專利名稱：在生長因子和生物基質(zhì)或載體結(jié)構(gòu)存在下進行細胞增殖和分化的方法和裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及使用至少一種分離形式的生長因子進行初級分化細胞的培養(yǎng)，用于成體細胞的局部特異分化和/或定向分化和/或骨、組織和/或內(nèi)分泌器官的再生。
在個體發(fā)生(即生物個體的胚胎發(fā)育)中，生長因子被表達，其能夠引發(fā)基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)的和與細胞數(shù)目相關(guān)的眾多過程。在正在生長的生物中，因為不再表達這些生長因子而日漸喪失通過再生進行結(jié)構(gòu)性修復(fù)的能力。在特定的個體發(fā)生過程中，骨髓或造血器官的因子在時間上與其它器官的生長過程耦聯(lián)。
已知的生長因子(如表皮生長因子(EGF)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)或肝細胞生長因子(HGF))的缺點是增殖過程是受限的，特別是體外使用初級細胞的增殖過程，而體內(nèi)的使用由于可能的副作用(如激活致癌基因)存在問題。
至今認為組織提取物(例如來自垂體或下丘腦的組織提取物)特別適合用于引起肝細胞的增殖(例如見US6 008 047)。已經(jīng)將這類動物的(偶爾為人的)提取物加入到細胞培養(yǎng)物中。然而，由于可傳播的病毒疾病(如BSE、豬或綿羊病毒)，使在實驗室工作或臨床中使用動物或人組織提取物存在問題。這類提取物的應(yīng)用說明對確切的相關(guān)因子以及它們潛在的用途和效果缺乏了解。另一實質(zhì)性缺點是，通過這類通常難以限定并相當(dāng)依賴于所使用的來源的異質(zhì)性提取物也向培養(yǎng)物中引入了因子，這些因子在臨床使用中可能帶來了不需要的副作用或性質(zhì)。因此，對因子的確切了解和對其劑量的控制，不僅對于能夠相應(yīng)地增殖和分化細胞(特別是在組織工程領(lǐng)域)是重要的因素，并且對于誘導(dǎo)三維(3-D)再生的結(jié)構(gòu)過程也是重要的。
這類結(jié)構(gòu)的設(shè)定，特別對于組織工程而言是重要的，其中3-D生長和它的起始至今仍不了解。雖然如聚集培養(yǎng)之類的傳統(tǒng)方法能夠達到高密度，但必須使用預(yù)擴增的或分離自原初組織的細胞(如肝細胞)才能建立起來。到目前為止，產(chǎn)生精細的預(yù)定結(jié)構(gòu)的誘導(dǎo)性生長過程還是不可能的。
相反，目前在增殖階段之后仍然將細胞(如肝細胞)包埋進凝膠中，以避免形成進一步的(也是大的)聚集體(超聚集體)。這些凝膠在維度上是二維的，它們包含很高的細胞密度，因此阻止了細胞增殖。這種導(dǎo)致分層的2-D凝膠內(nèi)含物已經(jīng)被Bader等人(1995)，Artif.Organs，19，368-374描述為三明治模型或凝膠包載。雖然聚集體在凝膠中的包埋改善了分化的保持，但并不進一步的生長。
至今，從少數(shù)前體細胞到3-D結(jié)構(gòu)的造型生長以及體外和體內(nèi)組織再生意義上的相鄰過程的誘導(dǎo)行為還不可能。然而，細胞的誘導(dǎo)生長行為意味著相當(dāng)大的創(chuàng)新，特別是對于治療或生物技術(shù)過程。這種由3-D載體基質(zhì)協(xié)助的生長行為應(yīng)該，不僅能夠允許移殖或結(jié)構(gòu)重建意義上的生長，事實上還能夠允許從誘導(dǎo)核區(qū)的定向地重新形成。這類過程發(fā)生在個體形成中，并建立在預(yù)先存在的結(jié)構(gòu)上。
僅僅知道生長因子，特別是來自胎兒的神經(jīng)元祖先細胞的生長因子(如白血病抑制因子(LIF)、睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(CNTF)、神經(jīng)膠質(zhì)來源的神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)或神經(jīng)生長因子(NGF))使未分化神經(jīng)元增殖階段成為可能。然而，一旦分化完成以后這些因子便失去作用。
在組織工程中，還存在額外的問題，即，使用的是已經(jīng)比胎兒細胞進一步分化的患者特異性的成體細胞系統(tǒng)。另外，在傳統(tǒng)應(yīng)用中并不考慮原位或體外的共培養(yǎng)。相反，例如甚至嘗試在擴增肝實質(zhì)細胞時避免內(nèi)皮細胞、巨噬細胞和成纖維細胞的如存在于肝臟中的共培養(yǎng)，因為它們是不需要的。然而，目前已知在分化培養(yǎng)物中這些所謂的非實質(zhì)細胞的存在為分化提供了實質(zhì)性貢獻。
因此需要提供能夠基本上保持細胞系統(tǒng)生理狀態(tài)并能提供實質(zhì)性的結(jié)構(gòu)生長的體外增殖方法和/或體內(nèi)再生方法。
現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)使用生長因子——血小板生成素(TPO)和/或促紅細胞生成素(EPO)和/或生長激素(GH)和/或促生長素抑制素和/或白血病抑制因子(LIF)和/或睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(CNTF)——能夠起始、終止并在結(jié)構(gòu)上指導(dǎo)細胞增殖和分化。
