專利名稱：熱休克蛋白65人上皮細(xì)胞生長因子受體2融合蛋白(hsp65－h(huán)er2)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種重組融合蛋白，該重組融合蛋白是由熱休克蛋白65(heat shock protein65，HSP65)和人上皮細(xì)胞生長因子受體2(human epidermal growth factor receptor，HER2)多表位抗原多肽融合所構(gòu)成(HSP65-HER2)，特別是涉及一種預(yù)防和或治療人HER2陽性腫瘤的重組融合蛋白，該重組融合蛋白中不含有二硫鍵，所形成的融合蛋白以單體形式表達(dá)。本發(fā)明還涉及該重組融合蛋白的氨基酸序列及編碼該重組融合蛋白的核苷酸序列。本發(fā)明還涉及含有上述基因的載體，含有上述基因和載體的宿主細(xì)胞、上述融合蛋白、基因、載體以及宿主細(xì)胞在制備用于治療和/或預(yù)防人的HER2陽性腫瘤的藥物和/或制劑中的應(yīng)用、所述重組融合蛋白的生產(chǎn)方法。
背景技術(shù)：
對于腫瘤的治療，目前有手術(shù)療法、化學(xué)療法、放射療法等。手術(shù)療法對于多組織轉(zhuǎn)移的患者來說，沒有治療意義?；瘜W(xué)療法由于化療藥物特異性較差而對正常細(xì)胞造成損害，放射療法也存在同樣的問題。為此，臨床上需要一種特異性較強(qiáng)的藥物，該藥物能夠區(qū)別腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞，特異性地殺傷腫瘤細(xì)胞而對正常細(xì)胞沒有損害。免疫療法治療腫瘤就具有這樣的特異性，免疫療法治療腫瘤的策略之一是通過激活體內(nèi)針對腫瘤抗原的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxic T lymphocytes，CTL)，被激活的CTL去殺傷表達(dá)此腫瘤抗原的腫瘤細(xì)胞。選擇合適的腫瘤抗原是研制具有特異性CTL激活作用的生物制品的關(guān)鍵。
人上皮細(xì)胞生長因子受體2(HER2)是由定位于人的第17號染色體的q21的c-erbB-2基因所編碼，是一種具有酪氨酸激酶的活性跨膜糖蛋白，和表皮生長因子受體有很高的同源性(Tadashi Yamamoto，et al.Similarity of protein encoded by the human c-erbB-2geneto epidermal growth factor receptor.Nature vol 31916 January 1986，230-234.)，因此也被稱為human epidermal growth factor receptor 2，簡稱HER2。
約20％的卵巢癌患者的癌細(xì)胞高表達(dá)HER2。胃癌細(xì)胞、子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞、唾液腺癌細(xì)胞、腺癌細(xì)胞、前腺癌細(xì)胞、結(jié)腸和直腸癌細(xì)胞、非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞也表達(dá)HER2。因此，針對HER2的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxic T lymphocytes，CTL)都可能殺傷這些癌細(xì)胞，產(chǎn)生對上述腫瘤的治療和或預(yù)防作用。
HER2的過度表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞侵襲性增加和對放療的敏感性下降(Sartor CI，Biologicalmodifiers as potential radiosensitizerstargeting the epidermal growth factorreceptor family.Semin Oncol.2000 Dec，27(6 Suppl 11)15-20；discussion 92-100.Review.)，這增加了手術(shù)后局部復(fù)發(fā)的可能性。在發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤細(xì)胞雌激素受體(ER)陰性的病人的腫瘤組織中更容易檢出HER2的高表達(dá)的腫瘤細(xì)胞，且HER2高表達(dá)和ER的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。
HER2基因擴(kuò)增已經(jīng)成為腫瘤患者不良預(yù)后的判斷指標(biāo)。多種研究表明，HER2編碼基因的擴(kuò)增和過度表達(dá)可引起細(xì)胞的癌變。
以HER2為靶點(diǎn)可能研制出預(yù)防和治療HER2陽性腫瘤的制劑。(HER2陽性腫瘤是指由表達(dá)HER2的腫瘤細(xì)胞形成的腫瘤)。
Wei WZ等證明，用突變的重組HER2蛋白免疫的小鼠可抑制表達(dá)HER2的小鼠乳腺癌細(xì)胞的生長(Wei WZ，Shi WP，Galy A，Lichlyter D，Hernandez S，Groner B，Heilbrun L，JonesRF.Protection against mammary tumor growth by vaccination with full-length，modifiedhuman ErbB-2 DNA.Int J Cancer.1999 May 31；81(5)748-54.)。Dakappagari NK等證明，用含B細(xì)胞表位的HER2多肽免疫小鼠可抑制過度表達(dá)HER2的腫瘤細(xì)胞在其體內(nèi)的生長(Dakappagari NK，Douglas DB，Triozzi PL，Stevens VC，Kaumaya PT Prevention of mammarytumors with a chimeric HER-2B-cell epitope peptide vaccine.Cancer Res.2000 Jul15；60(14)3782-9.)。Foy TM等的研究表明用含有編碼HER2全長或HER2亞單位的質(zhì)粒以及蛋白免疫小鼠能使小鼠獲得抵抗表達(dá)HER2腫瘤細(xì)胞攻擊的能力(Foy TM，Bannink J，Sutherland RA，McNeill PD，Moulton GG，Smith J，Cheever MA，Grabstein K.Vaccinationwith Her-2/neu DNA or protein subunits protects against growth of aHer-2/neu-expressing murine tumor.Vaccine.2001Mar 21；19(17-19)2598-606.)用HER2蛋白抗原肽(VLRENTSPK)裝載的樹突狀細(xì)胞體外免疫可誘導(dǎo)HER2蛋白特異性CTL，此CTL可殺傷表達(dá)HLA-A3和HER2的腫瘤細(xì)胞(Kawashima I，Tsai V，Southwood S，Takesako K，Sette A，Celis E.Identification of HLA-A3-restricted cytotoxic Tlymphocyte epitopes from carcinoembryonic antigen and HER-2/neu by primary in vitroimmunization with peptide-pulsed dendritic cells.Cancer Res.1999 Jan15；59(2)431-5.)。HLA-A2限制性HER2蛋白抗原肽(IISAVVGIL)在結(jié)直腸癌患者也可誘生出HER2蛋白特異性的CTL(Scardino A，Gross DA，Alves P，Schultze JL，Graff-DuboisS，F(xiàn)aure O，Tourdot S，Chouaib S，Nadler LM，Lemonnier FA，Vonderheide RH，CardosoAA，Kosmatopoulos K.HER-2/neu and hTERT cryptic epitopes as novel targets for broadspeckrum tumor immunotherapy.J Immunol.2002 Jun 1；168(11)5900-6.)。
STL是人體內(nèi)殺傷腫瘤細(xì)胞最高效的免疫細(xì)胞。通常情況下，外源性的蛋白類腫瘤抗原在免疫人體后，主要進(jìn)入MHC II類提呈途徑，激發(fā)體液免疫反應(yīng)(Heikema A，Agsteribbe E，Wilschut J，Huckriede A.Generation of heat shock protein-based vaccines byintracellular loading of gp96 with antigenic peptides.Immunol Lett.1997 Jun1；57(1-3)69-74.)，但不能有效地激發(fā)腫瘤特異性的CTL的產(chǎn)生，因而不能產(chǎn)生有效的腫瘤預(yù)防和治療作用。因此，賦予HER2多表位抗原激活特異性CTL的活性就成為研究以HER2多表位抗原為免疫原的具有預(yù)防和或治療人HER2陽性腫瘤重組融合蛋白的關(guān)鍵。
熱休克蛋白(heat shock protein，HSP)是存在于多種生物體內(nèi)的一個分子伴侶蛋白質(zhì)家族，含有多種成員。在免疫應(yīng)答的過程中，HSP可以協(xié)助外源性抗原物質(zhì)進(jìn)入包括樹突狀細(xì)胞在內(nèi)的抗原提呈細(xì)胞，并協(xié)助外源性抗原經(jīng)過加工處理后進(jìn)入MHC I類抗原提呈途徑，進(jìn)而激活抗原特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)；同時熱休克蛋白還能夠刺激樹突狀細(xì)胞表面協(xié)同刺激分子的表達(dá)(如B7等)和細(xì)胞因子的分泌。
近年的研究表明，HSP可使與其結(jié)合的腫瘤抗原在抗原提呈細(xì)胞內(nèi)和MHC I類分子結(jié)合并提呈在其表面，有效地激活腫瘤特異性CTL，激活的CTL去高效殺傷表達(dá)特異性腫瘤抗原的腫瘤細(xì)胞。注射從自體腫瘤提取的熱休克蛋白-抗原肽復(fù)合物可抑制荷瘤小鼠原發(fā)腫瘤的生長、降低腫瘤的轉(zhuǎn)移率，延長荷瘤小鼠的生存時間(Tamura Y，Peng P，Liu K，Daou M，Srivastava PK.Immunotherapy of tumors with autologous tumor-derived heat shockprotein preparations.Science.1997 Oct 3；278(5335)117-20.Erratum inScience 1999Feb 19；283(5405)preceding 1119.)。
綜上所述，將HSP65基因和HER2多表位抗原多肽基因融合后構(gòu)成的融合基因所表達(dá)出的融合蛋白可在機(jī)體內(nèi)特異性地激活針對表達(dá)HER2腫瘤抗原的腫瘤細(xì)胞的CTL，激活的CTL去殺傷表達(dá)HER2腫瘤抗原的腫瘤細(xì)胞，達(dá)到清除體內(nèi)HER2陽性腫瘤細(xì)胞的目的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種重組融合蛋白，其包含熱休克蛋白65(HSP65)和人HER2多表位抗原多肽。
