不引發(fā)這樣的一種組織損傷的增加，盡管可以通過一種抗體染色法證實(shí)它進(jìn)入到受損組織的區(qū)域(參見附圖18、19)。在NMDA注射后6小時(shí)以相應(yīng)方式靜脈內(nèi)注射t-PA或DSPA，仍未確定受損組織面積的增加。這可能歸因于，當(dāng)注射t-PA或DSPA時(shí)，血-腦屏障仍具有足夠的屏障作用。
這些結(jié)果顯示了，DSPA在哺乳動(dòng)物(也可以是人)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中主要表現(xiàn)為一種惰性蛋白酶，與t-PA相反，并不會(huì)引起經(jīng)KA或NMDA所誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性的增強(qiáng)。這種神經(jīng)毒性的缺乏使得DSPA與所預(yù)期的相反成為一種適宜的治療急性中風(fēng)的血栓溶解劑。
非神經(jīng)毒性纖溶酶原激活物的治療潛能DSPA和其它非神經(jīng)毒性纖溶酶原激活劑的神經(jīng)毒性缺乏特征(參見上述)為中風(fēng)治療提供了特別的優(yōu)勢，這些纖溶酶原激活劑的使用-與野生型t-PA相反-并不受限于中風(fēng)發(fā)作后最長為3小時(shí)的時(shí)間段。相反，治療可以遲些開始-例如6小時(shí)后或者更遲，而不會(huì)如同t-PA引發(fā)興奮性毒性反應(yīng)的危險(xiǎn)。首次用DSPA進(jìn)行的臨床試驗(yàn)證明了中風(fēng)發(fā)作后在甚至超過6或9小時(shí)的時(shí)間范圍對(duì)病人的安全治療。
用非神經(jīng)毒性激活劑進(jìn)行的這一無時(shí)間限制的治療選擇方案特別重要，因?yàn)樗谝淮慰梢院翢o顧慮地治療中風(fēng)發(fā)作時(shí)在時(shí)間上沒有足夠安全地治療的急性中風(fēng)癥狀的病人。這組病人至今由于不利的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估而被排除在采用纖溶酶原激活劑的血栓溶解療法之外的。因此，消除了血栓溶解試劑用于中風(fēng)治療的禁忌。
纖溶酶原激活物的施用與已經(jīng)確立的中風(fēng)治療劑rt-PA相反，用非神經(jīng)毒性均纖溶酶原激活劑治療中風(fēng)還沒有獲得對(duì)于可能的施用方式可靠的認(rèn)識(shí)。
因此，本發(fā)明的目的在于提供一種對(duì)于這些非神經(jīng)毒性的纖溶酶原激活物的有利的施用方式。
根據(jù)本發(fā)明，靜脈內(nèi)施用纖溶酶原激活劑來治療中風(fēng)，在纖維蛋白存在的情況下，其活性的增加超過650倍。
靜脈給予這些非神經(jīng)毒性纖溶酶原激活劑以治療中風(fēng)已經(jīng)在臨床試驗(yàn)中得以確定。其中，DSPA-作為這組纖維蛋白溶解劑的一個(gè)實(shí)例-靜脈施用于這些病人，僅造成一些比較小的副作用。
這些臨床研究的結(jié)果是意料之外的，因?yàn)楸娝苤?，靜脈內(nèi)施用t-PA和其它普通的纖維蛋白溶解劑與大腦出血的嚴(yán)重危險(xiǎn)有關(guān)(參見上述)。
為了減少大腦內(nèi)出血，新近發(fā)展的策略，不再將這些物質(zhì)靜脈內(nèi)施用，而是通過導(dǎo)管經(jīng)動(dòng)脈內(nèi)途徑直接施用于血管內(nèi)的血栓附近。為此，這種實(shí)際的實(shí)驗(yàn)已經(jīng)用于重組體產(chǎn)生的尿激酶(PROCAT作為與前尿激酶相關(guān)的一種研究)。由于這種施用方式使總劑量顯著減少，所以實(shí)現(xiàn)了劑量依賴的副作用的減少-這樣大腦出血也會(huì)減少。
然而這些動(dòng)脈內(nèi)施用的顯著優(yōu)勢被兩個(gè)可能存在的缺點(diǎn)所破壞。首先，這種治療的先決條件是需要時(shí)間做好病人的準(zhǔn)備工作，但在中風(fēng)的治療中在給定的僅僅3小時(shí)內(nèi)這不可能實(shí)現(xiàn)。另一方面人們確信能夠達(dá)到一個(gè)較低的總劑量，然而較高的藥物濃度將局部抵達(dá)末端動(dòng)脈血管。由于在中風(fēng)情況下，血管內(nèi)皮屏障功能削弱的緣故，藥物也將以局部高濃度抵達(dá)周圍的組織。這樣將會(huì)產(chǎn)生不想要的副作用。
