專利名稱：缺血疾病的治療方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及利用血管生成素(angiopoietin)-1(Ang1)或編碼Ang1的載體+治療缺血疾病的方法。本發(fā)明還涉及缺血疾病治療試劑盒，所述試劑盒包括Ang1或編碼Ang1的載體。
背景技術(shù)：
急性損傷或動脈堵塞導(dǎo)致的缺血有時導(dǎo)致肢指脫落(loss of finger)，機能障礙或?qū)е滤劳龅膰?yán)重疾病。由于社會環(huán)境的改變以及老齡化社會的到來，缺血性心臟病諸如急性心肌梗塞和重癥心絞痛尤其迅速增加，現(xiàn)在已經(jīng)占生活習(xí)慣相關(guān)疾病的主要部分。手術(shù)再血管化方法諸如經(jīng)皮經(jīng)腔冠狀動脈成型術(shù)(PTCA)和冠狀動脈旁路移植術(shù)(coronary artery bypassgraft)(CABG)主要地被用于治療急性心肌梗塞。這種常規(guī)治療方法與促進再血管化的遺傳改造技術(shù)的聯(lián)用使得心臟功能積極改善并且減少臥床時間成為可能。
美國首先進行了治療性血管生成的臨床試驗，由于血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)基因和蛋白質(zhì)的強血管內(nèi)皮增殖刺激活性，所述試驗利用血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)基因和蛋白質(zhì)，來治療冠狀動脈缺血(Losordo，D.W.，等(1998)Circulation.982800-2804；Rosengart，T.K.，等(1999)Circulation.100468-474；Lathi，K.G，等(2001)Anesth Analg.9219-25；Symes，J.F.，等(1999)Ann Thorac Surg.68830-836；discussion 836-837)和重癥肢體缺血(Baumgartner，I.，等(1998)Circulation.971114-1123；Isner，J，M.，等(1998)JVasc Surg.28964-973；discussion 973-965；Baumgartner，I.，等(2000)AnnIntern Med.132880-884)?，F(xiàn)在，VEGF基因治療的缺血性心臟病僅僅適用于嚴(yán)重心絞痛，并且不包括急性心肌梗塞。發(fā)現(xiàn)在急性缺血諸如心肌梗塞中，梗死后短時間內(nèi)，在局部心肌、外周血白細胞，單核細胞以及巨噬細胞中，VEGF生成增加，導(dǎo)致循環(huán)VEGF水平極高(Xu，X.，等(2001)J ThoracCardiovasc Surg.121735-742；Li，J.，等(1996)Am J Physiol.270H1803-1811；Ladoux，A.and C.Frelin.(1993)Biochem Biophys Res Commun.1951005-1010；Seko Y，等Clin Sci 92，453-454，1997；Banai S，等Cardiovasc Res.28，1176-1179，1994；Berse B，等Mol Biol Cell，3，211-220，1992；Taichman NS，J leukoc Biol，62，397-400，1997)。雖然VEGF生成增加的生理意義還沒被完全理解，認(rèn)為VEGF通過保護并修復(fù)缺血位點的血管而促進缺血的快速恢復(fù)(Banai S，等Cardiovasc Res.28，1176-1179，1994)。然而，過量投藥VEGF使脆弱血管以及未成熟的血管增多(Thurston，G，等(1999)Science.2862511-2514)，并誘導(dǎo)投藥部位的血管瘤形成(Schwarz，E.R.，等(2000)J AmColl Cardiol.351323-1330)。此外，Matsuno等最近報道心急梗塞中的高水VEGF可加重肺水腫并由此增加急性心肌梗塞的死亡率(Matsuno H等Blood 100，2487，2002)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了利用Ang1或編碼Ang1的載體治療缺血疾病的方法。本發(fā)明還提供用于治療缺血疾病的試劑盒，其包括Ang1或編碼Ang1的載體。
具有強血管生成誘導(dǎo)活性的VEGF165在心肌梗塞急性期由腺病毒載體在局部心肌內(nèi)表達。然后在存活大鼠的梗死的心臟中證實了血管生成誘導(dǎo)活性。然而，證實了在梗塞后4-5天的急性期，死亡率增加。死亡大鼠的活檢顯示明顯的胸膜積液(4ml-5ml)(數(shù)據(jù)省略)。由于VEGF增加毛細血管通透性，研究了VEGF165投藥對心肌梗塞后的肺內(nèi)血管通透性的影響。結(jié)果，血管通透性明顯增加(數(shù)據(jù)省略)。Matsuno等報道了心肌梗塞后α1-抗纖溶酶(antiplasmin)敲除小鼠中高水平VEGF的誘導(dǎo)，以及由此導(dǎo)致的肺水腫死亡率的增加。在本發(fā)明人進行的上述試驗中，根據(jù)心肌梗塞后的高VEGF水平，可推定VEGF165過表達增加肺中血管的通透性并誘導(dǎo)肺水腫，從而增加死亡率。本發(fā)明人的焦點在利用血管生成素-1(Ang1)來開發(fā)更安全有效的心肌梗塞基因療法。
Ang1是Tie-2受體的配體以及重要的血管生成因子，其與VEGF協(xié)同作用并參與血管生成、血管成熟和穩(wěn)定(Davis，S.，等(1996)Cell.871161-1169；Sato，T.N.，等(1995)Nature.37670-74)。據(jù)報道共同投藥Ang1和VEGF增加缺血動物模型中的再血管化(Jones，M.K.，等(2001)Gastroenterology.1211040-1047；Chae，J.K.，等(2000)。Arterioscler ThrombVasc Biol.202573-2578)。本發(fā)明人已經(jīng)報道在阻塞性動脈硬化癥模型中，聯(lián)用Ang1和VEGF基因進行基因治療增加VEGF的血管生成活性，同時減少諸如VEGF所致血管通透性增加引起的肺水腫等副作用(Ito Y.，等，Molecular Therapy，5(5)，S162，2002；WO02/100441)。本發(fā)明中，本發(fā)明人研究了將Ang1單獨投藥給缺血心臟的治療效果。通常認(rèn)為單獨的Ang1不刺激血管內(nèi)皮增殖，事實上，由于急性缺血諸如心肌梗塞中內(nèi)源性VEGF水平極高的狀態(tài)，在Ang1轉(zhuǎn)基因小鼠中，血管直徑增加而血管密度不增加(Thurston，G.，J.Anat.200575-580(2002))。然而，本發(fā)明人認(rèn)為血管生成效應(yīng)可通過單獨投藥Ang1獲得，這是。具體地，本發(fā)明人構(gòu)想出這樣一種策略在心肌梗塞急性期利用Ang1，與體內(nèi)活躍生成的VEGF協(xié)同來增加血管生成，從而促進再血管化，同時可降低增加的VEGF生成所伴隨的毒性。Ang1拮抗性地抑制炎性細胞因子誘導(dǎo)的血管通透性增加和血液凝固，所述炎性細胞因子諸如VEGF，IL-1和TNF，它們與心肌梗塞的加重有關(guān)(Thurston，G.(2002)J Anat.200575-580；Thurston，G.，等(2000)Nat Med.6460-463；Thurston，G.，等(1999)Science.2862511-2514)。本發(fā)明人預(yù)測Ang1投藥可防止心肌梗塞急性期中活躍產(chǎn)生的炎性細胞因子所引起的血管通透性增加以及血液凝固加速。
因此，本發(fā)明人制備了表達Ang1基因的腺病毒載體，并將所述載體經(jīng)心肌內(nèi)投藥給大鼠心肌梗塞模型。本發(fā)明人研究了血管生成效應(yīng)，梗塞區(qū)域縮小效應(yīng)，心臟功能的改善以及死亡率的降低。
動脈結(jié)扎誘導(dǎo)的心肌梗塞使得梗塞位點及其周圍區(qū)域的血管密度明顯下降。此外，還顯示心肌梗塞后，距離基因投藥部位較遠的中隔心肌中的血管密度降低。原因未知，但是推定其反映心肌梗塞后的心力衰竭。將腺病毒載體經(jīng)心肌內(nèi)投藥到模型大鼠中將被梗塞的位點的周圍區(qū)域。手術(shù)后5天檢測所投藥基因的表達水平，其在梗塞的心臟中(大約80％)與已投藥所述載體的正常心臟中相當(dāng)。由此證明在將基因注入梗塞周邊區(qū)域中的情況下，可獲得足夠高的基因表達水平。有趣的是，在投予Ang1基因的組中，不僅在梗死部位及其周圍區(qū)域中的血管密度增加，也在中隔區(qū)域中的血管密度也明顯增加。這提示Ang1不僅增加投藥位點的血管生成，還被分泌到血液中并也誘導(dǎo)遠處心肌中的血管生成。此外，直徑10μm或10μm以上的血管的數(shù)目在投予Ang1基因的組中明顯增加。此外，具有周細胞(提示更多的功能型血管)的血管明顯減少。這支持了Ang1誘導(dǎo)的血管的功能性更強的觀點。
此外，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)負鏈RNA病毒載體在缺血疾病的Ang1基因治療中非常有效。將基因?qū)胄募〖毎膶嶒灡砻骼秘撴淩NA病毒載體的情況與利用腺病毒載體的情況相比，前者將基因?qū)胄募〖毎男矢?。攜帶Ang1基因負鏈RNA病毒載體也顯示對心肌梗塞和肢體缺血具有明顯的治療效果。在用于治療心血管疾病具體是心臟疾病的載體中，腺病毒載體是最常用的，這是由于它們保證有效的基因轉(zhuǎn)移以及基因在非分裂細胞包括心肌細胞中的高水平表達。然而，已經(jīng)指出，由于腺病毒載體的高免疫原性，其可誘導(dǎo)炎癥，并由于它對肝臟過高的親和力而產(chǎn)生副作用。因此，需要更為安全有效的替代方法來取代利用腺病毒載體的基因?qū)爰夹g(shù)。已經(jīng)檢測腺伴隨病毒載體(AAV)，慢病毒載體等，并發(fā)現(xiàn)它們在心臟中顯示長期基因表達。然而，這些反轉(zhuǎn)錄病毒載體和DNA病毒載體有可能與宿主細胞核中的染色體相互作用，并整合到宿主染色體中。反之，負鏈RNA病毒載體可強烈表達其細胞質(zhì)中攜帶的基因而不會整合到宿主細胞染色體中，從而沒有造成染色體破壞的可能。負鏈RNA病毒載體的利用允許更為有效且安全的、缺血疾病的Ang1基因治療。
發(fā)現(xiàn)Ang1增加梗塞心肌中的血管密度。當(dāng)Ang1用于臨床時，評估血管密度的增加是否真正有助于梗塞區(qū)域的減小以及心功能的改善是重要的。梗塞區(qū)域在心肌梗塞后四周測定。發(fā)現(xiàn)在投藥Ang1基因的組中，梗塞區(qū)域減小，梗塞的壁變厚。發(fā)現(xiàn)心臟功能，具體是左心室短徑縮短率(FS)，收縮期左心室面積(LVAs)，以及左心室射血分?jǐn)?shù)(EF)得到改善。以前報道了肝細胞生長因子(HGF)，低氧誘導(dǎo)的因子-1α(HIF-1α)，和VEGF誘導(dǎo)大鼠心肌梗塞模型中的血管生成并減小梗塞區(qū)域，所述模型可通過將連接左前降支來制備。然而，有很少一些關(guān)于通過投藥單獨的血管生成因子來改善重癥心肌梗塞后的心功能的報道。據(jù)報道，只有在將血管生成因子與利用可補充心肌絕對質(zhì)量的胎兒心肌、ES細胞、肌母細胞等的細胞治療聯(lián)用時，心臟功能才得以有效改善(Yau，T.M.，Circulation 104I218-I222(2001)；Suzuki，K.，Circulation 104I207-212(2001)；Orlic，D.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9810344-10349(2001))。本發(fā)明首次證實，單獨投藥Ang1可改善梗塞后的心功能。在心肌梗塞急性期投藥Ang1可產(chǎn)生明顯的效果，諸如降低梗塞后死亡率，增加心肌中的血管數(shù)目，減小梗塞面積，以及改善心臟功能。因此，Ang1基因治療可以是急性心肌梗塞的新的有效療法。
本發(fā)明人還實施了基因治療，其中將單獨的Ang1基因投藥給嚴(yán)重肢體缺血的動物模型，所述投藥利用高表達Ang1的腺病毒載體以及負鏈RNA病毒載體。裸露DNA在心肌中以非常高的效率表達。反之，裸露的DNA載體所導(dǎo)入的基因的表達水平在骨骼肌中較低(實施例8)。因此，看上去直接將Ang1質(zhì)粒投藥給缺血肢體產(chǎn)生的效果不足以拯救肢體(WO02/100441)。然而，已經(jīng)清楚通過利用在骨骼肌中的表達效率高于裸露DNA的病毒載體，單獨投藥Ang1基因顯示明顯的肢體拯救效應(yīng)(實施例7，13，和14)。值得注意的發(fā)現(xiàn)是，作為Ang1基因投藥的結(jié)果，對肢體的拯救效果也在動脈生成(arteriogenesis)所致血液的組織灌注開始之前觀察到。因此，認(rèn)為Ang1基因治療不僅通過誘導(dǎo)血管生成而產(chǎn)生了治療效果，也在保護缺血組織中顯示意料之外的效果，后一效果開始于血管生成誘導(dǎo)以前的早期，是抗凋亡活性等的結(jié)果。因此，預(yù)期利用編碼Ang1的病毒載體投藥單獨的Ang1基因不僅在缺血性心臟病中也在常見的缺血疾病中產(chǎn)生治療效果，這對于質(zhì)粒載體而言是不可能的，所述常見的缺血疾病包括四肢缺血，與循環(huán)障礙有關(guān)的損傷，以及外傷性損傷諸如截肢，以及骨折。與VEGF聯(lián)用的常規(guī)治療存在過量VEGF增加血管通透性從而加重肺水腫等的危險。然而，當(dāng)單獨投藥編碼Ang1的病毒載體時，缺血可得以有效治療同時避免這些副作用。
具體地，本發(fā)明涉及利用Ang1或編碼Ang1的載體治療缺血疾病的方法，以及缺血疾病的治療試劑盒，所述試劑盒包括Ang1或編碼Ang1的載體，并更具體地涉及每個權(quán)利要求中所述的發(fā)明。本發(fā)明還涉及包括各個權(quán)利要求中所述的一或多種(或全部)發(fā)明的所需組合，具體涉及包含權(quán)利要求(從屬權(quán)利要求)中所述的一或多個(或全部)發(fā)明的所需組合，所述從屬權(quán)利要求引用相同的獨立權(quán)利要求(每個權(quán)利要求都涉及在其它任何權(quán)利要求中所述發(fā)明中所包含的發(fā)明)。每個獨立權(quán)利要求中描述的發(fā)明包括含有其從屬權(quán)利要求的任意組合的發(fā)明。具體地，本發(fā)明提供了[1]缺血性心臟病的治療方法，其包括投藥血管生成素-1或編碼血管生成素-1的載體的步驟。
[1]所述缺血性心臟病的治療方法，其包括投藥血管生成素-1或編碼血管生成素-1的載體的步驟，且其中沒有投藥血管內(nèi)皮生長因子。
[1]或[2]的方法，其中血管生成素-1或編碼血管生成素-1的載體是編碼血管生成素-1的病毒載體。
[3]的方法，其中所述病毒載體是腺病毒載體。
[3]的方法，其中所述病毒載體是負鏈RNA病毒載體。
[1]或[2]的方法，其中血管生成素-1或編碼血管生成素-1的載體是裸露的DNA。
[1]-[6]之一的方法，其中血管生成素-1或編碼血管生成素-1的載體是利用CA啟動子或具有與所述CA啟動子相同或更高轉(zhuǎn)錄活性的啟動子來驅(qū)動血管生成素-1表達的載體。
[1]-[7]之一的方法，其中血管生成素-1或編碼血管生成素-1的載體的投藥是注射入心肌。
治療缺血疾病的方法，其包括投藥編碼血管生成素-1的病毒載體的步驟。
[9]所述治療缺血疾病的方法，其包括投藥編碼血管生成素-1的病毒載體的步驟，并且其中沒有投藥血管內(nèi)皮生長因子。
[9]或[10]的方法，其中所述病毒載體是腺病毒載體。
[9]或[10]的方法，其中所述病毒載體是負鏈RNA病毒載體。
[9]-[12]之一的方法，其中所述載體的投藥是注射入缺血位點。
經(jīng)過遺傳修飾的間充質(zhì)細胞，其包括編碼血管生成素-1的外來基因。
[14]的間充質(zhì)細胞，其中已經(jīng)導(dǎo)入了編碼血管生成素-1的腺病毒載體。
[14]的間充質(zhì)細胞，其中已經(jīng)導(dǎo)入了編碼血管生成素-1的負鏈RNA病毒載體。
治療缺血的組合物，其包括[14]-[16]之一的間充質(zhì)細胞和可藥用的載體。
制備經(jīng)過遺傳修飾的間充質(zhì)細胞的方法，其中所述方法包括將間充質(zhì)細胞與攜帶基因的負鏈RNA病毒載體接觸的步驟。
[18]的方法，其中所述基因編碼血管生成素-1。
本發(fā)明涉及缺血性心臟病的治療方法，其包括投藥Ang1或編碼Ang1的載體的步驟。單獨的Ang1不具有刺激血管內(nèi)皮增殖的活性。不清楚單獨投藥Ang1基因是否對缺血性心臟病產(chǎn)生任何治療效果。然而，本發(fā)明中，證實了單獨投藥Ang1在心肌梗塞中產(chǎn)生明顯的治療效果。已知梗塞2-3天后，急性心肌梗塞患者血漿中的VEGF增加，并且在心肌梗塞后1-3天，心肌梗塞模型的心臟中的局部VEGF表達水平也增加，該高水平表達持續(xù)一周或更長時間。此外，證實VEGF的局部和血清水平在本發(fā)明人制備的大鼠心肌梗塞模型中增加(數(shù)據(jù)省略)。因此，投藥單獨的Ang1所產(chǎn)生的治療效果可以是與內(nèi)源性VEGF的聯(lián)用效果。過量VEGF增加肺血管通透性并導(dǎo)致肺水腫，從而增加死亡率。投藥單獨的Ang1而不給予VEGF允許內(nèi)源性VEGF和導(dǎo)入的基因所表達的Ang1協(xié)同作用以產(chǎn)生強的血管生成效應(yīng)，同時消除VEGF投藥產(chǎn)生的可能副作用。具體地，本發(fā)明提供了缺血性心臟病的治療方法，包括投藥Ang1或編碼Ang1的載體而不投藥血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)或其基因的步驟。投藥單獨的Ang1時梗塞位點及其周圍區(qū)域中的血管密度明顯增加，該血管密度增加效果與經(jīng)由腺病毒載體導(dǎo)入相同量的單獨VEGF165基因所產(chǎn)生的效果相似。根據(jù)本發(fā)明，缺血組織通過投藥Ang1基因而不投藥VEGF而以更為安全有效的方式得以保護。本發(fā)明治療缺血疾病及缺血性心臟病的方法是用于保護缺血組織，被排斥組織的再生以及被排斥組織中的再血管化的有用方法。
本文中，“血管生成素-1(Ang1)”指與Tie-2受體結(jié)合的配體，其通過受體活化信號轉(zhuǎn)導(dǎo)并促進血管生成。Tie-2是酪氨酸激酶受體并在內(nèi)皮細胞系中表達(Ac.No.NM_000459，protein ID.Q02763，NP_000450)(Ziegler，S.F.等，Oncogene 8(3)，663-670(1993)；Boon，L.M.等，Hum.Mol.Genet.3(9)，1583-1587(1994)；Dumont，D.J.等，Genomics 23(2)，512-513(1994)；GallioneCJ等，J.Med.Genet.32(3)，197-199(1995)；Vikkula M等，Cell 87(7)，1181-1190(1996)；Witzenbichler，B.等，J.Biol.Chem.273(29)，18514-18521(1998)；Asahara，T.等，Circ.Res.83(3)，233-240(1998)；Calvert，J.T.等，Hum.Mol.Genet.8(7)，1279-1289(1999))。Tie-2不僅從人而且從非人哺乳動物包括牛和小鼠中分離(Sato，T.N.等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90(20)，9355-9358(1993)；Iwama，A.等，Biochem.Biophys.Res.Commun.195(1)，301-309(1993))。野生型人Tie-2-編碼型DNA及其氨基酸序列分別顯示在SEQ ID NO1和2中。SEQ ID NO2所示人Tie-2配體以及上述促進血管生成的哺乳動物同源物可用于本發(fā)明中。本發(fā)明的Ang1包括天然存在的蛋白質(zhì)，也包括其經(jīng)修飾的蛋白質(zhì)以及部分肽，所述經(jīng)修飾的蛋白質(zhì)或部分肽具有與天然存在的Ang1相似的Tie-2配體功能。此外，其還可以是與Tie-2的細胞外結(jié)構(gòu)域像結(jié)合的抗-Tie-2抗體，或者具有Tie-2配體功能的非肽化合物。
哺乳動物Ang1蛋白質(zhì)已經(jīng)自多種哺乳動物種類分離，所述哺乳動物種類包括人，小鼠，大鼠，豬和牛(Davis，S.等，細胞87(7)，1161-1169(1996)；Valenzuela，D.M.等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.96(5)，1904-1909(1999)；Suri，C.等，Cell 87(7)，1171-1180(1996)；Valenzuela，D.M.等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.96(5)，1904-1909(1999)；Kim，I.，等，Cardiovasc.Res.49(4)，872-881(2001)；Mandriota，S.J.and Pepper，M.S.，Circ.Res.83(8)，852-859(1998)；Goede，V.等，Lab.Invest.78(11)，1385-1394(1998))(GenBank Ac.NoU83508，UNM_009640，AF233227，NM_053546；protein_IDAAB50557，NP_033770，O08538，AAKl4992，NP_445998，O18920)。野生型人Ang1-編碼型DNA及其氨基酸序列分別顯示于SEQ ID NO3和4。SEQ ID NO4所示人Ang1以及其上述的哺乳動物同源物也可優(yōu)選使用。
本發(fā)明的還包括含有以下氨基酸序列的蛋白質(zhì)，所述氨基酸序列具有人或其它哺乳動物Ang1氨基酸序列中的一或多個氨基酸取代，缺失和/或添加；含有以下氨基酸序列的蛋白質(zhì)，所述氨基酸序列與人或其它哺乳動物Ang1氨基酸序列具有70％或70％以上，優(yōu)選75％或75％以上，更優(yōu)選80％或80％以上，更優(yōu)選85％或85％以上，更優(yōu)選90％或90％以上，更優(yōu)選95％或95％以上同一性；以及由在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與包含人或其它哺乳動物Ang1基因的整個編碼區(qū)或所述基因一部分的核酸發(fā)生雜交的核酸所編碼的蛋白質(zhì)，其中所述蛋白質(zhì)與哺乳動物Tie-2受體結(jié)合并經(jīng)由所述受體活化信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而增加血管生成。這種蛋白質(zhì)可包含Ang1的多態(tài)性和剪接變體。
通過氨基酸取代，缺失和/或添加所改變的氨基酸數(shù)目通常為15個殘基或以下，優(yōu)選11個殘基或以下，更優(yōu)選9個殘基或以下，更優(yōu)選7個殘基或以下，更優(yōu)選5個殘基或以下。具體地，當(dāng)氨基酸被保守取代時，蛋白質(zhì)傾向于保持其原來的活性。保守取代包括以下各組中的氨基酸取代堿性氨基酸(例如，賴氨酸，精氨酸，組氨酸)，酸性氨基酸(例如，門冬氨酸，谷氨酸)，不帶電極性氨基酸(例如，甘氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，絲氨酸，蘇氨酸，色氨酸，半胱氨酸)，非極性氨基酸(例如，丙氨酸，纈氨酸，亮氨酸，異亮氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，甲硫氨酸，色氨酸)，β-分支氨基酸(例如，蘇氨酸，纈氨酸，異亮氨酸)和芳香族氨基酸(例如，酪氨酸，苯丙氨酸，色氨酸，組氨酸)。氨基酸序列可例如，利用BLASTP程序確定(Altschul，S.F.等，1990，J.Mol.Biol.215403-410)。具體地，blastp程序可用于該目的。例如，當(dāng)所述搜索利用BLAST在National Center for Biotechnology Information(NCBI)的網(wǎng)址中進行時，包括低復(fù)雜度(low complexity)的過濾物(filter)都被關(guān)閉并使用默認(rèn)參數(shù)(Altschul，S.F.等(1993)Nature Genet.3266-272；Madden，T.L.等(1996)Meth.Enzymol.266131-14l；Altschul，S.F.等(1997)Nucleic Acids Res.253389-3402；Zhang，J.&Madden，T.L.(1997)GenomeRes.7649-656)。例如，序列同一性可通過利用blast2sequences程序進行兩個序列的比對來測定，所述程序用于比較兩個序列(Tatiana A等(1999)FEMS Microbiol Lett.174247-250)。對缺口的處理類似于對錯配的處理。例如，計算與哺乳動物野生型Ang1蛋白質(zhì)的整個氨基酸序列的同一性。可選，同一性可通過雜交確定，其中從包含人或其它動物來源的Ang1蛋白質(zhì)編碼序列的核酸，或從雜交的靶核酸來制備探針。檢測探針與其它核酸的雜交。嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件包括在含有5×SSC，7％(W/V)SDS，100μg/ml變性的鮭精DNA，和5×Denhardt′s溶液(1×Denhardt′s溶液包含0.2％聚乙烯吡咯烷酮，0.2％牛血清白蛋白，和0.2％ Ficoll)的溶液中，在48℃，優(yōu)選50℃，更優(yōu)選52℃進行雜交，然后在與雜交溫度相同的溫度、震搖條件下洗滌2小時，更優(yōu)選在60℃，更優(yōu)選65℃，最優(yōu)選在68℃，在2×SSC中，優(yōu)選1×SSC中，更優(yōu)選0.5×SSC中，更優(yōu)選0.1×SSC中。