本發(fā)明所述融合蛋白包括HSP65和HER2多表位抗原多肽，其中，HER2多表位抗原多肽包含具有如SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3和SEQ ID NO4所示的序列的肽段。其中HER2多表位抗原多肽基因由序列為SEQ ID NO1，SEQ ID NO2，SEQ ID NO3，和SEQ ID NO4所示的多肽的編碼基因以隨機(jī)組合的方式融合而成；所謂的隨機(jī)組合是指本發(fā)明中的HER2多表位抗原多肽的序列可以是單獨(dú)的SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3和SEQ ID NO4所示的序列的肽段所組成，也可以是SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ IDNO3和SEQ ID NO4所示的序列的肽段相互連接所組成，具體的連接方式，如SEQ ID NO1-SEQ ID NO2-SEQ ID NO3-SEQ ID NO4，SEQ ID 1-SEQ ID NO3-SEQ ID NO2-SEQ ID NO4，SEQ ID NO1-SEQ ID NO3-SEQ ID NO4-SEQ ID NO2，SEQ ID NO1-SEQ ID NO4-SEQ ID NO2-SEQ ID NO3，SEQ ID NO1-SEQ ID NO2-SEQ ID NO4-SEQ ID NO3，SEQ ID NO1-SEQ ID NO4-SEQ ID NO3-SEQ ID NO2，SEQ ID NO1，SEQ ID NO2-SEQ ID NO1-SEQ ID NO3-SEQ ID NO4，SEQ ID NO2-SEQ ID NO3-SEQ ID NO1-SEQ ID NO4，SEQ ID NO2-SEQ ID NO4-SEQ ID NO3-SEQ ID NO1，SEQ ID NO2-SEQ ID NO3-SEQ ID NO4-SEQ ID NO1，SEQ ID NO2-SEQ ID NO4-SEQ ID NO1-SEQ ID NO3，SEQ ID NO2-SEQ ID NO4-SEQ ID NO3-SEQ ID NO1，SEQ ID NO3-SEQ ID NO2-SEQ ID NO1-S SEQ ID NO4，SEQ ID NO3-SEQ IDNO2-SEQ ID NO4-SEQ ID NO1，SEQ ID NO3-SEQ ID NO4-SEQ ID NO1-SEQ IDNO2，SEQ ID NO3-SEQ ID NO4-SEQ ID NO2-SEQ ID NO1，SEQ ID NO3-SEQID NO4-SEQ ID NO2-SEQ ID NO3，SEQ ID NO3-SEQ ID NO1-SEQ ID NO4-SEQ ID NO2，SEQ ID NO3-SEQ ID NO1-SEQ ID NO2-SEQ ID NO4，SEQ ID NO4-SEQ ID NO1-SEQ ID NO2-SEQ ID NO3，SEQ ID NO4-SEQ ID NO1-SEQ ID NO3-SEQ ID NO2，SEQ ID NO4-SEQ ID NO2-SEQ ID NO1-SEQ ID NO3，SEQ ID NO4-SEQ ID NO2-SEQ ID NO3-SEQ ID NO1，SEQ ID NO4-SEQ ID NO3-SEQ ID NO2-SEQ ID NO1，SEQ ID NO4-SEQ ID NO3-SEQ ID NO1-SEQ ID NO2。優(yōu)選地，本發(fā)明提供的HER2多表位抗原多肽基因是由序列為SEQ ID NO1，SEQ ID NO2，SEQ ID NO3和SEQ ID NO4所示的多肽的編碼基因按阿拉伯?dāng)?shù)字的順序連接而形成的。上述序列中去除了半胱氨酸的密碼子。
本發(fā)明的重組融合蛋白HSP65-HER2，其中，HSP65位于該融合蛋白的氨基端，HER2多表位抗原位于該融合蛋白的羧基端。優(yōu)選地，本申請的HSP65具有SEQ ID NO7的氨基酸序列，優(yōu)選地，本發(fā)明的重組融合蛋白HSP65-HER2具有SEQ ID NO6所示的氨基酸序列。
本發(fā)明還提供了一種編碼重組融合蛋白(HSP65-HER2)的基因。優(yōu)選地，該基因具有SEQID NO5所示的核苷酸序列。
HER2多表位抗原多肽是由多個人HER2分子中的抗原表位相互連接形成的多肽，由HER2分子上的4個肽段組成，其中去除了半胱氨酸的密碼子，序列可以如SEQ ID NO8所示，其編碼核苷酸序列為SEQ ID NO20，為了在真核細(xì)胞中表達(dá)，以SEQ ID NO20為模板，經(jīng)PCR獲得了另一個編碼HER2多表位抗原的基因SEQ ID NO25。
一個CTL表位可由8-9個氨基酸殘基組成，因而SEQ ID NO8所示的HER2蛋白多表位抗原可含有多個CTL表位。HER2多表位抗原SEQ ID NO8包含HER2的4個肽段，它們的序列分別是SEQ ID NO.1氨基端Asp Glu Ala Tyr Val Met Ala Gly Val Gly Ser Pro Tyr Val Ser Arg Leu Leu Gly Ile SerLeu Shr Glu Glu羧基端SEQ ID NO.2氨基端Gln Glu Phe Ala Gly Ser Lys Lys Ile Phe Gly Ser Leu Ala Phe Leu Pro Glu Ser Phe AspGly As Pro Ala Ser Asn Thr Ala Pro Leu Gln Pro Glu Gln Leu Gln Val Phe Glu Thr Leu Glu Glu Ile羧基端SEQ ID NO.3氨基端Val Ala Ile Lys Val Leu Arg Glu Asn Thr Ser Pro Lys Ala Asn Lys Glu羧基端SEQ ID NO.4氨基端Arg Gly Arg Ile Leu His Asn Gly Ala Tyr Ser Leu Thr Leu Gln Gly羧基端研究表明，在上述4個肽段中含有多個HLAI類分子限制性且能夠被特異性CTL識別的表位(Elissa Keogh，John Fikes，Scott Southwood，et al.Identification of New Epitopesfrom Four Different Tumor-Associated AntigensRecognition of Naturally ProcessedEpitcpes Correlates with HLA-Ap0201-Binding Affinity.The Journal of Immunology，2001，167787-796；Ichiro Kawashima，Stephen J.Hudson，et al.The Multi-epitopeApprcach For Immunotherapy for CancerIdentifyication of Several CTL Epitopes fromVarous Tumor-Associated Antigens Expressed on Solid Epithetlial Tumors.HumanImmuneology 1998，591-14；Ikuta Y，Okugawa T，et al.A HER2/NEU-derived peptide，aK(d)-restricted murine tumor rejection antigen，induces HER2-specificHLA-A2402-restricted CD8(+)cytotoxic T lymphocytes.Int J Cancer.2000Aug15；87(4)553-8.)。上述的四個肽段以隨機(jī)組合的方式相互連接在一起構(gòu)成的任何一個HER2多表位抗原多肽被定義為一個拷貝的HER2多表位抗原多肽。我們將這四個肽段的編碼基因以隨機(jī)組合的方式相連接在一起所生成的任何一種新的基因，定義為HER2多表位抗原基因，該基因編碼的多肽即為HER2多表位抗原多肽。HER2多表位抗原基因進(jìn)行人工點(diǎn)突變或以插入、在兩側(cè)連接其它序列的方式進(jìn)行改造所得的基因表達(dá)后形成的多肽也可能具有預(yù)防和或治療HER2陽性腫瘤的作用。將HER2多表位抗原和熱休克蛋白65融合形成的重組融合蛋白，在進(jìn)入人體后可激活針對表達(dá)HER2的腫瘤細(xì)胞的CTL，因而對HER2陽性腫瘤有預(yù)防和或治療的作用。該重組融合蛋白可用于治療下列腫瘤，但并不局限于此乳腺癌、卵巢癌、胃癌、子宮內(nèi)膜癌、唾液腺癌、腺癌、前腺癌、結(jié)腸和直腸癌、非小細(xì)胞肺癌、肺腺癌等。與SEQ ID NO1-SEQ ID NO8以及SEQ ID NO20、SEQ ID NO25具有70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％同源性的核苷酸序列或氨基酸序列，或在核酸雜交條件下(J.Sambrook，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Molecular cloning，1989)與上述核苷酸序列或上述氨基酸序列的編碼核苷酸序列雜交的核苷酸序列，或上述序列人工點(diǎn)突變或以插入、在兩側(cè)連接其它序列的方式進(jìn)行改造所得的序列也可與上述序列起到等同的作用。
熱休克蛋白65(HSP65)是一種來源于卡介苗的蛋白質(zhì)，它在和HER2多表位抗原形成融合蛋白后，可以協(xié)助HER2多表位抗原進(jìn)入包括樹突狀細(xì)胞在內(nèi)的抗原提呈細(xì)胞，并協(xié)助HER2多表位抗原進(jìn)入MHCI類抗原加工提呈途徑，進(jìn)而激活HER2特異性的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)，對表達(dá)HER2的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行攻擊和殺傷。此外，熱休克蛋白65還可刺激包括樹突狀細(xì)胞在內(nèi)的抗原提呈細(xì)胞表達(dá)協(xié)同刺激分子(如B7等)和細(xì)胞因子的分泌，這些協(xié)同刺激分子(如B7等)和細(xì)胞因子可協(xié)助激活CTL。
本申請首先從卡介苗中用PCR方法獲取了HSP65的編碼基因，將該基因與pEPT28a載體連接構(gòu)建了表達(dá)HSP65基因的表達(dá)載體pET28a-HSP65。根據(jù)HER2分子上的4個肽段SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO4的編碼核苷酸序列設(shè)計(jì)引物，通過四輪PCR反應(yīng)合成了HER2蛋白多表位抗原多肽基因(SEQ ID NO20)。將HER2蛋白多表位抗原多肽基因(SEQ ID NO20)經(jīng)限制性內(nèi)切酶消化后與pET28a-HSP65融合，形成pET28a-HSP65-HER2，在大腸桿菌中表達(dá)，并進(jìn)一步純化得到重組融合蛋白(HSP65-HER2)(SEQ ID NO6，其編碼核苷酸序列為SEQ ID NO5)。HSP65-HER2在大腸桿菌中的表達(dá)量比HSP65-HER2-ME(申請?zhí)枮?1136347.9的中國專利申請文件中的SEQ ID NO6)高，且HSP65-HER2蛋白中不含有二硫鍵，不會以二聚體形式表達(dá)，容易純化；在HSP65-HER2中，增加了由MHC限制性的表位，因而增加了HSP65-HER2的適應(yīng)人群。
為了獲得穩(wěn)定表達(dá)HER2多表位抗原基因的B16(C57BL/6小鼠黑色素瘤細(xì)胞系)細(xì)胞株，以序列為SEQ ID NO20的DNA片段為模板進(jìn)行PCR得到序列為SEQ ID NO25的DNA片段，其經(jīng)限制性內(nèi)切酶消化后與真核表達(dá)載體pcDNA3連接，得到pcDNA3-HER2質(zhì)粒，用上述質(zhì)粒轉(zhuǎn)染B16細(xì)胞株，即得到穩(wěn)定表達(dá)HER2多表位抗原多肽基因的B16(C57BL/6小鼠黑色素瘤細(xì)胞系)細(xì)胞株。
用HSP65-HER2融合蛋白免疫小鼠，以PBS為對照，免疫后，分離小鼠的淋巴細(xì)胞，體外培養(yǎng)，并用HSP65-HER2融合蛋白刺激2-3次，分別以B16細(xì)胞、pcDNA3穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的B16細(xì)胞、pcDNA3-HER2穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的B16細(xì)胞為靶細(xì)胞與上述效應(yīng)淋巴細(xì)胞共孵育，進(jìn)行殺傷實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，HSP65-HER2融合蛋白能夠在小鼠中誘生HER2特異性的CTL而PBS不能，且這種誘生的CTL只能特異性地殺傷表達(dá)HER2多表位抗原多肽的腫瘤細(xì)胞而不能殺傷不表達(dá)HER2多表位抗原多肽的腫瘤細(xì)胞。