較之而言，如果是靜脈內(nèi)施用，藥物的濃度將會(huì)被靜脈血流所稀釋。因此，如果藥物具有組織破壞的潛在性，如t-PA，那動(dòng)脈內(nèi)注射就是有問題的(Forth，Henschler，Rummel，Starke“Pharmakologie und Toxikologie”，第六版，1992，29頁)。
然而，這種使動(dòng)脈內(nèi)施用變復(fù)雜的局限性-時(shí)間范圍窄-和損傷組織的副作用-不存在于根據(jù)本發(fā)明在纖溶酶原激活劑的施用。因此，這種動(dòng)脈內(nèi)施用由于其不可否認(rèn)的優(yōu)勢(參見上述)原則上形成了非神經(jīng)毒性纖溶酶原激活劑非常有用的一種施用方式。因此，很明顯的可以沿循這種途徑尋找這些藥物的優(yōu)選施用方式。
然而，申請(qǐng)人也選擇將非神經(jīng)毒性的纖溶酶原激活劑采用有爭議的靜脈內(nèi)施用，其驚人的被證實(shí)了是有利的。
此外，本發(fā)明的施用方式還不同于常規(guī)治療慣例，為了給予具有高免疫潛能的蛋白質(zhì)藥物，主要使用肌肉注射或靜脈點(diǎn)滴，其目的在于降低過敏性休克的危險(xiǎn)(Mebs“Gifttiere”，第二版，2000)。
本發(fā)明所應(yīng)用的纖溶酶原激活劑與自身的t-PA相反或者是源于動(dòng)物的異種蛋白(例如DSPA)或者是遺傳學(xué)修飾的自身蛋白，由于其結(jié)構(gòu)上的不同具有新的抗原決定部位。伴隨的過敏反應(yīng)問題-尤其是當(dāng)施用高治療劑量時(shí)，比如在靜脈內(nèi)應(yīng)用通常是必須的-還同樣存在于其它的含有異種蛋白例如鏈激酶的溶纖維蛋白藥。
在一個(gè)特別有利的實(shí)施方式中，根據(jù)本發(fā)明使用的纖溶酶原激活劑可以通過一種快速推注(靜脈快速注射)的方式給予，也可以作為一種含有全部治療劑量的單獨(dú)的靜脈快速注射方式給予。
在臨床研究的范圍內(nèi)證實(shí)，甚至驚人的低治療劑量靜脈內(nèi)施用也會(huì)產(chǎn)生有利的結(jié)果。例如，當(dāng)劑量在90μg/kg和230μg/kg之間能夠達(dá)到優(yōu)選的治療結(jié)果。當(dāng)劑量在62.5到90μg/kg之間能夠達(dá)到特別優(yōu)選的治療結(jié)果。在所調(diào)查的病人當(dāng)中，中風(fēng)和施用藥物的時(shí)間間隔在3到9小時(shí)之間。通過合適的檢測方法可以確定起效的治療效果(參見附圖20-29)。
DSPA和其它的非神經(jīng)毒性纖溶酶原激活劑本身不表現(xiàn)神經(jīng)毒性副作用。然而，為盡可能限制有自身谷氨酸引起的組織損傷，將它們與神經(jīng)保護(hù)試劑聯(lián)合應(yīng)用于中風(fēng)治療是有利的?？梢允褂酶偁幮曰蚍歉偁幮砸种乒劝彼崾荏w的神經(jīng)保護(hù)試劑。有效的組合是使用例如已知的NMDA型、紅藻氨酸型或使君子氨酸型谷氨酸受體抑制劑，例如APV、APH、苯環(huán)利定、MK-801、右啡烷或氯胺酮。
進(jìn)一步，與陽離子聯(lián)用是有利的，因?yàn)殛栯x子尤其是Zn離子會(huì)阻斷由谷氨酸受體調(diào)控的陽離子通道從而能夠降低神經(jīng)毒性效應(yīng)。
在進(jìn)一步有利的實(shí)施方式中，非神經(jīng)毒性纖溶酶原激活劑可以與至少一種進(jìn)一步的治療性試劑或與藥學(xué)可接受載體聯(lián)用。尤其有利的是與通過活化細(xì)胞來有助于避免組織損傷的治療性試劑的聯(lián)用，以促使已受損組織的再生或在防止繼發(fā)性中風(fēng)。有利的是與抗生素如醌類、抗凝血?jiǎng)┤绺嗡鼗蛩嗡匾约芭c胞磷膽堿或乙酰水楊酸的聯(lián)用。
與至少一種凝血酶抑制劑的聯(lián)用也是有利的。優(yōu)選，也可以使用血栓調(diào)節(jié)蛋白和血栓調(diào)節(jié)蛋白類似物例如Solulin、Triabin或Pallidipin。進(jìn)一步與抗炎癥物質(zhì)的聯(lián)用是有利的，因?yàn)樗鼈冇绊懓准?xì)胞浸潤。
下面通過個(gè)別的治療實(shí)例概述本發(fā)明的施用方式和制劑。
實(shí)施例t-PA和DSPA的對(duì)比研究A.方法1、動(dòng)物野生型小鼠(c57/Black 6)和t-PA缺陷型小鼠(t-PA-/-小鼠)(c57/Black6)(Carmeliet等，1994)由Dr.Peter Carmeliet，Leuven，Belgien提供。