“編碼Ang1的載體”指包括編碼Ang1蛋白質(zhì)的核酸的載體。術(shù)語“編碼蛋白質(zhì)的”指核酸在有義和反義鏈中(在具體的病毒載體等中)含有編碼蛋白質(zhì)氨基酸序列的ORF，使得所述核酸能夠在適宜條件下表達所述蛋白質(zhì)。所述核酸可以是單鏈和雙鏈核酸。此外，所述核酸可以是DNA和RNA。所述載體包括質(zhì)粒載體，其它裸露的DNA以及病毒載體。
“裸露的DNA”指不與用于將核酸引入細胞的試劑結(jié)合的DNA，諸如病毒包膜，脂質(zhì)體和陽離子脂質(zhì)(Wolff等，1990，Science 247，1465-1468)。裸露的DNA可在溶于生理可接受的溶液例如無菌水，生理鹽水和緩沖液中以后使用。裸露的DNA諸如質(zhì)粒的注入是最為安全簡單的基因轉(zhuǎn)移方法，并且用作已得到認(rèn)可的臨床心血管疾病基因治療方案中的主要方法(Lee，Y.等，Biochem.Biophys.Res.Commun.2000；272230-235)。然而，所導(dǎo)入基因的相對低表達以及將所述基因?qū)胄募〖毎牡托蕮p害了這種方法的治療益處(Lin，H.等，Circulation 1990；822217-2221；Kass-eisler，A.等，Proc NatlAcad Sci USA 1993；9011498-11502)。例如，巨細胞病毒(CMV)啟動子是可得的最強效的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列之一，包括CMV啟動子的載體已經(jīng)普遍用于基因治療中(Foecking，M.K，and Hofstetter H.Gene 1986；45101-105)。然而，一些關(guān)于將質(zhì)粒注入骨骼肌內(nèi)的報道提示，當(dāng)時用強CMV啟動子時，所導(dǎo)入基因的表達水平或表達時間通常不足。
然而令人吃驚地，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)當(dāng)通過直接注射將裸露的質(zhì)粒引入心肌時，心肌中的表達水平比骨骼肌中的所述水平高大約一個數(shù)量級倍。利用20μg包含CA啟動子(其轉(zhuǎn)錄活性尤其強)的質(zhì)粒載體，被導(dǎo)入心臟的基因的表達水平，與利用6.0×109光學(xué)單位(optical unit)(OPU)的腺病毒載體所獲得的表達水平相當(dāng)。因此根據(jù)本發(fā)明的缺血疾病的基因治療可利用包含CA啟動子或具有與CA啟動子相當(dāng)或更高的轉(zhuǎn)錄活性的啟動子的質(zhì)粒來進行。CA啟動子是包含CMV立即早期增強子和雞β-肌動蛋白啟動子的嵌合啟動子(Niwa，H.等(1991)Gene.108193-199)。利用裸露的DNA的更為安全的基因治療可通過利用CA啟動子或具有與CA啟動子相當(dāng)或更高的轉(zhuǎn)錄活性的啟動子來實現(xiàn)。
將被使用的CMV立即早期增強子可以是來自所需CMV毒株的立即早期基因增強子。所述增強子包括SEQ ID NO5的核苷酸1-367的序列。將被使用的雞β-肌動蛋白啟動子包括這樣的DNA片段，其含有來自雞β-肌動蛋白基因組DNA的轉(zhuǎn)錄起始位點并具有啟動子活性。由于雞β-肌動蛋白基因的第一個內(nèi)含子具有轉(zhuǎn)錄增強活性，優(yōu)選使用包含至少部分該內(nèi)含子的基因組DNA片段。具體地，所述雞β-肌動蛋白啟動子包括SEQ ID NO5的核苷酸368-1615的序列。另一個基因的序列例如兔β-球蛋白內(nèi)含子受體序列可適宜地用作內(nèi)含子受體序列。本發(fā)明優(yōu)選的CA啟動子是DNA，其中包含部分該啟動子的雞β-肌動蛋白啟動子連于CMV立即早期增強子序列的下游，并隨后將所需的內(nèi)含子受體序列置于其下游。這種DNA的實例顯示于SEQ ID NO5。Ang1蛋白的編碼序列可連于上述序列的最后一個ATG，所述ATG作為起始密碼子。然而，CMV增強子中以及雞β-肌動蛋白基因中的序列多態(tài)性可存在于分離的毒株或分離的個體中。不必要利用SEQ ID NO5中所示與CMV立即早期增強子及雞β-肌動蛋白啟動子相同的區(qū)域。本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員可以構(gòu)建不同的變體類型。具有的轉(zhuǎn)錄活性等于或高于SEQ ID NO5所示啟動子的每種變體可優(yōu)選用于本發(fā)明。
如果SV40ori包含于載體中，優(yōu)選SV40ori序列被刪除。SV40大T抗原與一些類型的人癌癥相關(guān)，并且有可能含有SV40ori的載體可在患有SV40相關(guān)癌癥的患者中擴增(Martini，F(xiàn).等，Cancer 2002；941037-1048；Malkin，D.Lancet 2002；359812-813)。本發(fā)明人證實了從載體缺失SV40ori對導(dǎo)入的基因在心臟以及骨骼肌中的表達水平?jīng)]有影響(實施例8)。這一結(jié)果提示在CA啟動子的控制下表達Ang1的、不合SV40ori的載體，是心肌基因治療臨床應(yīng)用中最為安全有效的載體之一。具體地，其中的SV40ori被缺失的pCA1載體被認(rèn)為適于心肌基因治療。
此外，DNA可以適宜地與轉(zhuǎn)染劑聯(lián)用投藥。例如，轉(zhuǎn)染的效率可通過將DNA與脂質(zhì)體或所需的陽離子脂質(zhì)聯(lián)用而得以提高。
用于治療缺血疾病的本發(fā)明另一種優(yōu)選載體是病毒載體。Ang1可在心肌以及其它組織諸如骨骼肌中通過利用病毒載體而以足夠高的水平表達。所述病毒載體包括，但不限于腺病毒載體，腺伴隨病毒載體，反轉(zhuǎn)錄病毒載體，慢病毒載體，單純皰疹病毒載體，以及痘苗載體。優(yōu)選的病毒載體是腺病毒載體。所述腺病毒載體可以高效地將基因?qū)胄募〖毎⒏咚奖磉_所導(dǎo)入的基因。如實施例所示，表達Ang1的腺病毒載體對缺血的心臟和肢體產(chǎn)生明顯的治療效果。因此，腺病毒載體可適宜地用于本發(fā)明。本發(fā)明中，常規(guī)腺病毒載體可適宜地使用。在所述載體中，野生型病毒的基因可以被修飾，例如以提高外來基因的表達水平或減弱它們的抗原性。腺病毒載體可例如利用COS-TPC方法制備，所述方法由Saito等(Miyake，S.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 931320-1324(1996))開發(fā)。
當(dāng)將Ang1摻入載體中時，Ang1起始密碼子周圍的序列優(yōu)選制備成Kozak’s共有序列[例如，CC(G/A)CCATG]以增加Ang1基因表達的效率(Kozak，M.，Nucleic Acids Res 9(20)，5233(1981)；Kozak，M.，細胞44，283(1986)；Kozak，M.Nucleic Acids Res.158125(1987)；Kozak，M.，J.Mol.Biol.196，947(1987)；Kozak，M.，J.細胞Biol.108，229(1989)；Kozak，M.，Nucl.Acids Res.18，2828(1990))。
另一種優(yōu)選用于本發(fā)明的病毒載體是負鏈RNA病毒載體。如實施例中所示，負鏈RNA病毒載體可以在低于腺病毒滴度的滴度下獲得導(dǎo)入基因的更高表達。編碼Ang1的負鏈RNA病毒載體是最優(yōu)選用于本發(fā)明中的載體之一?！柏撴淩NA病毒”指包括負鏈(與編碼病毒蛋白質(zhì)的有義鏈互補的反義鏈)RNA基因組的病毒。負鏈RNA也成為“negative鏈RNA”。具體地，本發(fā)明中所用的負鏈RNA病毒包括單鏈負鏈RNA病毒(也稱“非-分節(jié)型負鏈RNA病毒”)?！皢捂渘egative鏈RNA病毒”指包括單鏈negative鏈(即，負鏈)RNA作為基因組的病毒。所述病毒包括副粘病毒(副粘病毒亞科(Paramyxoviridae)，諸如副粘病毒屬(Paramyxovirus))，麻疹病毒屬(Morbillivirus)，腮腺炎病毒屬(Rubulavirus)，以及肺病毒屬(Pneumovirus)；棒狀病毒(rhabdovirus)(棒狀病毒亞科(Rhabdoviridae)諸如水皰性口炎病毒屬(the genus Vesiculovirus)，狂犬病毒屬(the genus Lyssavirus)，和短時熱病毒屬(the genus Ephemerovirus))；絲狀病毒科(filovirus)(絲狀病毒亞科(Filoviridae))；正粘病毒(orthomyxovirus)(正粘病毒亞科(Orthomyxoviridae)諸如流感病毒A，B和C，以及Thogoto樣病毒)；布尼亞病毒(bunyavirus)(布尼亞病毒亞科(Bunyaviridae)諸如布尼亞病毒屬，漢坦病毒屬(the genusHantavirus)，奈諾病毒屬(the genus Nairovirus)，和白蛉病毒屬(the genusPhlebovirus))；以及沙粒病毒(arenavirus)(沙粒病毒亞科(Arenaviridae))。用于本發(fā)明中的負鏈RNA病毒載體可以是具有可傳播性的載體，或者不具有可傳播性的缺陷載體。術(shù)語“具有可傳播性”指病毒載體感染宿主細胞之后，所述病毒被復(fù)制并在細胞中產(chǎn)生感染性病毒粒子。
具體地，可優(yōu)選用于本發(fā)明中的負鏈RNA病毒包括仙臺病毒，新城疫病毒，腮腺炎病毒，麻疹病毒，呼吸道合胞病毒(RS病毒)，牛瘟病毒，犬瘟病毒，猴副流感病毒(SV5)，I，II和III型人副流感病毒，其屬于副粘病毒亞科；流感病毒，其屬于正粘病毒亞科；以及水皰性口炎和狂犬病病毒，其屬于棒狀病毒亞科。
可用于本發(fā)明中的病毒進一步包括仙臺病毒(SeV)，人副流感病毒-1(HPIV-1)，人副流感病毒-3(HPIV-3)，海豹瘟熱病毒(PDV)，犬瘟熱病毒(CDV)，海豚麻疹病毒(DMV)，小反芻獸疫病毒(PDPR)，麻疹病毒(MV)，牛瘟病毒(RPV)，亨德拉病毒(Hendra)，立百病毒(Nipah)，人副流感病毒-2(HPIV-2)，猴副流感病毒5(SV5)，人副流感病毒-4a(HPIV-4a)，人副流感病毒-4b(HPIV-4b)，腮腺炎病毒(Mumps)，和新城疫病毒(NDV)。更優(yōu)選，所述病毒包含選自以下病毒組成的組仙臺病毒(SeV)，人副流感病毒-1(HPIV-1)，人副流感病毒-3(HPIV-3)，海豹瘟熱病毒(PDV)，犬瘟熱病毒(CDV)，海豚麻疹病毒(DMV)，小反芻獸疫病毒(PDPR)，麻疹病毒(MV)，牛瘟病毒(RPV)，亨德拉病毒(Hendra)，和立百病毒(Nipah)。
更優(yōu)選，所述病毒屬于副粘病毒亞家族(包括呼吸道病毒屬，腮腺炎病毒屬(Rubulavirus)，麻疹病毒屬(Morbillivirus))或是其衍生物。更優(yōu)選，所述病毒屬于呼吸道病毒屬(也稱副粘病毒屬)或其衍生物。所述衍生物包括經(jīng)遺傳修飾的或化學(xué)修飾而不損害所述病毒導(dǎo)入基因的能力的病毒。本發(fā)明可用的呼吸道病毒屬病毒的實例包括1型人副流感病毒(HPIV-1)，3型人副流感病毒(HPIV-3)，3型牛副流感病毒(BPIV-3)，仙臺病毒(也稱1型鼠副流感病毒)，以及10型副流感病毒(SPIV-10)。本發(fā)明的副粘病毒最優(yōu)選仙臺病毒。這些病毒可源自天然毒株，野生型毒株，突變毒株，實驗室傳代的毒株，人工構(gòu)建的毒株等。
重組負鏈RNA病毒載體的重構(gòu)可通過已知方法實現(xiàn)(WO 97/16539；WO 97/16538；WO 00/70055；WO 00/70070；WO 03/025570；Durbin，A.P.等，Virology 235，323-332，1997；Whelan，S.P.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92，8388-8392，1995；Schnell.M.J.等，EMBO J.13，4195-4203，1994；Radecke，F(xiàn).等，EMBO J.14，5773-5784，1995；Lawson，N.D.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA92，4477-4481，1995；Garcin，D.等，EMBO J.14，6087-6094，1995；Kato，A.等，Genes Cell 1，569-579，1996；Baron，M.D.and Barrett，T.，J.Virol.71，1265-1271，1997；Bridgen，A.and Elliott，R.M.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93，15400-15404，1996；Hasan，M.K.等，J.Gen.Virol.782813-2820，1997；Kato，A.等，1997，EMBO J.16578-587；Yu，D.等，1997，Genes Cell 2457-466)。負鏈RNA病毒，包括副流感病毒，水皰性口炎病毒，狂犬病毒，麻疹病毒，牛瘟病毒和仙臺病毒，可利用所述方法從其DNA重構(gòu)。本發(fā)明的病毒可根據(jù)這些方法重構(gòu)。對于構(gòu)成病毒基因組的DNA，當(dāng)編碼構(gòu)成包膜的蛋白質(zhì)的基因(諸如F基因，HN基因，和/或M基因)已經(jīng)從病毒基因組缺失，感染性病毒粒子不能自動形成。然而，當(dāng)缺失的基因和/或來自另一種病毒的包膜基因(例如，編碼水皰性口炎病毒(VSV)G蛋白(VSV-G)的基因(J.Virology 39519-528(1981))被分別引入宿主細胞中并在所述細胞中表達時，可以形成感染性病毒粒子(Hirata，T.等，2002，J.Virol.法s，104125-133；Inoue，M.等，2003，J.Virol.776419-6429)。
負鏈RNA病毒的轉(zhuǎn)錄/復(fù)制僅在宿主細胞的細胞質(zhì)中進行，并且由于所述病毒沒有DNA相，該病毒不被整合入染色體(Lamb，R.A.and Kolakofsky，D.，ParamyxoviridaeThe viruses and their replication.InFields BN，KnipeDM，Howley PM，(eds).Fields Virology，3rd Edition，Vol.2.Lippincott-RavenPublishersPhiladelphia，1996，pp.1177-1204)。因此，所述載體不會引起安全性問題，諸如由于染色體異常導(dǎo)致的癌變(canceration)和永生化(immortalization)。負鏈RNA病毒的這個性質(zhì)是其作為載體使用時具有安全性的主要原因。根據(jù)異源基因表達的結(jié)果，例如，甚至在仙臺病毒的多次連續(xù)傳代之后，幾乎沒有發(fā)現(xiàn)核苷酸突變；因此基因組穩(wěn)定性高，且插入的異源基因可長期穩(wěn)定表達(Yu，D.等，Genes Cell 2，457-466(1997))。此外，該病毒的包裝柔軟性(flexibility)以及將被導(dǎo)入的適應(yīng)性(flexible)基因大小是有利的，這是由于該病毒沒有衣殼蛋白質(zhì)。此外，仙臺病毒是致病性的，并導(dǎo)致嚙齒動物中的肺炎，但在人類中不致病。這進一步由以前關(guān)于野生型仙臺病毒在經(jīng)鼻導(dǎo)入時，其在非人靈長類中不產(chǎn)生嚴(yán)重副作用的報道所支持(Hurwitz，J.L.等，Vaccine 15533-540，1997；Bitzer，M.等，J.Gene Med.5543-553，2003)。負鏈RNA病毒載體作為治療性載體在人缺血疾病的基因治療中非常有用。
回收的病毒載體可被純化到基本均質(zhì)。所述純化可利用常規(guī)純化/分離方法諸如過濾，離心，吸收和柱純化或其任意組合來實現(xiàn)。本文術(shù)語“基本純”指病毒載體構(gòu)成含有病毒載體的溶液的大部分。例如，如果被包含作為病毒載體組分的蛋白質(zhì)構(gòu)成溶液中總蛋白質(zhì)(除外被加入作為載體或穩(wěn)定劑的蛋白質(zhì))的10％或以上，優(yōu)選20％或以上，更優(yōu)選50％或以上，更優(yōu)選70％或以上，更優(yōu)選80％或以上，甚至更優(yōu)選90％或以上時，所述病毒載體組合物可被證實為基本純。例如，當(dāng)使用副粘病毒載體時，具體的純化方法包括，但不限于，例如使用纖維素硫酸酯或交聯(lián)的多糖硫酸酯的方法(日本專利申請Kokoku公開號(JP-B)S 62-30752(審查過的、批準(zhǔn)的日本專利申請，已公開處于異議期)；JP-B S 62-33879；和JP-B S62-30753)，以及基于含硫酸海藻糖的多糖和/或其降解產(chǎn)物的吸收的方法(WO 97/320l0)等。
本文中，“缺血疾病”指由于組織血供減少或被破壞所導(dǎo)致的功能異常，或組織變性或壞死，具體包括缺血性心臟病諸如心肌梗塞及心絞痛，以及肢體缺血，與循環(huán)障礙相關(guān)的損傷，外傷性損傷諸如截肢，以及骨折。具體地，本發(fā)明的缺血疾病不僅包括缺血疾病也包括作為損傷或損害結(jié)果的缺血狀態(tài)。投藥Ang1或編碼Ang1的載體抑制缺血位點周圍組織的壞死，并通過誘導(dǎo)血管生成改善它們的功能，以及其它效果諸如抗凋亡和抗炎效果。優(yōu)選，VEGF不包括在本發(fā)明的Ang1投藥中。明顯的治療效果可通過投藥單獨的Ang1而不投藥VEGF獲得。術(shù)語“不投藥VEGF”具體指在投藥Ang1或編碼Ang1的載體之前或之后的至少12小時內(nèi)，優(yōu)選24小時內(nèi)，更優(yōu)選14天內(nèi)，不投藥VEGF或編碼VEGF的載體。然而，只要在投予少量或痕量VEGF或編碼VEGF的載體之后，不能檢測到明顯的VEGF活性，就認(rèn)為沒有投予VEGF。血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)是對血管內(nèi)皮細胞特異的生長因子，目前分類為VEGF A，B，C，D和E，并被報道為血管通透性因子(Vascular Permeability Factor)(VPF)，見1989(Shibuya M.，“VEGF receptorand signal transduction”SAISHIN IGAKU 561728-1734，2001)。VEGF A進一步分成6種亞型。其中具體地，可溶性VEGF121和165具有強的血管增殖能力，目前用于臨床。本發(fā)明的VEGF具體包括VEGF165和VEGF121，優(yōu)選包括各個VEGF成員，包括VEGF165和VEGF121。具體地，本發(fā)明的治療方法對于伴隨內(nèi)源VEGF水平升高的缺血疾病非常有效。術(shù)語“內(nèi)源性VEGF水平升高”指血液或局部組織中的內(nèi)源VEGF水平高于健康個體中的所述水平，內(nèi)源VEGF水平在上述心肌梗塞，心絞痛，急性肢體缺血，心絞痛，急性肢體缺血，與循環(huán)障礙相關(guān)的損傷，截肢，骨折等中升高。
本文中，“缺血性心臟病”指心臟功能異常，或由于心肌血供減少或中斷導(dǎo)致的心肌變性或壞死，并具體包括心絞痛，心肌梗塞，以及一些類型的心肌病。將Ang1或編碼Ang1的載體投藥到缺血心臟中使得血管生成增多，心臟功能改善。本發(fā)明的方法對于伴隨內(nèi)源VEGF水平升高的缺血性心臟病非常有效，并適宜用于治療例如心絞痛，心肌梗塞和缺血性心肌病(Xu，X.，等(2001)J Thorac Cardiovasc Surg.121735-742；Banai，S.，等(1994)Cardiovasc Res.281176-1179；Sellke，F(xiàn).W.，等(1996)Am J Physiol.271H713-720)等。本發(fā)明方法對其最為有效的缺血性心臟病是心肌梗塞。
“心絞痛”指一種臨床綜合征，其主要癥狀是心肌中一過性缺血即缺氧導(dǎo)致的胸部不適(Ogawa H.，“pharmacotherapy for angina pectoris”，supplementary volume，Journal of Clinical and Experimental Medicine(Igaku noAyumi)；circulatory diseases352-355，1996，Eds.Yazaki Y.等IshiyakuPublisher Inc.)?！凹毙孕募」Ｈ笔侨毖孕呐K病，其中心肌壞死是由于冠狀動脈中的血流被阻塞導(dǎo)致的(Abu M.，and Takano T.，Acute心肌梗塞Thelatest therapy for circulatory diseases 2002-2003 II.coronary artery diseases37-42，2002，eds.，Shinoyama，S.and Yazaki Y.，Nankodo Co.Ltd.)。
當(dāng)根據(jù)本發(fā)明治療缺血疾病時，優(yōu)選既不投予VEGF也不投予任何其它血管生成因子或編碼血管生成因子的載體?！把苌梢蜃印敝概c參與血管化的細胞的發(fā)育，遷移或成熟直接或間接相關(guān)的因子。具體包括血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)，纖維母細胞生長因子(FGF)，上皮生長因子(EGF)，肝細胞生長因子(HGF)，胎盤來源的生長因子(PDGF)，單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)，胸苷磷酸化酶(TP)，血管生成素，ephrin(Eph)，基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)，以及金屬蛋白酶的組織抑制物(TIMP)(Kuwano，M.等，AngiogenesisInt.Med.40565-572(2001)；Freedman，S.B.等，Ann.Intern.Med.13654-71(2002))。術(shù)語“沒有投藥”指沒有將導(dǎo)致所述血管生成因子可明顯可檢測到的劑量或更高的劑量給藥個體。
Ang1或編碼Ang1的載體可被系統(tǒng)投藥或局部投藥給缺血組織。即使以高劑量投藥，Ang1也不產(chǎn)生明顯的副作用。因此，缺血可通過系統(tǒng)投藥Ang1治療。Ang1或編碼Ang1的載體可直接或經(jīng)由載體導(dǎo)入。所述載體應(yīng)為生理可接受的，并包括有機物質(zhì)諸如生物聚合物以及無機物質(zhì)諸如羥磷灰石；具體地，膠原基質(zhì)，多聚乳酸聚合物或共聚物，聚乙二醇聚合物或共聚物，以及其化學(xué)衍生物。此外，所述載體可以是上述生理可接受的物質(zhì)的混合的組合物。將被使用的載體不受限制，條件是其為生理可接受的載體，并且可使用所需的載體包括病毒載體以及非病毒載體。所述載體可以以源自患者本人的、載體處理的細胞的形式投藥。例如，所述載體或已經(jīng)導(dǎo)入了所述載體的細胞可以經(jīng)由肌內(nèi)注射(注射入心肌或骨骼肌)或靜脈內(nèi)(體內(nèi)及離體投藥)投藥。已經(jīng)系統(tǒng)投藥(經(jīng)由肌內(nèi)或靜脈內(nèi)注射)的細胞可轉(zhuǎn)移到損傷位點并促進缺血組織的存活。例如，最近報道間充質(zhì)干細胞(MSC)不僅分化為骨細胞，軟骨細胞，脂肪細胞等，也保持分化成骨骼肌細胞，心肌和神經(jīng)元的能力。因此，這些干細胞作為再生藥物的細胞來源而得到廣泛的研究。預(yù)期根據(jù)本發(fā)明將Ang1基因?qū)隡SC并利用產(chǎn)生的細胞治療缺血將獲得極好的治療效果。MSC可例如通過利用Tsuda，H.等Mol Ther 7(3)354-65(2003)中所述的方法制備。對于局部投予心臟，可將Ang1或編碼Ang1的載體注入心肌?？蛇x，其中導(dǎo)入了編碼Ang1的載體的細胞可被植入心肌(離體投藥)。所述注射可通過利用生產(chǎn)的產(chǎn)品諸如標(biāo)準(zhǔn)藥物注射器，以及外部留置連續(xù)輸注器來實現(xiàn)。