用HSP65-HER2融合蛋白免疫小鼠，以PBS為對照，免疫后分別給小鼠注射用pcDNA3-HER2穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的B16細(xì)胞和pcDNA3穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的B16細(xì)胞，結(jié)果表明，重組融合蛋白HSP65-HER2免疫的小鼠只能特異性地抑制其體內(nèi)轉(zhuǎn)染HER2多表位抗原多肽基因的腫瘤細(xì)胞的生長。
給小鼠分別注射用pcDNA3-HER2穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的B16細(xì)胞和pcDNA3穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的B16細(xì)胞，然后再注射PBS或HSP65-HER2融合蛋白，結(jié)果表明，注射轉(zhuǎn)染HER2多表位抗原多肽基因腫瘤細(xì)胞的小鼠接受重組HSP65-HER2融合蛋白后其體內(nèi)腫瘤細(xì)胞的生長受到特異性抑制。
分離人外周血單核細(xì)胞，誘導(dǎo)其形成未成熟的樹突狀細(xì)胞，用重組融合蛋白HSP65-HER2裝載樹突狀細(xì)胞，自人的外周血分離CD8+T細(xì)胞，用裝載HSP65-HER2的樹突狀細(xì)胞刺激CD8+細(xì)胞，收獲HER2特異性的CD8+T細(xì)胞，該細(xì)胞能夠殺傷表達(dá)HER2多表位抗原多肽的腫瘤細(xì)胞，而不能殺傷不含有該抗原的腫瘤細(xì)胞。即重組融合蛋白HSP65-HER2在體外能夠誘生HER2多表位特異性的CTL。
進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)表明，重組融合蛋白HSP65-HER2在體外能夠誘生HLA-A24限制性的CTL，而HEP65-HER2-ME則不能。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種編碼本發(fā)明重組融合蛋白的基因、含有上述基因的載體，含有上述基因和載體的宿主細(xì)胞。所述載體可以是pET28a、pcDNA3或其它可用于融合蛋白表達(dá)的真核或原核載體，所述宿主細(xì)胞可以是大腸桿菌(BL21DE3)、B16細(xì)胞，或其它可以表達(dá)融合蛋白的原核細(xì)胞、真核細(xì)胞，例如細(xì)菌、真菌或哺乳動物細(xì)胞。
本發(fā)明的另一個目的是提供上述融合蛋白、基因、載體以及宿主細(xì)胞在制備用于治療和/或預(yù)防人的HER2陽性腫瘤的藥物和/或試劑中的應(yīng)用。
本發(fā)明的重組融合蛋白可通過已知的方法進(jìn)行生產(chǎn)，例如，可以在合適條件下培養(yǎng)包含編碼所述重組蛋白的基因的宿主細(xì)胞，并回收所需的重組融合蛋白。


圖1熱休克蛋白65(HSP65)編碼基因PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖泳道1分子量標(biāo)尺(Takara)2000bp；1000bp；750bp；500bp泳道2熱休克蛋白65(HSP65)編碼基因的PCR產(chǎn)物(1638bp)，如箭頭所示圖2HER2多表位抗原基因的PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖泳道1分子量標(biāo)尺(Takara)2000bp；1000bp；750bp；500bp；250bp；100bp。
泳道2HER2多表位抗原基因的PCR產(chǎn)物(321bp)，如箭頭所示圖3重組質(zhì)粒pET28a-HSP65-HER2用EcoR1和HindIII酶切后的瓊脂糖凝膠電泳鑒定圖泳道1經(jīng)EcoR1和HindIII酶切后，得到的HER2多表位抗原基因片段(315bp)泳道2分子量標(biāo)尺(Takara)2000bp；1000bp；750bp；500bp；250bp；100bp圖4HSP65-HRE2重組融合蛋白的表達(dá)泳道1誘導(dǎo)前的HSP65-HER2-ME泳道2誘導(dǎo)后的HSP65-HER2-ME泳道3誘導(dǎo)前的HSP65-HER2泳道4誘導(dǎo)后的HSP65-HER2泳道5分子量標(biāo)尺(Takara)97KD，66KD，45KD，30KD，20.1KD，14.4KD圖5純化后的HSP65-HER2-ME和HSP65-HER2的SDS-PAGE電泳圖泳道1純化后的HSP65-HER2-ME泳道3蛋白質(zhì)分子量標(biāo)尺97KD，66KD，45KD，30KD，20.1KD泳道4蛋白質(zhì)分子量標(biāo)尺97KD，66KD，45KD，30KD，20.1KD泳道6純化后HSP65-HER2圖6重組質(zhì)粒pcDNA3-HER2用BamH1和Not1酶切鑒定圖泳道1重組質(zhì)粒pcDNA3-HER2用BamH1和Not1消化后釋放出的333bp的HER2片段泳道2分子量標(biāo)尺(Takara)2000bp；1000bp；750bp；500bp；250bp；100bp圖7重組融合蛋白HSP65-HER2在小鼠HER2特異性殺傷性T淋巴細(xì)胞誘生 用5μg HSP65-HER2重組融合蛋白免疫小鼠，靶細(xì)胞為pcDNA3-HER2穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的B16細(xì)胞 用5μg HSP65-HER2重組融合蛋白免疫小鼠，靶細(xì)胞為用pcDNA3穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的B16細(xì)胞 用5μg HSP65-HER2重組融合蛋白免疫小鼠，靶細(xì)胞為B16細(xì)胞注射PBS小鼠，靶細(xì)胞為pcDNA3-HER2穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的B16細(xì)胞 注射PBS小鼠，靶細(xì)胞用pcDNA3穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的B16細(xì)胞 注射PBS小鼠，靶細(xì)胞B16細(xì)胞圖8重組融合蛋白HSP65-HER2在小鼠對HER2陽性腫瘤細(xì)胞的抑制作用A HSP65-HER2免疫，腫瘤細(xì)胞為pcDNA3-HER2穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的B16細(xì)胞組小鼠腫瘤大小及數(shù)量B PBS注射，腫瘤細(xì)胞為pcDNA3-HER2穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的B16細(xì)胞組小鼠腫瘤大小及數(shù)量C HSP65-HER2免疫，腫瘤細(xì)胞為pcDNA3穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的B16細(xì)胞小鼠的腫瘤大小及數(shù)量圖9注射腫瘤細(xì)胞后重組融合蛋白HSP65-HER2對HER2陽性腫瘤細(xì)胞的抑制作用A接種pcDNA3-HER2穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的B16細(xì)胞后，HSP65-HER2免疫組小鼠腫瘤大小及數(shù)量B接種pcDNA3-HER2穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的B16細(xì)胞后，PBS注射組小鼠腫瘤大小及數(shù)量C接種pcDNA3穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的B16細(xì)胞后，HSP65-HER2免疫小鼠腫瘤大小及數(shù)量圖10重組融合蛋白HSP65-HER2人體外HER2特異性CTL的誘生圖11重組融合蛋白HSP65-HER2在體外HLA-A24限制性CTL的誘生具體實(shí)施方式
本申請是通過下述方式實(shí)現(xiàn)的，但是具體的實(shí)施方式僅僅是對本發(fā)明的解釋，而不應(yīng)當(dāng)理解為一種限制。
實(shí)施例1獲取熱休克蛋白65(HSP65)的編碼基因1.卡介苗來源于長春生物制品研究所。采用蘇通馬鈴薯培養(yǎng)基培養(yǎng)卡介苗，培養(yǎng)的溫度為37-39℃，生長出的卡介苗呈現(xiàn)干皺淺黃色的菌膜。收集菌膜。
2.提取卡介苗基因組DNA方法參照Molecular Cloning一書(Joseph.Sambrook，David W.Russell.用蛋白酶K和苯酚從哺乳動物細(xì)胞中分離高分子質(zhì)量DNA。MolecularcloningA Laboratory Manual，3rded.463-470，Cold Spring Harbor Laboratory Press，2001)，從上步收集的菌膜中提取卡介苗基因組DNA。
3.分離HSP65結(jié)構(gòu)基因采用PCR方法自卡介苗分離HSP65結(jié)構(gòu)基因。采用的5’端引物序列為5’CCATG GCC AAG ACA ATT GCG3’(SEQ ID NO21)；3’端引物序列為5’ACCGAA TTC GCT AGC CAT ATG GAA ATC CAT GCC ACC CAT 3’(SEQ ID NO22)。
PCR操作程序在500μl微量離心管中加入下列試劑模板cDNA(mmol/L)5μl10×PCR緩沖液(含氯化鎂) 5μldNTPs(10mmol/L) 1μl5’端和3’端引物(0.01mmol/L)各0.5μlTaq DNA聚合酶(5u/μl)0.25μl去離子水 加至終體積為50μl混合后加入礦物油 3滴反應(yīng)條件94℃，30″；55℃，1’；72℃，2’，30個循環(huán)周期后，72℃延伸10min4.克隆PCR產(chǎn)物采用TA克隆方法。方法見TA連接試劑盒(Promega)按常規(guī)方法(Joseph.Sambrook，David W.Russell.SDS堿裂解法制備質(zhì)粒DNA，MolecularcloningA Laboratory Manual，3rded.27-30，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，2001)提取質(zhì)粒，采用雙脫氧末端終止法，對插入片段進(jìn)行序列測定(ABIPrism310TM，USA)。