令人吃驚的是，這不僅引起了細胞增殖還誘導(dǎo)了結(jié)構(gòu)過程，特別是通過對移植物的就地(原位)誘導(dǎo)作用(例如經(jīng)由所謂的歸巢方法(homing process))引起局部特異分化和/或定向分化。這意味著這些生長激素既能誘導(dǎo)也能終止這些結(jié)構(gòu)過程(structure process)。
本發(fā)明因此涉及體外增殖和分化細胞的方法，其中通過使用生長因子TPO和/或EPO和/或GH，特別是HGH和/或促生長素抑制素和/或LIF和/或CNTF來起始、終止并在結(jié)構(gòu)上指導(dǎo)細胞的生長過程。
因此已知，TPO也可以作為例如c-Mpl配體、mpl配體、巨生成素或巨核細胞生長和發(fā)育因子，并且除了血小板及其前體細胞之外，至今未被用于培養(yǎng)例如成體肝細胞或其它初級細胞。TPO對于巨核細胞和血小板的增殖和發(fā)育是必需的，因此對于血液血小板的形成也是必需的。TPO以332個氨基酸長的蛋白質(zhì)構(gòu)成產(chǎn)生于肝臟和腎臟。
根據(jù)本發(fā)明能夠使用的其它生長因子有轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF β)、前列腺素、粒細胞-巨噬細胞刺激因子(GM-CSF)、生長激素釋放激素(GHRH)、促甲狀腺素釋放激素(TRH)、促性腺激素釋放激素(GnPH)、促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(CRH)、多巴胺、抗利尿激素(ADH)、催產(chǎn)素、催乳素、促腎上腺皮質(zhì)激素、beta-celltropin、lutrotropin和/或血管升壓素。
除了停止或減少所述生長因子向培養(yǎng)物的供給之外，促生長素抑制素和/或TGF β和/或前列腺素也適合終止本發(fā)明的生長過程。
生長因子在溶液中的單獨濃度通常約1至100ng/ml，優(yōu)選的是約10至50ng/ml，特別是約10到20ng/ml。然而，在局部覆蓋的情況下，生長因子的濃度也可以是上述的幾倍。
例如，在內(nèi)分泌器官再生的情況下，生長因子(特別是生長激素釋放激素(GHRH)、促甲狀腺素釋放激素(TRH)、促性腺激素釋放激素(GnRH)、促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(CRH)、促生長素抑制素、多巴胺、抗利尿激素(ADH)和/或催產(chǎn)素)與載體基質(zhì)的相互作用可能誘導(dǎo)內(nèi)分泌細胞原位的分化和/或生長。
對于結(jié)構(gòu)過程可以額外使用催乳素、促腎上腺皮質(zhì)激素、beta-celltropin、lutrotropin和/或血管升壓素。
在進一步的實施方案中，可以額外使用一種或多種神經(jīng)再生因子(優(yōu)選神經(jīng)生長因子(NGF))和/或一種或多種血管再生因子(優(yōu)選血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和/或血小板衍生生長因子(PDGF))。
在內(nèi)皮細胞存在的情況下還可以實現(xiàn)細胞內(nèi)皮化，并由此具有最佳的血液相容性(hemocompatibility)。
所述生長因子通常可以通過商業(yè)購買，但也可以通過技術(shù)人員已知的方法基因操作制備。它們不僅包括天然產(chǎn)生的生長因子，而且也包括基本具有相同的生物活性的生長因子衍生物或變體。
因此，商購獲得例如CellSystems GmbH，St Katharinen生產(chǎn)的TPO。對于培養(yǎng)人成體肝細胞而言優(yōu)選使用人TPO。另外，TPO和它的變體的制備和表征被描述于例如EP1 201 246、WO95/21919、WO95/21920和WO95/26746中。
合適的TPO變體例如是描述于WO95/21919的TPO衍生物或描述于WO95/21920的等位基因變體或種系同源物，或描述于WO95/26746和EP1 201 246的聚乙二醇化的TPO，但并不限于這些。在本發(fā)明的范圍內(nèi)，聚乙二醇化的TPO意指與有機聚合物(如聚乙二醇、聚丙二醇、聚氧化烯)連接的TPO衍生物。其它TPO變體還指與TPO具有低于100％序列一致性但具有優(yōu)選如EP1 201 246中所描述的TPO活性的TPO衍生物。TPO衍生物通常與人TPO(包括其具有TPO活性的片段)具有至少70％的序列一致性，優(yōu)選至少75％，特別是至少80％，尤其是至少85％。特別優(yōu)選的滿足本發(fā)明目的的TPO活性是通過TPO或其變體促進巨核細胞或巨核細胞前體增殖、分化和/或成熟為這些細胞的成血小板產(chǎn)生形式。
EPO也被稱為TPO的胚胎形式，并和它的變體一起被描述于例如EP0 148 605、EP0 205 564、EP0 209 539、EP0 267 678或EP0 411678中。
上文詳細描述的、舉例說明的衍生物和變體也以類似的方式適合于其它所述的生長因子。