對于病毒的情況，可例如在缺血位點周圍的存活肌肉(骨骼肌，心肌等)中的一或多個位點(2-10個位點)投藥所述劑量。對于在腺病毒的情況，所述劑量優(yōu)選例如，1010-1013pfu/機體，更優(yōu)選1011-1013pfu/機體。負鏈RNA病毒的劑量優(yōu)選例如，2×105-5×1011CIU。裸露的DNA可被投予缺血位點周圍的存活肌肉中的一或多個位點(例如2-10個位點)。每個位點的注入劑量為例如，10μg-10mg，更優(yōu)選100μg-1mg。當(dāng)進行已經(jīng)導(dǎo)入了載體的細胞的離體投藥時，所述載體在離體條件下被導(dǎo)入靶細胞(例如，在試管或培養(yǎng)皿中)，例如，以感染復(fù)數(shù)(MOI)1-500進行。本發(fā)明中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)負鏈RNA病毒載體以非常高的效率將外來基因?qū)腴g充質(zhì)細胞。因此，在間充質(zhì)細胞用于離體投藥中的情況下，優(yōu)選利用負鏈RNA病毒載體將基因引入間充質(zhì)細胞。當(dāng)使用導(dǎo)入了Ang-1基因的細胞時，例如，105-109細胞，優(yōu)選106-108細胞可被移植到缺血組織。當(dāng)使用蛋白質(zhì)制備物時，可將其投藥給缺血位點周圍的一或多個位點(例如2-10個位點)。所述劑量優(yōu)選例如，1μg/kg-10mg/kg，更優(yōu)選10μg/kg-1mg/kg?？蛇x，所述載體或蛋白制備物可例如數(shù)次(1-10次)投予動脈，所述動脈導(dǎo)致組織缺血(例如缺血心臟的冠狀動脈)。在這種情況下，當(dāng)使用蛋白制備物時，每個位點的劑量優(yōu)選例如，1μg/kg-10mg/kg，更優(yōu)選10μg/kg-1mg/kg。載體或蛋白制備物可經(jīng)靜脈內(nèi)投藥數(shù)次(1-10次)或可連續(xù)投藥。在這種情況下，當(dāng)使用蛋白制備物時，總劑量優(yōu)選例如，1μg/kg-10mg/kg，更優(yōu)選10μg/kg-1mg/kg。當(dāng)使用載體時，可投藥與上述肌內(nèi)注射劑量相同的劑量。所述劑量見，F(xiàn)reedmanSB等Ann Intern Med 13654-71(2002)。
然而，載體劑量可根據(jù)患者體重，年齡，性別和癥狀；被投藥組合物的劑量；投藥所述載體的方法等而不同。本領(lǐng)域技術(shù)人員可適宜調(diào)整劑量。在臨床可接受的副反應(yīng)限度內(nèi)，投藥頻率可為1到數(shù)次?？梢杂幸换蚨鄠€投藥位點。非人動物的每kg劑量可以與人的相同，或者可選從上述劑量換算，例如基于受試動物和人的缺血器官(諸如心臟)之間的體積比(例如，均值)。接受本發(fā)明治療的動物包括人和其它所需哺乳動物，具體為人，猴，小鼠，大鼠，兔，綿羊，牛和狗。
本發(fā)明的治療方法可單獨進行和與其它標(biāo)準(zhǔn)和先進的方法聯(lián)用。例如，本發(fā)明治療缺血性心臟病的方法可優(yōu)選與手術(shù)再血管化聯(lián)用，諸如經(jīng)皮經(jīng)腔冠狀血管成形術(shù)(PTCA)或冠狀動脈旁路移植(CABG)。與本發(fā)明的治療方法的聯(lián)用可選可以改善心臟功能并減少臥床時間。當(dāng)與促進梗塞區(qū)域中的重構(gòu)例如梗塞后心肌的再生的方法聯(lián)用時，利用本發(fā)明的Ang1進行治療也被預(yù)期更為有效。Ang1基因治療增加梗塞厚度，其改善舒張參數(shù)諸如LVAd和Edd的效果相對較弱，所述改善見于心肌的絕對質(zhì)量通過聯(lián)合使用細胞治療等得到改善的同時。據(jù)推定，Ang1對收縮體積、射血分?jǐn)?shù)等的改善可通過增加存活心肌諸如梗塞周圍心肌中的血管密度來防止梗塞周圍心肌的功能低下，然后通過促進存活心肌的代償性肥大而改善心肌功能。因此，當(dāng)考慮胎兒心肌、ES細胞、成肌細胞、間充質(zhì)細胞等的移植，和誘導(dǎo)細胞遷移進入梗塞位點的情況下，優(yōu)選將Ang1與可補償心肌絕對質(zhì)量缺乏的細胞治療聯(lián)用。也可通過在離體條件下將Ang1基因誘導(dǎo)進入這些細胞而改進對缺血心肌的治療效果。
本發(fā)明還提供了包括Ang1或編碼Ang1的載體的治療性藥劑，其用于缺血性心臟病。本發(fā)明還提供了Ang1或編碼Ang1的載體在投藥缺血心臟以治療缺血性心臟病中的用途。此外，本發(fā)明還提供了Ang1或編碼Ang1的載體在制備用于缺血性心臟病的治療性藥劑中的用途，其用于將Ang1或編碼Ang1的載體投藥給缺血心臟。具體地，本發(fā)明提供了包括Ang1或編碼Ang1的載體的治療性藥劑，所述藥劑用于缺血性心臟病，以將Ang1或編碼Ang1的載體投藥到缺血心臟而不投藥VEGF或VEGF載體。此外，本發(fā)明還提供了Ang1或編碼Ang1的載體在治療缺血性心臟病中的用途，其中將Ang1或編碼Ang1的載體投藥缺血心臟而不投藥VEGF或VEGF載體.此外，本發(fā)明還提供了Ang1或編碼Ang1的載體在制備缺血性心臟病的治療性藥劑中的用途，所述藥劑用于將Ang1或編碼Ang1的載體投予缺血心臟而不投藥VEGF或VEGF載體。根據(jù)治療藥劑以及上述用途，優(yōu)選不投藥VEGF和任何其它血管生成因子或編碼血管生成因子的載體。此外，Ang1或編碼Ang1的載體優(yōu)選被配制用于局部投予缺血心臟。例如，所述配制劑優(yōu)選通過注入心肌來投藥。編碼Ang1的載體優(yōu)選編碼Ang1的病毒載體或裸露的DNA。所述病毒載體沒有具體限制，但腺病毒載體和負鏈RNA病毒載體是具體優(yōu)選的。裸露的DNA包括質(zhì)粒，其可為環(huán)狀和線性的。優(yōu)選所述質(zhì)粒不包含SV40ori。驅(qū)動Ang1轉(zhuǎn)錄的載體啟動子優(yōu)選具有強轉(zhuǎn)錄活性。例如，可適宜地使用CA啟動子。
本發(fā)明還涉及用于治療缺血性心臟病的試劑盒，其包括(a)Ang1或編碼Ang1的載體，和(b)含有當(dāng)投藥Ang1或編碼Ang1的載體時，不應(yīng)投藥含有VEGF或VEGF載體的說明的記錄介質(zhì)，或與該說明書的鏈接(link)。所述試劑盒用于治療至少一種缺血性心臟病，包括心肌梗塞和心絞痛。本發(fā)明的試劑盒優(yōu)選用于治療心絞痛和/或急性心肌梗塞。所述試劑盒包含上述Ang1或編碼Ang1的載體。編碼Ang1的載體優(yōu)選是裸露的DNA或編碼Ang1的病毒載體。所述病毒載體不受具體限制，但具體優(yōu)選腺病毒載體和負鏈RNA病毒載體。所述試劑盒中的Ang1或編碼Ang1的載體可以是除包含Ang1外，還包含所需的可藥用載體和/或添加劑的組合物。例如，所述組合物可包含無菌水，生理鹽水，標(biāo)準(zhǔn)緩沖液(例如磷酸，檸檬酸和其它有機酸)，穩(wěn)定劑，鹽，抗氧化劑(諸如抗壞血酸)，去污劑，助懸劑，等張劑或防腐劑。對于局部投藥，Ang1或編碼Ang1的載體優(yōu)選與以下物質(zhì)聯(lián)用有機物質(zhì)諸如生物聚合物，無機物質(zhì)諸如羥磷灰石，具體地，膠原基質(zhì)，多聚乳酸聚合物或共聚物，聚乙二醇聚合物或共聚物，以及其化學(xué)衍生物。一個優(yōu)選實施方案中，Ang1或編碼Ang1的載體被制備成適于注射的劑型。為此，Ang1或編碼Ang1的載體優(yōu)選溶解于可藥用的含水溶液，或優(yōu)選可溶的凍干配制劑等。本發(fā)明的試劑盒可進一步包含所需的可藥用載體，其可用于溶解或稀釋Ang1或編碼Ang1的載體。所述載體包括，例如，蒸餾水和生理鹽水。
本發(fā)明還提供了缺血疾病的治療藥劑，其包括編碼Ang1的病毒載體。本發(fā)明還提供了編碼Ang1的病毒載體用于治療缺血疾病的用途。此外，本發(fā)明提供了編碼Ang1的病毒載體用于制備缺血疾病的治療藥劑的用途，其中的治療藥劑包括編碼Ang1的病毒載體。具體地，本發(fā)明提供了缺血疾病的治療藥劑，其包括編碼Ang1的病毒載體且其用于將Ang1病毒載體投予患有缺血的個體而不投予VEGF或VEGF載體。此外，本發(fā)明提供了用于治療缺血疾病的、編碼Ang1的病毒載體在將Ang1病毒載體投予患有缺血的個體而不投予VEGF或VEGF載體中的用途。此外，本發(fā)明提供了Ang1病毒載體在制備缺血疾病的治療藥劑中的用途，其用于將編碼Ang1的病毒載體投予患有缺血的個體而不投予VEGF或VEGF載體.在上述治療藥劑和用途中，優(yōu)選既不投藥VEGF也不投藥任何其它編碼這些因子的血管生成因子或載體。此外，編碼Ang1的病毒載體優(yōu)選配制成用于局部投予缺血組織。優(yōu)選將使用的病毒載體是腺病毒載體和負鏈RNA病毒載體。
本發(fā)明還涉及用于治療缺血性心臟病的試劑盒，其包括(a)Ang1或編碼Ang1的載體，和(b)含有當(dāng)投藥Ang1或編碼Ang1的載體時，不應(yīng)投藥含有VEGF或VEGF載體的說明的記錄介質(zhì)，或與該說明書的鏈接。所述試劑盒是用于治療以下疾病中的至少一種的試劑盒缺血性心臟病諸如心肌梗塞和絞痛，以及缺血疾病諸如四肢缺血，與循環(huán)障礙相關(guān)的損傷，外傷性損傷包括截肢和骨折。所述試劑盒包含上述Ang1或編碼Ang1的載體。所述病毒載體不受具體限制，但具體優(yōu)選腺病毒載體和負鏈RNA病毒載體。所述試劑盒中的Ang1或編碼Ang1的載體可以是包含除載體外，還包含所需的可藥用載體和/或添加劑的組合物。例如，所述組合物可包含無菌水，生理鹽水，標(biāo)準(zhǔn)緩沖液(例如磷酸，檸檬酸和其它有機酸)，穩(wěn)定劑，鹽，抗氧化劑(諸如抗壞血酸)，去污劑，助懸劑，等張劑或防腐劑。對于局部投藥，Ang1或編碼Ang1的載體優(yōu)選與以下物質(zhì)聯(lián)用有機物質(zhì)諸如生物聚合物，無機物質(zhì)諸如羥磷灰石，具體為膠原基質(zhì)，多聚乳酸聚合物或共聚物，聚乙二醇聚合物或共聚物，以及其化學(xué)衍生物。一個優(yōu)選實施方案中，Ang1或編碼Ang1的載體被制備成適于注射的劑型。為此，Ang1或編碼Ang1的載體優(yōu)選溶解于可藥用的含水溶液，或優(yōu)選是可溶的凍干配制劑等。本發(fā)明的試劑盒可進一步包含所需的可藥用載體，其可用于溶解或稀釋Ang1或編碼Ang1的載體。所述載體包括，例如，蒸餾水和生理鹽水。
本發(fā)明的試劑盒含有當(dāng)投藥Ang1或編碼Ang1的載體時，不應(yīng)投藥含有VEGF或VEGF載體的說明的記錄介質(zhì)，或與該說明書的鏈接。“不應(yīng)投藥VEGF或VEGF載體的說明”指例如，投藥VEGF或VEGF應(yīng)被禁忌或避免的說明或建議。具體地，所述說明指示不應(yīng)在投藥Ang1或編碼Ang1的載體以前或以后的至少12小時以內(nèi)投藥VEGF或編碼VEGF的載體。優(yōu)選，所述說明指示不應(yīng)在投藥Ang1或編碼Ang1的載體之前后之后的24小時內(nèi)，優(yōu)選14天內(nèi)投藥VEGF或編碼VEGF的載體。VEGF包括VEGF165和VEGF121，具體且優(yōu)選VEGF的各個成員包括VEGF165和VEGF121。本發(fā)明的試劑盒優(yōu)選包括將治療有效量的Ang1或編碼Ang1的載體投藥給患病個體的說明，或所述說明的鏈接。記錄介質(zhì)包括所需的記錄基質(zhì)，例如打印介質(zhì)諸如紙和塑料，以及計算機可讀介質(zhì)諸如軟盤(FD)，光盤(CD)，數(shù)字視頻盤(DVD)，以及半導(dǎo)體存儲器(semiconductor memory)。記錄介質(zhì)的常見例子是附于該試劑盒的說明。“鏈接”指所述說明，其指示當(dāng)投藥Ang1或編碼Ang1的載體時不應(yīng)投藥VEGF121，所述說明通過試劑盒中的標(biāo)記等連接使得所述標(biāo)記提供與該說明的快捷連接，而不是直接包含于該試劑盒中。例如，當(dāng)所述說明含在附頁或URL中時，所述說明可給出參考附頁或URL的指導(dǎo)或提示。
利用負鏈RNA病毒載體將基因引入間充質(zhì)細胞在下文描述。本發(fā)明的間充質(zhì)細胞優(yōu)選指骨髓細胞(骨髓細胞的單個核細胞級分組分)，臍血細胞或外周血細胞，間充質(zhì)干細胞，源自這些細胞的細胞等。本發(fā)明的間充質(zhì)細胞還包括，例如與間充質(zhì)有關(guān)的細胞以及中胚層干細胞。即使本文作為“間充質(zhì)細胞”所述的細胞將來被分類成非間充質(zhì)細胞，所述細胞可適宜地用于本發(fā)明中。
骨髓含有兩種類型的干細胞造血干細胞和“間充質(zhì)干細胞(MSC)”。本文中，“干細胞”通常指未分化的細胞，其在構(gòu)成活體的細胞的增殖和分化的生理過程中具有自我復(fù)制并分化成具有具體功能的細胞?！霸煅杉毎敝阜只杉t細胞、白細胞或血小板的干細胞。間充質(zhì)干細胞可分化成神經(jīng)元、心血管系統(tǒng)、內(nèi)部器官、骨、軟骨、脂肪或肌肉。
本發(fā)明中，主要使用間充質(zhì)干細胞；然而也可使用機體內(nèi)的造血干細胞和其它干細胞(前體細胞)。間充質(zhì)干細胞可通過自骨髓回收的骨髓細胞分離而獲得。和間充質(zhì)干細胞一樣，盡管含有間充質(zhì)干細胞的骨髓細胞效力較低，其可用于治療。
此外，可能間充質(zhì)干細胞-樣細胞可自外周血制備。因此，其功能與間充質(zhì)干細胞的功能相似的細胞可通過在外周血中培養(yǎng)細胞而制備并用于本發(fā)明。
本文中，“中胚層干細胞”指構(gòu)成組織的細胞，其在胚胎學(xué)上被分類為中胚層，所述細胞包含血細胞。此外，“中胚層干細胞”指這樣的細胞，其可制造(分裂或增殖成)具有與其相同的能力的細胞拷貝，并且其可分化成構(gòu)成中胚層組織的所有類型的細胞。中胚層干細胞包括，但不限于，具有標(biāo)記諸如SH2(+)，SH3(+)，SH4(+)，CD29(+)，CD44(+)，CD14(-)，CD34(-)，和CD45(-)的細胞。此外，所謂的“間充質(zhì)-相關(guān)的干細胞”也包含在本發(fā)明的中胚層干細胞中。
上述間充質(zhì)-相關(guān)的細胞指間充質(zhì)干細胞，間充質(zhì)細胞，間充質(zhì)細胞前體細胞以及來源自間充質(zhì)細胞的細胞。
“間充質(zhì)干細胞”指干細胞，其可獲自，例如骨髓，外周血，皮膚，發(fā)根，肌肉組織，子宮內(nèi)膜，血液，臍血，以及各種組織的原代培養(yǎng)物。功能等同于間充質(zhì)干細胞的細胞也包括在本發(fā)明的間充質(zhì)干細胞中，其可通過在外周血中培養(yǎng)細胞獲得。
本發(fā)明優(yōu)選的間充質(zhì)細胞包括骨髓細胞和骨髓干細胞(間充質(zhì)干細胞)。此外，本發(fā)明優(yōu)選細胞的實例是臍血細胞，外周血細胞，和胎肝細胞。
本發(fā)明一個優(yōu)選實施方案中，骨髓細胞，臍血細胞，外周血細胞，和胎肝細胞包括分離自骨髓，臍血，外周血，或胎肝的細胞級分，以及可分化成心血管系統(tǒng)細胞或心肌細胞的細胞級分。
另一實施方案中，所述細胞級分包括中胚層肝細胞，其具有SH2(+)，SH3(+)，SH4(+)，CD29(+)，CD44(+)，CD14(-)，CD34(-)，和CD45(-)。
除了以上內(nèi)容，本發(fā)明的細胞級分包括含有間質(zhì)細胞的細胞級分，所述細胞包括以下細胞標(biāo)記Lin(-)，Sca-1(+)，CD10(+)，CD11D(+)，CD44(+)，CD45(+)，CD71(+)，CD90(+)，CD105(+)，CDw123(+)，CD127(+)，CD164(+)，纖連蛋白(+)，ALPH(+)，和膠原酶-1(+)；以及含有AC133(+)細胞的細胞級分。
本發(fā)明的骨髓細胞，臍血細胞，或外周血細胞(cell fractions)通常來自脊椎動物。所述細胞優(yōu)選優(yōu)選來自哺乳動物(例如，小鼠，大鼠，兔，豬，狗，猴，和人)，但不限于此。
本發(fā)明中，發(fā)現(xiàn)其中導(dǎo)入了Ang1基因的間充質(zhì)細胞與未經(jīng)遺傳修飾的間充質(zhì)細胞相比，前者對缺血產(chǎn)生更強的治療效果。因此，用于治療缺血的細胞可通過將外源Ang1基因?qū)腴g充質(zhì)細胞來制備。缺血組織中的血管生成和再血管化可通過將這些細胞投予缺血組織而得以促進。Ang1基因可利用上述質(zhì)粒載體，其它裸露的DNA或病毒載體引入間充質(zhì)細胞。所述載體啟動子優(yōu)選是高效啟動子，使得Ang1在所述載體所投藥的組織中高水平表達。優(yōu)選使用上述CA啟動子。其它優(yōu)選實施方案中，利用病毒載體將Ang1基因引入間充質(zhì)細胞。具體優(yōu)選的病毒載體包括腺病毒載體和負鏈RNA病毒載體。負鏈RNA病毒載體是最為優(yōu)選使用的。利用負鏈RNA病毒載體，Ang1基因可以以非常高的水平在間充質(zhì)細胞中表達。
為利用病毒載體將基因?qū)腴g充質(zhì)細胞，可將間充質(zhì)細胞與攜帶待導(dǎo)入基因的病毒載體接觸。所述載體可在體內(nèi)或體外與間充質(zhì)細胞接觸，例如在所需的生理水溶液諸如培養(yǎng)液，生理鹽水，血液，血漿，血清以及體液中。對于體外導(dǎo)入的情況，感染復(fù)數(shù)(MOI；感染性病毒粒子數(shù)每細胞)優(yōu)選在1-500，更優(yōu)選1-300，更優(yōu)選1-200，更優(yōu)選1-100，更優(yōu)選1-70的范圍內(nèi)調(diào)節(jié)。例如，所述感染可通過將所述病毒載體與含有間充質(zhì)細胞的細胞級分結(jié)合而進行。當(dāng)使用負鏈RNA病毒載體時，將間充質(zhì)細胞與僅有的載體接觸較短時間以便進行感染是足夠的。接觸時間可以是1分鐘或更長，優(yōu)選3分鐘或更長，5分鐘或更長，10分鐘或更長，或20分鐘或更長，例如，約1-60分鐘，更具體地約5-30分鐘。顯而易見，所述接觸可持續(xù)較長時間，例如，24小時，或數(shù)天或更長。所述接觸可在體內(nèi)或離體條件下實現(xiàn)。例如在包括在離體條件下將病毒載體與取自機體的間充質(zhì)細胞接觸并將所述細胞輸回所述機體的離體基因?qū)胫?，?yōu)選使用利用負鏈RNA病毒載體并由此需要載體與間充質(zhì)細胞之間的短時間接觸的基因?qū)敕椒?。間充質(zhì)細胞可用于心肌缺血，肢體缺血等中的基因治療，所述間充質(zhì)細胞中已經(jīng)通過本發(fā)明的方法導(dǎo)入了血管生成相關(guān)基因。
間充質(zhì)細胞可通過例如Tsuda，H.等Mol Ther 7(3)354-65(2003)所述的方法制備。對于人間充質(zhì)細胞的培養(yǎng)，見Kobune M，等，Hamada H，Telomerized human multipotent mesenchymal cells can differentiate intohematopoietic and cobblestone area-supporting cells Exp.Hematol Exp Hematol.31(8)715-22，2003。所得細胞可立即用于治療，或在體外培養(yǎng)到約10-40群體倍增(population doubling)(PD)后用于治療。
更具體地，含有間充質(zhì)細胞的細胞級分可通過對采集自骨髓細胞或臍血細胞進行分級分離來制備例如通過在2,000rpm進行密度梯度離心足夠時間以基于細胞在溶液中的比重而分離所述細胞，然后，回收特定比密度在1.07g/ml-1.1g/ml的細胞級分。本文中，術(shù)語“足夠長以基于細胞的比重而分離所述細胞”指足夠長的時間，其允許細胞穩(wěn)定在用于密度梯度離心的溶液中對應(yīng)其自身比重的位置。時間長度通常為約10分鐘到30分鐘。待回收細胞級分的比重優(yōu)選為1.07g/ml-1.08g/ml(例如，1.077g/ml)。用于密度梯度離心的溶液包括，但不限于，F(xiàn)icoll溶液和Percoll溶液?？蛇x，通過上述方法自脊椎動物采集的臍血細胞也可用作細胞級分。
具體的實例包括首先將溶液(2ml L-15+3ml Ficoll)與采集自脊椎動物的骨髓液(5μl-10μl)混合，并在2,000rpm離心所得混合物15分鐘以分離單個核細胞級分(約1ml)。然后通過將單個核細胞級分與培養(yǎng)液(2mlDMEM)混合進行洗滌，并再一次在2,000rpm離心所述混合物15分鐘。棄去上清，回收沉淀的細胞。除股骨外，本發(fā)明的細胞級分具有來源包括胸骨，構(gòu)成骨盆的髂骨。所述細胞級分不僅可獲自這些骨而且可獲自其它較大的骨。所述細胞級分也可從儲存于骨髓庫中的骨髓液或臍血獲得。當(dāng)使用臍血細胞時，所述細胞級分可采集自儲存于骨髓庫中的臍血。
本發(fā)明另一實施方案中，所述細胞級分是單個核細胞級分，其分離并純化自骨髓細胞，臍血細胞，或外周血細胞，包括可分化成心血管系統(tǒng)的細胞的中胚層干細胞(間充質(zhì)干細胞)。含有中胚層干細胞的細胞級分可通過根據(jù)細胞表面標(biāo)記諸如上述SH2從上述細胞級分中選出細胞，例如，從骨髓細胞，臍血細胞，或外周血細胞中選出。
含有可分化成心血管系統(tǒng)細胞的中胚層干細胞(間充質(zhì)干細胞)的細胞級分，可通過對采集自脊椎動物的骨髓細胞和臍血細胞進行分級分離來制備，所述分級分離通過在900g進行密度梯度離心足夠的長時間來基于細胞在溶液中的比重而分離所述細胞，然后回收比密度在1.07g/ml-1.1g/ml的細胞級分來進行。本文中，術(shù)語“足夠長以基于細胞的比重而分離所述細胞”指足夠長的時間，其允許細胞穩(wěn)定在用于密度梯度離心的溶液中對應(yīng)其自身比重的位置。時間長度通常為約10分鐘到30分鐘。待回收細胞級分的比重根據(jù)所述細胞所來源的動物物種類型(例如，人，大鼠和小鼠)而不同。用于密度梯度離心的溶液包括，但不限于，F(xiàn)icoll溶液和Percoll溶液。
具體的實例包括首先將與采集自脊椎動物的骨髓液(25ml)或臍血等體積的PBS混合，在900g離心所得混合物10分鐘，并混合沉淀的細胞與PBS(細胞密度約4×107細胞/ml)以去除血液組分。隨后將5-ml細胞等分試樣與Percoll溶液(1.073g/ml)混合，然后將所述混合物在900g離心30分鐘來分離單個核細胞級分。將單個核細胞級分與培養(yǎng)基(DMEM，其含有10％FBS和1％抗生素-抗霉菌劑溶液)混合以洗滌細胞。所述混合物在2,000rpm離心15分鐘，棄去上清液?；厥粘恋淼募毎⑦M行培養(yǎng)(37℃，含有5％CO2的空氣中)。
本發(fā)明另一實施方案中，所述細胞級分是單個核細胞級分，其分離自骨髓細胞或臍血細胞，并含有可分化成心血管系統(tǒng)細胞的間質(zhì)細胞。所述間質(zhì)細胞是例如，具有以下標(biāo)記的細胞Lin(-)，Sca-1(+)，CD10(+)，CD11D(+)，CD44(+)，CD45(+)，CD71(+)，CD90(+)，CD105(+)，CDW123(+)，CD127(+)，CD164(+)，纖連蛋白(+)，ALPH(+)，和膠原酶-1(+)。含有間質(zhì)細胞的所述細胞級分可例如通過從通過離心獲自骨髓細胞或臍血細胞的上述細胞級分中選出帶有細胞表面標(biāo)記諸如Lin的細胞來獲得。
可選，所述細胞級分可通過對采集自骨髓細胞或臍血細胞進行分級分離來制備，所述分級分離通過在800g進行密度梯度離心足夠長的時間以基于細胞在溶液中的比重來分離所述細胞，然后回收比密度在1.07g/ml-1.1g/ml的細胞級分進行。本文中，術(shù)語“足夠長以基于細胞的比重而分離所述細胞”指足夠長的時間，其允許細胞穩(wěn)定在用于密度梯度離心的溶液中對應(yīng)其自身比重的位置。時間長度通常為約10分鐘到30分鐘。待回收細胞級分的比重優(yōu)選為1.07g/ml-1.08g/ml(例如，1.077g/ml).用于密度梯度離心的溶液包括，但不限于，F(xiàn)icoll溶液和Percoll溶液。