獲得的卡介苗(BCG)HSP65基因的序列為5’ATGGCCAAGA CAATTGCGTA CGACGAAGAG GCCCGTCGCG GCCTCGAGCG 50GGGCTTGAAC GCCCTCGCCG ATGCGGTAAA GGTGACATTG GGCCCCAAGG100GGCGCAACGT CGTCCTGGAA AAGAAGTGGG GTGCCCCCAC GATCACCAAC150GATGGTGTGT CCATCGCCAA GGAGATCGAG CTGGAGGATC CGTACGAGAA200GATCGGCGCC GAGCTGGTCA AAGAGGTAGC CAAGAAGACC GATGACGTCG250CGGGTGACGG CACCACGACG GCCACCGTGC TGGCCCAGGC GTTGGTTCGC300GAGGGCCTGC GCAACGTCGC GGCCGGCGCC AACCCGCTCG GTCTCAAACG350CGGCATCGAA AAGGCCGTGG AGAAGGTCAC CGAGACCCTG CTCAAGGGCG400CCAAGGAGGT CGAGACCAAG GAGCAGATTG CGGCCACCGC AGCGATTTCG450GGGGGTGACC AGTCCATCGG TGACCTGATC GCCGAGGCGA TGGACAAGGT500GGGCAACGAG GGCGTCATCA CCGTCGAGGA GTCCAACACC TTTGGGCTGC550AGCTCGAGCT CACCGAGGGT ATGCGGTTCG ACAAGGGCTA CATCTCGGGG600TACTTCGTGA CCGACCCGGA GCGTCAGGAG GCGGTCCTGG AGGACCCCTA650CATCCTGCTG GTCAGCTCCA AGGTGTCCAC TGTCAAGGAT CTGCTGCCGC700TGCTCGAGAA GGTCATCGGA GCCGGTAAGC CGCTGCTGAT CATCGCCGAG750GACGTCGAGG GCGAGGCGCT GTCCACCCTG GTCGTCAACA AGATCCGCGG800CACCTTCAAG TCGGTGGCGG TCAAGGCTCC CGGCTTCGGC GACCGCCGCA850AGGCGATGCT GCAGGATATG GCCATTCTCA CCGGTGGTCA GGTGATCAGC900GAAGAGGTCG GCCTGACGCT GGAGAACGCC GACCTGTCGC TGCTAGGCAA950GGCCCGCAAG GTCGTGGTCA CCAAGGACGA GACCACCATC GTCGAGGGCG 1000CCGGTGACAC CGACGCCATC GCCGGACGAG TGGCCCAGAT CCGCCAGGAG 1050ATCGAGAACA GCGACTCCGA CTACGACCGT GAGAAGCTGC AGGAGCGGCT 1100GGCCAAGCTG GCCGGTGGTG TCGCGGTCAT CAAGGCCGGT GCCGCCACCG 1150ACGTCGAACT CAAGGAGCGC AAGCACCGCA TCGAGGATGC GGTTCGCAAT 1200GCCAAGGCCG CCGTCGAGGA GGGCATCGTC GCCGGTGGGG GTGTGACGCT 1250GTTGCAAGCG GCCCCGACCC TGGACGAGCT GAAGCTCGAA GGCGACGAGG 1300CGACCGGCGC CAACATCGTG AAGGTGGCGC TGGAGGCCCC GCTGAAGCAG 1350ATCGCCTTCA ACTCCGGGCT GGAGCCGGGC GTGGTGGCCG AGAAGGTGCG 1400CAACCTGCCG GCTGGCCACG GACTGAACGC TCAGACCGGT GTCTACGAGG 1450ATCTGCTCGC TGCCGGCGTT GCTGACCCGG TCAAGGTGAC CCGTTCGGCG 1500CTGCAGAATG CGGCGTCCAT CGCGGGGCTG TTCCTGACCA CCGAGGCCGT 1550CGTTGCCGAC AAGCCGGAAA AGGAGAAGGC TTCCGTTCCC GGTGGCGGCG 1600ACATGGGTGG CATGGATTTC CATATGGCTA GCGAATTC 3’用PCR得到的HSP65基因瓊脂糖凝膠電泳見圖1，其對應(yīng)的氨基酸序列為SEQ ID NO7。
實(shí)施例2合成HER2蛋白多表位抗原基因根據(jù)SEQ ID NO1、2、3、4的氨基酸序列設(shè)計(jì)引物，用四輪PCR合成HER2蛋白多表位抗原基因1.第一輪PCR下列兩條引物互為模板引物1的序列為5’CTCTCGCATTCCTGCCAGAATCTTTTGACGGCGACCCGGCATCTAATACCGCACCGCTTCA3’(SEQ IDNO9)引物1’的序列為5’CAACGATTTCTTCCAGAGTCTCAAATACTTGCAGTTGTTCCGGTTGAAGCGGTGCGGTATT3’(SEQ IDNO10)第一輪PCR合成的產(chǎn)物的序列是5’CTCTCGCATTCCTGCCAGAATCTTTTGACGGCGACCCGGCATCTAATACCGCACCGCTTCAACCGGAACAACTGCAAGTATTTGAGACTCTGGAAGAAATCGTTG 3’(SEQ ID NO11)2.第二輪PCR以第一輪PCR的產(chǎn)物為模板引物2的序列是5’CTGACCGAGGAGCAGGAGTTCGCAGGTTCTAAAAAAATCTTCGGCTCTCTCGCATTCCTGC3’(SEQ IDNO12)引物2’的序列是5’CTTTGTTAGCTTTCGGGGAGGTGTTTTCACGCAGAACCTTGATAGCAACGATTTCTTCCA3’(SEQ IDNO13)產(chǎn)物的序列是5’CTGACCGAGGAGCAGGAGTTCGCAGGTTCTAAAAAAATCTTCGGCTCTCTCGCATTCCTGCCAGAATCTTTTGACGGCGACCCGGCATCTAATACCGCACCGCTTCAACCGGAACAACTGCAAGTATTTGAGACTCTGGAAGAAATCGTTGCTATCAAGGTTCTGCGTGAAAACACCTCCCCGAAAGCTAACAAAG3’(SEQ ID NO14)3.第三輪PCR以第二輪PCR的產(chǎn)物為模板引物3的序列是5’GGTGTTGGTTCCCCGTACGTTTCCCGTCTGCTGGGTATTTCCCTGACCGAGGAGCAG3’(SEQ ID NO15)引物3’的序列是5’AGTCAGAGAGTAAGCACCGTTGTGCAGAATACGACCACGTTCTTTGTTAGCTTTCG3’(SEQ ID NO16)
產(chǎn)物的序列是5’GGTGTTGGTTCCCCGTACGTTTCCCGTCTGCTGGGTATTTCCCTGACCGAGGAGCAGGAGTTCGCAGGTTCTAAAAAAATCTTCGGCTCTCTCGCATTCCTGCCAGAATCTTTTGACGGCGACCCGGCATCTAATACCGCACCGCTTCAACCGGAACAACTGCAAGTATTTGAGACTCTGGAAGAAATCGTTGCTATCAAGGTTCTGCGTGAAAACACCTCCCCGAAAGCTAACAAAGAACGTGGTCGTATTCTGCACAACGGTGCTTACTCTCTGACT3’(SEQ IDNO17)4.第四輪PCR以第三輪PCR的產(chǎn)物為模板引物4的序列是5’GAATTCGACGAAGCATACGTTATGGCTGGTGTTGGTTCCCCG3’(SEQ ID NO18)引物4’的序列是5’AAGCTTACCTTGCAGAGTCAGAGAGTAAGC3’(SEQ ID NO19)產(chǎn)物的序列是5’GAATTCGACGAAGCATACGTTATGGCTGGTGTTGGTTCCCCGTACGTTTCCCGTCTGCTGGGTATTTCCCTGACCGAGGAGCAGGAGTTCGCAGGTTCTAAAAAAATCTTCGGCTCTCTCGCATTCCTGCCAGAATCTTTTGACGGCGACCCGGCATCTAATACCGCACCGCTTCAACCGGAACAACTGCAAGTATTTGAGACTCTGGAAGAAATCGTTGCTATCAAGGTTCTGCGTGAAAACACCTCCCCGAAAGCTAACAAAGAACGTGGTCGTATTCTGCACAACGGTGCTTACTCTCTGACTCTGCAAGGTAAGCTT3’(SEQ ID NO20)。
此序列代表的是HER2多表位抗原基因，其編碼的氨基酸序列為SEQ ID NO8。
PCR的反應(yīng)條件為94℃，30″；55℃，1’；72℃，1’，30個循環(huán)周期后，72℃延伸10min。
用PCR獲得的HER2多表位抗原基因的瓊脂糖凝膠電泳見圖2。
實(shí)施例3構(gòu)建表達(dá)HSP65基因的表達(dá)載體(pET28a-HSP65)將熱休克蛋白65(HSP65)的編碼基因和pET28a(Invitrogen)載體分別用NcoI、EcoRI消化，37℃，2h。采用瓊脂糖凝膠電泳分離消化產(chǎn)物。電泳的條件是1％瓊脂糖凝膠，1×TAE緩沖液，150-200mA，電泳0.5-1h。
20×TAE緩沖液0.8mol/L Tris base0.4mol/L NaOAc0.04mol/L Na2EDTA用冰醋酸調(diào)pH 8.3。
在紫外燈下觀察并分別切下瓊脂糖凝膠上的1.6Kb和5.5KbDNA電泳帶處的凝膠。將含DNA的瓊脂糖凝膠，置-70℃冷凍15min，然后在65℃水浴中使膠融化；加入等倍體積TE-飽合酚，劇烈振蕩30秒，然后-70℃冷凍15min；室溫融化后，12,000r/min離心5min，將上層液相移至另一管中，用2-2.5倍乙醇沉淀、洗滌和干燥DNA。
將經(jīng)NcoI、EcoRI消化的熱休克蛋白65(HSP65)的編碼基因和pET28a載體用連接酶連接。
連接反應(yīng)HSP65基因(0.5μg/μl) 2μlpET28a載體(50ng/μl) 2μl10×連接緩沖液(Takara) 1μlT4DNA連接酶1μl雙蒸水 加至體積為10μl混合后置14-16℃水浴6-12h。
實(shí)施例4HSP65和HER2多表位抗原基因融合基因(pET28a-HSP65-HER2)的構(gòu)建1.在37℃，用EcoRI和HindIII分別消化HER2多表位抗原基因和插入了HSP65基因的pET 28a載體(pET28a-HSP65)兩小時。消化產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離。電泳的條件是1％瓊脂糖凝膠，1×TAE緩沖液，150-200mA，電泳0.5-1h。20×TAE緩沖液0.8mol/L Trisbase 0.4mol/L NaOAc 0.04mol/L Na2EDTA用冰醋酸調(diào)pH 8.3。
在紫外燈下觀察并切下瓊脂糖凝膠上的315bp、7.1Kb大小DNA電泳帶的凝膠。將含DNA區(qū)帶的瓊脂糖凝膠，置-70℃冷凍15min，然后在65℃水浴中使膠融化；加入等倍體積TE-飽合酚，劇烈振蕩30sec，然后-70℃冷凍15min；室溫融化后，1200r/min離心5min，將上層液相移至另一管中，用2-2.5倍乙醇沉淀、洗滌和干燥DNA。
2.連接反應(yīng)質(zhì)粒DNA(pET28a-HSP65)(0.5μg/μl) 2μlHER2多表位抗原基因(300ng/μl) 5μl10×連接緩沖液(Takara)1μlT4DNA連接酶 1μl雙蒸水調(diào)節(jié)體積至10μl混合后置14-16℃水浴6-12h3.將含HSP65-HER2融合基因的重組質(zhì)粒pET28a(+)-HSP65-HER2轉(zhuǎn)化E.colil).感受態(tài)細(xì)胞的制備
a、將E.coli在LB瓊脂培養(yǎng)基上劃線，37℃培養(yǎng)12-16h；b、次日從瓊脂平板上取一單菌落于5ml LB培養(yǎng)基中，37℃以225rpm/min速度震蕩培養(yǎng)12-16h；c、取1ml上述培養(yǎng)物接種于100ml LB培養(yǎng)基中，37℃以225rpm/min的速度震蕩培養(yǎng)直至OD值為0.5左右(大約3h)；d、將菌液冰浴2h，然后2,500g，4℃離心20min收集菌體；e、加入100ml冰冷的Trituration緩沖液(100mmol/LCaCl2，70mmol/L MgCl2，40mmol/L醋酸鈉，pH5.5)，混勻，置冰上45min；f、1,800g，4℃離心10min，棄上清，加入10ml冰冷的Trituration緩沖液懸浮細(xì)胞；g、按每份200μl分裝，4℃可保存1-2周。若需長期保存，可加甘油至終濃度為15％，置-70℃?zhèn)溆谩?br> 2).轉(zhuǎn)化試驗(yàn)a、將200μl感受態(tài)細(xì)胞置冰上融化，然后加入3μl DMSO或β-巰基乙醇，混合后，加入3-5μl連接反應(yīng)液(含重組質(zhì)粒)，溫和混勻，置冰上30min。
b、42℃45sec，然后迅速放回冰中1-2min。
c、加入2ml LB培養(yǎng)液，37℃以225rpm/min的速度搖蕩培養(yǎng)1h。
d、4,000g離心10sec，棄上清，用200μl LB培養(yǎng)液重懸菌體。