2、腦組織蛋白抽提t(yī)-PA或DSPAα1輸注后用酶譜分析進(jìn)行腦組織中蛋白水解活性的測定(Granelli Piperno和Reich，1974)。對(duì)海馬進(jìn)行七天輸注后麻醉小鼠，然后用PBS經(jīng)心臟灌流，取腦。切下海馬區(qū)域，轉(zhuǎn)入Eppendorf管并培養(yǎng)于等體積(w/v)(約30-50μm)不合蛋白酶抑制劑的0.5％NP-40裂解緩沖液(0.5％NP-40，10mM Tris-HCl pH7.4，10mM NaCl，3mM MgCl2，1mM EDTA)中，用手動(dòng)式玻璃勻漿機(jī)勻漿腦提取物并將其置于冰上30分鐘。隨后離心樣品，取得上清液。檢測存在的蛋白質(zhì)含量(Bio-Rad試劑)。
3、蛋白酶的酶譜分析根據(jù)Granelli-Piperno和Reich(1974)的方法用酶譜分析檢測樣品或腦組織提取物中的蛋白水解活性。在非還原條件下對(duì)含重組蛋白質(zhì)(至多100nmol)的樣品或腦組織提取物(20μg)進(jìn)行10％的SDS-PAGE。將凝膠從盤中取出，在1％Triton×100中洗滌2小時(shí)，之后覆蓋在一塊含有聚合纖維蛋白原和纖溶酶原的瓊脂糖凝膠上(Granelli，Piperno和Reich，1974)。于37℃下將膠在濕潤容器中溫育直到蛋白水解條帶可識(shí)別。
4、t-PA、DSPA向海馬內(nèi)的輸注以及隨后的紅藻氨酸注射紅藻氨酸損傷模型是以Tsirka等的研究(1995)為基礎(chǔ)的。向動(dòng)物腹腔內(nèi)(i.p.)注射阿托品(4mg/kg)，之后通過腹腔注射戊巴比妥鈉(70mg/kg)麻醉。然后將小鼠置于腦立體定位框架(stereotaktischen Rahmen)中，并將一個(gè)含有100μl PBS或重組人t-PA(0.12mg/ml，1.85μM)或DSPAα1(1.85μM)的微滲泵(Alzet型號(hào)1007D，Alzet CA.USA)皮下植入肩胛骨間。為了在中線附近導(dǎo)入液體，將泵經(jīng)無菌管與腦套管針連接，并從穿越坐標(biāo)為前囟-2.5mm，中側(cè)(midolateral)0.5mm和背腹側(cè)1.6mm的顱骨開孔插入。將套管針固定在合適的位點(diǎn)，并開啟泵，以每小時(shí)0.5μl的流速灌注相應(yīng)溶液共7天。
輸注蛋白酶兩天后，再次麻醉小鼠并再將其置于腦立體定位框架中。然后，向海馬單側(cè)注射溶于0.3μl PBS中的1.5nmol紅藻氨酸(KA)。坐標(biāo)為前囟-2.5mm，中側(cè)1.7mm和背腹側(cè)1.6mm。將興奮性毒素(KA)以30秒注入。紅藻氨酸處理后，為防止液體倒流將注射針頭在該坐標(biāo)再保持2分鐘。
5、腦研究KA注射5天后，麻醉動(dòng)物并用30ml PBS經(jīng)心臟灌流，接著用70ml 4％的多聚甲醛溶液經(jīng)心臟灌流，用相同的固定劑中固定24小時(shí)，隨后在30％的蔗糖中進(jìn)一步溫育24小時(shí)。之后在冷凍切片機(jī)上切制冠狀腦片(40μm)，然后或者用硫堇(BDH，澳大利亞)復(fù)染或者如下述進(jìn)行免疫組織化學(xué)檢測處理。
6、定量海馬內(nèi)神經(jīng)元的損失率如前人所述進(jìn)行對(duì)海馬CA1-CA3子域內(nèi)神經(jīng)元損失的定量(Tsirka等，1995；Tsirka等，1996)。從所有處理組制備背側(cè)海馬的五個(gè)連續(xù)切片，所述切片確保帶有KA注射和損傷區(qū)域。對(duì)這些切片的海馬子域(CA1-CA3)進(jìn)行照相掃描作圖(Camera lucida Zeichnungen)。與相同放大數(shù)倍下作圖的1mm標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比較以測定出子域全長。測定了含有有活力錐體神經(jīng)元(呈正常形態(tài))的組織長度和無神經(jīng)元(不含細(xì)胞，無硫堇染色)的組織長度。對(duì)這些代表各海馬子域完整神經(jīng)元和神經(jīng)元損失的長度取腦片平均值，并計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)差。