具體的實例包括首先將與采集自脊椎動物的骨髓液(25ml)或臍血等體積的溶液(PBS，含有2％BSA，0.6％檸檬酸鈉，和1％青霉素-鏈霉素)混合，然后將5-ml細胞樣品等分試樣與Ficoll/Paque溶液(1.077g/ml)混合，然后將所得混合物在800g離心20分鐘來分離單個核細胞級分。然后將單個核細胞級分與培養(yǎng)液(Alfa MEM，含有12.5％FBS，12.5％馬血清，0.2％i-肌醇，20mM葉酸，0.1mM 2-巰基乙醇，2mM L-谷氨酰胺，1μm氫化可的松，和1％抗生素-抗霉菌劑溶液)混合以洗滌細胞。所得混合物在2,000rpm離心15分鐘，棄去上清液?；厥粘恋淼募毎⑦M行培養(yǎng)(37℃，含有5％CO2的空氣中)。
本發(fā)明另一實施方案中，所述細胞級分是單個核細胞級分，其分離自骨髓細胞、臍血細胞、外周血細胞、或胎肝細胞，并且含有包含AC133(+)標(biāo)記并可分化成心血管系統(tǒng)細胞的細胞。所述細胞級分可例如通過從上述細胞級分選出具有上述細胞表面標(biāo)記AC133(+)的細胞而獲得，所述細胞級分通過離心獲自骨髓細胞，臍血細胞，或外周血細胞。
另一個實施方案中，所述細胞級分可通過對采集自脊椎動物的胎肝細胞進行分級分離來制備，所述分級分離通過在2,000rpm進行密度梯度離心足夠長的時間以基于細胞在溶液中的比重來分離所述細胞，然后回收比密度在1.07g/ml-1.1g/ml的細胞級分，然后從所述細胞級分回收AC133(+)的細胞來進行。本文中，術(shù)語“足夠長以基于細胞的比重而分離所述細胞”指足夠長的時間，其允許細胞穩(wěn)定在用于密度梯度離心的溶液中對應(yīng)其自身比重的位置。時間長度通常為約10分鐘到30分鐘。用于密度梯度離心的溶液包括，但不限于，F(xiàn)icoll溶液和Percoll溶液。
具體實例包括首先在L-15溶液中洗滌采集自脊椎動物的肝組織，然后進行酶處理(37℃、在包含0.01％ DNaseI，0.25％胰蛋白酶，和0.1％膠原酶的L-15溶液中、30分鐘)。所述組織通過吸液分離成單個細胞。這些單個肝細胞用自股骨制備單個細胞級分所用的方法離心。所得細胞經(jīng)洗滌，利用抗-AC133抗體從經(jīng)洗滌的細胞中回收AC133(+)細胞?？煞只尚难芟到y(tǒng)細胞的細胞可由此從胎肝細胞制備。利用抗體回收AC133(+)細胞可通過利用磁珠或細胞分選儀(FACS等)實現(xiàn)。
前述細胞級分中所含、可分化成心血管系統(tǒng)細胞的細胞包括，但不限于，中胚層干細胞(間充質(zhì)干細胞)，間質(zhì)細胞，和上述所述細胞級分中的AC133-陽性細胞。
本發(fā)明還涉及制備經(jīng)過遺傳修飾的口腔鱗狀上皮細胞的方法，包括使口腔鱗狀上皮細胞與負鏈RNA病毒載體接觸的步驟。此外，本發(fā)明還涉及制備經(jīng)過遺傳修飾的巨噬細胞的方法，包括將巨噬細胞與攜帶基因的負鏈RNA病毒載體接觸的步驟。此外，本發(fā)明還涉及制備經(jīng)過遺傳修飾的樹突細胞的方法，包括將樹突細胞與攜帶基因的負鏈RNA病毒載體接觸的步驟。發(fā)現(xiàn)與腺病毒載體相比，負鏈RNA病毒載體可以以高得多的效率將基因?qū)肟谇击[狀上皮細胞，巨噬細胞，和樹突細胞，通常預(yù)期腺病毒可高水平表達所導(dǎo)入的基因。因此，負鏈RNA病毒載體對于將基因?qū)肟谇击[狀上皮細胞(包括口腔鱗狀上皮癌細胞)，巨噬細胞，和樹突細胞非常有用。具體地，本發(fā)明涉及(i)制備經(jīng)過遺傳修飾的口腔鱗狀上皮細胞的方法，包括使口腔鱗狀上皮細胞與攜帶基因的負鏈RNA病毒載體接觸的步驟；(ii)制備遺傳修飾的巨噬細胞的方法，包括使樹突細胞與攜帶基因的負鏈RNA病毒載體接觸的步驟，和(iii)制備經(jīng)過遺傳修飾的巨噬細胞的方法，包括使樹突細胞與攜帶基因的負鏈RNA病毒載體接觸的步驟。此外，本發(fā)明還涉及通過上述方法制備的經(jīng)過遺傳修飾的細胞。這種對細胞的遺傳修飾對于在口腔鱗狀上皮細胞癌的基因治療以及癌癥和免疫疾病的基因治療中調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)是有用的。


圖1是圖示了LacZ基因在正?；蚬Ｈ拇笫笮呐K中的表達，所述基因通過腺病毒介導(dǎo)導(dǎo)入。攜帶大腸桿菌β-半乳糖苷酶基因的腺病毒載體(1×109-1×1010opu)被注入正?；蚬Ｈ蟮拇笫笮呐K的心前壁?；?qū)牒?天，處死大鼠。并用組織裂解緩沖液對摘出的心臟進行勻漿。測定心臟勻漿物的β-半乳糖苷酶活性?？瞻字硎緜问中g(shù)(正常)心臟，灰色柱表示梗塞的心臟。
圖2圖示了偽手術(shù)后大鼠心臟或梗塞的心臟中LacZ-陽性區(qū)的分布。(A)X-gal-染色的心臟的概圖。上段經(jīng)心肌內(nèi)注入AxCAZ3(1×1010opu)的正常(偽手術(shù))心臟；中段注入了生理鹽水的梗塞心臟；下段經(jīng)心肌內(nèi)注入AxCAZ3(1×1010opu)的梗塞心臟。每段中的左手側(cè)圖像是從右心室側(cè)觀察的圖像；每段的中間圖像都是從腹側(cè)(正面)觀察的圖像；每段中的右手側(cè)圖像都是從左心室側(cè)觀察的圖像。實心箭頭(黃色)指示左冠狀動脈(LAD)中的結(jié)扎位點，虛線箭頭(白色)指示注射位點。箭頭(紅色)標(biāo)記的區(qū)域指示心肌中的梗塞區(qū)。(B)X-gal-染色的心肌梗塞心臟的橫斷面。梗塞的心臟在結(jié)扎位點和心尖部之間的中間以及下1/4部位水平切斷。淺灰色區(qū)域是梗塞區(qū)，深灰色區(qū)域是X-gal-陽性心肌。LV左心室；RV右心室。
圖3是相片，顯示偽手術(shù)后的心臟和梗塞的心臟中，腺病毒介導(dǎo)的Ang1表達?；?qū)?天后，通過PCR檢測正常和梗塞心臟中人Ang1-特異性mRNA的表達。(A)人Ang1-特異性表達。泳道1∶100-堿基對DNA梯作為長度標(biāo)記；泳道2陽性對照(感染了AxCAhAng1的HeLa細胞)；泳道3正常心臟；泳道4注入了AxCAZ3的心臟；泳道5注入了AxCAhAng1的正常心臟；泳道6注入了AxCAhAng1的梗塞心臟。(B)大鼠GAPDH在作為內(nèi)部對照的對應(yīng)細胞和組織中的表達。長度標(biāo)記中最明亮的帶對應(yīng)500堿基對。
圖4是圖片和照片，顯示梗塞心臟各個區(qū)域內(nèi)的毛細血管密度。測定每個區(qū)域的CD34陽性毛細血管密度(A梗塞壁；B隔壁；和C梗塞區(qū)附近的邊界區(qū))。用抗CD-34單克隆抗體染色的毛細血管數(shù)目以盲性方式計數(shù)。毛細血管密度以數(shù)目/mm2單位表示。*p＜0.01。
圖5圖示了偽術(shù)后心臟和梗塞的心臟的組織學(xué)發(fā)現(xiàn)。所述心臟在心肌梗塞后4周切除，然后進行Masson′s三色染色(A-D)，并用抗-CD34單克隆抗體(E-H)和抗-α-SMA單克隆抗體(I-L)進行免疫染色。顯示了偽術(shù)后心臟(A，E，和I)；生理鹽水對照(B，F(xiàn)，和J)；腺病毒對照(C，G，和K)；Ang1-治療的心臟(D，H，和L)。柱表示50μm。
圖6是收縮和舒張末期，超聲心動描記術(shù)所示的縱軸圖像。心臟功能在心肌梗塞4周后通過超聲心動描記術(shù)評估。照片顯示了通過二維，超聲心動描記術(shù)獲得的縱軸圖像。上圖收縮末期的圖；下圖舒張期的圖。兩個箭頭之間的區(qū)域?qū)?yīng)梗塞的前壁。用虛線標(biāo)記的區(qū)域?qū)?yīng)左心室腔。
圖7是照片，顯示急性下肢缺血小鼠模型中，由單獨投藥表達Ang1的腺病毒載體所引起的壞死抑制效應(yīng)。
圖8圖示了通過注入裸露的DNA，LacZ在大鼠骨骼肌(A)和心臟(B)中的表達。將圖示量的質(zhì)粒(20μg)注入下肢肌肉或心尖(n＝4)。β-gal活性利用Galacto-light plus試劑盒評估在質(zhì)粒注入四天后進行評估，并顯示為相肌肉或心臟中ng活性的LacZ。柱表示標(biāo)準(zhǔn)差。
圖9是圖示了通過注入裸露的DNA并將腺病毒載體注入大鼠心臟，對LacZ表達水平的比較。20μg pCAZ2或各種量的AxCAZ3被注入心肌。條(bar)表示標(biāo)準(zhǔn)差(n＝4)。
圖10圖示了利用腺病毒(Ad)載體或仙臺病毒(SeV)載體將基因?qū)胄募〖毎男ЧＲ愿鞣NMOI和感染時間，將編碼LacZ的腺病毒載體(AxCAZ3)或SeV載體(SeVAng1)導(dǎo)入大鼠心肌細胞。測定β-半乳糖苷酶的表達水平。
圖11圖示了利用腺病毒載體或仙臺病毒載體經(jīng)由體內(nèi)投藥將基因?qū)胄募〉男Ч?。報道基因的表達水平在將表達LacZ的AdV或SeV投藥給心肌三天以后測定。
圖12圖示了通過Ad或SeV載體的經(jīng)靜脈內(nèi)或心肌內(nèi)投藥，基因表達的器官分布。SeVLacZ和AxCAZ3分別以1×108CIU和1×1010opu經(jīng)由正常大鼠陰莖靜脈投藥。72小時后，取出器官，并測定所述器官中l(wèi)acZ的表達水平。SeV載體的經(jīng)心肌內(nèi)投藥以后測定各個器官中LacZ的表達水平。
圖13圖示了利用SeV載體將Ang1基因?qū)牍Ｈ笫笮呐K導(dǎo)致的對心肌梗塞的治療效果。將5×107CIU的SeVAng1分別注入LAD灌注區(qū)周圍左心室前壁中的兩個位點，梗塞大小和厚度在四周后測定。
圖14圖示了利用SeV載體將Ang1基因?qū)牍Ｈ笫笮呐K導(dǎo)致的對心肌梗塞的治療效果。將5×107CIU的SeVAng1分別注入LAD灌注區(qū)周圍左心室前壁中的兩個位點。四周后測定梗塞大小和厚度。
圖15圖示利用SeV載體將Ang1基因引入下肢缺血大鼠模型中的治療效果。將5×107CIU的SeVAng1給藥至股動脈結(jié)扎大鼠的股直肌的兩個位點。缺血后兩周通過激光多普勒血流圖像進行血流測定。顯示了缺血下肢中的血流和正常下肢中的血流之比(組織血流比缺血肢體血流/正常肢體血流)。
圖16圖示了利用腺病毒(Ad)載體或仙臺病毒(SeV)載體將基因?qū)腴g充質(zhì)細胞(MSC)。以改變的MOI將編碼LacZ的腺病毒載體(AxCAZ3)或SeV載體(SeVAng1)導(dǎo)入大鼠MSC。測定β-半乳糖苷酶表達。
圖17是照片，顯示X-gal-染色的MSC，其中利用腺病毒(Ad)載體或仙臺病毒(SeV)載體導(dǎo)入了LacZ基因。
圖18圖示了利用導(dǎo)入了Angl的MSC，對治療肢體缺血的治療效果。
圖19是圖和照片，顯示了由SeV載體和由腺病毒載體向細胞系中導(dǎo)入基因之間的比較。
圖20圖示了利用SeV載體將基因?qū)胂俨《镜挚剐腿丝谇击[狀上皮癌細胞系。
圖21圖示了利用aSeV載體將基因?qū)肴司奘杉毎蜆渫患毎?br> 實施例下文中，本發(fā)明將通過實施例具體描述，然而，不應(yīng)理解為限制于此。本文引用的所有公開出版物都作為本說明書的一部分包含在內(nèi)。
VEGF和Ang1的腺病毒表達載體人VEGF基因通過對來自人膠質(zhì)細胞瘤細胞系U251的cDNA進行PCR克隆而獲得。所得VEGF基因的核苷酸序列通過BigDye Terminator法(Perkin-Elmer)確認(rèn)。人Ang1基因從來自人骨髓細胞的cDNA經(jīng)PCR法克隆，并通過上述方法確認(rèn)所得核苷酸序列。測定的Ang1基因核苷酸序列與GenBank登錄號U83508的核苷酸序列之間的比較提示它們是相同的，但位置933上的核苷酸A被G取代。盡管存在核苷酸取代，Ang1蛋白的氨基酸序列與GenBank中U83508的氨基酸序列相同。將克隆的VEGF和Ang1cDNA分別插入pCAcc載體的限制位點EcoRI和BglII之間(WO 02/100441；Ito.，Y.，等(2002)Mol Ther.5S162)，所述載體來自pCAGGS(Niwa，H.等(1991)Gene.108193-199)。由此制備出分別表達VEGF和Ang1的載體pCAhVEGF和pCAhAng1。表達VEGF或Ang1的腺病毒通過Saito等(Miyake，S.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 931320-1324(1996))開發(fā)的COS-TPC法制備。質(zhì)粒pCAhVEGF和pCAhAng1用限制酶ClaI消化。所得基因表達單位(分別包含VEGF或Ang1 cDNA以及CA啟動子)，被插入包含腺病毒5型基因的一部分的粘粒pAxcw(Nakamura，T.等(2002)Hum Gene Ther.13613-626)的ClaI限制位點，來制備pAxCAhVEGF/Ang1。包含pAxCAhVEGF/Ang1和全長5型腺病毒的DNA-末端蛋白質(zhì)復(fù)合體(TPC)用限制酶EcoT22I消化，并通過磷酸鈣共沉淀法將產(chǎn)物導(dǎo)入293細胞?；厥蘸薪?jīng)修飾的腺病毒的噬斑(Graham，F(xiàn).L.and A.J.van der Eb.(1973)Virology.52456-467)。來自每個噬斑的腺病毒通過其限制酶消化模式得以確認(rèn)。此外，通過PCR確認(rèn)所述病毒并沒有被野生型病毒污染。由此制備出分別用于表達VEGF和Ang1的腺病毒載體AxCAhVEGF和AxCAhAng1。用于產(chǎn)生大鼠心肌梗塞模型的腺病毒通過在CsCl不連續(xù)密度梯度中超離心并用10％甘油/PBS透析來純化(Kanegae，Y.，等(1995)Nucleic Acids Res.233816-3821)。經(jīng)純化的腺病毒載體的濃度(光學(xué)密度單位/ml，opu/ml)在1％SDS存在的條件下、于A260測定，并利用以下公式?jīng)Q定(Nyberg-Hoffman，C.等(1997)Nat Med.3808-811)opu＝A260×(1.1×1012)病毒滴度(噬斑形成單位pfu)利用293細胞通過限制稀釋分析測定(Miyake，S.，等(1996)Proc Natl Acad Sci U S A.931320-1324)。表達大腸桿菌β-半乳糖苷酶基因的AxCAZ3(Nakamura，T.等(2002)Hum Gene Ther.13613-626)用作對照腺病毒。除插入了cDNA以外，該載體與AxCAhAng1一樣。本發(fā)明中所用病毒載體AxCAhAng1，AxCAhVEGF和AxCAZ3的opu/pfu比分別為13.3，28.0，和80.0。
腺病毒載體-介導(dǎo)的梗塞心臟中的基因表達據(jù)報道，與正常心臟相比，梗塞心臟中的異源基因表達水平非常低(Leor，J.等(1996)J Mol細胞Cardiol.282057-2067)。因此，在治療試驗開始前，檢驗了用腺病毒導(dǎo)入的基因在大鼠心肌梗塞模型中是否充分表達。
大鼠心肌梗塞模型的制備大鼠心肌梗塞模型根據(jù)Pfeffer等(Pfeffer，M.A.等Cir.Res.44503-512，1979)的方法制備。Lewis大鼠(8周齡，雄性，約300g體重)通過吸入乙醚并經(jīng)腹腔內(nèi)注入70mg/kg氯胺酮和6-7mg/kg甲芐噻嗪進行麻醉，然后對大鼠進行插管。通過在分時(minute)換氣量200-250ml，潮氣量3ml，呼吸次數(shù)60-80循環(huán)/min，和O21 l/min的條件下吸入0.5％-2.0％氟烷來麻醉，然后進行左胸開胸術(shù)。鑒定左前降(LAD)支，然后在左心耳的高度用6-0不可吸收縫線(尼龍縫線)結(jié)扎。結(jié)扎后，通過呼氣終末正壓式人工呼吸(positive end-expiratory pressure)來擴張肺。小心關(guān)閉肋間切口以便不損傷肺后，用連續(xù)縫合關(guān)閉肌肉層和皮膚。對于偽手術(shù)的對照組，大鼠用相同的手術(shù)方法治療，但其冠狀動脈沒有被結(jié)扎。結(jié)扎左前降支以后，利用30G針經(jīng)心肌內(nèi)將5×109opu/50μl(總量1×1010opu)腺病毒載體導(dǎo)入在估計為左前降支灌注區(qū)周圍的左右區(qū)域。
心肌內(nèi)LacZ基因表達的檢測由投藥腺病毒載體導(dǎo)致的大腸桿菌β-半乳糖苷酶基因的表達，通過X-gal染色(Nakamura，Y.，等(1994)Cancer Res.545757-5760)在大鼠心肌中得到證實。經(jīng)心肌內(nèi)投藥1×1010OPU/100μl AxCAZ3后5天，器官固定通過在深麻醉條件下用2％多聚甲醛灌注整個身體進行。摘出固定的心臟，并通過于30℃浸泡在X-gal溶液(PBS(pH 7.2)，含有2mM MgCl2，4mM氰鐵酸鉀(potassium ferricyanide)，以及1mg/ml X-gal)中16小時進行X-gal染色(Sigma Chemical Co.St.Louis，MO)。此外，β-半乳糖苷酶在心臟中的表達水平利用Galacto-Light Plus試劑盒(Tropix Inc.Bedford，MA)以及標(biāo)準(zhǔn)β-半乳糖苷酶樣品(Roche)，通過測定β-半乳糖苷酶活性定量檢測(Shaper NL等J.Biol.Chem.269(40)，25165-25171，1994)。經(jīng)心肌內(nèi)投藥1×109-1×1010opuAxCAZ3后5天處死大鼠。摘出的心臟在裂解緩沖液(100mM磷酸鉀(pH7.8)，0.2％Triton X-100，1mM二硫蘇糖醇，0.2mM苯基甲基磺?；?phenylmethylsulfonyl fluoride)，和5μg/ml leupeptin)中勻漿。將勻漿物在12，500xg離心10min，上清液中的內(nèi)源β-半乳糖苷酶通過在48℃保溫1小時來滅活(Young DC，Anal.Biochemi.215，24-30，1993)。
所述上清液與Galacto-Light Plus在室溫保溫1小時。上清液中的酶活性利用Mini-Lumat LB9506通過化學(xué)發(fā)光(chemical luminescence)測定(Berthold Technologies GmbH & Co.KG，Wildbad，Germany)。利用由標(biāo)準(zhǔn)重組β-半乳糖苷酶樣品制備的標(biāo)準(zhǔn)曲線(Roche Diagnostics，Mannheim，Germany)，將所得結(jié)果(相對光單位)轉(zhuǎn)化成β-半乳糖苷酶活性(pg/ml)。
通過下述方法將所述腺病毒載體經(jīng)心肌內(nèi)投藥。結(jié)扎左前降支以后，利用30G針將5×109opu/50μl(所用載體總量為1×1010opu)腺病毒載體經(jīng)心肌內(nèi)投藥到兩個位點估計為左前降支灌注區(qū)的左右周圍區(qū)域。腺病毒載體被分開，并經(jīng)心肌內(nèi)投藥給正常心臟和梗塞心臟，所述正常和梗塞心臟中各有兩個投藥位點。表達水平在投藥5天后測定。如圖1所示，投藥15×109opu或更高劑量的腺病毒載體時，正常和梗塞心臟中的基因表達可明顯被識別，梗塞心臟中的表達水平幾乎等同于正常心臟中的表達水平。所導(dǎo)入的基因以劑量依賴的方式表達，表達水平隨腺病毒劑量的增加而增加。如圖2(A)所示，梗塞心臟中的基因表達分布是前側(cè)壁中部的廣泛區(qū)域，其為基因?qū)氲奈稽c。然而，如X-gal染色的橫斷面中明顯所見(圖2(B))，在梗塞部的心肌、中隔部和右心室心肌中沒有發(fā)現(xiàn)基因表達。
導(dǎo)入VEGF和Ang1基因后的心肌梗塞后存活率由于自1×1010opu腺病毒的基因表達在梗塞心肌中明顯可見，用血管生成因子基因來治療大鼠心肌梗塞模型。同時檢測VEGF基因?qū)π募」Ｈ闹委熜Ч?，以前顯示所述VEGF基因?qū)β孕募∪毖行АＮ唇?jīng)治療的心肌梗塞后組，投予腺病毒的對照組以及投予AxCAhAng1的組的存活率在心肌梗塞后4周計算。在模型制成的24小時之內(nèi)死亡的大鼠不計在所述計算中。
Ang1在已經(jīng)導(dǎo)入了載體的心臟中的表達也由RT-PCR檢測(圖3)。腺病毒載體介導(dǎo)的基因?qū)?1×1010opu/心臟)5天后，摘出心臟。利用RNeasy試劑盒(Qiagen KK，Tokyo，Japan)從左心室心肌提取總RNA。為避免心肌總RNA被DNA污染，用利用Rnase-free DNase Set(Qiagen)根據(jù)所附說明書用DnaseI處理所述樣品。通過隨機引發(fā)法(randome priming method)利用隨機混合引物(random primer mixture)(Invitrogen，Carlsbad，CA)和SuperscriptTM II(Invitrogen)從總RNA合成第一cDNA鏈。利用人Ang1-特異性正向引物以及位于Ang1表達單位的終止子位點的、兔β-球蛋白的反向引物，檢測從腺病毒載體轉(zhuǎn)錄出的人Ang1-特異性mRNA。內(nèi)部對照大鼠3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)也通過RT-PCR檢測。人Ang1正向引物，兔β-球蛋白反向引物，以及GAPDH引物如下所示。
人Ang1引物正向引物5’-CAGAGGCAGTACATGCTAAGAATTGAGTTA-3’(SEQ IDNO6)兔β-球蛋白引物反向引物5’-AGATGCTCAAGGGGCTTCATGATG-3’(SEQ ID NO7)兔GAPDH引物正向引物5’-TATTGGGCGCCTGGTCACCA-3’(SEQ ID NO8)反向引物5’-CCACCTTCTTGATGTCATCA-3’(SEQ ID NO9)
進行30個循環(huán)的PCR，檢測人Ang1 mRNA和GAPDH mRNA。所得PCR產(chǎn)物在2％瓊脂糖凝膠上分離?？俁NA自已經(jīng)用AxCAhAng1以100opu/細胞感染的HeLa細胞分離，并用作人Ang1 mRNA的陽性對照。
對應(yīng)大鼠GAPDH基因(內(nèi)部對照)的407-bp產(chǎn)物見于所有心肌RNA樣品(圖3)。人Ang1的特異性453-bp PCR帶見于投予了AxCAhAng1的大鼠心臟樣品以及利用AxCAhAng1導(dǎo)入了所述基因的HeLa細胞樣品中。反之，人Ang1-特異性帶在正常心臟和投藥AxCAZ3的心臟中都不能檢測到。
心肌梗塞模型的死亡率大約25％，不包括在模型制成24小時內(nèi)死亡的大鼠。在對照組中，在已經(jīng)投藥腺病毒AxCAZ3的情況下，死亡率為20％，因此投予的腺病毒對死亡率幾乎沒有影響。首先，檢測VEGF基因?qū)π募」Ｈ闹委熜Ч粨?jù)報道所述基因?qū)τ诼孕募∪毖行?。然而，發(fā)現(xiàn)投藥VEGF基因的組中的死亡率在心肌梗塞4周后升高到大約40％。反之，在投藥1×1010opu AxCAhAng1的組中，死亡率降低到8％(表1)。
這些發(fā)現(xiàn)表明，對于急性心肌梗塞，Ang1比VEGF更有效。
表1患試驗性心肌梗塞的大鼠的死亡率
心肌梗塞后Ang1和VEGF基因誘導(dǎo)的血管生成VEGF基因有強血管生成誘導(dǎo)活性。Ang1通過與VEGF的協(xié)同作用促進血管生成。為直接證實所導(dǎo)入的Ang1基因的效果，測定導(dǎo)入了所述基因的梗塞心臟中的血管密度。心肌梗塞發(fā)生后4周，心肌中的血管密度通過用抗-CD34單克隆抗體對血管內(nèi)皮細胞進行免疫染色來評估。心臟用福爾馬林固定并包埋于石蠟中，切成10-μm切片。所述切片用抗-CD34單克隆抗體(MoAb)(NU-4A1，Nichirei，Tokyo Japan)作為第一單克隆抗體染色，然后用生物素化的抗-小鼠IgG第二單克隆抗體和抗生物素蛋白-辣根過氧化物酶(DAB石蠟IHC染色模件，Ventana Medical System Inc，Tucson，AZ)染色。第一單克隆抗體的特異性通過利用小鼠IgG證實，其具有與抗體相同的亞型。室間隔、梗塞位點周圍區(qū)域以及心肌梗塞中存活心肌中的血管數(shù)目以盲性方式在放大率200倍的顯微鏡下確定。計數(shù)梗塞區(qū)、邊界區(qū)以及中隔壁中被染色的血管，用每單位面積(mm2)的血管數(shù)平均值表示。為了證實成熟血管的存在，利用抗-α-SMA MoAb(克隆1A4，Dako Japan，Tokyo，Japan)通過用于抗-CD34 MoAb免疫染色的方法對切片進行染色。以與上述用于毛細血管密度相似的方式計數(shù)α-SMA-陽性血管。
梗塞心臟的梗塞位點和梗塞周心肌中的血管密度與正常心臟相比而言降低(圖4)。利用腺病毒投藥VEGF或Ang1的情況下，梗塞位點和梗塞周圍心肌中的血管密度明顯增加。具體地，接近基因投藥位點的梗塞周圍區(qū)域中的血管密度增加到高于正常心肌中的水平(梗塞周圍心肌中的血管密度在Ang1-治療的組中為644±96/mm2，生理鹽水-治療的組中為350±79/mm2(p＜0.01相對于Ang1-治療的組)，在AxCAZ3-治療的組中為332±127/mm2(p＜0.01相對于Ang1-治療的組)，或在偽-手術(shù)組中為402±121/mm2)。從宏觀和微觀角度，在Ang1-治療的組中沒有發(fā)現(xiàn)血管瘤。有趣的是，生理鹽水-治療的組和AxCAZ3-治療的組顯示，心肌梗塞4周后，距離基因投藥位點較遠的室間隔中的血管數(shù)目降低(分別為341±60/mm2和367±113/mm2)。中隔部血管數(shù)目的增加通過投藥Ang1基因(461±100/mm2)或VEGF基因(在偽術(shù)后組中為483±46/mm2)而受到抑制。圖5顯示用抗-CD34MoAb對血管內(nèi)皮細胞進行的免疫染色。10μm或10μm以下的微血管，以及10μm或10μm以上的血管見于投藥Ang1基因的組中(對于每種樣品，許多α-SMA-陽性血管見于Ang1治療的梗塞心臟的左心室區(qū)；中隔區(qū)中為38.9±7.35/mm2，邊界區(qū)中為38.9±4.81/mm2，梗塞區(qū)中為112±26.1/mm2)。除了Ang1治療組的每個組，大于10μm(19-22/mm2)的α-SMA-陽性血管的密度沒有明顯變化。此外，發(fā)現(xiàn)單獨投藥Ang1使血管密度增加到與投藥VEGF基因相同的程度(圖4)。