e、將菌液鋪于含有卡那霉素30-50μg的LB瓊脂培養(yǎng)板上，涂勻，室溫放置20-30min，倒置于37℃孵箱中培養(yǎng)12-16h。用限制性內(nèi)切酶消化的方法鑒定重組克隆。
f、質(zhì)粒和菌株的保存質(zhì)粒冰凍保存于-20℃。菌株在含20％-50％甘油培養(yǎng)液中保存于-20℃或-70℃。
4.HSP65和人HER2多表位抗原基因融合構(gòu)成的融合基因的測序按照常規(guī)提取質(zhì)粒的方法(Joseph.Sambrook，David W.Russell.SDS堿裂解法制備質(zhì)粒DNA，Molecular cloningA Laboratory Manual，3rded.27-30，Cold Spring HarborLaboratory Press，2001)，得到含有HSP65-HER2基因的質(zhì)粒，用測序儀(ABIPrism310TM，USA)測定HSP65-HER2的基因序列，結(jié)果表明，所得到的HSP65-HER2融合基因和本發(fā)明設(shè)計(jì)的HSP65-HER2基因序列完全一致。
pET28a-HSP65-HER2酶切鑒定結(jié)果見圖3。
實(shí)施例5HSP65-HER2重組融合蛋白的表達(dá)挑取含有重組質(zhì)粒pET28a-HSP65-HER2的表達(dá)菌BL21DE3(Novagen，America)單菌落接種于含有50ml LB培養(yǎng)基的250ml三角燒瓶中，37℃水浴震蕩培養(yǎng)至OD600值為0.6。加入IPTG使其終濃度為0.4mM，37℃水浴震蕩培養(yǎng)2-3h。將含有表達(dá)菌的三角燒瓶置于冰上5min，4℃離心5min(5000xg)。吸棄上清，收集細(xì)菌，立即使用或凍存。
用同樣方法誘導(dǎo)含有pET28a-HSP65-HER2-ME重組質(zhì)粒的表達(dá)菌BL21 DE3(Novagen，America)進(jìn)行表達(dá)。
分別取上述兩種表達(dá)菌誘導(dǎo)前及誘導(dǎo)后的等量樣品進(jìn)行SDS-PAGE。
重組融合蛋白HSP65-HER2和HSP65-HER2-ME表達(dá)量比較的SDS-PAGE鑒定見圖4。
實(shí)施例6重組融合蛋白HSP65-HER2的純化重組融合蛋白HSP65-HER2和HSP65-HER2-ME用同樣的方法進(jìn)行純化。
1、裂菌使用溶液A(50mM NaCl、20mM醋酸鈉pH6.0)重懸發(fā)酵菌體，超聲波裂菌，離心收集上清。
2、離子交換層析層析填料Q Sepharose XL(Pharmingen，USA)溶液A50mM NaCl、20mM醋酸鈉pH6.0溶液B20mM醋酸鈉、1M NaCl pH6.0樣品超聲裂菌上清步驟使用溶液A平衡Q Sepharose XL介質(zhì)，樣品上樣后，使用溶液B0-100％線性梯度洗脫收集目標(biāo)蛋白所在洗脫峰作為下一步疏水層析樣品。
三、疏水層析層析填料Phenyl Sepharose FF(Pharmingen)溶液C1.5M NaCl、20mMTris pH7.9溶液D20mM Tris pH7.9樣品離子交換層析洗脫樣品(經(jīng)透析后更換緩沖液為溶液C)步驟用溶液C平衡疏水介質(zhì)(Phenyl SFF)，樣品上樣，溶液D 35％-100％進(jìn)行線性梯度洗脫，收集目標(biāo)蛋白所在洗脫峰。
4、DEAE離子交換去除內(nèi)毒素層析填料DEAE Sepharose FF(Pharmingen)溶液E100mM NaCl、20mM Tris、pH7.0溶液F1.5M NaCl、20mM Tris、pH7.0樣品疏水層析洗脫樣品步驟用溶液E平衡介質(zhì)(DEAE SFF)，溶液F進(jìn)行梯度洗脫，收集洗脫峰。洗脫樣品使用G25除鹽并更換緩沖液為PBS。
樣品進(jìn)行脫鹽后即得到重組融合蛋白HSP65-HER2，其編碼核苷酸序列為SEQ ID NO5，氨基酸序列為SEQ ID NO6。
重組融合蛋白HSP65-HER2和HSP65-HER2-ME純化后的單體和二聚體SDS-PAGE見圖5。
實(shí)施例7獲得穩(wěn)定表達(dá)HER2多表位抗原基因的B16(C57BL/6小鼠黑色素瘤細(xì)胞系)細(xì)胞株1.用PCR方法獲得多聚HER2多表位基因的序列以SEQ ID NO20的DNA片段為模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)引物5的序列為5’CTGCAGGATCCATGGACGAAGCATACGTTATGGC3’(SEQ ID NO23)引物5’的序列為5’GCGGCCGCAAGCTTAAGATCTACCTTGCAGAGTCAGAGAGTAA 3’(SEQ ID NO24)PCR的反應(yīng)條件為94℃，30″；55℃，1’；72℃，1’，30個循環(huán)周期后，72℃延伸10min。
得到產(chǎn)物DNA的序列為5’CTGCAGGATCCATGGACGAAGCATACGTTATGGCTGGTGTTGGTTCCCCGTACGTTTCCCGTCTGCTGGGTATTTCCCTGACCGAGGAGCAGGAGTTCGCAGGTTCTAAAAAAATCTTCGGCTCTCTCGCATTCCTGCCAGAATCTTTTGACGGCGACCCGGCATCTAATACCGCACCGCTTCAACCGGAACAACTGCAAGTATTTGAGACTCTGGAAGAAATCGTTGCTATCAAGGTTCTGCGTGAAAACACCTCCCCGAAAGCTAACAAAGAACGTGGTCGTATTCTGCACAACGGTGCTTACTCTCTGACTCTGCAAGGTAGATCTTAAGCTTGCGGCCGC 3’(SEQ ID NO25)(含有PstI，BamHI，kozak序列，BglII，HindIII和NotI酶切位點(diǎn))2.將HER2多表位基因與真核表達(dá)載體pcDNA3連接將HER2多表位抗原基因(SEQ ID NO25)和真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3(Invitrogen)分別用限制性內(nèi)切酶BamHI和NotI酶切。酶切條件37℃2小時，采用瓊脂糖凝膠電泳分離消化產(chǎn)物。
采用瓊脂糖凝膠電泳分離消化產(chǎn)物。電泳的條件是1％瓊脂糖凝膠，1×TAE緩沖液，150-200mA，電泳0.5-1h。
20×TAE緩沖液0.8mol/L Tris base0.4mol/L NaOAc0.04mol/L Na2EDTA用冰醋酸調(diào)pH 8.3。
在紫外燈下觀察并分別切下瓊脂糖凝膠上的333bp和5.5Kb DNA電泳帶。將含DNA區(qū)帶的瓊脂糖凝膠，置-70℃冷凍15min，然后在65℃水浴中使膠融化；加入等倍體積TE-飽合酰，劇烈振蕩30秒，然后-70℃冷凍15min；室溫融化后，12,000r/min離心5min，將上層液相移至另一管中，用2-2.5倍乙醇沉淀、洗滌和干燥DNA。
將經(jīng)BamHI和NotI酶切消化的HER2和用同樣酶處理的真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3用連接酶連接。
連接反應(yīng)HER2基因 (5μg/μl) 2μl真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3 (0.5μg/μl)2μl10×連接緩沖液(Takara) 1μlT4DNA連接酶1μl雙蒸水調(diào)節(jié)總體積至10μl混合后置14-16℃水浴6-12h。
3.pcDNA3-HER2基因的測序(ABIPrism310TM，USA)結(jié)果表明所得到的pcDNA3-HER2基因和本發(fā)明所設(shè)計(jì)的pcDNA3-HER2基因完全一致。
pcDNA3-HER2基因用BamHI和NotI的酶切鑒定見圖6。
4.用pcDNA3-HER2質(zhì)粒(pcDNA3-HER2)轉(zhuǎn)染B16細(xì)胞系取1-2μg pcDNA3-HER2質(zhì)粒及15μl的Liposome(Invitrogen)加入到200μl無血清培養(yǎng)液中，混勻。室溫(一般為20-25℃左右)孵育10-15min后，加入800μl無血清培養(yǎng)液，輕輕混勻待用。用PBS將欲轉(zhuǎn)染的B16細(xì)胞洗一次，然后加入上述配好的轉(zhuǎn)染試劑。37℃，5％CO2培養(yǎng)5小時。加入1000μl完全培養(yǎng)液，混勻，37℃，5％CO2培養(yǎng)過夜。次日，更換為含G418的新鮮完全培養(yǎng)液。待細(xì)胞穩(wěn)定增長后，用有限稀釋法篩選出表達(dá)HER2多表位基因的B16細(xì)胞單克隆株。用Western blot或ELISA法檢測HER2多表位抗原的表達(dá)，選取陽性克隆用于下步實(shí)驗(yàn)。
實(shí)施例8重組融合蛋白HSP65-HER2可誘生小鼠HER2特異性的CTL1.方法共設(shè)計(jì)6組，10只小鼠/組


上述小鼠的注射和免疫部位是小鼠四肢皮下向心端。
各種靶細(xì)胞用51Cr標(biāo)記1h。采用常規(guī)細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)，效應(yīng)細(xì)胞和靶細(xì)胞共孵育4h后離心收集上清。使用放射性測定儀測定上清中的放射性含量(cpm)。
特異性殺傷％＝實(shí)驗(yàn)孔(cpm)-自發(fā)釋放孔(cpm)/最大釋放孔(cpm)-自發(fā)釋放孔(cpm)％。
2.結(jié)果HSP65-HER2融合蛋白能夠在小鼠中誘生HER2特異性的CTL而PBS不能，且這種誘生的CTL只能特異性地殺傷表達(dá)HER2多表位抗原的腫瘤細(xì)胞而不能殺傷不表達(dá)HER2多表位抗原的腫瘤細(xì)胞。各組間所誘生的CTL的比較見圖7。
3.結(jié)論HSP65-HER2融合蛋白能夠在小鼠中誘生HER2特異性的CTL，且此CTL在體外只能殺傷表達(dá)HER2多表位抗原的腫瘤細(xì)胞。
實(shí)施例9重組融合蛋白HSP65-HER2免疫的小鼠其體內(nèi)轉(zhuǎn)染HER2多表位抗原基因的腫瘤細(xì)胞的生長受到特異性地抑制1方法及免疫程序共設(shè)計(jì)3組，10只小鼠/組


在接種腫瘤細(xì)胞25天后處死上述各組小鼠，分離腫瘤，稱量各組小鼠瘤重。
2.結(jié)果實(shí)驗(yàn)組小鼠腫瘤重量顯著小于對照組1小鼠的腫瘤重量，實(shí)驗(yàn)組小鼠的腫瘤重量顯著小于對照組2小鼠的腫瘤重量(P＜0.05)。各組小鼠腫瘤大小的比較見圖8。
3.結(jié)論重組融合蛋白HSP65-HER2免疫的小鼠只能特異性地抑制其體內(nèi)轉(zhuǎn)染HER2多表位抗原基因的腫瘤細(xì)胞的生長。
實(shí)施例10注射轉(zhuǎn)染HER2多表位抗原基因腫瘤細(xì)胞的小鼠接受重組HSP65-HER2融合蛋白后其體內(nèi)腫瘤細(xì)胞的生長受到特異性抑制1.方法及免疫程序共設(shè)計(jì)3組，10只小鼠/組

在接種腫瘤后25天后處死上述各組小鼠，分離腫瘤，稱量各組小鼠瘤重。
2.結(jié)果實(shí)驗(yàn)組小鼠的腫瘤重量顯著小于對照組1小鼠的腫瘤重量，實(shí)驗(yàn)組小鼠的腫瘤重量顯著小于對照組2小鼠的腫瘤重量(P＜0.05)。各組小鼠腫瘤大小的比較見圖9。
3.結(jié)論注射轉(zhuǎn)染HER2多表位抗原基因腫瘤細(xì)胞的小鼠接受重組HSP65-HER2融合蛋白后其體內(nèi)腫瘤細(xì)胞的生長受到特異性抑制。
實(shí)施例11重組融合蛋白HSP65-HER2在體外誘生HER2多表位抗原特異性的CTL1.分離人外周血單核細(xì)胞1)將12.5ml泛影葡胺分別加入于幾支50ml離心管中2)汲取50ml PBS/EDTA緩沖液移入一燒瓶中。
3)血袋經(jīng)70％己醇洗后，將其中的血移入于含與血樣等體積的PBS/EDTA(PBSNaCL 8.0克，KCL 0.2克，Na2PO43.58克，KH2PO40.24克，將上述試劑溶于800毫升蒸餾水中，最后定容至1000毫升，高壓滅菌后使用。1000毫升的PBS中加入10毫升濃度為200mM的EDTA)溶液的燒瓶中，混勻。