根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“生長因子”并不限于天然產(chǎn)生的形式，也包括非天然產(chǎn)生的形式或者變體或衍生物。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“生長因子”不僅包括生長促進子也包括生長抑制子，例如促生長素抑制素、TGF β和/或前列腺素。通過同時或相繼的局部高濃度使用(例如通過水合凝膠或緩慢釋放材料)，這類生長抑制子特別適合抑制或阻止已改變的細胞(如腫瘤細胞)的生長。
本發(fā)明的生長過程在適合特定細胞的培養(yǎng)物中進行。在這方面，該方法可以通過合適的裝置任選地將生長過程形成的細胞聚集體打碎、任選地包囊化以及任選地冷凍。
適當(dāng)裝置的實例是例如具有大小為例如500μm的相交網(wǎng)孔結(jié)構(gòu)的柵格，它具有能反復(fù)產(chǎn)生新的亞聚集物(subsidiary aggregate)(如肝細胞的)的效果。這可以有利地發(fā)生在完全封閉的系統(tǒng)中。特別是可以使用非接觸的、自動或手動控制的泵系統(tǒng)，此系統(tǒng)例如由活塞泵組成產(chǎn)生定向流，或者由磁力或管道壓縮空氣產(chǎn)生定向流。在內(nèi)皮細胞存在的情況下，可能通過經(jīng)灌注的生物反應(yīng)器中的剪切壓力使內(nèi)皮細胞自發(fā)匯合于聚集物表面，這對于進一步的使用可能是有利的。
技術(shù)工人已知適合包囊化的材料，其中例如整合了結(jié)構(gòu)化的形狀或空間，并且使原位生長結(jié)構(gòu)或放大成為可能。無需包囊化的一種替代的可能性是例如內(nèi)皮細胞存在的情況下的內(nèi)皮化，并由此達到最佳的血相容性。
在進一步的實施方案中，細胞的生長過程被定點引發(fā)或終止，并接受結(jié)構(gòu)指導(dǎo)，優(yōu)選的是通過生物基質(zhì)來完成。
在此，生物基質(zhì)被例如一種所述生長因子處理或被所述生長因子的組合以混合物的形式或相繼被處理。由此即使使用成體細胞系統(tǒng)，仍能使3-D再生和/或人工指導(dǎo)組織修復(fù)或組織培養(yǎng)成為可能。
生物基質(zhì)通常是植入物，例如支架、補片(patch)或?qū)Ч?、移植物，如皮膚移植物和/或用于細胞生長的載體材料，如所謂的緩慢釋放材料，如基于如纖維蛋白的水合凝膠和/或聚合物(如聚交酯或聚羥基鏈烷酸酯)，和/或藻酸鹽、骨替代材料(如磷酸三鈣)、同種異型、自體或異種無細胞化或非無細胞化的組織(如心臟瓣膜、靜脈瓣膜、動脈瓣膜、皮膚、血管、大動脈、腱、角膜、軟骨、骨、氣管(tracea)、神經(jīng)、miniscus、椎間盤、輸尿管、尿道或膀胱(例如見EP0 989 867或EP1 172 120)、基質(zhì)(如層粘連蛋白、膠原蛋白IV和/或Matrigel-基質(zhì)，優(yōu)選飼養(yǎng)層(如膠原蛋白I、3T3和/或MRC-5飼養(yǎng)層，或膠原纖維))。
在進一步優(yōu)選的實施方案中，通過技術(shù)人員已知的方法，使用細胞預(yù)先移殖生物基質(zhì)，優(yōu)選組織特異性細胞、前體細胞、骨髓細胞、外周血、脂肪組織和/或纖維組織，例如用來自骨髓的成體前體細胞。通過這種方式可以在體外預(yù)先進行體內(nèi)創(chuàng)傷恢復(fù)過程，因此縮短了體內(nèi)移植后所需的再整合時間。
根據(jù)本發(fā)明使用的細胞特別是成體細胞，即優(yōu)選不再具有胚胎或胎兒表型的初級分化細胞，特別優(yōu)選人成體細胞。它們的例子有成體祖細胞、組織特異性細胞，優(yōu)選造骨細胞、成纖維細胞、肝細胞和/或平滑肌細胞。
然而，也有可能通過高濃度地同時或相繼使用生長抑制子(如促生長素抑制素、TGF β和/或前列腺素)來抑制或阻止已改變的細胞(如腫瘤細胞)。在這種情況下可以使用已經(jīng)提及的含有或由此富集了至少一種所述生長抑制子的水合凝膠或緩慢釋放材料，它們被局部施用或施用在已改變的細胞的附近。
因此，本發(fā)明方法特別適合成體細胞的局部特異的或定向的增殖、結(jié)構(gòu)生長和隨后的分化，和/或骨、組織和/或內(nèi)分泌器官的再生，如心臟瓣膜、靜脈瓣膜、動脈瓣膜、皮膚、血管、大動脈、腱、角膜、軟骨、骨、氣管、神經(jīng)、miniscus、椎間盤、輸尿管、尿道或膀胱。
通過單獨使用所述生長因子或以混合物或相繼的形式使用所述生長因子的組合，或與所述生物基質(zhì)或載體結(jié)構(gòu)聯(lián)合使用，本發(fā)明的方法也能用于體內(nèi)局部使用，如用于肝臟再生、心肌再生之類的組織再生或用于糖尿病潰瘍或齒齦之類的皮膚區(qū)域創(chuàng)傷復(fù)原。例如，TPO可以以水合凝膠如纖維蛋白和/或聚合物(如聚交酯或聚羥基鏈烷酸酯)和/或藻酸鹽的形式被用于如肝臟的切除表面促進肝臟再生，或例如在急性肝衰竭中，在導(dǎo)管的協(xié)助下經(jīng)由肝門被局部或全身性給藥。因此，所述生長因子可以在肝臟切除或肝組織被除去之前、之中或之后被使用以協(xié)助肝臟再生。在使用所述生長因子促進軟骨再生時，生長因子可以被直接注射到膝關(guān)節(jié)。因此，生長因子可能經(jīng)由滑液直接對新軟骨結(jié)構(gòu)的形成發(fā)揮作用。