Ang1基因降低心肌梗塞大小Ang1基因?qū)Ｈ挠绊懤眯募」ＨＰ痛_定。心肌梗塞大小通過下述方法測定。心肌梗塞后4周，用Edelberg等(Edelberg JM等Circulation 105，608-613，2001)及Roberts等(Roberts CS et al，Am.J.Cardiol.51，872-876，1983)的方法測定梗塞大小。處死大鼠并在模型制成后4周摘出梗塞心臟。將心臟浸于冷生理鹽水中以去除心室的血液，然后在4％多聚甲醛中固定48小時。將所述心臟包埋于石蠟中并切成10μm切片。所述切片通過在心尖與左前降支結(jié)扎位點間的中間部位沿短軸方向切割來制備。通過蘇木精-伊紅、Masson′s三色(trichrome)染色對梗塞位點進行染色。用數(shù)字照相機獲取切片的圖像，然后利用NIH image，以盲性方式確定以下參數(shù)總左室(LV)面積(mm2)，梗塞面積(mm2)，中隔壁厚(mm)，梗塞壁厚(mm)，LV的心外膜和心內(nèi)膜周長(mm)，以及心外膜側(cè)和心內(nèi)膜側(cè)的梗塞長(mm)。
根據(jù)這些結(jié)果，利用以下公式進行評估％梗塞大?。焦Ｈ麉^(qū)/總LV面積×100％前/中隔壁厚＝前壁(梗塞)厚/中隔壁厚×100存活LV面積＝(總LV心肌面積)-(梗塞心肌面積)；％心內(nèi)膜側(cè)梗塞長＝梗塞的心內(nèi)膜側(cè)長/LV的心內(nèi)膜側(cè)周長×100；％心外膜側(cè)梗塞長＝梗塞的心外膜側(cè)長/LV的心外膜側(cè)周長×100；如圖5所示，在梗塞的心肌以及全部存活的左心室心肌中，觀察到明顯的心衰征兆，包括梗塞中心肌壁的薄化，以及左心室腔擴大的傾向。如表2所示，與對照組的參數(shù)相比，在投藥Ang1基因的組中，梗塞區(qū)明顯減小(％梗塞大小)，存活心肌的質(zhì)量明顯增加(％存活LV面積)。因此，明顯地，Ang1對存活心肌有影響，并且對于減小心肌梗塞大小有影響。反應(yīng)梗塞壁厚的參數(shù)％梗塞厚在投藥Ang1的組中也明顯增加。
表2在有或無Ang1基因治療的情況下，心肌梗塞后大鼠左心室的解剖學(xué)改變

*，p＜0.01vs 生理鹽水，，p＜0.05vs AxCAZ3
(表的說明)每個值用平均值±SD表示。LV表示左心室。心肌梗塞4周后處死大鼠。所有參數(shù)均在心尖部和冠狀動脈結(jié)扎部位之間的中間部橫斷面測定。統(tǒng)計學(xué)分析利用Bonferroni/Dunn檢驗的ANOVA進行。
Ang1基因?qū)π募」Ｈ笮呐K功能的改善發(fā)現(xiàn)Ang1在梗塞的心臟中具有血管生成活性以及縮小心肌梗塞大小的作用。然后檢驗了這些效果是否真正導(dǎo)致心功能的改善。利用M-模式法，通過超聲波心動描記法以及B-模式長軸斷層像中的面積-長度(area-length)法來評估心功能。
具體地，LAD結(jié)扎后四周后利用超聲心動圖(LOGIQ500，GE YokokawaMedical System，Tokyo，Japan)測定心臟功能。所述測定在經(jīng)肌內(nèi)注入氯胺酮鹽酸化物(50mg/kg)和甲芐噻嗪(2.5mg/kg)進行麻醉的條件下進行。M-模式測定部位利用10MHz探針基于長軸形式測定。左心室舒張末期直徑(Edd)和左心室收縮末期直徑(Esd)用M-模式法測定，然后計算左心室短徑縮短率(FS)。
FS(％)＝(Edd-Eds)/Edd×100擴張期左室面積(LVAd)，收縮期左室面積(LVA)，擴張期左室長軸徑(LVLd)，以及收縮期左室長軸徑(LVL)可從通過B-模式方法獲得的左心室長軸斷層像測定。左心室射血分?jǐn)?shù)(EF)根據(jù)以下公式計算(面積-長度法)(sjaastad，I.等(2000)J.Appl.Physiol.891445-1454)EF(％)＝[(0.85×LVAd2/LVLd)-(0.85×LVA2/LVL)]/(0.85×LVAd2/LVLd)×100通過超聲心動描記術(shù)在大鼠心肌梗塞模型中獲得的長軸斷層像如圖6所示。心衰征象，諸如左室前壁(即梗塞位點)的薄化，回聲亮度增加，以及左室腔的擴大在梗塞的心臟中明顯可見，與組織學(xué)圖像中觀察到的相似。
超聲心動描記術(shù)確定的各個參數(shù)如表3所示。心肌梗塞后，Edd、Esd、LVAd和LVAs的明顯增加見于生理鹽水-以及腺病毒(AxCAZ3)-處理的對照組。FS和EF也降低到正常心臟水平的40-50％。根據(jù)超聲心動描記術(shù)的參數(shù)，這些組在心肌梗塞后4周被確認(rèn)為處于心衰狀態(tài)。而在投藥Ang1基因的組，沒有發(fā)現(xiàn)Edd，Esd和LVAd明顯增加。然而，F(xiàn)S和LVA與對照組相比增加。EF也改善到55％。
表3利用超聲心動描記術(shù)對Ang1基因治療后的梗塞心臟的心臟功能進行評估

*，p＜0.05vs.生理鹽水 ；，p＜0.05vs.AxCAZ3(表的說明)梗塞4周后，通過超聲心動描記術(shù)利用M-模式和面積-長度法測定經(jīng)1×1010opu AxCAZ3或AxCAhAng1治療的心臟的心功能。每個值用平均±SD表示。Edd表示左室舒張末期直徑；Esd，左室收縮終末期直徑；FS，左室短徑短縮率；LVAd，舒張期左室面積；LVAs，收縮期左室面積；FAC，左室內(nèi)腔面積變化率；EF，左室射血分?jǐn)?shù)。統(tǒng)計學(xué)分析用Bonferroni/Dunn檢驗的ANOVA進行。
小鼠急性下肢缺血模型中單獨投藥Ang1基因的壞死抑制效果組織的VEGF產(chǎn)生在急性下肢缺血以及心肌缺血中增加。因此制作小鼠急性下肢缺血模型，并通過單獨投藥Ang1腺病毒表達載體進行抗缺血治療。利用C3H/HeN小鼠(雄性，20-25g)，根據(jù)Couffinhal等(Couffinhal T等(1998)Am J Pathol 152(6)1667-79)的方法制備下肢缺血模型。所述小鼠經(jīng)肌內(nèi)注入Ketalar(50mg/kg)和甲芐噻嗪(20mg/kg)而被全身麻醉。雙下肢剃毛后，切開左鼠蹊部，暴露左股動脈及其全部分支。股動脈起始部用7-0尼龍縫線結(jié)扎。在股動脈分支成腘窩動脈和股深動脈處前方以同樣的方式結(jié)扎。此外，其它所有分支均被結(jié)扎，切除/除去股動脈?？p合手術(shù)創(chuàng)傷完成手術(shù)。
表達Ang1的腺病毒AxCAhAng1通過上述方法制備(opu/pfu比為13.3)。誘導(dǎo)下肢缺血后，立刻將AxCAhAng1(1×1010opu/頭)經(jīng)肌內(nèi)投藥到左大腿內(nèi)收肌和左腓腸肌。利用1.0ml注射器與29G針，將每劑25μl(2.5×109opu)的AxCAhAng1注入上述肌肉中，每塊肌肉中選擇兩個位點(即，總共注射了四個位點)。對照組由五只患有誘導(dǎo)的缺血的小鼠組成。模型制成后第3天，第9天，或第10天，小鼠中的缺血通過肉眼觀察壞死區(qū)，肢指脫落，下肢脫落，潰瘍形成來評價。
在對照組中，模型制成后第3天，可確認(rèn)壞死區(qū)(3/5，即5例中的3例)，檢測到肢指脫落(2/5)，下肢脫落(0/5)，潰瘍形成(1/5)。第9天，可確認(rèn)壞死區(qū)(3/5，即5例中的3例)，檢測到肢指脫落(3/5)，下肢脫落(0/5)，潰瘍形成(1/5)以及缺血進展。在Ang1組，模型制成后第3天，可確認(rèn)壞死區(qū)(0/5)，檢測到肢指脫落(0/5)，下肢脫落(0/5)，潰瘍形成(2/5)。第9天，可確認(rèn)壞死區(qū)(3/5)，檢測到肢指脫落(1/5)，下肢脫落(0/5)，潰瘍形成(2/5)，缺血進展受到抑制。結(jié)果如圖7所示。
單獨投藥表達Ang1的腺病毒可明顯抑制肢指脫落。缺血第三天檢查患病肢體，投藥Ang1的肢體與對照肢體相比，前者中缺血介導(dǎo)的改變明顯減輕。血管生成涉及很多步驟，諸如血管新生物萌出和分支形成。具體地，動脈生成參與可提高組織灌注的功能型血管的形成，并在缺血后第10天即血管生成晚期被觀察到。因此，該試驗中觀察到的Ang1的早期效果不能歸因于血管生成，并可由血管生成以外的機制導(dǎo)致。已知Ang1經(jīng)由Tie-2活化PI3激酶，從而活化具有抗凋亡活性的Akt。經(jīng)由Tie-2，Ang1可促進NO生成，NO具有抑制血管內(nèi)皮凋亡的作用。Ang1的這些活性抑制血管內(nèi)皮細胞的凋亡并由此預(yù)防缺血發(fā)展是有可能的。
推定急性缺血導(dǎo)致的VEGF生成增加可加重組織缺血并進一步損傷組織灌注。事實上，據(jù)報道VEGF的過表達促進本發(fā)明模型中的壞死和下肢脫落。在該實施例中，推定在缺血急性期投藥Ang1抑制導(dǎo)致灌注受損的水腫的發(fā)展。在投藥Ang1的組中，即使是在第9天，也僅有一例伴有肢指脫落的嚴(yán)重壞死。
如上述，在急性下肢缺血模型中，確認(rèn)投藥Ang1可抑制壞死發(fā)展并拯救壞死后脫落的肢體。
裸露的質(zhì)粒-介導(dǎo)將Ang1基因引入骨骼肌和心肌直接將裸露的質(zhì)粒注入組織是最安全且簡單的基因轉(zhuǎn)移方法?；诰藜毎《?CMV)啟動子的質(zhì)粒主要用于已經(jīng)認(rèn)可的心血管疾病基因的臨床治療方案中。注射裸露的質(zhì)粒的一個主要缺點是導(dǎo)入的基因的表達水平較低。CA啟動子(包括巨細胞病毒增強子的雞β-肌動蛋白啟動子)是最強的體外和體內(nèi)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)模件之一。然而，CA啟動子驅(qū)動的基因表達水平隨細胞類型或器官類型而不同。實際上，當(dāng)基于CA啟動子的載體用于注入裸露的質(zhì)粒，所導(dǎo)入的基因是否以適當(dāng)水平在心組織中表達是不清楚的。因此，制備基于CA啟動子的裸露質(zhì)粒來檢測通過直接注入心肌所導(dǎo)入基因的表達水平。
大腸桿菌β-半乳糖苷酶(LacZ)基因從pIND/lacZ(Invitrogen)切出。LacZ基因被插入以下各個載體pcDNA3(Invitrogen)，包括CA啟動子的pCAGGS(Niwa，M.等，基因1991；108193-199)，以及通過缺失pCAGGS的猴病毒復(fù)制起點(SV40ori)制備的pCA1。構(gòu)建的質(zhì)粒分別命名為pcDNA3LacZ，pCAZ2，和pCA1LacZ。本發(fā)明所用質(zhì)粒pCAZ2是Yoshida等(Hum.基因Ther.92503-2515，1998)公開的。通過用BamHI和HindIII消化pCAGGS以去除包含SV40ori的片段(522bp)，制備質(zhì)粒pCA1。經(jīng)消化的質(zhì)粒的5’末端用T4 DNA聚合酶填平。該質(zhì)粒利用T4 DNA連接酶連接以制備表達載體pCA1。所有質(zhì)粒利用Endofree Maxi試劑盒(Qiagen GmbH，Hilden，Germany)純化。
利用1ml注射器與27G注射針，將0.1ml 0.9％生理鹽水中的20μg裸露質(zhì)粒注入Lewis大鼠(雄性，8-周齡，體重250-300g；Sankyo Labo Service(Tokyo，Japan))的骨骼肌或心臟。0.1ml 0.9％生理鹽水中的AxCAZ3腺病毒粒子(1010，5×109，和109OPU)也被注入心臟。為注入骨骼肌，切開后腿2cm長以有助于注入大腿肌肉(Wolff，J.A.等，Science 1990；2471465-1468)。為注入心臟，打開左胸并將裸露的質(zhì)?；蛳俨《玖Ｗ幼⑷胄募獠?Lin，H.等，Circulation 1990；822217-2221)。注入后，切開傷口用絲線縫合。
骨骼肌和心臟中的β-gal活性通過以前報道的方法分析(Shaper，N.L.等，J Boil Chem 1994；26925165-25171)。具體地，在4ml組織裂解緩沖液(100mM磷酸鉀，0.2％ Triton X-100，2mM leupeptin，1mM苯基甲基磺?；?，和0.5mM二硫蘇糖醇，pH 7.8)中勻漿組織(0.8g-1.0g)1min。勻漿化的組織在12,000xg離心10min?；厥丈锨?，在48℃加熱1小時以滅活內(nèi)源性β-半乳糖苷酶活性。上清液中的β-gal活性利用Galacto-LightTM Plus試劑盒(Tropix，Bedford，MA)根據(jù)生產(chǎn)商的說明進行?；瘜W(xué)發(fā)光信號利用MicroLumat LB96光度計(Wallac，Gaitherburg，MD)檢測。以相對光單位(RLU)獲得的數(shù)據(jù)利用重組β-半乳糖苷酶標(biāo)準(zhǔn)品(Roche Diagnostics，Manheim，Germany)轉(zhuǎn)化成LacZ的ng活性。LacZ的組織化學(xué)檢測中，首先在37℃用X-gal溶液對10μm心組織冷凍切片染色24小時(Nabel，E.G等，Science 1989；2441342-1344)。所述切片隨后用伊紅復(fù)染。數(shù)據(jù)表示為平均±S.E。統(tǒng)計學(xué)分析利用Scheffe檢驗進行。當(dāng)p值低于0.05，推定數(shù)據(jù)為有顯著意義的。
本實施例所用裸露質(zhì)粒的劑量(20μg)等同于肢體缺血(Losordo，D.W.等，Circulation 1998；982800-2804)和心臟疾病(Baumgartner，I.等，Circulation 1998；971114-1123)的臨床基因治療試驗中所用劑量(g/kg)。前者利用總量4mg的裸露DNA，后者利用200μg-2,000μg裸露DNA。報道基因自基于CA啟動子的載體和CMV啟動子的載體的表達在本試驗中在大鼠骨骼肌和心臟中檢測。兩種組織都是在臨床心血管基因治療中注入裸露質(zhì)粒的已知位點。將質(zhì)粒注入后腿的大腿肌肉(n＝4)和心臟(n＝4)中后5天，基于CMV啟動子的載體(pcDNA3LacZ和pCMVβ)以及基于CA啟動子的載體(pCAZ2和pCAlLacZ)介導(dǎo)的LacZ在骨骼肌中的表達水平分別為1.6±0.4ng，10.2±2.0ng，37.2±6.9ng，和27.2±6.8ng(圖8A)。在骨骼肌中，基于CA啟動子的載體的報道基因表達水平高于基于CMV啟動子的載體的報道基因表達水平。同樣，由基于CA啟動子的載體介導(dǎo)的被導(dǎo)入基因在心臟中的表達水平(pCAZ2，510.8±69.8ng；pCAlLacZ，509.9±66.7ng)高于由基于CMV啟動子的載體介導(dǎo)的表達水平(pcDNA3LacZ，46.2±13.2ng；pCMVβ，108.8±37.8ng)。對于所有質(zhì)粒，在心臟中，所導(dǎo)入基因的表達水平比在骨骼肌中的所述水平高大約一個數(shù)量級(圖8B)。用pCAlLacZ載體檢測所導(dǎo)入基因的表達水平，所述載體中缺失了SV40ori序列以提高安全性。如圖8所示，骨骼肌和心臟中，pCAlLacZ的LacZ表達水平與pCAZ2的LacZ表達水平?jīng)]有顯著差異。
比較基于CA啟動子的質(zhì)粒載體和腺病毒載體在心臟中的LacZ表達水平。以各種劑量(1010，5×109，和109OPU)(n＝4)將腺病毒載體AxCAZ3注入心尖部。5天后，比較注入了AxCAZ3的心臟中LacZ的表達水平與注入了20μgpCAZ2的心組織中的所述水平。結(jié)果顯示，在心臟中，由20μgpCAZ2介導(dǎo)的被導(dǎo)入基因的平均表達水平與由6.0×109OPU AxCAZ3介導(dǎo)的情況相當(dāng)(圖9)。
注入pcDNA3LacZ(20μg)，pCAZ2(20μg)，或5×109OPU AxCAZ3，然后進行X-gal染色。受試組中的所有樣品中均存在LacZ-陽性肌肉細胞。在注入了pcDNA3LacZ的心臟樣品中的注射位點周圍區(qū)域中，幾乎沒有LacZ-陽性細胞。反之，在利用pCAZ2的情況下，具有高基因表達水平的LacZ-陽性心肌細胞分散存在于注射位點周圍區(qū)域。注入了5×109OPU AxCAZ3的心肌中，所導(dǎo)入基因的表達水平和模式與注入了pCAZ2的組織中的相似。如上所證實，直接投藥質(zhì)粒導(dǎo)致被導(dǎo)入的基因在心肌中非常有效地表達，并獲得與利用腺病毒具體是使用CA啟動子的情況幾乎等同的高水平表達。
通過表達人Ang1基因的負鏈RNA病毒載體將基因?qū)胄募〖毎男Ч迦肓巳薃ng1 cDNA的傳播型(transmissible)仙臺病毒載體(SeVAng1)，通過常規(guī)方法(Kato，A.等，1996，Genes Cell 1569-579；Yu，D.等，1997，GenesCell 2457-466)制備。使用不含有外來基因的SeV(SeVNull)以及大腸桿菌β-半乳糖苷酶基因(LacZ)SeV表達載體(SeVLacZ)被用作對照病毒載體。也使用編碼LacZ的腺病毒載體AxCAZ3進行比較。將SeV載體注入10日齡有胚雞卵的尿囊腔中，使其擴增，然后回收。利用雞紅細胞通過血凝素試驗測定病毒滴度。將病毒保存在-80℃?zhèn)溆?。編碼LacZ(AxCAZ3)的腺病毒載體在人腎293細胞中增殖，并通過在CsCl不連續(xù)密度梯度中超離心得以純化。利用含有10％甘油的PBS對病毒進行透析，保存在-70℃?zhèn)溆?。使用前，檢測病毒母液中的腺病毒密度和滴度，以及有復(fù)制能力腺病毒的任何污染。利用293細胞，通過LD50(噬斑形成單位pfu)和A260(光學(xué)粒子單位opu)測定測定腺病毒滴度。
新生大鼠心肌細胞中腺病毒載體和仙臺病毒載體介導(dǎo)的LacZ基因的表達通過下述方法檢測。新生大鼠心肌細胞通過下述步驟分離。從深度麻醉的新生Lewis大鼠摘出心臟并浸于氧飽和的Tyrode’s溶液(143mM NaCl，5.4mM KCl，1.8mM CaCl2，0.5mM MgCl2，0.33mM NaH2PO4，5.5mM葡萄糖，和5.0mM HEPES)中，分離心室肌肉。所得心室肌肉在37℃、含有膠原酶(5mg/ml；Wako Pure Chemical Industries)的、不含Ca2+的Tyrode’s溶液中保溫1小時以分離心肌細胞。分離的新生大鼠心肌細通過移液到KB溶液(50mM L-谷氨酸，40mM KCl 40，20mM?；撬?，20mM KH2PO4，3mM MgCl2，10mM葡萄糖，0.5mM EGTA，和10mM HEPES)中懸浮5分鐘以制備細胞懸液。在含有10％胎牛血清(FBS)的Dulbecco’s改良的Eagle培養(yǎng)基(DMEM)中，將細胞以5×104/孔接種于24孔板。
通過下述方法將基因?qū)胄律笫笮募〖毎?。如上述將心肌細胞?×104/孔的細胞密度接種于24孔板的孔中，第二天用病毒載體感染。在具有不同感染復(fù)數(shù)(moi對于SeV載體為CIU/細胞；對于Ad載體為pfu/細胞)的病毒溶液中，用SeVLacZ或AxCAZ3在37℃感染新生大鼠心肌細胞1小時，所述病毒溶液已經(jīng)用含有2％胎牛血清(FBS)的DMEM稀釋。利用磷酸鹽緩沖的鹽水(PBS)洗滌細胞，然后在補充了10％FBS的DMEM中培養(yǎng)24小時。檢測細胞的LacZ表達。利用β-gal報道基因測定試劑盒(Roche)以及β-半乳糖苷酶標(biāo)準(zhǔn)樣品(Roche)以β-半乳糖苷酶活性的形式定量檢測LacZ活性。
結(jié)果如圖10所示。以高moi(＞30moi)使用的SeVLacZ和AxCAZ3都實現(xiàn)了所導(dǎo)入基因在大鼠心肌細胞中的高水平表達。即使使用moi低至10或更低的SeV進行感染，報道基因也被高表達。報道基因表達水平以病毒密度依賴的方式增加，并在moi 30或30以上時幾乎達到平臺期。Ad載體介導(dǎo)的向大鼠心肌細胞中導(dǎo)入基因依賴于病毒密度。即使病毒以moi 100感染，表達水平也不能達到最高水平。用moi 10的Ad載體感染的新生大鼠心肌細胞中的LacZ表達水平幾乎與用1moi的SeV載體時的情況一樣。具體地，當(dāng)以低moi(10moi或更低)感染時，SeV載體的基因?qū)胄矢哂贏dV載體。其次，檢測了病毒暴露時間對向新生大鼠心肌細胞中導(dǎo)入基因的影響。當(dāng)使用腺病毒載體時，需要較長時間(120分鐘或更長)以獲得被導(dǎo)入心肌細胞的基因在體外的最高表達。反之，當(dāng)使用SeV載體時，僅僅需要將細胞暴露于病毒溶液短時間(30分鐘或更短)即足以獲得所導(dǎo)入基因在相同條件下的最高表達。
心肌內(nèi)投藥SeV載體介導(dǎo)的基因表達證實了新生大鼠心肌細胞中有效的SeV載體-介導(dǎo)的基因表達。然而，沒有關(guān)于基因在已被投予SeV載體的心臟中的表達的報道或信息，所述SeV載體的投藥是在體內(nèi)經(jīng)心肌內(nèi)投藥。各種濃度的LacZ表達型Ad或SeV載體經(jīng)心肌內(nèi)投藥給正常大鼠心臟。3天后處死大鼠以研究報道基因在心臟中的表達。如下所述在體內(nèi)評估大鼠心臟中自載體的基因表達。通過吸入乙醚、經(jīng)腹腔內(nèi)注入氯胺酮鹽酸鹽(50mg/kg)和甲芐噻嗪(2.5mg/kg)來麻醉Lewis大鼠，然后進行插管。通過開胸手術(shù)打開左胸，利用注射器與30G針，將各種滴度的SeVLacZ或AxCAZ3經(jīng)心肌內(nèi)投藥到心尖部?；?qū)?2小時后處死大鼠，然后評估LacZ表達水平。
結(jié)果顯示于圖11。如該圖所示，心臟中的報道基因表達水平的增加依賴于病毒載體的量。對于利用3.3×109opu Ad載體和利用1×108CIU SeV載體的情況，報道基因表達水平相似。
經(jīng)靜脈內(nèi)或經(jīng)心肌內(nèi)投藥SeV載體所介導(dǎo)的基因表達的器官分布如果血流由于溢出而被病毒粒子污染，并且所述情況發(fā)生在經(jīng)心肌內(nèi)投藥以后，在除心臟以外的器官中所產(chǎn)生的表達可產(chǎn)生副作用，且從臨床角度看是非常嚴(yán)重的問題。然而，沒有關(guān)于靜脈內(nèi)投藥SeV載體后基因表達器官分布的報道。因此，研究了經(jīng)靜脈內(nèi)和經(jīng)心肌內(nèi)投藥后基因表達的器官分布，將SeVLacZ(1×108CIU)通過陰莖靜脈投藥給正常大鼠，72小時后處死所述大鼠。摘出心臟，右肺，肝，右腎和脾，并檢測其中的LacZ表達。同樣，將1×108CIU SeVLacZ或1×109-1×1010opuAxCAZ3經(jīng)心肌內(nèi)投藥給正常大鼠，72小時后處死所述大鼠。摘出心臟，右肺，肝，右腎和脾，并檢測其中的LacZ表達。
測定LacZ表達以前，在裂解緩沖液(100mM磷酸鉀(pH 7.8)，0.2％Triton X-100，1mM二硫蘇糖醇，0.2mM苯基甲基磺?；?，和5μgleupeptin)中勻漿摘出的器官。勻漿物在12,500xg離心10分鐘。產(chǎn)生的上清液在48℃保溫1小時以滅活其中的內(nèi)源性β-半乳糖苷酶活性(Young DC，Anal.Biochemi.215，24-30，1993)。所述上清液利用β-gal報道基因測定試劑盒在室溫處理1小時。上清液中的酶活性通過利用Mini-Lumat LB9506(Berthold)(Shaper NL等J.Biol.Chemi.269(40)，25165-25171，1994)測定化學(xué)發(fā)光來測定?；诶忙?半乳糖苷酶標(biāo)準(zhǔn)樣品制備的標(biāo)準(zhǔn)曲線，將所得結(jié)果(相對光學(xué)單位)轉(zhuǎn)化成β-半乳糖苷酶活性(pg/ml)。
結(jié)果顯示于圖12。如通常所知，由Ad載體導(dǎo)入的外來基因在經(jīng)靜脈內(nèi)投藥后主要在肝內(nèi)表達。而SeV載體與AdV不同；使用SeV載體時，報道基因在肺，心臟以及脾中表達，但幾乎不在肝中表達。附圖中所示結(jié)果通過利用完整器官提取物獲得(“肺”表示右肺和“腎”表示右腎)?？紤]到器官重量，表達水平以心臟＜脾＜肺的順序漸增。經(jīng)心肌內(nèi)投藥后基因表達的器官分布幾乎與經(jīng)靜脈內(nèi)投藥后的情形一樣。因此，由于載體外溢導(dǎo)致的、其它器官中的基因表達所靶向的器官是肺和脾。