4)從燒瓶中汲取稀釋后的血液25ml移入于含12.5ml泛影葡胺的50ml試管中。
5)將上述試管，室溫下以3000r/min轉(zhuǎn)速(不使用剎車)離心20-25min。
6)離心后，去上清，汲取界面層，移入一新離心管中。
7)向此含有分層細(xì)胞的離心管中加入PBS/EDTA緩沖液至45ml后，1800r/min，4℃，離心10min。此為第一次沖洗；第二次沖洗時為1200r/min，4℃，離心7min。
8)收取試管底部的細(xì)胞團(tuán)，加入PBS/EDTA/人血清緩沖液重懸細(xì)胞。所用體積視細(xì)胞數(shù)而定。
9)將上述含有細(xì)胞的試管離心，1200r/min，4℃離心7min(不用剎車)。
10)以6ml冷的PBS/EDTA/人血清緩沖液重懸細(xì)胞，取2只試管，各加6ml 52％冷的Percol。
11)汲取3ml細(xì)胞懸液緩慢移入(勿攪動Percol)含6ml冷的52％Percol試管中，在無剎車條件下離心，2000r/min，4℃離心20min。
12)汲取界面層細(xì)胞，移入一新管中；將其他細(xì)胞移入另一管中進(jìn)行HLA分型。
13)以冷的PBS/EDTA/人血清緩沖液洗滌分層細(xì)胞，4℃，1300r/inm，無剎車離心10min。
14)以尼龍網(wǎng)濾過因死亡而成團(tuán)的分層細(xì)胞。
15)計(jì)數(shù)單核細(xì)胞數(shù)。
2.誘導(dǎo)未成熟的樹突狀細(xì)胞1)以IMDM稀釋單核細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞數(shù)達(dá)2×106/ml。
2)向12孔板中每一個孔加入1ml細(xì)胞懸液，再加入1ml IMDM，將含有細(xì)胞的12孔板于37℃，5％CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)2h。
3)2h后，用IMDM沖洗含有細(xì)胞的12孔板去掉每孔中未黏附的細(xì)胞。
4)以IMDM洗一次，用手輕輕搖動12孔板。
5)每孔中加入2ml含100ng(200U)/ml GM-CSF和200U/ml IL-4的IMDM。
6)于37℃，5％CO2孵箱中培養(yǎng)5d，每2-3d換一次培養(yǎng)液。
3.用重組融合蛋白HSP65-HER2裝載樹突狀細(xì)胞1)于第5天將重組融合蛋白HSP65-HER2直接加于未成熟的樹突狀細(xì)胞(DC)中使其終濃度達(dá)100μg/ml，繼續(xù)培養(yǎng)2d。
2)于第7d收獲成熟的DC。
4.自人的外周血分離CD8+T淋巴細(xì)胞1)從人血漿白細(xì)胞層分離外周血單個核細(xì)胞(PBMC)。
2)以PBS/EDTA/人血清緩沖液洗滌分離出的單個核細(xì)胞并計(jì)數(shù)。
3)根據(jù)得到的細(xì)胞數(shù)量準(zhǔn)備抗體溶液抗體溶液是用PBS/EDTA/人血清緩沖液將抗體制備成1∶1000稀釋液，所含抗體為小鼠抗人anti-CD4，anti-CD14，anti-CD56，anti-CD19，anti-CD45RO，HLA-DR，γδ-TCR。每20×106個細(xì)胞需要1ml抗體溶液。
4)用抗體溶液重懸細(xì)胞。
5)將細(xì)胞與抗體混懸液置冷室內(nèi)或冰上震蕩培養(yǎng)30min。
6)離心收獲細(xì)胞，將與抗體結(jié)合的細(xì)胞重懸于25ml PBS/EDTA/人血清緩沖液中。
7)制備抗小鼠IgG磁珠，以PBS(pH7.4)將磁珠洗三次。
8)按照細(xì)胞/磁珠＝1/4的比例將細(xì)胞重懸于含磁珠的試管內(nèi)，置冰上，然后于雙向搖床上培養(yǎng)20min。
9)離心收獲上清，上清中即含有所需要的CD8+T淋巴細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)。
10)于96孔U型板中加入2×105T細(xì)胞/孔。
5.用裝載重組融合蛋白HSP65-HER2的樹突狀細(xì)胞刺激CD8+T淋巴細(xì)胞1)按照1∶1，1∶2，1∶5和1∶10等幾種不同濃度將CD8+T淋巴細(xì)胞和裝載了重組融合蛋白HSP65-HER2的樹突狀細(xì)胞(DCs)混合在一起，培養(yǎng)6d-7d。
2)按照上述方法重復(fù)刺激CD8+T淋巴細(xì)胞兩次，每次培養(yǎng)6d-7d。
3)3周以后，收獲HER2特異性的CD8+T細(xì)胞。
6.T2細(xì)胞標(biāo)記和HER2特異性抗原肽的加載1.含有T2細(xì)胞的培養(yǎng)瓶中，加入51Cr使其終濃度達(dá)到1μCi/ml，將含有T2細(xì)胞和51Cr的培養(yǎng)瓶于37℃，5％CO2培養(yǎng)1-2小時。期間偶而搖動混合幾次，然后以IMDM培養(yǎng)液洗細(xì)胞3次。
2.向含有已標(biāo)記51Cr的T2細(xì)胞培養(yǎng)中，分別加入10-100μgHER2特異性抗原肽，37℃，5％CO2培養(yǎng)1-2小時。同時用無關(guān)肽作陰性對照。
7.CTL分析1.向96孔板中以不同的效靶比加入效應(yīng)細(xì)胞和靶細(xì)胞。
2.設(shè)立對照組自然釋放對照靶細(xì)胞50μl+培養(yǎng)基 100μl最大釋放對照靶細(xì)胞50μl+10％Triton X-100100μl3.將已加入效應(yīng)細(xì)胞和靶細(xì)胞的96孔板離心，1500rpm/min，5min。
4.將96孔板置37℃，5％CO2條件下培養(yǎng)4-6h。
5.培養(yǎng)后使用Skkatron濾過系統(tǒng)收獲細(xì)胞懸液，每個樣品于γ-計(jì)數(shù)器上計(jì)數(shù)1min。
6.按以下公式計(jì)算釋放率(％)特異性殺傷％＝實(shí)驗(yàn)孔(cpm)-自發(fā)釋放孔(cpm)/最大釋放孔(cpm)-自發(fā)釋放孔(cpm)％。
8.CTL結(jié)果成熟的樹突狀細(xì)胞能夠?qū)ER2特異性的T細(xì)胞表位呈遞給自體來源的CD8+T淋巴細(xì)胞。用這種成熟的樹突狀細(xì)胞刺激CD8+T淋巴細(xì)胞3次，每次6-7天，獲得的殺傷性T淋巴細(xì)胞能夠殺傷表達(dá)HER2多表位抗原的腫瘤細(xì)胞，而不能殺傷不含有該抗原的腫瘤細(xì)胞。見圖10。
9.結(jié)論重組融合蛋白HSP65-HER2在體外能夠誘生HER2多表位抗原特異性的CTL。
實(shí)施例12重組融合蛋白HSP65-HER2在體外可誘導(dǎo)HLA-A24限制性的CTL1.步驟同實(shí)施例11，分離HLA-A24限制性的的健康人外周血單核細(xì)胞，其中一部分細(xì)胞誘導(dǎo)為不成熟的樹突狀細(xì)胞，另一種細(xì)胞用于分離CD8+T淋巴細(xì)胞。不成熟的樹突狀細(xì)胞分別加載HSP65-HER2-ME和HSP65-HER2進(jìn)行培養(yǎng)。在HSP65-HER2和HSP65-HER2-ME誘導(dǎo)下轉(zhuǎn)變?yōu)槌墒鞝顟B(tài)的樹突狀細(xì)胞刺激自體來源的CD8+T淋巴細(xì)胞。共刺激三次，每次培養(yǎng)6-7d，3周以后，分別收獲HSP65-HER2及HSP65-HER2-ME特異性的CD8+T淋巴細(xì)胞。
2.T2/A24細(xì)胞的標(biāo)記(T2/A24細(xì)胞為T2細(xì)胞用HLA-A2402cDNA轉(zhuǎn)染而成)和HER2特異性抗原肽(PYVSRLLGI)加載同實(shí)施例11中的6.T2細(xì)胞標(biāo)記和HER2特異性抗原肽的加載。
分別用收獲的HSP65-HER2及HSP65-HER2-ME特異的CD8+T淋巴細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞，加載了抗原肽(PYVSRLLGI)的T2/A24細(xì)胞作為靶細(xì)胞，進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)的殺傷實(shí)驗(yàn)。
結(jié)果表明重組融合蛋白HSP65-HER2在體外可誘生HLA-A24限制性的CTL而HSP65-HER2-ME不能。見圖11。
結(jié)論重組融合蛋白HSP65-HER2在體外可誘生HLA-A24限制性的CTL而HSP65-HER2-ME不能。
序列表<110>北京迪威華宇生物技術(shù)有限公司<120>熱休克蛋白65-人上皮細(xì)胞生長因子受體2融合蛋白(HSP65-HER2)<160>25<210>1<211>25<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>1Asp Glu Ala Tyr Val Met Ala Gly Val Gly Ser Pro Tyr Val Ser1 5 10 15Arg Leu Leu Gly Ile Ser Leu Thr Glu Glu20 25<210>2<211>45<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>2Gln Glu Phe Ala Gly Ser Lys Lys Ile Phe Gly Ser Leu Ala Phe1 5 10 15Leu Pro Glu Ser Phe Asp Gly Asp Pro Ala Ser Asn Thr Ala Pro20 25 30Leu Gln Pro Glu Gln Leu Gln Val Phe Glu Thr Leu Glu Glu Ile35 40 45<210>3<211>17<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>3Val Ala Ile Lys Val Leu Arg Glu Asn Thr Ser Pro Lys Ala Asn1 5 10 15Lys Glu
<210>4<211>16<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>4Arg Gly Arg Ile Leu His Asn Gly Ala Tyr Ser Leu Thr Leu Gln1 5 10 15Gly<210>5<211>1989<212>DNA<213>人工合成<400>5atggccaaga caattgcgta cgacgaagag gcccgtcgcg gcctcgagcg 50gggcttgaac gccctcgccg atgcggtaaa ggtgacattg ggccccaagg100gccgcaacgt cgtcctggaa aagaagtggg gtgcccccac gatcaccaac150gatggtgtgt ccatcgccaa ggagatcgag ctggaggatc cgtacgagaa200gatcggcgcc gagctggtca aagaggtagc caagaagacc gatgacgtcg250ccggtgacgg caccacgacg gccaccgtgc tggcccaggc gttggttcgc300gagggcctgc gcaacgtcgc ggccggcgcc aacccgctcg gtctcaaacg350cggcatcgaa aaggccgtgg agaaggtcac cgagaccctg ctcaagggcg400ccaaggaggt cgagaccaag gagcagattg cggccaccgc agcgatttcg450gcgggtgacc agtccatcgg tgacctgatc gccgaggcga tggacaaggt500gggcaacgag ggcgtcatca ccgtcgagga gtccaacacc tttgggctgc550agctcgagct caccgagggt atgcggttcg acaagggcta catctcgggg600tacttcgtga ccgacccgga gcgtcaggag gcggtcctgg aggaccccta650catcctgctg gtcagctcca aggtgtccac tgtcaaggat ctgctgccgc700tgctcgagaa ggtcatcgga gccggtaagc cgctgctgat catcgccgag750