因此本發(fā)明也涉及生長因子TPO和/或EPO和/或GH和/或促生長素抑制素和/或LIF和/或CNTF在生產(chǎn)藥物中的用途，該藥物用于治療骨、軟骨、組織和/或內(nèi)分泌器官(如實質(zhì)或非實質(zhì)器官，特別是心肌、心臟瓣膜、靜脈瓣膜、動脈瓣膜、皮膚、血管、大動脈、腱、角膜、軟骨、骨、氣管、神經(jīng)、miniscus、椎間盤、肝、腸上皮、輸尿管、尿道或膀胱)的再生，或治療退化性疾病和/或協(xié)助創(chuàng)傷復(fù)原過程，特別是局限性回腸炎、潰瘍性結(jié)腸炎和/或皮膚區(qū)域的創(chuàng)傷(優(yōu)選為糖尿病潰瘍或齒齦)，和/或用于治療肝臟疾病，特別是肝硬化、肝炎、急性或慢性肝衰竭，和/或運動損傷后肌肉組織的創(chuàng)傷復(fù)原、肌肉疾病、骨損傷、軟組織損傷和/或改善創(chuàng)傷復(fù)原和組織再生(如手術(shù)、急性和慢性疾病后)，和/或改善創(chuàng)傷復(fù)原和組織再生(如手術(shù)、急性和慢性紊亂后)，和/或刺激血管新生或再生以治療缺血性心肌病癥，和/或治療受傷和外傷后的缺血，和/或緊隨組織損傷后的再生，如心肌梗塞或血栓(中樞或外周)可能導(dǎo)致的隨后缺血。在這種情況下，給予EPO使血管新生以及隨后或伴隨的組織再生成為可能。
在一特定的實施方案中，用作生長因子的還有轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF β)、前列腺素、粒細胞-巨噬細胞刺激因子(GM-CSF)、生長激素釋放激素(GHRH)、促甲狀腺素釋放激素(TRH)、促性腺激素釋放激素(GnRH)、促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(CRH)、多巴胺、抗利尿激素(ADH)、催產(chǎn)素、催乳素、促腎上腺皮質(zhì)激素、beta-celltropin、lutrotropin和/或血管升壓素，或加上一種或多種神經(jīng)再生因子，優(yōu)選神經(jīng)生長因子(NGF)和/或一種或多種血管再生因子(優(yōu)選血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和/或血小板衍生生長因子(PDGF))。
描述于本發(fā)明的進一步的實施方案以類似的方式也適用于本發(fā)明所描述的用途。
進一步的可能性是含有生長因子TPO、EPO、GH，特別是HGH、促生長素抑制素、LIF和/或CNTF的至少一種的生物基質(zhì)或載體結(jié)構(gòu)，用作為擴增階段中3-D生長和/或再生的誘導(dǎo)性底物，或用于誘導(dǎo)擴增階段后的分化，或者用于阻滯生長。例如，至少一種所述生長因子可以與上述例舉描述的所謂緩慢釋放材料組合被涂敷于支架上。
因此本發(fā)明還進一步涉及生物基質(zhì)或載體結(jié)構(gòu)，它們包含生長因子血小板生成素(TPO)、促紅細胞生成素(EPO)、生長激素(GH)，特別是人生長激素(HGH)、促生長素抑制素、白血病抑制因子(LIF)和/或睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(CNTF)中的至少一種，其中這種生物基質(zhì)或載體結(jié)構(gòu)也可以另外包含生長因子TGF β、前列腺素、GM-CSF、GHRH、TRH、GnRH、CRH、多巴胺、ADH、催產(chǎn)素、催乳素、促腎上腺皮質(zhì)激素、beta-celltropin、lutrotropin和/或血管升壓素中的至少一種，任選地還可以含有一種或多種神經(jīng)再生因子(優(yōu)選神經(jīng)生長因子(NGF))和/或一種或多種血管再生因子(優(yōu)選血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和/或血小板衍生生長因子(PDGF))。
本發(fā)明生物基質(zhì)或載體結(jié)構(gòu)是例如植入物、移植物和/或細胞生長的載體材料，該生物基質(zhì)或載體結(jié)構(gòu)可能是支架、導(dǎo)管、皮膚、水合凝膠、骨替代材料、同種異型、自體或異種無細胞化或非無細胞化的組織、合成的組織、飼養(yǎng)層或纖維片(fabric)，如膠原、層粘連蛋白和/或纖連蛋白形成的纖維片(具有或不具有合成的或其它類型的基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)(如塑料或生物基質(zhì))。上文已經(jīng)描述了示范性的實施方案。
所述生物基質(zhì)或載體結(jié)構(gòu)是，如上文已經(jīng)詳細描述的，優(yōu)選已使用組織特異性細胞、前體細胞、骨髓細胞、外周血、脂肪組織和/或纖維組織進行了預(yù)移殖的，或用于體內(nèi)移殖或誘導(dǎo)性重建已體外準備好的。
所述生物基質(zhì)或載體結(jié)構(gòu)也可以是被含有至少一種所述生長因子的(生物)聚合物層包覆的。例如纖維蛋白、血漿、膠原和/或聚交酯適用于(生物)聚合物層。