7、使用或不使用t-PA或DSPA的紋狀體內(nèi)NMDA興奮性毒性損傷麻醉野生型小鼠(c57/Black 6)并將其置于腦立體定位框架內(nèi)(參見上述)。單獨(dú)或與46μM rt-PA或46μM DSPAα1聯(lián)合用50nmol NMDA單側(cè)注射小鼠左側(cè)紋狀體。單獨(dú)注射t-PA和DSPAα1作為對(duì)照(濃度均為46μM)。注射坐標(biāo)為前囟-0.4mm、midolateral 2.0mm和背腹側(cè)2.5mm。以0.2μl/分鐘的速率5分鐘轉(zhuǎn)移溶液(對(duì)全部處理組總體積均為1μl)，注射后將針頭在原位再保留2分鐘以使液體回流降到最少。24小時(shí)后麻醉小鼠，用30ml PBS經(jīng)心臟灌注，接著用70ml 4％多聚甲醛溶液經(jīng)心臟灌注，用相同的固定劑固定24小時(shí)，之后在30％的蔗糖中進(jìn)一步溫育24小時(shí)。然后在冷凍切片機(jī)上切制腦片(40μm)，并置于明膠包被的載玻片上。
8、對(duì)注射NMDA后損傷體積的定量用Callaway等(2000)描述的方法完成對(duì)紋狀體損傷體積的定量。制備跨越損傷區(qū)域的10個(gè)連續(xù)冠狀切片。根據(jù)Callaway的方法使損傷區(qū)域可視化，并通過使用一臺(tái)微電腦成像裝置來定量損傷體積(MCID，Imaging Research Inc.，Brock University，Ontario，Canada)。
9、免疫組織化學(xué)根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法完成免疫組織化學(xué)。將冠狀切片在3％H2O2/10％甲醇中浸泡5分鐘，之后在5％正常山羊血清中溫育60分鐘。將切片用抗-GFAP抗體(1∶1000；Dako，Carpinteria，CA，USA)孵育過夜以檢測星形膠質(zhì)細(xì)胞，或用抗-MAC-1抗體(1∶1000；Serotec，Raleigh，NC，USA)孵育過夜以檢測小膠質(zhì)細(xì)胞或用抗-DSPA多克隆抗體(Schering AG，Berlin)孵育過夜。漂洗后，將切片用適當(dāng)?shù)纳锼鼗?Vector Laboratories，Burlingame，CA，USA)一起孵育。接著在用3，3′-Diaminobebzidin/0.03％H2O2最終染色之前用抗生物素蛋白/生物素一復(fù)合體(Vector Laboratories，Burlingame，CA，USA)孵育60分鐘。然后將切片置于明膠包被的載玻片上、干燥、脫水以及封上蓋玻片。
10、靜脈內(nèi)給藥t-PA或DSPA后被NMDA注射所誘導(dǎo)的組織損傷的擴(kuò)大為了誘導(dǎo)紋狀體的組織損傷，將小鼠立體定向注射NMDA。NDMA注射六小時(shí)后通過尾部靜脈注射t-PA或DSPA(100μl；10mg/kg)。作為對(duì)照注射100μl0.9％NaCl隨后灌注PBS。再經(jīng)過24小時(shí)后將動(dòng)物殺死測定損傷體積。
在第二次試驗(yàn)中多達(dá)15只小鼠的測試組用NDMA注射，NDMA注射24小時(shí)后輸注t-PA或DSPA，并測定相應(yīng)的組織損傷的擴(kuò)大。為了證明腦內(nèi)存在DSPA根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法用抗-DSPA抗體對(duì)冠狀切片染色。
B.結(jié)果1、輸注的t-PA或DSPA經(jīng)t-PA-/-小鼠的海馬分布，并保持其蛋白水解活性最初的試驗(yàn)是為了證實(shí)DSPA和t-PA在7天灌注期間都保持它們的蛋白水解活性而設(shè)計(jì)的。為該目的，將等分量的t-PA和DSPA(100nmol)在37℃和30℃水浴中孵育7天。為檢測蛋白水解活性，在非還原條件下將探針的5倍連續(xù)稀釋液進(jìn)行SDS-PAGE，用酶譜分析來評(píng)估蛋白水解活性。用一份冷凍保存7天的等分量t-PA和DSPA作對(duì)照。正如可從附圖1看到的，在25℃和37℃下孵育這段時(shí)間僅造成微弱的DSPA或t-PA活性喪失。
2、輸注后在t-PA-/-小鼠的海馬提取物中可鑒定到t-PA和DSPA活性首先必須證實(shí)所輸注的蛋白酶出現(xiàn)在被輸注動(dòng)物腦中，且在該區(qū)室中也仍然保持它們的蛋白水解活性。為此用t-PA或DSPA灌注t-PA-/-小鼠7天(參見上述)。然后用PBS經(jīng)心臟灌注小鼠，并切除腦。分離海馬同側(cè)和對(duì)側(cè)區(qū)以及小腦區(qū)(用作陰性對(duì)照)。將組織樣品(20μg)進(jìn)行SDS-PAGE，以及根據(jù)方法部分的說明作酶譜分析。正如可從附圖2看到的，t-PA和DSPA活性在海馬同側(cè)區(qū)都被檢測到了，但在對(duì)側(cè)區(qū)也檢測到一些活性。這表明，所注入的蛋白酶不僅在腦中保持了它們的活性，而且還擴(kuò)散進(jìn)了海馬區(qū)。作為對(duì)照，從小腦制備的提取物中沒有檢測到活性。