gacgtcgagg gcgaggcgct gtccaccctg gtcgtcaaca agatccgcgg 800caccttcaag tcggtggcgg tcaaggctcc cggcttcggc gaccgccgca 850aggcgatgct gcaggatatg gccattctca ccggtggtca ggtgatcagc 900gaagaggtcg gcctgacgct ggagaacgcc gacctgtcgc tgctaggcaa 950ggcccgcaag gtcgtggtca ccaaggacga gaccaccatc gtcgagggcg1000ccggtgacac cgacgccatc gccggacgag tggcccagat ccgccaggag1050atcgagaaca gcgactccga ctacgaccgt gagaagctgc aggagcggct1100ggccaagctg gccggtggtg tcgcggtcat caaggccggt gccgccaccg1150acgtcgaact caaggagcgc aagcaccgca tcgaggatgc ggttcgcaat1200gccaaggccg ccgtcgagga gggcatcgtc gccggtgggg gtgtgacgct1250gttgcaagcg gccccgaccc tggacgagct gaagctcgaa ggcgacgagg1300cgaccggcgc caacatcgtg aaggtggcgc tggaggcccc gctgaagcag1350atcgccttca actccgggct ggagccgggc gtggtggccg agaaggtgcg1400caacctgccg gctggccacg gactgaacgc tcagaccggt gtctacgagg1450atctgctcgc tgccggcgtt gctgacccgg tcaaggtgac ccgttcggcg1500ctgcagaatg cggcgtccat cgcggggctg ttcctgacca ccgaggccgt1550cgttgccgac aagccggaaa aggagaaggc ttccgttccc ggtggcggcg1600acatgggtgg catggatttc catatggcta gcgaattcga cgaagcatac1650gttatggctg gtgttggttc cccgtacgtt tcccgtctgc tgggtatttc1700cctgaccgag gagcaggagt tcgcaggttc taaaaaaatc ttcggctctc1750tcgcattcct gccagaatct tttgacggcg acccggcatc taataccgca1800ccgcttcaac cggaacaact gcaagtattt gagactctgg aagaaatcgt1850tgctatcaag gttctgcgtg aaaacacctc cccgaaagct aacaaagaac1900
gtggtcgtat tctgcacaac ggtgcttact ctctgactct gcaaggtaag 1950cttgcggccg cactcgagca ccaccaccac caccactga 1989<210>6<211>663<212>PRT<213>人工合成<400>6Met Ala Lys Thr Ile Ala Tyr Asp Glu Glu Ala Arg Arg Gly Leu1 5 10 15Glu Arg Gly Leu Asn Ala Leu Ala Asp Ala Val Lys Val Thr Leu20 25 30Gly Pro Lys Gly Arg Asn Val Val Leu Glu Lys Lys Trp Gly Ala35 40 45Pro Thr Ile Thr Asn Asp Gly Val Ser Ile Ala Lys Glu Ile Glu50 55 60Leu Glu Asp Pro Tyr Glu Lys Ile Gly Ala Glu Leu Val Lys Glu65 70 75Val Ala Lys Lys Thr Asp Asp Val Ala Gly Asp Gly Thr Thr Thr80 85 90Ala Thr Val Leu Ala Gln Ala Leu Val Arg Glu Gly Leu Arg Asn95 100 105Val Ala Ala Gly Ala Asn Pro Leu Gly Leu Lys Arg Gly Ile Glu110 115 120Lys Ala Val Glu Lys Val Thr Glu Thr Leu Leu Lys Gly Ala Lys125 130 135Glu Val Glu Thr Lys Glu Gln Ile Ala Ala Thr Ala Ala Ile Ser140 145 150Ala Gly Asp Gln Ser Ile Gly Asp Leu Ile Ala Glu Ala Met Asp155 160 165Lys Val Gly Asn Glu Gly Val Ile Thr Val Glu Glu Ser Asn Thr170 175 180
Phe Gly Leu Gln Leu Glu Leu Thr Glu Gly Met Arg Phe Asp Lys185 190 195Gly Tyr Ile Ser Gly Tyr Phe Val Thr Asp Pro Glu Arg Gln Glu200 205 210Ala Val Leu Glu Asp Pro Tyr Ile Leu Leu Val Ser Ser Lys Val215 220 225Ser Thr Val Lys Asp Leu Leu Pro Leu Leu Glu Lys Val Ile Gly230 235 240Ala Gly Lys Pro Leu Leu Ile Ile Ala Glu Asp Val Glu Gly Glu245 250 255Ala Leu Ser Thr Leu Val Val Asn Lys Ile Arg Gly Thr Phe Lys260 265 270Ser Val Ala Val Lys Ala Pro Gly Phe Gly Asp Arg Arg Lys Ala275 280 285Met Leu Gln Asp Met Ala Ile Leu Thr Gly Gly Gln Val Ile Ser290 295 300Glu Glu Val Gly Leu Thr Leu Glu Asn Ala Asp Leu Ser Leu Leu305 310 315Gly Lys Ala Arg Lys Val Val Val Thr Lys Asp Glu Thr Thr Ile320 325 330Val Glu Gly Ala Gly Asp Thr Asp Ala Ile Ala Gly Arg Val Ala335 340 345Gln Ile Arg Gln Glu Ile Glu Asn Ser Asp Ser Asp Tyr Asp Arg350 355 360Glu Lys Leu Gln Glu Arg Leu Ala Lys Leu Ala Gly Gly Val Ala365 370 375Val Ile Lys Ala Gly Ala Ala Thr Asp Val Glu Leu Lys Glu Arg380 385 390Lys His Arg Ile Glu Asp Ala Val Arg Asn Ala Lys Ala Ala Val395 400 405
Glu Glu Gly Ile Val Ala Gly Gly Gly Val Thr Leu Leu Gln Ala410 415 420Ala Pro Thr Leu Asp Glu Leu Lys Leu Glu Gly Asp Glu Ala Thr425 430 435Gly Ala Asn Ile Val Lys Val Ala Leu Glu Ala Pro Leu Lys Gln440 445 450Ile Ala Phe Asn Ser Gly Leu Glu Pro Gly Val Val Ala Glu Lys455 460 465Val Arg Asn Leu Pro Ala Gly His Gly Leu Asn Ala Gln Thr Gly470 475 480Val Tyr Glu Asp Leu Leu Ala Ala Gly Val Ala Asp Pro Val Lys485 490 495Val Thr Arg Ser Ala Leu Gln Asn Ala Ala Ser Ile Ala Gly Leu500 505 510Phe Leu Thr Thr Glu Ala Val Val Ala Asp Lys Pro Glu Lys Glu515 520 525Lys Ala Ser Val Pro Gly Gly Gly Asp Met Gly Gly Met Asp Phe530 535 540His Met Ala Ser Glu Phe Asp Glu Ala Tyr Val Met Ala Gly Val545 550 555Gly Ser Pro Tyr Val Ser Arg Leu Leu Gly Ile Ser Leu Thr Glu560 565 570Glu Gln Glu Phe Ala Gly Ser Lys Lys Ile Phe Gly Ser Leu Ala575 580 585Phe Leu Pro Glu Ser Phe Asp Gly Asp Pro Ala Ser Asn Thr Ala590 595 600Pro Leu Gln Pro Glu Gln Leu Gln Val Phe Glu Thr Leu Glu Glu605 610 615Ile Val Ala Ile Lys Val Leu Arg Glu Asn Thr Ser Pro Lys Ala620 625 630Asn Lys Glu Arg Gly Arg Ile Leu His Asn Gly Ala Tyr Ser Leu
635 640 645Thr Leu Gln Gly Lys Leu Ala Ala Ala Leu Glu His His His His650 655 660His His ter663<210>7<211>544<212>PRT<213>BCG HSP65<400>7Met Ala Lys Thr Ile Ala Tyr Asp Glu Glu Ala Arg Arg Gly Leu1 5 10 15Glu Arg Gly Leu Asn Ala Leu Ala Asp Ala Val Lys Val Thr Leu20 25 30Gly Pro Lys Gly Arg Asn Val Val Leu Glu Lys Lys Trp Gly Ala35 40 45Pro Thr Ile Thr Asn Asp Gly Val Ser Ile Ala Lys Glu Ile Glu50 55 60Leu Glu Asp Pro Tyr Glu Lys Ile Gly Ala Glu Leu Val Lys Glu65 70 75Val Ala Lys Lys Thr Asp Asp Val Ala Gly Asp Gly Thr Thr Thr80 85 90Ala Thr Val Leu Ala Gln Ala Leu Val Arg Glu Gly Leu Arg Asn95 100 105Val Ala Ala Gly Ala Asn Pro Leu Gly Leu Lys Arg Gly Ile Glu110 115 120Lys Ala Val Glu Lys Val Thr Glu Thr Leu Leu Lys Gly Ala Lys125 130 135Glu Val Glu Thr Lys Glu Gln Ile Ala Ala Thr Ala Ala Ile Ser140 145 150Ala Gly Asp Gln Ser Ile Gly Asp Leu Ile Ala Glu Ala Met Asp155 160 165