通過利用SeV的Ang1基因?qū)雭碇委熜募」Ｈ肧eV載體中的人血管生成素-1(Ang1)進行的心肌梗塞基因治療如下所述。在上述腺病毒載體介導(dǎo)的Ang1基因治療中，所用腺病毒載體為1×1010opu(等于7.5×108pfu)。當(dāng)利用SeV載體將LacZ基因?qū)胄募〖毎?體外)和心臟(體內(nèi))時，基因?qū)胄逝cAd載體相比前者相對較高。因此，試圖用經(jīng)心肌內(nèi)投藥5×107CIU SeVAng1來治療大鼠心肌梗塞。Lewis大鼠通過結(jié)扎左冠狀動脈前降支來處理。結(jié)扎后，立即將5×107CIU SeVAng1分別注入LAD灌注區(qū)周圍左心室前壁中的兩個位點。4周后，通過組織學(xué)方法檢測心肌梗塞中的毛細血管數(shù)目。
大鼠心肌梗塞模型根據(jù)Pfeffer等(Pfeffer，M.A.等Myocardial infarctsize and ventricular function in rats.Cir.Res.44503-512，1979)的方法制備。Lewis大鼠(8周齡，雄性，體重約300g)通過吸入乙醚并經(jīng)腹腔內(nèi)注入70mg/kg氯胺酮及6-7mg/kg甲芐噻嗪來麻醉，然后對大鼠進行插管。通過在分時(minute)換氣量200-250ml，潮氣量3ml，呼吸次數(shù)60-80循環(huán)/min，和O21 l/min的條件下吸入0.5％-2.0％氟烷來麻醉大鼠。進行左胸切開術(shù)。鑒定左前降(LAD)支然后利用6-0不可吸收縫線(尼龍縫線)在左心耳的高度結(jié)扎。小心肋間切口關(guān)閉以便不損傷肺后，連續(xù)縫合關(guān)閉肌肉層和皮膚。
如下述經(jīng)心肌內(nèi)導(dǎo)入SeV載體。結(jié)扎左前降支以后，利用30G針在兩個位點經(jīng)心肌內(nèi)投藥5×107CIU SeVAng1估計為左前降支灌注區(qū)周圍區(qū)的左右兩處。在null組，注入5×107CIU SeVNull而不是SeVAng1，在陰性對照組，注入0.9％生理鹽水。
用Edelberg等(Edelberg JM等Circulation 105，608-613，2001)和Roberts等(Roberts CS et al，Am.J.Cardiol.51，872-876，1983)的方法測定梗塞大小。處死大鼠并在模型制成后4周摘出梗塞心臟。用多聚甲醛固定心臟并包埋于石蠟中。所述切片通過在心尖部和左前降支結(jié)扎位點之間的中間部、沿短軸方向切割來制備。用蘇木頸-伊紅染色和Masson′s三色染色對梗塞位點進行染色。用數(shù)字照相機獲取切片的圖像，然后利用NIH image，以盲性方式確定以下參數(shù)總左室(LV)面積(mm2)，梗塞面積(mm2)，中隔壁厚(mm)，梗塞壁厚(mm)，LV的心外膜和心內(nèi)膜周長(mm)，以及心外膜側(cè)和心內(nèi)膜側(cè)的梗塞長(mm)。
根據(jù)這些結(jié)果，利用以下公式進行評估梗塞大小％梗塞大?。焦Ｈ麉^(qū)/總LV面積×100％梗塞厚＝前壁(梗塞)厚/中隔壁厚×100存活LV域＝(總LV心肌域)-(梗塞心肌面積)；此外，產(chǎn)生心肌梗塞4周后，心肌內(nèi)血管密度通過用抗-CD34單克隆抗體對血管內(nèi)皮細胞進行免疫染色來評估。切片用抗-CD34MoAb(NU-4A1，Nichirei，Tokyo Japan)作為第一單克隆抗體染色，然后用生物素化的抗-小鼠IgG第二單克隆抗體和抗生物素蛋白-辣根過氧化物酶(DAB石蠟IHC染色模件，Ventana Medical System Inc，Tucson，AZ)染色。室間隔部、梗塞位點周圍區(qū)以及心肌梗塞中存活心肌的切片中的血管數(shù)目以盲性方式在200倍放大率的顯微鏡下測定。結(jié)果表示為血管數(shù)/mm2。
心肌梗塞的SeV Ang1治療后，梗塞面積和厚度顯示于圖13。將對照載體SeVNull投藥給心肌不導(dǎo)致心肌梗塞大小和厚度的明顯改善。反之，在用SeVAng1治療的組中，梗塞大小減小且梗塞厚度明顯增加，這與利用表達Angl的腺病毒載體治療心肌梗塞的情況類似。血管數(shù)目的評估也顯示，梗塞和梗塞周圍心肌中的毛細血管數(shù)目在用SeVAng1治療的組中顯著增加(圖14)。因此，在大鼠心肌梗塞模型中，即使是較低病毒滴度的SeVAng1也可產(chǎn)生與Ad載體等同的治療效果。
大鼠下肢缺血模型中SeVAng1的治療效果Lewis大鼠(8-周齡，雄性，體重約300g)通過吸入乙醚，并經(jīng)上肢肌內(nèi)注入40mg/kg氯胺酮和4mg/kg甲芐噻嗪而被麻醉。兩側(cè)下肢剃毛后，切開腹部以及左鼠蹊部，暴露右髂動脈，右股動脈，以及其分支。結(jié)扎右髂動脈及其分支后，也在左股動脈分成腘動脈和股深動脈處之前、左股動脈起點處進行結(jié)扎。此外，鑒定并結(jié)扎左股動脈的所有其它分支，然后手術(shù)切除左股動脈。手術(shù)中，利用30G針，將5×107CIU SeV載體投藥到股直肌上的兩個位點。證實沒有出血后，縫合手術(shù)切口，完成手術(shù)。在null組，注入5×107CIU SeVNull而不是SeVAng1，在陰性對照組，注入0.9％生理鹽水。
血流分析利用Laser-Doppler成像法如下述分析。利用Laser Doppler系統(tǒng)(Moor LDI，Moor Instruments，Devon，United Kingdom)，在缺血后兩周內(nèi)連續(xù)(缺血后第1，3，7，148天)測定下肢中的血流。通過吸入乙醚麻醉大鼠，并用氯胺酮(25mg/kg)和甲芐噻嗪(2mg/kg)進一步麻醉并鎮(zhèn)靜。大鼠在37℃保持10分鐘，然后分析其血流。連續(xù)血流測定在相同大鼠的相同的點測定。分析所得血流圖像以估計足和雙下肢腓腸肌區(qū)中的平均血流。為減少測定條件的影響，隨后計算缺血側(cè)(左下肢)與正常側(cè)(右下肢)的血流比(組織血流比缺血側(cè)血流/正常側(cè)血流)。
大鼠下肢缺血模型制成3天后，觀察到患病肢體中血流的嚴(yán)重堵塞與健康肢體相比，生理鹽水-治療的組中的血流為45％；與健康肢體相比，SeV載體對照組(SeVNull)中的血流為48％。在用SeVAng1治療的組中，在第三天患病肢體中的血流非常高63％。在用生理鹽水治療的組和用SeVNull治療的組中，患病肢體中血流的自發(fā)性恢復(fù)在缺血模型制成后7和14天被發(fā)現(xiàn)。投藥SeVAng1可促進血流恢復(fù)，14天后，血流改善到健康肢體中的87％(圖15)。
利用導(dǎo)入了Ang1基因的間充質(zhì)細胞來治療肢體缺血據(jù)報道間充質(zhì)干細胞(MSC)不僅分化成間充質(zhì)組織諸如骨和脂肪組織，也分化成心肌組織，肌肉組織等。此外，據(jù)報道，MSC可分泌各種血管生成因子，并誘導(dǎo)血管生成。該實施例中，將MSC移植產(chǎn)生的血流改善效應(yīng)與基因治療的所述效應(yīng)相比較。此外，制備經(jīng)過遺傳修飾的MSC用于抗-缺血治療。
根據(jù)以前的報道(Tsuda，H.，T.Wada，等(2003)Mol Ther 7(3)354-65)，自Lewis大鼠股骨分離大鼠心間充質(zhì)干細胞(MSC)。所述股骨的兩端被切除，并通過利用注射器用含10％FBS的Dulbecco′s改良的Eagle′s培養(yǎng)基(DMEM)沖洗所述骨來回收骨髓。產(chǎn)生的骨髓懸液連續(xù)通過18，20，和22G針來制備骨髓細胞懸液。所得骨髓細胞以細胞密度5×107有核細胞/10cm接種于培養(yǎng)皿，并在培養(yǎng)基(含有10％FBS，100μg/ml鏈霉素，0.25μg/ml兩性霉素，和2mM L-谷氨酰胺的DMEM)中培養(yǎng)4天。培養(yǎng)基每3-4天更換，以去除漂浮的細。對貼壁細胞進行傳代并用作大鼠MSC。
大鼠下肢缺血模型如實施例13所述制備，制成后立即將5×106大鼠MSC投藥給骨直肌。表達血管生成素-1(Ang1)基因的仙臺病毒載體用于通過基因治療來治療的組中。利用Laser Doppler成像法按時間順序測定組織血流(患病肢體/健康肢體)。產(chǎn)生缺血以后3天，在對照(培養(yǎng)基)組觀察到嚴(yán)重缺血，其血流比為48.2％。7天后血流恢復(fù)到60％，然后到達平臺。第3天和第7天，MSC-投藥組的血流與對照組的血流之間沒有差異。第14天，MSC-投藥組的血流顯著改善到89％。通過基因治療來治療的組中，血流在早期階段就得以改善，第3天為63％。第14天，血流達到87％。
制備結(jié)合了基因治療與細胞治療優(yōu)點的經(jīng)遺傳修飾的MSC。已知MSC對于物理和化學(xué)基因誘導(dǎo)法以及病毒載體法諸如逆轉(zhuǎn)錄病毒和腺病毒相對抵抗。因此，利用仙臺病毒載體將基因?qū)氪笫箝g充質(zhì)干細胞，仙臺病毒載體在多種原代細胞培養(yǎng)物中顯示高效率基因?qū)?，并且將所述效率與利用腺病毒載體所得到的效率相比較。
如下所述將基因?qū)氪笫驧SC。以細胞密度2.5×104細胞/孔將大鼠MSC接種于24孔板，第二天用病毒載體(SeVLacZ或AxCAZ3)感染所述細胞。在具有不同感染復(fù)數(shù)(moi對于SeV載體為CIU/細胞；對于Ad載體為pfu/細胞)的病毒溶液中，用SeVLacZ或AxCAZ3在37℃感染新生大鼠心肌細胞1小時，所述病毒溶液已經(jīng)用含有2％胎牛血清(FBS)的DMEM稀釋。然后所述細胞用磷酸鹽緩沖的鹽水(PBS)洗滌，并培養(yǎng)于含有10％FBS的DMEM中24小時。分析細胞的LacZ表達。利用β-gal報道基因測定試劑盒(Roche)分析LacZ活性。
結(jié)果顯示于圖16。即使所述用低moi(3moi或更低)的SeV進行感染，報道基因仍以高水平表達。表達水平的增加依賴于病毒濃度，在moi 30或更高時幾乎到達平臺。反之，利用Ad載體將基因?qū)氪笫驧SC依賴于病毒濃度，表達水平在為比較而進行檢測的任何病毒濃度條件下都低，在moi30或更低時，所述表達水平為利用SeV載體所獲得表達水平的百分之一或百分之一以下。用X-gal對由moil00的SeV載體或Ad載體導(dǎo)入了LacZ基因的MSC進行染色。結(jié)果，陽性細胞的數(shù)目在使用Ad載體的情況下相對較少，但使用SeV載體的情況下，幾乎所有細胞均為LacZ-陽性(圖17)。
大鼠重癥肢體缺血模型通過利用導(dǎo)入了Ang1基因的MSC的抗缺血療法治療。間充質(zhì)干細胞(MSC)分離自Lewis大鼠(8-周齡，雄性)，并根據(jù)以前的報道進行培養(yǎng)(Tsuda，H.，T.Wada，等(2003)Mol Ther 7(3)354-65)。所得MSC用SeVAng1以moi 2在37℃感染1小時以制備經(jīng)過遺傳修飾的MSC?；?qū)牒?4小時，將經(jīng)過遺傳修飾的MSC(5×106細胞)投藥給大鼠下肢缺血模型(該模型如實施例13所述制備)。缺血后立即注入經(jīng)過遺傳修飾的MSC。通過分析laser Doppler圖像檢測肢體中的血流。數(shù)據(jù)表示為％血流(缺血側(cè)血流/正常側(cè)血流×l00)。與對照相比，導(dǎo)入了Ang1基因的MSC的植入導(dǎo)致在治療后3天，缺血肢體中的血流顯著改善(圖18)。7天后，直接投藥SeVAng1，血流改善更佳(圖18)。
利用負鏈RNA病毒載體的基因?qū)雽ο挛乃鲇韶撴淩NA病毒載體介導(dǎo)的、將基因?qū)氩溉閯游锛毎男逝c利用腺病毒載體的情況所得效率進行比較。
(1)培養(yǎng)的細胞系表達LacZ基因的SeV載體(SeV-LacZ)或腺病毒載體(AxCAZ3)被用于以各種病毒密度感染Hela細胞1小時。載體感染24小時后，利用β-半乳糖苷酶報道基因測定試劑盒或通過X-gal染色測定LacZ活性。當(dāng)SeV載體以10的低MOI或更低的MOI(具體為MOI 0.3-3)使用時，SeV載體高水平表達所導(dǎo)入的基因，所述表達水平比利用腺病毒載體的情況高得多(圖19A)。通過X-gal染色檢驗導(dǎo)入了所述基因的細胞。使用SeV載體時，已經(jīng)導(dǎo)入了基因的細胞的比例明顯高于使用腺病毒載體的情況，個體細胞中所導(dǎo)入基因的表達水平明顯高于使用腺病毒載體的情況(圖19B)。
(2)人口腔鱗狀上皮細胞癌為檢測所述載體的基因?qū)胄Ч肧eV載體將基因?qū)肴丝谇击[狀上皮癌細胞系HSC3(JCRB Cell BankJCRB0623，Rikimaru，K.等，In VitroCell Dev.Biol.，26849-856，1990)和OSC19(JCRB Cell BankJCRB0198，Yokoi，T.等，Tumor Res.，2343-57，1988；Yokoi，T.等，Tumor res.，2457-77，1989；Kawahara，E.等，Jpn.J.Cancer Res.，84409-418，1993；Kawahara，E.等，Jpn J.Cancer Res，84409-418，1993；Kawashiri，S.等，Eur.J.Cancer B OralOncol.，31B216-221，1995)，所述細胞系抵抗利用腺病毒載體(AxCAZ3)的基因?qū)搿Ｓ酶鞣NMOI的SeV-LacZ或AxCAZ3感染1小時以后，利用β-半乳糖苷酶報道基因測定試劑盒測定LacZ活性。在任何受試MOI條件下，SeV-LacZ-介導(dǎo)的將基因?qū)隣SC19和HSC3的效率高于利用AxCAZ3的情況(圖20)。即使在HSC3中，也證實了利用SeV載體的高效率基因?qū)?，HSC3對野生型腺病毒和靶向整聯(lián)素的腺病毒顯示抗性(adenovirus withRGD-modified fiber，Dehari H，Ito Y等Cancer Gene Therapy 1075-85，2003)，并且將基因?qū)肫渲蟹浅＠щy。因此，SeV載體非常適于將基因?qū)肟谇击[狀上皮癌細胞。
(3)人巨噬細胞和樹突細胞比較SeV將基因?qū)肴司奘杉毎蜆渫患毎男逝c腺病毒載體將基因?qū)肴司奘杉毎蜆渫患毎男?。表達LacZ的SeV和腺病毒載體各自以MOI 1感染1小時。載體感染后24小時，LacZ活性利用β-半乳糖苷酶報道基因測定試劑盒測定。當(dāng)使用SeV載體時，表達水平比使用腺病毒載體的情況高1000倍或1000倍以上(圖21)。因此，SeV載體非常適用于件基因?qū)刖奘杉毎蜆渫患毎?br> 工業(yè)可用性本發(fā)明提供了用于缺血疾病治療的新的藥劑和方法。本發(fā)明的方法作為安全有效且副作用較小的缺血疾病治療方法是非常好的。目前，手術(shù)再血管化方法諸如經(jīng)皮經(jīng)腔冠狀動脈成型術(shù)(PTCA)和冠狀動脈旁路移植術(shù)(CABG)被主要地用于治療急性心肌梗塞。本發(fā)明的方法中，利用基因改造技術(shù)可促進再血管化。因此，心功能的主動改善以及臥床時間縮短是可預(yù)期的。此外，本發(fā)明的方法在肢體缺血等的治療中產(chǎn)生非常好的治療效果。
序列表<110>株式會社載體研究所(DNAVEC RESEARCH INC.)<120>缺血疾病的治療方法<130>D3-A0208P<150>JP 2003-040806<151>2003-02-19<160>9<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>3372<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<220>
<221>CDS<222>(1)..(3372)<223>
<400>1atg gac tct tta gcc agc tta gtt ctc tgt gga gtc agc ttg ctc ctt 48Met Asp Ser Leu Ala Ser Leu Val Leu Cys Gly Val Ser Leu Leu Leu1 5 10 15tct gga act gtg gaa ggt gcc atg gac ttg atc ttg atc aat tcc cta 96Ser GIy Thr Val Glu Gly Ala Met Asp Leu Ile Leu Ile Asn Ser Leu20 25 30cct ctt gta tct gat gct gaa aca tct ctc acc tgc att gcc tct ggg 144Pro Leu Val Ser Asp Ala Glu Thr Ser Leu Thr Cys Ile Ala Ser Gly35 40 45tgg cgc ccc cat gag ccc atc acc ata gga agg gac ttt gaa gcc tta 192Trp Arg Pro His Glu Pro lle Thr Ile Gly Arg Asp Phe Glu Ala Leu50 55 60atg aac cag cac cag gat ccg ctg gaa gtt act caa gat gtg acc aga 240
Met Asn Gln His Gln Asp Pro Leu Glu Val Thr Gln Asp Val Thr Arg65 70 75 80gaa tgg gct aaa aaa gtt gtt tgg aag aga gaa aag gct agt aag atc 288Glu Trp Ala Lys Lys Val Val Trp Lys Arg Glu Lys Ala Ser Lys Ile85 90 95aat ggt gct tat ttc tgt gaa ggg cga gtt cga gga gag gca atc agg 336Asn Gly Ala Tyr Phe Cys Glu Gly Arg Val Arg Gly Glu Ala Ile Arg100 105 110ata cga acc atg aag atg cgt caa caa gct tcc ttc cta cca gct act 384Ile Arg Thr Met Lys Met Arg Gln Gln Ala Ser Phe Leu Pro Ala Thr115 120 125tta act atg act gtg gac aag gga gat aac gtg aac ata tct ttc aaa 432Leu Thr Met Thr Val Asp Lys Gly Asp Asn Val Asn Ile Ser Phe Lys130 135 140aag gta ttg att aaa gaa gaa gat gca gtg att tac aaa aat ggt tcc 480Lys Val Leu Ile Lys Glu Glu Asp Ala Val Ile Tyr Lys Asn Gly Ser145 150 155 160ttc atc cat tca gtg ccc cgg cat gaa gta cct gat att cta gaa gta 528Phe Ile His Ser Val Pro Arg His Glu Val Pro Asp Ile Leu Glu Val165 170 175cac ctg cct cat gct cag ccc cag gat gct gga gtg tac tcg gcc agg 576His Leu Pro His Ala Gln Pro Gln Asp Ala Gly Val Tyr Ser Ala Arg180 185 190tat ata gga gga aac ctc ttc acc tcg gcc ttc acc agg ctg ata gtc 624Tyr Ile Gly Gly Asn Leu Phe Thr Ser Ala Phe Thr Arg Leu Ile Val195 200 205cgg aga tgt gaa gcc cag aag tgg gga cct gaa tgc aac cat ctc tgt 672Arg Arg Cys Glu Ala Gln Lys Trp Gly Pro Glu Cys Asn His Leu Cys210 215 220act gct tgt atg aac aat ggt gtc tgc cat gaa gat act gga gaa tgc 720Thr Ala Cys Met Asn Asn Gly Val Cys His Glu Asp Thr Gly Glu Cys225 230 235 240att tgc cct cct ggg ttt atg gga agg acg tgt gag aag gct tgt gaa 768
Ile Cys Pro Pro Gly Phe Met Gly Arg Thr Cys Glu Lys Ala Cys Glu245 250 255ctg cac acg ttt ggc aga act tgt aaa gaa agg tgc agt gga caa gag 816Leu His Thr Phe Gly Arg Thr Cys Lys Glu Arg Cys Ser Gly Gln Glu260 265 270gga tgc aag tct tat gtg ttc tgt ctc cct gac ccc tat ggg tgt tcc 864Gly Cys Lys Ser Tyr Val Phe Cys Leu Pro Asp Pro Tyr Gly Cys Ser275 280 285tgt gcc aca ggc tgg aag ggt ctg cag tgc aat gaa gca tgc cac cct 912Cys Ala Thr Gly Trp Lys Gly Leu Gln Cys Asn Glu Ala Cys His Pro290 295 300ggt ttt tac ggg cca gat tgt aag ctt agg tgc agc tgc aac aat ggg 960Gly Phe Tyr Gly Pro Asp Cys Lys Leu Arg Cys Ser Cys Asn Asn Gly305 310 315 320gag atg tgt gat cgc ttc caa gga tgt ctc tgc tct cca gga tgg cag 1008Glu Met Cys Asp Arg Phe Gln Gly Cys Leu Cys Ser Pro Gly Trp Gln325 330 335ggg ctc cag tgt gag aga gaa ggc ata ccg agg atg acc cca aag ata 1056Gly Leu Gln Cys Glu Arg Glu Gly Ile Pro Arg Met Thr Pro Lys Ile340 345 350gtg gat ttg cca gat cat ata gaa gta aac agt ggt aaa ttt aat ccc 1104Val Asp Leu Pro Asp His Ile Glu Val Asn Ser Gly Lys Phe Asn Pro355 360 365att tgc aaa gct tct ggc tgg ccg cta cct act aat gaa gaa atg acc 1152Ile Cys Lys Ala Ser Gly Trp Pro Leu Pro Thr Asn Glu Glu Met Thr370 375 380ctg gtg aag ccg gat ggg aca gtg ctc cat cca aaa gac ttt aac cat 1200Leu Val Lys Pro Asp Gly Thr Val Leu His Pro Lys Asp Phe Asn His385 390 395 400acg gat cat ttc tca gta gcc ata ttc acc atc cac cgg atc ctc ccc 1248Thr Asp His Phe Ser Val Ala Ile Phe Thr Ile His Arg Ile Leu Pro405 410 415cct gac tca gga gtt tgg gtc tgc agt gtg aac aca gtg gct ggg atg 1296