3、DSPA的免疫組織化學(xué)評(píng)價(jià)為進(jìn)一步證實(shí)DSPA確實(shí)已經(jīng)擴(kuò)散進(jìn)入了海馬區(qū)，輸注DSPA后對(duì)t-PA-/-小鼠的冠狀腦切片進(jìn)行免疫組織化學(xué)分析。在海馬區(qū)檢測到了DSPA-抗原，其中輸注區(qū)域的染色最深。這一結(jié)果證實(shí)所注入的DSPA是可溶的并確實(shí)出現(xiàn)在海馬中。
4、DSPA輸注不能恢復(fù)體內(nèi)由紅藻氨酸依賴的神經(jīng)變性t-PA-/-小鼠表現(xiàn)對(duì)紅藻氨酸依賴的神經(jīng)變性的抗性。然而，rt-PA在海馬內(nèi)的輸注完全恢復(fù)對(duì)紅藻氨酸-依賴的損傷的敏感性。為判定該模型中DSPA是否可以替代t-PA，用微滲泵將t-PA或DSPA輸注至t-PA-/-小鼠海馬內(nèi)。兩組都測試了12只小鼠。2天后給動(dòng)物注射紅藻氨酸，隨后是靜養(yǎng)期。5天后殺死動(dòng)物，取腦并處理(參見上述)。作為對(duì)照，用KA處理前還對(duì)t-PA-/-小鼠進(jìn)行了PBS注入(n＝3)。
制備冠狀腦切片，并用Nissl染色法檢測神經(jīng)元。如附圖4a和4b所示，用PBS灌注的t-PA-/-小鼠對(duì)KA有抗性。然而，輸注重組t-PA恢復(fù)了對(duì)KA處理的敏感性。相反，海馬區(qū)輸注相同濃度的DSPA不改變動(dòng)物對(duì)KA的敏感性。
那些結(jié)果的定量是以獲自各組12只小鼠的數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)的。在注入DSPA的12只小鼠中有兩只觀察到了輕微的神經(jīng)變性。其原因尚不清楚，可能與DSPA的存在無關(guān)。綜合數(shù)據(jù)已考慮了對(duì)這兩只動(dòng)物中觀察到的這一輕微下效應(yīng)。用t-PA處理的所有12只小鼠都對(duì)KA處理敏感。這些結(jié)果顯示，當(dāng)輸注等摩爾濃度的t-PA或DSPAα1時(shí)，只有t-PA給藥導(dǎo)致對(duì)KA誘導(dǎo)的神經(jīng)變性的敏感性的恢復(fù)。
5、DSPA輸注不導(dǎo)致小膠質(zhì)細(xì)胞激活由t-PA輸注產(chǎn)生的t-PA-/-小鼠KA敏感性的修復(fù)也導(dǎo)致小膠質(zhì)細(xì)胞激活(Rogove等，1999)。為確定在t-PA-或DSPA輸注及隨后的KA處理后小膠質(zhì)細(xì)胞激活的程度，用Mac-1抗體對(duì)小鼠冠狀切片進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色以確定激活的小膠質(zhì)細(xì)胞。t-PA輸注后對(duì)KA敏感性的恢復(fù)導(dǎo)致Mac-1陽性細(xì)胞的明顯增多。在用DSPA輸注的小鼠中未觀察到該現(xiàn)象。因此，KA處理后在DSPA的存在不導(dǎo)致小膠質(zhì)細(xì)胞的激活。
6、小鼠海馬區(qū)的DSPA和t-PA滴定用于輸注的t-PA濃度是以Tsirka等(1995)所述濃度為基礎(chǔ)的(100μl0.12mg/ml[1.85μM])。用低10倍量的t-PA(0.185μM)和高10倍量的DSPA(18.5μM)重復(fù)KA損傷試驗(yàn)。較低的t-PA濃度仍然能夠恢復(fù)對(duì)KA處理的敏感性(n＝3)。尤其值得注意的是KA處理后輸注濃度提高10倍的DSPA僅導(dǎo)致極少神經(jīng)元的損失。這些數(shù)據(jù)有利地表明，DSPA不導(dǎo)致對(duì)KA敏感性的增強(qiáng)。
7、t-PA和DSPA對(duì)野生型小鼠中NMDA-依賴型神經(jīng)變性的效應(yīng)還檢測了t-PA和DSPA在野生型小鼠神經(jīng)變性模型中的效應(yīng)。向這些小鼠紋狀體中注射t-PA確定地導(dǎo)致由谷氨酸類似物NMDA引起的神經(jīng)變性效應(yīng)的增強(qiáng)(Nicole等，2001)。