本發(fā)明也涉及生產(chǎn)本發(fā)明生物基質(zhì)或載體結(jié)構(gòu)的方法，其中未活化或經(jīng)活化的、經(jīng)生長因子TPO、EPO、GH(特別是HGH)、促生長素抑制素、LIF和/或CNTF中的至少一種包覆的生物基質(zhì)或載體結(jié)構(gòu)，其中所述生物基質(zhì)或載體結(jié)構(gòu)可以任選地被額外的生長因子TGF β、前列腺素、GM-CSF、GHRH、TRH、GnRH、CRH、多巴胺、ADH、催產(chǎn)素、催乳素、促腎上腺皮質(zhì)激素、beta-celltropin、lutrotropin和/或血管升壓素中的至少一種包覆，并且任選地還可額外的被一種或多種神經(jīng)再生因子(優(yōu)選NGF)和/或一種或多種血管再生因子(優(yōu)選VEGF和/或PDGF)包覆。
生物基質(zhì)或載體結(jié)構(gòu)的活化可例如通過等離子離子化(如使用過氧化氫)或激光活化的方式進行。
其它的可能性是使用含有所述生長因子的生物可降解的(生物)聚合物層進行包覆。在此合適的實例是纖維蛋白、血漿、血液、膠原和/或聚交酯。
本發(fā)明方法中同樣可以使用細胞在體外對生物基質(zhì)或載體結(jié)構(gòu)進行預(yù)移殖，優(yōu)選使用組織特異性細胞、前體細胞、骨髓細胞、外周血、脂肪組織和/或纖維組織。
以上描述的優(yōu)選的本發(fā)明特征或特征性實例以類似的方式適合于本發(fā)明的生產(chǎn)方法。
本發(fā)明也延伸至實現(xiàn)本發(fā)明方法的裝置，其中優(yōu)選為灌注生物反應(yīng)器(perfused bioreactor)，特別是封閉形式的灌注生物反應(yīng)器。
以下實施例意圖詳細解釋本發(fā)明，而對本發(fā)明不具限制性。
實施例1.骨再生制備具有例如大于15μm的微孔性的單相β磷酸三鈣顆粒，并以3-D空缺形狀成形，該3-D空缺形狀符合患者的需要。這通常通過燒結(jié)方法進行。隨后通過等離子離子化處理該材料，以便產(chǎn)生表面的活化，并將該構(gòu)建物置于具有血小板生成素、促紅細胞生成素和/或生長激素(GH)的溶液中，由此以微小的量精細地包覆?；蛘?，可以在沒有事先進行表面活化的情況下在溶液中孵育，或用含有這些生長因子的生物可降解的(生物)聚合物層包覆。在這種情況下可使用纖維蛋白、血漿、膠原和/或聚交酯。
然后將該構(gòu)建物立即放入空缺中，或使用組織特異性細胞、前體細胞或骨髓細胞進行體外預(yù)移殖。這實現(xiàn)了在體外預(yù)先進行體內(nèi)創(chuàng)傷復(fù)原過程，并由此縮短了(例如7天之后)體內(nèi)植入后的再整合時間。可以與神經(jīng)再生因子(NGF)或血管再生因子(VEGF、PDGF)聯(lián)合使用。在此與結(jié)構(gòu)形成因子聯(lián)用并且考慮環(huán)境因素是令人感興趣的。
在體內(nèi)和體外都存在造血和富集干細胞的骨髓的整合、造骨細胞分化速率的增加以及載體基質(zhì)吸收和被正常骨骼取代的速率增加。通過重構(gòu)能力和誘導(dǎo)特征實現(xiàn)位點特異性整合。
可以通過已經(jīng)在體外用骨膜于外側(cè)進行覆蓋移殖的方式進一步促進整合。
2.心臟瓣膜再生和尿道構(gòu)建物的產(chǎn)生使用血小板生成素和促紅細胞生成素作為生長因子對生物基質(zhì)進行預(yù)包覆。該生物基質(zhì)包括具有和不具有細胞化的同種異型或自體心臟瓣膜，由塑料制成的合成載體結(jié)構(gòu)(其在膠原的化學(xué)組成和空間排列方面與目的心血管組織的生理微環(huán)境相似)。
然后通過等離子離子化(如使用過氧化氫H2O2)處理該材料，同時達到滅菌作用，以便產(chǎn)生表面的活化，并將該構(gòu)建物置于具有血小板生成素、促紅細胞生成素和/或生長激素(GH)的溶液中，由此以微小的量精細地包覆。或者，可以在沒有事先進行表面活化的情況下在溶液中孵育，或用含有這些生長因子的生物可降解的(生物)聚合物層包覆。在這種情況下可使用纖維蛋白、血漿、膠原和/或聚交酯。
然后將該構(gòu)建物立即置入需要的位置(心臟瓣膜位置，作為補片或血管替代物)，或使用組織特異性細胞、前體細胞或骨髓細胞進行體外預(yù)移殖。這實現(xiàn)了在體外預(yù)先進行體內(nèi)創(chuàng)傷復(fù)原過程，并由此縮短了(例如7天之后)體內(nèi)植入后的再整合時間?？梢耘c神經(jīng)再生因子(NGF)或血管再生因子(VEGF、PDGF)聯(lián)合使用，但這并不是絕對必需的。
在體內(nèi)和體外都存在造血和富集干細胞的骨髓的整合、成纖維細胞和平滑肌細胞分化速率的增加以及載體基質(zhì)吸收和被正常心血管組織取代的速率增加。通過重構(gòu)能力和誘導(dǎo)特征實現(xiàn)位點特異性整合。
可以通過已經(jīng)在體外使用內(nèi)皮細胞于外側(cè)進行覆蓋移殖的方式進一步促進整合。
可以通過相應(yīng)的方式制備尿道構(gòu)建物。
3.在具有非實質(zhì)細胞的共培養(yǎng)物中進行成體肝細胞增殖向培養(yǎng)基上清加入濃度為10-50ng/ml的TPO和/或EPO和/或生長激素(如HGH)以處理來自活檢組織或部分切除物的混合肝細胞群體。接種細胞的密度是10000細胞/cm。匯合之后，在加入2g/l的白蛋白或自體血清(10-20％)的情形下，用0.005％的膠原酶和0.01％胰蛋白酶處理5小時。然后吹落細胞，并在培養(yǎng)基(Williams E(Williams等人(1971)Exptl.Cell Res.，69，106)中用含有2g/l白蛋白清洗3次，然后將細胞置于膠原包覆的培養(yǎng)皿上沉淀。