Pro Asp Ser Gly Val Trp Val Cys Ser Val Asn Thr Val Ala Gly Met420 425 430gtg gaa aag ccc ttc aac att tct gtt aaa gtt ctt cca aag ccc ctg 1344Val Glu Lys Pro Phe Asn Ile Ser Val Lys Val Leu Pro Lys Pro Leu435 440 445aat gcc cca aac gtg att gac act gga cat aac ttt gct gtc atc aac 1392Asn Ala Pro Asn Val Ile Asp Thr Gly His Asn Phe Ala Val Ile Asn450 455 460atc agc tct gag cct tac ttt ggg gat gga cca atc aaa tcc aag aag 1440Ile Ser Ser Glu Pro Tyr Phe Gly Asp Gly Pro Ile Lys Ser Lys Lys465 470 475 480ctt cta tac aaa ccc gtt aat cac tat gag gct tgg caa cat att caa 1488Leu Leu Tyr Lys Pro Val Asn His Tyr Glu Ala Trp Gln His Ile Gln485 490 495gtg aca aat gag att gtt aca ctc aac tat ttg gaa cct cgg aca gaa 1536Val Thr Asn Glu Ile Val Thr Leu Asn Tyr Leu Glu Pro Arg Thr Glu500 505 510tat gaa ctc tgt gtg caa ctg gtc cgt cgt gga gag ggt ggg gaa ggg 1584Tyr Glu Leu Cys Val Gln Leu Val Arg Arg GlyGlu Gly Gly Glu Gly515 520 525cat cct gga cct gtg aga cgc ttc aca aca gct tct atc gga ctc cct 1632His Pro Gly Pro Val Arg Arg Phe Thr Thr Ala Ser Ile Gly Leu Pro530 535 540cct cca aga ggt cta aat ctc ctg cct aaa agt cag acc act cta aat 1680Pro Pro Arg Gly Leu Asn Leu Leu Pro Lys Ser Gln Thr Thr Leu Asn545 550 555 560ttg acc tgg caa cca ata ttt cca agc tcg gaa gat gac ttt tat gtt 1728Leu Thr Trp Gln Pro Ile Phe Pro Ser Ser Glu Asp Asp Phe Tyr Val565 570 575gaa gtg gag aga agg tct gtg caa aaa agt gat cag cag aat att aaa 1776Glu Val Glu Arg Arg Ser Val Gln Lys Ser Asp Gln Gln Asn Ile Lys580 585 590gtt cca ggc aac ttg act tcg gtg cta ctt aac aac tta cat ccc agg 1824
Val Pro Gly Asn Leu Thr Ser Val Leu Leu Asn Asn Leu His Pro Arg595 600 605gag cag tac gtg gtc cga gct aga gtc aac acc aag gcc cag ggg gaa 1872Glu Gln Tyr Val Val Arg Ala Arg Val Asn Thr Lys Ala Gln Gly Glu610 615 620tgg agt gaa gat ctc act gct tgg acc ctt agt gac att ctt cct cct 1920Trp Ser Glu Asp Leu Thr Ala Trp Thr Leu Ser Asp Ile Leu Pro Pro625 630 635 640caa cca gaa aac atc aag att tcc aac att aca cac tcc tcg gct gtg 1968Gln Pro Glu Asn Ile Lys Ile Ser Asn Ile Thr His Ser Ser Ala Val645 650 655att tct tgg aca ata ttg gat ggc tat tct att tct tct att act atc 2016Ile Ser Trp Thr Ile Leu Asp Gly Tyr Ser Ile Ser Ser Ile Thr Ile660 665 670cgt tac aag gtt caa ggc aag aat gaa gac cag cac gtt gat gtg aag 2064Arg Tyr Lys Val Gln Gly Lys Asn Glu Asp Gln His Val Asp Val Lys675 680 685ata aag aat gcc acc atc att cag tat cag ctc aag ggc cta gag cct 2112Ile Lys Asn Ala Thr Ile Ile Gln Tyr Gln Leu Lys Gly Leu Glu Pro690 695 700gaa aca gca tac cag gtg gac att ttt gca gag aac aac ata ggg tca 2160Glu Thr Ala Tyr Gln Val Asp Ile Phe Ala Glu Asn Asn Ile Gly Ser705 710 715 720agc aac cca gcc ttt tct cat gaa ctg gtg acc ctc cca gaa tct caa 2208Ser Asn Pro Ala Phe Ser His Glu Leu Val Thr Leu Pro Glu Ser Gln725 730 735gca cca gcg gac ctc gga ggg ggg aag atg ctg ctt ata gcc atc ctt 2256Ala Pro Ala Asp Leu Gly Gly Gly Lys Met Leu Leu Ile Ala Ile Leu740 745 750ggc tct gct gga atg acc tgc ctg act gtg ctg ttg gcc ttt ctg atc 2304Gly Ser Ala Gly Met Thr Cys Leu Thr Val Leu Leu Ala Phe Leu Ile755 760 765ata ttg caa ttg aag agg gca aat gtg caa agg aga atg gcc caa gcc 2352
Ile Leu Gln Leu Lys Arg Ala Asn Val Gln Arg Arg Met Ala Gln Ala770 775 780ttc caa aac gtg agg gaa gaa cca gct gtg cag ttc aac tca ggg act 2400Phe Gln Asn Val Arg Glu Glu Pro Ala Val Gln Phe Asn Ser Gly Thr785 790 795 800ctg gcc cta aac agg aag gtc aaa aac aac cca gat cct aca att tat 2448Leu Ala Leu Asn Arg Lys Val Lys Asn Asn Pro Asp Pro Thr Ile Tyr805 810 815cca gtg ctt gac tgg aat gac atc aaa ttt caa gat gtg att ggg gag 2496Pro Val Leu Asp Trp Asn Asp Ile Lys Phe Gln Asp Val Ile Gly Glu820 825 830ggc aat ttt ggc caa gtt ctt aag gcg cgc atc aag aag gat ggg tta 2544Gly Asn Phe Gly Gln Val Leu Lys Ala Arg Ile Lys Lys Asp Gly Leu835 840 845cgg atg gat gct gcc atc aaa aga atg aaa gaa tat gcc tcc aaa gat 2592Arg Met Asp Ala Ala Ile Lys Arg Met Lys Glu Tyr Ala Ser Lys Asp850 855 860gat cac agg gac ttt gca gga gaa ctg gaa gtt ctt tgt aaa ctt gga 2640Asp His Arg Asp Phe Ala Gly Glu Leu Glu Val Leu Cys Lys Leu Gly865 870 875 880cac catcca aac atc atc aat ctc tta gga gca tgt gaa cat cga ggc 2688His His Pro Asn Ile Ile Asn Leu Leu Gly Ala Cys Glu His Arg Gly885 890 895tac ttg tac ctg gcc att gag tac gcg ccc cat gga aac ctt ctg gac 2736Tyr Leu Tyr Leu Ala Ile Glu Tyr Ala Pro His Gly Asn Leu Leu Asp900 905 910ttc ctt cgc aag agc cgt gtg ctg gag acg gac cca gca ttt gcc att 2784Phe Leu Arg Lys Ser Arg Val Leu Glu Thr Asp Pro Ala Phe Ala Ile915 920 925gcc aat agc acc gcg tcc aca ctg tcc tcc cag cag ctc ctt cac ttc 2832Ala Asn Ser Thr Ala Ser Thr Leu Ser Ser Gln Gln Leu Leu Hi s Phe930 935 940gct gcc gac gtg gcc cgg ggc atg gac tac ttg agc caa aaa cag ttt 2880
Ala Ala Asp Val Ala Arg Gly Met Asp Tyr Leu Ser Gln Lys Gln Phe945 950 955 960atc cac agg gat ctg gct gcc aga aac att tta gtt ggt gaa aac tat 2928Ile His Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Ile Leu Val Gly Glu Asn Tyr965 970 975gtg gca aaa ata gca gat ttt gga ttg tcc cga ggt caa gag gtg tac 2976Val Ala Lys Ile Ala Asp Phe Gly Leu Ser Arg Gly Gln Glu Val Tyr980 985 990gtg aaa aag aca atg gga agg ctc cca gtg cgc tgg atg gcc atc gag 3024Val Lys Lys Thr Met Gly Arg Leu Pro Val Arg Trp Met Ala Ile Glu995 10001005tca ctg aat tac agt gtg tac aca acc aac agt gat gta tgg tcc 3069Ser Leu Asn Tyr Ser Val Tyr Thr Thr Asn Ser Asp Val Trp Ser1010l0l51020tat ggt gtg tta cta tgg gag att gtt agc tta gga ggc aca ccc 3114Tyr Gly Val Leu Leu Trp Glu Ile Val Ser Leu Gly Gly Thr Pro102510301035tac tgc ggg atg act tgt gca gaa ctc tac gag aag ctg ccc cag 3159Tyr Cys Gly Met Thr Cys Ala Glu Leu Tyr Glu Lys Leu Pro Gln104010451050ggc tac aga ctg gag aag ccc ctg aac tgt gat gat gag gtg tat 3204Gly Tyr Arg Leu Glu Lys Pro Leu Asn Cys Asp Asp Glu Val Tyr105510601065gat cta atg aga caa tgc tgg cgg gag aag cct tat gag agg cca 3249Asp Leu Met Arg Gln Cys Trp Arg Glu Lys Pro Tyr Glu Arg Pro107010751080tca ttt gcc cag ata ttg gtg tcc tta aac aga atg tta gag gag 3294Ser Phe Ala Gln Ile Leu Val Ser Leu Asn Arg Met Leu Glu Glu108510901095cga aag acc tac gtg aat acc acg ctt tat gag aag ttt act tat 3339Arg Lys Thr Tyr Val Asn Thr Thr Leu Tyr Glu Lys Phe Thr Tyr110011051110gca gga att gac tgt tct gct gaa gaa gcg gcc 3372
Ala Gly Ile Asp Cys Ser Ala Glu Glu Ala Ala11151120<210>2<211>1124<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>2Met Asp Ser Leu Ala Ser Leu Val Leu Cys Gly Val Ser Leu Leu Leul 5 10 15Ser Gly Thr Val Glu Gly Ala Met Asp Leu Ile Leu Ile Asn Ser Leu20 25 30Pro Leu Val Ser Asp Ala Glu Thr Ser Leu Thr Cys Ile Ala Ser Gly35 40 45Trp Arg Pro His Glu Pro Ile Thr Ile Gly Arg Asp Phe Glu Ala Leu50 55 60Met Asn Gln His Gln Asp Pro Leu Glu Val Thr Gln Asp Val Thr Arg65 70 75 80Glu Trp Ala Lys Lys Val Val Trp Lys Arg Glu Lys Ala Ser Lys Ile85 90 95Asn Gly Ala Tyr Phe Cys Glu Gly Arg Val Arg Gly Glu Ala Ile Arg100 105 110Ile Arg Thr Met Lys Met Arg Gln Gln Ala Ser Phe Leu Pro Ala Thr115 120 125Leu Thr Met Thr Val Asp Lys Gly Asp Asn Val Asn Ile Ser Phe Lys130 135 140Lys Val Leu Ile Lys Glu Glu Asp Ala Val Ile Tyr Lys Asn Gly Ser145 150 155 160Phe Ile His Ser Val Pro Arg His Glu Val Pro Asp Ile Leu Glu Val165 170 175His Leu Pro His Ala Gln Pro Gln Asp Ala Gly Val Tyr Ser Ala Arg
180 185 190Tyr Ile Gly Gly Asn Leu Phe Thr Ser Ala Phe Thr Arg Leu Ile Val195 200 205Arg Arg Cys Glu Ala Gln Lys Trp Gly Pro Glu Cys Asn His Leu Cys210 215 220Thr Ala Cys Met Asn Asn Gly Val Cys His Glu Asp Thr Gly Glu Cys225 230 235 240Ile Cys Pro Pro Gly Phe Met Gly Arg Thr Cys Glu Lys Ala Cys Glu245 250 255Leu His Thr Phe Gly Arg Thr Cys Lys Glu Arg Cys Ser Gly Gln Glu260 265 270Gly Cys Lys Ser Tyr Val Phe Cys Leu Pro Asp Pro Tyr Gly Cys Ser275 280 285Cys Ala Thr Gly Trp Lys Gly Leu Gln Cys Asn Glu Ala Cys His Pro290 295 300Gly Phe Tyr Gly Pro Asp Cys Lys Leu Arg Cys Ser Cys Asn Asn Gly305 3l0 315 320Glu Met Cys Asp Arg Phe Gln Gly Cys Leu Cys Ser Pro Gly Trp Gln325 330 335Gly Leu Gln Cys Glu Arg Glu Gly Ile Pro Arg Met Thr Pro Lys Ile340 345 350Val Asp Leu Pro Asp His Ile Glu Val Asn Ser Gly Lys Phe Asn Pro355 360 365Ile Cys Lys Ala Ser Gly Trp Pro Leu Pro Thr Asn Glu Glu Met Thr370 375 380Leu Val Lys Pro Asp Gly Thr Val Leu His Pro Lys Asp Phe Asn His385 390 395 400Thr Asp His Phe Ser Val Ala Ile Phe Thr Ile His Arg Ile Leu Pro405 410 415
Pro Asp Ser Gly Val Trp Val Cys Ser Val Asn Thr Val Ala Gly Met420 425 430Val Glu Lys Pro Phe Asn Ile Ser Val Lys Val Leu Pro Lys Pro Leu435 440 445Asn Ala Pro Asn Val Ile Asp Thr Gly His Asn Phe Ala Val Ile Asn450 455 460Ile Ser Ser Glu Pro Tyr Phe Gly Asp Gly Pro Ile Lys Ser Lys Lys465 470 475 480Leu Leu Tyr Lys Pro Val Asn His Tyr Glu Ala Trp Gln His Ile Gln485 490 495Val Thr Asn Glu Ile Val Thr Leu Asn Tyr Leu Glu Pro Arg Thr Glu500 505 510Tyr Glu Leu Cys Val Gln Leu Val Arg Arg Gly Glu Gly Gly Glu Gly515 520 525His Pro Gly Pro Val Arg Arg Phe Thr Thr Ala Ser Ile Gly Leu Pro530 535 540Pro Pro Arg Gly Leu Asn Leu Leu Pro Lys Ser Gln Thr Thr Leu Asn545 550 555 560Leu Thr Trp Gln Pro Ile Phe Pro Ser Ser Glu Asp Asp Phe Tyr Val565 570 575Glu Val Glu Arg Arg Ser Val Gln Lys Ser Asp Gln Gln Asn Ile Lys580 585 590Val Pro Gly Asn Leu Thr Ser Val Leu Leu Asn Asn Leu His Pro Arg595 600 605Glu Gln Tyr Val Val Arg Ala Arg Val Asn Thr Lys Ala Gln Gly Glu610 615 620Trp Ser Glu Asp Leu Thr Ala Trp Thr Leu Ser Asp Ile Leu Pro Pro625 630 635 640Gln Pro Glu Asn Ile Lys Ile Ser Asn Ile Thr His Ser Ser Ala Val645 650 655
Ile Ser Trp Thr Ile Leu Asp Gly Tyr Ser Ile Ser Ser Ile Thr Ile660 665 670Arg Tyr Lys Val Gln Gly Lys Asn Glu Asp Gln His Val Asp Val Lys675 680 685Ile Lys Asn Ala Thr Ile Ile Gln Tyr Gln Leu Lys Gly Leu Glu Pro690 695 700Glu Thr Ala Tyr Gln Val Asp Ile Phe Ala Glu Asn Asn Ile Gly Ser705 710 715 720Ser Asn Pro Ala Phe Ser His Glu Leu Val Thr Leu Pro Glu Ser Gln725 730 735Ala Pro Ala Asp Leu Gly Gly Gly Lys Met Leu Leu Ile Ala Ile Leu740 745 750Gly Ser Ala Gly Met Thr Cys Leu Thr Val Leu Leu Ala Phe Leu Ile755 760 765Ile Leu Gln Leu Lys Arg Ala Asn Val Gln Arg Arg Met Ala Gln Ala770 775 780Phe Gln Asn Val Arg Glu Glu Pro Ala Val Gln Phe Asn Ser Gly Thr785 790 795 800Leu Ala Leu Asn Arg Lys Val Lys Asn Asn Pro Asp Pro Thr Ile Tyr805 810 815Pro Val Leu Asp Trp Asn Asp Ile Lys Phe Gln Asp Val Ile Gly Glu820 825 830Gly Asn Phe Gly Gln Val Leu Lys Ala Arg Ile Lys Lys Asp Gly Leu835 840 845Arg Met Asp Ala Ala Ile Lys Arg Met Lys Glu Tyr Ala Ser Lys Asp850 855 860Asp His Arg Asp Phe Ala Gly Glu Leu Glu Val Leu Cys Lys Leu Gly865 870 875 880His His Pro Asn Ile Ile Asn Leu Leu Gly Ala Cys Glu His Arg Gly
885 890 895Tyr Leu Tyr Leu Ala Ile Glu Tyr Ala Pro His Gly Asn Leu Leu Asp900 905 9l0Phe Leu Arg Lys Ser Arg Val Leu Glu Thr Asp Pro Ala Phe Ala Ile915 920 925Ala Asn Ser Thr Ala Ser Thr Leu Ser Ser Gln Gln Leu Leu His Phe930 935 940Ala Ala Asp Val Ala Arg Gly Met Asp Tyr Leu Ser Gln Lys Gln Phe945 950 955 960Ile His Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Ile Leu Val Gly Glu Asn Tyr965 970 975Val Ala Lys Ile Ala Asp Phe Gly Leu Ser Arg Gly Gln Glu Val Tyr980 985 990Val Lys Lys Thr Met Gly Arg Leu Pro Val Arg Trp Met Ala Ile Glu995 10001005Ser Leu Asn Tyr Ser Val Tyr Thr Thr Asn Ser Asp Val Trp Ser1010 1015 1020Tyr Gly Val Leu Leu Trp Glu Ile Val Ser Leu Gly Gly Thr Pro1025 1030 1035Tyr Cys Gly Met Thr Cys Ala Glu Leu Tyr Glu Lys Leu Pro Gln1040 1045 1050Gly Tyr Arg Leu Glu Lys Pro Leu Asn Cys Asp Asp Glu Val Tyr1055 1060 1065Asp Leu Met Arg Gln Cys Trp Arg Glu Lys Pro Tyr Glu Arg Pro1070 1075 1080Ser Phe Ala Gln Ile Leu Val Ser Leu Asn Arg Met Leu Glu Glu1085 1090 1095Arg Lys Thr Tyr Val Asn Thr Thr Leu Tyr Glu Lys Phe Thr Tyr1100 1105 1110