在t-PA或DSPA(各46μM)存在下向野生型小鼠紋狀體區(qū)注射總體積為1μl的NMDA。24小時(shí)后取腦，并根據(jù)Callaway的方法(Callaway等，2000)對(duì)損傷大小進(jìn)行定量(參見上述)。正如可從附圖7看到的，單獨(dú)注射NMDA在所有處理小鼠(n＝4)中產(chǎn)生可重復(fù)性損傷。當(dāng)聯(lián)合使用t-PA和NMDA時(shí)，損傷大小提高大約50％(P＜0.01，n＝4)。明顯相反的是，NMDA和相同濃度的DSPA的共同注射與單獨(dú)注射NMDA相比不導(dǎo)致?lián)p傷大小的增加。
單獨(dú)注射t-PA或DSPA不導(dǎo)致可檢測的神經(jīng)變性。單獨(dú)給藥時(shí)t-PA缺乏效應(yīng)與Nicole等(2001)的結(jié)果一致。這些數(shù)據(jù)顯示，DSPA的存在甚至在神經(jīng)變性事件過程中也不增強(qiáng)神經(jīng)變性。
為證實(shí)DSPA注射確實(shí)已經(jīng)擴(kuò)散進(jìn)入了海馬區(qū)，用DSPA抗體對(duì)冠狀切片進(jìn)行了免疫組織化學(xué)分析，檢測表明，DSPA確實(shí)進(jìn)入了紋狀體區(qū)。
用間接色原體測試進(jìn)行的纖溶酶原激活的動(dòng)力學(xué)分析根據(jù)Madison E.L.，Goldsmith E.J.，Gerard R.D.，Gething M.-J.，Sambrook J.F.(1989)Nature 339 721-724；Madison E.L.，Goldsmith E.J.，Gerard R.D.，Gething M.J.，Sambrook J.F.和Bassel-Duby R.S.(1990)Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A 87，3530-3533以及Madison E.L.，GoldsmithE.J.，Gething M.J.，Sambrook J.F.和Gerard R.D.(1990)J.Biol.(Chme265，21423-21426用底物L(fēng)ys-纖溶酶原(American Diagnostica)和Spectrozyme PL(American Diagnostica)進(jìn)行對(duì)t-PA活性的間接色原體測試。在有或無輔因子DESAFIB(American Diagnostica)存在下都進(jìn)行了測試。DESAFIB是用蛋白酶蛇毒凝血酶(Batroxobin)對(duì)高純度人纖維蛋白原進(jìn)行切割獲得的可溶性纖維蛋白單體制劑。蛇毒凝血酶切割在纖維蛋白原Aα-鏈中的Arg16-Gly17結(jié)合位點(diǎn)從而釋放纖維蛋白肽A。肽Gly-Pro-Arg-Pro不存在時(shí)，所產(chǎn)生的代表纖維蛋白I單體的des-AA-纖維蛋白原是可溶的。Lys-纖溶酶原的濃度變化范圍在DESAFIB存在時(shí)為0.0125-0.2μM以及在無輔因子存在時(shí)為0.9-16μM。
不同刺激物在下的間接色原體測試。
根據(jù)上述引用的出版物完成標(biāo)準(zhǔn)間接色原體測試。使用了含有0.25-1ng酶、0.2μM Lys-纖溶酶原和0.62μM Spectrozym PL且總體積為100μl的探針。測試在存在緩沖液、25μg/ml DESAFIB、100μg/ml纖維蛋白原溴化氰片斷(American Diagnostica)或100μg/ml刺激性13氨基酸肽P368下進(jìn)行。在微量滴定板中進(jìn)行分析，并持續(xù)1小時(shí)在“Molecular Devices Thermomax”中于波長405nm處每30秒檢測一次光學(xué)密度。反應(yīng)溫度為37℃。
8、DSPA在靜脈內(nèi)應(yīng)用時(shí)也不會(huì)造成神經(jīng)組織損傷的增加在小鼠的紋狀體中，組織損傷是通過注射NMDA誘導(dǎo)，接下來在其注射之后6或24小時(shí)靜脈內(nèi)施用t-PA或DSPA。與陰性對(duì)照相比，當(dāng)NMDA-注射后24小時(shí)靜脈輸注t-PA時(shí)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物被NMDA-注射所誘導(dǎo)的損傷組織擴(kuò)大了約30％；相比較而言，DSPA并不會(huì)引起這樣的組織損傷的增加(參見附圖18)。通過用抗-DSPA-抗體染色冠狀切片可以證明在NMDA注射后24小時(shí)靜脈施用的DSPA可以進(jìn)入到損傷的組織區(qū)域內(nèi)(參見附圖19)。而在NMDA-注射后6小時(shí)相應(yīng)地靜脈施用t-PA或DSPA，并不能檢測到損傷組織的增加。其原因可能是在施用t-PA或DSPA的這一時(shí)刻血腦屏障仍然能夠具有足夠的屏障作用。因此，DSPA在靜脈內(nèi)施用時(shí)也不會(huì)顯示出神經(jīng)毒性的副作用。