通過用胞外基質(zhì)覆蓋可以實現(xiàn)細胞的分化。
或者通過攪拌阻止細胞沉淀，并使它們聚在一起。
為了防止在生長過程中形成過大的聚集物，可以使細胞通過具有大小為500μm的網(wǎng)孔結(jié)構(gòu)的柵格裝置，以便可以反復(fù)產(chǎn)生新的亞聚集物。這可以在完全封閉的系統(tǒng)中進行。理想地，可以使用非接觸的泵系統(tǒng)(無蠕動系統(tǒng)的擠壓，而是由磁力或管道壓縮空氣產(chǎn)生定向流，或者活塞泵——自動或手動)。
然后可以將細胞包囊化和冷凍?？梢栽诎医Y(jié)構(gòu)中整合進結(jié)構(gòu)化的形狀和空間，這使原位結(jié)構(gòu)生長和擴大成為可能。
或者，可以免于進行包囊，通過在該系統(tǒng)中存在內(nèi)皮細胞以及靶向的加入這些細胞以實現(xiàn)內(nèi)皮化，并因此達到最佳的血相容性。
灌注生物反應(yīng)器中的剪切力導(dǎo)致內(nèi)皮細胞在聚集物表面自發(fā)匯合。當(dāng)達到所需大小時，可以將它們冷凍在例如適合用于培養(yǎng)的袋中。
4.軟組織(肌肉片、神經(jīng)、腱)為了重建腹壁缺損，相應(yīng)于上文可以制備膠原片或纖維片(如層粘連蛋白、具有或不具有合成或其它類型基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)(如塑料或生物基質(zhì))的纖連蛋白)，或具有限定空間的結(jié)構(gòu)(神經(jīng)管、腱)。這些膠原片或結(jié)構(gòu)被成形，并用TPO、EPO和/或生長激素(GH)包覆和植入或用目的組織的細胞(如跟腱細胞、神經(jīng)元)預(yù)移殖。
使用血小板生成素和促紅細胞生成素作為生長因子對生物基質(zhì)進行預(yù)包覆。該生物基質(zhì)包括具有和不具有細胞化的同種異型或自體心臟瓣膜，由塑料制成的合成載體結(jié)構(gòu)(其在膠原的化學(xué)組成和其空間排列方面與目的組織的生理微環(huán)境相似)。
在這之前或之后，通過等離子離子化(如使用過氧化氫H2O2)處理該材料，同時達到滅菌作用，以便產(chǎn)生表面的活化，將構(gòu)建物置于具有血小板生成素、促紅細胞生成素和/或生長激素的溶液中，由此以微小的量精細地包覆?；蛘?，可以在沒有事先進行表面活化的情況下在溶液中進行孵育，或用含有這些生長因子的生物可降解的(生物)聚合物層包覆。在這種情況下可使用纖維蛋白、血漿、膠原和/或聚交酯。
然后將構(gòu)建物立即引入需要的位置(腹壁、心肌、骨骼肌片)，或使用組織特異性細胞、前體細胞或骨髓細胞進行體外預(yù)移殖。這實現(xiàn)了在體外預(yù)先進行體內(nèi)創(chuàng)傷復(fù)原過程，并由此縮短了(例如7天之后)體內(nèi)植入后的再整合時間?？梢耘c神經(jīng)再生因子(NGF)或血管再生因子(VEGF、PDGF)聯(lián)合使用，但這并不是絕對必需的。
在體內(nèi)和體外都存在造血和富集干細胞的骨髓的整合、成纖維細胞和平滑肌細胞分化速率的增加以及載體基質(zhì)吸收和被正常心血管組織取代速率的增加。通過重構(gòu)能力和誘導(dǎo)特征實現(xiàn)位點特異性整合。
可以通過已經(jīng)在體外使用角質(zhì)細胞(腹肌)、Schwann′s細胞和/或纖維組織于外側(cè)進行覆蓋移殖的方式進一步促進整合。
5.組織的體內(nèi)再生a)肝臟肝臟被部分切除后，通過與聚合物聯(lián)合施用于切除表面而將EPO全身性地和/或局部地施用于患者。聚合物可以是生物聚合物如纖維蛋白(如來自纖維蛋白膠)、聚合血漿、聚合血液或生物粘附劑(如貝類粘附劑)。但是也可以是人工合成的或是生物凝膠和水合凝膠。EPO也可被引入用于止血的纖維片(如膠原纖維片、填篩物(Tamponade)、機織織物和編織物)。
通過EPO的作用，肝臟在兩周內(nèi)恢復(fù)到原來的體積。這不僅涉及肝細胞的增殖，還涉及一個協(xié)同生長過程，其中血管、膽管和囊狀結(jié)構(gòu)生長恢復(fù)原來的大小。
可以在30種動物中表明，肝臟的所述再生顯著好于(沒有提供EPO的)對照動物。
EPO也可以在慢性肝疾病(如硬化、纖維化、肝炎)中被用于肝臟再生。因此可以首次獲得對于肝實質(zhì)的治療效果。
b)腸炎疾病局限性回腸炎的患者在腸上皮區(qū)域出現(xiàn)創(chuàng)傷復(fù)原障礙。更深層的組織結(jié)構(gòu)可能也參與炎癥反應(yīng)。在這些患者中，全身性或局部使用EPO導(dǎo)致腸上皮通過再生而復(fù)原。局部施用可通過腸區(qū)緩釋膠囊或施予使用凝膠的栓劑或使用溶液局部注入而實現(xiàn)。
通過使用聚乙二醇化(PEG)的化合物可以使局部的血管區(qū)域的吸收最佳化，以便在發(fā)炎區(qū)域的局部給藥實現(xiàn)整體的效果，并由此實現(xiàn)引發(fā)創(chuàng)傷復(fù)原過程。
貧血的存在被看作是局限性回腸炎患者的診斷陽性指標(biāo)。過去認為貧血是獨立的伴隨性病癥或是由于吸收問題導(dǎo)致的消瘦。我們的研究表明創(chuàng)傷復(fù)原障礙涉及內(nèi)源EPO的不足。因此通過使用外源EPO可能高度選擇性的治療局限性回腸炎。也可以進一步應(yīng)用于潰瘍性結(jié)腸炎領(lǐng)域。