Lys Val Gly Asn Glu Gly Val Ile Thr Val Glu Glu Ser Asn Thr170 175 180Phe Gly Leu Gln Leu Glu Leu Thr Glu Gly Met Arg Phe Asp Lys185 190 295Gly Tyr Ile Ser Gly Tyr Phe Val Thr Asp Pro Glu Arg Gln Glu200 205 210Ala Val Leu Glu Asp Pro Tyr Ile Leu Leu Val Ser Ser Lys Val215 220 225Ser Thr Val Lys Asp Leu Leu Pro Leu Leu Glu Lys Val Ile Gly230 235 240Ala Gly Lys Pro Leu Leu Ile Ile Ala Glu Asp Val Glu Gly Glu245 250 255Ala Leu Ser Thr Leu Val Val Asn Lys Ile Arg Gly Thr Phe Lys260 265 270Ser Val Ala Val Lys Ala Pro Gly Phe Gly Asp Arg Arg Lys Ala275 280 285Met Leu Gln Asp Met Ala Ile Leu Thr Gly Gly Gln Val Ile Ser290 295 300Glu Glu Val Gly Leu Thr Leu Glu Asn Ala Asp Leu Ser Leu Leu305 310 315Gly Lys Ala Arg Lys Val Val Val Thr Lys Asp Glu Thr Thr Ile320 325 330Val Glu Gly Ala Gly Asp Thr Asp Ala Ile Ala Gly Arg Val Ala335 340 345Gln Ile Arg Gln Glu Ile Glu Asn Ser Asp Ser Asp Tyr Asp Arg350 355 360Glu Lys Leu Gln Glu Arg Leu Ala Lys Leu Ala Gly Gly Val Ala365 370 375Val Ile Lys Ala Gly Ala Ala Thr Asp Val Glu Leu Lys Glu Arg380 385 390
Lys His Arg Ile Glu Asp Ala Val Arg Asn Ala Lys Ala Ala Val395 400 405Glu Glu Gly Ile Val Ala Gly Gly Gly Val Thr Leu Leu Gln Ala410 415 420Ala Pro Thr Leu Asp Glu Leu Lys Leu Glu Gly Asp Glu Ala Thr425 430 435Gly Ala Asn Ile Val Lys Val Ala Leu Glu Ala Pro Leu Lys Gln440 445 450Ile Ala Phe Asn Ser Gly Leu Glu Pro Gly Val Val Ala Glu Lys455 460 465Val Arg Asn Leu Pro Ala Gly His Gly Leu Asn Ala Gln Thr Gly470 475 480Val Tyr Glu Asp Leu Leu Ala Ala Gly Val Ala Asp Pro Val Lys485 490 495Val Thr Arg Ser Ala Leu Gln Asn Ala Ala Ser Ile Ala Gly Leu500 505 510Phe Leu Thr Thr Glu Ala Val Val Ala Asp Lys Pro Glu Lys Glu515 520 525Lys Ala Ser Val Pro Gly Gly Gly Asp Met Gly Gly Met Asp Phe530 535 540His Met Ala Ser544<210>8<211>107<212>PRT<213>人工合成<400>8Glu Phe Asp Glu Ala Tyr Val Met Ala Gly Val Gly Ser Pro Tyr1 5 10 15Val Ser Arg Leu Leu Gly Ile Ser Leu Thr Glu Glu Gln Glu Phe20 25 30Ala Gly Ser Lys Lys Ile Phe Gly Ser Leu Ala Phe Leu Pro Glu35 40 45
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1.一種重組融合蛋白，其特征在于它包括熱休克蛋白65(HSP65)和人上皮細(xì)胞生長因子受體2(HER2)多表位抗原多肽，其中，HER2多表位抗原多肽包括SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3和SEQ ID NO4所示的序列。
2.權(quán)利要求1所述的重組融合蛋白，其中HER2多表位抗原多肽可以為1-5個拷貝。
3.權(quán)利要求1所述的重組融合蛋白，其對人的HER2陽性腫瘤有預(yù)防和/或治療作用。
4.權(quán)利要求3所述的重組融合蛋白，其中HER2多表位抗原多肽(1)包含SEQ ID NO8所示的氨基酸序列；或(2)其氨基酸序列與SEQ ID NO8所示的氨基酸序列的同源性大于80％；或(3)其核苷酸編碼序列能夠在核酸雜交條件下與編碼SEQ ID NO8所示的氨基酸序列的核苷酸編碼序列雜交；或(4)包括那些對SEQ ID NO8所示的序列進(jìn)行人工點(diǎn)突變或插入其它序列、或以兩側(cè)連接其它序列的方式進(jìn)行改造后所得到的序列。
5.權(quán)利要求3所述的重組融合蛋白，其中HER2多表位抗原多肽是由a)與SEQ ID NO20的核苷酸序列具有簡并性的核苷酸序列編碼的；或b)與SEQ ID NO20的核苷酸序列具有70％以上同源性的核苷酸序列編碼的；或c)與SEQ ID NO20的核苷酸序列能夠在核酸雜交條件下雜交的核苷酸序列編碼的；或d)SEQ ID NO20的核苷酸序列編碼的；或e)包括那些對SEQ ID NO20所示的序列進(jìn)行人工點(diǎn)突變或插入其它序列、或以兩側(cè)連接其它序列的方式進(jìn)行改造后所得到的序列編碼的。
6.權(quán)利要求3所述的重組融合蛋白，其中HER2多表位抗原多肽是由(1)與SEQ ID NO25的核苷酸序列具有簡并性的核苷酸序列編碼的；或(2)與SEQ ID NO25的核苷酸序列具有70％以上同源性的核苷酸序列編碼的；或(3)與SEQ ID NO25的核苷酸序列能夠在核酸雜交條件下雜交的核苷酸序列編碼的；或(5)SEQ ID NO25的核苷酸序列編碼的；或(6)包括那些對SEQ ID NO25所示的序列進(jìn)行人工點(diǎn)突變或插入其它序列、或以兩側(cè)連接其它序列的方式進(jìn)行改造后所得到的序列編碼的。
7.權(quán)利要求3所述的重組融合蛋白，其中SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3和SEQ ID NO4按隨機(jī)組合方式相互連接構(gòu)成一個拷貝。
8.權(quán)利要求3所述的重組融合蛋白，其中，HER2多表位抗原基因包括那些對SEQ ID NO1，SEQ ID NO2，SEQ ID NO3，和SEQ ID NO4所示的序列進(jìn)行人工點(diǎn)突變或插入其它序列、或以兩側(cè)連接其它序列的方式進(jìn)行改造后所得到的序列。
9.權(quán)利要求1-8中任意一項(xiàng)的重組融合蛋白，其中HSP65(1)包含SEQ ID NO7所示的氨基酸序列；或(2)其氨基酸序列與SEQ ID NO7所示的氨基酸序列的同源性大于80％；或(3)其核苷酸編碼序列能夠在核酸雜交條件下與編碼SEQ ID NO7所示的氨基酸序列的核苷酸編碼序列雜交；或(4)包括那些對SEQ ID NO7所示的序列進(jìn)行人工點(diǎn)突變或插入其它序列、或以兩側(cè)連接其它序列的方式進(jìn)行改造后所得到的序列。
10.權(quán)利要求1-3中任意一項(xiàng)的重組融合蛋白，(1)其具有SEQ ID NO6所示的氨基酸序列；或(2)其氨基酸序列與SEQ ID NO6所示的氨基酸序列的同源性大于80％；或(3)其核苷酸編碼序列能夠在核酸雜交條件下與編碼SEQ ID NO6所示的氨基酸序列的核苷酸編碼序列雜交；或(4)包括那些對SEQ ID NO6所示的序列進(jìn)行人工點(diǎn)突變或插入其它序列、或以兩側(cè)連接其它序列的方式進(jìn)行改造后所得到的序列。
11.權(quán)利要求1-3中任意一項(xiàng)的重組融合蛋白，其是由(1)與SEQ ID NO5的核苷酸序列具有簡并性的核苷酸序列編碼的；或(2)與SEQ ID NO5的核苷酸序列具有70％以上同源性的核苷酸序列編碼的；或(3)與SEQ ID NO5的核苷酸序列能夠在核酸雜交條件下雜交的核苷酸序列編碼的；或(4)SEQ ID NO5的核苷酸序列編碼的；或(5)包括那些對SEQ ID NO5所示的序列進(jìn)行人工點(diǎn)突變或插入其它序列、或以兩側(cè)連接其它序列的方式進(jìn)行改造后所得到的序列編碼的。
12.權(quán)利要求1-3中任意一項(xiàng)所述的重組融合蛋白，其中，HSP65位于該重組融合蛋白的氨基端，HER2多表位抗原位于該重組融合蛋白的羧基端。
13.權(quán)利要求9所述的重組融合蛋白，其中，HSP65位于該重組融合蛋白的氨基端，HER2多表位抗原位于該重組融合蛋白的羧基端。
14.權(quán)利要求1-3中任意一項(xiàng)所述的重組融合蛋白，其中沒有二硫鍵。
15.權(quán)利要求9所述的重組融合蛋白，其中沒有二硫鍵。
16.編碼權(quán)利要求1-15中任意一項(xiàng)的重組融合蛋白的核苷酸序列。
17.含有權(quán)利要求16的核苷酸的載體。
18.權(quán)利要求17的載體，其是質(zhì)粒載體。
19.權(quán)利要求18的載體，其中用于連接權(quán)利要求16的核苷酸的原始載體是pET28a。
20.權(quán)利要求18的載體，其中用于連接權(quán)利要求16的核苷酸的原始載體是pcDNA3。
21.含有權(quán)利要求16所述的核苷酸序列或權(quán)利要求17-20中任意一項(xiàng)所述載體的宿主細(xì)胞。
22.權(quán)利要求21的宿主細(xì)胞，其是原核細(xì)胞。
23.權(quán)利要求22的宿主細(xì)胞，其中所述原核細(xì)胞是大腸桿菌。
24.權(quán)利要求21的宿主細(xì)胞，其是真核細(xì)胞。
25.權(quán)利要求24的宿主細(xì)胞，其中所述真核細(xì)胞是B16細(xì)胞。
26.生產(chǎn)權(quán)利要求1-15中任意一項(xiàng)重組融合蛋白的方法，包括在合適條件下培養(yǎng)權(quán)利要求21-25中任意一項(xiàng)的宿主細(xì)胞，并回收所需的重組融合蛋白。
27.權(quán)利要求1-15中任意一項(xiàng)的重組融合蛋白、權(quán)利要求16的核苷酸序列、權(quán)利要求17-20中任意一項(xiàng)的載體和/或權(quán)利要求21-25中任意一項(xiàng)的細(xì)胞在制備用于治療和/或預(yù)防人的HER2陽性腫瘤的藥物和/或試劑中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種對表達(dá)人上皮細(xì)胞生長因子受體2(HER2)的腫瘤有預(yù)防和/或治療作用的重組融合蛋白，該重組融合蛋白是將熱休克蛋白65(heat shock protein 65，HSP65)的編碼基因和人上皮細(xì)胞生長因子受體2(HER2)多表位抗原基因融合在一起，在大腸桿菌(E.coli)中表達(dá)的重組融合蛋白(HSP65－HER2)。該融合蛋白沒有二硫鍵，不會以二聚體的形式表達(dá)而且MHC限制性范圍擴(kuò)大，覆蓋的人群比例增加。本發(fā)明還提供了編碼HSP65－HER2的堿基序列。
文檔編號A61P35/00GK1749276SQ20041007474
公開日2006年3月22日 申請日期2004年9月14日 優(yōu)先權(quán)日2004年9月14日
發(fā)明者王麗穎, 向澤敏, 于永利 申請人:北京迪威華宇生物技術(shù)有限公司