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權(quán)利要求
1.纖溶酶原激活因子在制備用于治療人類中風(fēng)的靜脈內(nèi)施用的治療劑中的用途，纖溶酶原激活因子的活性在纖維蛋白存在下至少增強(qiáng)650倍。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的纖溶酶原激活因子的用途，其特征在于使用吸血蝙蝠的纖溶酶原激活因子(DSPA)或其藥學(xué)上可接受的鹽。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的纖溶酶原激活因子的用途，其中纖溶酶原激活因子至少含有組氨酸或絲氨酸殘基，所述組氨酸或絲氨酸殘基與天冬氨酸殘基一起形成酶原三聯(lián)體的至少一部分。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的纖溶酶原激活因子的用途，其中絲氨酸殘基位于與t-PA的位點(diǎn)292至少部分同源的位點(diǎn)、組氨酸殘基位于與t-PA的位點(diǎn)305至少部分同源的位點(diǎn)和天冬氨酸殘基位于與t-PA的位點(diǎn)447至少部分同源的位點(diǎn)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的纖溶酶原激活因子的用途，其中纖溶酶原激活因子選自以下t-PA突變體組t-PA/R275E；t-PA/R275E，F(xiàn)305H；t-PA/R275E，F(xiàn)305H，A292S。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的纖溶酶原激活因子的用途，其中纖溶酶原激活因子帶有Asp194上的點(diǎn)突變或在同源位點(diǎn)上的天冬氨酸的點(diǎn)突變，致使在纖維蛋白不存在的情況下纖溶酶原激活因子的催化活性構(gòu)象的穩(wěn)定性降低。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的用途，其中Asp194被谷氨酸或天冬酰胺取代。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的用途，其特征在于，t-PA中Asp194被Glu194或Asn194所取代。
9.根據(jù)權(quán)利要求1的纖溶酶原激活因子的用途，其中纖溶酶原激活因子在自溶環(huán)中含有至少一個(gè)突變，該突變導(dǎo)致在不存在纖維蛋白的情況下纖溶酶原與纖溶酶原激活因子間的功能性相互作用降低。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的用途，其中在自溶環(huán)中的至少一個(gè)突變于野生型t-PA的氨基酸位點(diǎn)420至423或同源位點(diǎn)。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的用途，其中突變選自由以下突變體組成的組L420A、L420E、S421G、S421E、P422A、P422G、P422E、F423A和F423E。
12.根據(jù)權(quán)利要求1的纖溶酶原激活因子的用途，其中纖溶酶原激活因子是含有至少一個(gè)防止纖溶酶催化的點(diǎn)突變的酶原。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的纖溶酶原激活因子的用途，其中點(diǎn)突變位于t-PA的位點(diǎn)15或275或在與之同源的位點(diǎn)上。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的用途，其中谷氨酸在位點(diǎn)15或275處。
15.根據(jù)權(quán)利要求1的用途，其中組織纖溶酶原激活因子含有一個(gè)含有His420、Asn421、Ala422和Cys423的自溶環(huán)。
16.根據(jù)權(quán)利要求1的用途，其中纖溶酶原激活因子的特征在于具有位點(diǎn)194的點(diǎn)突變，該點(diǎn)突變導(dǎo)致在不存在纖維蛋白的情況下纖溶酶原激活因子催化活性構(gòu)象穩(wěn)定性降低。
17.根據(jù)權(quán)利要求16的用途，其中組織纖溶酶原激活因子的特征在于Phe194。