c)皮膚區(qū)域的創(chuàng)傷復(fù)原障礙糖尿病潰瘍患者具有營養(yǎng)障礙，它們導(dǎo)致通常在腿部區(qū)域的傷口愈合困難。由于基礎(chǔ)疾病，導(dǎo)致結(jié)構(gòu)組織的再生能力受限。在這些病例中，通過全身性或局部使用EPO誘導(dǎo)創(chuàng)傷復(fù)原。已證明清創(chuàng)術(shù)中對底層粗糙處理后使用EPO是有利的。氯化鈣誘導(dǎo)的多聚化作用與EPO聯(lián)合導(dǎo)致EPO整合入血凝塊，從而形成一種局部緩釋制劑。或者，EPO也可以與纖維蛋白膠或纖維片或包裹EPO的填篩物(如膠原纖維片)聯(lián)合施用。
對于所有的其它創(chuàng)傷復(fù)原需要(如運動損傷后的肌肉區(qū)域、肌肉疾病、骨損傷、軟組織損傷)和一般的改善創(chuàng)傷復(fù)原和組織再生(如術(shù)后、急性和慢性疾病)，可以以相似的方式使用EPO。
權(quán)利要求
1.進行體外細胞增殖和分化的方法，其特征在于通過使用生長因子血小板生成素(TPO)和/或促紅細胞生成素(EPO)，和/或生長激素(GH)，特別是人生長激素(HGH)，和/或促生長素抑制素和/或白血病抑制因子(LIF)和/或睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(CNTF)起始和終止細胞的生長過程，并對細胞的生長過程進行結(jié)構(gòu)性指導(dǎo)。
2.權(quán)利要求1的方法，其特征在于還使用轉(zhuǎn)化生長因子β(TGFβ)、前列腺素、粒細胞-巨噬細胞刺激因子(GM-CSF)、生長激素釋放激素(GHRH)、促甲狀腺素釋放激素(TRH)、促性腺激素釋放激素(GnPH)、促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(CRH)、多巴胺、抗利尿激素(ADH)、催產(chǎn)素、催乳素、促腎上腺皮質(zhì)激素、beta-celltropin、lutrotropin和/或血管升壓素作為生長因子。
3.權(quán)利要求1或2的方法，其特征在于還使用一種或多種神經(jīng)再生因子，優(yōu)選神經(jīng)生長因子(NGF)，和/或一種或多種血管再生因子，優(yōu)選血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和/或血小板衍生生長因子(PDGF)。
4.權(quán)利要求1到3中至少一項的方法，其特征在于此方法在內(nèi)皮細胞存在下進行。
5.權(quán)利要求1到4中至少一項的方法，其特征在于細胞的生長過程被局部引發(fā)和終止，并被結(jié)構(gòu)性指導(dǎo)。
6.權(quán)利要求5的方法，其特征在于通過生物基質(zhì)或載體結(jié)構(gòu)來對細胞的生長過程進行局部引發(fā)或終止和結(jié)構(gòu)性指導(dǎo)。
7.權(quán)利要求6的方法，其特征在于使用一種所述生長因子處理所述生物基質(zhì)或載體結(jié)構(gòu)，或用所述生長因子的組合以混合物形式或相繼的形式處理所述生物基質(zhì)或載體結(jié)構(gòu)。
8.權(quán)利要求6或7的方法，其特征在于植入物、移植物和/或載體材料被用作細胞生長的生物基質(zhì)或載體結(jié)構(gòu)。
9.權(quán)利要求1到8中至少一項的方法，其特征在于使用細胞，優(yōu)選組織特異性細胞、前體細胞、骨髓細胞、外周血、脂肪組織和/或纖維組織對生物基質(zhì)或載體結(jié)構(gòu)進行預(yù)移殖，或該生物基質(zhì)或載體結(jié)構(gòu)已被體外制備，以用于體內(nèi)移殖或誘導(dǎo)性重建。
10.權(quán)利要求1到9中至少一項的方法，其特征在于使用的細胞是成體祖細胞和/或組織特異性細胞，優(yōu)選造骨細胞、成纖維細胞、肝細胞和/或平滑肌細胞。
11.權(quán)利要求1到10中至少一項的方法，其用于成體細胞的局部特異和/或定向增殖、結(jié)構(gòu)生長和隨后的分化，和/或用于骨、組織和/或內(nèi)分泌器官的再生。
12.權(quán)利要求1到4中至少一項的方法，其特征在于通過合適的裝置任選地打碎細胞在生長過程中形成的聚集物，并且任選地進行包囊化和任選地冷凍。
13.生物基質(zhì)或載體結(jié)構(gòu)，其含有生長因子TPO、EPO、GH，特別是HGH、促生長素抑制素、LIF和/或CNTF中的至少一種。
14.權(quán)利要求13的生物基質(zhì)或載體結(jié)構(gòu)，其還含有生長因子TGFβ、前列腺素、GM-CSF、GHRH、TRH、GnRH、CRH、多巴胺、ADH、催產(chǎn)素、催乳素、促腎上腺皮質(zhì)激素、beta-celltropin、lutrotropin和/或血管升壓素中的至少一種，并且任選地，還含有一種或多種神經(jīng)再生因子，優(yōu)選NGF，和/或一種或多種血管再生因子，優(yōu)選VEGF和/或PDGF。
15.權(quán)利要求13或14的生物基質(zhì)或載體結(jié)構(gòu)，其特征在于該生物基質(zhì)或載體結(jié)構(gòu)是用作細胞生長的植入物、移植物和/或載體材料。