Ala Gly Ile Asp Cys Ser Ala Glu Glu Ala Ala1115 1120<210>3<211>1494<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<220>
<221>CDS<222>(1)..(1494)<223>
<400>3atg aca gtt ttc ctt tcc ttt gct ttc ctc gct gcc att ctg act cac 48Met Thr Val Phe Leu Ser Phe Ala Phe Leu Ala Ala Ile Leu Thr Hisl 5 10 15ata ggg tgc agc aat cag cgc cga agt cca gaa aac agt ggg aga aga 96Ile Gly Cys Ser Asn Gln Arg Arg Ser Pro Glu Asn Ser Gly Arg Arg20 25 30tat aac cgg att caa cat ggg caa tgt gcc tac act ttc att ctt cca 144Tyr Asn Arg Ile Gln His Gly Gln Cys Ala Tyr Thr Phe Ile Leu Pro35 40 45gaa cac gat ggc aac tgt cgt gag agt acg aca gac cag tac aac aca 192Glu His Asp Gly Asn Cys Arg Glu Ser Thr Thr Asp Gln Tyr Asn Thr50 55 60aac gct ctg cag aga gat gct cca cac gtg gaa ccg gat ttc tct tcc 240Asn Ala Leu Gln Arg Asp Ala Pro His Val Glu Pro Asp Phe Ser Ser65 70 75 80cag aaa ctt caa cat ctg gaa cat gtg atg gaa aat tat act cag tgg 288Gln Lys Leu G1n His Leu Glu His Val Met Glu Asn Tyr Thr Gln Trp85 90 95ctg caa aaa ctt gag aat tac att gtg gaa aac atg aag tcg gag atg 336Leu Gln Lys Leu Glu Asn Tyr Ile Val Glu Asn Met Lys Ser Glu Met100 105 110gcc cag ata cag cag aat gca gtt cag aac cac acg gct acc atg ctg 384
Ala Gln Ile Gln Gln Asn Ala Val Gln Asn His Thr Ala Thr Met Leu115 120 125gag ata gga acc agc ctc ctc tct cag act gca gag cag acc aga aag 432Glu Ile Gly Thr Ser Leu Leu Ser Gln Thr Ala Glu Gln Thr Arg Lys130 135 140ctg aca gat gtt gag acc cag gta cta aat caa act tct cga ctt gag 480Leu Thr Asp Val Glu Thr Gln Val Leu Asn Gln Thr Ser Arg Leu Glu145 150 155 160ata cag ctg ctg gag aat tca tta tcc acc tac aag cta gag aag caa 528Ile Gln Leu Leu Glu Asn Ser Leu Ser Thr Tyr Lys Leu Glu Lys Gln165 170 175ctt ctt caa cag aca aat gaa atc ttg aag atc cat gaa aaa aac agt 576Leu Leu Gln Gln Thr Asn Glu Ile Leu Lys Ile His Glu Lys Asn Ser180 185 190tta tta gaa cat aaa atc tta gaa atg gaa gga aaa cac aag gaa gag 624Leu Leu Glu His Lys Ile Leu Glu Met Glu Gly Lys His Lys Glu Glu195 200 205ttg gac acc tta aag gaa gag aaa gag aac ctt caa ggc ttg gtt act 672Leu Asp Thr Leu Lys Glu Glu Lys Glu Asn Leu Gln Gly Leu Val Thr210 215 220cgt caa aca tat ata atc cag gag ctg gaa aag caa tta aac aga gct 720Arg Gln Thr Tyr Ile Ile Gln Glu Leu Glu Lys Gln Leu Asn Arg Ala225 230 235 240acc acc aac aac agt gtc ctt cag aag cag caa ctg gag ctg atg gac 768Thr Thr Asn Asn Ser Val Leu Gln Lys Gln Gln Leu Glu Leu Met Asp245 250 255aca gtc cac aac ctt gtc aat ctt tgc act aaa gaa ggt gtt tta cta 816Thr Val His Asn Leu Val Asn Leu Cys Thr Lys Glu Gly Val Leu Leu260 265 270aag gga gga aaa aga gag gaa gag aaa cca ttt aga gac tgt gca gat 864Lys Gly Gly Lys Arg Glu Glu Glu Lys Pro Phe Arg Asp Cys Ala Asp275 280 285gta tat caa gct ggt ttt aat aaa agt gga atc tac act att tat att 912
Val Tyr Gln Ala Gly Phe Asn Lys Ser Gly Ile Tyr Thr Ile Tyr Ile290 295 300aat aat atg cca gaa ccc aaa aag gtg ttt tgc aat atg gat gtc aat 960Asn Asn Met Pro Glu Pro Lys Lys Val Phe Cys Asn Met Asp Val Asn305 310 315 320ggg gga ggt tgg act gta ata caa cat cgt gaa gat gga agt cta gat 1008Gly Gly Gly Trp Thr Val Ile Gln His Arg Glu Asp Gly Ser Leu Asp325 330 335ttc caa aga ggc tgg aag gaa tat aaa atg ggt ttt gga aat ccc tcc 1056Phe Gln Arg Gly Trp Lys Glu Tyr Lys Met Gly Phe Gly Asn Pro Ser340 345 350ggt gaa tat tgg ctg ggg aat gag ttt att ttt gcc att acc agt cag 1104Gly Glu Tyr Trp Leu Gly Asn Glu Phe Ile Phe Ala Ile Thr Ser Gln355 360 365agg cag tac atg cta aga att gag tta atg gac tgg gaa ggg aac cga 1152Arg Gln Tyr Met Leu Arg Ile Glu Leu Met Asp Trp Glu Gly Asn Arg370 375 380gcc tat tca cag tat gac aga ttc cac ata gga aat gaa aag caa aac 1200Ala Tyr Ser Gln Tyr Asp Arg Phe His Ile Gly Asn Glu Lys Gln Asn385 390 395 400tat agg ttg tat tta aaa ggt cac act ggg aca gca gga aaa cag agc 1248Tyr Arg Leu Tyr Leu Lys Gly His Thr Gly Thr Ala Gly Lys Gln Ser405 410 415agc ctg atc tta cac ggt gct gat ttc agc act aaa gat gct gat aat 1296Ser Leu Ile Leu His Gly Ala Asp Phe Ser Thr Lys Asp Ala Asp Asn420 425 430gac aac tgt atg tgc aaa tgt gcc ctc atg tta aca gga gga tgg tgg 1344Asp Asn Cys Met Cys Lys Cys Ala Leu Met Leu Thr Gly Gly Trp Trp435 440 445ttt gat gct tgt ggc ccc tcc aat cta aat gga atg ttc tat act gcg 1392Phe Asp Ala Cys Gly Pro Ser Asn Leu Asn Gly Met Phe Tyr Thr Ala450 455 460gga caa aac cat gga aaa ctg aat ggg ata aag tgg cac tac ttc aaa 1440
Gly Gln Asn His Gly Lys Leu Asn Gly Ile Lys Trp His Tyr Phe Lys465 470 475 480ggg ccc agt tac tcc tta cgt tcc aca act atg atg att cga cct tta 1488Gly Pro Ser Tyr Ser Leu Arg Ser Thr Thr Met Met Ile Arg Pro Leu485 490 495gat ttt 1494Asp Phe<210>4<211>498<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>4Met Thr Val Phe Leu Ser Phe Ala Phe Leu Ala Ala Ile Leu Thr His1 5 10 15Ile Gly Cys Ser Asn Gln Arg Arg Ser Pro Glu Asn Ser Gly Arg Arg20 25 30Tyr Asn Arg Ile Gln His Gly Gln Cys Ala Tyr Thr Phe Ile Leu Pro35 40 45Glu His Asp Gly Asn Cys Arg Glu Ser Thr Thr Asp Gln Tyr Asn Thr50 55 60Asn Ala Leu Gln Arg Asp Ala Pro His Val Glu Pro Asp Phe Ser Ser65 70 75 80Gln Lys Leu Gln His Leu Glu His Val Met Glu Asn Tyr Thr Gln Trp85 90 95Leu Gln Lys Leu Glu Asn Tyr Ile Val Glu Asn Met Lys Ser Glu Met100 105 110Ala Gln Ile Gln Gln Asn Ala Val Gln Asn His Thr Ala Thr Met Leu115 120 125Glu Ile Gly Thr Ser Leu Leu Ser Gln Thr Ala Glu Gln Thr Arg Lys130 135 140
Leu Thr Asp Val Glu Thr Gln Val Leu Asn Gln Thr Ser Arg Leu Glu145 150 155 160Ile Gln Leu Leu Glu Asn Ser Leu Ser Thr Tyr Lys Leu Glu Lys Gln165 170 175Leu Leu Gln Gln Thr Asn Glu Ile Leu Lys Ile His Glu Lys Asn Ser180 185 190Leu Leu Glu His Lys Ile Leu Glu Met Glu Gly Lys His Lys Glu Glu195 200 205Leu Asp Thr Leu Lys Glu Glu Lys Glu Asn Leu Gln Gly Leu Val Thr210 215 220Arg Gln Thr Tyr Ile Ile Gln Glu Leu Glu Lys Gln Leu Asn Arg Ala225 230 235 240Thr Thr Asn Asn Ser Val Leu Gln Lys Gln Gln Leu Glu Leu Met Asp245 250 255Thr Val His Asn Leu Val Asn Leu Cys Thr Lys Glu Gly Val Leu Leu260 265 270Lys Gly Gly Lys Arg Glu Glu Glu Lys Pro Phe Arg Asp Cys Ala Asp275 280 285Val Tyr Gln Ala Gly Phe Asn Lys Ser Gly Ile Tyr Thr Ile Tyr Ile290 295 300Asn Asn Met Pro Glu Pro Lys Lys Val Phe Cys Asn Met Asp Val Asn305 310 315 320Gly Gly Gly Trp Thr Val Ile Gln His Arg Glu Asp Gly Ser Leu Asp325 330 335Phe Gln Arg Gly Trp Lys Glu Tyr Lys Met Gly Phe Gly Asn Pro Ser340 345 350Gly Glu Tyr Trp Leu Gly Asn Glu Phe Ile Phe Ala Ile Thr Ser Gln355 360 365
Arg Gln Tyr Met Leu Arg Ile Glu Leu Met Asp Trp Glu Gly Asn Arg370 375 380Ala Tyr Ser Gln Tyr Asp Arg Phe His Ile Gly Asn Glu Lys Gln Asn385 390 395 400Tyr Arg Leu Tyr Leu Lys Gly His Thr Gly Thr Ala Gly Lys Gln Ser405 410 415Ser Leu Ile Leu His Gly Ala Asp Phe Ser Thr Lys Asp Ala Asp Asn420 425 430Asp Asn Cys Met Cys Lys Cys Ala Leu Met Leu Thr Gly Gly Trp Trp435 440 445Phe Asp Ala Cys Gly Pro Ser Asn Leu Asn Gly Met Phe Tyr Thr Ala450 455 460Gly Gln Asn His Gly Lys Leu Asn Gly Ile Lys Trp His Tyr Phe Lys465 470 475 480Gly Pro Ser Tyr Ser Leu Arg Ser Thr Thr Met Met Ile Arg Pro Leu485 490 495Asp Phe<210>5<211>1744<212>DNA<213>人工<220>
<223>人工合成的序列<400>5actagttatt aatagtaatc aattacgggg tcattagttc atagcccata tatggagttc 60cgcgttacat aacttacggt aaatggcccg cctggctgac cgcccaacga cccccgccca120ttgacgtcaa taatgacgta tgttcccata gtaacgccaa tagggacttt ccattgacgt180caatgggtgg agtatttacg gtaaactgcc cacttggcag tacatcaagt gtatcatatg240ccaagtacgc cccctattga cgtcaatgac ggtaaatggc ccgcctggca ttatgcccag300tacatgacct tatgggactt tcctacttgg cagtacatct acgtattagt catcgctatt360accatggtcg aggtgagccc cacgttctgc ttcactctcc ccatctcccc cccctcccca420
cccccaattt tgtatttatt tattttttaa ttattttgtg cagcgatggg ggcggggggg480gggggggggc gcgcgccagg cggggcgggg cggggcgagg ggcggggcgg ggcgaggcgg540agaggtgcgg cggcagccaa tcagagcggc gcgctccgaa agtttccttt tatggcgagg600cggcggcggc ggcggcccta taaaaagcga agcgcgcggc gggcggggag tcgctgcgac660gctgccttcg ccccgtgccc cgctccgccg ccgcctcgcg ccgcccgccc cggctctgac720tgaccgcgtt actcccacag gtgagcgggc gggacggccc ttctcctccg ggctgtaatt780agcgcttggt ttaatgacgg cttgtttctt ttctgtggct gcgtgaaagc cttgaggggc840tccgggaggg ccctttgtgc ggggggagcg gctcgggggg tgcgtgcgtg tgtgtgtgcg900tggggagcgc cgcgtgcggc tccgcgctgc ccggcggctg tgagcgctgc gggcgcggcg960cggggctttg tgcgctccgc agtgtgcgcg aggggagcgc ggccgggggc ggtgccccgc 1020ggtgcggggg gggctgcgag gggaacaaag gctgcgtgcg gggtgtgtgc gtgggggggt 1080gagcaggggg tgtgggcgcg tcggtcgggc tgcaaccccc cctgcacccc cctccccgag 1140ttgctgagca cggcccggct tcgggtgcgg ggctccgtac ggggcgtggc gcggggctcg 1200ccgtgccggg cggggggtgg cggcaggtgg gggtgccggg cggggcgggg ccgcctcggg 1260ccggggaggg ctcgggggag gggcgcggcg gcccccggag cgccggcggc tgtcgaggcg 1320cggcgagccg cagccattgc cttttatggt aatcgtgcga gagggcgcag ggacttcctt 1380tgtcccaaat ctgtgcggag ccgaaatctg ggaggcgccg ccgcaccccc tctagcgggc 1440gcggggcgaa gcggtgcggc gccggcagga aggaaatggg cggggagggc cttcgtgcgt 1500cgccgcgccg ccgtcccctt ctccctctcc agcctcgggg ctgtccgcgg ggggacggct 1560gccttcgggg gggacggggc agggcggggt tcggcttctg gcgtgtgacc ggcggctcta 1620gagcctctgc taaccatgtt catgccttct tctttttcct acagctcctg ggcaacgtgc 1680tggttattgt gctgtctcat cattttggca aagaattcgg cttgatcgaa gcttgcccac 1740catg1744<210>6<211>30<212>DNA<213>人工<220>
<223>人工合成的引物<400>6cagaggcagt acatgctaag aattgagtta 30<210>7<211>24<212>DNA<213>人工<220>
<223>人工合成的引物
<400>7agatgctcaa ggggcttcat gatg24<210>8<211>20<212>DNA<213>人工<220>
<223>人工合成的引物<400>8tattgggcgc ctggtcacca 20<210>9<211>20<212>DNA<213>人工<220>
<223>人工合成的引物<400>9ccaccttctt gatgtcatca 20
權(quán)利要求
1.缺血性心臟病的治療方法，其包括投藥血管生成素-1或編碼血管生成素-1的載體的步驟。
2.權(quán)利要求1所述缺血性心臟病的治療方法，其包括投藥血管生成素-1或編碼血管生成素-1的載體的步驟，且其中沒有投藥血管內(nèi)皮生長因子。
3.權(quán)利要求1或2的方法，其中血管生成素-1或編碼血管生成素-1的載體是編碼血管生成素-1的病毒載體。
4.權(quán)利要求3的方法，其中所述病毒載體是腺病毒載體。
5.權(quán)利要求3的方法，其中所述病毒載體是負鏈RNA病毒載體。
6.權(quán)利要求1或2的方法，其中血管生成素-1或編碼血管生成素-1的載體是裸露的DNA。
7.權(quán)利要求1-6之一的方法，其中血管生成素-1或編碼血管生成素-1的載體是利用CA啟動子或具有與所述CA啟動子相同或更高轉(zhuǎn)錄活性的啟動子來驅(qū)動血管生成素-1表達的載體。
8.權(quán)利要求1-7之一的方法，其中血管生成素-1或編碼血管生成素-1的載體的投藥是注射入心肌。
9.缺血疾病的治療方法，其包括投藥編碼血管生成素-1的病毒載體的步驟。
10.權(quán)利要求9所述治療缺血疾病的方法，其包括投藥編碼血管生成素-1的病毒載體的步驟，并且其中沒有投藥血管內(nèi)皮生長因子。
11.權(quán)利要求9或10的方法，其中所述病毒載體是腺病毒載體。
12.權(quán)利要求9或10的方法，其中所述病毒載體是負鏈RNA病毒載體。
13.權(quán)利要求9-12之一的方法，其中所述載體的投藥是注射入缺血位點。
14.經(jīng)過遺傳修飾的間充質(zhì)細胞，其包括編碼血管生成素-1的外來基因。
15.權(quán)利要求14的間充質(zhì)細胞，其中已經(jīng)導(dǎo)入了編碼血管生成素-1的腺病毒載體。
16.權(quán)利要求14的間充質(zhì)細胞，其中已經(jīng)導(dǎo)入了編碼血管生成素-1的負鏈RNA病毒載體。
17.治療缺血的組合物，其包括權(quán)利要求14-16之一的間充質(zhì)細胞和可藥用的載體。
18.制備經(jīng)過遺傳修飾的間充質(zhì)細胞的方法，其中所述方法包括將間充質(zhì)細胞與攜帶基因的負鏈RNA病毒載體接觸的步驟。
19.權(quán)利要求18的方法，其中所述基因編碼血管生成素-1。
全文摘要
本發(fā)明提供了治療缺血疾病的方法，其包括投藥血管生成素－1(Ang1)或編碼Ang1的載體的步驟。本發(fā)明還提供了用于治療缺血疾病的試劑盒，其包括Ang1。構(gòu)建了表達Ang1的載體，并且將其單獨投藥給心肌梗塞急性期大鼠的心肌，從而在心肌中局部表達Ang－1。結(jié)果，觀察到明顯的效果諸如梗塞后死亡率下降，心肌中的血管數(shù)增加，心急梗塞灶縮小，以及心功能改善。不必要投藥Ang－1的血管生成作用所需要的VEGF。當(dāng)將Ang－1－表達病毒載體投藥給患有動脈結(jié)扎誘導(dǎo)的重癥肢體缺血的模型動物時，進一步觀察到顯著的治療效果。Ang1基因治療作為缺血疾病諸如缺血性心臟病和肢體缺血的安全有效的治療法是非常好的。
文檔編號A61K48/00GK1777678SQ20048001050
公開日2006年5月24日 申請日期2004年1月30日 優(yōu)先權(quán)日2003年2月19日
發(fā)明者濱田洋文, 伊藤克禮, 高橋一泰, 森川雅之 申請人:株式會社載體研究所