18.根據(jù)權(quán)利要求1的用途，其中纖溶酶原激活因子的特征在于具有防止纖溶酶催化的至少一個(gè)點(diǎn)突變。
19.根據(jù)權(quán)利要求18的用途，其中組織纖溶酶原激活因子含有Glu275。
20.根據(jù)權(quán)利要求1的用途，其中組織纖溶酶原激活因子含有根據(jù)Seq.IDNo.1所示的氨基酸序列。
21.根據(jù)權(quán)利要求1的用途，其中纖溶酶原激活因子是具有含有Val420、Thr421、Asp422和Ser423的自溶環(huán)的尿激酶。
22.根據(jù)權(quán)利要求21的用途，其中尿激酶的特征在于具有在位點(diǎn)194上的點(diǎn)突變，該點(diǎn)突變導(dǎo)致在不存在纖維蛋白的情況下尿激酶的催化活性構(gòu)象的穩(wěn)定性降低。
23.根據(jù)權(quán)利要求22的用途，其中尿激酶含有Glu194。
24.根據(jù)權(quán)利要求21到23的一項(xiàng)的用途，其中尿激酶的特征在于具有防止纖溶酶催化的至少一個(gè)點(diǎn)突變。
25.根據(jù)權(quán)利要求1的用途，其中纖溶酶原激活因子是含有Seq.ID No.2所示的氨基酸序列的尿激酶。
26.根據(jù)上述權(quán)利要求中一項(xiàng)的纖溶酶原激活因子的用途，其特征在于點(diǎn)滴輸注。
27.根據(jù)上述權(quán)利要求中一項(xiàng)的纖溶酶原激活因子的用途，其特征在于快速推注。
28.根據(jù)上述權(quán)利要求中一項(xiàng)的纖溶酶原激活因子的用途，其特征在于單次快速推注。
29.含有Ile275的尿激酶用于制備治療中風(fēng)的藥劑的用途，其中尿激酶是靜脈內(nèi)施用的。
30.根據(jù)上述權(quán)利要求中一項(xiàng)的纖溶酶原激活因子的用途，用于中風(fēng)發(fā)作3小時(shí)后治療人類中風(fēng)。
31.根據(jù)上述權(quán)利要求中一項(xiàng)的纖溶酶原激活因子的用途，用于在中風(fēng)發(fā)作6小時(shí)后治療人類中風(fēng)。
32.根據(jù)上述權(quán)利要求中一項(xiàng)的纖溶酶原激活因子的用途，用于在中風(fēng)發(fā)作9小時(shí)后治療人類中風(fēng)。
33.根據(jù)上述權(quán)利要求中一項(xiàng)的纖溶酶原激活因子的用途，用于治療中風(fēng)發(fā)作時(shí)間不確定的中風(fēng)病人。
34.根據(jù)上述權(quán)利要求中一項(xiàng)的纖溶酶原激活因子的用途，其在避免野生型t-PA神經(jīng)毒性的情況下用于中風(fēng)治療。
35.用于根據(jù)上述權(quán)利要求中一項(xiàng)的用途的藥物組合物，其含有在上述權(quán)利要求中所述的纖溶酶原激活因子以及至少一種額外的治療活性成分或其藥學(xué)可接受的鹽。
36.根據(jù)權(quán)利要求35的藥物組合物，其特征在于含有神經(jīng)保護(hù)試劑。
37.根據(jù)權(quán)利要求36的藥物組合物，其特征用于含有谷氨酸受體拮抗劑。
38.根據(jù)權(quán)利要求37的藥物組合物，其特征在于含有競爭性或非競爭性拮抗劑。
39.根據(jù)權(quán)利要求35的藥物組合物，其特征在于含有至少一種凝血酶抑制劑，優(yōu)選選自下列血栓調(diào)節(jié)蛋白、血栓調(diào)節(jié)蛋白類似物、Triabin、Pallidipin或Solulin。
40.根據(jù)權(quán)利要求35的藥物組合物，其特征在于含有至少一種抗凝血試劑，優(yōu)選選自下列抗凝血試劑水蛭素、肝素、乙酰水楊酸或安克洛酶。
41.根據(jù)權(quán)利要求35的藥物組合物，其特征在于含有抗炎癥物質(zhì)。
42.根據(jù)權(quán)利要求35的藥物組合物，其特征在于含有抗生素。
43.根據(jù)權(quán)利要求35的藥物組合物，其特征在于含有胞磷膽堿。
全文摘要
本發(fā)明涉及非神經(jīng)毒性纖溶酶原激活因子的用途，例如，源自Desmodus rotundus(DSPA)或經(jīng)遺傳學(xué)修飾的纖溶酶原激活因子，尤其是人源的，用于制備注射用治療人類中風(fēng)的藥物。
文檔編號(hào)A61P7/02GK1849133SQ200480011863
公開日2006年10月18日 申請(qǐng)日期2004年4月30日 優(yōu)先權(quán)日2003年5月2日
發(fā)明者M·索恩根, W·索恩根, W-D·施樂寧, R·麥德卡夫 申請(qǐng)人:帕昂德國有限公司