16.權(quán)利要求13到15中任一項的生物基質(zhì)或載體結(jié)構(gòu)，其特征在于該生物基質(zhì)或載體結(jié)構(gòu)是支架、補片、導(dǎo)管、皮膚、水合凝膠、骨替代材料、同種異型、自體或異種無細胞化或非無細胞化的組織、合成組織、飼養(yǎng)層或纖維片。
17.權(quán)利要求13到16中任一項的生物基質(zhì)或載體結(jié)構(gòu)，其特征在于使用細胞，優(yōu)選組織特異性細胞、前體細胞、骨髓細胞、外周血、脂肪組織和/或纖維組織對該生物基質(zhì)或載體結(jié)構(gòu)進行預(yù)移殖。
18.權(quán)利要求13到17中任一項的生物基質(zhì)或載體結(jié)構(gòu)，其特征在于此生物基質(zhì)或載體結(jié)構(gòu)被含有至少一種所述生長因子的生物可降解的(生物)聚合物層包覆。
19.權(quán)利要求13到18中任一項的生物基質(zhì)或載體結(jié)構(gòu)的生產(chǎn)方法，其特征在于任選活化的生物基質(zhì)或載體結(jié)構(gòu)被生長因子TPO、EPO、GH，特別是HGH、促生長素抑制素、LIF和/或CNTF中的至少一種包覆。
20.權(quán)利要求19的方法，其特征在于所述生物基質(zhì)或載體結(jié)構(gòu)還被另外的生長因子TGFβ、前列腺素、GM-CSF、GHRH、TRH、GnRH、CRH、多巴胺、ADH、催產(chǎn)素、催乳素、促腎上腺皮質(zhì)激素、beta-celltropin、lutrotropin和/或血管升壓素中的至少一種包覆，任選地還被一種或多種神經(jīng)再生因子，優(yōu)選NGF，和/或一種或多種血管再生因子，優(yōu)選VEGF和/或PDGF包覆。
21.權(quán)利要求19或20的方法，其特征在于通過等離子離子化或激光活化的方式活化所述生物基質(zhì)或載體結(jié)構(gòu)。
22.權(quán)利要求19到21中至少一項的方法，其特征在于使用細胞，優(yōu)選組織特異性細胞、前體細胞、骨髓細胞、外周血、脂肪組織和/或纖維組織在體外對所述生物基質(zhì)或載體結(jié)構(gòu)進行預(yù)移殖。
23.一種用于實施權(quán)利要求1到12和權(quán)利要求19到22中至少一項的方法的裝置。
24.權(quán)利要求23的裝置，其特征在于此裝置是灌注生物反應(yīng)器，優(yōu)選封閉系統(tǒng)的形式。
25.生長因子TPO和/或EPO和/或GH和/或促生長素抑制素和/或LIF和/或CNTF在生產(chǎn)藥物中的用途，其中該藥物用于治療骨、軟骨、組織和/或內(nèi)分泌器官，特別是心肌、心臟瓣膜、靜脈瓣膜、動脈瓣膜、皮膚、血管、大動脈、腱、角膜、軟骨、骨、氣管、神經(jīng)、miniscus、椎間盤、肝臟、腸上皮、輸尿管、尿道或膀胱的再生，或用于治療退化性疾病和/或協(xié)助創(chuàng)傷復(fù)原過程，特別是局限性回腸炎、潰瘍性結(jié)腸炎和/或皮膚區(qū)域的創(chuàng)傷，優(yōu)選糖尿病潰瘍或齒齦，和/或用于治療肝臟疾病，特別是治療肝硬化、肝炎、急性或慢性肝衰竭，和/或運動損傷、肌肉疾病、骨損傷、軟組織損傷后肌肉組織的創(chuàng)傷復(fù)原，和/或用于改善創(chuàng)傷復(fù)原和組織再生，如手術(shù)、急性和慢性疾病和/或缺血性心肌疾病后，以刺激血管新生和再生，和/或用于治療受傷和外傷后的缺血，和/或促進組織損傷后的再生。
26.如權(quán)利要求25中的用途，其特征在于還另外使用轉(zhuǎn)化生長因子β(TGFβ)、前列腺素、粒細胞-巨噬細胞刺激因子(GM-CSF)、生長激素釋放激素(GHRH)、促甲狀腺素釋放激素(TRH)、促性腺激素釋放激素(GnPH)、促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(CRH)、多巴胺、抗利尿激素、催產(chǎn)素、催乳素、促腎上腺皮質(zhì)激素、beta-celltropin、lutrotropin和/或血管升壓素作為生長因子。
27.如權(quán)利要求25或26中的用途，其特征在于還另外使用一種或多種神經(jīng)再生因子，優(yōu)選神經(jīng)生長因子(NGF)，和/或一種或多種血管再生因子，優(yōu)選血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和/或血小板衍生生長因子(PDGF)。
全文摘要
本發(fā)明涉及細胞增殖和分化的體內(nèi)和體外方法，其中通過使用生長因子——血小板生成素(TPO)和/或促紅細胞生成素(EPO)，和/或生長激素(GH)，特別是人生長激素(HGH)，和/或促生長素抑制素和/或白血病抑制因子(LIF)和/或睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(CNTF)——來起始或終止細胞生長過程，并對細胞生長過程進行結(jié)構(gòu)性指導(dǎo)。本發(fā)明也涉及含有前述生長因子的生物基質(zhì)和載體結(jié)構(gòu)，以及制造它們并實行本發(fā)明方法的裝置和方法。
文檔編號A61K38/19GK1668734SQ03816829
公開日2005年9月14日 申請日期2003年6月20日 優(yōu)先權(quán)日2002年6月20日
發(fā)明者A·巴德 申請人:比奧索斯控股有限公司